SECRETARIA DE COMERCIO Y FOMENTO INDUSTRIAL

NORMA MEXICANA

NMX-F-199-1970

METODO DE PRUEBA PARA LA DETERMINACION DE LA PRESENCIA DE MICROORGANISMOS COLIFORMES EN GRENETINA

COLIFORMS MICROOREANISMS PRESENCE DETERMINATION IN EDIBLE GELATINE - TEST METHOD

DIRECCION GENERAL DE NORMAS

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METODO DE PRUEBA PARA LA DETERMINACION DE LA PRESENCIA DE MICROORGANISMOS COLIFORMES EN GRENETINA COLIFORMS MICROOREANISMS PRESENCE DETERMINATION IN EDIBLE GELATINE - TEST METHOD

1 ALCANCE El mtodo descrito en la presente Norma establece el procedimiento para determinar la presencia de microorganismos coliformes (ver 8.1.4). 2 APARATOS Y EQUIPO Incubadora con regulador de temperatura. Autoclave capaz de mantener 1 0.05 kg/cm2 (15 1 lb/pulg2) de presin manomtrica. Refrigerador. Balanza analtica con sensibilidad de 0.0001 g. Tubos de ensayo de 16 x 150 mm. Tubos de fermentacin de Durham de 5 x 25 mm. Cajas de Petri de 100 x 20 mm. Pipetas graduadas serolgicas de 1 ml de capacidad. 3 MATERIALES Y REACTIVOS 3.1 Materiales

Algodn absorbente esterilizado. Gasa esterilizada. 3.2 Reactivos

Las substancias que a continuacin se mencionan deben ser reactivos analticos a menos que se indique otra cosa. Cuando se hable de agua se entiende agua destilada. Medios de cultivo para anlisis (ver 8.1.1).

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Caldo lactosado. En 1000 ml de agua, se disuelven 3 g de extracto de carne, 5 g de peptona y 5 g de lactosa. Caldo lactosado, bilis y verde brillante.- En 1000 ml de agua se disuelven 20 g de bilis, 10 g de peptona, 10 g de lactosa y 0.0133 g de verde brillante. Preparacin de los tubos de ensayo con los medios de cultivo. - Se agrega 10 ml del medio de cultivo a los tubos de ensayo que contienen invertidos los tubos de fermentacin Durham, se tapan, se esterilizan a 1 kg/cm2 de presin durante 15 minutos y despus se guardan en el refrigerador. Agar-Endo. En 1000 ml de agua se suspenden 10 g de peptona, 10 g de lactosa, 10 g de fosfato dipotsico, 15 g de agar, 0.5 g de fucsina bsica y 2.5 g de sulfito de sodio, se hierve ligeramente hasta disolucin completa (ver 8.1.2). 4 PREPARACION DE LA MUESTRA De la muestra representativa obtenida segn la Norma de Calidad para Grenetina pura comestible NMX-F-43 en vigor, se toman 10 g y se envasan en condiciones de esterilidad en recipientes de cristal hermticos. 5 PROCEDIMIENTO 5.1 En condiciones de esterilidad se pesa 1.0 gramo de muestra transfirindola a una botella de dilucin que contiene 99 ml de agua estril, se agita enrgicamente durante 2 minutos. 5.2 Prueba presuntiva

5.2.1 Se inoculan 4 tubos que contienen caldo lactosado, con 1 ml de la solucin de muestra se incuban 24 horas a 35C y al cabo de ese tiempo se observa la produccin de gas, si no la hay, se prolonga este tiempo a 48 horas, al cabo del cual se observa. Los tubos con produccin de gas se consideran positivos. 5.3 Pruebas confirmativas

5.3.1 Prueba A) con caldo lactosado bilis y verde brillante.- De un tubo con caldo lactosado inoculado en el cual se haya producido gas (se agita suavemente para mezclar), se pasa con un asa de dimetro no menor de 3 mm una pequea cantidad a 4 tubos de fermentacin con caldo lactosado, bilis y verde brillante. Se incuba durante 48 3 hrs a 35 0.5C. La formacin de gas en cualquiera de los tubos constituye una prueba positiva. 5.3.2 Prueba B) con placas de Endo. Se inoculan por estria dos placas por lo menos con una pequea cantidad de caldo lactosado inoculado que haya producido gas (no debe tomarse de la membrana sobrenadante sino del lquido a unos 5 mm de la superficie). Se incuban las placas invertidas a 35 0.5C durante 24 2 horas. Las colonias que se

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desarrollan en la placa de Endo se describen como: Tpicas, nucleadas con o sin lustre metlico (positivas), Atpicas, opacas, anucleadas, mucoides despus de 24 horas de incubacin y de color rosa (positivas), Negativos los restantes 6 CALCULOS Y RESULTADOS La presencia de organismos coliformes se manifiesta por: a) Fermentacin de los caldos lactosado y lactosado, bilis y verde brillante. b) Desarrollo de colonias positivas en las placas de Endo. 7 REPRODUCCION DE LA PRUEBA Teniendo en cuenta la ndole de la determinacin, los resultados obtenidos deben ser similares al menos en 3 de 4 determinaciones hechas al mismo tiempo. 8 APENDICE 8.1 Observaciones

8.1.1 Los medios de cultivos para anlisis pueden ser medios deshidratados, que deben ser disueltos, envasados y esterilizados a 1 kg/cm2 de presin de vapor durante 15 minutos. 8.1.2 El medio de agar Endo se debe utilizar el da de su preparacin, esterilizndose durante 15 minutos a 1 kg/cm2 de presin. 8.1.3 Los microorganismos coliformes son bacilos gram negativos no esporulados aerobios y anaerobios facultativos que fermentan la lactosa con produccin de cido y gas en 24 horas de incubacin a 35C. 8.1.4 Toda operacin de sembrado inculo, transferencia o preparacin de cultivos o medios nutritivos deben efectuarse en condiciones de esterilidad que son los siguientes: un recinto debidamente aislado del exterior, que posea una lmpara de luz ultravioleta de esterilizacin, la que se enciende dos horas mnimo, antes de la operacin. En el momento en que se efecta sta, se suprime la actividad de la lmpara y se encienden dos mecheros Fisher efectuando las operaciones antes sealadas entre stos. 8.2 Normas de referencia

Norma de calidad de grenetina pura comestible NMX-F-43 en vigor. 8.3 Bibliografa

8.3.1 Standard Methods for the examination of dairy products, microbiological and chemical. 1st. edition. American Public Health Association 1941, New York.

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8.3.2 British Standard Methods of Sampling and Testing Gelatines. B.S. 757:1959 British Standards Institution. British Standards House, 2 Park St.,London, W.I.

Mxico, D.F., Octubre 1, 1970

EL C. OFICIAL MAYOR

LIC. FRANCISCO RODRIGUEZ GOMEZ

Fecha de aprobacin y publicacin: Octubre 22, 1970