Bioqumica de los Alimentos, Junio 2011

Determinacin de la actividad enzimtica de peroxidasa de rbano (Raphanus sativus L.) a diferentes concentraciones de enzima.
Diamara Vergara F. Laboratorio de Bioqumica de Alimentos, Universidad de Chile. 1. Introduccin Las peroxidasas son oxidorreductasas que catalizan la reaccin entre H2O2 y diversos compuestos reductores y la mayora son hemo protenas que contienen hierro (III) protoporfirina IX, como grupo prosttico. Las peroxidasas de plantas clase III (EC 1.11.1.7) participan en lignificacin, el mecanismo de defensa de daos fsicos o tejidos infectados, la degradacin del cido indol actico y la respuesta de estrs entre otros procesos fisiolgicos. Dado que la peroxidasa es relativamente estable a altas temperaturas es usada como indicador de escaldado en los productos vegetales procesados. Adems, la facilidad para medir su actividad ha permitido su uso como enzima modelo en el estudio de la estructura de la protena y las reacciones y funciones de la enzima. Las races de rbano (Armoracia rusticana) son la principal fuente de la peroxidasa, y la ms abundante isoenzima (HRP-C) es ampliamente utilizada en sntesis orgnica, junto con anlisis enzimtico, ensayos de quimioluminiscencia y terapia del cncer. (1) Por lo que es de gran importancia saber cmo se mide la actividad enzimtica de la enzima. En este trabajo se determin la actividad enzimtica de la peroxidasa de rbano; ocupando como sustrato guayacol, que es oxidado a un complejo coloreado de tetraguayacol en presencia de peroxidasa (fig.1), la velocidad de formacin del color rojo ladrillo que se lee en espectrofotmetro puede ser utilizada como medida de la actividad enzimtica de la enzima.(2)

Fig.1 Reaccin utilizada para medir actividad enzimtica de

peroxidasa de rbano. El sustrato guayacol incoloro pasa a tetraguayacol de color rojo ladrillo.

2. Materiales y Mtodos 2.1 Materiales Para la extraccin de la enzima se utiliz agua destilada y una gasa como filtro. En el ensayo enzimtico se ocup 6%, solucin de guayacol al 1% en 50% etanol 50% , agua destilada, cubeta de plstico de 1 cm y el extracto enzimtico de rbano preparado anteriormente. 2.2 Metodologas 2.2.1 Extraccin de Peroxidasa Luego de pelar los rbanos estos fueron molidos en una licuadora a velocidad frape, con agua en una proporcin 1 gr rbano: 1 ml , por 15 segundos. La pasta obtenida se filtr; se llev 5 ml de filtrado a un tubo con tapa y se guardo en hielo para su posterior uso. 2.2.2 Curva de progreso La solucin de 6% se llev a 1%. Se prepar 5 ml de solucin A compuesta por: 4,7 ml , 0,1 ml guayacol y 0,2 ml . Para la primera curva de progreso con la enzima a cierta concentracin, se diluy el extracto de enzima con un factor de dilucin de 10 (concentracin 1); con 0,5 ml de esta solucin y 2 ml se prepar la solucin B. La

Bioqumica de los Alimentos, Junio 2011 sol. A se utiliz como blanco de la reaccin y se llev a cero en un espectrofotmetro a 470 nm. A continuacin se agreg 1,5 ml de sol. A y 1,5 ml de sol. B en una cubeta, se agit y se ley en el espectrofotmetro en ese instante, luego se registr la absorbancia cada 15 segundos por 3 minutos. Este mismo procedimiento se efectu para la segunda y tercera curva de progreso, en donde el factor de dilucin del extracto de enzima fue 20(concentracin 2) y 30 (concentracin 3) respectivamente. 3. Resultados Las absorbancias (Abs) obtenidas para las diferentes concentraciones de enzimas se muestran en la tabla 1. Tiempo (min) Abs (seg) Conc. 1 0 15 30 45 60 75 90 105 120 135 150 165 180 0 0,25 0,5 0,75 1 1,25 1,5 1,75 2 2,25 2,5 2,75 3 0,006 0,03 0,065 0,102 0,136 0,171 0,204 0,235 0,264 0,296 0,325 0,354 0,38 Abs Conc. 2 0,003 0,008 0,018 0,033 0,05 0,068 0,087 0,105 0,123 0,141 0,157 0,173 0,188 Abs Conc. 3 0,003 0,007 0,015 0,026 0,04 0,054 0,069 0,085 0,101 0,116 0,13 0,146 0,157

Curvas de Progreso
0.45 0.4 0.35 0.3 0.25 0.2 0.15 0.1 0.05 0 -0.05 0 y = 0.1276x + 0.0061 y = 0,0659x -0,0101

Absorbancia

y = 0.055x - 0.0095

Concentracin 1 Concentracin 2

2 Tiempo (min)

Concentracin 3

Fig. 2 Curvas de Progreso para las diferentes concentraciones

de peroxidasa de rbano, se aprecia linealidad en las curvas.

Con las pendientes de estas cuervas podemos calcular velocidad inicial (m), obtenindose: m (conc. 1): 0,1276 m (conc.2): 0,0659 m (conc.3): 0,055 Como el volumen total (VR) de la reaccin fue 3 ml y el coeficiente de extincin molar () del completo tetrahidroguayacol es 7.019 (3), ocupamos la siguiente frmula para calcular la actividad enzimtica (U):

Tabla 1 Absorbancias de tetraguayacol para las distintas

concentraciones de enzima peroxidasa.

Obtenindose las curvas de progreso para cada concentracin de la enzima. (fig.2)

Esta ecuacin se multiplica por el factor de dilucin total que fueron respectivamente 100, 200 y 300. Se obtiene finalmente: Conc 1: 5,454 U Conc 2: 5,633 U Conc 3: 7,052 U 4. Discusiones y Conclusin De acuerdo a las actividades enzimticas obtenidas para la misma enzima, se puede apreciar que U de la enzima con concentracin 3 se distanci de los otros dos valores, esto pudo deberse por ocupar solucin A preparada posteriormente a la que se ocup para las dos primeras concentraciones de enzima, y tambin porque la primera lectura en el

Bioqumica de los Alimentos, Junio 2011 espectrofotmetro (t=0) de esta concentracin se demor unos segundos ms en comparacin con los dos primeros casos; esto llev a tener un coeficiente de determinacin ( ) en la regresin lineal de 0,991 mientras que en las dems concentraciones se acercaban a 1. Por lo que en este caso sera propicio eliminar este dato si es que se quiere sacar un promedio de las actividades enzimticas para informar la actividad enzimtica de la peroxidasa de rbano en el extracto original, (5,544 U). En el periodo de tiempo utilizado para medir las absorbancias (3 min) no se alcanz el equilibrio de la reaccin, esto se puede ver en fig.2 donde se aprecia claramente curvas lineales. Debido a esto, 3 minutos ocupados para realizar el anlisis es un buen periodo de tiempo para determinar la actividad de la peroxidasa, pero esto no es un periodo de tiempo general ya que depende de la concentracin de la enzima, pues a mayor concentracin de enzima la reaccin llegar al equilibrio ms rpido por lo que se deber hacer el anlisis en un periodo de tiempo menor. Por lo anteriormente sealado la concentracin enzima ptima para realizar este anlisis es la concentracin 2, ya que la concentracin 1 tiene una leve curvatura pues al estar ms concentrada llegara al equilibrio rpidamente. La reaccin con guayacol es un buen mtodo para determinar la presencia de peroxidasa y en este caso para medir la actividad de la enzima, por ser fcil de cuantificar y rpida. En este anlisis de la actividad se trabaj con diferentes concentraciones de enzima pero con una misma cantidad de sustrato por lo tanto por los datos obtenidos no se pueden calcular los parmetros cinticos como lo son Km y Vmx ya que para esto se necesitan realizar diferentes curvas de progreso para diferentes cantidades de sustrato a concentracin de enzima constante. 5. Bibliografa
(1) Rodrguez-Cabrera, N.; Regalado, C.; Garca-Almendrez, B. Cloning, Heterologous Expression and Properties of a Recombinant Active Turnip Peroxidase. J. Agric. Food Chem. 2011. (2) Schmidt Hebbel, H.; Pennacchiotti Monti, I. Las enzimas en los alimentos, su importancia en la qumica y la tecnologa de los alimentos. Fundacin Chile. 1982. Pag. 66 (3) Abugouch, L.; Horacio; M. Gua de Trabajos Prcticos. Bioqumica de Alimentos. Facultad de Ciencias Qumicas y Farmacuticas. Universidad de Chile. 2011.