SEPARACIN DE AMINOACIDOS POR CROMATOGRAFIA EN CAPA FINA Fundamento La sustancia que se quiere separar se extrae de una fase liquida

y mvil y es retenida en una fase slida. El fenmeno depende de adsorcin por fuerzas de Van der Walls o puentes de hidrogeno, o de intercambios de iones. El mtodo de la cromatografa consiste en extender sobre una placa de vidrio o algn soporte el adsorbente deseado. La gota de solucin problema se aplica en un punto inicial conocido. La placa se coloca en una cmara cromatografica cerrada, junto con un sistema de solventes adecuado. Por capilaridad el solvente recorre la capa estacionaria y separa los componentes de la muestra en un cierto nmero de manchas. Despus de la separacin se sacan las placas y se revelan., por adicin de ciertos reactivos o por otros medios.

Procedimiento 1.- Colocar en la cromatoplaca una gota (con un tubo capilar) de la mezcla de aminocidos a una distancia del borde de 1cm. 2.- Introducir la placa con la lnea de muestra hacia abajo en la cmara de cromatografa que contiene el sistema de solventes: Acido actico: Butanol: Agua V/V:30:50:10, verifique que la altura del solvente no exceda a .5cm. 3.- Cierre la cmara y saque la placa cuando el solvente llegue a 1.5 cm aproximadamente del borde superior de esta. Marque con un lapiz la altura del solvente. 4.- Sacar las placas y revelarlas con ninhidrina en atomizador. 5.- Identificar la relacin de frentes(RF) de cada mancha por la siguiente formula: RF=Distancia recorrida por el problema /Distancia recorrida por el solvente

DETERMINACIN DE LAS PROTEINAS TOTALES DEL SUERO Y LA RELACIN ALBUMINA/GLOBULINA (A/G) La sustancia que se quiere separar se extrae de una fase liquida mvil y es retenida en una fase slida. Fundamento Las protenas totales del suero se determinan mediante la prueba de Biuret. La albmina reacciona especficamente con el colorante verde de bromocresol, por el mtodo llamado error proteico de los indicadores, formando una coloracin

verde proporcional a la concentracin de la fraccin de albmina. Que puede ser medida espectrofotometricamente. Las globulinas se calculan por las diferencias de la cantidad de las protenas totales y la fraccin de albmina. Materiales Biolgicos Suero o plasma del voluntario, suero humano, control multiparametrico (labtrol,ortho,etc.) Qumicos Solucin de verde de bromocresol Reactivo de Biuret Agua destilada

Procedimiento para protenas totales 1.- Disponer de 3 tubos: blanco, patrn y problema. 2.- Mezclar y reposar 15 minutos a temperatura ambiente. 3.- Ajustar a cero de absorbancia con el blanco (545nm). 4.- Medir la absorbancia del patrn y de la muestra. Blanco Agua .1ml destilada Suero ------problema Reactivo 5ml de Biuret Clculos
Absorbancia del problema Proteinas totales = Absorbancia del patron x patrn

Patrn ------------5ml

Problema -------.1ml 5ml

Procedimiento para albmina 1.- Disponer de 3 tubos: blanco, patrn y problema. 2.- Mezclar y reposar 15 minutos a temperatura ambiente. 3.- Medir la absorbancia del patrn y de la muestra a 630nm. 4.- Ajustar a 0 de absorbancia con el blanco. Solucin de Blanco Muestra Patrn verde 5ml 5ml 5ml

bromocresol Suero ------problema Suero control -------Agua .02ml destilada Clculos

Absorbancia del problema Proteinas totales = Absorbancia del patron

.02ml ---------------

-------.02ml -------

x patrn

Valores normales de referencia Protenas totales 6-8 grs x 100ml Albmina 3-5 grs x 100ml Globulinas 1.5-2.5 grs x 100ml

EXPERIMENTO N 2 Preparacin de soluciones porcentuales, molares y normales. Procedimiento 1.-Preparar 250ml de una solucin de cloruro de sodio al 0.9% (p/v).Describa los clculos para conocer la cantidad de cloruro de sodio que tiene que pesar y la cantidad de agua destilada que es necesario aadir. 2.-Preparar 500ml de una solucin de acido fosfrico (H3PO4) 0.1M tomando como base para sus clculos los siguientes datos:El peso molecular(PM) del acido fosfrico es de 98, siendo su pureza del 85% y la densidad de 1.71 g/cm3 escriba los clculos que hizo para conocer el volumen del acido fosfrico concentrado que utilizo para preparar 500ml de dicha solucin. 3.-preparar 500 ml de una solucin de NaOH al 0.1 M cuyo peso molecular es de 40. Describa los clculos para ver cuantos gramos tiene que pesar de NaOH y cuantos mililitros de agua tiene que utilizar para preparar los 500ml.

4.-Preparar dos soluciones: una de HCL y otra de NaOH al 0.01 N .La cantidad que se requiere de ellas es de 100 ml de cada una. El PM del HCL es de 36.5 y su densidad a 200C es de 1.060 g/cm3. E l conocer las cantidades de solutos (HCL y NaOH) y de solvente(agua destilada) que hay que utilizar

ESPECTROFOTMETRO Aparato que sirve para medir la intensidad de la luz absorbida por una solucin, en un estrecho intervalo de longitudes de onda del espectro UV/visible. A mayor intensidad de color de una solucin es mayor la absorcin de la luz, de modo que esa absorcin pueda utilizarse como medida directa en la intensidad de color. La relacin entre la concentracin de una sustancia con la absorcin se basa en la ley de beer-Lambert, la cual enuncia que la concentracin de una sustancia es directamente proporcional a la cantidad de luz absorbida al logaritmo de la luz transmitida. Sus componentes son los siguientes: 1.- Fuente de luz 2.- Filtro 3.-Cubeta con la muestra 4.-Celula fotoelctrica 5.- Amplificador y medidor La fuente de luz tiene como caracterstica su gran intensidad sobre una limitada superficie, algunas muestras deben ser manejadas con luz ultravioleta o infrarroja para lo que son utilizadas lmparas con caractersticas especiales. El filtro es un dispositivo cuya funcin consiste en permitir el paso de luz de una longitud de onda especfica. El filtro no debe absorber cantidades apreciables de la luz en una longitud de onda determinada, la cual debe ser de color complementario al de la muestra.

Caractersticas del espectro uv-visible Color Nombre Muestra Regin de la de la absorbida espectral luz longitud absorbida de en nm onda Verde Rojo visible 620-700 azuloso Azul Naranja Visible 600-620

verdoso Azul Amarillo Visible Violeta Verde Visible amarillo Purpura Verde Visible Rojo Verde Visible azuloso Naranja Azul Visible verdoso Amarillo Azul Visible Verde Violeta Visible amarillo ---------- No UV visible ---------- No UV lejano visible

575-600 555-575 505-555 495-505 475-495 430-475 380-430 220-380 180-220

Las cubetas o celdas analticas sueles ser tubos redondos o cuadrados de espesor constante, de diversos materiales como vidrio, cuarzo o materiales plsticos. Una muestra puede presentar una absorbancia de cero, es decir, que no absorbe la radiacin incidente y por lo tanto transmite el 100% de esa radiacin. La situacin opuesta se tiene con un cuerpo opaco a un intervalo determinado del espectro electromagntico, en este caso la transmisiones nula y la absorcin es completa. La determinacin cuantitativa de una sustancia depende de la relacin de la cantidad de radiacin absorbida por la muestra problema y la absorbancia de una sustancia de referencia cuya concentracin es conocida . Los espectrofotmetros permiten efectuar la comparacin entre la seal obtenida por una mezcla que no contiene la sustancia en estudio y otra que si la tiene para poder tener la seal de esa diferencia.