Departamento de Ciencias Biolgicas Facultad de Ciencias Exactas Universidad Nacional de La Plata

Regulacin de la transcripcin en eucariotas

Niveles de activacin transcripcional

Estado inactivo basal

Estado desreprimido

Estado activado

Des-represin Des-represin

Activacin Activacin

Eucromatina y heterocromatina
Heterocromatina: Se tie fuertemente
Condensada durante todo el ciclo celular Transcripcionalmente inactiva Contiene DNA repetitivo y algunos genes Puede ser constitutiva: telmeros, centrmeros y DNA repetitivo facultativa: regulada por desarrollo y diferenciacin

Eucromatina y heterocromatina
Heterocromatina: Se tie fuertemente
Condensada durante todo el ciclo celular Transcripcionalmente inactiva Contiene DNA repetitivo y algunos genes Puede ser constitutiva: telmeros, centrmeros y DNA repetitivo facultativa: regulada por desarrollo y diferenciacin

Eucromatina:

Regiones menos condensadas que se tien menos Transcripcionalmente activa Contiene genes housekeeping y genes individuales Fibra de 30 nm organizada en loops

El rol del insulator

La organizacin de los lazos depende del insulator

Condensacin del cromosoma

Cmo ocurre el cambio de la cromatina del estado inactivo a activo?

Algunas regiones de la cromatina nunca son activas. En otras regiones, ocurre una activacin que involucran tanto modificaciones como remodelamiento o reposicionamiento de las histonas en un gen.

Cmo se modifica la estructura de la cromatina para que ocurra la transcripcin?

1. Los activadores modifican covalentemente la lisina 9 del N terminal de H3 por acetilacin / metilacin 3. Los activadores remodelan la estructura del nucleosoma

2.Las histonas modificadas reclutan otras protenas

Qu sucede con la cromatina durante la elongacin?

Velocidad de transcripcin in vivo = 1200-2000 nucl/min. Velocidad in vitro = 100-300 nucleotides/min. Se observa un pausado frecuente y freno aun en ausencia de cromatina

Un gran nmero de protenas y complejos proteicos regulan la etapa de elongacin de la transcripcin Suprimen el pausado (back-tracking 2-4 nucleotides) Promueven el pausado Evitan el frenado (irreversible backsliding 7-14 nucleotides) Permiten la elongacin a travs de la cromatina

El DNA que forma parte de la heterocromatina est muy metilado

Metilacin del DNA

Metilacin de novo por accin de DNA metiltransferasa (DMT) especfica de DNA no metilado Mantenimiento de la metilacin por DMT especfica de DNA hemi-metilado Ambas ocurren en CpGs y dentro de transposones, elementos repetidos y dentro de los genes. Islas CpG Los genes poseen en su extremo 5' secuencias ricas en GC Muchas secuencias GCs son parte de sitios de unin de factores de transcripcin como Sp1. En el genoma humano, hay aproximadamente 45 000 islas CpG y la mitad de ellas se encuentran asociadas a genes house-keeping En las islas CpG se metila la citosina de dinucletidos 5-CG-3 La citosina metilada es reconocida por protenas (como MeCP2) que reclutan histona deacetilasas Altos niveles de CG metilados se asocian a bajos niveles de histonas acetiladas y viceversa Altos niveles de histonas acetiladas se encuentran en genes que se transcriben activamente, por lo que las islas CpG metiladas suprimen la expresin gnica si se encuentran en zonas promotoras. Los patrones de metilacin varan de un tipo celular a otro.

Identificacin de secuencias metiladas

Es posible diferenciar el DNA metilado empleando enzimas de restriccin que reconocen la misma secuencia, pero muestran distinta sensibilidad a la presencia de grupos metilo.

Regulacin epigentica
- Herencia epigentica: alteraciones heredables que no afectan a la secuencia de nucletidos del DNA Ejemplos: Metilacin - La metilacin de adenina en bacterias controla la transcripcin de algunos genes - En animales la metilacin se produce en las citosinas de los dobletes 5'-CG-3' (tambin llamados CpG). Hay promotores con alta concentracin de CG (islas CpG). Cuando el promotor est metilado no hay transcripcin. - El estado de metilacin se perpeta en las divisiones mitticas y, en algunos casos, meiticas.

En la impronta parental, el patrn de metilacin, establecido durante la gametognesis es distinto para cada sexo.

Factores de transcripcin o transactivadores

La mayora de los activadores eucariticos forman dmeros

Homo y heterodmeros

TFs en el genoma humano

Factores de transcripcin: dominios de interaccin con DNA

Helix-turn-helix Zinc-fingers basic domain Helix-loop-helix Helix-Turn-Helix

Factores de transcripcin: dominios de interaccin con DNA

ZINC FINGERS

Factores de transcripcin: dominios de interaccin con DNA

DIMERIZATION MOTIFS: THE LEUCINE ZIPPER
SCHEMATIC OF A LEUCINE ZIPPER BETWEEN TWO aHELICES

MODEL OF TWO -HELICES JOINED BY A LEUCINE ZIPPER IN A PARALLEL COILED COIL STRUCTURE

WEAVER 2e: FIGS. 12.12, 12.13 WEAVER: FIG. 12.11

Factores de transcripcin: dominios de interaccin con DNA

helix-loophelix proteins
bind to the DNA binding domains of enhancer elements

Estructura modular de los factores de transcripcin

-Poseen una estructura modular
Dominio de unin a DNA Dominio transactivador

Actividad de un TF quimrico lexA-GAL4

Sistema de doble hbrido de levadura: interaccin entre protenas

Fusin protena con AD

Fusin DNA BD protena

Silenciamiento de genes
El silenciamiento de un gen puede ocurrir por:
- Silenciamiento gnico transcripcional (TGS) (ej la metilacin del DNA provoca el
superenrollamiento)

- Inactivacin por un regulador negativo (represor) - Silenciamiento gnico postranscripcional (PTGS) (degradacin mediada por RNAs
pequeos)

Silenciamiento de genes
El silenciamiento de un gen puede ocurrir por:
- Silenciamiento gnico transcripcional (TGS) (ej la metilacin del DNA provoca el
superenrollamiento)

- Inactivacin por un regulador negativo (represor) - Silenciamiento gnico postranscripcional (PTGS) (degradacin mediada por RNAs
pequeos)
Inactivacin mediante una protena represora (poco comn en eucariotas)
La protena represora puede reconocer: 1-Elementos distales. Silenciamiento especfico de tejido: se encarga de silenciar en una clula los genes que son especficos de otras. Ej seales de hormonas esteroideas 2-Elementos proximales la protena CDPC: recibe el nombre de desplazamiento de CAAT porque impide que la caja CAAT sea reconocida por sus protenas especficas. 3-El promotor basal el represor global Dr1/DRAP1: es un heterodmero que se une a TBP para evitar que interacte con TFIIB

Diferenciacin y desarrollo

Respuesta a estmulos ambientales

Regulacin hormonal
Es frecuente que un mismo factor de transcripcin controle a un gran nmero de genes. Esto se debe a la existencia de elementos de respuesta para ese factor en los promotores o potenciadores de esos genes. Ejemplos: HSE: elemento de respuesta a choque trmico GRE: elemento de respuesta a glucocorticoides SRE: elemento de respuesta al suero

Respuesta a hormonas esteroideas mediada por elementos GRE.

Estas hormonas se sintetizan en respuesta a un gran variedad de actividades neuroendocrinas y controlan crecimiento, desarrollo de tejidos y homeostasis corporal. Todas tienen un modo de accin similar: se unen a un receptor citoplsmico haciendo que este se una al DNA y active la transcripcin

Regulacin transcripcional durante la diferenciacin y el desarrollo

A cada elemento cis se unen distintos factores de transcripcin, especficos de tejido o constitutivos.

MyoD

Myogenesis

E-Box E NeuroD

E-Box E E

Neurogenesis

E-Box

B-cell development

Regulacin transcripcional durante la diferenciacin y el desarrollo

El desarrollo de los rganos de la flor est determinado por factores de transcripcin

Homeogenes

Programas de desarrollo

Redes regulatorias

Gene Regulatory Networks

[Davidson & Erwin, 2006] http://cs273a.stanford.edu [Bejerano Aut07/08] 36

SILENCIAMIENTO MEDIADO POR RNA

Afecta diversos procesos: Afecta diversos procesos: --Regulacin de la expresin de genes endgenos Regulacin de la expresin de genes endgenos --Transposones Transposones --Defensa ante virus Defensa ante virus --Modificacin de la cromatina Modificacin de la cromatina Puede ocurrir a nivel Puede ocurrir a nivel --Transcripcional Transcripcional --Postranscripcional Postranscripcional --estabilidad del mRNA estabilidad del mRNA --niveles de traduccin niveles de traduccin

Silenciamiento transcripcional mediado por RNAi

RNA interference-mediated heterochromatin assembly. Tandem repeats or multiple copies of transposable elements in heterochromatin generate dsRNAs, or those that can be converted to a double-stranded form, through the activity of RNA-dependent RNA polymerase (RdRP). The dsRNA is cleaved by Dicer to produce small interfering RNAs (siRNAs). These siRNAs are thought to guide histone methyltransferases (HMTs) to the chromatin to modify histone H3 on lysine 9 (H3K9). The methylated form of H3 is bound by Swi6 or HP1, which also associates with the methyltransferases, to maintain the silenced state. m, methyl group.

Matzke, et al. Nature Reviews Genetics. 6: 24-35 (2005)

siRNAs pueden sileciar el DNA mediante metilacin de citosinas o mediante enzimas que modifican las histonas
NH2 N O N
e as er f ns tra yl eth NH2 M

N O N

CH3

~
cytosine

~
5-methylcytosine

El mecanismo preciso por el cual los siRNAs silencian el DNA an no se conocen pero involucra la accin de dos RNA polimerasas especficas de plantas RNA Polimerasa IV (Pol IV) and RNA Polimerasa V (Pol V).

AGO

La metilacin es llevada a cabo por DNA metiltransferasas.

DNA metiltransferasa

Modificacin de histonas

Metilacin del DNA

Las plantas poseen complejos de RNA polimerasas adicionales que contribuyen al silenciamiento
RNA DNA RNA Polymerase

Complex Distribution RNA Polymerase I All eukaryotes RNA Polymerase II All eukaryotes RNA Polymerase III RNA Polymerase IV RNA Polymerase V All eukaryotes Land plants Angiosperms

Function Production of rRNA Production of mRNA, microRNA Production of tRNA, 5S rRNA Production of siRNA Recruitment of AGO to DNA

Facultad de Ciencias Exactas - Universidad Nacional de La Plata Curso Biotecnologa de Organismos Superiores

Caractersticas de RNAs pequeos

siRNA: Una clase de RNAs de doble cadena de 21-22 nt de
longitud generado a partir de dsRNAs de origen viral o celular. Los siRNAs silencian genes promoviendo el clivaje de mRNAs cuyas secuencias son exactamente complementarias, o dirigiendo la modificacin de DNA cuya secuencia es exactamente complementaria.

miRNA: Una clase de RNA de simple cadena de 21-26 nt de

longitud codificados por los genomas de la mayor parte de los organismos multicelulares que se han estudiado. Algunos estn evolutivamente conservados y estn regulados durante el desarrollo. Silencian genes mediante clivaje de mRNA complementarios o bloqueo de la traduccin.

Mtodos
1- Qu elementos del DNA son reconocidos por un factor de transcripcin?
Elementos comunes en genes corregulados Selex Inmunoprecipitacin de cromatina

2- Qu factores de transcripcin se unen a una determinada secuencia?

Sistema de un hbrido de levadura

Identificacin de dominios regulatorios

Gal4 Gal4 Mig1

GAL1

CGG

CCG

CGG

CCG

CCCCW

ATGACTAAATCTCATTCAGAAGAA

La regulacin gnica depende de secuencias en el DNA reconocidas por factores de transcripcin Por qu son difciles de detectar?
Los dominios suelen ser cortos y degenerados (6-8 bp) Se encuentran a una distancia variable del sitio de inicio

La caracterizacin del transcriptoma permite identificar genes co-regulados

Los microarreglos o la secuenciacin masiva (deep sequencing) permiten caracterizar la expresin de todos los genes en distintas situaciones fisiolgicas
Microarreglos Deep sequencing

Genes co-regulados

Identificacin de dominios regulatorios

A partir de varias secuencias promotoras
Por ejemplo, genes corregulados en un microarray
GTATAA ACCGAGAGTATAAGCTTACGTGACTTGCATGATCTTGCGATGTGTGTTCAGCT ATCGTACGTTGAGGAGAGGCGGTAATAGAAGTACGTCGATGTCGTCGTACAT GTAATA TTCCTATAAGATCGACTGTAGGGAGAGTCTCTGAGAGTATTGCTGGCATGTG CTATAA GTATTA ACTTCGAGGAGAGATTCTCTAGATCTATGCTGTGGTATTAAGAGATCTCTAG ATCGATGCGCTGATCGCTATAATATATCGGCGGTATCTGGTTGATCTGGTGT CTATAA GACTGATGTATCGTATCTGATCTGTCGGTATAATATAGCTGTCTGATTAGTTG GTATAA GTAATA TCTCTAGATGCTGTGCTGATGGTCTTATCGATGTGCGACGGTAATAGTATCCT

Buscar elementos comunes

Representation de dominios
GTATAA CTATAA GTCTTA ATATAC GTAATA TTGTAC GTATTA GTATTC ATCTAA

GTATAA
Consensus

GTATAM
IUPAC

Complex Dependency Graphical Models

ATATAC GTAATA ATCTAA GTATAA GTATTC GTATTA TTGTACGTCTTA

Nonparametric Graph or Bag of Words

PSSM

CTATAA

Los dominios consenso suelen ser conservados

human dog mouse rat CTCTTAATGGTACACGTTCTGCCT----AAGTAGCCTAGACGCTCCCGTGCGCCC-GGGG CTCTTA-CGGGGCACATTCTGCTTTCAACAGTGGGGCAGACGGTCCCGCGCGCCCCAAGG GTCTTAGGAGGCT-CGATCGCC---------------------GCCTGCATTATT----GTCTTAGTTGGCCACGACCTGC---------------------TCATGCATAATT----***** * * * * * *

Err

human dog mouse rat

CGGGTAGGCCTGGCCGAAAATCTCTCCCGCGCGCCTGACCTTGGGTTGCCCCAGCCAGGC CAGGC---CCGGGCTGCAGACCTGCCCTGAGGGAATGACCTTGGGCGGCCGCAGCGGGGC --------------CACAAGCCTGTGGCGCGC-CGTGACCTTGGGCTGCCCCAGGCGGGC --------------CACAAGTTTCTC---TGC-CCTGACCTTGGGTTGCCCCAGGCGAG* * * ********** *** *** * TGCGGGCCCGAGACCCCCG-------------------GGCCTCCCTGCCCCCCGCGCCG CGCGGGCCCAGGCCCCCCTCCCTCCCTCCCTCCCTCCCTCCCTCCCTGCCCCCCGGACCG TGCAGGCTCACCACCCCGTCTTTTCT---------------------GCTTTTCGAGTCG -GCATACACCCCGCCTTTTTTTTTTTTTT---------TTTTTTTTTGCCGTTCAAG-AG ** * * ** ** * *

human dog mouse rat

Gabpa

Sirve para detectar dominios? No, se requiere confirmacin

Systematic Evolution of Ligands by EXponential enrichment (SELEX)

coleccin de DNA secuencias al azar Incubacin con el factor de transcripcin

Afinidad/EMSA PCR

ChIP-chip

Promoter motifs match known TF binding sites

Compare discovered motifs to TRANSFAC database of 125 known motifs
MCS 46.8 34.7 32.7 31.2 30.8 29.7 29.5 26.0 25.0 22.6 19.8 17.9 14.9 14.6 14.2 13.9 12.6 12.5 12.4 12.2 11.9 11.7 11.0 10.7 Discovered motif GGGCGGR GCCATnTTg CACGTG GATTGGY TGAnTCA GGGAGGRR TGACGTMR CGGCCATYK TGACCTTG CCGGAARY SCGGAAGY CATTTCCK TTGTTT TATAAA RTAAACA SMGGAAGT YYATTGTT TCACGTG YATGYAAAT GGGnnTTTCC GGGnnTTTCC TGACGTGK TTAYRTAA CCAWWnAAGG CCAWWnAAGG TAAWWATAG Factor SP-1 YY1 MYC NF-Y AP-1 MAZ CREB NF-MUE1 ERR? ELK-1 GABP STAT1 SRY TBP FOXO1 PEA3 SOX-5 SREBP-1 OCTAMER P65 ATF6 E4BP4 SRF MEF-2 Known motif GGGCGGG GCCATnTT SCACGTG YSATTGGYY CTGASTCA GGGGAGGG TGACGTMA CGGCCATCT TGACCTTG CCGGAART VCCGGAAG CAnTTCCS KTWGTTT TATAAATW RWAAACAA MGGAWGT ATTGTT ATCACGTGAY ATCACGTGAY ATGCAAATnA ATGCAAATnA GGGRATTTCC TGACGTGG RTTACRTAAY CCAWATAWGGM YTAAAWATAGCY

Mtodos
1- Qu elementos del DNA son reconocidos por un factor de transcripcin?
Elementos comunes en genes corregulados Selex Inmunoprecipitacin de cromatina

2- Qu factores de transcripcin se unen a una determinada secuencia?

Sistema de un hbrido de levadura

Mtodos de screening y estudio de factores de transcripcin

Sistema de un hbrido de levadura
Se dispone de un promotor y se quieren identificar factores que interacten con los elementos cis de dicho promotor

Se incorpora la construccin reportera a la levadura

BoxI BoxI BoxI BoxI 4X cis elements reportero

Mtodos de screening y estudio de factores de transcripcin

Sistema de un hbrido de levadura
Se dispone de un promotor y se quieren identificar factores que interacten con los elementos cis de dicho promotor

cDNA Library

AD

DNA-BP

AD

BoxI BoxI BoxI BoxI 4X cis elements

reportero

reportero