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1.

INTRODUCCIN

Las enzimas pertenecen a las macromolculas llamadas protenas que tienen la capacidad de facilitar y acelerar las reacciones qumicas que tienen lugar en los tejidos vivos, disminuyendo el nivel de la "energa de activacin" propia de la reaccin. Se entiende por "energa de activacin" al valor de la energa que es necesario aplicar (en forma de calor, electricidad o radiacin) para que dos molculas determinadas colisionen y se produzca una reaccin qumica entre ellas, alcanzando un estado de transicin. La cintica enzimtica estudia las velocidades de reacciones qumicas. Uno de los objetivos principales es comprender los mecanismos de reaccin, esto es, la descripcin detallada de las diversas etapas del proceso de una reaccin. La termodinmica es la que permite saber si determinado proceso se produce en forma espontanea, pero proporciona escasa informacin sobre la naturaleza, o incluso, la existencia de los pasos que lo componen. (Voet y Voet, 2006). Las mediciones cinticas de las reacciones catalizadas por enzimas son algunas de las tcnicas ms poderosas para dilucidar los mecanismos catalticos de las enzimas. Es por esto, que para determinar cuantitativamente los aspectos cinticos de la reaccin se procede a realizar ensayos enzimticos mediante los cuales se puede medir la velocidad de una reaccin enzimtica. Como las enzimas no se consumen en la reaccin que catalizan, los ensayos enzimticos suelen medir los cambios experimentados en la concentracin de sustrato (que va decreciendo) o bien en la concentracin de producto (que va aumentando). Existen diversos mtodos para realizar estas medidas como los colorimtricos, basados luego en absorbancia de luz. La espectrofotometra permite detectar cambios en la absorbancia de luz por parte del sustrato o del producto (Bibian y Rojas, 2004) Experimentalmente, la medicin de la velocidad de reaccin es un buen indicador para la medida de la actividad enzimtica, sin embargo debido a que la velocidad de reaccin disminuye a travs del tiempo, se considera tericamente a la actividad como la velocidad inicial de reaccin. A partir del valor de actividad enzimtica, grficamente se puede obtener los parmetros cinticos como KM y Vmax al usar un mtodo de linearizacin de Lineweaver-Burke (Mathews et al, 2002). En el presente prctico se dar a conocer un procedimiento de estudio basado en mtodo colorimtrico (DNS) para cuantificar mediante espectrofotometra el producto de la reaccin enzimtica de preparado de -amilasa, y as medir la actividad enzimtica grficamente a travs del tiempo, para posteriormente obtener los parmetros cinticos de KM y Vmax, desde una grfica de recprocos de actividad vs. Concentracin de sustrato.

2. OBJETIVOS

2.1 Objetivo general: Determinar empricamente la actividad enzimtica y parmetros cinticos KM y Vmax de un preparado de -amilasa que efecta reaccin de catlisis de solucin de almidn, para cuatro diluciones diferentes de sustrato.

Objetivos especficos: Aplicar el Mtodo del DNS como indicador colorimtrico de la reaccin en la determinacin de azucares reductores del producto. Determinar absorbancia de las soluciones resultantes del Mtodo del DNS en un espectrofotmetro a 540 nm. Evaluar grficamente, por medio de la pendiente, la actividad enzimtica en 4 distintas diluciones de solucin de almidn (sustrato) previo a la obtencin de parmetros cinticos. Aplicar el mtodo de linearizacin de Lineweaver-Burke para obtencin de datos. Efectuar curva patrn de glucosa como medida referencia experimental. Construir grficos de recprocos de actividad enzimtica vs recprocos de concentracin de solucin de almidn para el ensayo.

3. REVISIN BIBLIOGRFICA 3.1 Cintica Enzimtica: La cintica enzimtica estudia la velocidad de las reacciones qumicas que son catalizadas por las enzimas. El estudio de la cintica y de la dinmica qumica de una enzima permite explicar los detalles de su mecanismo cataltico, su papel en el metabolismo, cmo es controlada su actividad en la clula y cmo puede ser inhibida su actividad por frmacos o venenos o potenciada por otro tipo de molculas. Las enzimas son protenas (macromolculas) con la capacidad de manipular otras molculas, denominadas sustratos. Un sustrato es capaz de unirse al centro cataltico de la enzima que lo reconozca y transformarse en un producto a lo largo de una serie de pasos denominados mecanismo enzimtico. Algunas enzimas pueden unir varios sustratos diferentes y/o liberar diversos productos, como es el caso de las proteasas al romper una protena en dos polipptidos. En otros casos, se produce la unin simultnea de dos sustratos, como en el caso de la ADN polimerasa, que es capaz de incorporar un nucletido (sustrato 1) a una hebra de ADN (sustrato 2). Aunque todos estos mecanismos suelen seguir una compleja serie de pasos, tambin suelen presentar una etapa limitante que determina la velocidad final de toda la reaccin. Esta etapa limitante puede consistir en una reaccin qumica o en un cambio conformacional de la enzima o del sustrato (Ebbing, 1993) 3.1.1 Catlisis: La catlisis es el proceso por el cual se aumenta o disminuye la velocidad de una reaccin qumica, debido a la participacin de una sustancia llamada catalizador (Lehninger, 2007)

3.1.2 Actividad enzimtica La medicin de la velocidad de reaccin es un buen indicador para la medida de la actividad enzimtica, sin embargo debido a que la velocidad de reaccin disminuye a travs del tiempo, se considera tericamente a la actividad como la velocidad inicial de reaccin (Mathews et al, 2002). Cuando se conoce el peso molecular de la enzima pura y el nmero de centros activos por molcula de enzima, las medidas de actividad enzimtica permiten calcular el nmero de recambio del enzima, o sea, el nmero de reacciones elementales que realiza el enzima por cada centro activo y por unidad de tiempo. Se define la unidad de actividad enzimtica (U) como la cantidad de enzima que cataliza la conversin de 1 mol de sustrato en un minuto. La actividad especfica es el nmero de unidades de enzima por miligramo de protena (U/mg prot) o por mililitro de

disolucin (U/ml). Recientemente, el Sistema Internacional de unidades (SI) ha definido la unidad de actividad enzimtica como la cantidad de enzima que transforma 1 mol de sustrato por segundo. Esta unidad se llama katal (kat). Como 1 mol son 10 6 moles y 1 minuto son 60 segundos, resulta que 1 katal equivale a 60 x 10 6 U. Esta unidad es muy grande, de forma que se utilizan frecuentemente los submltiplos como el microkatal (kat, 10-6 kat) o el nanokatal (nkat, 10-9 kat) (Voet y Voet, 2006). 3.1.3 Parmetros cinticos La velocidad de transformacin de los sustratos de una reaccin en los correspondientes productos en una reaccin enzimtica que transcurra en condiciones de estado estacionario es dependiente tanto de las concentraciones de la enzima como de los sustratos. Normalmente, esa dependencia puede expresarse matemticamente por la ecuacin de Michaelis-Menten: v = Vmax [S] / (Km + [S]) Esta ecuacin predice que la velocidad de formacin de producto es saturable con respecto al sustrato, es decir existe una concentracin de sustrato a partir del cual la velocidad (v) no aumenta de forma significativa. La Km es un parmetro que depende de la afinidad de la enzima por el sustrato y que se denomina constante de Michaelis. La Vmax se denomina velocidad mxima, y depende de la concentracin de enzima segn una relacin lineal: Vmax = k2 [E] El clculo de los valores de Vmax y Km se realiza mediante la representacin de Lineweaver-Burk, que es en realidad la ecuacin de Michaelis-Menten en forma doble recproca: 1/v = 1/Vmax + (Km/Vmax) [S] La representacin de 1/v frente a 1/[S] da lugar a una lnea recta cuya ordenada en el origen es 1/Vmax y cuya abscisa es -1/Km. La velocidad de reaccin se suele expresar en moles de producto formado por minuto, aunque existan unidades estndar, como el Katal, que por ser muy grande es poco empleada (Gonzalez-Romero, 2007)

3.2 Ensayos enzimticos colorimtricos Un ensayo enzimtico es un procedimiento, llevado a cabo en un laboratorio, mediante el cual se puede medir la velocidad de una reaccin enzimtica. Como las enzimas no se consumen en la reaccin que catalizan, los ensayos enzimticos suelen medir los cambios experimentados bien en la concentracin de sustrato (que va decreciendo), bien en la concentracin de producto (que va aumentando). Los ensayos espectrofotomtricos basados en colorimetra son los ms utilizados, ya que permiten medir la velocidad de la reaccin de forma continua.

3.2.1 Mtodo del DNS El mtodo DNS es una tcnica colorimtrica que emplea 3,5-cidodinitrosaliclico para la hidrlisis de polisacridos presentes en una muestra, seguido de la determinacin espectrofotomtrica a 540nm de los azcares reductores. Esta tcnica sirve para cuantificar los azucares reductores producidos durante una fermentacin o para cuantificar los productos de una reaccin enzimtica tornndose de amarillo a rojo en presencia de azucares reductores. Esta prueba es un mtodo para detectar la presencia del grupo carbonilo libre (C = O) (Miller, 2001). Para determinar la concentracin de glucosa, es usado un reactivo qumico reductor, llamado solucin de acido 3, 5 dinitrosaliclico (DNS) al 98%. La solucin de DNS es preparada disolviendo 10g de acido 3, 5 dinitrosaliclico en una solucin de hidrxido de sodio 2 m. Una solucin separada de 300 g de solucin de tartrato de sodio y potasio preparada en 300 ml de agua destilada. La solucin alcalina caliente de 3,5 dinitrosalicilato es aadida a la solucin tartrato sodio-potasio, el volumen final de la solucin DNS se lleva a 1 litro con agua destilada. Al concluir el experimento, para cada muestra, se mide la concentracin de glucosa con el reactivo de DNS, debiendo diluir 1 ml de la muestra en 10 ml de agua destilada para hacer conveniente el rango de concentracin para el anlisis colorimtrico, donde las muestras son determinadas por el desarrollo del color el cual es detectado por un espectrofotmetro a una longitud de onda de 540 nm. (PRONK, 1996).

3.3 Espectrofotmetro UV-visible RAYLEIGH UV1800 Posee un rango de 190 a 1100 nm con un haz simple con barrido espectral, posee diferentes opciones de ancho de banda, amplia variedad de mtodos, incluyendo barrido de longitud de onda, barrido en el tiempo, multi-longitud de onda, doble y triple longitud de onda. Soporta 4 celdas de 5 a 50 mm de paso ptico que puede ser reemplazado por soportes para celdas de hasta 100 mm de paso. Posee salida de datos para impresora, salida RS 232 (USB) y software para PC y almacena datos y parmetros en caso de falla de alimentacin.

4. MATERIALES Y MTODOS 4.1.- Ubicacin del ensayo La determinacin de los parmetros cinticos Km y Vmax, a partir de la actividad enzimtica de las distintas concentraciones de almidos, mediante un mtodo de linealizacion como Lineweaver-Burke se realizar en el Laboratorio de Biotecnologa de las reacciones qumicas, ubicado en las dependencias del Departamento de Agricultura del Desierto, del Campus Huayquique de la Universidad Arturo Prat, Iquique regin de Tarapac. 4.2.- Materiales 4.2.1.- Solucin almidn 10 g/L Se preparara utilizando el tampn acetato 0,02 M a pH 4,5, se utilizara el Mechero Bunsen para calentara alrededor de 50 mL de tampn hasta que ebulla y adicionara lentamente 1 gr de almidn suspendido en 30 mL de tampn. Ebulla por 2 minutos la preparacin y djela enfriar, luego aforara adicionando tampn hasta alcanzar los 100 ml del matraz aforado 100mL. A partir de esta solucin, preparara 10 ml de soluciones con concentraciones de 0,15625 2,5 10,0 g/L, por dilucin. 4.2.2.- Reactivo DNS Se utilizar un vaso precipitado de 250 mL para disolver 1,6 gr. de NaOH en 50 mL de agua destilada, adems se agregara 30 gr. de tartrato de sodio y potasio, a continuacin se usara una plancha para calentar y agitar la mezcla, a la cual se le agregara lentamente 1 gr acido dinitrosalicilico, posteriormente la mezcla se aforara a 100 mL en un matraz aforado de 100mL. Finalmente se almacenara bajo refrigeracin y lo proteger utilizando papel aluminio. 4.2.3.- Solucin enzimtica Para determinar la actividad enzimtica se utilizarn una solucin enzimtica obtenida a partir de una dilucin 1:500000 del preparado enzimtico original con tampn acetato 0,02 M pH 4,5. Tampn acetato 0,02 M pH 4,5 Componentes: Acetato de sodio Acido actico Concentracin: 0,36 g/L 0,3 ml/L

4.3.- Mtodo

4.3.1.-. Confeccin de la curva patrn de glucosa (realizado en el lab. anterior) Deber realizar soluciones de glucosa de concentraciones 0,5 gr/L, 1 gr/L, 1,5 gr/L y 2 gr/L. realizara el anlisis de azucares reductores (Mtodo DNS) a las soluciones antes sealadas, por duplicado: tomando 1 mL de cada solucin de glucosa y agregndole 1 Ml de reactivo DNS, luego seguir el protocolo del mtodo en el cual dejara 15 minutos en bao a ebullicin, bao de hielo y 10 Ml de agua destilada. Construir la curva patrn graficando la absorbancia a 540 nm versus la concentracin en gr/L.

4.3.2.- Obtencin de la actividad enzimtica del preparado (realizado en el lab. anterior) Para la obtencin de la actividad enzimtica del preparado graficara los valores de la concertacin de azucares reductores expresados como glucosa en funcin del tiempo, obtenidos a los 0, 2 y 4 minutos de reaccin analizados para cada dilucin. Finalmente determinara las pendientes (m) de las curvas obtenidas anteriormente, con las cuales (pendientes) obtendr el valor de la actividad enzimtica. 4.4.- Diseo experimental 4.4.1.- Obtencin de los parmetros cinticos El diseo que utilizar para la obtencin de Km y Vmax es necesario calcular la actividad enzimtica del preparado lo ser mediante una curva de calibrado, en la cual primero obtendr los valores de las concentraciones de cada tubo en gr/L y obtendr las absorbencias a 540 nm medidos a las diferentes diluciones de almidn, a partir de esos valores de actividad V/s sustrato se determinan los parmetros utilizando el mtodo de Lineweaver-Burke.

4.4.2 Procedimiento experimental para la reaccin enzimtica. Adicione en series de 6 tubos de ensayos, 0,9 ml de cada dilucin de la solucin de almidn para lo cual utilizar 24 tubos en total, incube cada serie de 6 tubos sealados anteriormente en un bao con agua a 60C durante 4 minutos, de manera que las diluciones de la solucin de almidn alcance la temperatura del bao, agregue 0,1 ml de la solucin enzimtica a los primeros 4 tubos de cada serie, incube a 60C los cuatro tubos a los que se le agrego la solucin enzimtica, 2 por tubos por dos minutos y los otros 2 por cuatro minutos, transcurrido el tiempo de incubacin detenga la reaccin enzimtica y adicione 1 ml del reactivo DNS.

Para realizar el tiempo cero adicione a los 2 tubos restantes de cada serie 1 ml de reactivo DNS luego de la incubacin por 4 minutos a 60C y luego coloque 0,1 ml de la solucin enzimtica.

4.4.3 Procedimiento experimental para la obtencin de los parmetros cinticos Luego de haber realizado la reaccin enzimtica, incube los tubos en un bao a ebullicin por 15 minutos junto con un blanco realcelo con 1 ml de agua destilada y 1 ml de reactivo DNS, enfrie los tubos en un bao de hielo, posteriormente agregue a los tubos 10 ml de agua destilada y djelos reposar por 15 minutos, determine su absorbencias de las soluciones resultantes en un espectrofotmetro a 540 nm. Para determinar la actividad enzimtica necesita una curva patrn realizada anteriormente con glucosa. 4.4.4.- Modelo de regresin lineal simple arreglado y curva de calibrado

y = b + mCA
Donde: CA: es la concentracin del anualito y: es la seal medida, b: la ordenada en el origen m: la pendiente de la recta. r: ndice de correlacin

Utilizaremos la curva de calibrado la cual es un mtodo de qumica analtica empleado para medir la concentracin de una sustancia en una muestra por comparacin con una serie de elementos de concentracin conocida. Se basa en la existencia de una relacin en principio lineal entre un carcter medible (por ejemplo la absorbencia en los enfoques de espectrofotometra) y la variable a determinar (la concentracin). Para ello, se efectuamos diluciones de nuestras muestras y se produce su lectura en el espectrofotmetro a 540 nm y el consiguiente establecimiento de una funcin matemtica que relacione ambas; despus, se lee el mismo carcter en la muestra problema y, mediante la sustitucin de la variable independiente de esa funcin, se obtiene la concentracin de esta. Se dice pues que la respuesta de la muestra puede cuantificarse y, empleando la curva de calibracin, se puede interpolar el dato de la muestra problema hasta encontrar la concentracin del analito. Con la frmula de Lambert-Beer efectuaremos los clculos de las concentraciones. Absorbancia (A) =

lC

Donde: - : Coeficiente de extincin - l: Camino ptico (en este caso es igual a 1) - C: Concentracin El coeficiente de extincin es igual a la pendiente por el camino ptico y como en este caso el camino ptico es igual a uno entonces el coeficiente de extincin ser igual a la pendiente. 4.4.5.- Diagrama de Lineweaver-Burk En bioqumica, el diagrama de Lineweaver-Burk se emplea como herramienta grfica para calcular los parmetros cinticos de una enzima. Su utilidad consiste en que el recproco de la cintica de Michaelis-Menten es fcilmente representable y que de l emanan mucha informacin de inters.

Cuyo recproco es:

Donde: V es la velocidad de reaccin, Km es la constante de Michaelis-Menten, Vmax es la velocidad mxima, [S] es la concentracin de sustrato.

La representacin grfica de Lineweaver-Burk permite identificar el K m y Vmax; el punto de corte con el eje de ordenadas es el equivalente a la inversa de V max, y el de abscisas es el valor de -1/Km.

5. RESULTADOS Se confecciona la curva patrn de glucosa para posteriormente calcular las concentraciones de azucares reductores y calcular su actividad enzimtica. [Gramos/Lit Absorbanc ro] ia 0,5 1 1,5 2 0,137 0,259 0,507 0,688

Se obtiene mediante una regresin lineal la pendiente que usaremos para calcular nuestras concentraciones. b (intercepto): -0,0775 m (pendiente): 0,380 r (ndice de correlacin): 0,992

Entonces al obtener nuestras absorbancias en cada una de sus diluciones tenemos: Ahora con la frmula de Lambert-Beer podremos calcular las concentraciones. Absorbanci a Tubos 1 2 3 4 5 6 0,15625 g/L 0 0 0,01 0,024 0,016 0,02 0,625 g/L 0 0,001 0 0,009 0 0,013 2,5 g/L 0,006 0,004 0,01 0,027 0,015 0,016 10 g/L 0,087 0,095 0,175 0,15 0,13 0,2 Tiempo (Min) 0 0 2 2 4 4

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C= Absorbancia/(

l ) donde = 0,380 (obtenido de la curva patrn) Concentrac in

Tubos 1 2 3 4 5 6

0,15625 g/L 0 0 0,0263 0,0631 0,0421 0,0526

0,625 g/L 0 0,0026 0 0,0236 0 0,0342

2,5 g/L 0,0157 0,0105 0,0263 0,071 0,0394 0,0421

10 g/L 0,2289 0,25 0,4605 0,3947 0,3421 0,5263

Tiempo (Min) 0 0 2 2 4 4

Grficos de Concentracin de glucosa vs.tiempo (para calcular la actividad enzimtica): como el ensayo fue por duplicados, se procedi a elegir los datos que mostraban mejor regresin lineal para cada dilucion.

Pendiente: 0,0691 Intercepto: 0,2522

Pendiente: 0,0059 Intercepto:0,0153

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Pendiente: 0,0079 Intercepto: 0,0043

Pendiente: 0,0105 Intercepto: 0,0018

Calculo de actividad enzimtica (por medio de las pendientes de las rectas): Factor dilucin total: V.total / V muestra = (0,9mL + 0,1 mL + 1mL )/(0,1mL): 20 Factor dilucin total x m x Factor dilucin del ensayo = g / L x Min Unidad : UI : mol/(L x min) PM glucosa : 180 g/mol Dilucin (0,15625 g/L) 20 x 0,0105 x 0,15625 = 0,0328 g /( L x Min) UI : 182,22 mol/(L x min)

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Dilucin (0,625 g/L) 20 x 0,0079 x 0,625 = 0,09875 g /( L x Min) UI: 548,61 mol/(L x min) Dilucin (2,5 g/L) 20 x 0,0059 x 2,5 = 0,295 g / (L x Min) UI: 1638,88 mol/(L x min) Dilucin (10 g/L) 20 x 0,0691 x 10 = 13,82 g / (L x Min) UI: 76777,77mol/(L x min) [S](g/L) 0,15625 0,625 2,5 10 1/[S] (L/g) 6,4 1,6 0,4 0,1 Act 182,22 548,61 1638,88 76777,77 1/Act [(L min)/mol] 5,487E-03 1,822E-03 6,101E-04 1,302E-05 x [S] M 0,15625 0,625 2,5 10 Act 182,22 548,61 1638,88 76777,77

1/[S] (1/M) 6,4 1,6 0,4 0,1

1/Act [(L x min)/mol] 5,487E-03 1,822E-03 6,101E-04 1,302E-05

PM almidn: segn bibliografa, en promedio es 106 g/mol

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Km/Vm = 0,0008 min Km = 4 M 1/Vm = 0,0002 Vm = 5000 mol/min

6. DISCUSIN

Durante el experimento, si bien se obtuvo datos experimentales tras la medicin espectrofotomtrica, no fueron del todo significativos, ya que al medir absorbancia en algunas muestras, arrojaba resultados negativos, lo que indica que la lectura estaba errnea. Esto pudo deberse a falencias en la manipulacin del material empleado o mal estado de los reactivos, lo que indujo a esos errores experimentales, obteniendo as menos resultados de anlisis. Una de las variantes que se postulan para explicar esos errores en la lectura, por una parte es que las muestras estaban muy diluidas y menos concentradas, incluso algunas se observaban mas diluidas que el tubo blanco, por lo que los datos arrojaban nmeros negativos. Las nicas muestras que se leyeron mejor fueron las ms concentradas (10g/L). Claramente al proceder a extraerle 1 mL a cada muestra, para luego aadirle 10mL de agua, stas quedaron ms diluidas, por lo que la lectura fue deficiente. Tambin, pudo no haber medicin de absorbancia debido a que las muestras no encajaban de acuerdo a la curva patrn, alejndose de la tendencia y no mostrando valor, a diferencia de lo que afirma la bibliografa que la absorbancia se mide porque permite conocer la concentracin del compuesto que absorbe en la mezcla, Midiendo disoluciones de varias concentraciones conocidas, se puede crear una recta de calibrado para luego calcular concentraciones de muestras desconocidas (Skoog y West, 2005), que en este caso no sucedi para todas las muestras que se midieron. Por otro lado, se observ que el reactivo DNS presentaba un aspecto extrao en su color caracterstico (ms opaco) y ya llevaba 3 semanas de preparado; posiblemente este reactivo importante no acto bien en la detencin de la reaccin enzimtica y por lo mismo no provoc cambio colorimtrico medible por espectrofotometra, ya que la bibliografa seala que la -

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amilasa cataliza la hidrlisis rpida, al azar, de los enlaces internos (1-4) de almidn. Los productos finales de la degradacin son glucosas. El 3-5-DNS en presencia de glucosas se reduce a cido 3-amino-5-dinitrosaliclico (producto coloreado que absorbe a 540 nm) (Martnez et al. 2008), lo cual en nuestro caso experimental, no se cumpli en ciertas muestras. Sin embargo, debido a que el ensayo se realiz con duplicados, se eligieron los datos ms significativos en cada dilucin, por lo que los errores experimentales no influyeron muchos y se pudo obtener una grfica final de recprocos de actividad enzimtica vs. Concentracin de sustrato (distintas diluciones de almidn) con una buena regresin lineal (r=0,9909), en el cual se pudo determinar los parmetros cinticos como Km = 4 M y Vmax= 5000 mol/min. Los resultados obtenidos se consideran aceptables y significativos para nuestro caso experimental al compararlos con lo que seala la literatura, ya que ningn valor se alej bastante de lo real, ni hubo resultados tan discordantes en los 4 ensayos de diluciones de almidn. 7. CONCLUSIN

En conclusin, tras realizar el experimento, se logr determinar empricamente la actividad enzimtica y parmetros cinticos KM y Vmax obteniendo as como resultado 4 M y 5000 mol/min respectivamente, que fue resultante del preparado de -amilasa que efectu la reaccin de catlisis de solucin de almidn, para las cuatro diluciones diferentes de sustrato. Se llegaron a obtener los parmetros cinticos, debido a que aplicamos el Mtodo del DNS como indicador colorimtrico de la reaccin en la determinacin de azcares reductores del producto. Luego de realizar el mtodo colorimtrico determinamos la absorbancia de las soluciones resultantes en un espectrofotmetro a 540 nm. As por medio de la pendiente, la actividad enzimtica en las 4 distintas diluciones de solucin de almidn (sustrato). Efectuamos la curva patrn de glucosa como medida de referencia experimental. Construimos los grficos de los inversos recprocos de actividad enzimtica vs los recprocos de concentracin de solucin de almidn, utilizada en el ensayo.

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8. BIBLIOGRAFIA

Bibian.L y E.Rojas. 2004. Determinacion de azucares reductores por tcnica de Miller (DNS). 7pp Ebbing, D.D. 1993 General chemistry (4th edition) Houghton Mifflin Co. Elsevier R. 2007 PO Box 211, 1000 AE Amsterdam First edition. The Netherlands The Boulevard, Langford Lane, Kidlington, Oxford OX5 1GB, UK Gonzalez-Romero, V. 2007. Prctica avanzada de Bioqumica para Grados en Ciencias de la Salud. Cintica Enzimtica. Universidad de Murcia. 7pp. LEHNINGER. E. 2007. Principios de Bioqumica. 3ra Edicion. Editorial Interamericana. 1536pp Martinez.E, C.Padilla, C.Garca, J.A. Brcena, J. Diez. 2008. Hidrlisis cida y enzimtica del glucgeno. Departamento de Bioqumica y Biologa Molecular, Campus Universitario de Rabanales. Crdoba. 7pp Mathews. C, K. Ahem, E. Van Holde. 2002. 3ra edicion. 1335pp Miller.2001.Use of dinitrosalicylic acid reagent for determination of reducing sugar, la utilizacin del reactivo de cido dinitrosaliclico para la determinacin de azcares reductores, Anal. Anal. Chem., 31, 426, 1959. Chem.., 31, 426, 1959 pp

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