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ACTIVIDAD ALELOPTICA, CUANTIFICACIN DE COMPUESTOS FENLICOS Y ELUCIDACIN ESTRUCTURAL DEL EXTRACTO POLAR DE LA CORTEZA DEL Theobroma obovatum.

Heinz REBATTA1, Bianca SORIA2, Priscila SUREZ1

Notas de Autores:
1,2

Estudiantes del VI nivel/XII ciclo de la FFBQ - UNAP.

hrebatta_89@hotmail.com, Calle Urubamba #264, movistar: 958601783.

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SUMARIO Se evalu la actividad aleloptica de la corteza de Theobroma obovatum mediante el mtodo del bioensayo con semillas germinadas de Lactuca sativa. El contenido de los diversos compuestos fenlicos se realiz por cromatografa lquida de alta rendimiento (HPLC) y se elucid estructuralmente por medio de cromatografa de gases acoplada a espectrometra de masas (GCMasa), del extracto polar de esta corteza. El contenido de polifenoles totales se determin, por el mtodo de Folin - Ciocalteu a partir de una curva patrn utilizando como estndar catequina. Los resultados de la actividad aleloptica obtenida mostraron que presenta un EC50 de el contenido de fenoles se relaciona muy bien con la actividad mostrada por el extracto de la planta estudiada.

Palabras claves: aleloptica, cromatografa de gases acoplada a espectrometra de masas, cromatografa lquida de alta rendimiento, elucidar, fenoles totales y Theobroma obovatum.

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ABSTRACT It was evaluated the activity allelopathic of the bark of Theobroma obovatum by the bioassay of lettuce germinated method. About the concentration of the different phenolics components were determined by liquid chromatography of high performance (HPLC) and the polar extracts of this bark were elucidated by gas chromatography coupled to mass spectrometry (GC-Mass). The content of total phenolics were determined starting from a patron curve of the standard reagent of catechin, by the Folin - Ciocalteu method. The allelopathic activity is referred to the bioassay with germinated seeds of Lactuca sativa. The obtained results showed that the phenols content is related very well with the activity allelopathic shown by the extract of the studied plant.

Key words: allelopathic, chromatography of gases coupled to spectrometry of mass, liquid chromatography of high yield, to elucidate, total phenols and Theobroma obovatum.

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AGRADECIMIENTO

Agradecemos al Dr. Vctor Sotero Sols, al Dr. Kember Meja Carhuanca, a la Blga. Elsa Rengifo Salgado, a la Ing. rika Dvila y a la Ing. Claudia Merino, por la asesora, apoyo, esfuerzo y conocimientos que nos brindaron en la realizacin del trabajo.

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CONTENIDO Introduccin.....7 Metodologa.....8 Material Vegetal.......8 Preparacin del Extracto Polar.....8 Actividad Aleloptica Bioensayo con Lactuca sativa..8 Mtodo de Folin Ciocalteu....9 Cuantificacin por HPLC.9 Elucidacin por GC-Ms.10 Resultados..11 Discusiones....20 Conclusiones..21 Referencias bibliogrficas..22 TABLAS Tabla 1. Concentracin Mnima Inhibitoria...11 Tabla 2. Polifenoles totales de T. obovatum..12 FIGURAS Figura 1. Actividad Aleloptica Bioensayo con Lactuca sativa.11 Figura 2. Curva Estndar de Catequina.12 Figura 3. Espectros HPLC de cido Clorognico.....13 Figura 4. Espectro de HPLC del extracto polar T. obovatum14 Figura 5. Curva de calibracin de cido clorognico....14 Figura 6. Perfil Cromatogrfico15

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Figura 7. (a) Phenol...16 Figura 8. (b) Phosphonic acid, (p-hydroxyphenyl)16 Figura 9. (c) Mequinol...17 Figura 10. (d) Phenol, 3,4-dimethoxy....17 Figura 11. (e) Phenol, 2-propyl..18 Figura 12. (f) Homovanillyl alcohol..18 Figura 13. (g) Phenol, 3,4,5-trimethoxy19

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INTRODUCCIN Theobroma obovatum, de la familia Malvaceae, es un rbol pequeo que se desarrolla en bosque hmedo de tierra firme con suelo frtil alcanzando hasta 15 m de alto con el tronco de 10 a 25 cm de dimetro; las ramas jvenes y brotes estn cubiertos de pelos lanosos deciduos. Su fruto es elptico a obovado, de 5-7 cm de largo y 3-4 cm de ancho. Su rea principal de distribucin, es en el occidente de Brasil y en Per [1]. El trmino alelopata fue utilizado por primera vez por Hans Molisch en 1937. Rice en 1984 la defini como los efectos perjudiciales o benficos que son, ya sea directa o indirectamente, el resultado de la accin de compuestos qumicos que, liberados por una planta, ejercen su accin inhibitoria en otra
[2] [3]

. Esta definicin ha sido modificada y actualmente se utiliza la de la

[4]

Sociedad Internacional de Alelopata (SIA), en la cual se incluyen bacterias, hongos y algas

En la bsqueda de compuestos naturales con actividad aleloptica se han encontrado diversos compuestos como fenlicos, compuestos nitrogenados y otros. Los fenoles es el origen de funciones biolgicas tales como la antimutagnica, anticancergena, antienvejecimiento y tambin para fines agroindustriales como herbicidas, plaguicidas y fungicida de manera natural sin afectar el ambiente y salud humana, por lo tanto se formula el siguiente problema: Presenta actividad aleloptica y compuestos fenlicos, el extracto polar de la corteza de Theobroma obovatum? El objetivo principal de este estudio fue evaluar la actividad aleloptica, determinar los compuestos fenlicos y elucidar dichas estructuras del extracto polar de la corteza del T. obovatum.

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METODOLOGA Material Vegetal. Se colect la parte biolgica de corteza en buenas condiciones de la especie amaznicos en estudio que hayan alcanzado la madurez vegetativa, que ser colectada del Centro de Investigaciones Allpahuayo (CIA) del IIAP, ubicado en el km 26.7 de la carretera Iquitos Nauta, en el mbito de la Reserva Nacional Allpahuayo - Mishana, en el Distrito de San Juan, Provincia de Maynas, Regin Loreto. Se trabajar con la parte de corteza, debido a que segn la etnobotnica, se pueden encontrar los principios activos. Se someter a secado por estufa a 33 C por 14 das, y posteriormente pulverizar. Preparacin del Extracto Polar. Pesar 20 g de corteza seca pulverizada de T. obovatum. Se adicionar 180 ml de etanol 96%, para luego llevar a reflujo por 30 minutos y dejar reposar y enfriar en oscuridad hasta el da siguiente. Filtrar la muestra con papel filtro y embudo, en oscuridad, luego lavar el residuo del papel filtro con 100 ml (repetir 2 veces). Concentrar en rotavapor, y dejar secar en la estufa, extrayendo del baln y obtener la muestra seca y concentrada llamado Extracto Polar, guardar en un frasco a 20 C, hasta el anlisis. Actividad Aleloptica Bioensayo con Lactuca sativa [5] [6]. Germinada las semillas, se prepara las placas de control y de extracto a cinco concentraciones establecidas. Se pesa 1 g de corteza pulverizada, luego adicionar 10 ml de etanol 96%, colocar el disco de papel filtro a cada microplaca y preparar los patrones del extracto polar a 50; 10; 3; 1; 0,3 mg/ml. Se adiciona 100 l del extracto a la concentracin requerida, dejando evaporar el solvente por 20 horas, luego de agrega 700 l de agua destilada, para sustituir el solvente

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evaporado. Transferir 5 semillas previamente germinadas a cada microplaca, incubando las microplacas a 20C por 52 horas, en oscuridad y finalmente medir el crecimiento. Todas las muestras fueron analizadas por triplicada. Mtodo de Folin - Ciocalteu [7]. Realizacin de curva de calibracin, con estndar de catequina Q.P. mediante el siguiente procedimiento. Catequina Vol. MeOH Cd. STD 0 STD 1 STD
2

Vol. Cateq. (l) 0 333 300 333 207

Vol. Final Concent. Concent. (l) 1000 1000 1000 1000 1000 (M) 0 344 1033 3445 10335 ( mM) 0 0.344 1.033 3.445 10.335

(mg/ml) 0 0.1 0.3 1 3

(l) 1000 667 700 667 793

STD 3 STD 4

Seguidamente adicionar 20 L del extracto en tubos de 2.5 ml, adicionar 1.58 ml de agua ultrapura, posteriormente se adicion tanto a estndares como a extractos 100 l de la solucin de Folin-Ciocalteu, homogenizar en el vortex e incubar al ambiente por 1min, adicionar 300 l de la solucin de NaCO 3 al 20%, incubar al ambiente por 2 horas. Para determinar la cantidad de compuestos fenlicos producidos durante la reaccin, se coloc 1 ml de la muestra en cubetas de poliestireno de 1 cm x 1 cm x 4.5 cm, leyndose la absorbancia en el espectrofotmetro UV-Vis a 700 nm. Todas las muestras fueron analizadas por triplicado. Cuantificacin por HPLC Medir 2 ml de la muestra diluyendo en 5 ml de agua/metanol (2:8) y 2 mM de fluoruro de sodio, homogenizar con ayuda del vortex y centrifugar a 5000 rpm por 45 minutos de 2-5C. Se procede a filtrar 1 ml de muestra e inyectar al equipo de HPLC.

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Se prepara las siguientes soluciones de estndares de compuestos fenlicos (catequina, epicatequina, epigallocatequina y quercetina) de 0,03125; 0,0625; 0,125; 0,25; 0,5 y 1 mg/ml diluidos en agua/metanol (2:8). Luego se prepara la fase mvil agua/metanol (88:12). Elucidacin por GC-Ms. Columna m/z Tiempo Tipo Flujo Horno : BR-5ms FS 15 m. x 0.25 mm x 0.25 m Max T: 350 : 35 500 : 35.00 min : Full Scan : 1 ml/min : 200 C

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RESULTADOS

Figura 1. Actividad Aleloptica Bioensayo con Lactuca sativa. Tabla 1. Concentracin Mnima Inhibitoria. PROMEDIO (mm) Hipoctilo Radcula Control 50 mg/mL 10 mg/mL 3 mg/mL 1 mg/mL 0,3 mg/mL 8 4 6 7 8 8 17 2 4 8 12 17 DESV. EST. Hipoctilo 0.8367 0.4472 0.8367 0.5477 0.8367 0.5477 Radcula 4.3932 0.0000 0.5477 1.1402 0.0000 2.4900 % INHIBICIN Hipoctilo 0 50 25 12.5 0 0 Radcula 0 88.24 76.47 52.94 29.41 0

En la figura 1, se observa que el extracto polar T. obovatum a una concentracin de 3 mg/mL logra inhibir el crecimiento de L. sativa en un casi 53%, a diferencia de las concentraciones de 10 y 50 mg/mL, que logran inhibir ms del 50% del crecimiento de L. sativa a un porcentaje de 76 y 88 respectivamente.

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Mtodo de Folin - Ciocalteu.

Figura 2. Curva Estndar de Catequina Tabla 2. Polifenoles totales de T. obovatum Polifenoles Totales Especie Vegetal (gEC/100g) T. obovatum 30,9333 0.4618

El valor de absorbancias obtenidas para cada uno de las concentraciones evaluadas (0.00; 0.10; 0.30; 1.00 y 3.00 mg/ml) se sustituy en la ecuacin de la curva de calibracin de catequina que se muestra en la figura 2; en donde y es igual a la absorbancia y x es igual a la concentracin. En la tabla 2, el extracto polar de la corteza de T. obovatum destaca la alta concentracin de polifenoles totales.

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Determinacin de la Concentracin del Extracto por HPLC.

Figura 3. Espectros por HPLC a diferentes concentraciones de cido Clorognico.

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Figura 4. Extracto polar T. obovatum.

Figura 5. Curva de calibracin de cido clorognico.

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Cuantificacin del Extracto:

F.D.= 3,5 x x

Elucidacin por CG-Masa.

Figura 6. Perfil Cromatogrfico.

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Relacin de probables compuestos segn espectrograma general:

Figura 7. (a) Phenol

Figura 8. (b) Phosphonic acid, (p-hydroxyphenyl)

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Figura 9. (c) Mequinol

Figura 10. (d) Phenol, 3,4-dimethoxy

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Figura 11. (e) Phenol, 2-propyl

Figura 12. (f) Homovanillyl alcohol

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Figura 13. (g) Phenol, 3,4,5-trimethoxy

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DISCUSIONES Segn Fujii (2007), estudio y demostr que los altos y ptimos resultados de actividad

aleloptica, son de extractos de hojas frescas, pero en el presente estudio demostramos que en el extracto de corteza seca y pulverizada, brinda un porcentaje favorable de inhibicin del crecimiento de la radcula de L. sativa. Sotero et al., (2011), determin la concentracin de fenoles totales de Theobroma cacao L. con un valor (g/100g GAE) de 12,1015 0,0218
[9]

, en comparacin del extracto de corteza de T.

obovatum nos present una alta concentracin de polifenoles totales (g/100g CE) de 30,9333 0.4618, demostrando que ste brinda una concentracin mucho mayor que T. cacao L. En la elucidacin, los picos ms altos del espectrograma general, son posibles compuesto ajenos a los fenlicos tales como hexanol; diisoctil ftalato y algunos cidos carboxlicos y alcanos, caso contrario los compuestos de mayor inters (fenlicos) en el presente estudio, corresponden a picos de menor elevacin como se mencionan en los resultados.

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CONCLUSIONES - Las concentraciones 50; 10; 3 mg/ml del extracto polar de T. obovatum tienen diversos niveles de poder inhibitorio ms del 50% sobre la semilla germinada de Lactuca sativa, donde destaca la tercera concentracin, ya que el propsito de la alelopata es lograr una inhibicin mayor o igual que el 50% a la mnima concentracin. - Cuantificacin de cido clorognico del extracto polar de la corteza de T. obovatum, es 0,0215g/100g. - La elucidacin de compuestos bioactivos (fenlicos), present molculas, tales como Phenol; Phosphonic acid, (p-hydroxyphenyl); Mequinol; Phenol, 3,4-dimethoxy; Phenol, 2propyl; Homovanillyl alcohol; Phenol, 3,4,5-trimethoxy. - Este estudio contribuye al conocimiento de la actividad aleloptica del extracto de la corteza de T. obovatum del tipo polar, en particular de los compuestos fenlicos.

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REFERENCIAS BIBLIOGRFICAS 1. Mora A, Zapata B, Hunter D. 2009. Libro rojo de parientes silvestres de cultivos de Bolivia. 330-332. 2. Vyvyan J. 2002. Allelochemicals as leads for new herbicides and agrochemicals. Tetraheadron. (58), 1631-46. 3. Bhowmik P, Inderjit C. 2003.Challenges and opportunities in implementing allelopathy for natural weed management. CP. (22), 661-71. 4. Macas F, Molinillo J. 1999. Terpenoids with potencial use as natural herbicide templates. En: Cutler H, Cutler S. Biologically active natural products: Agrochemicals. 1 ed. 15-31. 5. Ebana K, Okuno K. 2007. Rice Allelopathy. En: Fujii Y, Hiradate S. Allelopathy: New concepts and methodology. 1 ed. India: Edenbridge Ltd. (16), 256-57. 6. Kato-Noguchi H, Tanaka Y. 2004. Allelopathic potencial of Citrus junos fruit waste processing industry. Bio Tech. Japn. (94), 211-14. 7. Vela E. 2012. Evaluacin de la actividad aleloptica in vitro del extracto metanlico de Attalea moorei, Attalea salazarii y Attalea sp. [tesis pre grado]. Universidad Nacional de la Amazona Peruana. Facultad de Farmacia y Bioqumica. 49. 8. Gil M, Toms-Barbern F. High-performance liquid chromatography of honey flavonoids. Journal of Chromatography. (643), 41-46. 9. Sotero V. 2011. Evaluacin de la actividad antioxidante y compuestos fenlicos en pulpa y semillas de cuatro frutales amaznicos de la familia Sterculiaceae. Soc. Qumica. LimaPer.