BIOQUMICA Enzimas ENZIMAS

Aceleran procesos biolgicos (biocatalizadores). Son molculas proteicas. Son muy pocas las reacciones que no son catalizadas por enzimas. Como funciona: si se pasa de A a B. Al principio solo hay A. A se transforma en B y B en A, hasta que se llega al equilibrio de la reaccin. En el equilibrio la disminucin de A se termina y el incremento de B se termina. Si a esta reaccin se le agrega una enzima A se transforma en B, solo que el equilibrio de la reaccin va a llegar en un tiempo tremendamente menor. (Ejemplo de botar un borrador) La reaccin debe ser termodinmicamente posible, la energa que tiene A es tal que permite transformarse en B (que queda con menos energa). La condicin energtica se llama energa libre. Se requiere una energa libre de activacin. La enzima hace disminuir la energa de activacin del reaccionante. Si la energa de activacin se reduce a la mitad, no implica que el tiempo tambin se disminuye a la mitad. Energa libre de activacin sin enzima Energa libre de activacin con enzima

Progreso de la reaccin CUALIDADES DE LAS ENZIMAS. Acelerar la reaccin. Son especficas: una enzima va a catalizar una o un grupo de reacciones pero no cualquier reaccin. El reaccionante sobre el que va a actuar la enzima se llama sustrato (S) y lo que resulta se llama producto (P). Las enzimas aceptan determinados grupos de sustratos. La ureasa tiene como sustrato la urea; la glucoquinasa, la glucosa; el sustrato de las proteasas son las protenas (en este caso la especifidad es relativa porque hay miles de protenas); de las nucleasas los cidos nucleico; de los aminocidos oxidasas, los aminocidos (los oxidan); hay enzimas daminocidos oxidasas, que tienen como sustrato los d-aminocidos. * Efectividad: cuando una enzima reacciona con un sustrato se forma un complejo inestable, luego la enzima se recupera intacta y se puede volver a usar miles de veces. Una molcula de enzima puede transformar muchas molculas de sustrato. La efectividad se mide por el nmero de transferencia: N de molculas de sustrato que transforma un mol de enzima en un tiempo determinado. La catalasa tiene un N de transferencia de 4 x 10 7 por segundo. La quimiotripsina: 100 por segundo. Las enzimas en su funcin son regulables, hay una serie de factores que hacen que la encima funcione o no funcione, ms rpidamente o no tan rpidamente. Se pueden regular por su cantidad: hay mecanismos que le indican a la clula que fabrique ms una determinada enzima. Se puede regular por su actividad: las enzimas estn, pero condiciones pueden inhibir la activdad de la enzima. Esteban Arriagada

BIOQUMICA Enzimas Existen 2 tipos de reacciones enzimticas: Reaccin Monosustrato: A+E AE P+E Reaccin multisustrato: A+B+E ABE P+Q+E

En este ltimo caso las 2 molculas interactan con la enzima; ambos productos no pueden entrar ni salir al mismo tiempo, por lo que se dan los siguientes casos: 1) Secuencial Ordenada: entra el primer sustrato y luego el segundo; sale el primer producto y luego el otro. P Q B A catlisis E EA EAB EPQ EQ E

2) Secuencial al azar: cualquiera de los 2 sustratos puede entrar primero y cualquiera de los 2 productos puede salir primero. A E EB B A Q EA B EAB EPQ EP P P EQ Q E

3) Mecanismo ping-pong: la enzima reacciona con el primer sustrato entrega el primer producto, toma el segundo sustrato y entrega el segundo producto. A EA E EP P E B EB EQ E Q

En trminos de regulacin, la actividad enzimtica va a depender del mecanismo de reaccin que se de con una determinada enzima y si es de un sustrato o de dos sustratos.

Esteban Arriagada

BIOQUMICA Enzimas

10

Cambios energticos de una reaccin en presencia de enzima y en ausencia de ella Cuando una enzima cataliza una reaccin lo que vara no es el cambio de energa, sino la energa libre de activacin que se necesita, lo que se traduce en una velocidad de reaccin menor. La enzima no cambia el delta de energa al pasar de un sistema a otro, no se libera ms o menos energa. El equilibrio de la reaccin expresado en la constante de equilibrio tampoco va a cambiar. Las enzimas no desencadenan la reaccin, con o sin enzima igual va a ocurrir, pero acelera la reaccin y hace que se llegue a mayor velocidad al equilibrio. Las enzimas estn presentes en todas partes de un organismo biolgico, en cualquier tejido, en cualquier lquido. Las enzimas son especficas, por lo que hay miles de enzimas. Para estudiar, por ejemplo, una enzima de la saliva se toma un poco de saliva. All habrn muchas enzimas (tambin hay de bacterias), para diferenciarla hay que aprovecharse de que son especficas y se coloca el sustrato de esa enzima y se estudia el aparecimiento de producto o desaparecimiento de sustrato. Si se dan las condiciones de temperatura y pH adecuado, aparece producto en un tiempo determinado. Si se le da ms tiempo debera aparecer ms producto. Pero este incremento del producto no es eterno, llega un momento en que no se incrementa ms; en este lapso de tiempo donde se encuentra el mismo producto, se detuvo el incremento y la reaccin llega a su equilibrio. Concentracin de Producto [P] Primera fase: se ve una lnea recta y proporcionalidad entre tiempo e incremento. Alto rendimiento o velocidad. Segunda Fase: el incremento existe, pero empieza a disminuir. La velocidad ms baja. El incremento se hace cero, se llega al equilibrio.

La velocidad inicialmente no cambia. V

Curva de progreso de una reaccin enzimtica

t Una de las formas clsicas de averiguar la presencia de una enzima, cuanta hay, si est activa, etc., es a travs de su actividad, para lo cual lo esencial es agregarle el sustrato. Si en las mismas condiciones se toma la muestra de otra persona y se encuentra una curva con menor ngulo con respecto a la horizontal, la enzima est presente pero en menor cantidad. Las enzimas pueden ser

V=P t

Tiempo 1 Fase 2 Fase

Esteban Arriagada

BIOQUMICA Enzimas

11

Simples: formadas solo por aminocidos Complejas: tienen otra parte, llamado cofactor, denominandose apo enzima a la parte proteica; el conjunto se llama holo Enzima Hay varios cofactores, como las sustancias derivadas de vitaminas, caso en que se llaman coenzimas, como el fosfato de piridoxal. Algunas estn unidas fuertemente a la enzima, otras no. Las enzimas se recuperan y pueden volver a hacer lo mismo. Tampoco las coenzimas se necesitan en grandes cantidades, por lo que no es necesario tomar tantas vitaminas. Regulacin de la actividad enzimtica Presentan un sitio preciso para el sustrato, con una conformacin precisa, llamado sitio activo de las enzimas. Adems presentan otros sitios llamados sitios regulatorios o sitio alosterio, que sirve para regular la actividad de la enzima a travs de la modificacin del sitio activo; a este sitio entran molculas que pueden regular positiva (estimular) o negativamente (inhibir) la actividad enzimtica. Un regulador positivo: cuando se une la molcula reguladora al sitio regulatorio, entonces se produce un cambio de conformacin del sitio activo, lo que permite la formacin del complejo enzima sustrato. Un regulador negativo: cambia la conformacin a fin con el sustrato, lo que impide que se forme el complejo enzima sustrato. No todas las enzimas son tan regulables. En esto hay que tener en cuenta un efecto de economa importante. La mayora de los efectos biolgicos dependen de reacciones mltiples, cascadas o secuencias de reacciones; cada una de estas etapas es catalizada por una enzima (se habla de una batera de enzimas). No hay necesidad de regular negativamente todas las enzimas de una cadena de reacciones, basta con que se regule una (economa) y todo el proceso se afectar. Los reguladores: son de muy variada naturaleza y pueden ser reguladores externos o internos. Externo: por ejemplo, la propia glucosa puede ser un regulador para que se activen ciertos mecanismos que tienen que ver con el metabolismo de la glucosa. Internos: Se puede dar que la formacin de exceso de ATP regule negativamente alguna de las enzimas de la glicolisis, as se inhibe todo el fenmeno. Si el organismo fabrica harto ATP y este se gasta, se forma mucho ADP, el que se transforma en un regulador positivo de una de las enzimas y se activa nuevamente la degradacin de la glucosa. As una enzima tendra un sitio que le permite estimular su actividad y otra que lo inhibe. Si se quiere verificar si una enzima est hay que colocarle harto sustrato (no suficiente), para as medir la concentracin de enzimas. Harto significa garantizar que por un tiempo determinado todas las molculas de enzimas tengan sustrato. Esto se llama saturacin de las enzimas por el sustrato y permite construir una curva de progreso donde la lnea recta indica que todas las enzimas estaban saturadas. En el organismo las enzimas trabajan a una concentracin saturizante; si no hay glucosa las enzimas estn insaturadas.

Esteban Arriagada

BIOQUMICA Enzimas Ecuacin Michaelis-Menten

12

Representa los efectos de la concentracin de sustrato sobre los ndices de numerosas reacciones enzimticas. La concentracin del sustrato que produce la mitad de la velocidad mxima Vi = V max [S] Km + [S] (constante de Michaeli o Km) se puede determinar graficando v i como funcin de [S]. Cuando [S] es aproximadamente igual a Km, la enzima est Vi = V max 1 = V max 1+1 2 trabajando a la mitad de su velocidad. Supongamos un valor de 1 milimolar: Vi = V max 0,1 1 + 0,1 Si la concentracin de sustrato es 0,1 Qu pasa si la concentracin de sustrato es 0,2; 100 veces Km o mil veces Km.? Cuando la concentracin del sustrato es considerablemente inferior a la requerida para producir la mitad de la velocidad mxima, la velocidad inicial Vi depende de la concentracin del sustrato. Cuando la concentracin del sustrato excede con mucho a Km la velocidad incial Vi es V max. Cuando la concentracin del sustrato es igual al valor de Km, la velocidad inicial Vi es semimxima.

V max V Efecto saturacin

Km

[S]

Constante cataltica: Se compara el valor Constante catalitica/Km con una enzima que tiene 2 sustratos: exoquinosa, que trabaja con glucosa y galactosa, pero con una de ellas tiene un valor mayor y con la otra menor. Qu significa (prueba). Ecuacin Lineweaver-Burk La ecuacin de Michaelis-Menten se reordena en forma de una lnea recta para determinar Km y V max. (Puesto que numerosas enzimas dan curvas de saturacin que no permiten fcilmente la valoracin de V max).* La Km puede ser calculada a partir de la grfica de Lineweaver-Burk o del doble recproco, donde la interseccin en y es 1/Vmax y la pendiente es Km/Vmax. La interseccin negativa en x es 1/Km. 1 = Km 1_ + 1__ V Vmax [S] Vmax

i_ Vi

Pendiente= Km Vmax

_ 1 Km

1__ Vmax 1 [S]

Esteban Arriagada

BIOQUMICA Enzimas INHIBIDORES DE ENZIMAS

13

Pueden disminuir la velocidad de la reaccin enzimtica. Esta sustancia al interactuar va a disminuir el efecto de la enzima sobre el sustrato. En un caso, cuando esta molcula se ubica en el sitio inhibidor, se altera la conformacin del sitio activo, por lo que no se va a producir el complejo enzima sustrato. Este inhibidor no se Con inhibidor puede desplazar porque la unin que forma no competitivo 1/V con la enzima es bastante fuerte (covalente). Este inhibidor se llama no competitivo y se Sin inhibidor puede graficar. El valor de la velocidad mxima disminuye, no se recupera aunque se aumente el sustrato y se mantiene para esa velocidad disminuida el valor de Km que se 1/S encuentra en ausencia de esa inhibidor.

Otra situacin ocurre cuando el inhibidor tiene la misma forma del sitio activo, ocupa el lugar del sitio activo correspondiente al sustrato, impidiendo la formacin del complejo enzima sustrato. Se puede desplazar al inhibidor del sitio activo por simple competencia, aumentando la cantidad de sustrato. Estos inhibidores no alteran la velocidad mxima, sino la Km. Se llaman inhibidores competitivos.

1/V

Con inhibidor competitivo Sin inhibidor

1/S

Existen muchas alteraciones orgnicas donde se puede intervenir conociendo la patologa y la enzimas. Todas las patologas comprometen la accin de una o ms enzimas. Ejemplo: - La angiotensina eleva la presin, se sintetiza a partir de un angiotensingeno, que luego forma angiotensina I, II y III. Cuando hay hipertensin se puede evitar la formacin de II y III con inhibidores enzimticos competitivos. - Hipercolesterolemia: el organismo sintetiza colesterol, un inhibidor hace que la sntesis del colesterol baje. Un inhibidor muy usado en el mundo (no reversible) es la aspirina. Su destino es interferir una reaccin enzimtica que lleva a la produccin de prostaglandinas (precursor: cido araquidnico); la oxigenasa tiene en su sitio activo un aminocido llamado serina con un radical con un grupo OH; sobre esta enzima acta el cido acetilsalicilico; as la serina y la enzima no funcionan, lo que produce una inhibicin irreversible. Cuando algn signo molesto ocurre en el organismo (fiebre, dolor, coagulaciones intravasculares, etc), la disminucin de la sntesis de prostaglandinas hace que estos signos se abatan.

Esteban Arriagada

BIOQUMICA Enzimas REGULACIN DE LA ACTIVIDAD ENZIMTICA.

14

Existen 2 mecanismos: Sintetizar ms o menos enzimas de acuerdo a las necesidades. Regulacin por va de la actividad. Hay muchos mecanismos reguladores de la actividad enzimtica. MECANISMOS REGULATORIOS INDUCCIN Y REPRESIN Si una persona tiene tendencia a presin baja, tender a producir ms sustancias que aumenten la presin. Esto est afectado por factores externos, por ejemplo, si una persona come mucha azcar, las enzimas degradadoras de glucosa estarn aumentadas y viceversa. MODIFICACION COVALENTE Agregado a las enzimas una sustancia que se une covalentemente a ellas se puede hacer ms activa o menos activa. La regulacin esta en la enzima que une o separa una sustancia a la enzima. El caso ms frecuente son las reacciones de fosforilacin, donde X es un grupo fosfato. Una enzima puede fosforilarse o defosforilarse. Hay enzimas que al fosforilarse se activan y otras que al desfosforilarse se activan; en cualquier caso se requiere de un sistema que fosforile y otro que defosforile. PROTEOLISIS DE PROENZIMA Hidrlisis: degradacin de enlaces peptdicos. Cuando* a una enzima (proenzima o cimgeno), se le corta un trozo, se activa. Esto lo hace otra enzima, llamada proteoltica. Este mecanismo se da en un solo sentido, no se vuelve atrs, no se le puede volver a unir el pptido a la enzima. MECANISMOS ALOSTRICOS Enzimas que aparte de su sitio activo tiene un sitio alostrico que cuando se une un efector alostrico puede favorecer o desfavorecer (positivo o negativo) la actividad de la enzima, en cualquier caso, regula. COOPERATIVIDAD POSITIVA La unin de un sustrato hace ms fcil la llegada de un segundo sustrato. Cuando llega un sustrato al primer sitio activo, se favorece la entrada de sustrato a los otros sitios activos. Normalmente se da en enzimas de estructura cuaternaria. Sustrato solo V Cooperatividad positiva

[S]

Esteban Arriagada

BIOQUMICA Enzimas ENZIMAS V/S DIAGNSTICO

15

Las enzimas estn generalmente en el interior de las clulas; existe un recambio celular constante y cuando la clula se muere, el contenido de enzimas pasa a la sangre. Por lo que se espera encontrar una cantidad basal en la sangre; pero si la cantidad de enzimas aumenta, esto es signo del deterioro de un determinado rgano, lo que ayuda al diagnstico. Las enzimas aparecen, adems, con una determinada secuencia:

Nivel Plasma

CF 5x 4x 3x 2x x 1 GOT OH But DH

3 5 7 Das post dolor torxico x = valor normal

VITAMINAS A veces las enzimas necesitan trabajar con una sustancia no proteica que se llama Coenzima (CoE). En la estructura de estas coenzimas participan las vitaminas. Las vitaminas no son coenzimas y solo algunas enzimas necesitan trabajar con coenzimas. Las coenzimas pueden servir a varias enzimas, son poco especficas. Como las enzimas son pocas, las coenzimas igual, por tanto, las vitaminas tambin se necesitan en pequea cantidad. Las vitaminas estn en todos los alimentos. Si una persona hace una dieta normal, jams necesitar vitaminas.

Esteban Arriagada

BIOQUMICA Enzimas COFACTORES ENZIMTICOS

16

Uno de ellos se refiere a las coenzimas. En general las coenzimas son sustancias que estn al lado de las enzimas contribuyendo a la eficiencia de la reaccin enzimtica. Las coenzimas son siempre cofactores positivos. En general estn hechos de vitaminas ms algn agregado. VITAMINAS Deben venir de afuera porque el organismo humano no las sintetiza. Provienen de la dieta, por lo que las vitaminas se llaman complementos de la dieta o factores accesorios de la alimentacin. Estn en los vegetales y otros animales. Las vitaminas, generalmente una vez que ingresan al organismo se catabolizan, por lo que hay que irlas reemplazando diariamente. Otra fuente importante de vitaminas es la flora bacteriana intestinal. Los antibiticos esterilizan la zona bacteriana, por lo que se puede caer en un dficit de vitaminas. Cuando ocurre una falla nutricional o un tratamiento de antiobiticos o una dificultad de absorcin de las vitaminas, aparecen signos tpicos que en su conjunto corresponden a los cuadros carenciales. ALGUNAS VITAMINAS La vitamina D contribuye a favorecer el proceso de mineralizacin de los tejidos duros; cuando hay un cuadro carencial de vitamina D, se produce una hipocalcificacin de los tejidos duros, lo que puede ocurrir en cualquier momento de la vida. Cuando esto ocurre en la infancia, la desmineralizacin se llama raquitismo; cuando ocurre en los adultos se llama osteomalacia. La vitamina K tiene un rol en la formacin de un grupo de enzimas que coagulan la sangre; cuando hay dficit de vitamina K (por antibiticos, ya que un aporte importante lo entrega la flora bacteriana) hay tendencia a sangramiento anormal largo. La vitamina C tiene rol en la formacin de colgeno, estructura que le da firmeza a todos los tejidos; cuando falta, se daan los tejidos de vasos sanguneos, por lo que se produce sangramiento por ruptura de los vasos. La gran mayora de las vitaminas deben su nombre a la funcin recin mencionada. As, la vitamina D se denomina antirraqutica, la K, antihemorrgica, la C, antiescorbuto.

Esteban Arriagada

BIOQUMICA Enzimas ROL DE LAS VITAMINAS COMO COENZIMAS

17

Una parte del sustrato liberado por una enzima no queda libre, sino unido a la coenzima. La coenzima acepta un grupo qumico del sustrato. Este complejo EC 0Eh se una a otro sustrato formando un segundo complejo, al que se unir el elemento libre. ECoEh + S2 ECoEhS2 ECoE + S2h

Hay una transferencia de un grupo qumico de un elemento a otro, donde el elemento que transfiere es la coenzima, es un aceptor transitorio del grupo qumico del sustrato. La gran mayora de las reacciones qumicas consiste justamente en esto, en degradar un sustrato y componer otro. Los grupos qumicos transferibles son muchos: metilar, carboxilar, acetilar, hidrogenar, etc. Por ejemplo, en las reacciones de oxido reduccin de la cadena respiratoria de las mitocondrias o fosforilacin oxidativa se forma ATP, aqu lo que se hace es trasladar un grupo H al oxgeno para formar agua; aqu hay coenzimas que sirven a la unin transitoria de hidrgeno. (Cuando pierde hidrgeno se oxida, cuando gana H, se reduce.). De esto deriva el nombre de la enzima y coenzima, ej: enzima oxireductasa y coenzima de co-oxidoreductasa. Hay dos etapas diferentes. La coenzima le va a quitar H al sustrato; puede ocurrir que una segunda enzima que va a entregar H a un segundo sustrato necesita una coenzima reducida; aqu se ocuparon 2 enzimas. En otras oportunidades la misma enzima toma de un sustrato y se lo entrega a otro sustrato. SH2 CoEH2 + S CoEH2 + O CoE + OH2

Coenzimas de oxidorrecudccin o oxidorreductasa: NAD (Nicotidamida adenina dinucletico) FAD (flavina adenina dinucletido; flavina es la vitamina) CoA (la vitamina es la A)

NUCLETIDOS Son biomolculas de mltiples funciones: Son precursores activados de ADN y ARN Sirven como intermediarios de algunas biosntesis importantes; en el caso de la sntesis del glicgeno es necesaria la presencia de un nucletido a base de uracilo. Se definen como la moneda universal de la energa; el ATP (adenina) y el GTP (guanina) son nucletidos. Existen muchas coenzimas cuya estructura qumica es de nucletidos. Algunos de ellos son reguladores de procesos metablicos, interfiriendo la actividad de ciertas enzimas (AMPc)

Esteban Arriagada

BIOQUMICA Enzimas ESTRUCTURA Estn formados por: Base nitrogenada, que puede ser adenina, guanina, citosita, uracilo, timina Azucar: ribosa o desoxirribosa. Grupo fosfato que puede estar 1,2 o 3 veces (mono, di o trifosforado)

18

Cuando la base nitrogenada est unida al azcar se habla de nuclesido; cuando se agrega el fosfato se transforma en nucletido. ATP: adenosina (adenina ms ribosa) tri-fosfato; es un nuclesido trifosforado, (no nucletido trifosforado). Cuando se habla de nucletidos se indica que el azcar es ribosa; cuando se habla de d-cletidos, el azcar es desoxirribosa. (El carbono 2 de la ribosa lleva un grupo OH, cuando desaparece, se transforma en desoxirribosa). BASES NITROGENADAS Se clasifican de 2 maneras Prica: Estructura cclica carbonada y nitrogenada; puede ser adenina y guanina. Pirimdica: puede ser citosina, timina y uracilo. El organismo sintetiza las bases prica y pirimdica. La sntesis es extremadamente complicada. Sin los nucletidos no se construyen cidos nucleicos, es una sntesis de las ms costosas, complicadas y reguladas, porque cuando ocurre la divisin celular se necesitan muchsmas bases nitrogenadas para construir el ADN. Las bases nitrogenadas se construyen a partir de elementos muy simples, como los aminocidos: glicina, glutamina, cido asprtico. A partir de los esqueletos formados hay que construir las bases especficas, donde nuevamente hacen aporte los aminocidos. La ribosa (pentosa) deriva de los glcidos, se come como almidn o glucgeno. Adenina + ribosa = adenosina + P = AMP + P = ADP + P = ATP. Guanina + ribosa = guanosina + P = GMP + P = GDP + P = GTP. Timina + desoxirribosa = d-timidina + P = d-TMP + P = dTDP + P = dTTP El ATP es una molcula de alto contenido de energa qumica, la que se libera al desdoblarse. Cuando una clula est en reposo funcionan los mecanismos para sintetizar ATP; cuando la clula ejerce su funcin se desdobla el ATP en ADP + P. Para sintetizar nucletidos de timina hay que transformar el nucletido uracilo, sacarle el OH (sistema enzimtico: reductasa) e insertarle un CH3 (como el nucletido de timina se llama cido timirlico, la enzima se llama timidilato sintetasa). Del uracilo se fabrica citosina y timina. Se necesita cido timirlico para construir timina para la mitosis, se necesitan varios miles de millones. Es daino que esta molcula se sintetice cuando el tejido se transforma en tumoral. Un mecanismo que frena esta sntesis consiste en inhibir la timidilato sintetasa, que constituye una de las terapias anticancergenas (frmacos fluoracilo y fluordesoxiuridilato), por medio de un inhibidor competitivo.

Esteban Arriagada