iVISTA COLOMBIANA DE QUMICA. BOGOT (COLOMBIA). VOLUMBI 22. No.

2 DE 1993

OBTENCIN DEL RNA TOTAL DE HIPFISIS DE RATA MEDIANTE EL MTODO GUANIDINIO/CsCI MODIFICADO
Myriam de Gmez, Norma de Sambuccetti, Orlando Del Real y Antonio Bermudez. Departamento de Qumica, Universidad Nacional de Colombia, A.A 14490, Santaf de Bogot, Colombia. Keywords: RNA, hypophysis, Growth Hormone.

RESUMEN Se obtuvo RNA tolal de hipfisis de rata con alta pureza. Se discuten las modificaciones efectuadas al mtodo de Guanidinio/CsCl comiitunente empleado y se describe un procedimiento adecuado para efectuar hipofisectonras a ratas.

ABSTRACT Pur total RNA was obtained from ral hypophysis. Modifications to the commonly used Guanidinium/CsCl method are discussed and an adequate procedure to perform hypophysectomy in rats is described.

INTRODUCCIN Los mtodos ms empleados para aislar RNA intacto y biolgicamente activo a partir de clulas y tejidos animales (1), se pueden clasificar en dos categoras: 1- Aquellos que utilizan precipitacin selectiva basada en la solubilidad y 2Sedimentacin selectiva basada en la densidad de flotacin. Durante nuestros estudios sobre la hormona de Crecimiento (GH), requerimos de material biolgicamente activo para estudiar a nivel molecular los cambios que ocurren como consecuencia de restricciones nutricionales proteicas y/o calricas. El conocimiento de los aspectos genticos que regulan la sntesis de la hormona, de su receptor y de IGF-1, es fundamental para comprender cmo la malnutricin incide dentro del conjunto de acciones complejas que ejerce la GH (2). La obtencin de RNA total de hipfisis de rata, la efectuamos modificando una metodologa diseada con base en los estudios de Glisin (3) y Chirgwin (4).

REVISTA COLOMBIANA DE QUMICA. BOGOT (COLOMBIA), VOLUMEN 22, No. 2 DE 1993

MATERIALES Y MTODOS Tcnicas Generales Utilizadas La eliminacin de RNasas exgenas se realiz siguiendo las recomendaciones de Blumberg (5). Todo el material de vidrio o plstico, agua y dems reactivos, exceptuando los que contienen EDTA fueron tratados con DEPC al 0.1 % durante 18 h y luego se esterilizaron o secaron en estufa a 70''C por una hora. Los espectros de ultravioleta se tomaron en un espectrofotmetro marca Hewlett-Packard Diode Array modelo 8451 A. Las fotografas se tomaron con una cmara Kodak Polaroid MP4. Animales de experimentacin Se utilizaron ratas Fisher 344 (50 hembras y 50 machos) de 35 das de edad y peso promedio de 80 g, adquiridas en el bioterio del Departamento de Farmacia, Universidad Nacional de Colombia. Hipofisectomia Se efectu segn el siguiente protocolo: Los animales de experimentacin se sacrificaron por sangrado en blanco mediante puncin directa en el ventrculo izquierdo a travs del tercer espacio intercostal. A continuacin, se cort la piel a la altura de la base del crneo, desde la regin anterior hasta las orejas, y por traccin de la piel se dej al descubierto el mismo. Se realiz diseccin de los msculos occipitocervicales y maseteros. Se incidi con sierra suavemente el hueso occipital y a continuacin se levantaron completamente los huesos parietal y frontal dejando expuesto el encfalo, que se levant con sonda acanalada para dejar al descubierto la cara intema de la base del crneo. Ubicada la silla turca, se cort la membrana tentorial y se retir con traccin muy suave la hipfisis, que se transfiri al vial de crioconservacin. Extraccin del RNA Las hipfisis (256 mg) se homogenizaron durante 2 min con 3 mL de una solucin de pH 7.0 conformada por: isotiocianato de guanidina 4 M, citrato de sodio 5 mM, Sarcosil 0.5% y p-mercaptoetanol 0.1 M. El homogenizado se centrifug (12.000 g X 10 min) a 12C. Tras calentar el sobrenadante a 65C durante 2 min, se adicion CsCI slido en cantidad suficiente para alcanzar una concentracin de 0.1 mg/mL. Acto seguido se transfiri a un tubo de ul tracentrfuga que contena 3 mL de una solucin de pH 7.0 compuesta por CsC 1 5.7 M en EDTA 0.1 M, formndose 2 fases en relacin 5:3. Se centrifug (60.000 g x 12 h) a 22C, se retir el sobrenadante y el precipitado se lav con etanol del 70% (3 x 300 pL) y se redisolvi en un buffer EDTA 5 mM, Sarcosil 0.5% y p-mercaptoetanol 0.1 M (600 pL) y se extrajo (3 x 600 pL) con mezcla cloroformo: alcohol iso-amilico 24:1. Una vez separadas las fases, se precipit el RNA con acetato de sodio 3 M (57 pL) y etanol absoluto fro (1.5 mL; 2.5 Vol). El RNA separado, se lav con Etanol del 70% (2 x 100 pL) y se disolvi
64

REVISTA COLOMBIANA DE QUMICA, BOGOT (COLOMBIA). V0LUMB4 22. No. 2 DE 1993

en Hfi DEPC (160 pL), Se tom una alcuota de 10 pL y se midi su absorbancia a 260 y 280 nm. Para datos experimentales ver tabla 1. Electroforesis Se realizaron en cmara saturada no submarina en gel de agorosa 1% y buffer (pH 7.0) de fosfato 0.01 M y formaldehdo 2.2 M. Las muestras se aplicaron luego de ser previamente desnaturalizadas con formamida hasta una concentracin del 50%. La tincin de los geles se realiz con bromuro de etidio (1 pg/mL), se visualizaron las bandas en un transiluminador de luz uv y se fotografiaron.

RESULTADOS Y DISCUSIN La secuencia de fotografas 1 - 8, muestra el proceso seguido para la remocin de las hipfisis. En ella se puede observar claramente cmo la pimcin cardaca efectuada previamente a la craneotoma, permiti una buena limpieza de campo y obtener las hipfisis con menor grado de contaminacin exgena debida a la sangre. De esta manera, se obvi tambin el empleo de anestsicos o sedantes que por su accin sobre el sistema nervioso central pueden tener efecto sobre el contenido de RNA. El procedimiento seguido para las hipofisectomas permiti hacer la remocin rpida de las glndulas y la obtencin de RNA no degradado. La extraccin del RNA se realiz con mayor eficiencia y en menor tiempo agregando Sarcosil durante la homogenizacin, disminuyendo concomitantemente el tiempo de exposicin del RNA a las ribonucleasas y contrario a lo informado por algunos autores (1, 6) en ningn caso observamos ni formacin de espuma ni perturbacin del homogenizado durante el proceso. La inclusin de fenol como agente extractante, recomendada en la literatura (3), en este caso no result adecuada pues condujo a la obtencin de un RNA de relacin de absorbancias 1.56, menos puro que el obtenido sin emplear dicho compuesto, cuyo valor fue 1.71. Mediante las variaciones hechas al mtodo, entre las cuales estn la eliminj^in de protenas por centrifugacin previa al tratamiento de gradiente de CsCI, reprecipitacin con acetato de sodio y etanol, y la realizacin de las extracciones empleando nicamente mezclas de clorofonno: alcohol iso-amlico, se obtuvo un RNA de alta pureza como se comprob con el valor de la relacin de absorbancias (2.08) y la existencia de las bandas 28S y 18S en relacin 2:1 (ver fotografa 9, carriles 4,5, 7 y 8) en las electroforesis (7). En la misma fotografa, no se observan manchas en los carriles 1, 2, 3 y 6 debido a concentraciones no detectables de RNA. Con el mtodo descrito en este trabajo se alcanz un buen equilibrio entre el rendimiento y la calidad del RNA aislado.

REVISTA COLOMBIANA DE QUMICA. BOGOT (COLOMBIA), VOLUMEN 22. No. 2 DE 1993

Fotografas de la Secuencia de Pasos Seguidos para la Remocin de las Hipfisis de las Ratas Fotografa: 1. Corle de la piel; 2. Exfwsicin del crneo; 3. Diseccin de misculos; 4. Trepanacin del crneo; 5. Exposicin del encfalo; 6. Remocin del encfalo; 7. Cara interna de la base del crneo; 8. Extraccin de la hipfisis.

66

REVISTA COLOMBIANA DE QUMICA. BOGOT (COLOMBIA), V a U M E N 22. No. 2 DE 1993

Fotografa 9. Electroforesis del RNA extrado. Tabla 1. Extraccin de RNA Total

Extrac, inicial

Ensayo Volumen (pL) Alcuota (pL) Volumen Final (pL) Absorbancia 260 nm Relacin 260/280 Peso tejido (mg) RNA total (pg) RNA total (pg) / (g) tejido

Extrac, reprecipitado 70 10 400 0.523 2.08 256 133.9 523

160 10 400 0.891 1.71 256 228 891

<7

REVISTA COLOMBIANA DE QUMICA. BOGOT (CaOMBIA). VOLUMEN 22, No. 2 DE 1993

AGRADECIMIENTOS

Los autores agradecen al Programa Internacional de Ciencias Qumicas (IPICS) de la Universidad de Uppsala (Suecia), a COLCIENCIAS y al Departamento de Qumica de la Universidad Nacional de Colombia por la ayuda econmica recibida. Al doctor Augusto Rivera por sus acertados comentarios y ayuda durante la elaboracin de este artculo.

BIBLIOGRAFA
1. Sambrook, J; Fristsch, E. F.; Maniatis, T.; "Molecular Cloning ' . Cold Spring Harboor Laboratory Press. Vol. I Unidad 7. 1989. 2. Norsledt, C ; Enberg, B.; Mollcr, C ; Mathews, L. Acta Pediatr. Scand 1990,2M, 79. 3. Glisin, V.; Crkvenjakov, R.; Byus, C. Biochem. 1973,12.2633. 4. Chirgwin, 1.; Przbyla, A.; McDonald, R.; Rutter, W. Biochem. 1979,11. 5294. 5. Blumberg, D. Meth. EnzymoL 1987. 152,20. 6. Ausubel, F.M.; Brent, R.; Kingston, R.E.; Moore, D.D.; Seidtnan, J.C; Smith, J.A.; Struhl, K. 'Current Protocols in Molecular Biology'. John Wiley & Sons, Inc. N.Y., 1989. 7. Lehrach, H.; Diamond, D.; Wolney, J.; Boedtker, H. Biochem. 1977. ifi. 4743.

68