CENTRO DE INVESTIGACIONES MARINAS Universidad de La Habana

Gentica poblacional del camarn rosado Farfantepenaeus notialis (Decpoda, Penaeidae): variacin espacio temporal de la diversidad y la estructura gentica

Resumen de la tesis presentada para optar por el grado cientfico de Doctor en Ciencias Biolgicas

Autor: MC. Ayme Robainas Barcia Tutor: Dr. Erik Garca Machado

Ciudad de La Habana, 2004

Sntesis
En este trabajo se analiza la variacin espacio temporal de los patrones de diversidad gentica, y de la estructura poblacional del camarn rosado Farfantepenaeus notialis, en la plataforma Sur de Cuba. Se estudiaron, 22 loci aloenzimticos, de los cuales seis resultaron polimrficos (Akp3, AmyB, Est3, Gdh, GP7 y Per1); cinco loci microsatlites (PnS01, PnS03, PnS04, PnS18 y PnS20); y un fragmento de 2027pb del ADNmt, en muestras procedentes de siete localidades del Golfo de Ana Mara, tres del Golfo de Bataban y dos del Golfo de Guacanayabo, durante los aos 1995, 1999 y 2003. El anlisis de los marcadores nucleares, en el ao 1995, revel diferencias genticas entre las poblaciones del Golfo de Ana Mara. Los agrupamientos observados en el rbol UPGMA, a partir del anlisis de distancias de Nei (1978), indica que la estructura de las poblaciones est estrechamente relacionada con su posicin geogrfica, as como con los patrones de corrientes marinas. El anlisis de estos loci, en el ao 2003, detect diferencias significativas entre las localidades de los Golfos Bataban y Ana Mara, corroborando las particiones reveladas, previamente, por el anlisis del ADNmt, que muestra diferencias bien establecidas entre estos Golfos. La variacin temporal observada en las frecuencias allicas, sugiere que la estructura gentica de las poblaciones de F. notialis, vara en el tiempo debido, probablemente, a la varianza en el xito reproductivo, y a la inestabilidad ambiental creada por el efecto de eventos climatolgicos, y por la accin directa del hombre. El anlisis combinado de los marcadores nucleares y mitocondriales, constituyen un criterio gentico adecuado, para clasificar las poblaciones de F. notialis, en diferentes categoras para su manejo. La existencia de dos linajes mitocondriales, establecidos en reas geogrficas distantes, y las diferencias significativas de las frecuencias allicas de los genes nucleares, identifica a las poblaciones del Golfo de Ana Mara y a las del Golfo de Bataban, como unidades con significado evolutivo (ESUs). Por otra parte, aunque las diferencias genticas entre las poblaciones del Golfo de Ana Mara se han perdido en el tiempo; debe considerarse, de forma precautoria, la estructura observada, a mediados de los aos 90, como una gua para la explotacin pesquera en la zona referida. Esta debe considerar, de manera general, como unidades de manejo (UM) a las poblaciones que se agrupan hacia las zonas interna y externa del Golfo, as como a la localidad de Tunas de Zaza.

Abreviaturas y Smbolos
ADNmt Akp AMOVA Amy ANOVA ARN 12S ARN 16S ARNr ARNt BFA BrEt BSA COI COIII ddNTP dNTPs DTT Est ESUs Fis Fit Fst Gdh GP He Ho HWE IAM KAM LBA M Mc MDS MUs NADH Ne Nem OMPG PCR Per RFLP SDS SMM TBE TPM UPGMA UV ADN mitocondrial Locus Fosfatasa alcalina Anlisis molecular de varianza Locus Amilasas Anlisis de varianza Subunidad menor del ARN mitocondrial Subunidad mayor del ARN mitocondrial ARN ribosomal ARN de transferencia Bromofenol azul Bromuro de Etidio Albumina de Suero Bovino Citocromo Oxidasa subunidad I Citocromo Oxidasa subunidad III didesoxinucletidos desoxinucletidos Ditiotreitol Locus Esterasas Unidades con Significado Evolutivo Indice de diferenciacin gentica dentro de las subpoblaciones Indice de diferenciacin gentica para el global de las poblaciones Indice de diferenciacin gentica entre subpoblaciones Locus Glutamato deshidrogenasa Locus Protenas totales Heterocigosidad promedio esperada Heterocigosidad promedio observada Equilibrio de Hardy Weingberg Modelo de alelos infinitos modificacin del Modelo de alelos infinitos para un alelo K Medio LB Agar Proporcin del nmero total de alelos respecto al nmero mximo de estados allicos Valor crtico de M Mtodo de escalado multidemensional Unidades con Significado para el manejo NADH deshidrogenasa tamao efectivo poblacional flujo gentico Regla de un migrante por generacin Reaccin en cadena de la polimerasa Locus Peroxidasas Polimorfismo de longitude de fragmentos de restriccin Duodecilsulfato de sodio Modelo de mutacin por pasos Tampn Tris cido Brico Modelo de dos fases mtodo de agrupamiento por pares no ponderados de medias aritmticas Luz ultravioleta

Introduccin
Tanto la conservacin de especies de inters comercial, como el establecimiento de estrategias de manejo adecuadas para su explotacin sostenible, requieren del conocimiento previo de diferentes aspectos de la biologa, de la diversidad gentica y de la estructura y dinmica de sus poblaciones. En este sentido, los estudios gentico-poblacionales han demostrado, que aunque en el ambiente marino las barreras fsicas que dificultan la dispersin de las especies son difciles de distinguir y las poblaciones pueden mezclarse, ya sea por la dispersin de sus larvas o por la libre migracin de los adultos (Grantham et al. 2003), en este medio pueden existir poblaciones genticamente estructuradas a diferentes escalas geogrficas (Planes et al, 1998; Barber et al, 2002; Taylor y Hellberg 2003). Esta tendencia ha sido descrita para especies ampliamente distribuidas como el arenque y el bacalao (Shaw et al. 1999; Ruzzante et al. 2001; Knutsen et al, 2003) y para otras, como los camarones, caracterizadas por estadios larvales pelgicos que facilitan su dispersin a merced de las corrientes marinas (Sponaugle et al. 2002). Esto tambin evidencia que no todas las especies con habilidades natatorias alcanzan su potencial de dispersin (Benzie, 2000). Los primeros estudios acerca de la estructura poblacional de las especies de peneidos se realizaron sobre la base del polimorfismo aloenzimtico, evidenciando bajos niveles de diversidad gentica y de subdivisin poblacional a grandes escalas geogrficas (Lester, 1979; Mulley y Latter, 1981). El anlisis de estos marcadores, de manera general, dio lugar a que se consideraran las poblaciones de las especies estudiadas como un grupo indiferenciado a lo largo de su rea de distribucin. Por esta razn se introdujo un marcador molecular, el ADN mitocondrial (ADNmt), con una tasa de mutacin relativamente elevada (Brown et al. 1985), que ofreci mayor informacin en este sentido e indic elevados niveles de estructuracin poblacional a escalas macro-geogrficas (Benzie et al. 1992, 1993; Klibunga et al. 1998; Benzie 2000; McMillen-Jackson y Bert 2003, 2004). El ADNmt ha resultado muy til para inferir patrones de distribucin geogrfica, pues, adems de que no presenta recombinacin, se hereda generalmente de forma uniparental y por lo tanto su tamao efectivo poblacional es ms pequeo (1/4) con respecto al genoma nuclear (Avise 1994). Por esta razn los cambios ocurridos en las poblaciones se detectan en este marcador antes que en los genes nucleares. Recientemente ha sido empleado el ADN microsatlite para abordar la gentica poblacional de los peneidos. Estas secuencias presentan una serie de caractersticas que las hacen muy atractivas para los estudios poblacionales: son altamente polimrficas, estn distribuidas por todo el genoma, son codominantes y, de forma general, selectivamente neutrales. Se han descrito numerosos loci microsatlites para diferentes especies de peneidos (Garca et al. 1994, 1996; Bagshaw et al. 1997;
1

Wolfus et al. 1997; Ball et al. 1998; Tassanakajon, et al.1998a; Moore et al. 1999; Xu et al. 1999; Pongsomboon et al. 2000; Espinosa et al. 2001; Cruz et al. 2002), sin embargo, slo unos pocos han resultado tiles para el estudio gentico de sus poblaciones. Los resultados obtenidos del anlisis de los loci microsatlites han mostrado dismiles patrones de diferenciacin, corroborando en algunos casos los generados por las aloenzimas (Benzie, 2000; Borrell et al. 2004). La mayora de los estudios genticos realizados hasta la fecha han empleado muestras puntuales en el tiempo, y por lo tanto han asumido que los patrones genticos observados son estables. De esta forma, la deteccin de diferencias entre las poblaciones son atribuidas a variaciones recientes de las frecuencias allicas. Sin embargo, las especies que se encuentran estructuradas genticamente pueden sufrir fluctuaciones demogrficas que en ocasiones consiguen afectar y/o causar cambios en la distribucin y abundancia de la diversidad gentica de sus poblaciones. Con el objetivo de esclarecer las causas y consecuencias de estas variaciones, algunos autores han examinado la estabilidad temporal de la diversidad y estructura gentica de las poblaciones mediante el anlisis comparativo de muestras antiguas y contemporneas. Estos estudios se han realizado en especies marinas y de agua dulce y en la mayora de stas se han evidenciado patrones de diversidad gentica estables durante perodos de tiempo relativamente largos, como ha ocurrido para el salmn del Atlntico (Salmo salar) (Nielsen et al. 1997, 1999, Tessier y Bernatchez 1999, Potvin y Bernatchez 2001), la trucha (Salmo trutta) (Hansen et al. 2002), el bacalao (Gadus morua) (Ruzzante et al. 2001), el sargo (Diplodus sargus) (Planes y Lenfant, 2002) y la platija (Pleuronectes platessa) (Hoarau et al. 2002). Sin embargo, tambin han sido referidas variaciones importantes en las frecuencias allicas en otras especies de truchas (Jorde y Ryman 1996, Heath et al. 2002, stergaard et al. 2003). Hasta el momento ningn anlisis de este tipo haba sido realizado para alguna especie de camarn. Entre los factores intrnsecos que pueden afectar la estabilidad de las frecuencias allicas en las poblaciones naturales se han descrito los efectos de la deriva gentica, que acta sobre poblaciones con un pequeo tamao censal o efectivo (Hartl y Clark 1997), y la varianza en el xito reproductivo (Hedgecock 1994; Flowers et al. 2002). Sin embargo, estudios ms recientes han manifestado que la existencia de ambientes inestables tambin puede generar variaciones significativas en la estructura gentica, reduciendo temporal o permanentemente, el tamao de las poblaciones y provocando su extincin en algunos casos (stergaard et al. 2003). Entre los factores intrnsecos que pueden afectar la estabilidad de las frecuencias allicas en las poblaciones naturales se han descrito los efectos de la deriva gentica, que acta sobre poblaciones con un pequeo tamao censal o efectivo (Hartl y Clark 1989), y la varianza en el xito reproductivo (Hedgecock 1994; Flowers et al. 2002). Sin embargo, estudios ms recientes han manifestado que la
2

existencia de ambientes inestables tambin puede generar variaciones significativas en la estructura gentica, reduciendo temporal o permanentemente, el tamao de las poblaciones y provocando su extincin en algunos casos (stergaard et al. 2003). Entre las especies de camarones peneidos que habitan el Atlntico Oeste, el camarn rosado Farfantepenaeus notialis Prez-Farfante 1967, es una de las ms ampliamente distribuidas, encontrndose desde la costa Este de Mxico, a travs de las Antillas, hasta Brasil, y tambin en las costas de frica, desde Angola hasta Cabo Verde (Prez-Farfante 1969). En Cuba, esta especie es la ms importante en trminos de abundancia. Habita la plataforma insular entre 10 y 20 m de profundidad, y luego del desove las larvas quedan a la deriva por un periodo de 15 a 20 das, conducidas aparentemente, a merced de las corrientes marinas, hacia las reas de cra en aguas poco profundas cercanas a las costas (Guitart et al. 1985; Pez et al. 1997). El camarn rosado constituye el segundo recurso pesquero de importancia para el pas, representando actualmente casi el 100% de las pesqueras nacionales (Sosa, comunicacin personal). No obstante, las capturas anuales, estimadas en un promedio de 6000 TM durante los aos 1976 a 1980, han ido disminuyendo paulatinamente en el Golfo de Ana Mara, y llegaron a colapsar en el Golfo de Bataban (Baisre y Zamora, 1983). A pesar de las regulaciones establecidas oficialmente para la proteccin de este recurso pesquero, se observ que de las 4500 TM que se capturaban anualmente en la dcada de los aos 80, ocurri un descenso importante en el ao 1998 a 1239 TM (Sosa et al. 1999), y actualmente se pesca un promedio de 968 TM por ao (Sosa, comunicacin personal). Esta tendencia a la disminucin de las capturas ha sido relacionada con el efecto combinado de la explotacin intensa por las pesqueras comerciales y con el impacto que han causado las perturbaciones ecolgicas ocurridas durante las ltimas tres dcadas en las principales zonas de pesqueras (Sosa et al. 1999; Gonzles-Yaez y Bult, 2002). Varios autores han centrado sus estudios en la estructura y dinmica poblacional de F. notialis (Prez et al. 1981; 1984, Revilla y Pez 1990; Espinosa et al. 1996; Pez et al. 1997; 1998; 1999; Pez y Utset 1998). En algunos casos estas investigaciones se han realizado mediante el empleo de marcadores aloenzimticos (Villaescusa et al. 1984; Labacena, et al. 1994; Espinosa et al. 1996), ofreciendo alguna informacin acerca de la variabilidad existente entre las poblaciones. Pero, ninguna ha brindado elementos que reflejen las afectaciones que se han podido producir en la diversidad y estructura gentica de sus poblaciones. Solamente el estudio realizado para evaluar los resultados de un proyecto de repoblacin en el Golfo de Bataban (Espinosa et al. 1996) demostr la existencia de diferencias significativas entre dos poblaciones separadas por 15 Km, sugiriendo que en esta especie el intercambio de individuos puede estar limitado a pequeas distancias geogrficas.
3

Teniendo en cuenta las interrogantes que existen con respecto al nivel de diversidad gentica presente en las poblaciones de F. notialis que habitan la plataforma Sur de Cuba, a la existencia de poblaciones aisladas genticamente, en relacin al flujo gentico existente entre ellas, as como con algunas evidencias de fluctuaciones de las frecuencias allicas en el tiempo, nos planteamos la siguiente hiptesis: Las caractersticas geogrficas y los factores fsicos imperantes en las reas ocupadas por el camarn Farfantepenaeus notialis, as como algunos aspectos de su biologa, determinan la existencia de una estructuracin poblacional significativa que puede variar tambin significativamente en el tiempo. Para demostrar esta hiptesis nos trazamos los siguientes objetivos: Analizar la diversidad y estructura gentica de las poblaciones de F. notialis de los Golfos de Ana Evaluar la estabilidad temporal de los patrones de diversidad y estructura gentica, mediante el Mara y Bataban empleando loci aloenzimticos y microsatlites. anlisis de la variacin de las frecuencias allicas de loci aloenzimticos y microsatlites en los aos 1995, 1999 y 2003. Evaluar el polimorfismo de sitios de restriccin de un fragmento amplificado del ADN mitocondrial, comprendido entre los genes COI y COIII, en las muestras colectadas en el ao 1995 en los Golfos de Bataban, Ana Mara y Guacanayabo. Analizar las posibles causas de las variaciones espacio-temporales de la diversidad y estructura gentica de las poblaciones de F. notialis. Novedad Cientfica: Se analiza, por primera vez en la comunidad cientfica, la estabilidad temporal de los patrones de diversidad y estructura gentica de las poblaciones de una especie de peneido; se describen por primera vez en la literatura cientfica, loci microsatlites polimrficos especie-especficos; se realiza, por primera vez en la comunidad cientfica y por un mismo grupo de investigadores, el estudio de las poblaciones de una especie de peneido mediante el anlisis comparativo de loci aloenzimticos, ADN microsatlite y ADNmt; y se describe por primera vez en la literatura cientfica, la estructura gentica de las poblaciones de la especie F. notialis, que habitan la plataforma Sur de Cuba. Importancia terica: Los resultados de este trabajo aportan nuevos elementos que complementan los conocimientos existentes sobre la biologa y la ecologa de F. notialis, desde el punto de vista gentico, lo cual contribuye a esclarecer la dinmica de sus poblaciones; se demuestra, utilizando tres marcadores moleculares, la existencia de diferencias genticas entre las poblaciones de F. notialis a una escala microgeogrfica (decenas de kilmetros), y por lo tanto se ofrecen evidencias de que la deriva de las larvas y la migracin de los adultos, contrariamente a lo planteado a partir de estudios pesqueros, no cumplen con los propuestos anteriormente por otros autores; se brinda informacin referente a la
4

variacin temporal de los patrones de diversidad y estructura de gentica, lo cual resulta de gran importancia para comprender la dinmica de las poblaciones del ambiente marino, particularmente la de los camarones peneidos. Los resultados a partir del anlisis comparativo de aloenzimas, ADN microsatlite y ADNmt, confirman la necesidad de abordar los estudios poblacionales y evolutivos mediante el empleo de diferentes marcadores moleculares, ya que la complementacin de sus resultados permite esclarecer los patrones de estructuracin observados en las poblaciones. Se ofrece informacin acerca de los posibles efectos que ejercen los factores dependientes de la biologa y ecologa de la especie, los provocados por eventos climatolgicos, y los suscitados por la accin directa del hombre, como promotores de la accin de las fuerzas evolutivas en la dinmica de las poblaciones de F. notialis. Importancia prctica: En este trabajo se ofrecen datos que permiten hacer recomendaciones que complementan las medidas establecidas para la explotacin sostenible del segundo recurso pesquero de importancia econmica del pas, pues al demostrarse la existencia de una estructura gentica significativa en las poblaciones naturales de F. notialis, se impone la necesidad de que se consideren las estrategias que han sido implementadas hasta la fecha.

Materiales y Mtodos
Procesamiento de las muestras. Se colectaron ejemplares adultos, hembras y machos de la especie Farfantepenaeus notialis en los Golfos de Ana Mara, Guacanayabo y Bataban en los aos 1995, 1999 y 2003 (Tabla 1).
Tabla 1. Sitios de muestreo, cantidad de individuos colectados por localidad y cuadrcula de pesca (entre parntesis), y
marcadores moleculares analizados en cada caso. Ao y meses de colecta 1995 (Marzo) 1999-2000 (Septiembre-Febrero) 2003 (Junio-Julio)

Marcador Molecular Aloenzimas ADNmt Microsatlites Microsatlites Aloenzimas y Microsatlites Localidad de colecta Tamao de muestra Golfo de Bataban 15 15 50 Rosario (64) Mayabeque (66) 15 15 50 50 Caimito (62) 15 15 Golfo de Ana Mara 40 15 30 Manat a Florida (68-69) 40 50 50 M. Gomez (129-130) 40 15 30 50 M. Gomez (127-128) 50 50 Sta. Cruz Abajo (19) 40 50 50 Palomo (12) b 40 15 30 50 Tunas de Zaza (78) 21 15 16 30 Jcaro (71) 49 Sta. Cruz Arriba (86) 40 50 Golfo de Guacanayabo Guayabal (88) 20 a: La cuadrcula de muestreo no pudo precisarse, b: La cuadrcula de muestreo no pudo precisarse en el ao 1995.

Se analizaron un total de 22 loci aloenzimticos: Glutamato deshidrogenasa (1.4.1.2), Peroxidasa (1.11.1.7), Carboxilesterasa (3.1.11), Lactato deshidrogenasa (1.1.1.27), Aspartato Aminotransferasa (2.6.1.10), Fosfoglucomutasa (2.7.5.1) y Protenas totales; que fueron resueltos mediante electroforesis en
5

geles de poliacrilamida al 7.5-10%, y Malato Deshidrogenasa (1.1.1.37) y Fosfoglucomutasa (2.7.5.1), en geles de almidn hidrolizado al 12%. Las electroforesis se corrieron bajo una corriente de 40 mA entre 150 y 200 V por un perodo de 5 a 6 horas. La deteccin de los sistemas enzimticos se llev a cabo sando tcnicas especficas de revelado (Shaw y Prasad, 1970; Harris y Hopkinson, 1976; Richardson et al. 1986). La obtencin del ADN total, para el anlisis del ADNmt, se realiz, a partir de 30 y 50 mg de tejido de plepodo, segn Garca-Machado et al. (1993). Se amplific un segmento de 2027pb entre los genes COI y COIII, empleando los oligonucleotidos COI4 y COIII4, (Garca-Machado et al. 1999). Las condiciones de la reaccin fueron: 0.1 g de ADN, tampn de amplificacin 1X, 250 M de dNTPs, 2 mM de MgCl2, 100 g/mL de BSA, 200nM de cada oligonucletido, 2.5 u de Taq Polimerasa (Promega) y agua desionizada estril hasta 100 L. El programa incluy 3min a 93C y 35 ciclos del siguiente perfil: 45s a 93C, 1min a 50C, 2min, y 30 s a 72C, y 5min a 72C de extensin. Los productos de amplificacin fueron digeridos con 12 endonucleasas de restriccin (AluI, AvaII, HaeIII, HincII, HinfI, HpaII, NsiI, DdeI, DraI, Sau3AI, SspI y TaqI). Las reacciones se realizaron con 200ng de ADN, 5u de enzima, buffer de reaccin de la enzima 1X, y agua destilada hasta 20L final, y se incubaron a la temperatura ptima de trabajo de la endonucleasa por 6 horas. Los fragmentos obtenidos de las reacciones fueron separados en geles de poliacrilamida entre 5 y 7%, y en geles de agarosa NewSieve GTG entre 2 y 4% preparados con tampn TBE 1X. Los fragmentos se revelaron con BrEt 0.5 g/mL y luz UV, en el caso de los geles de agarosa, y segn Caetano-Anolls et al. (1993), en el caso de los geles de poliacrilamida. Para la caracterizacin del ADN microsatlite, se construy una genoteca parcial segn Estoup y Cornuet (1994), a partir ADN total extrado segn Garca-Machado et al. (1993). El ADN plasmdico se obtuvo por el mtodo minialcalino (Sambrook et al. 1989). Las reacciones de secuencia se realizaron segn el mtodo de Sanger et al. (1977) con el Thermosequenase Radiolabeled terminador Cycle Sequencing Kit (Amersham). Las secuencias fueron resueltas mediante electroforesis en geles desnaturalizantes de poliacrilamida al 6%, a 60W y 2000V empleando el tampn TBE 1X. Los geles se revelaron segn Sambrook et al. (1989). La seleccin de los loci microsatlite se realiz segn Estoup (1993), y la amplificacin de los loci microsatlites, a partir del ADN total extrado segn Walsh et al. (1991). Las reacciones de PCR se realizaron con 2 L del Tampn de PCR 10X, 1u de Taq Polimerasa (Promega), 1 L de la muestra, 200 nmol de cada oligonucletido, 200 mM de dNTPs, MgCl2 a la concentracin ptima, y agua destilada estril hasta 20 L. El programa de amplificacin consisti en: 94C por 3 min, 40 ciclos de 94 C por 45s, 45s a la temperatura ptima, 72C por 2 min 30s, y 72 C
6

por 10min. Los productos de PCR fueron desnaturalizados por 5min a 95C con 5L de tampn de carga, y separados en geles desnaturalizantes de poliacrilamida al 5 y 6%. El revelado de los geles se efectu segn Caetano-Anolls et al. (1993). Procesamiento estadstico. Para el anlisis de las aloenzimas, se consider polimrfico el locus en el cual la frecuencia del alelo ms comn no excediera el 95%. La neutralidad de los loci polimrficos se comprob mediante la prueba de Ewens-Waterson (Ewens, 1972; Watterson 1978) implementado en el programa ARLEQUIN (Schneider, 1992). Para conocer la dependencia entre el sexo y los genotipos por locus, se calcul el estadgrafo 2 utilizando el programa ChiRxC (Zaykin et al. 1993). El desequilibrio por ligamiento gentico entre pares de loci se estim mediante la prueba exacta de Fisher siguiendo el algoritmo de Cadenas de Markov (Guo y Thompson, 1992). Las frecuencias allicas, A y ag, se determinaron usando el programa FSTAT 2.9.3 (Goudet, 2001). La Ho y He, mediante la expresin de Nei (1987) y sus desviaciones estndar, mediante simulaciones, empleando el programa GENETIX (Belkhir et al, 2000). Estos parmetros fueron comparados entre poblaciones de un mismo ao de colecta, y entre rplicas temporales de las muestras, mediante permutaciones empleando el programa FSTAT 2.9.3 (Goudet, 2001). Tambin utilizando el programa STATISTICA 6.0 empleando un ANOVA de clasificacin simple para comparar los valores promedios de Ho y He, y la prueba de comparacin de rangos de medias de Kruskall-Wallis (Siegel y Castellan, 1988) para los de A y ag, entre las poblaciones de un mismo ao de colecta. Los valores promedios de Ho y He entre las rplicas temporales se compararon usando una prueba t de Student (Student, 1908), y los de A y ag, con una prueba U de Mann-Whitney (Mann y Whitney, 1947). Las desviaciones del equilibrio de Hardy-Weinberg se estimaron mediante el estadstico Fis (Wright, 1965), segn Weir y Cockerham (1984). Las comparaciones de las frecuencias allicas y genotpicas entre pares de poblaciones, se realizaron mediante el algoritmo de Cadenas de Markov (Guo y Thompson, 1992), implementado en el programa GENEPOP versin 3.3 (Raymond y Rousset, 1995a). Para los anlisis de comparaciones mltiples, excepto los anlisis de frecuencia, se ajust el nivel de significacin aplicando la correccin de Bonferroni (Rice, 1989). El ndice de diferenciacin entre las poblaciones (FST) se estim por pares de poblaciones en cada ao, y entre aos de colecta. La significacin se obtuvo mediante permutaciones entre grupos de muestras, empleando el programa FSTAT 2.9.3 (Goudet, 2001). El grado de diferenciacin en el tiempo fue estimado mediante un AMOVA (Excoffier et al. 1992; Michalakis y Excoffier, 1996) implementado en el programa ARLEQUN (Schneider et al. 1997). Los ndices de distancia se calcularon segn Nei (1978) utilizando el programa GENETIX (Belkhir et al. 2000), y se utilizaron para construir un rbol UPGMA (Sneath y Sokal, 1973) mediante el programa MEGA ver. 2.1 (Kumar et al. 2001). El flujo gentico se calcul
7

como Nem=[(1/FST) -1]/4 (Wright, 1965), y se realiz una prueba de Mantel (Mantel, 1967) implementada en el programa GENETIX (Belkhir et al. 2000). Los estimados de Ne se obtuvieron empleando la frmula de Kimura y Crow (1964), considerando una tasa de mutacin de =10-7. La estimacin de los parmetros de diversidad y diferenciacin gentica para los loci microsatlites, se realiz de igual forma que para las aloenzimas, con algunas particularidades. Las frecuencias de alelos nulos se calcularon segn Brookfield (1996). Para estimar los niveles de diferenciacin gentica, se emplearon adems de los estadsticos F (Wright, 1965), el estadstico Rst (Goldstein et al.1995). Las desviaciones estndar y los intervalos de confianza para el 95%, se obtuvieron mediante mtodos de remuestreo implementados en el programa RSTCalc (Goodman, 1997). El Ne se estim empleando las frmula de Ohta y Kimura (1973) y de Kimura y Crow (1964) asumiendo los modelos SMM y IAM, respectivamente y considerando una tasa de mutacin de =10-4 segn Chakraborty y Kimmel (1999). La reduccin del Ne, se evalu mediante el clculo de M (Garza y Williamson, 2001). La significacin se obtuvo a travs del clculo del valor crtico Mc asumiendo que un 10% de los loci evolucionan bajo IAM y un 90% bajo SMM. Las diferencias nucleotdicas entre los genotipos de ADNmt se estimaron segn Nei y Li (1979), y su desviacin estndar mediante re-muestreo, usando el programa RESTSITE (Miller, 1990). La diversidad haplotpica, se estim segn (Nei y Tajima, 1981).

Resultados
Anlisis espacio temporal de la diversidad gentica y estructura poblacional de F. notialis utilizando aloenzimas. El anlisis gentico bioqumico, se realiz sobre la base de 22 loci aloenzimticos, de los cuales Akp3, AmyB, Est3, Gdh, GP7, y Per1 resultaron polimrficos. El nmero promedio de alelos por locus, para las muestras colectadas en 1995, oscil entre 2.8 para GP7 y 3.6 para Gdh, y las frecuencias allicas presentaron una gran variabilidad entre las poblaciones. En la mayora de las poblaciones el alelo ms frecuente fue el b, para todos los loci, con pocas excepciones. Los resultados del anlisis de la diversidad gentica en el ao 2003 indicaron que el nmero medio de alelos por locus oscil entre 2.75 en Per1 y 3.87 para Gdh, y la frecuencia de los alelos tambin vari entre los loci, oscilando entre 0.025 para Gdh en Santa Cruz Arriba y 0.82 para Per1 en la misma localidad. De forma general se observ una disminucin de las frecuencias del alelo b respecto a 1995 con un consecuente incremento en la frecuencia de los alelos que estaban menos representados. Esta movilidad prevaleci en todos los loci excepto para GP7 en Florida, Manuel Gmez y Santa Cruz Abajo donde a fue el alelo ms frecuente. En 1995, A oscil entre 2. y 3.17, y mostr diferencias no significativas H(gl=6,
N=42)=4.31

, p=0.63. De

manera similar, los estimados ag tampoco se diferenciaron (H(gl=4, N=30)=0.58, p=0.97). En el ao 2003, aunque A no vari significativamente con respecto a los de 1995 (U(gl=36, N=42)=564, p=0.08), ag mostr un
8

incremento significativo (U(gl=36,

N=30),

p<0.001). Los valores promedio de He en 1995 y 2003,

N=41; 36)=-7.66,

evidenciaron diferencias significativas entre ambos aos de colecta t(gl=75,

p<0.001). El

anlisis de ligamiento entre pares de loci evidenci que se encontraban en equilibrio de ligamiento en todos los casos y en HWE para un nivel de significacin del 5%, luego del ajuste para pruebas mltiples de Bonferroni (=0.00064, 78 comparaciones). Los valores de FST estimados en el ao 1995 por pares de poblaciones fueron significativos en todos los casos, excepto entre Manat y Manuel Gmez. Como resultado de las pruebas de Mantel entre las matrices de distancias geogrficas y de ndices de diferenciacin gentica (FST), para las muestras colectadas en el Golfo de Ana Mara durante 1995, se obtuvo que no existe correlacin con un coeficiente no significativo (r=0.342, Z=786.6, p=0.386). Para las poblaciones colectadas en el 2003, se observan diferencias significativas, solamente entre las poblaciones de ambos Golfos. Los menores valores de diferenciacin se encontraron entre las poblaciones ms cercanas geogrficamente y los niveles de migracin entre estas resultaron los ms elevados. Las rplicas temporales de las poblaciones mostraron diferencias altamente significativas en todas las comparaciones. El rbol UPGMA obtenido a partir de los estimados de distancia gentica (Nei ,1978) (Figura 1), muestra dos grupos bien definidos, uno que contiene las poblaciones colectadas en 1995 y otro compuesto por las poblaciones del 2003, mientras que la localidad de Tunas de Zaza se separa de ambos grupos.
Figura 1. rbol UPGMA no enraizado obtenido a partir de la matriz de distancias de Nei (1978), que muestra la relacin existente entre las poblaciones de cada ao de colecta, en el Golfo de Ana Mara y el Golfo de Bataban. La barra indica la equivalencia entre la longitud de las ramas y la unidad indicada de distancia gentica.

El nodo correspondiente al ao 1995 mostr una dicotoma, que congrega por una parte, las localidades de Manat, Manuel Gmez y Santa Cruz Abajo, ubicadas hacia la parte ms externa del Golfo, y por otra a Florida, Palomo y Santa Cruz Arriba. Las dos primeras se localizan en el centro del Golfo. La unin de Santa Cruz Arriba en este grupo es aparentemente aleatoria, teniendo en cuenta su posicin geogrfica ms cercana a Manuel Gmez y Santa Cruz Abajo. Tunas de Zaza, ubicada en el extremo Este del Golfo, se separa del resto, mostrando los mayores valores de distancia, en correspondencia con las los estimados de FST. En el nodo del 2003, a pesar de que los valores de FST por pares de poblaciones indican
9

diferencias no son significativas entre las localidades del Golfo de Ana Mara, se mantienen las principales relaciones observadas entre las poblaciones colectadas en 1995. Las localidades del Golfo de Bataban se agrupan separndose de las poblaciones del Golfo de Ana Mara. Las particiones mostradas en el rbol fueron consistentes con los resultados del AMOVA. El 12.47% de la variacin se distribuye entre las muestras de los diferentes aos de colecta con un componente de varianza significativo (b=0.02,
SC=0.119, p<0.001), mientras que el 1.41%, entre las del mismo ao, con un componente de varianza

significativo (b=0.007, SC=0.014, p<0.001). El estimado del tamao efectivo poblacional (Ne) oscil, para las localidades colectadas entre 181540 en Palomo (1995) y 444641 en Florida (2003). Anlisis espacio-temporal de la diversidad gentica y estructura poblacional utilizando loci microsatlites Las frecuencias de los alelos para cada locus microsatlite vari considerablemente de un ao a otro. En 1995, A fluctu entre 7.4 y 10.8; en 1999, entre 9.8 y 13.4; y en el ao 2003 vari entre 10.2 y 11.5 en. Sin embargo, la comparacin entre las localidades dentro de cada ao mostr diferencias no significativas(H(gl=6, N=35)=6.18, p=0.4; H(gl=7, N=40)=3.35, p=0.85; y H(gl=5, N=30)=0.42, p=0.99) para 1995, 1999 y 2003 respectivamente. No obstante, la comparacin entre las rplicas temporales de las poblaciones ofreci como resultado que el nmero de alelos vari significativamente entre los aos 1999 y 2003 (H(gl=2, N=105)=19.57, p<0.001). Los estimados de ag tapoco variaron significativamente dentro de cada ao de colecta (F(N=28)=0.16, p=0.98; F(N=32)=0.13, p=0.99; y F(N=24)=0.11, p=0.99) para 1995, 1999 y 2003 respectivamente, pero, al igual que A, evidenciaron diferencias significativas entre los aos 1999 y 2003 (F(N=102)=16.84, p<0.001). Los valores de He resultaron altos con un valor promedio de He=0.836 0.0052 en 1995, He=0.836 0.0036 en 1999 y He=0.812 0.0047 en el 2003. La comparacin de los estimados resultaron no significativos dentro de cada ao (F(N=28)=0.3, p=0.91 en 1995, F(N=32)=0.17, p=0.99 en 1999, y
F(N=24)=0.76, p=0.59 en el 2003) y entre los aos de colecta (F(N=102)=1.09, p=0.34).

El anlisis de desequilibrio de ligamiento mostr valores significativos en todas las comparaciones; y el anlisis del ajuste de las frecuencias allicas al HWE, luego de aplicar la correccin de Bonferroni (=0.00048, 105 comparaciones) reflej que las poblaciones colectadas en 1995 estaban en equilibrio para la mayora de los loci. Las excepciones fueron el locus PnS01 en Palomo (FIS=0.518, p=0.0000), y el locus PnS18 en las localidades de Manuel Gmez (FIS=0.420, p=0.0000), Palomo (FIS=0.319, p=0.0002),
Manat (FIS=0.469, p=0.0000), Rosario (FIS=0.723, p=0.0000) y Caimito (FIS=0.582, p=0.0000). En las muestras

colectadas en 1999, al igual que en 1995, el locus PnS18 mostr desviaciones significativas del equilibrio gentico en todas las localidades. Las muestras colectadas en el ao 2003 tambin reflejaron desviaciones significativas del HWE. En este caso, los loci que ms contribuyeron al desequilibrio fueron el PnS01 en Florida (FIS =0.371, p=0.0000), Santa Cruz Arriba (FIS =0.295, p=0.0000) y Mayabeque (FIS =0.473, p=0.0000), el PnS03 en todas las poblaciones, y el PnS04 en Santa Cruz Abajo y Manuel
11

Gmez. El locus PnS20 se desvi significativamente del HWE en Rosario (FIS =0.296, p=0.0000), y el PnS18 se ajust al equilibrio en todas las localidades. En todos los casos el desequilibrio se manifest producto de un dficit de heterocigotos. Aunque la mayora de las amplificaciones fueron exitosas, no todas las muestras rindieron productos de amplificacin para todos los loci, particularmente para el locus PnS18 en 1995 y 1999. Por esta causa, y teniendo en cuenta que este locus mostr desviaciones de las proporciones del equilibrio gentico en todas las localidades para ambos aos de muestreo, se estim la frecuencia de alelos nulos. Los estimados resultaron elevados oscilando entre 0.186 en Palomo y 0.550 en Rosario para las muestras de 1995, y entre 0.186 en Tunas de Zaza y 0.44 en Mayabeque, para las muestras de 1999. Por otra parte y considerando la presencia de estos alelos, se realiz nuevamente el anlisis del ajuste de las frecuencias allicas al HWE, y se obtuvo que todas las poblaciones colectadas en 1995 y en 1999 se ajustaban al equilibrio luego de aplicar la correccin de Bonferroni (=0.00048, 105 comparaciones). Los estimados de FST por pares de poblaciones, en 1995 revelaron diferencias significativas entre todas las poblaciones del Golfo de Ana Mara. Tunas de Zaza, Palomo y Manat tambin mostraron diferencias significativas al ser comparadas con las localidades del Golfo de Bataban. Los mayores niveles de diferenciacin fueron encontrados entre Tunas de Zaza y el resto de las localidades. Entre las localidades colectadas en 1999 no se observaron diferencias significativas en ninguno de los casos. De manera similar, en el ao 2003, solamente se observaron diferencias significativas entre las poblaciones de los Golfos de Ana Mara y Bataban. Los mayores valores de diferenciacin se observaron entre las poblaciones de los diferentes aos de colecta.
Manuel Gmez (M) Mayabeque (N) Manat (A) Rosario (R) Palomo (P) Tunas de Zaza (T) Caimito (C) Manuel Gmez (M) Sta. Cruz Arriba (S1) Sta. Cruz Abajo (S2) Florida (F) Caimito (C) Rosario (R) Manuel Gmez (M1) Sta. Cruz Abajo (S2) Jcaro (J) Mayabeque (N) Palomo (P) Manuel Gmez (M) Florida (F) Tunas de Zaza (T)
0.05

El anlisis de las distancias

1995

genticas mediante el rbol UPGMA (Figura 2) evidenci que las relaciones ms distantes se encuentran entre las rplicas temporales de las poblaciones. El AMOVA indic la existencia de componentes de varianza significativos entre las muestras de los diferentes aos de colecta, mayores que el existente entre las muestras de cada ao.
12

2003

1999

Figura 2. rbol UPGMA no enraizado obtenido a partir de la matriz de distancias

de Nei (1978), que muestra la relacin existente entre las poblaciones de cada ao de colecta en el Golfo de Ana Mara y el Golfo de Bataban. La barra indica la longitud de las ramas equivalente a la unidad indicada de distancia gentica

El 0.16% de la variacin se distribuy entre las muestras de 1995 y 1999 con un componente de varianza significativo (b=0.0008, SC=0.00156, p<0.001), el 0.21% (b=0.0011, SC=0.00215, p=0.017) entre las de 1999 y 2003, y el 0.97% (b=0.0048, SC=0.0096, p<0.001) entre 1995 y 2003. El tamao efectivo poblacional en cada localidad segn el modelo IAM fueron de 11157 para 1995, 13054 para 1999 y de 9730 para el 2003; mientras que de acuerdo al SMM, fueron 1292, 1242 y 1297 para cada ao respectivamente Anlisis del polimorfismo de sitios de restriccin, de un fragmento amplificado del ADNmt, en poblaciones colectadas en 1995 El anlisis del polimorfismo de sitios de restriccin del ADN mitocondrial, se amplific el fragmento de 2027pb entre los genes COI y COIII. Se utilizaron 12 endonucleasas de restriccin (AluI, AvaII, HaeIII,
HincII, HinfI, HpaII, NsiI, DdeI, DraI, Sau3AI, SspI y TaqI), de las cuales dos (DdeI y TaqI) presentaron sitios

polimrficos. La combinacin de sitios permiti identificar dos haplotipos. Las muestras de las localidades del Golfo de Bataban presentaron la variante B determinada por la ganancia de dos sitios de restriccin en el fragmento de 1064 pb del genotipo A, para la enzima DdeI, y por la prdida de dos sitios de restriccin para la enzima TaqI. Las localidades de los Golfos de Ana Mara y Guacanayabo compartieron el haplotipo A (Tabla 2).
Tabla 2. Genotipos identificados a partir del anlisis de los sitios de restriccin reconocidos por las endonucleasas de restriccin DdeI y TaqI. Se muestra el tamao en pares de bases (pb) de los fragmentos.
Genotipos Golfos de Ana Mara y Golfo de Bataban Guacanayabo DdeI TaqI DdeI TaqI 738a 907 383 633 323 150a a 261 142a 147 132 110 63 63a a: las tallas de los fragmentos fueron estimadas a partir de las 1064 383 323 147 110 907 633 292 132 63 distancias de migracin medidas en los geles

La diversidad nucleotdica () estimada a partir de los resultados obtenidos fue de 0.0096, mientras que la diversidad haplotpica (h) result igual a 0.5035. La divergencia fue evolutiva de los en genotipos estimada

d=0.03850.01603.

Discusin
Diversidad gentica de las poblaciones de F. notialis Los primeros estudios realizados en especies de peneidos, empleando loci aloenzimticos, evidenciaron bajos niveles de variabilidad, indicando que menos del 40% de los loci estudiados resultan polimrficos, con un nmero promedio de alelos por locus entre 1.06 y 1.56 (Benzie, 2000). Nuestros resultados, a diferencia de los que se resumen por este autor, muestran que el nmero promedio de alelos (2.3 a 3.5) es superior al observado para los diferentes loci estudiados en otras especies, indicando una mayor diversidad gentica para F. notialis.

12

El anlisis de los sistemas aloenzimticos seleccionados indic, al igual que para otras especies de peneidos (De Matthaeis et al. 1983; Mulley y Latter, 1981; Alonso et al. 1987, De la Rosa-Vlez et al. 2000), que varios loci de los sistemas de Amilasas, Peroxidasas, Glutamato deshidrogenasa, Esterasas y Protenas Totales son polimrficos. El locus Gdh, junto a los loci Per, haban sido referidos por Hedgecock et al. (1982), como poco variables en los crustceos, y como monomrficos para varias especies de peneidos (Mulley y Latter, 1981). Sin embargo, los resultados obtenidos por Labacena et al. (1994), a partir del anlisis de las poblaciones de F. notialis del Golfo de Bataban, muestran que este locus es uno de los ms variables e incluso refieren la presencia de un quinto alelo. Las diferencias, en cuanto al polimorfismo encontrado para este sistema, est relacionada con el tipo de soporte empleado para su separacin. De esta forma, los loci que haban sido referidos como poco variables o monomrficos en los anlisis sustentados en el uso de geles de almidn, han sido encontrados como polimrficos al ser resueltos en geles de poliacrilamida (Alonso et al. 1987; Espinosa et al. 1989). A partir de la caracterizacin del ADN microsatlite de F. notialis, encontramos que slo cinco de los veinte loci analizados resultaron tiles para el anlisis gentico de sus poblaciones. El nmero de alelos result elevado (entre 12 para PnS01 y 25 para PnS03 y PnS20), lo cual ha sido una constante para los loci microsatlites de las especies de peneidos, observndose un aumento del nmero de alelos, consecuentemente con el aumento de la longitud del locus. El nmero promedio de alelos por locus y la riqueza allica para cada ao de colecta, se hallaron tambin, entre los valores referidos para otras especies de peneidos (Benzie 2000; Xu et al. 2001; Ball y Chapman 2003; Maggioni et al. 2003; Borrell et al. 2004). La estimacin de los valores de Ho y He, a partir del anlisis de los loci aloenzimticos, para las poblaciones muestreadas en 1995, se encontraron entre los ms altos de los referidos para otras poblaciones de peneidos (0.007-0.119) (revisado por Benzie, 2000), mientras que en el ao 2003, resultaron superiores. De igual forma, los valores de Ho y He, obtenidos a partir del anlisis de los loci microsatlites en los aos 1995, 1999 y 2003, resultaron similares a los referidos para otros camarones peneidos (Tassanakajon et al. 1998a, 1998b; Brooker et al. 1999; Xu et al. 2001; Ball y Chapman, 2003; Maggioni et al. 2003). Las poblaciones analizadas durante los aos 1995 y 2003 se ajustaron a las proporciones del equilibrio gentico de Hardy-Weinberg (HWE), para todos los loci aloenzimticos, como lo indican los valores globales no significativos de FIS para cada ao. El valor global de FIT para 1995, result significativo debido a la subestructuracin geogrfica existente entre las poblaciones del Golfo de Ana Mara, que evidencia un dficit de heterocigotos cuando se analiza el conjunto de subpoblaciones. Sin embargo, en

14

el 2003 el valor de FIT es no significativo, lo cual indica que estas subpoblacionesson genticamente homogneas, probablemente por el efecto de las migraciones. El desajuste de las frecuencias allicas de loci microsatlites a las proporciones de HWE ha sido observado con frecuencia durante el anlisis de las poblaciones de diferentes especies de camarn. Tal es el caso de las especies L. setiferus (Ball y Chapman, 1998, 2003) y P. monodon (Xu et al. 2001) para las cuales se detect un exceso de individuos homocigotos, fundamentalmente en aquellos loci que presentaban un mayor nmero de alelos y de unidades repetitivas. Los autores argumentaron la presencia de alelos nulos y el efecto Wahlund, como las causas ms probables de este desequilibrio. Los resultados de este trabajo indican que el desequilibrio encontrado para el locus PnS18 en las poblaciones de los aos 1995 y 1999 podra deberse a la presencia de alelos nulos. Para llegar a esta conclusin nos apoyamos en tres evidencias: el locus aparece en desequilibrio gentico en la mayora de las poblaciones para ambos aos de muestreo, debido a un dficit de heterocigotos; aunque la mayora de las muestras amplificaron exitosamente el resto de los loci microsatlites, muchas no lo hicieron para el locus PnS18; por ltimo, los estimados de las frecuencias de alelos nulos (entre 18.6% y 53%) resultaron elevados de acuerdo a los valores informados por Jarne y Lagoda (1996) y por Ball y Chapman (1998). Para corroborar esta hiptesis se analiz nuevamente el ajuste de las frecuencias allicas al HWE, asumiendo la presencia de estos alelos segn Xu et al. (2001) y se obtuvo que las localidades colectadas durante 1995 y 1999 se encontraban en equilibrio para este locus. Por otra parte, no todos los loci microsatlites varan de igual manera, y en ste, como puede observarse en la estimacin comparativa de los valores de FST y RST, las mutaciones parecen influir ms que la deriva gentica (Balloux y Lugon-Moulin, 2002), lo cual puede ser determinante en la generacin de alelos nulos. Contrariamente a lo ocurrido en los aos 1995 y 1999, todas las frecuencias allicas de las muestras colectadas en el ao 2003, se ajustaron a las proporciones del equilibrio para el locus PnS18. Sin embargo, el locus PnS03 apareci en desequilibrio en todas las localidades excepto Rosario, luego de ajustar el nivel de significacin mediante la correccin de Bonferroni. La ausencia de homocigotos para alelos nulos en este locus, hizo descartarlos como la causa del desequilibrio. En este caso, podra argumentarse que el tamao de muestra (cincuenta individuos) no haya sido suficiente para representar la totalidad de los alelos de este locus, lo cual concuerda con lo planteado por Pongsomboon et al. (2000) para loci que presentan un nmero elevado de alelos. La significacin de los valores de FIS de cada uno de los loci para el global de las poblaciones en los tres aos de muestreo, a pesar de que se encuentran en equilibrio en la mayora de las poblaciones, se podra explicar por la gran varianza de las frecuencias allicas de estos loci debido a su elevado nmero de
15

alelos. Los valores globales significativos de FIT y FST para el 1995 corroboran la subestructuracin existente entre las poblaciones del Golfo de Ana Mara en ese ao. Para los aos 1999 y 2003, la significacin de los valores podra ser consecuencia de las diferencias en las frecuencias allicas entre las localidades de los Golfos de Ana Mara y Bataban, cuyo efecto sobre el valor global de FIT puede estar enmascarando la homogeneidad gentica de las poblaciones en el Golfo de Ana Mara, constatada a partir de los estimados de FST por pares de poblaciones en estos aos. La diversidad observada en las poblaciones de F. notialis, a partir del anlisis del polimorfismo de sitios de restriccin del ADNmt, contrariamente a los resultados obtenidos a partir del anlisis de los loci nucleares, result baja con un valor de diversidad nucleotdica () del 0.96%. Este valor, aunque es ligeramente superior al referido por Benzie et al. (2002) cuando analiza el genoma completo de algunas poblaciones de P. monodon del Oeste de Australia y del Sureste de frica, resulta extremadamente pequeo si se compara con el referido por Garca-Machado et al. (1993), cuando analiz la secuencia del gen ARNr-16S en poblaciones de esta misma especie (2.4%, considerando las inserciones y deleciones). Tambin resulta menor que los valores, entre 1.2 y 3.3, informados para las especies P. monodon, L. setiferus y F. aztecus, obtenidos a partir de la secuenciacin de la regin no codificadora de este genoma (Benzie, 2000; MacMillen-Jacson y Bert, 2003, 2004). El bajo nivel de diversidad detectado a partir del anlisis del fragmento comprendido entre los genes COI y COIII, en las poblaciones de F. notialis, as como las diferencias detectadas en los valores de diversidad con respecto al de otras regiones en la misma especie, pudiera deberse a que los genes mitocondriales muestran diferencias en cuanto a sus tasas de mutacin (Avise, 1994). Aunque algunos de los genes comprendidos en el fragmento analizado (COI y los ARNts) se encuentran entre los ms conservados del ADNmt de los crustceos (Palumbi y Benzie, 1991), seleccionamos la regin porque se conoca, a partir de la secuencia parcial del genoma de esta especie (Garca-Machado et al. 1997), que presentaba sitios de reconocimiento para numerosas endonucleasas de restriccin y porque se abarcaba un 15.7% del genoma, lo cual aumentaba las probabilidades de encontrar sitios polimrficos. Estructura gentica de las poblaciones de F. notialis. El anlisis de la estructura gentica poblacional brind una informacin importante con respecto a la forma en que se encuentra distribuida la diversidad gentica, a lo largo del rea que ocupa la especie. Por otra parte, el anlisis complementario de varios marcadores con propiedades evolutivas diferentes permiti esclarecer la naturaleza de los patrones observados. La variabilidad gentica de las especies de peneidos, con diferentes estilos de vida, ha sido estudiada a travs del anlisis de loci aloenzimticos. Los primeros estudios describieron la ausencia de diferenciacin gentica entre poblaciones separadas por grandes distancias geogrficas (Proctor et al.
16

1974; Lester 1979; Mulley y Latter 1981; Hedgecock et al. 1982; Mattocia et al. 1987; Weber et al. 1993; Dall et al. 1990). Sin embargo, la ejecucin de estudios posteriores para algunas de estas especies, indic un alto nivel de estructuracin poblacional, an entre poblaciones cercanas geogrficamente (Richardson 1982; Benzie et al. 1992; De la Rosa-Vlez et al. 2000; Sugama et al. 2002; Espinosa et al. 2003). En las poblaciones de F. notialis, los resultados provenientes del anlisis de dos tipos de marcadores nucleares (aloenzimas y microsatlites) mostraron un patrn de estructuracin gentica espacio-temporal muy similar, evidenciando una marcada estructura gentica en el Golfo de Ana Mara en 1995. El anlisis de los loci microsatlites, particularmente en las muestras colectadas durante 1999, manifest la ausencia de diferenciacin entre las poblaciones del Golfo de Ana Mara y para el ao 2003 los resultados obtenidos por ambos marcadores evidencian diferencias entre los Golfos de Ana Mara y Bataban, coincidiendo con los resultados obtenidos a partir del ADNmt para las muestras colectadas en 1995. La comparacin de las frecuencias allicas y los estimados de FST por pares de poblaciones, revelaron que las mayores diferencias estn entre las rplicas temporales de las poblaciones, lo cual fue corroborado por los agrupamientos mostrados en los rboles y la representacin multidimensional de las distancias genticas entre las poblaciones. La distribucin de los componentes de varianza, de igual forma describen la separacin temporal de las muestras. La estructura detectada para el Golfo de Ana Mara en el ao 1995, como lo demuestran los estimados de FST por pares de poblaciones y el anlisis de distancias genticas a partir de loci aloenzimticos (Figura 1), evidenci un nivel de diferenciacin elevado entre localidades que se encuentran separadas por distancias geogrficas relativamente pequeas. Correspondientemente, el flujo gentico (Nem) existente entre estas poblaciones reflej, con valores entre 0.42 y 6.79, que la tasa de migrantes de acuerdo a la regla de un migrante por generacin (OMPG) (Whang, 2003) es suficiente para mantener los niveles de diversidad gentica en las poblaciones, sin que se afecte su estructura geogrfica. Tunas de Zaza mostr los mayores valores de FST y los menores de Nem, diferencindose significativamente de todas las localidades del Golfo de Ana Mara. Esta poblacin se encuentra relativamente aislada del resto de las localidades de este Golfo y se ubica frente a una zona de cra que podra tributarle exclusivamente. Un comportamiento similar ha sido observado para la poblacin de L. schmitti de Tunas de Zaza (Espinosa et al. 2003). Entre las localidades de Palomo y Florida, Santa Cruz Abajo y Manat, y entre Manuel Gmez y Manat, pudo apreciarse un menor nivel de diferenciacin que desaparece al aplicar un ajuste al nivel de error () en el anlisis estadstico. Estas dos ltimas poblaciones mostraron diferencias no significativas bajo

17

cualquier condicin de anlisis, lo que puede estar relacionado con su ubicacin geogrfica en la zona externa del Golfo de Ana Mara y con el patrn de corrientes marinas del rea. Por otra parte, los agrupamientos obtenidos a partir de la matriz de distancias genticas de Nei (1978), obtenidas del anlisis de los loci aloenzimticos, muestran dos grupos principales en correspondencia con las zonas interna y externa del Golfo, lo cual sugiere que la estructuracin observada pudiera guardar una relacin estrecha con respecto al patrn de corrientes marinas, as como con la distribucin de las reas de cra principales dentro del Golfo (Emilsson y Tpanes 1971). El anlisis de la diferenciacin gentica entre las poblaciones del Golfo de Ana Mara en 1995 sugiere que la distancia geogrfica pudiera determinar el patrn de diferenciacin. Sin embargo, el anlisis de correlacin entre estos estimados (FST versus distancia geogrfica), realizado mediante una prueba de Mantel (Smouse y Long, 1992), indica que sta es no significativa, an cuando en un anlisis se excluy a Santa Cruz Arriba por presentar una relacin gentica inesperada que la agrupa con las localidades de la regin interna del Golfo. El modelo ms acertado para explicar la estructuracin de las poblaciones sera el modelo paso a paso o stepping stone (Hartl y Clark, 1989), segn el cual cada grupo intercambia una proporcin m de sus individuos con los grupos adyacentes cada generacin y otra proporcin menor con la poblacin en su conjunto. Tambin considera que la probabilidad de flujo gentico entre las poblaciones decrece linealmente con la distancia que las separa. Este modelo permitira explicar los agrupamientos observados a partir del anlisis de distancia gentica en las zonas externa e interna del Golfo y Tunas de Zaza, as como la relacin inesperada entre Santa Cruz Arriba y las poblaciones ms internas del Golfo de Ana Mara. Esta ltima tambin podra tener una explicacin en la ocurrencia de variaciones temporales del patrn de corrientes locales, que pudiera facilitar el flujo entre poblaciones ms lejanas. Aunque los resultados obtenidos mediante el anlisis de los loci microsatlites muestran menores valores de diferenciacin que las aloenzimas, sugieren un patrn de estructuracin similar en el Golfo de Ana Mara, como fue demostrado por la comparacin de las frecuencias allicas, los estimados de FST y los anlisis de distancia (Figura 2). Las diferencias, encontradas entre algunas localidades de los Golfos de Ana Mara y Bataban durante 1995, con estos loci, pueden estar indicando la existencia de heterogeneidad en sus frecuencias allicas. Sin embargo, es posible que el tamao de la muestra empleado para el anlisis de las poblaciones del Golfo de Bataban en este ao, as como la varianza de los loci microsatlites introducida por su elevado nmero de alelos, haya influido en que las diferencias observadas sean leves. La existencia de estructuracin gentica a pequea escala geogrfica, ha sido demostrada para diferentes especies del ambiente marino que, como los camarones, presentan estadios larvales planctnicos durante
18

su desarrollo (Sponaugle et al. 2002). En este contexto, un anlisis de las poblaciones de F. notialis del Golfo de Bataban usando marcadores aloenzimticos (Espinosa et al. 1996) evidenci heterogeneidad gentica entre las poblaciones de Rosario y Mayabeque, con respecto a la poblacin de Caimito. Por otra parte, la distancia mnima a la que se ha encontrado diferenciacin para la especie de camarn P. monodon es de 250Km (Benzie 2000). Los resultados obtenidos del anlisis gentico-bioqumico de las poblaciones de P. californiensis y L. stylirostris (De la Rosa-Vlez et al. 2000) y las encontradas para L. schmitti (Espinosa et al. 2003), tambin muestran diferencias entre poblaciones cercanas. Con estas evidencias se demuestra que la existencia de diferencias genticas entre poblaciones geogrficamente cercanas, puede deberse a factores relacionados con mecanismos oceanogrficos y con la conducta de estas especies, que posibilitan el reclutamiento de las larvas y facilitan la diferenciacin de sus poblaciones (Barber et al. 2000; GrandJean y Souty-Grosset, 2000; Hellberg et al. 2002; Taylor y Hellberg, 2003). Las zonas de cra para el camarn rosado en el Golfo de Ana Mara, estn localizadas en zonas del litoral, especficamente en Tunas de Zaza, Jcaro, Santa Cruz del Sur Abajo, Playa Florida, Santa Cruz Arriba y algunos cayos lejanos de la costa. Las corrientes marinas en este Golfo, describen tres cursos diferentes de acuerdo a los patrones descritos por Morenza et al. (indito). Dos de ellas pasan por la cayera Jardines de la Reina, siguiendo una trayectoria curva hacia el extremo noroeste de dichos cayos y la tercera genera un giro interno que abarca las zonas del interior del Golfo. La variacin gentica encontrada en este Golfo durante 1995, podra deberse a que las larvas provenientes de diferentes localidades contribuyan a zonas de cra especficas, provocando un flujo gentico limitado entre las poblaciones. Este factor no se corresponde con las caractersticas biolgicas de la especie, que pudieran favorecer la homogenizacin gentica de las poblaciones potencialmente, mediante la migracin activa de los adultos y pasiva de las larvas a merced de las corrientes entre las zonas de cra (Pez y Utset, 1998). Sin embargo, se ha descrito que el transporte de las larvas puede verse limitado de manera determinante en poblaciones que aparentan ser demogrficamente abiertas, por diferentes procesos fsicos y biolgicos que pueden actuar selectivamente sobre su supervivencia. Entre los factores fsicos se pueden mencionar las mareas, los giros costeros asociados a las descargas fluviales, y los frentes entre masas de aguas a la entrada de los estuarios. Entre los biolgicos estn las complejas habilidades sensoriales y natatorias de las larvas de algunos taxa, como los crustceos decpodos, que les permiten adaptar su comportamiento a cambios temporales y espaciales, garantizando de esta forma su supervivencia, retencin y auto-reclutamiento (Sponaugle et al. 2002). Las muestras colectadas en el ao 1999, analizadas particularmente para los loci microsatlites, revelaron la ausencia de diferenciacin entre las localidades del Golfo de Ana Mara, sugiriendo su
19

homogenizacin gentica. Este momento de muestreo permite determinar, aproximadamente, cuando se produjeron los cambios significativos en las frecuencias allicas entre las poblaciones y cuales fueron los posibles factores que los potenciaron. En el ao 2003 se observ, segn los resultados obtenidos del anlisis de frecuencia y distancia de los loci microsatlites, que solamente existen diferencias significativas entre las poblaciones de los Golfos de Bataban y Ana Mara. Este resultado coincidi con el derivado del anlisis aloenzimtico, al demostrar la homogenizacin gentica de las poblaciones dentro de cada uno de estos Golfos. As lo demuestran los estimados de FST significativos solamente entre las localidades de ambos Golfos y los bajos niveles de flujo gentico entre ellas. Tambin las diferencias entre ambos Golfos se vieron reforzadas por los datos obtenidos del anlisis del polimorfismo de restriccin del ADNmt. El ADNmt indica la existencia de genotipos bien diferenciados y establecidos en el Golfo de Ana Mara y probablemente en el de Guacanayabo, y por otro lado en el Golfo de Bataban (Figura 15, Tabla 16) sugiriendo, que a pesar de que el patrn de corrientes marinas de la plataforma Sur de Cuba debera influir sobre la dispersin de la especie entre las diferentes regiones (Guitart et al. 1985), no existe un intercambio de individuos entre las poblaciones de estos Golfos. La diferenciacin encontrada entre las dos regiones, sugiere la existencia de una barrera efectiva al flujo gentico. En este sentido puede sealarse que la discontinuidad que presenta la plataforma Sur de Cuba, determinada por el Golfo Casilda-Cazones, pudiera prevenir las migraciones entre ambas zonas. Por otra parte, la separacin de estas poblaciones podra estar relacionada directamente con los eventos paleo-geogrficos de formacin de las plataformas que conocemos actualmente. Estas emergieron en el Mioceno, como dos grupos tectnicos independientes, y en la actualidad se mantienen separadas por el accidente geogrfico mencionado anteriormente (Nuez-Jimnez, 1982). Esta hiptesis es difcil de sostener a partir de los genes nucleares, pues los alelos ancestrales slo se mantienen por tanto tiempo (millones de aos), si el tamao censal de las poblaciones iniciales es muy grande y se pueden despreciar los efectos de la deriva gentica y la seleccin direccional sobre estos alelos; o si la seleccin equilibradora actu durante todo ese tiempo manteniendo los niveles de polimorfismo. Por otra parte tampoco existen alelos privados de cada regin que permitan distinguir ambos grupos poblacionales. Sin embargo, el ADNmt como presenta un tamao efectivo poblacional menor que el de los genes nucleares manifiesta tres veces ms rpido los efectos del aislamiento geogrfico (Palumbi et al. 2001). La estructuracin poblacional a grandes escalas geogrficas ha sido estudiada en otras especies de peneidos. La diferenciacin encontrada en las poblaciones de P. monodon que habitan los Ocanos ndico y Pacfico (Benzie et al. 1993; Klibunga et al. 1998, Benzie 2000), y las poblaciones del Sur de frica, sureste asitico y Australasia (Benzie et al. 2002), se vincul a fenmenos geolgicos
20

importantes, y no a patrones de dispersin recientes. De manera similar, las poblaciones de L. setiferus que habitan el Atlntico Oeste y el Golfo de Mxico mostraron diferencias, debido a que la pennsula de la Florida limita el flujo de individuos entre las zonas mencionadas (McMillen-Jackson y Bert, 2003). Otras especies que habitan esta misma regin, han mostrado un comportamiento similar (Avise, 1987, 1994). Causas que determinan la variacin temporal de la diversidad y estructura gentica de F. notialis. Los estudios realizados para investigar la variacin temporal de las frecuencias allicas, han evidenciado diferentes patrones de estabilidad poblacional. Las especies como el salmn Atlntico (Salmo salar) (Nielsen et al. 1997, 1999; Tessier y Bernatchez, 1999; Potvin y Bernatchez, 2001), la trucha (Salmo trutta) (Hansen et al. 2002), el bacalao (Gadus morua) (Ruzzante et al. 2001), el sargo (Diplodus sargus) (Planes y Lenfant, 2002) y la platija (Pleuronectes platessa) (Hoarau et al. 2002), han mostrado que la composicin gentica de sus poblaciones tiende a ser estable por largos perodos de tiempo. Sin embargo, se han encontrado diferencias significativas de las frecuencias allicas en las especies de trucha Salmo trutta (Jorde y Ryman, 1996; stergaard et al. 2003) y Oncorhynchus mykiss (Heath et al. 2002), como consecuencia de los efectos de la deriva gentica y de ambientes inestables, o de ambos. Recientemente, otros estudios han atribuido esta disparidad a los efectos de la seleccin natural, como ocurre en el bacalao Gadus morhua L.(Karlsson y Mork, 2003), y al impacto humano (Waples y Teel, 1990). Para analizar las posibles causas de la inestabilidad temporal de la diversidad y estructura gentica manifestada por las poblaciones de F. notialis, debemos tener en cuenta que esta especie desarrolla su ciclo vital en un ambiente heterogneo (Garca y Le Reste, 1981), y que puede presentar una gran varianza en cuanto a la cantidad de descendientes que contribuyen a la prxima generacin debido a las elevadas tasas de fecundidad y de mortalidad en los primeros estadios larvales (Hegecock, et al. 1994). Por otra parte, los datos de las estadsticas pesqueras indican que las capturas de F. notialis han sufrido un deterioro continuo, como resultado de los efectos producidos por cambios climatolgicos, por ejemplo: la variacin en el rgimen de lluvias, los cambios globales de temperatura, y los ciclones (Nickolic y Ruz de Quevedo, 1971; Alonso et al. 1992; Sosa et al. 1999); y tambin por la accin directa del hombre mediante la sobrepesca, el represamiento de los ros, y la degradacin y contaminacin del hbitat (Baisre y Zamora, 1983; Pez et al. 1996, 1997; Gonzlez-Yaez y Bult, 2002). Estas evidencias indican que las poblaciones de F. notialis se encuentran bajo la influencia de diferentes agentes biticos y abiticos que pueden tener consecuencias importantes para su adaptacin y evolucin. Sobre esta base, analizaremos la accin de estos agentes como promotores de las diferentes fuerzas evolutivas que puedan haber generado los cambios temporales de las frecuencias allicas de F.
21

notialis, partiendo del hecho de que las poblaciones analizadas, tanto en 1995 como en el 1999 y 2003, se encuentran en equilibrio gentico. Por lo tanto las fuerzas evolutivas estn actuando de forma compensada y solamente podemos reflexionar acerca de sus efectos entre los aos en los que se realiz la colecta. El primer aspecto a considerar es la disparidad observada entre los loci aloenzimticos y los loci microsatlites, en cuanto la variacin de los estimados de diversidad gentica. Estos podran deberse a los efectos de la seleccin natural sobre los loci aloenzimticos, ya que se espera que la deriva gentica y las migraciones tengan efectos relativamente uniformes sobre todo el genoma (Storz y Nachman, 2003). Sin embargo, slo podemos aseverar esta hiptesis s los patrones de estructuracin gentica, reflejados por ambos tipo de marcadores tambin difieren, como ha sido descrito en otras especies a partir del estudio comparativo de marcadores neutrales y seleccionados (Kart y Avise, 1992; Dufresne et al. 2002; Karlsson y Mork, 2003). Los resultados a partir del anlisis de las aloenzimas en F. notialis indicaron que la variacin gentica, estimada en trminos de heterocigosidad y riqueza allica, aument significativamente en el tiempo, mientras que los resultados obtenidos del anlisis de los loci microsatlites, muestran que los estimados de heterocigosidad promedio se mantuvieron estables en el perodo de tiempo analizado. No obstante, el hecho de que los niveles de heterocigosidad permanezcan estables no quiere decir que no se produzcan cambios significativos en las frecuencias allicas. En este sentido los loci microsatlites, adems de mostrar un aumento significativo del nmero de alelos y de la riqueza allica entre 1995 y los aos 1999 y 2003, exhibieron al igual que los loci aloenzimticos, variaciones significativas de las frecuencias allicas a travs del tiempo que evidenciaron la prdida de la estructura gentica existente en las poblaciones en el ao 1995. Todo esto nos sugiere, como se demostr en los estudios realizados en la trucha Salmo trutta (Estoup et al. 1998) y en el mejilln Mytilus edulis (Bierne et al. 2003), que debemos considerar, adems de los diferentes tipos de seleccin natural, el efecto de otras fuerzas evolutivas. Las migraciones efectivas entre las diferentes localidades del Golfo de Ana Mara, promovidas por factores biticos y abiticos, pudieran ser la causa de las variaciones temporales de la diversidad gentica de las poblaciones de F. notialis, y explicar a la vez el aumento de los niveles de diversidad gentica que muestran las aloenzimas. Aunque estos movimientos siempre estn presentes en la naturaleza, slo se hacen evidentes cuando las poblaciones estn reprimidas o ha disminuido su tamao. Los resultados de los loci aloenzimticos de F. notialis develan un incremento en la riqueza allica, debido a que los alelos que se encontraban menos representados en las poblaciones de 1995 aumentan su frecuencia en las muestras del 2003 a expensas de la reduccin de los ms frecuentes, y a la presencia
22

en todas las poblaciones del ao 2003, de alelos que aparecan solamente en algunas poblaciones en el ao 1995. Tal es el caso de la aparicin del alelo a del locus GP7 en Manuel Gmez, del alelo a de Per1 en las localidades de Florida y Manuel Gmez, del alelo c de este mismo locus en Santa Cruz Arriba, y del alelo d de Gdh en Manuel Gmez cuya aparicin no puede explicarse por las mutaciones. Esta es la evidencia ms clara de que haya ocurrido mezcla entre las poblaciones. Para los loci microsatlites, sin embargo, los alelos ms frecuentes aparecen representados en todas las poblaciones durante los tres aos de colecta, y los alelos privados que surgen para los aos 1999 y 2003, tienen una frecuencia muy baja. Por estos motivos, la estabilidad de los parmetros de diversidad gentica no se ve afectada por la mezcla de las poblaciones, an cuando el nmero de alelos y la riqueza allica aumenta significativamente a travs del tiempo. Por otra parte, las migraciones tambin explican la inestabilidad temporal de la estructura gentica de las poblaciones de F. notialis que se manifiesta por la prdida de la estructura existente en el Golfo de Ana Mara despus de 1995, producto de la homogenizacin gentica de sus poblaciones. Bajo los efectos de las migraciones las frecuencias allicas de dos o ms poblaciones tienden a igualarse previniendo la diferenciacin de las localidades (Wang y Whitlock, 2003), como ocurre con las poblaciones de F. notialis. En este sentido, se pudo constatar cmo los estimados de flujo gentico aumentaron a ms de 10 migrantes por generacin entre las localidades del Golfo de Ana Mara, en el ao 2003 para ambos marcadores nucleares. Esta cifra, segn Vucetich y Waite (2001) es suficiente para garantizar la uniformidad gentica de las poblaciones, independientemente de su tamao. Lgicamente las migraciones pueden provocar el desajuste de las frecuencias allicas al HWE como consecuencia de un efecto Wahlund (Wahlund, 1928). Sin embargo, entre los aos de colecta de las poblaciones en equilibrio gentico de F. notialis han pasado como mnimo ocho generaciones, y se plantea que una o pocas generaciones son suficientes para que las poblaciones panmxticas puedan alcanzar nuevamente el equilibrio conforme a las proporciones tericas (Hartl y Clark, 1997). Como se haba sealado anteriormente es poco probable que las mutaciones y la recombinacin sean las causas de los cambios temporales en las frecuencias allicas. Segn los presupuestos de la Teora Neutralista (Kimura, 1968), para que un alelo neutral introducido por una mutacin se fije o se pierda, es necesario que transcurran 4N generaciones (Hartl y Clark, 1997). Por lo tanto, teniendo en cuenta que el tamao censal de las poblaciones de camarones oscila en el orden de los millones de individuos (particularmente se ha estimado en alrededor de 300 millones para las poblaciones de F. notialis en el Golfo de Ana Mara) (Sosa, comunicacin personal), y el tamao efectivo ha sido estimado como promedio en el orden de las decenas de miles, se necesitaran mucho ms de 16 generaciones (tiempo mximo transcurrido entre 1995 y 2003) para la fijacin de nuevas variantes allicas. Solamente se
23

observ un incremento en el nmero de alelos para los loci microsatlites en las muestras de 1999 y 2003, pero estos aparecen con frecuencias muy bajas, lo cual no gener cambios en los valores de heterocigosidad observada y esperada a travs del tiempo, como pudo apreciarse en la comparacin mediante el ANOVA de clasificacin simple entre los diferentes aos de colecta. Los efectos de la recombinacin (otra de las fuentes de variacin), entre los diferentes loci analizados en las poblaciones de F. notialis, se descartaron luego de demostrar que stos se encontraban en equilibrio de ligamiento. Esta evidencia asegura que los sistemas aloenzimticos analizados se encuentran en cromosomas diferentes o suficientemente separados dentro del mismo cromosoma, es decir, con una frecuencia de recombinacin mayor o igual a 0.5 (mxima frecuencia de recombinacin entre dos genes) (Hart y Clark, 1997). Sin embargo, la recombinacin puede ocurrir tambin dentro de un mismo gen, en regiones de alta o baja frecuencia de recombinacin. Estos eventos de recombinacin estn vinculados a la seleccin, pues se observa una disminucin del nivel de polimorfismo, ya sea porque se fija una mutacin beneficiosa trayendo consigo la fijacin de los nucletidos ligados a este nuevo alelo (selective sweep), o porque se pierda una mutacin deletrea (Background selection) (Hartl y Clark, 1997). Por estos motivos la nica forma de detectar esta fuente de variacin es conociendo la secuencia nucleotdica de los genes en estudio y realizando una prueba de neutralidad que permita descifrar s la reduccin en los niveles de diversidad se debe a los efectos de estos mecanismos selectivos, como ha sido realizado en algunas especies de Drosophila (Begun y Aquadro, 1992, 1993 y 1994; Smith y EyreWalker, 2002; Fay et al. 2002). Para la especie F. notialis no se conoce la secuencia de los loci aloenzimticos y no existe ningn estudio que analice s los cambios en la movilidad electrofortica de las protenas se corresponden con la variacin de la secuencia nucleotdica del gen. Sin embargo, la prueba de neutralidad selectiva de Ewens-Watterson (1985) reflej que los loci aloenzimticos analizados varan segn la teora neutral. Las poblaciones de F. notialis presentan grandes tamaos censales (Sosa, comunicacin personal) y por lo tanto es poco probable que sufran los efectos de la deriva gentica (Nei 1987). Sin embargo, se ha demostrado para algunas especies marinas, que las poblaciones naturales que presentan un tamao censal considerable pueden estar sustentadas por unos pocos individuos (Heath et al. 2002; Arden y Kapuscinski, 2003). En estos casos, los tamaos censales pueden enmascarar cualquier reduccin drstica del tamao efectivo poblacional (cuello de botella) y por consiguiente los efectos de la deriva gentica (Garza y Williamson, 2001). En el caso particular de F. notialis, es probable que esto suceda porque se conoce que stas, como otras especies de crustceos, se caracterizan por un rpido desarrollo, altas tasas de fecundidad y tasas de mortalidad temprana elevadas, lo que las hace susceptibles a una gran varianza en el xito reproductivo.
24

Las consecuencias de este fenmeno, a nivel gentico, se reflejan a travs de la variacin temporal significativa de las frecuencias allicas, que puede afectar el tamao efectivo de sus poblaciones (Hedgecock 1994), como ha sido demostrado en algunas especies marinas como el bacalao (Ruzzante et al. 1996). Tambin se sabe que en las poblaciones de F. notialis coexisten varias generaciones, pues se reproducen de 2 a 4 veces durante su vida, a las edades de 6, 8, 11 y 15 meses (Prez y Morenza, 1994). Por ltimo, se supone que sta especie se encuentra sometida a fluctuaciones demogrficas producto de las intensas pesqueras (Sosa et al. 1999). Todas estas evidencias se encuentran entre las causas que, segn Hartl y Clark (1997), provocan que el tamao efectivo poblacional (Ne) sea menor que el tamao censal (N) de las poblaciones. Los estimados indirectos de Ne a partir de los loci aloenzimticos y de los loci microsatlites ofrecieron valores muy inferiores al tamao censal de las poblaciones de F. notialis, que ha sido considerado, a partir de las capturas en el Golfo de Ana Mara, en alrededor de 300 millones de individuos (Sosa, comunicacin personal). Aunque la diferencia entre el tamao censal y el efectivo resulta extremadamente amplia, se han referido discrepancias similares para otras especies marinas (Hedgecock et al. 1994; Turner et al. 2002; Ball y Chapman, 2003) y los estimados de Ne son equivalentes a los obtenidos para las poblaciones de L. setiferus a partir de loci microsatlites (Ball y Chapman, 2003). An as, estos valores resultan elevados y junto a los altos niveles de heterocigosidad de las poblaciones de F. notialis, sugieren que no ha ocurrido un cuello de botella reciente. Los cuellos de botella pueden detectarse mediante los cambios en los patrones de distribucin de las frecuencias allicas a travs de las generaciones. En este sentido, algunos autores refieren que el nmero de alelos por locus es un estimador muy sensible a las reducciones drsticas del tamao efectivo poblacional (Maruyama y Fuerst 1985, Leberg 2002). Los resultados derivados del anlisis de las aloenzimas en F. notialis muestran un incremento de la riqueza allica, mientras el nmero de alelos permanece constante. Sin embargo, el tiempo transcurrido entre los muestreos no es suficiente para que se detecten cambios en el tamao efectivo de las poblaciones, ya que se necesitaran 4N generaciones para detectarlos (Maruyama y Fuerst, 1985). Por lo tanto, el incremento en el tamao efectivo poblacional manifestado por los loci aloenzimticos est determinado por los efectos, que sobre los niveles de heterocigosidad pueden ejercer las migraciones y la seleccin natural, como se explicar ms adelante. Por otra parte, los loci microsatlites que segn (Cornuet y Luikart, 1996) son marcadores ms apropiados para detectar los efectos de la deriva gentica debido a que presentan un mayor nmero de alelos y son ms variables, muestran que los estimados de Ne, asumiendo los modelos IAM y SMM, permanecen prcticamente invariables en el tiempo. Las diferencias que se observan entre estos,
25

pudieran deberse al modelo mediante el que realmente estn evolucionando los loci microsatlites. Si tenemos en cuenta que los estimados de Ne generados por el modelo IAM se corresponden con los obtenidos a partir de los loci aloenzimticos y con los referidos para L. setiferus (Ball y Chapman, 2003), es muy probable que estos sean los ms cercanos a la realidad, y que el sesgo que presentan se deba a la tasa de mutacin asumida en cada caso, que no fue calculada para F. notialis, y a la mezcla ocurrida entre las poblaciones. Los estimados Ne a partir de los loci microsatlites fueron empleados para calcular M (proporcin del nmero total de alelos por poblacin, respecto al nmero mximo de estados allicos que puede mostrar el locus) (Garza y Williamson, 2001). Este parmetro refleja claramente los cambios en los patrones de distribucin de las frecuencias allicas a travs del tiempo y relaciona la prdida de los alelos con la ocurrencia de un cuello de botella varias generaciones antes. Los valores obtenidos para todos los loci, aunque inferiores, resultaron muy cercanos al valor crtico (Mc) en la mayora de las poblaciones. Esto indica que el tamao efectivo de las poblaciones de F. notialis no ha sufrido una reduccin drstica recientemente, pero si ha manifestado un descenso a travs de las generaciones que ha sido ms pronunciado en las localidades de Tunas de Zaza, en el Golfo de Ana Mara; y Caimito, en el Golfo de Bataban. Aunque los niveles de diversidad gentica mostrados por ambos marcadores nucleares son elevados y no muestran reducciones a travs del tiempo, y tanto los estimados del tamao censal como efectivo de las poblaciones de F. notialis son lo suficientemente grandes como para no manifestar los efectos de la deriva gentica, no podemos descartar completamente los efectos, a largo plazo, de esta fuerza evolutiva. El bajo nivel de diversidad nucleotdica estimado a partir del marcador de ADNmt, que refleja los cambios con mayor rapidez que los genes nucleares, sugiere que la deriva gentica pueda estar actuando en estas poblaciones. Los efectos de la deriva gentica podran manifestarse adems, mediante la variacin temporal de las frecuencias allicas producto de la varianza en el xito reproductivo de la especie. Este es un elemento importante a considerar, pues podra ser la causa de la inestabilidad encontrada en la estructura gentica de F. notialis. Un anlisis detallado de la variacin gentica, durante los diferentes estadios de desarrollo, contribuira a la mejor comprensin de este proceso, como fue realizado por Planes y Lenfant (2002) para la especie Diplodus sargus. La variacin temporal de las frecuencias allicas en las poblaciones de F. notialis tambin puede ser consecuencia de la accin de diferentes agentes, biolgicos o no, que potencian los efectos de la seleccin natural. Sin embargo, los resultados permiten descartar algunas de las formas en que esta fuerza evolutiva pudiera haber actuado. En primera instancia se excluy la seleccin direccional, pues los cambios temporales de las frecuencias allicas ocurrieron de forma aleatoria y no se fij algn
26

genotipo en particular, como ha sido descrito, por ejemplo, para diferentes especies de Drosophila (Eanes, 1996; Fay, 2000; Fay et al. 2002), en las cuales la seleccin direccional o positiva ha promovido el aumento de la diversidad gentica. Los cambios de las frecuencias allicas en F. notialis consistieron en un aumento de la frecuencia de aquellos alelos que se encontraban menos representados en 1995 a expensas de la disminucin del alelo ms frecuente b, pero este continu siendo el mejor representado en las muestras del ao 2003. Por otra parte, se observa una homogeneidad gentica de las poblaciones en este ao y lejos de aumentar las diferencias entre stas, como era de esperar si hubiese actuado la seleccin direccional (Whitlock, 2002), se hicieron ms semejantes como lo indican los estimados de distancia gentica, desapareciendo la estructura gentica que exhiban en 1995. Existen otros tipos de seleccin ms complejos, que podran explicar el mantenimiento de los niveles de diversidad equilibrados en F. notialis, como la diversificadora durante 1995, y la balanceadora en el 2003, pero no los cambios ocurridos en el transcurso de las generaciones. La primera se encarga de mantener la diversidad dentro y entre las poblaciones, al favorecer los genotipos extremos (homocigotos), en ambientes heterogneos espacial o temporalmente (Hartl y Clark, 1997). Este tipo de seleccin ha sido esgrimida por numerosos autores para explicar cmo, en ausencia de barreras a la dispersin, las variaciones en la diversidad gentica mostrada por ciertos loci aloenzimticos puede estar modulada por factores abiticos. Ejemplo de esto son la variacin gradual de las frecuencias allicas, conjuntamente con la temperatura, sobre el locus Ldh en el pez Fundulus heteroclitus (Powers y Schulte, 1998) y sobre el locus Gpi en Semibalanus balanoides (Rand et al. 2002), con la distribucin geogrfica sobre el locus Gpi en dos especies de grillo Grillus veletis y G. pennsylvanicus (Katz y Harrison, 1997), sobre los loci Mpi y Gpi de Semibalanus balanoides (Dufresne et al. 2002) y la Glucosa 6-P deshidrogenasa en Drosophila melanogaster (Eanes, 1999), y con los efectos de la presin de oxgeno y la altitud sobre el locus Alb en Peromiscus maniculatus (Storz y Dubach, 2004). Tambin las poblaciones de L. schmitti que habitan la plataforma cubana han mostrado una variacin gradual de las frecuencias allicas en correspondencia con la latitud, desde Bataban hasta Tunas de Zaza (Espinosa et al. 2003). Por lo tanto, podramos esperar que las de F. notialis, que ocupan el mismo nicho durante algunos de sus estadios de vida y que tienen niveles de diversidad muy similares (Espinosa et al. 2003), tuvieran un comportamiento parecido. Aunque no se pudo contar con muestras de F. notialis del Golfo de Bataban en 1995, que pudieran esclarecer los efectos de la seleccin diversificadora sobre la diferenciacin de sus poblaciones, las del Golfo de Ana Mara presentan un mayor nmero de genotipos homocigotos que heterocigotos (Anexo 10) para la mayora de los loci analizados, lo cual se corresponde con los efectos de este tipo de seleccin.

27

De igual forma, es poco probable que la seleccin balanceadora, especficamente por ventaja del heterocigoto, sea la causa del aumento de la diversidad gentica en las poblaciones de F. notialis en el tiempo. Este tipo de seleccin mantiene equilibrados los niveles de diversidad gentica, al favorecer los genotipos heterocigotos en una poblacin que se mantiene genticamente homognea y con apareamiento aleatorio, como ha sido demostrado para el locus Pgi en las mariposas del gnero Colias en diferentes ambientes (Watt et al. 2003), an cuando stas se caracterizan por un xito reproductivo diferencial. Sin embargo, no explica el aumento de los heterocigotos en una poblacin panmxtica, con respecto a un estado anterior en el que se encontraba subestructurada genticamente, como es el caso que nos ocupa. De todas formas, este tipo de seleccin puede haber comenzado a actuar luego de que ocurri la homogenizacin gentica de las poblaciones, detectada para el ao 2003. Al igual que como se seal para las migraciones y la deriva gentica, los cambios en la supervivencia y reproduccin diferencial de los genotipos (seleccin natural) pueden ser potenciados por los efectos de eventos naturales y antropognicos. A continuacin se discuten los efectos de algunos de ellos sobre las poblaciones de F. notialis. En este sentido, se ha demostrado que las capturas de este recurso pesquero han ido disminuyendo paulatinamente a travs de los aos, conjuntamente con el aumento de la construccin de embalses y diques entre 1985 y 1997 (Pez et al. 1997). Estas construcciones pueden provocar el incremento de la temperatura del agua lo cual resulta crtico para la supervivencia de esta especie (Revilla, 1994). Las poblaciones de los Golfos de Bataban y Ana Mara tambin han sido sometidas a pesqueras intensas, lo cual ha estado determinado por el patrn de explotacin aplicado desde la dcada de los 80. Este patrn se caracterizaba por el arrastre de toda el rea cada 33 das (Baisre y Zamora, 1983) y a partir de 1997 fue modificado con la implementacin de redes de mayor tamao, con lo cual actualmente se arrastra un rea mayor en menor tiempo (Sosa et al. 1999). Adems, el arte de pesca empleado para la explotacin de estas poblaciones, conocido como arrastre de fondo, puede causar el deterioro y hasta la prdida de las reas de pesca, producto de la erosin que provoca sobre el fondo marino. Varios autores le han atribuido la reduccin de los parmetros de abundancia al relacionarlos positivamente (Baisre y Zamora, 1983; Pez et al. 1996; Pez, 1997). Ambos factores (sobre-pesca y arte de pesca) causan la prdida del hbitat (Jackson et al. 2001), potencian las migraciones y, como consecuencia, promueven la homogenizacin de las poblaciones. La reduccin de la biomasa y de las capturas de F. notialis tambin se ha relacionado con las variaciones en el rgimen de precipitaciones (Alonso et al. 1992). Tanto los perodos de lluvias intensas como los de sequa pueden afectar los niveles de nutrientes en el medio, lo cual resulta fundamental para el mantenimiento de las poblaciones. Los huracanes y ciclones estn considerados como uno de los
28

fenmenos naturales ms catastrficos en este sentido, pues traen consigo un aumento en el rgimen de lluvias que facilita la suspensin de sedimentos, el influjo de residuos y contaminantes provenientes de los ros, as como la disminucin de los niveles de oxgeno disuelto (Allison et al. 2003; Burkholder et al. 2004). Estos fenmenos, adems crean mareas que sacan a los camarones de sus refugios naturales, exponindolos a las pesqueras. Por esta razn, luego del paso de los ciclones se ha registrado un aumento en las capturas (Nickolic y Ruiz de Quevedo, 1971). Entre los aos que abarca el presente estudio, Cuba fue afectada por el paso de varios ciclones y huracanes, George y Mitch en 1998, Irene en el 1999, Michelle en el 2001, y Lili e Isidore en el 2002, y tras su paso por el caribe, tambin se comunic por parte de los pescadores, un aumento de las capturas en el Golfo de Ana Mara. A partir del anlisis espacio temporal de la diversidad y estructura de las poblaciones de F. notialis se puede proponer que la inestabilidad de estos patrones se deben a los efectos, que sobre las capacidades adaptativas y reproductivas de la especie, han ejercido a travs del tiempo la deriva gentica y las migraciones, potenciadas por eventos naturales y antropognicos. Consideraciones generales. El resultado fundamental de este trabajo es que demuestra la existencia de
poblaciones y grupos de poblaciones demogrficamente independientes en la especie de camarn F. notialis, lo que permite hacer ciertas consideraciones con respecto a su conservacin y manejo. En este sentido, los resultados obtenidos a partir del anlisis del ADNmt indican que las poblaciones de F. notialis se separan en dos grandes grupos, diferenciados por la presencia de haplotipos nicos que distinguen el Golfo de Bataban, ubicado en la plataforma Sur Occidental de la isla y los Golfos de Ana Mara y Guacanayabo, pertenecientes a la plataforma Sur Oriental. Estos linajes mitocondriales se han mantenido separados por un perodo de tiempo, lo suficientemente largo como para que les haya permitido acumular cambios genticos, que se han mantenido debido a la ausencia de migraciones efectivas entre ambas zonas. Teniendo en cuenta el criterio gentico que las caracteriza y las evidencias que existen acerca de la ausencia de migraciones entre estos grupos poblacionales, pudieran ser clasificados como Unidades con Significado Evolutivo (ESUs) (Fraser y Bernatchez, 2001), lo que los hace prioritarios para el mantenimiento de la biodiversidad.

Por otra parte, los resultados obtenidos del anlisis de los loci nucleares indican la existencia de una estructura gentica importante dentro del Golfo de Ana Mara, sobre la base de diferencias significativas en las frecuencias allicas. Las poblaciones de este Golfo se diferencian entre s agrupndose en tres nodos principales; uno que relaciona las reas de cra de la zona interna del Golfo, otro que vincula las reas de cra de la zona externa del Golfo y el tercero, perteneciente a la localidad de Tunas de Zaza. De acuerdo a este criterio gentico, estas poblaciones pueden clasificarse como unidades independientes con significado para el manejo (MUs) (Paetkau, 1999), lo cual implica que deben tenerse en cuenta para el establecimiento de estrategias efectivas para su explotacin sustentable.
29

Conclusiones
1. La diversidad gentica de las poblaciones de F. notialis que habitan la plataforma Sur de Cuba, medida
en trminos de heterocigosidad, es elevada en los diferentes aos de muestreo (1995, 1999 y 2003) con respecto a las referidas para otras especies de camarones peneidos, y no manifiesta deterioro a pesar de las reducciones en el tamao censal de las poblaciones.

2. La estructura poblacional significativa encontrada en 1995 para las poblaciones del Golfo de Ana Mara,
demostrada por la distribucin de las frecuencias allicas de las aloenzimas, y en menor medida por los loci microsatlites, se corresponde con la localizacin de las zonas de cra y el patrn de corrientes marinas, ajustndose al modelo poblacional de aislamiento por pasos.

3. La poblacin de Tunas de Zaza mostr los mayores valores de diferenciacin gentica con respecto al
resto de las poblaciones del Golfo de Ana Mara.

4. El anlisis del fragmento del ADNmt evidenci la existencia de dos haplotipos diferentes que distinguen
las poblaciones del Golfo de Ana Mara de las del Golfo de Bataban.

5. Los marcadores nucleares en el ao 2003 y el ADNmt demuestran la ausencia de flujo gentico entre los
Golfos de Ana Mara y Bataban, determinado por la discontinuidad geogrfica de la plataforma Sur de Cuba.

6. La estructura poblacional encontrada en 1995 en las poblaciones del Golfo de Ana Mara desaparece
completamente en el ao 1999, como demuestra el anlisis de los loci microsatlites.

7. La estructura gentica de las poblaciones de F. notialis vara significativamente en el tiempo como

consecuencia del efecto de las migraciones y, probablemente, de la deriva gentica potenciadas por factores biticos y abiticos.

Recomendaciones
1. Extender el estudio de la diversidad y estructura gentica de F. notialis a la costa Norte de la isla, as como profundizar en el conocimiento sobre la ecologa de la especie con respecto a la variacin de sus caracteres fenotpicos. 2. Realizar un estudio de prospeccin en un rea reducida, como el Golfo de Bataban, para registrar la evolucin de los cambios en la estructura y diversidad gentica, con vistas a conocer el estado de las poblaciones de F. notialis. 3. Notificar la necesidad de implementar una estrategia de administracin y explotacin del recurso pesquero, con vistas a su mantenimiento y a la conservacin de la especie, que considere la estructuracin gentica previamente existente en las poblaciones del Golfo de Ana Mara, teniendo en cuenta que estas poblaciones pueden ser demogrficamente diferentes.

30

4. Evaluar los efectos que ejerce la varianza del xito reproductivo de la especie, sobre la estabilidad de la diversidad y diferenciacin genticas, mediante el anlisis de la evolucin de estos patrones, a travs de diferentes estadios del desarrollo de una muestra homognea de larvas.

31

Referencias Bibliogrficas
Alfonso I, Fabr S, Garca A, Gozles M. (1992) Aspectos ecolgicos en un rea de desove de camarn rosado P. notialis durante 1986-89. Rev. Cub. Inv. Pesq. 17(1), 9-17. Allison G. W, Gaines S. D, Lubchenco J, Possingham, H. P. (2003) Ensuring persistence of marine reserves: Catastrophes require adopting an insurance factor. Ecological Applications 13 (1), Supplement, S8-S24. Alonso M. E, Joo, L, Espinosa, G. (1987) Anlisis electrofortico y caracterizacin bioqumica de las esterasas de msculo en Penaeus notialis y Penaeus schmiti. Rev. Inv. Mar. 9(1), 8189. Ardren W. R, Kapuscinski A. R. (2003) Demographic and genetic estimates of effective population size (Ne) reveals genetic compensation in steelhead trout. Molecular Ecology 12, 35-49. Avise J. C, Arnold J, Ball R. M, Bermingham E, Lamb T, Neigel J. E, Reeb C. A, Saunders N. C. (1987). Intraespecific phylogeography: The mitochondrial DNA bridge between population genetics and systematics. Annu. Rev. Ecol. Syst. 18, 489-522. Avise J. C. (1994) Molecular markers, natural history and evolution. Chapman and Hall, edits. N. Y. London. Bagshaw J. C, M. Buckholt (1997) A novel satellite/microsatellite combination in the genome of the marine shrimp, Penaeus vannamei. Gene 184, 211-214. Baisre J, Zamora A. (1983) Las pesqueras cubanas de camarn, antecedentes histricos, situacin actual y perspectivas. Ministerio de la Industria Pesquera, Centro de Investigaciones Pesqueras, pp. 62. Ball A. O, Leonard S, Chapman R. W. (1998). Characterization of (GT)n microsatellites from native shrimp (Penaeus setiferus). Molecular Ecology 7, 1242-1263. Ball A. O, Chapman R. W. (2003) Population genetic analysis of white shrimp, Litopenaeus setiferus, using microsatellite genetic markers. Molecular Ecology 12, 23192330. Balloux F, Lugon-Moulin N. (2002) The estimation of population differentiation with microsatellite markers. Molecular Ecology 11, 155-165. Barber P. H, Palumbi S. R, Erdmann M. V, Moosa M. K (2002). Sharp genetic breaks among populations of Haptosquilla pulchella (Stomatopoda) indicate limits to larval transport: patters, causes, and consequences. Molecular Ecology, 11, 659-674. Begun D. J, Aquadro C. F. (1994) Evolutionary inferences from DNA variation at the 6phospogluconate Dehydrogenase locus in natural populations of Drosophila: selection and geographic differentiation. Genetics 136, 155-171. Belkhir K, Borsa P, Goudet J, Chikhi L, Bonhomme F (2000) Genetix ver. 4.01, logiciel sous Windows TM pour la gntique des populations. Laboratoire Gnome et Populations, CNRS UPR 9060, Universit de Montpellier II, Montpellier. Benzie J .A. H, Frusher S, Ballment E. (1992) Geographical variation in allozyme frequencies of populations of Penaeus monodon (Crustacea : Decapoda) in Australia. Aust. J. Mar. Freshwater Res. 43, 715-725. Benzie J. A. H, Ballment E, Frusher S. (1993) Genetic structure of Penaeus monodon in Australia: concordant results from mtDNA and allozymes. Aquaculture 111, 89-93. Benzie J. A. H. (2000) Population genetic structure in penaeid prawns. Aquaculture Research, 31, 95119. Benzie J. A. H, Ballment E, Forbes A. T, Demetriades N. T, Sugama K, Haryanti M, Moria S. (2002). Mitochondrial DNA variation in Indo-Pacific populations of the giant tiger prawn, Penaeus monodon. Molecular Ecology 11, 2553-2571. Bierne N, Daguin C, Bonhome F, David P, Borsa P. (2003) Direct selection on allozymes is not required to explain heterogeneity among marker loci across Mytilus hybrid zone. Molecular Ecology 12, 2505-2510.

Borrell Y, Espinosa G, Romo J, Vzquez E, Snchez JA, Blanco G (2004). DNA microsatellites variability and genetic differentiation among natural populations of the Cuban white shrimp Litopenaeus schmitti. Marine Biology 144(2), 327-333. Brooker A. L, Benzie J. A. H, Blair D, Versini J. J. (1999) Population structure of the giant tiger prawn Penaeus monodom in Australian waters, determined using microsatellite markers. Marine Biology 136, 149157. Brookfield J. F.Y. (1996) A simple new method for estimating null allele frequency from heterozygote deficiency. Molecular Ecology 5, 453-455. Brown W. M, Prager E. M, Wang A, y Wilson A. C. (1985). Mitochondrial DNA sequences of primates: tempo and mode of evolution. Journal of Molecular Evolution 18, 225-239. Burkholder J, Eggleston D, Glasgow H, Brownie C, Reed R, Janowitz G, Posey M, Melia G, Kinder R, Toms D, Alphin T, Deamer N, Springer J. (2004) Comparative impacts of two major hurricane seasons on the Neuse River and western Pamlico Sound ecosystems. PNAS 25, 9291-9296. Caetano-Anolls G, Bassan B. J, Gresshoff, P. M. (1993) Staining nucleic acids with silver. Promega Notes 42, 10. Chakraborty R, Kimmel M. (1999) Statistics of microsatellite loci: estimation of mutation rate and pattern of population expansion. En Microsatellites Evolution and Applications Oxford University Press, Inc. New York, 139-150. Clarke K. R, Warwick R. M. (2001) Change in marine communities: An approach to statistical analysis and interpretation. PRIMER-E. Plymouth, 176. Cornuet J. M, Luikart G (1996). Description and power analysis of two test for detecting recent population bottlenecks from allele frequency data. Genetics 144, 2001-2014. Cruz P, Meja-Ruiz H, Prez-Enriquez R, Ibarra A. M. (2002) Isolation and characterization of microsatellites in Pacific white shrimp Penaeus (Litopenaeus) vannamei. Molecular Ecology Notes 2, 239-241. De la Rosa Vlez J, Escobar-Fernndez F. C, Maqueda-Cornejo M. (2000) Genetic structure of two comercial penaeids (Penaeus californiensis and P. stylirostris) from the Gulf of California, as revealed by allozyme variation. Fish. Bull. 98, 674-683. De Matthaeis E, Allegrucci, G, Caccone A, Cesaroni D, Sbordoni M, Sbordoni V. (1983) Genetic differentiation between Penaeus kheraturus y Penaeus japonicus (Crustacea, Decapoda). Mar. Ecol. Prog. Ser. 12, 191-197. Dufresne F, Bourget E, Bernatchez L (2002) Differential patterns of spatial divergence in microsatellite and allozyme alleles: further evidence for locus-specific selection in the acorn barnacle, Semibalanus balanoides? Molecular Ecology, 11, 113123. Eanes W. F, Kirchner M, Yoon J, Biermann H, Wang I, McCartney M. A, Verrelli C. (1996) Historical selection, aminoacid polymorphism and lineage-specific divergence at the G6pd locus in Drosophila melanogaster and D. simulans. Genetics 144, 1027-1041. Espinosa G, Berovides V. (1989) Gentica bioqumica y morfometra del camarn blanco Penaeus schmitti de Cuba, resultados preliminares. Revista de Investigaciones Marinas X(2), 157162. Espinosa G, Daz R, Matos J, Becquer U, Romo J, Borrell Y (2003) Variacin aloenzimtica en poblaciones cubanas del camarn blanco Litopenaeus schmitti. Revista de Investigaciones Marinas 24(1), 1119. Espinosa G, Daz R, Pez J, Prats R. M, Labacena M. E (1996) Estudio gentico-bioqumico de la poblacin de Penaeus notialis de la Ensenada de La Broa. Revista de Investigaciones Marinas 17(1), 37-43. Espinosa G, Jager M, Machado E, Borrell Y, Corona N, Robainas A, Deutsh J. (2001) Microsatellites from the white shrimp Litopenaeusschmitti (Crustacea, Decapoda) Biotecnologa Aplicada 18(4), 232-234.

Estoup A, Solignac M, Harry M, Cournuet J. M. (1993) Characterization of (GT)n and (CT)n microsatellites in two insect species : Appis mellifera and Bombus terrestris. Nucleic Acid Research 21, 1427-1431. Estoup A, y Cornuet J. .M. (1994). Brin Complmentaire, le journal des biotechnologies 10, 5-7. Estoup A, Rousset F, Michalakis Y, Cournuet J. M, Adriamanga M, Guyomard R. (1998) Comparative analysis of microsatellite and allozyme markers : a case study investigating Ewens, W. J. (1972) The sampling theory of selectively neutral alleles. Theor. Popul. Biol, 3, 87112. Excoffier A, Smouse P, Quattro J. (1992) Analysis of Molecular Variance inferred from metric distances among DNA haplotypes: Application to human mitochondrial DNA restriction data. Genetics 131, 479-491. Fay J. C, Wu C. (2000) Hitchhiking under positive darwinian selection. Genetics 155, 1405-1413. Fay J. C, Wyckoff G. J, Wu C. (2002) Testing the neutral theory of molecular evolution with genomic data from Drosophila. Nature 415, 1024-1026. Flowers J. M, Schroeter S. C, Burton R. S. (2002) The recruitment sweepstakes has many winners: Genetic evidence. Evolution 56(7), 1445-1453. Fraser D. J, Bernatchez L. (2001) Adaptive evolutionary conservation : towards a unified concept for defining conservation units. Molecular Ecology 10, 2741-2752. Garca D. K, Faggart M, Rhadis L, Alcivar-Warren A, Wyban J. A, Carr W. H, Sweeney N, Ebert K. M. (1994) Genetic diversity of the culture Penaeus vannamei shrimp using three molecular techniques. Molecular Marine Biology and Biotechnology 3 (5), 270-280. Garca D. K, Dhar A. K, Alcvar-Warren A. (1996) Molecular analysis of a RAPD marker (B20) reveals two microsatellites and differential mRNA expression in Penaeus vannamei. Mol Mar Biol Biotechnol 5, 7183. Garca S, Le Reste, L. (1981). Life cycles, dynamics, exploitation and management of coastal penaeid shrimp stocks. FAO Fisheries Technical Paper 203. Garca-Machado E, Dennebouy N, Oliva Suarez M, Mounolou J-C, y Monnerot M. (1993) Mitochondrial 16S-RNA gene of two species of shrimps: sequence variability and secundary structure. Crustaceana 65, 279-286. Garca-Machado E. (1997) Gnome mitochondrial de la crevette Penaeus notialis. Rflexion sur la phylognie des Arthropodes. Tesis presentada para obtener el grado de Doctor en Ciencias. Universidad de Paris Sur. Francia Garca-Machado E, Pempera M, Dennebouy N, Oliva M, Mounolou J. C, Monnerot M. (1999) Mitochondrial genes collectively suggest the paraphyly of crustacea with respect to insecta. J. Mol. Evol. 49, 142-149. Garza J. C, Williamson E. G, (2001) Detection of reduction in population size using data from microsatellite loci. Molecular Ecology 10, 305-318. Goldstein D. B, Ruiz Linares A, Cavalli-Sforza L, Feldman M. W. (1995) An evaluation of genetic distances for use with microsatellite loci. Genetics 139, 163-171. Gonzlez-Ynez A. A, Ortz P (2002) Relacin estacional entre el clima y la abundancia relativa del camarn rosado Farfantepenaeus notialis en el Golfo de Ana Mara, Cuba. Revista de Investigaciones Marinas 23(2), 97-104. Goodman S. J. (1997) RSTCALC: A collection of computer programs for calculatingunbiased estimates of genetic differentiation and determining their significance for microsatellite data. Molecular Ecology 6, 881- 885. Goudet J. (2001) FSTAT, a program to estimate and test gene diversities and fixation indices (version 2.9.3). Available from http://www.unil.ch/izea/softwares/fstat.html GrandJean F, Souty-Grosset C. (2000) Mitochondrial DNA variation and population genetic structure of the white-clawed crayfish, Austropotamobius pallipes pallipes. Conservation Genetics 1, 309-319. Grantham B. A, Eckert G. L, Shanks L. (2003) Dispersal potencial of marine invertebrates in diverse habitats. Ecological Applications 13(1), Supplement, S108-S116.

Guitart B, Gonzlez E, Fraga I, Reyes R. (1985) Areas y pocas de desove de los camarones Penaeus notialis y Penaeus schmitti en la plataforma cubana. Rev. Cub. Inv. Pesq. 10 (34), 1-31. Guo, S. W, Thompson, E. A. (1992) Performing the exact test of Hardy-Weinberg proportion for multiples alleles. Biometrics 48, 361-372. Hamblin M. T, Veuille M. (1999). Population structure among African and derived populations of Drosophila simulans. Evidence for ancient subdivision and recent admixture. Genetics 153, 305-317. Hansen M. M, Ruzzante D. E, Nielsen E. E, Bekkevold D, Mesenberg K. D. (2002) Long-term effective population sizes, temporal stability of genetic composition and potential for local adaptation in anadromous brown trout (Salmo trutta) populations. Molecular Ecology, 11, 25232535. Harris H, Hopkinson D. A. (1976) Handbook of enzyme electrophoresis in human genetics. North Holland, Amsterdam. Hartl D. L, Clark A. G. (1997) Principles of population genetics. Sinauer Associates, Inc. Sunderland, Massachusetts. Heath D. D, Busch C, Kelly J, Atagi D. Y. (2002) Temporal change in genetic structure and effective population size in steelhead trout (Oncorhynchus mykiss). Molecular Ecology, 11, 197 214. Hedgecock D, Tracey M. L, Nelson K. (1982) Genetics. En: The Biology of Crustacea. Eds. Abele LG, Academic. Press, New York, 284-403. Hedgecock D. (1994) Does variance in reproductive success limit effective population sizes of marine organisms? En: Genetics and Evolution of Aquatic Organisms eds. Beaumont AR, Chapman & Hall, London, 122-134. Hellberg M. E, Burton R. S, Heigel J. E, Palumbi S. R. (2002) Genetic assessment of connectivity among marine populations. Bulletin of Marine Science 70 (1), 273-290. Hoarau G, Rijnsdorp A. D, Van der Veer, H. W, Stam W. T, Olsen, J. (2002) Population structure of plaice (Pleuronectes platessa L.) in northern Europe: microsatellites revealed large scale spatial and temporal homogeneity. Molecular Ecology, 11, 1165-1176. Jackson J. B. C, Kirby M. X, Berger W. H, Bjorndal K. A, Botsford L. W, Bourque B. J, Bradbury R. H, Cooke R, Erlandson J, Estes J. A, Hughes T. P, Kidwell S, Lange C, Lenihan H. S, Pandolfi J. M, Peterson C. H, Steneck, R. S, Tegner M. J, Y Warner R. R. (2001) Historical overfishing and the recent collapse of coastal ecosystems. Science 293, 629-638. Jarne P, y Lagoda J. L. (1996) Microsatellites, from molecules to populations and back. Trends in Ecology and Evolution 11, 424-429. Jorde P. E, Ryman N. (1996) Demographic genetics of Brown trout (Salmo trutta) and estimation of effective population size from temporal change of allele frequencies. Genetics 143, 1369-1381. Karl S. A, Avise J. C. (1992) Balancing selection at allozyme loci in oysters: implications from nuclear RFLPs. Science 256, 100-103. Karlsson S, Mork, J. (2003) Selection-induced variation at the pantophysin locus (PanI) in a Norwegian fjord population of cod (Gadus morhua L.). Molecular Ecology 12, 3275-3286. Katz L. A, Harrison R. G. (1997) Balancing selection on electrophoretic variation of Phosphoglucose Isomerase in two species of field cricket: Gryllus veletis and G. pennsylvanicus. Genetics 147, 609-621. Kimura M, Crow J. F. (1964) The number of alleles that can be maintained in a finite population. Genetics, 49, 725738. Kimura, M. (1968) Evolutionary rate at the molecular level. Nature 217, 624-626. Klibunga S, Penman D. J, McAndrew B. J, Tassanakajon A, Jarayabhand P. (1998) Genetic variation, population differentiation, and gene flow of the giant tiger shrimp Penaeus monodon inferred from mtDNA-RFLP data. En: Advances in shrimp biotechnology. Eds. Flegel, National Center for Genetic Engineering and Biotechnology, Bangkok, 5159.

Knutsen H, Jorde P. E, Andr C, Stenseth N. R. (2003) Fine-scaled geographical population structuring in a highly mobile marine species: the Atlantic cod. Molecular Ecology 12, 385-394. Kumar S, Tamura K, Nei M. (2001) MEGA. Molecular Evolutionary Genetics Analysis 2.1, eds. The Pennsylvania State University, University Park, PA. 16802. Labacena M, Torres M, Espinosa G. (1994) Variabilidad y distancia gentica en especies de Penaeus. Rev. Inv. Mar. 15 (1), 80-87. Leberg P. L (2002) Estimating allelic richness: effects of sample size and bottlenecks. Molecular Ecology 11, 2445-2449. Lester L. J. (1979) Population genetics of Penaeid shrimp from the Gulf of Mexico. J. Heredity 70, 175-180. Louis E. J, Dempster E. R. (1987) An exact test for Hardy-Weinberg and multiple alleles. Biometrics 43, 805-811 MacMillen-Jackson A. L, Bert T. M (2003). Disparate patterns of population genetic structure and population history in two sympatric penaeid shrimp species (Farfantepenaeus aztecus and Litopenaeus setiferus) in the eastern United States. Molecular Ecology 12, 28952905. MacMillen-Jacson A. L, Bert T. (2004) Genetic diversity in the mtDNA control region and population structure in the pink shrimp Farfantepenaeus duorarum. Journal of Crustacean Biology 24 (1), 101-109. Maggioni R, Rogers A. D, Maclean N. (2003) Population structure of Litopenaeus schmitti (Decapoda: Penaeidae) from the Brazilian coast identified using six polymorphic microsatellite loci. Molecular Ecology 12, 32133217. Mann H. B, Whitney D, R. (1947) On a test of whether one or two random variables is stochastically larger than the other. Annals of Mathematical Statistics 18, 50-60. Mantel N. A (1967) The detection of disease clustering and generalized regression approach. Cancer Res. 27, 209-218. Maruyama T, Fuerst P. A. (1985) Population bottleneck and nonequilibrium models in population genetics. II. Number of alleles in a small population that was formed by recent bottleneck. Genetics 111, 675-689. Michalakys Y, Excoffier L. (1996) A generic estimation of population subdivision using distances between alleles with special reference for microsatellite loci. Genetics 142, 1061-1064. Miller J. C. (1990) RESTSITE, version 1.1. Programs for the analysis of restyriction sites and fragment data. Whitehead Institute, Cambridge. Massachussets. Moore, S. S, Wham V, Davis G. P, Byrne K, Hetzel D. J. S, Preston N. (1999) The development and application of genetic markers for the Kurama prawn Penaeus japonicus. Aquaculture 173(1-4), 19-32. Mulley J. C, Latter B. D. H. (1981) Geographic diferentiation of tropical australian Penaeid prawn populations. Aust. J. Mar. Freshwater 32, 897-906. Nei M, Li J. (1979) Mathematical model for studying genetic variations in terms of restriction endonucleases. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 79, 7195-7199. Nei M. (1978) Estimation of average heterozygosity and genetic distance from small number of individuals. Genetics 89, 583-590. Nei M, Tajima F. (1981) DNA polimorphism detectable by restriction endonucleases. Genetics 97, 145-163. Nei M. (1987) Molecular Evolutionary Genetics. Columbia University Press, New York. Nickolic M, Ruiz de Quevedo M. E. (1971) Aspectos biolgico-pesqueros de los pendidos comerciales (Penaeus duorarum y Penaeus schmitti) en Cuba. Archivo, Centro de Investigaciones Pesqueras, Cuba. Nielsen E. E, Hansen M. M, Loeschcke V. (1997) Analysis of microsatellite DNA from old scale samples of Atlantic salmon Salmo salar: A comparison of genetic composition over 60 years. Molecular Ecology 6, 487492.

Nielsen E. E, Hansen M. M, Loeschcke V. (1999) Genetic variation in time and space: Microsatellite analysis of extinct and extant populations of Atlantic salmon. Evolution, 53, 261268. Ohta T, Kimura M. (1973) A model of mutation appropriate to estimate the number of electrophoretically detectable alleles in a finite population. Genetical Research Cambridge 22, 201-204. stergaard S, Hansen M. M, Loeschcke V, Nielsen E. E (2003) Long-term temporal changes of genetic composition in brown trout (Salmo trutta L.) populations inhabiting an unstable environment. Molecular Ecology 12, 3123-3135. Paetkau D. (1999) Using genetics ti identify intraspecific conservation units: a critic o current methods. Conservation Biology 13(6), 1507-1509. Pez J, Font L, Sosa M, Morenza M (1996) Las pesqueras de camarn en la plataforma cubana. FAO Fish Rep, 544, 155 179. Pez J. (1997) The role of the ecological and anthropological factors in the last three stages of Cuban shrimp fisheries. V Meting of the WECAFC ad hoc Shirmp and Groupfish Working Group of Guianas-Brazil Continental Shelf and CFRAMP Shirmp and Groundfish subproject specification Workshop. 155-179. Pez J, Font L, Sosa M. (1997) Las pesqueras de camarn de la plataforma cubana. CARICOM Fishery Research Document 22, 131-152. Pez J, Utset, A. (1998) A Geostatistical application to the Cuban Shrimp population management at Ana Mara Gulf. Second CFRAMP/FAO/DANIDA Stock Assessment workshop on the Shrimp and Groundfish Fisheries of the Brazil-Guianas Shelf. FAO, Rome, 1-15. Pez J, Font L, Sosa M. (1999) Shrimp stock assesment in Cuban fisheries. En: Technical reports on shrimp and fish. Second CFRAMP/FAO/DANIDA stock assessment workshop on the shrimp and groundfish fisheries of the Brazil-Guianas Shelf. FAO, Rome, 97-102. Palumbi S. R, Benzie J. (1991) Large mitochondrial DNA differences between morphologically similar Penaeid shrimp. Molecular Marine Biology and Biotechnology 1(1), 27-34. Palumbi S. R. (2001) Predicting nuclear gene coalescence from mitochondrial data: the three times rule. Evolution 55, 859-868. Prez A, Puga R, Rodrguez J, Vente G. (1981) Dinmica de la pesquera mixta de camarn en el rea de Manzanillo. Rev. Cuba. Invest. Pesq. 6, 46-99. Prez A, Puga R, Rodrguez J, Vente G, Morenza M, Hondares A, Aybar F, Fundora C, Gonzlez E, Moreno M, Muoz L, y Scantlenburry C. (1984) Dinmica poblacional y evaluacin de las pesqueras del Golfo de Ana Mara. Rev. Cub. Inv. Pesq. 9 (1-2), 61-138. Prez-Farfante I. (1969) Western Atlantic shrimps of the genus Penaeus. U.S. Fish. Wild Serv. Bull. 67, 461-591. Planes S, Romans P, Lecomte-Finiger R. (1998) Genetic evidence of closed life-cycles for some coral reef fishes within Taiaro Lagoon (Tuamotu Archipelago, French Polynesia). Coral Reefs 17, 9-14. Planes S, Lenfant P. (2002) Temporal change in the genetic structure between and within cohorts of a marine fish, Diplodus sargus, induced by a large variance in individual reproductive success. Molecular Ecology 11, 1515-1524. Pongsomboon S, Whan V, Moore S. S, Tassanakajon A. (2000) Characterization of tri and tetranucleotide microsatellites in the black tiger prawn, Penaeus monodon. Science Asia 18. Potvin C, Bernatchez L. (2001) Lacustrine spatial distribution of landlocked Atlantic salmon populations assessed across generations by multilocus individual assignment and mixedstock analyses. Molecular Ecology 10, 2375-2388. Powers D. A, Schulte P. M. (1998) Evolutionary adaptations of gene structure and expression in natural populations in relation to a changing environment: a multidisciplinary approach to address the million year saga of a small fish. Journal of Experimental Zoology 282, 71-94.

Proctor R. R, Marvin K. T, Lansford L. M, Benton R. C. (1974) Phosphoglucomutase polymorphism in brown shrimp Penaeus aztecus. J. Fish Res. Board Can 31 (8). Rand D. M, Spaeth P. S, Sackton T. B, Schmidt P. S. (2002) Ecological genetics of Mpi and Gpi polymorphism in the acorn barnacle and the spatial scale of neutral and non-neutral variation. Integ. Comp. Biol. 42, 825-836. Raymond M, Rousset F. (1995a) Genepop (version 3.3): A population genetics software for exact test and ecumenicism. J Hered, 86, 248-249. Revilla R, Pez J. (1990) Los tipos de fondo y su relacin con la distribucin de las especies marinas comerciales en el Golfo de Bataban. Rev. Invest. Mar. 11, 125-138. Rice W. R. (1989) Analyzing tables of statistical test. Evolution 43, 223-225. Richardson B. U, Baverstock P. R, Adams, M. (1986) A Handbook for Animal Systematics and Population Studies. Academic Press. New York, 401. Ruzzante D. E, Taggart C. T, Cook D, Goddard S. V. (1996) Genetic differentiation between inshore and offshore Atlantic cod (Gadus morhua L.) off Newfoundland: Microsatellite DNA variation and antifreeze level. Can. J. Fish Aquat. Sci. 53, 634645. Ruzzante D. E, Taggart C. T, Doyle R. W, Cook D. (2001) Stability in the historical pattern of genetic structure of Newfoundland cod (Gadus morhua) despite the catastrophic decline in population size from 1964 to 1994. Conservation Genetics 2, 257269. Sambrook J, Fritsh E. F, y Maniatis T. (1989) Molecular cloning : a laboratory manual. 2nd ed. Col. Spring Harbor. New York. Sanger F. S, Nicklen S, Coulson A. R. (1977) DNA sequencing with chain-terminating inhibitors. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 74, 5463-5467. Schneider S, Roessli D, Excoffier L (2000) Arlequin, Version 2.000. A sofware for population genetic data analysis. Genetics and Biometry Laboratory, University of Geneva, Switzerland. Shaw C. R, Prasad R. (1970) Starch gel electrophoresis of enzymes. A compilation of recipies. Biochem. Genet. 4, 297-320. Shaw P. W, Turan C, Wright J. M, OConnell M, Carvalho G. R. (1999) Microsatellite DNA analysis of population structure in Atlantic herring (Clupea harengus), with direct comparison to allozyme and mtDNA RFLP analyses. Heredity 83, 490499. Siegel S, Castellan N, J. (1988). Non parametric statistics for the behavioral sciences. Second Edition. Mc Graw Hill. New York. Smith N, Eyre-Walker A. (2002) Adaptive protein evolution in Drosophila. Nature 415, 10221024. Sneath P. H. A, Sokal R. R. (1973) Numerical Taxonomy. W. H. Freeman and Co., San Francisco Sosa M, Iglesias M, Castro P, O. (1999) Contribucin al conocimiento de la dinmica poblacional del camarn rosado (Farfantepenaeus notialis) en el Golfo de Ana Mara. Taller 40 Aniversario del Centro de Investigaciones Pesqueras. Sponaugle S, Cowen R. K, Shanks A, Morgan S. G, Leis J. M, Pineda J, Boehlert G. W, Kingsford M. J, Lindeman K. C, Grimes C, y Munro J. (2002) Predicting self-recruitment in marine populations: biophysical correlates and mechanisms. Bulleting of Marine Science 70(1), 341-375. Storz J. F, Nachman M. (2003) Natural selection on protein polymorphism in the rodent genus Peromyscus: evidence form interlocus contrast. Evolution 57 (14), 2628-2635. Storz J. F, Dubach J. M. (2004) Natural selection drives altitudinal divergence at the albumin locus in deer mice, Peromyscus maniculatus. Evolution 58 (6), 1342-1352. Student (1908) The probable error of a mean. Biometrika 6, 1-25.

Sugama K, Haryanti, Benzie J. A. H, Ballment E. (2002) Genetic variation and population structure of the giant tiger prawn, Penaeus monodon, in Indonesia. Aquaculture 205, 37 48. Tassanakajon A, Tiptawonnukul A, Supungul P, Rimphanit C, Cook D, Jarayabhand P, Klibunga S, Boonsaeg V. (1998a) Isolation and characterization of microsatellite markers in the black tiger prawn Penaeus monodon. Mol Marine Biol and Biotech 7(1), 55-61. Tassanakajon A, Supangul P, Klinbunga S, Jarayabhand P, Boosaeng V. (1998b) Microsatellite variation in wild populations of the black tiger prawn Penaeus monodon in Thailand. En: Agricultural biotechnology: laboratory, field and market. Eds. Larkin A. Proceedings of the 4th AsiaPacific conference on agricultural biotechnology. CPN Publications, Canberra, pp 255257. Taylor M. S, Hellberg M. E. (2003) Genetic evidence for local retention of pelagic larvae in a Caribbean reef fish. Science 299, 107-109. Tessier N, Bernatchez L. (1999) Stability of population structure and genetic diversity across generations assessed by microsatellites among sympatric populations of landlocked Atlantic salmon (Salmo salar L.). Molecular Ecology 8, 169-179. Turner T. F, Wares J. P, Gold J. R. (2002). Genetic effective size is three orders of magnitude smaller than adult census size in an abundant, estuarine-dependent marine fish (Sciaenops ocellatus). Genetics 162, 1329-1339. Villaescusa A, Camacho A, Rivalta V. (1984) Polimorfismo de la fosfoglucosa isomerasa y de la fosfoglucomutasa en el camarn rosado Penaeus notialis en el golfo de Ana Mara. Ciencias Biolgicas 12, 23-29. Vucetich J. A, Waite T. A. (2001) Migration and inbreeding: the importance of recipient population size for genetic management. Genetics 2, 167-171. Wahlund S. (1928) The combination of populations and the appereance of correlation examined from the standpoint of the study of heredity. Hereditas 11, 65-106. Walsh P. S, Metzger D. A, Higuchi R. (1991) Chelex 100 as a medium for simple extraction of DNA for PCR-based typing from forensic material. BioTechniques 10, 506510. Wang J, Whitlock M. C. (2003) Estimating effective population size and migration rates from genetic samples over space and time. Genetics 163, 429-446. Waples R. S, Teel D. J (1990) Conservation genetics of Pacific salmon I. Temporal changes in allele frequency. Conservations Biology 4, 114-156. Watt W. B, Wheat C. W, Meyer E. H, Martin J. F. (2003) Adaptation at specific loci. VII. Natural selection, dispersal and the diversity of molecular-functional variations patterns among butterfly species complexes (Colias: Lepidoptera, Pieridae). Molecular Ecology 12, 12651275. Watterson G. (1978) The homozygosity test of neutrality. Genetics 88, 405-417. Weir B. S, Cockerham C. C. (1984) Estimating F-statistics for the analysis of population structure. Evolution, 38, 1358-1370. Whitlock M. C. (2002) Selection, load and inbreeding depression in a large metapopulation. Genetics, 160, 11911202. Wolfus G. M, Garca G. K, Alcivar-Warren A. (1997) Application of the microsatellites technique for analyzing genetic diversity in shrimp breeding programs. Aquaculture 152, 3547. Wright S. (1965) The interpretation of population structure by F-statistics with special regards to systems of mating. Evolution 19, 395-420. Xu Z, Dhar A. K, Wyrzykowski J, y Alcivar-Warren A. (1999) Identification of abundant and informative microsatellites from shrimp (Penaeus monodon) genome. Animal Genetics 30, 150-156. Xu Z, Primavera J. H, De la Pena L, Petit P, Belak J, Alcivar-Warren A. (2001) Genetic diversity of wild and cultured black tiger shrimp (Penaeus monodon) in the Philippines using microsatellites. Aquaculture 199, 1340.

Zaykin D.V, Pudovkin A.I. (1993) Two programs to estimate significance of 2 values using pseudo-probability test. Journal of Heredity 84, 152.

Autobibligrafa
Trabajos relacionados con el tema de la tesis presentados en eventos cientficos 17th International Congress of Biochemistry and Molecular Biology. San Francisco, California. USA (Agosto, 1997). Crustacean mitochondrial DNA characterization A. Robainas y E. Garca-Machado Young Scientist program at ASILOMAR, Monterrey, California. (Agosto, 1997). Crustacean mitochondrial DNA characterization A. Robainas y E. Garca-Machado II International Workshop La Bioqumica en la Biotecnologa Marina. (La Habana, Diciembre, 1997). Contribucin de algunas reas de anidacin de la tortuga carey a reas de alimentacin del archipilago cubano Espinosa, G., A. Robainas, G. Bordn, E. Garca Machado, M. Rmos, G. Hernndez y M. Rodrguez II International Workshop La Bioqumica en la Biotecnologa Marina. (La Habana, Diciembre, 1997). Estructura poblacional del camarn rosado en el Golfo de Ana Mara utilizando aloenzimas y ADN mitocondrial Robainas, A., Espinosa, G., Garca-Machado, E., Pez, J., Verdecia, N., Becquer, U. International Congress Biotechnology 98 (La Habana, Noviembre 1998). Population structure of Penaeus notialis assessed with allozymes and mitochondrial DNA A, Robainas. E. Garca Machado, G. Espinosa, M.Oliva, J. Paez, N. Verdecia, J.C. Mounolou and M. Monnerot. 18th International Congress of Biochemistry and Molecular Biology, ( Julio 2000) Beyond the Genome, ICC, Birmingham, UK. Microsatellites genetic markers for white shrimp Litopenaeus schmitti G. Espinosa; Jagger, M; Borrell, Y; Corona, N; Robainas, A and Deutsch, J. V Congress of Marine Science, Marcuba2000. Por una mayor integracin en el manejo de los recursos marinos y costeros (La Habana, Diciembre, 2000). Genetic variation and population structure of the pink shrimp Farfantepenaeus notialis using three genetic markers A.Robainas; Garca-Machado, E; Espinosa, G; Monnerot, M; Solignac, M and Dennebouy, N. Taller de Medio Ambiente. Facultad de Biologa (La Habana, Junio, 2001). Diversidad gentica de las poblaciones naturales de las especies de camarones cubanas econmicamente importantes A. Robainas; Espinosa, G; Garca-Machado, E. Taller de Medio Ambiente. Facultad de Biologa (La Habana, Junio, 2001). Contribucin de los marcadores moleculares al conocimiento de la estructura poblacional de las tortugas marinasGeorgina Espinosa Lpez, Rogelio Daz Fernndez, Gloria Hernndez Aguilera, Madelyn Ramos Machn, Felix Moncada Gaviln, Gonzalo Nodarse Andreu, Julia Azanza Ricardo, Ayme Robainas Barcia y Erik Garcia Machado. I Simposio Internacional de Bioqumica y Biologa Molecular (La Habana, Abril, 2001). Microsatellite loci characterisation from the pink shrimp Farfantepenaeus notialisA. Robainas; Monnerot, M; Solignac, M; Dennebouy, N; Espinosa, G and Garca-Machado, E. Biotecnologa Habana 2002. La agrobiotecnologa en el nuevo milenio (Noviembre, 2002). Marcadores moleculares en especies de camarones que habitan en Cuba Espinosa, G; Garca Machado, E; Robainas A y Borrell Y. Biotecnologa Habana 2002. La agrobiotecnologa en el nuevo milenio (Noviembre, 2002).

Estructura poblacional del camarn rosado Farfantepenaeus notialis empleando ADNmt y ADN microsatlite Robainas A; Garca Machado, E; Espinosa, G ; Blanco, G; Monnerot, M and Solignac, M. VI Congress of Marine Science, Marcuba2003 (La Habana, Diciembre 2003) Variacin temporal de la diversidad y estructura gentica en poblaciones de Farfantepenaeus notialis A. Robainas, D. A. Hernndez, E. Garca-Machado, G. Blanco, J. A. Snchez. 14th Internacional Congress of Biochemistry and Molecular Biology (Octubre 2004). Variacin espacio-temporal de la diversidad y estructura gentica del camarn rosado Farfantepenaeus notialis en la plataforma Sur de Cuba A. Robainas, D. A. Hernndez, G. Espinosa, , G. Blanco, J. A. Snchez, E. Garca-Machado

Lista de publicaciones que forman parte de la tesis Garca-Machado E, Robainas A, Espinosa G, Oliva M, Paez J, Verdecia N, y Monnerot M . (2001) Allozyme and mitochondrial DNA variation in Cuban populations of the shrimp Farfantepenaeus notialis (Crustacea: Decpoda) Marine Biology 138 (4), 701-707. Robainas A, Monnerot M, Solignac M, Dennebouy N, Espinosa G, y Graca-Machado E. (2002) Polimorphic microsatellite loci from the pink shrimp Farfantepenaeus notialis (Crustacea, Decpoda). Molecular Ecology Notes 2, 344-345. Robainas A, Espinosa G, y Garca-Machado E. (2003) Characterization of the pink shrimp Farfantepenaeus notialis (Crustacea, Decpoda) microsatellite DNA. Rev. Invest. Mar. 24 (2), 161-164. 14th Internacional Congress of Biochemistry and Molecular Biology (Octubre 2004). Variacin espacio-temporal de la diversidad y estructura gentica del camarn rosado Farfantepenaeus notialis en la plataforma Sur de Cuba A. Robainas, D. A. Hernndez, G. Espinosa, , G. Blanco, J. A. Snchez, E. Garca-Machado Robainas A, Borrell Y, Herndez D, Espinosa G, y Garca-Machado E. Temporal variation of the population structure and genetic diversity of two penaeid species Farfantepenaeus notialis and Litopenaeus schmitti assessed by allozyme loci. (enviada a Molecular Ecology) Robainas A, Blanco G, Fernndez J. A, Solignac M, y Garca-Machado E. Spatio-temporal population structure of the Cuban pink shrimp Farfantepenaeus notialis assessed by microsatellites. (enviada a Molecular Ecology). Otras publicaciones relacionadas con el tema Robainas A, y Garca-Machado E. (1997) Crustacean mitochondrial DNA characterization. The FASEB journal 11(9). Robainas A, y Garca-Machado E. (1998) ADN mitocondrial de Panulirus argus : Clonaje, cartografa de sitios de restriccin y secuenciacin parcial. Rev. Inv. Mar. 19, 2-3. Espinosa G, Jager M, Garca-Machado E, Corona N, Borrell Y, Robainas A, y Deutsch J. (2001). Microsatellites from the white shrimp Litopenaeus schmitti (Crustacea: Decapoda). Biotecnologa Aplicada 18:19-22.