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QUMICA ORGANICA
INGENIERA BIOMDICA
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Profesores Adjuntos Esp. Patricia Mara Albarracn Dra. Mara Julia Barrionuevo
Jefes de Trabajos Prcticos Dra. Mariela Gonzlez Dra. Mara Laura Tereschuk
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Es una tcnica que permite la realizacin de una serie de destilaciones sencillas en una sola operacin continua. Se usa para separar componentes lquidos que difieren menos de 25C en el punto de ebullicin. Es un montaje similar a la destilacin simple en el que se ha intercalado entre el matraz y la cabeza de destilacin una columna que puede rellenarse con cualquier tipo de sustancia inerte que posea gran superficie, por ejemplo anillos o hlices de vidrio, alambre, trocitos de arcilla, fragmentos de porcelana, etc. Equipo para destilacin fraccionada Al calentar la mezcla el vapor se va enriqueciendo en el componente ms voltil, conforme asciende en la columna, y los lquidos al caer se enriquecen en el componente menos voltil, consiguiendo as su separacin
Destilacin a vaco Es una forma de destilacin (sencilla o fraccionada) que se efecta a presin reducida. El montaje es muy parecido a los otros procesos de destilacin, con la salvedad de que el conjunto se conecta a una bomba de vaco o trompa de agua, lo cual permite destilar lquidos a temperaturas inferiores a su punto de ebullicin normal. Muchas sustancias no pueden purificarse por destilacin a presin atmosfrica porque se descomponen antes de alcanzar sus puntos de ebullicin normales. Otras sustancias tienen puntos de ebullicin tan altos que su destilacin es difcil o no resulta conveniente. En estos casos se emplea la destilacin a presin reducida. Un lquido comienza a hervir a la temperatura en que su tensin de vapor se hace igual a la presin exterior, por tanto, disminuyendo esta se lograr que el lquido destile a una temperatura inferior a su punto de ebullicin normal Fuente: www.quimicaorganica.net
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De lo anterior se concluye que el punto de fusin es una propiedad fsica que puede utilizarse como: Criterio de pureza. Si se tiene una sustancia pura, su mbito de fusin es muy pequeo (0,5C 1C), y el punto de fusin se mantiene constante an despus de varias purificaciones. Si la muestra es impura, el rango de fusin se hace amplio (mayor a 2C), y el punto de fusin es menor que el de la sustancia pura. Se deduce de lo anterior que las sucesivas purificaciones de un compuesto pueden controlarse tomando el P.F. despus de cada una de ellas.
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Criterio de identificacin Si despus de varias purificaciones el punto de fusin de una sustancia se mantiene sin variacin, puede suponerse que dicha sustancia est pura. Se debe recurrir a tablas de constantes fsicas para determinar de qu compuesto se trata. En caso de que existan varias sustancias que tengan P.F. anlogos al que se determin, se recurre al punto de fusin mixto para poder identificarlas con certeza. Este mtodo consiste en mezclar la sustancia a identificar con pequeas cantidades de muestras puras de distintos compuestos (en proporcin 9:1 8:2) que poseen P.F. similar. Slo se mantendr la constancia del P.F. en caso de que se trate de la misma sustancia, pues las que sean diferentes se comportarn como impurezas, en consecuencia tendrn los puntos de fusin ms bajos y los mbitos de fusin ms amplios. PARTE EXPERIMENTAL Mtodo del tubo capilar El mtodo del tubo capilar es muy comn y conveniente porque tiene la ventaja de requerir pequeas cantidades del producto. En un primer paso con la llama del mechero se cierra el extremo de un capilar de vidrio de aproximadamente 10 cm de longitud y 1 mm de dimetro interno y se deja enfriar. Se pulveriza el slido y se llena el capilar colocando una pequea cantidad de la muestra en un papel de filtro o vidrio de reloj. Presione el extremo abierto del capilar contra la muestra dejando que la misma penetre en el capilar. La longitud del slido en el tubo no debe exceder los dos centmetros; es preferible que sea de 1 cm. Golpee repetidamente el extremo cerrado del capilar contra el mesn para compactar la muestra. Esta operacin se realiza ms fcilmente dejando caer el capilar dentro de un tubo de vidrio. A continuacin se lo adosa al termmetro con un aro de goma de preferencia con una gota del lquido del bao. La sustancia debe quedar a la altura del bulbo del termmetro. Se introducen ambos en el bao y se procede a calentarlo. El bao consiste en un vaso de precipitacin con vaselina lquida otro lquido. El calentamiento debe ser lento y uniforme, este ltimo se logra moviendo cuidadosamente el lquido mediante una varilla de vidrio. La velocidad de calentamiento se regular de forma que el incremento de la temperatura no exceda de 1C por minuto en las proximidades del punto de fusin.
Mtodo del tubo capilar usando un vaso de precipitacin para el bao. Se observa la sustancia contenida en el tubo capilar y se anota la temperatura a la cual se notan los primeros indicios de licuefaccin. Se contina observando hasta que la sustancia formada funda completamente y se anota la nueva temperatura. Tendremos as el mbito de fusin. Se han propuesto muchas formas de baos lquidos para utilizarlos en el mtodo del tubo capilar.
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Mtodo del tubo capilar usando un tubo Thiele para el bao. Correccin del punto de fusin Ecuacin para corregir el punto de fusin por la dilatacin trmica del mercurio:
T c = T f + (T f T ext) .n.K T f = (T f1 + T f2 ) /2 Tf1: Temperatura inicial de fusin Tf2: Temperatura final de fusin Tf: Temperatura promedio de fusin Text: Temperatura exterior (medida con otro termmetro) n: Columna emergente, es decir altura de la columna de Hg (medida en C) desde el nivel del lquido del bao hasta la temperatura k: 1.54 x10-4 1/ C factor de correccin de la dilatacin trmica del mercurio.
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Se colocan 0,5grs de sustancia pulverizada en un tubo de ensayo y se agrega suficiente solvente para cubrirlo. Si se disuelve fcilmente en fro, este solvente no es conveniente. Si no se disuelve, se calienta lentamente con agitacin hasta que el lquido hierva. Luego se contina agregando solvente hasta que prcticamente toda la sustancia se haya disuelto teniendo en cuenta que si es necesario una gran cantidad del lquido (1/2 2/3 del tubo) el solvente resulta inapropiado por su baja solubilidad. Si se obtiene una solucin casi limpia, se enfra el tubo y se agita suavemente para inducir la cristalizacin, efecto que tambin puede lograrse raspando las paredes del tubo con una varilla de vidrio. Se repite el mismo procedimiento con los diferentes solventes en tubos de ensayo limpios hasta elegir el adecuado por su solubilidad y las proporciones necesarias de soluto y solvente para una eficiente cristalizacin. Filtracin en caliente de las impurezas insolubles Una vez que se obtiene una solucin lmpida cuando sobre la base del ensayo previo se reconoce que slo quedan las impurezas insolubles, se filtra la solucin caliente, evitando enfriamientos durante la filtracin que produciran recristalizacin prematura con la consiguiente obturacin del filtro. La filtracin se realiza utilizando un embudo cnico, calentado previamente un bao de agua especial para filtrar en caliente y un papel de filtro plegado para aumentar la superficie de filtracin. No es conveniente usar filtros al vaco porque se favorece la evaporacin del solvente y el enfriamiento prematuro de la solucin con la consecuente cristalizacin anticipada.
Filtracin con papel de filtro: a) Plegado del papel de filtro b)Filtracin por gravedad usando papel de filtro plegado Recristalizacin a mayor escala Se coloca la sustancia en un erlenmeyer y se agrega la mnima cantidad necesaria del solvente seleccionado adecuadamente a fin de conseguir una solucin saturada. Se calienta lentamente a
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ebullicin, teniendo en cuenta que si el solvente es voltil debe trabajarse con refrigerante de reflujo. Si es necesario se agrega durante el calentamiento pequeas cantidades de solvente hasta que el slido se disuelva completamente. Se filtra en caliente como se describi anteriormente. Enfriamiento y cristalizacin del slido La solucin lmpida obtenida del filtrado anterior se trasvasa a un cristalizador convenientemente cubierto para evitar la evaporacin pronta del solvente. Se deja enfriar sin mover el cristalizador. Si una vez alcanzada la temperatura ambiente el slido no ha cristalizado, se procede de la siguiente manera: 1. Se enfra por debajo de 0C usando mezclas frigorficas. 2. Se raspan las paredes del cristalizador o el fondo del mismo con varilla de vidrio, con lo que se introducen micropartculas de vidrio en la solucin que actan a modo de ncleos de cristalizacin. 3. Si se dispone del slido a cristalizar puro, aadir un cristal para que acte de ncleo de cristalizacin (sembrado). Cuando la cristalizacin se ha completado se filtran los cristales en un Bchner y se lavan con pequeas cantidades de solvente fro que se agrega interrumpiendo el vaco.
Equipos para filtracin por succin: a) Con embudo de Bchner b) Con embudo Hirsch Tambin es factible usar trompas de agua para lograr un vaco moderado. La trompa se fija a un grifo mediante una goma de vaco que posee paredes de espesor considerable de modo que no se estrangula por efecto de la baja presin.
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El kitasato se conecta a la trompa por su salida lateral. Al abrir totalmente el grifo, el estrechamiento del tubo que conduce el agua genera una prdida de presin que provoca aspiracin por la entrada lateral de la trompa, con la consiguiente disminucin de presin en el sistema. Cuando se termina la filtracin no se debe cerrar la canilla. Previamente es necesario abrir el sistema en el que se est haciendo vaco al exterior, para permitir que se igualen las presiones. De otro modo, podra entrar agua de la trompa al kitasato. Una vez que el sistema est a presin atmosfrica puede cerrarse la canilla. Trompa de agua Secado de los cristales Los cristales obtenidos tienen solvente adsorbido. Si el solvente de recristalizacin es voltil, los cristales pueden secarse al aire en lugar clido y convenientemente protegidos del polvo ambiental. Si el solvente es difcil de evaporar por exposicin al aire, puede utilizarse un desecador con conexin al vaco.
Desecador con conexin al vaco Clculo del rendimiento R = (masa final/ masa inicial )x100
TRABAJO PRCTICO N 4: GRUPOS FUNCIONALES ALCOHOLES, ALDEHDOS Y CETONAS Objetivos: Comparar las velocidades de reaccin entre alcoholes primarios, secundarios y terciarios a travs de reacciones de sustitucin. Verificar la oxidacin de alcoholes a travs de distintos agentes oxidantes. Comprobar el carcter reductor de aldehdos con reactivos especficos. Diferenciar de cetonas Visualizar la formacin de resinas mediante reacciones de carbono .
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PROPIEDADES QUMICAS DE ALCOHOLES Introduccin Los alcoholes son el grupo de compuestos qumicos que resultan de la sustitucin de uno o varios tomos de hidrgeno (H) por grupos hidroxilo (-OH) en los hidrocarburos saturados o no saturados. Los alcoholes pueden ser primarios, secundarios o terciarios, dependiendo de a qu tipo de carbono est unido el grupo funcional hidroxilo. Los alcoholes son compuestos anfteros, y por tanto actan de forma diferente frente a bases fuerte y cidos fuertes. 1) Formacin de alcxidos Reaccionan con los metales alcalinos como Li, Na, K ... y an con los alcalino-trreos como el Ca. El hidrgeno del hidroxilo es reemplazado por el metal desprendindose en estado gaseoso.
La sustancia que se forma es un alcxido que en este caso se denomina etxido de sodio. EL ALCOHOL EN ESTAS REACCIONES ACTA COMO UN CIDO DBIL. Como los alcanos no reaccionan con los metales alcalinos, debe admitirse que el tomo reemplazado es el de hidrgeno unido al hidroxilo, lo que prueba la polarizacin de la molcula de los alcoholes. La reaccin de los alcoholes con los metales alcalinos es menos enrgica que la de stos con el agua. La acidez de los alcoholes vara ampliamente, desde los alcoholes que son casi tan cidos como el agua. hasta algunos que son mucho menos cidos. La constante de disociacin cida, K a, de un alcohol, queda definida por el equilibrio siguiente:
Los alcoholes ms cidos, como el etanol y el metanol, reaccionan rpidamente con sodio para formar metxido y etxido de sodio. Los alcoholes secundarios, como el 2-butanol, reaccionan con velocidad ms moderada. Los alcoholes terciarios, como el alcohol t-butlico, reaccionan lentamente. 2) Reacciones por sustitucin del grupo hidroxilo. Al reaccionar un alcohol con el reactivo formado por HCl y ZnCl2 (reactivo de Lucas) se produce un halogenuro de alquilo.
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Otro ejemplo es la reaccin del cido clorhdrico con alcoholes secundarios y terciarios. El alcohol ter-butlico reacciona para dar un 98 % de cloruro de ter-butilo. Los alcoholes secundarios y terciarios reaccionan generalmente con el reactivo de Lucas por un mecanismo SN1 Una vez que el alcohol ha reaccionado con para formar el halogenuro de alquilo, ste se separa por su baja solubilidad en agua y aparece una segunda fase. 3) Oxidacin de alcoholes Comparacin entre los alcoholes primarios, secundarios y terciarios. Los alcoholes secundarios se oxidan fcilmente para dar rendimientos excelentes de cetonas. El reactivo cido crmico constituye el procedimiento ms eficiente para oxidar alcoholes secundarios en el laboratorio. El cido crmico se prepara disolviendo dicromato de sodio en una mezcla de cido sulfrico y agua. La especie activa en la mezcla probablemente sea el cido crmico, o bien el in cromato cido. PARTE EXPERIMENTAL 1) Formacin de alcxidos. Velocidad de reaccin entre alcoholes primarios, secundarios y terciarios.
I) Colocar en un tubo de ensayo 2 ml de alcohol etlico absoluto, agregar un trocito de sodio del
tamao de un guisante (observar el desprendimiento de H2), verter luego la mezcla en un vidrio de reloj y colocar a Bao Mara para evaporar el exceso de etanol; aadir 2 ml de H2O y ensayar la solucin resultante con papel de tornasol. Observar el carcter del residuo. Formular la reaccin. II) En tres tubos de ensayo colocar respectivamente 2 ml de butanol, 2-butanol y 2 metil, 2 propanol (ter-butanol). Agregar a cada tubo un trocito de sodio y comparar las velocidades de reaccin (calentar si fuera necesario). Formular las reacciones correspondientes. 2) Reacciones de sustitucin. Reactivo de Lucas. En tres tubos de ensayo colocar respectivamente 2 ml de butanol, 2 butanol y 2 metil, 2 propanol (ter-butanol). A cada tubo agregar 6 ml de reactivo de Lucas. Observar si se produce reaccin. En los tubos en que, despus de 10 min. a temperatura ambiente y en reposo, la solucin permanece clara y homognea, calentar a Bao Mara 15 min. y observar. Formular las reacciones. 3) Oxidacin de los alcoholes primarios, secundarios y terciarios. Con dicromato de potasio en medio cido Colocar en un tubo de ensayo 2 ml de butanol, 2 gotas de solucin de dicromato de potasio al 10% y unas gotas de cido sulfrico; agitar el tubo y observar si hay aumento de temperatura o cambio de color; caso contrario, proceder a su calentamiento. Repetir el ensayo con 2 ml de 2-butanol y 2 ml de ter-butanol. Formular las reacciones correspondientes. PROPIEDADES QUMICAS DE ALDEHDOS Y CETONAS Introduccin Los aldehdos y cetonas son sustancias reactivas. Se polimerizan, condensan, forman derivados de adicin, se pueden reducir y los aldehdos se oxidan con gran facilidad.
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Los aldehdos se diferencian de las cetonas por su facilidad de oxidacin, ya que son agentes reductores: los aldehdos, por ejemplo, dan positiva la reaccin de Tollens mientras que las cetonas no. Slo las -hidroxi cetonas darn positivas las reacciones de oxidacin con oxidantes dbiles como Tollens o Fehling.
O CH 3 CH 2 C H
O CH 3 CH 2 C OH
O CH 3 C CH 3
O No reacciona
Desde luego los aldehdos son oxidados tambin por agentes oxidantes fuertes como permanganato de potasio o dicromato de potasio. En medio de cido sulfrico. PARTE EXPERIMENTAL 1) Reacciones de oxidacin
Con permanganato de potasio en medio bsico A unas gotas de solucin diluida de acetaldehdo, se aaden una o dos gotas de permanganato de potasio al 0,3% en medio de NaOH al 10%. El ensayo se repite con solucin diluida de propanona (acetona). CH3-COH + MnO4 -+ 2 H2O + 3 eVioleta 2) Carcter reductor CH3-COOH + MnO2 + 4 OHPardo
a) Reactivo de Fehling. Fehling A: Solucin de sulfato cprico en medio cido Fehling B : Solucin de Tartrato disdico en medio bsico Colocar en un tubo de ensayo 3 ml de Fehling A y aadir lentamente igual volumen de Fehling B hasta que el precipitado azul de Cu(OH)2 (hidrxido cprico) formado, se haya disuelto al agitar. En un tubo de ensayo colocar 2 ml de solucin de formaldehdo, y aadir 5 gotas de la mezcla de Fehling preparada y colocar a B.M. durante 2 min. Observar. Repetir el ensayo con acetona. Si se observa un precipitado rojo, es porque el Cu+1 se ha reducido a Cu metlico. Amarillo
b) Reactivo de Tollens. Formacin del espejo de plata. Reactivo de Tollens: hidroxi diamn argntico
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En un tubo de ensayo colocar 2 ml de solucin de formaldehdo, y aadir 5 gotas de la mezcla de Tollens preparada y colocar a B.M. durante 2 min. Observar. Repetir el ensayo con acetona. Observacin: el tubo debe estar recientemente lavado y secado para que la plata pueda adherirse a sus paredes.
3) Reacciones de C: Formacin de aldol Unos 2 ml de solucin de acetaldhedo se agrega igual volumen de solucin de hidrxido sdico al 10%.
O 2 CH3 C H
NaOH10%, H2O
CH3
CH
CH2
Acetaldehdo
H OH 3 hidroxi-butanal (aldol)
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Desde el punto de vista qumico, las grasas son steres de cidos carboxlicos de cadena larga con un alcohol trihidroxilado, el glicerol y stas son las que se conocen como triacilgliceroles o triglicridos. Reaccin general de esterificacin:
H2C-OOC
COOH
H-C-OOC H2C-OOC
Triacilglicrido
H2O
En esta reaccin se consider que los tres cidos grasos son iguales (18 tomos de carbono= esterico), pero pueden ser diferentes. Propiedades generales Dentro de los lpidos simples, aquellos que son lquidos a temperatura ambiente, generalmente se conocen como aceites. Estos son glicridos que estn formados por steres de glicerina con cidos grasos que en su mayora son insaturados y tienen un punto de fusin ms bajo que las grasas. El grado de esta insaturacin de stos cidos grasos est relacionado con el estado fsico de los triglicridos a temperatura ambiente, esto concuerda con el hecho de que la hidrogenacin de un aceite, donde se satura algunos o todos los dobles enlaces presentes, produce una grasa semislida o slida. Los triglicridos slidos a temperatura ambiente se conocen como grasas. La saponificacin o hidrlisis alcalina de triacilgliceroles produce glicerol y una mezcla de sales de cidos carboxlicos de cadena larga. Reaccin de saponificacin: H2C-OH H C-OOC
2
H-C-OOC H2C-OOC
Triacilglicrido (grasa)
3 Na(OH)
COONa
H-C-OH H2C-OH
Jabn
Glicerina
Estas sales de cidos carboxlicos de cadena larga son jabones y esta es exactamente la forma en que se fabrican la mayora de los jabones comerciales a partir de grasas o aceites. Los glicridos son fcilmente saponificables en caliente y en medio bsico, en fro la hidrlisis es parcial. Entre los saponificables de un fosfolpido est la lecitina que es importante para la tecnologa de los alimentos por sus propiedades emulsificantes. Tambin se encuentran las ceras que son steres de cidos grasos y alcoholes de cadena recta de alto peso molecular. En los lpidos tambin se encuentran en cantidades variables sustancias que no son saponificables. Los insaponificables comprenden principalmente esteroides que son compuestos de estructuras derivadas del ciclopentaoperhidrofenantreno y del isopreno, que comprenden vitaminas, pigmentos, hormonas, entre otros. Las propiedades qumicas y funcionales de los lpidos estn asociadas a su composicin o sea que sus propiedades dependen directamente de los cidos grasos esterificados con glicerol. Uno de los ms serios problemas de los lpidos es la rancificacin oxidativa, como consecuencia de reacciones en cadena de los radicales libres de los cidos grasos insaturados. sas reacciones son aceleradas por cationes como el Fe+3 o Cu+2, el calor o la luz. El progreso de la rancificacin puede ser medido por la cantidad de perxidos presentes en el aceite en funcin del tiempo recorrido, considerando que las dems variables (presin del oxgeno, relacin volumen-rea de contacto, luz, temperatura) permanecen constantes.
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La cantidad de perxido puede ser medida por iodimetra, por la capacidad de los perxidos de los lpidos de oxidar el in iodato a iodo. I) SAPONIFICACIN DE GRASAS Y ACEITES
Colocar en un vaso de precipitacin de 100 ml, 25 ml de aceite, agregar 15 ml de alcohol etlico y 6 g de hidrxido de sodio disueltos en 25 ml de agua. Introducir el vaso en otro ms grande y colocar a B.M. Mantener la temperatura de la mezcla en 90C, agitar con frecuencia y calentar por lo menos una hora. Si la mezcla de reaccin se hace casi slida por evaporacin, agregar alcohol. Cumplido el perodo de calentamiento, agregar 200 ml de solucin concentrada de cloruro de sodio, porque favorece la precipitacin del jabn formado. Enfriar la mezcla y filtrar. Lavar el jabn sobre un filtro con 50 ml de agua fra, conservar el filtrado y las aguas de lavado. Prensar el jabn en una pequea cpsula y de las aguas de lavado, aislar la glicerina disuelta. Reacciones del jabn: Los ensayos se realizan con la masa gelatinosa reservada para este fin. a) Tomar una pequea porcin y verificar que es jabn por su capacidad de producir espuma al agitarlo con agua. RCOONa + H2O espuma (sal soluble)
b) Acidificar unos 20 ml de la solucin (4) con cido sulfrico diludo, filtrar el insoluble, lavarlo con agua y efectuar con l los experimentos siguientes:1) ensayar solubilidad de agua; 2) agitar vigorosamente con solucin de NaOH; 3) disolver una pequea cantidad en tetracloruro de carbono y agregar unas gotas de solucin de Br2 en el mismo solvente. Observar si el Br2 se decolora. 2RCOONa + H2SO4 RCOOH + NaOH RCOOH + Br2/ CCl4 II) 2 RCOOH + Na2SO4 RCOONa + H2O decolora el agua de bromo si el cido graso es insaturado
AISLAMIENTO DE LA GLICERINA
Filtrar la solucin salina que contiene la glicerina para separar las partculas de jabn que contiene. Neutralizar el filtrado con cido clorhdrico y evaporar a sequedad. Separar la glicerina de la sal extrayndola con 20 ml de alcohol etlico absoluto. Decantar la solucin alcohlica y evaporar a B.M., quedando como residuo una cantidad pequea de glicerina que se ensaya con cualquiera de las reacciones del punto anterior. Reaccin de caracterizacin de glicerina: Formacin del complejo de cobre Colocar en un tubo de ensayo 2 ml de solucin de sulfato de cobre (CuSO4), agregar gotas de hidrxido de sodio concentrado, mezclar y agregar glicerina gota a gota, calentar. Observar la coloracin. Normas de Seguridad 1- En este prctico Ud trabajar con alcohol que es inflamable por lo tanto evite llamas fuertes y en lo posible es aconsejable usar mantas calefactores o bao mara, en lugar de mecheros. 2- Utilizar tambin cidos y bases fuertes altamente corrosivas a las cuales debe manipular con cuidado, evitar pipetear y salpicaduras en la piel u ojos. 3- Utilice gafas protectoras y guantes para solventes orgnicos.
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PARTE EXPERIMENTAL
Propiedades qumicas de los monosacridos I) Monosacridos a) Facilidad de oxidacin de la D(+) Glucosa 1) Con KMnO 4: En un tubo de ensayo se colocan unos mls. de solucin de D(+) Glucosa al 10% y se agregan unas gotas de solucin de KmnO4 al 0,3%. Se observa a temperatura ambiente una decoloracin. El ensayo se repite con una solucin de D(+) Glucosa al 10% a la que se ha agregado unos mililitros de solucin de NaOH al 10%. En este caso, la decoloracin se observa ms rpido.
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2) Con reactivo de Tollens: En un tubo de ensayo se colocan unos ml. de solucin de D(+) Glucosa al 10% y aproximadamente igual cantidad de reactivo, se calienta y observamos la formacin del espejo de plata.
3) Con reactivo de Fehling: En un tubo de ensayo que contiene unas gotas de solucin de D(+) Glucosa al 10% se agregan 6 ml de Fehling (3 ml de cada una de las soluciones A y B) y la mezcla se calienta.
Los azcares que dan reaccin positiva con Tollens y Fehling se conocen como azcares reductores. II) Disacridos
a) Accin reductora de los disacridos En tres tubos de ensayo de 5 ml de reactivo de Fehling se aaden unas gotas de soluciones diluidas de sacarosa al primero, de maltosa al segundo y de lactosa al tercero. Se introducen los tubos en agua a ebullicin y se observar que la solucin de sacarosa no reacciona mientras que s lo hacen las soluciones de maltosa y lactosa.
b) Hidrlisis de sacarosa
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1) Condiciones favorables a la hidrlisis: Tres tubos de ensayo conteniendo cada uno 5 ml de solucin de solucin de sacarosa al 5%, se colocan en un vaso de agua caliente y se aade igual volumen de agua al primero, de cido clorhdrico diluido al segundo y de solucin de hidrxido de sodio al 10% al tercero, respectivamente. Se calientan los tubos en bao mara durante 5 minutos y despus se ensaya una porcin de ellos con el reactivo de Fehling. 2) Hidrlisis enzimtica: Dos tubos de ensayo conteniendo cada uno de ellos 5 ml de una suspencin de levadura de pan, a los que se les aade igual volumen de solucin de sacarosa al 5% al primero y 5 ml de agua a la segunda porcin de la suspensin. Luego se colocan en un vaso con agua templada durante 15 minutos. Un poco de cada suspencin se ensaya luego con reactivo de Fehling. El ensayo en blanco es para comprobar si la levadura misma tiene algn compuesto reductor. III) Polisacridos
Los polisacridos son compuestos constitudos por muchas unidades de monosacridos por molcula, cientos y an miles de ellas. Estas unidades se mantienen unidas por enlaces glicosdicos que se pueden romper por hidrlisis, al igual que en los disacridos. El almidn y la celulosa son los polisacridos ms importantes, amos se producen en los vegetales por medio del proceso de fotosntesis a partir de dixido de carbono y agua. Ambos estn constituidos por unidades de D(+) Glucosa. Almidn: Preprese una solucin de almidn mezclando en un mortero 3 grs. De almidn con un poco de agua hasta consistencia cremosa agrguese aproximadamente unos 200 ml de agua hirviendo, enfrese y emplese la solucin para los siguientes ensayos. 1) Precipitacin del almidn Mezcle un volumen de la solucin de almidn con volmenes iguales de a) Solucin saturada de sulfato de amonio y b) Solucin de acetato de plomo. Deje en reposo y observe. 2) Reaccin de Iodo Agregue una gota de solucin de Yodo a la solucin de almidn, caliente brevemente la solucin porque se puede volatilizar el yodo y la coloracin no reaparece. Deje enfriar y agregue solucin de hidrxido de sodio gota a gota y luego neutralice con cido clorhdrico concentrado. 3) Reaccin con Fehling En un tubo de ensayo colocar unos ml de solucin de almidn e igual cantidad de reactivo de Fehling. Anote los resultados observados.
4) Hidrlisis del almidn Se aade 1 ml de cido clorhdrico concentrado a 25 ml de solucin de almidn. La solucin hierve y a intervalos pequeos, se toma 1 ml de la mezcla reaccionante para realizar el ensayo con yodo.
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Cuando reaccin de la solucin con iodo ya no da positiva, se neutraliza y se ensaya una pequea porcin con reactivo de Fehling. Pectina Los frutos y las bayas contienen hidratos de carbono complejos insolubles en agua conocidos como proto pectinas, que por hidrlisis parcial producen pectinas y cidos pectnicos. Las pectinas tienen la propiedad de formar geles con azcar y cidos en condiciones adecuadas y son agentes necesarios para la produccin de jaleas de jugos de frutas. Se compone de cido galacturnico y su ster metlico. El cido galacturnico cuando se calienta con HCl pierde H2O y CO2 por cada grupo COOH. Sus productos son furfural y agua. Obtencin de pectinas: Triturar una manzana cortada en trozos en un mortero, exprimir a travs de una muselina con una prensa de mano y calentar el residuo durante 15 minutos en 100 ml de HCl 0,1 N. Filtrar a travs de la muselina. Los compuestos pcticos de la pared celular se hidrolizan por este tratamiento, y la pectina se disuelve. A) A unos mililitros de la solucin agregar igual volumen de alcohol. Se forma un precipitado gelatinoso de pectina, esta es la sustancia que forma la jalea de frutas cuando se la hierve en soluciones azucaradas cidas. B) La otra porcin de la solucin se neutraliza con NaOH y se agrega unos mililitros de agua de cal, se forma un pectato de calcio. Gomas Muchas plantas producen exudados o sustancias extractivas solubles en agua que dan soluciones viscosas mucilaginosas muy usadas como adhesivos y agentes espesantes. Sus principales constituyentes son heteropolisacridos. Se agrega una pequea cantidad de agua a un poco de goma arbiga y se mezcla en un mortero. 1) Reaccin con Fehling 2) Hidrlisis Agregar dos volmenes de HCl diludo. Calentar a bao mara hirviendo, durante 10 minutos, y con la solucin, hacer ensayos con reactivo de Fehling.
Propiedades pticas de algunos hidratos de carbono Una solucin recientemente preparada de D(+) glucosa, que es la forma habitual de la glucosa cristalina, experimenta un cambio en su poder rotatorio bastante lentamente. Sin embargo las sustancias bsicas actan de catalizadores en el proceso de establecimiento del equilibrio entre D(+)glucosa y otras de sus formas tautmeras.
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La adicin de una pequea cantidad de amonaco a la solucin de D(+)glucosa origina un cambio en el poder rotatorio de sta a una velocidad relativamente rpida. Ensayo: Se preparan 100 ml de una solucin de D(+) glucosa al 10% y con esta solucin se llena un tubo del polarmetro de 1 dm y se determina el poder rotatorio. Luego a 50 ml de la solucin original se aade una gota de amonaco concentrado, se llena el tubo polarimtrico y se determina el poder rotatotio de esta solucin, haciendo varias lecturas a intervalos de uno dos minutos cada una. Reaccin D Glucosa
D Manosa
enediol
D Fructosa
Hidrlisis cida de la sacarosa La sacarosa que es dextrgira, por la accin de los cidos se hidroliza para dar cantidades equimoleculares de D(+) Glucosa y D(-) Fructosa. Como la rotacin especfica de la D(-) Fructosa es mayor que la de la D(+) Glucosa, el curso de la hidrlisis se puede seguir, observando la inversin en el poder rotatorio de la solucin. Ensayo Se preparan con precisin 100 ml de solucin de sacarosa al 10%. En el polarmetro se determina su poder rotatorio y se calcula la rotacin especfica. A 50 ml de la solucin de sacarosa se aaden 5 ml de cido clorhdrico concentrado, se diluye la solucin hasta 100 ml y se calienta en un bao de vapor durante 20 minutos. Luego de determina el poder rotatorio de esta solucin y se calcula su rotacin especfica. Reaccin de hidrlisis H+ Sacarosa Glucosa + Fructosa
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H R-C-NH2 + CO(OH
H HOOC-C-R H)NH
Unin peptdica
dipptido
tripptido ...
protena
(aproximadamente unos 20 monmeros). R puede ser aliftica aromtica. PROPIEDADES GENERALES DE LAS PROTENAS Las protenas pueden ser coaguladas, esto es, precipitadas irreversiblemente y a este efecto se llama "desnaturalizacin", si bien no se conoce con certeza los cambios qumicos que tienen lugar durante el proceso. La desnaturalizacin de las protenas se pueden efectuar por: agentes fsicos: temperatura, presin hidrosttica, tratamientos mecnicos (agitacin), irradiacin (UV). agentes qumicos: solventes orgnicos, cidos, bases, metales pesados (cloruro mercrico, sulfato cprico). Las protenas pueden tambin ser precipitadas reversiblemente, esto es, que pueden redisolverse el precipitado formado, sea solucin concentrada de sulfato de amonio cloruro de sodio. Tambin, las protenas dan muchas reacciones coloreadas: Biuret, Millon, Xantoproteica, etc. PARTE EXPERIMENTAL Preparacin de una solucin de albmina
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Se prepara una solucin de albmina, batiendo la clara de un huevo durante unos minutos y mezclndola despus, con cinco veces su volumen de agua. La mezcla se filtra a travs de una gasa y con el filtrado se realizan los ensayos que se indican a continuacin: Coagulacin de la albmina En una serie de cinco tubos de ensayo se pone en cada uno 2 ml de solucin de clara de huevo. Uno, se calienta poco a poco y se observa la temperatura aproximada a la que tiene lugar la coagulacin. En otro tubo se aade 4 ml de etanol. Al tercer tubo se aaden unas gotas de HCl cc. Al cuarto tubo, cido ntrico y al quinto, solucin de NaOH. Se deben anotar los resultados obtenidos en cada caso. Precipitacin de una protena mediante cationes En seis tubos de ensayo se ponen las siguientes soluciones: 1- 5 ml de agua 2- 5 ml de solucin de clara de huevo 3- 5 ml de agua y 4 gotas de HCl al 10% 4- 5 ml de clara de huevo y 4 gotas de HCl al 10% 5- 5 ml de agua y 4 gotas de solucin de NaOH al 10% 6- 5 ml de solucin de clara de huevo y 4 gotas de solucin de NaOH al 10%. A continuacin, en cada tubo se agregan 2 ml de solucin de sulfato de cobre al 10% y se observan los resultados. Los ensayos en blanco, en los que no se utiliza protena, son necesarios para determinar si el efecto observado en cada caso es realmente debido a la precipitacin de la protena a la precipitacin del hidrxido metlico. Precipitacin de protenas mediante aniones Se preparan soluciones idnticas a las 2, 4, 6 del apartado anterior, a cada una se aaden 2 gotas de solucin de ferricianuro de potasio y se observa en que tubo el precipitado se forma ms rpidamente. Reaccin coloreada de formaldehdo para protenas En un tubo de ensayo se pone una pequea cantidad de solucin de clara de huevo y se aade una gota de solucin diluida de formaldehdo. A continuacin se agrega con cuidado, cido sulfrico concentrado de tal manera que se forme una capa separada en el fondo del tubo.
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Reaccin de Biuret A una solucin de clara de huevo se aade un volumen igual de solucin de NaOH al 10%. Despus se aade una gota de solucin de sulfato de cobre al 1%. Se observa el color. Ecuacin: Protena + NaOH + CuSO4
2 molculas de urea
+ NH3
La estructura del producto de reaccin con una seccin de una cadena de un polipptido puede representarse por la frmula siguiente:
Esta reaccin permite seguir el grado de hidrlisis de una protena. Del color rosado del reactivo de Biuret se obtiene una coloracin violeta y a medida que se hidroliza la cadena de polipptidos se hace ms chica y el color va suavizndose. Cuando hay solamente aminocidos, no se produce el encadenamiento y por lo tanto no se puede acomplejar y entonces, la reaccin da negativa. Reaccin xantoproteica de las protenas Entre las protenas de la piel, uas, cueros, existen algunas con grupos aromticos (fenil alanina, tirosina, triptfano, etc.) que en presencia de cido ntrico dan reaccin coloreada. En un tubo de ensayo con 1 ml de HNO3 concentrado se aade un trozo pequeo de lana seda y se calienta el tubo. Se observa el color del material aadido. Ecuacin:
O OH NH2
HNO3 O 2N
OH NH2
La nitracin de los grupos aromticos de las protenas da el color amarillo (reaccin xantoproteica). Hidrlisis cida de gelatina En un matraz de fondo redondo conteniendo 100 ml de cido sulfrico al 25% se agregan 20 g de gelatina. Se une al matraz un refrigerante de reflujo y se monta en un soporte sobre una rejilla con amianto. La solucin se calienta a reflujo. Se sigue el curso de la hidrlisis con el reactivo de Biuret.
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Entre las principales reacciones de identificacin de los aminocidos se encuentra la reaccin con la ninhidrina. Esta reaccin es til para detectar y cuantificar aminocidos en cantidades del orden del microgramo. Fundamento: Los aminocidos en general reaccionan con ninhidrina en presencia de calor dando dixido de carbono, amonaco y un aldehdo. La reaccin da lugar a la formacin de un complejo de color azul o prpura (= 570 nm), que es til para la estimacin cualitativa y cuantitativa de los aminocidos. Los iminocidos prolina e hidroxiprolina, producen un color amarillo con este reactivo. Determinacin Cualitativa: Impregnar una tira de papel de filtro con la solucin de gelatina hidrolizada que contiene aminocidos y secar. Mojar posteriormente con ninhidrina y llevar a estufa a 100 C. La aparicin de un color azul indica un resultado positivo para alfa-aminocidos, un color amarillo indica la presencia de prolina y/o hidroxiprolina y la asparagina, que tiene un grupo amido en la cadena lateral, origina un color caf. Esta reaccin tambin identifica los grupos alfa-amino libres presentes en pptidos y protenas. Advertencia: la Ninhidrina es un producto combustible y nocivo por ingestin. Irrita los ojos, la piel y las vas respiratorias.
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Enzimas: CATALASA Triturar en un mortero 5 gr de papa, agregar luego 30 ml H2O destilada y centrifugar, para separar las enzimas que quedaran en el lquido sobrenadante. Efecto de la Temperatura En tres tubos marcados con: calor, fro y temperatura ambiente, colocar 3 ml de la solucin de enzima en cada tubo. 1- Colocar el tubo marcado como calor en un bao de H2O caliente por tres minutos. 2- Colocar el tubo marcado como fro en un bao de hielo por tres minutos. 3- Dejar el tubo marcado a Temperatura ambiente en la gradilla por tres minutos. Despus de este tiempo, agregar H2O2 al 3% (aproximadamente 10 volmenes) a cada tubo. Incubar la mezcla durante 1 minuto y anotar la altura en cm, de la espuma que producen las burbujas de O 2 desprendidas. Medir el radio del tubo en cm y anotar. Efecto del pH En tres tubos marcados con: cido, base y agua, colocar 3 ml de solucin de catalasa en cada tubo. 1. Agregar diez gotas de HCl al tubo denominado cido 2. Agregar 10 gatas de NaOH 1M al tubo con la denominacin base. 3. Agregar 10 gotas de H2O al tercer tubo. Mezclar muy bien y esperar dos minutos. Luego agregar 3 ml de H2O2 a cada tubo. Incubar la mezcla durante 1 minuto a temperatura ambiente y medir la altura de las burbujas en cm. Medir el radio del tubo de ensayo y anotar. Realizar los clculos correspondientes con la ecuacin: r2h. Anotar los clculos en las tablas 1 y 2. Tabla 1. Efecto de la Temperatura sobre la accin de la catalasa Altura de las burbujas (cm) Calor Temperatura ambiente Fro Tabla 2. Efecto de pH sobre la accin de la catalasa Altura de la espuma (cm) cido Agua Base Radio del tubo de ensayo (cm) Volumen de reaccin (cm 3) Radio del tubo de ensayo (cm) Volumen de reaccin (cm 3)
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5'
BASES
2' H OH OH
OH
Pentosa Ribosa
Pentosa Desoxiribosa
Nucletido de ADN
NITROGENADAS
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N N N
N N
Las bases nitrogenadas del ADN son: Adenina-Timina, Citosina-Guanina. Las bases nitrogenadas del ARN son: Adenina-Uracilo, Citosina-Guanina. Los nucletidos difieren entre s por las bases nitrogenadas.
NH2 N N N ADENINA N N N
O N N NH2
GUANINA
O CH3 N N TIMINA
PENTOSAS:
O N O N URACILO O
NH2 N N CITOSINA O
Los desoxirribonucletidos contienen la 2-desoxi-D-ribosa, que existe en el ADN . La D-ribosa es la pentosa del los ARN. Ambas pentosas se encuentran en la forma furanosa. La combinacin de una base (prica o pirimidica) con un azcar (ribosa o desoxirribosa) da lugar a un NUCLEOSIDO.
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La combinacin de un nuclesido con el c. fosfrico produce un NUCLEOTIDO (o sea que son fosfatos de nuclesidos) (Fig 1)
NUCLEOTIDO La pentosa est unida a la base por un enlace -N glucosilo, establecido entre el tomo de carbono 1 de la pentosa y el tomo de nitrgeno 9 de las bases pricas, o el tomo de nitrgeno 1 de las bases pirimidnicas. El grupo fosfato de los nucletidos se halla unido por medio de un enlace ster al tomo de carbono 5 de la pentosa. ADN Se presenta como dos hebras, en un ordenamiento duplohelicoidal pero tambin puede existir en la naturaleza en forma de cadenas simples. En los procariontes, que presentan un solo cromosoma, todo el ADN est en forma de una sola doble hlice, en los eucariontes que tienen muchos cromosomas, hay muchas molculas de ADN. En los procariontes (bacterias) el ADN no est ligado a protenas y est en la zona nuclear ligado por un punto a la membrana celular. En los eucariontes el ADN est ligado mediante enlaces inicos a protenas llamadas HISTONAS (protenas bsica) y se encuentran en el ncleo, cloroplastos y mitocondrias. ARN Los ARN en general se presentan como cadenas simples. Existen tres tipos de ARN - ARN MENSAJERO (mARN): Se forma a partir de ADN por un proceso llamado transcripcin, en donde la secuencia de bases de la hebra del mARN es complementaria de la del ADN que fue transcripta. Desde el ncleo pasa al citoplasma donde entregar la informacin para sntesis de protenas - ARN DE TRANSFERENCIA (tARN): Actan como transportadores de aminocidos individuales durante la sntesis de las protenas. Cada uno de los 20 aminocidos posee por lo menos un tARN. ARN RIBOSOMICO (rARN): Constituye el 65% de la masa de los ribosomas (los ribosomas estn formados por ribonucleoprotenas). ARN cataltico (RIBOZIMAS): son enzimas de naturaleza nucleotdica no proteica que se presentan en el proceso de maduracin de ARNm.
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Tanto el ADN como el ARN presentan a los nucletidos unidos covalentemente por puentes fosfodister entre el grupo 5'-hidroxilo de un nucletido y el 3'-hidroxilo de siguiente. As el esqueleto de ADN y ARN est constitudo por grupos alternados de fosfatos y pentosas. Las bases pricas y pirimidnicas constituyen cadenas laterales diferenciadas.
PARTE EXPERIMENTAL
AISLAMIENTO DEL DESOXIRRIBONUCLEATO DE SODIO DEL TIMO DE TERNERA Una fuente adecuada para la obtencin del ADN debe reunir ciertos requisitos, entre los que se puede mencionar los siguientes: 1) Elevada concentracin de ADN. 2) Mnima relacin ARN/ADN 3) Baja actividad de ADNasa. 4) Elevado contenido ADN/rgano. 5) Fcil disponibilidad. 6) Bajo costo. El timo de ternera, conocido vulgarmente como falsa molleja rene todos estos requisitos. El mtodo elegido consta de los siguientes pasos: I. II. III. IV. Aislamiento del complejo desoxirribonucleoproteico (ADN-protena). Disociacin del complejo en sus dos componentes : DNA y protenas. Eliminacin de las protenas. Precipitacin del desoxirribonucleato de sodio.
I- AISLAMIENTO DEL COMPLEJO DESOXIRRIBONUCLEOPROTEICO Pesar 15 gr. de timo en una cpsula de Petri y cortar con un cuchillo o navaja en lminas delgadas; colocar el tejido desmenuzado en un vaso homogeneizador de 100 ml de capacidad y se le agregar 45 c.c. de citrato de sodio 0,015 M y 45 c.c. de cloruro de sodio 0,15 M. Tomar el pH y elevar a pH 7 con Tris. Colocar la mezcla en licuadora y presionar el botn de mxima velocidad durante 3 minutos. Se obtiene una suspensin de color rosado con resto de tejido de aspecto fibroso. Centrifugacin: Verter el homogeneizado en tubos de centrfuga y centrifugar en fro (5C) durante 5 minutos a 5.000 r.p.m.. Se obtiene un precipitado adherente blanquecino (dRNP) y un sobrenadante de color rosado (RNP). Desechar el sobrenadante y trabajar con el precipitado.
II-DISOCIACION DEL COMPLEJO DESOXIRRIBONUCLEOPROTEICO: Colocar en un Erlenmeyer de 200 ml el precipitado obtenido y agregar 30,75 ml de Citrato de Sodio 0,015 M y dispersar con varilla de vidrio a temperatura ambiente. Agregar 0,77 ml. de solucin de SDS (dodecil sulfato de sodio) al 5% en etanol al 45%. Sucesivamente agregar siguiendo el orden que se indica y mezclar bien despus de cada adicin, 9,72 ml de SDS al 45% en etanol al 45%, 52,50 ml. de ClNa 2 M y 3,78 ml de Citrato de Sodio 0,015 M (para completar 105 ml.) III-ELIMINACION DE LAS PROTEINAS:
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En una ampolla de decantacin colocar la suspensin obtenida y agregar el mismo volumen de cloroformo-alcohol isoamlico (24:1), agitar vigorosamente durante 30 segundos. Distribuir la emulsin resultante en tubos de centrfuga y se centrifuga en fro (5C) durante 10 minutos a 5000 r.p.m. Retirar los tubos suavemente de la centrfuga para mantener la separacin de las fases. Con una pipeta capilar retirar la capa acuosa superior que contiene la sal de sodio del DNA tratando de no perturbar la fase proteica. IV-PRECIPITACION DEL DESOXIRRIBONUCLEATO DE SODIO: En un recipiente de telgopor colocar hielo picado y sobre el mismo, un vaso de precipitacin que contiene la capa acuosa desproteinizada. Medir dos volmenes de etanol al 95% fro y verter lentamente sobre las paredes del vaso tratando de formar una capa alcohlica sobre la fase acuosa viscosa. Con una varilla de vidrio gruesa agitar la solucin de ADN con un movimiento de rotacin suave y continuo hasta que las dos fases se mezclen y todas las fibras del material gelatinoso rico en ADN se hallan enroscado sobre la varilla. Cuando el etanol se vuelve lmpido, signo de que ya se ha enroscado todo el ADN, retirar la varilla del lquido y presionar las fibras de ADN sobre las paredes del vaso de precipitacin para exprimir el exceso de solvente. Eliminar el lquido residual apoyando la varilla sobre un papel de filtro. Lavar el precipitado introduciendo la varilla que contiene el ADN en un tubo que contenga etanol al 95% y luego en otro que contenga ter etlico. Retirar el ADN de la varilla y colocar en un vidrio de reloj dejar secar 10 minutos para eliminar por completo el solvente.