Principios de Microscopa

Tamao celular
Las clulas son las unidades bsicas de los seres vivos. La mayora de ellas son de pequeo tamao por lo que es indispensable el uso de instrumentos como los microscopios para su visualizacin. Por lo general el poder resolutivo del ojo humano es de 0.2mm (200 m), o sea la menor distancia vista o resuelta por el ojo humano es de dos lneas separadas 1mm de distancia; si hay dos lneas a 200 m de distancia, veremos una sola lnea. Los microscopios se utilizan para mejorar la resolucin. La invencin del microscopio en el siglo XVII posibilit la serie de descubrimientos posteriores de las mismas. En 1665 Robert Hooke utilizando un microscopio ptico simple, examin un corte de corteza, encontr que esta estaba compuesta por una masa de diminutas cmaras, que llam clulas, en realidad slo vi las paredes celulares, ya que este tejido est muerto a la madurez y las clulas ya no tienen contenido. Mas tarde, Hoock y algunos de sus contemporneos observaron clulas vivas.

Existen dos tipos bsicos de microscopios: PTICOS y ELECTRNICOS.

Microscopio ptico (MO)

El tipo de microscopio ms utilizado es el microscopio ptico, que se sirve de la luz visible para crear una imagen aumentada del objeto. El microscopio ptico ms simple es la lente convexa doble con una distancia focal corta. Estas lentes pueden aumentar un objeto hasta 15 veces. Por lo general se utilizan microscopios compuestos, que disponen de varias lentes con las que se consiguen aumentos mayores. Algunos microscopios pticos pueden aumentar un objeto por encima de las 2.000 veces. El microscopio compuesto consiste en dos sistemas de lentes, el objetivo y el ocular, montados en extremos opuestos de un tubo cerrado. El objetivo est compuesto de varias lentes que crean una imagen real aumentada del objeto examinado. Las lentes de los microscopios estn dispuestas de forma que el objetivo se encuentre en el punto focal del ocular. Cuando se mira a travs del ocular se ve una imagen virtual aumentada de la imagen real. El aumento total del microscopio depende de las longitudes focales de los dos sistemas de lentes. El equipamiento adicional de un microscopio consta de un armazn con un soporte que sostiene el material examinado y de un mecanismo que permite acercar y alejar el tubo para enfocar la muestra. Los especimenes o muestras que se examinan con un microscopio son transparentes y se observan con una luz que los atraviesa, y se suelen colocar sobre un rectngulo fino de vidrio. El soporte tiene un orificio por el que pasa la luz. Bajo el soporte se encuentra un espejo que refleja la luz para que atraviese el espcimen. El microscopio puede contar con una fuente de luz elctrica que dirige la luz a travs de la muestra. Los MO actuales tiene un poder resolutivo de 0,2 m, unas mil veces la del ojo humano.

Uso del microcopio ptico compuesto

 Sistema ptico OCULAR: Lente situada cerca del ojo del observador. Ampla la imagen del objetivo. OBJETIVO: Lente situada cerca de la preparacin. Ampla la imagen de sta. CONDENSADOR: Lente que concentra los rayos luminosos sobre la preparacin. DIAFRAGMA: Regula la cantidad de luz que entra en el condensador. FOCO: Dirige los rayos luminosos hacia el condensador. Sistema mecnico SOPORTE: Mantiene la parte ptica. Tiene dos partes: el pie o base y el brazo. PLATINA: Lugar donde se deposita la preparacin. CABEZAL: Contiene los sistemas de lentes oculares. Puede ser monocular, binocular, .. REVLVER: Contiene los sistemas de lentes objetivos. Permite, al girar, cambiar los objetivos. TORNILLOS DE ENFOQUE: Macromtrico que aproxima el enfoque y micromtrico que consigue el enfoque correcto. MANEJO Y USO DEL MICROSCOPIO PTICO 1. Colocar el objetivo de menor aumento en posicin de empleo y bajar la platina completamente. Si el microscopio se recogi correctamente en el uso anterior, ya debera estar en esas condiciones. 2. Colocar la preparacin sobre la platina sujetndola con las pinzas metlicas. 3. Comenzar la observacin con el objetivo de 4x (ya est en posicin) o colocar el de 10 aumentos (10x) si la preparacin es de bacterias. 4. Para realizar el enfoque: 1. Acercar al mximo la lente del objetivo a la preparacin, empleando el tornillo macromtrico. Esto debe hacerse mirando directamente y no a travs del ocular, ya que se corre el riesgo de incrustar el objetivo en la preparacin pudindose daar alguno de ellos o ambos. 2. Mirando, ahora s, a travs de los oculares, ir separando lentamente el objetivo de la preparacin con el macromtrico y, cuando se observe algo ntida la muestra, girar el micromtrico hasta obtener un enfoque fino. 5. Pasar al siguiente objetivo. La imagen debera estar ya casi enfocada y suele ser suficiente con mover un poco el micromtrico para lograr el enfoque fino. Si al cambiar de objetivo se perdi por completo la imagen, es preferible volver a enfocar con el objetivo anterior y repetir la operacin desde el paso 3. El objetivo de 40x enfoca a muy poca distancia de la preparacin y por ello es fcil que ocurran dos tipos de percances: incrustarlo en la preparacin si se descuidan las precauciones anteriores y mancharlo con aceite de inmersin si se observa una preparacin que ya se enfoc con el objetivo de inmersin. 6. Empleo del objetivo de inmersin: 1. Bajar totalmente la platina.

2. Subir totalmente el condensador para ver claramente el crculo de luz que nos indica la zona que se va a visualizar y donde habr que echar el aceite. 3. Girar el revlver hacia el objetivo de inmersin dejndolo a medio camino entre ste y el de x40. 4. Colocar una gota mnima de aceite de inmersin sobre el crculo de luz. 5. Terminar de girar suavemente el revlver hasta la posicin del objetivo de inmersin. 6. Mirando directamente al objetivo, subir la platina lentamente hasta que la lente toca la gota de aceite. En ese momento se nota como si la gota ascendiera y se adosara a la lente. 7. Enfocar cuidadosamente con el micromtrico. La distancia de trabajo entre el objetivo de inmersin y la preparacin es mnima, aun menor que con el de 40x por lo que el riesgo de accidente es muy grande. 8. Una vez se haya puesto aceite de inmersin sobre la preparacin, ya no se puede volver a usar el objetivo 40x sobre esa zona, pues se manchara de aceite. Por tanto, si desea enfocar otro campo, hay que bajar la platina y repetir la operacin desde el paso 3. 9. Una vez finalizada la observacin de la preparacin se baja la platina y se coloca el objetivo de menor aumento girando el revlver. En este momento ya se puede retirar la preparacin de la platina. Nunca se debe retirar con el objetivo de inmersin en posicin de observacin. 10.Limpiar el objetivo de inmersin con cuidado empleando un papel especial para ptica. Comprobar tambin que el objetivo 40x est perfectamente limpio. MANTENIMIENTO Y PRECAUCIONES 1. Al finalizar el trabajo, hay que dejar puesto el objetivo de menor aumento en posicin de observacin, asegurarse de que la parte mecnica de la platina no sobresale del borde de la misma y dejarlo cubierto con su funda. 2. Cuando no se est utilizando el microscopio, hay que mantenerlo cubierto con su funda para evitar que se ensucien y daen las lentes. Si no se va a usar de forma prolongada, se debe guardar en su caja dentro de un armario para protegerlo del polvo. 3. Nunca hay que tocar las lentes con las manos. Si se ensucian, limpiarlas muy suavemente con un papel de filtro o, mejor, con un papel de ptica. 4. No dejar el portaobjetos puesto sobre la platina si no se est utilizando el microscopio. 5. Despus de utilizar el objetivo de inmersin, hay que limpiar el aceite que queda en el objetivo con pauelos especiales para ptica o con papel de filtro (menos recomendable). En cualquier caso se pasar el papel por la lente en un solo sentido y con suavidad. Si el aceite ha llegado a secarse y pegarse en el objetivo, hay que limpiarlo con una mezcla de alcoholacetona (7:3) o xilol. No hay que abusar de este tipo de limpieza, porque si se aplican estos disolventes en exceso se pueden daar las lentes y su sujecin. 6. No forzar nunca los tornillos giratorios del microscopio (macromtrico, micromtrico, platina, revlver y condensador). 7. El cambio de objetivo se hace girando el revlver y dirigiendo siempre la mirada a la preparacin para prevenir el roce de la lente con la muestra. No cambiar nunca de objetivo agarrndolo por el tubo del mismo ni hacerlo mientras se est observando a travs del ocular. 8. Mantener seca y limpia la platina del microscopio. Si se derrama sobre ella algn lquido, secarlo con un pao. Si se mancha de aceite, limpiarla con un pao humedecido en xilol. 9. Es conveniente limpiar y revisar siempre los microscopios al finalizar la sesin prctica y, al acabar el curso, encargar a un tcnico un ajuste y revisin general de los mismos -oOo-

Tincin de Gram

A. Objetivo del ejercicio Ejercitarse en interpretar los resultados de la tincin de Gram para adiestrase y ser capaces de diferenciar las bacterias gram positivas de las gram negativas

B. Fundamentos de la tincin de Gram Esta tincin fue desarrollada empricamente por Christian Gram en 1884. A pesar del tiempo transcurrido, la tincin apenas se ha modificado y es uno de los primeros pasos que se realiza para cualquier identificacin bacteriana. La tincin de Gram requiere cuatro soluciones: Primer colorante: Es un colorante bsico que en contacto con las clulas cargadas negativamente, reacciona con ellas colorendolas. El ms utilizado es el cristal violeta. Solucin mordiente: Fija las tinciones y aumenta la afinidad entre el colorante y las clulas. Los mordientes empleados suelen ser sales metlicas, cidos o bases, como, p.ej., el Lugol. Agente decolorante: es un disolvente orgnico, p.ej. alcohol-acetona (1:1). Colorante de contraste: Es un colorante bsico de distinto color que el primer colorante, como, p.ej., la safranina o la fucsina.

La tcnica es capaz de diferenciar dos grandes grupos de eubacterias: Gram positivas (G+) y Gram negativas (G-). Los dos grupos bacterianos que distingue esta tcnica difieren en el color con el que finalmente aparecen.

Las bacterias Gram+ se teirn de azul por el cristal violeta y no perdern esta coloracin durante los pasos sucesivos.

Las bacterias Gram- perdern la coloracin inicial del cristal violeta en los siguientes pasos y se teirn de rosa debido a la safranina. La diferencia est determinada por la composicin de su envoltura celular. Las Gram+ poseen una malla de peptidoglicano en su parte ms externa, mientras que las Gram-, recubriendo una fina capa de peptidoglicano, presentan una membrana externa que envuelve toda la clula.

C. Materiales y reactivos

Portaobjetos para frotis bacterianos Solucin de cristal violeta al 1% Solucin de safranina al 0,5% Solucin diluida de yodo (Lugol) Alcohol-acetona (1:1) o bien alcohol al 95% Cubeta de tinciones Microscopio y aceite de inmersin

D. Procedimiento de la tincin (Ver pelcula de la tincin)

1 Preparar los frotis bacterianos y fijar a la llama

2. Teir con cristal violeta 2 min. 3. Quitar el exceso de colorante sin lavar con agua

4. Cubrir con Lugol 1 min. 5. Quitar el exceso de Lugol sin lavar.

6. Decolorar con alcohol de 96 o alcohol-acetona durante 1 minuto 7. Lavar con abundante agua para eliminar el resto de disolvente.

8. Teir con safranina 1min. 9. Lavar con agua para eliminar el colorante de contraste.

10. Secar la preparacin al aire.

11. Examinar al microscopio poniendo previamente aceite de inmersin.

E. Interpretacin de los resultados

Gram Positivos
De violeta fuerte a azul claro

Gram negativos
De rosa a rojo intenso

Forma: cocos y bacilos (finos, gruesos, ramificados)

Forma: cocos, bacilos y vibrios

Agrupaciones: racimos, cadenas, tetradas

Agrupaciones: aislados, en parejas (diplos)

Cocos Gram positivos en racimos

Cocos Gram negativos en diplos (diplococos)

Staphylococcus sp

Neisseria sp. y Moraxwella sp.

Cocos Gram positivos en cadenas

Bacilos Gram negativos finos

Streptococcus sp

Enterobacteriaceae como E. coli

Cocos Gram positivos en tetradas

Bacilos Gram negativos cocobacilos

Micrococcus sp.

Haemophylus sp.

Bacilos Gram positivos gruesos

Bacilos Gram negativos curvados

Clostridium perfringens

Vibrio sp y Campylobacter sp.

Bacilos Gram positivos finos

Bacilos Gram negativos fusiformes

Listeria sp.

Fusobacterium sp.

Bacilos Gram positivos ramificados

Actinomyces sp. y Nocardia sp.

Bacilos Gram positivos irregulares

Bifidobacterium bifidus

Preparacin de colorantes
1. Acido-Alcohol: (decolorante para tincin Ziehl-Neelsen) cido clorhdrico concentrado ..........................................................3 ml Etanol 95% ....................................................................................97 ml 2. Azul de metileno: Colorante de contraste para tincin de flagelos. Azul de metileno................................................................................1 g Agua destilada...............................................................................100 ml 3. Azul de metileno de Loeffler: Tinciones simples. Solucin de hidrxido potsico al 1%.................................................1 ml Azul de metileno, sol. saturada en etanol al 95%...............................30 ml Agua destilada...............................................................................100 ml 4. Colorante para esporas: Solucin acuosa saturada de verde malaquita 5. Colorante para flagelos de Leifson: Solucin A Fucsina bsica .........................................................................1,2 g Etanol 95%.............................................................................100 ml Solucin B cido tnico................................................................................3 g Agua destilada.........................................................................100 ml Solucin C Cloruro sdico..........................................................................1,5 g Agua destilada.........................................................................100 ml Para preparar la solucin de uso, se mezclan cantidades iguales de las soluciones A, B y C y se guarda en frasco cerrado

hermticamente en la nevera donde es estable durante varias semanas. 6. Cristal violeta: Para tincin Gram y tincin simple. Cristal violeta (violeta de genciana)....................................................0,5 g Agua destilada.................................................................................100 ml 7. Eosina: Para observacin de clulas sanguneas. Eosina...............................................................................................0,3 g cido actico glacial......................................................................0,025 ml Agua destilada...................................................................................100 ml 8. Fucsina diluida: Para tincin Gram y tincin simple. Fucsina fenicada de Ziehl-Neelsen......................................................10 ml Agua destilada.................................................................................100 ml 9. Fucsina fenicada de Ziehl-Neelsen: Para tincin cido-alcohol resistente. Fucsina bsica......................................................................................1 g Etanol 95%........................................................................................10 ml Fenol 5% en solucin acuosa............................................................100 ml 10.Hematoxilina: Para observacin de clulas sanguneas. Hematoxilina.........................................................................................2 g Agua destilada......................................................................................1 l 11.Lactofenol: Para preparaciones microscpicas en fresco de mohos. cido lctico.....................................................................................100 ml Fenol................................................................................................100 g Glicerol.............................................................................................200 ml Agua.................................................................................................100 ml 12.Lactofenol al Azul Algodn: Para preparaciones en fresco y tinciones de mohos. Solucin de azul algodn Sol. saturada de azul algodn (azul anilina soluble)......................10 ml Glicerol.....................................................................................10 ml Agua.........................................................................................80 ml Mezclar esta solucin con lactofenol a partes iguales 13.Lugol: Solucin de yodo para tincin Gram. Yodo...................................................................................................1 g Yoduro potsico..................................................................................2 g Agua destilada.................................................................................300 ml 14.Orcena A: Tincin de cromosomas. Orcena................................................................................................2 g cido actico.....................................................................................45,8 ml cido clorhdrico 1 mol/l......................................................................8,3 ml Agua..................................................................................................45,8 ml 15.Orcena B: Tincin de cromosomas. Orcena................................................................................................2 g cido actico.....................................................................................55 ml Agua..................................................................................................55 ml 16.Safranina: Colorante de contraste para tincin Gram (preferible a la fucsina) y esporas. Safranina.........................................................................................0,25 g Agua destilada..................................................................................100 m

17.Sudn III: Tincin especfica de grasas. Alcohol etlico...................................................................................100 ml Sudn III...................................................................................hasta saturacin 18.Verde de metilo actico: Igual composicin que la eosina (num. 7)