PROCEDIMIENTO

VALIDACION DE METODOS DE ENSAYOS

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1. OBJETIVO El presente procedimiento tiene por objetivo describir el proceso para la validacin de un mtodo de ensayo, realizado con el fin de confirmar la aptitud del mtodo de ensayo mediante examen y provisin de evidencia objetiva. 2. ALCANCE Este procedimiento se aplica a cualquier mtodo, normalizado o no, que pertenezca a los servicios de ensayo del Laboratorio de Medio Ambiente y QA/QC. 3. RESPONSABILIDADES 3.1. Analistas y Asistentes Responsables del cumplimiento de este procedimiento.

4. CONTENIDO 4.1. 4.2. 4.3. 4.4. 4.5. 4.6. Definiciones. Elaboracin del Programa de Validacin. Elaboracin del Programa de Revalidacin Lmite de Deteccin del Mtodo y Lmite de Cuantificacin Prctico. Estudio de Linealidad del Mtodo. Estudio de Exactitud: Veracidad y Precisin. 4.6.1. 4.6.2. 4.7. 4.8. Estudio de Veracidad. Estudio de Precisin.

Estudio de Selectividad del Mtodo. Informe de Validacin del Mtodo.

4.9. Control de Eliminaciones 5. DESARROLLO DOCUMENTO NO CONTROLADO EN FORMATO IMPRESO

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5.1.

DEFINICIONES 5.1.1. Validacin: confirmacin mediante el suministro de evidencia objetiva de que se han cumplido todos los requisitos para una utilizacin o aplicacin especifica prevista. Veracidad: es el grado de concordancia entre la media aritmtica de un gran nmero de resultados de ensayos y el valor de referencia verdadero convencionalmente verdadero. Precisin: grado de dispersin entre los resultados de ensayos. Repetibilidad: variabilidad mnima, determinado con factores constantes: operador, equipo, calibracin del equipo, ambiente y tiempo entre mediciones, se expresa en trminos de desviacin estndar Sr. Reproducibilidad: variabilidad mxima, determinado con factores variables. Se expresa en trminos de desviacin estndar SR. Linealidad: capacidad del procedimiento analtico de obtener resultados que sean directamente proporcionales a la concentracin del analito. Lmite de Linealidad: El lmite superior de la concentracin o cantidad de una sustancia para la cual las adiciones incrementadas producen incrementos constantes de la respuesta.

5.1.2.

5.1.3. 5.1.4.

5.1.5.

5.1.6.

5.1.7.

5.2.

ELABORACIN DEL PROGRAMA DE VALIDACIN 5.2.1. El Coordinador del Sistema de Calidad, en coordinacin con el Supervisor del Laboratorio o una persona designada por l , elabora un programa de validacin sealando el anlisis, mtodo de ensayo analistas participantes, aspectos a validar, nivel de concentracin en estudio, fechas de cumplimiento y responsable a evaluar. Este programa debe ser aprobado por el Supervisor del Laboratorio. El Coordinador del Sistema de Calidad o una persona designada por l, comunica y coordina con los analistas y asistentes la realizacin del Programa de Validacin. Los estudios de validacin comprenden: a. Lmite de Deteccin del Mtodo y Lmite de Cuantificacin Prctico. DOCUMENTO NO CONTROLADO EN FORMATO IMPRESO

5.2.2.

5.2.3.

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b. Estudio de Linealidad del Mtodo. c. Estudio de Exactitud: Veracidad y Precisin. d. Estudio de Selectividad del Mtodo. 5.2.4. El estudio completo de validacin se aplicar de acuerdo al programa de validacin de cada mtodo de ensayo.

5.3.

ELABORACIN DEL PROGRAMA DE REVALIDACIN 5.3.1. El estudio de revalidacin del mtodo se realizara cada 2 aos segn el FLMA-110 Programa de Revalidacin de los Mtodos de Ensayo del Laboratorio el cual ser elaborado por el Coordinador del Sistema de calidad o una persona designada por l y aprobado por el Supervisor e incluir lo siguientes puntos: a. Verificacin del Lmite de Cuantificacin segn ILMA-22 Lmites de Deteccin y Cuantificacin. b. Verificacin del lmite de linealidad. c. Evaluacin de linealidad. d. Evaluacin de repetibilidad (anlisis continuo de la data de los grficos de control. Ver ILMA-16) 5.3.2. Los datos generados del tem: 5.3.1 (a,b,c) de la revalidacin se ingresaran al FLMA-95 Estudio de Revalidacin. Cada proceso de revalidacin de los mtodos de ensayos se archiva en forma independiente. Cada mtodo revalidado posee un informe de validacin (FLMA-76 Informe de Validacin ), el mismo que es revisado por el Coordinador de Sistema de Calidad y aprobado por el Supervisor del Laboratorio. El Coordinador del Sistema de Calidad archiva el informe de Validacin y los registros generados durante la revalidacin del mtodo.

5.3.3.

5.3.4.

5.3.5.

5.4.

LMITE DE DETECCIN DEL MTODO (LDM) Y LMITE DE CUANTIFICACIN PRCTICO (LCP). El Lmite de Deteccin del Mtodo y el Lmite de Cuantificacin Prctico se evalan de acuerdo a la instruccin ILMA-22 Lmites de Deteccin y Cuantificacin. DOCUMENTO NO CONTROLADO EN FORMATO IMPRESO

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5.5.

ESTUDIO DE LINEALIDAD DEL MTODO 5.5.1. La determinacin de linealidad se aplica a aquellas tcnicas que proporcionen curvas de calibracin. Realizar tres curvas de calibracin para obtener los datos de la seal de cada uno de los estndares de calibracin (seal como absorbancia, picoamperios, etc). Ingresar los datos de las tres curvas de calibracin en el formato FLMA63 Validacin de Mtodos de Ensayo donde se ejecutar, en forma automtica, el clculo de la ecuacin de la curva de calibracin, del coeficiente de correlacin y de los siguientes parmetros estadsticos:

5.5.2.

5.5.3.

Sa = Sy/x =

X2 / n

( xi x prom)2

Sb = S y/x / ( Xi X prom) 2 Sy/x = ( Yi Y prom) 2 / ( n-2) donde: Sa = desviacin estndar de la ordenada. Sb = desviacin estndar de la pendiente Sy/x = varianza del residual n = nmero de datos X = valores de x Y = valores de y 5.5.4. Para confirmar la linealidad del mtodo en el mbito de concentraciones determinado, los datos ingresados en 5.4.3 nos proporcionaran una ecuacin de la recta (el coeficiente de correlacin aceptable debe ser mayor o igual a 0.995). Se evaluara el lmite de linealidad preparando estndares con concentraciones mayores al ltimo punto de la curva de calibracin. La recuperacin del estndar deber encontrarse dentro del +/- 10% del valor del estndar preparado para aceptar la linealidad hasta esa concentracin. DOCUMENTO NO CONTROLADO EN FORMATO IMPRESO

5.5.5.

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5.5.6.

Prueba de convergencia para la correlacin a. Se plantea la hiptesis nula: Ho:r=0 ( no existe correlacin entre x e y), para aceptar la hiptesis alternativa H1:r 0. Se aplica la siguiente formula:

Sr 2= 1 r2 n-2 donde: r : coeficiente de correlacin n : nmero de datos Se aplica la prueba t-student segn la frmula: r

tr = Sr -

El valor de t - student de la tabla se calcula con n-2 grados de libertad bajo un nivel de significancia 95% con dos colas. El valor t calculado debe ser mayor al t tabla, para rechazar la hiptesis, es decir se rechaza la hiptesis nula y se concluye en tal caso que existe una correlacin significativa por lo tanto hay linealidad.

5.6.

ESTUDIO DE EXACTITUD: PRECISIN Y VERACIDAD 5.6.1. Estudio de Veracidad a. Se selecciona la concentracin del material de referencia para trabajar en los niveles bajo, medio y alto. b. Se realiza una serie de 10 rplicas del material de referencia por cada nivel de estudio. Estas soluciones deben ser preparadas independientemente una de la otra. c. Los 10 datos obtenidos por cada nivel de estudio, se ingresan a la hoja Veracidad del formato electrnico FLMA-63 Validacin de Mtodos de Ensayos

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d. Este formato electrnico posee frmulas que se ejecutarn automticamente para realizar la prueba de t-Student. La prueba de tStudent compara los resultados obtenidos, con el valor de referencia o convencionalmente verdadero: La prueba de t-Student se inicia con el planteamiento de la hiptesis que x = 0 Se calcula la t-student con la siguiente frmula: t = x - 0 s/ n donde: x = promedio hallado. 0= valor referencial. n = nmero de datos. Los valores nominales de la t-student se encuentran en tablas estadsticas (para n-1 grados de libertad y con 95% de probabilidad). El valor t calculado debe ser menor al t tabla para no rechazar la hiptesis planteada, es decir para aceptar la veracidad del mtodo.

e. El formato electrnico emitir un mensaje de el mtodo SI es veraz o el mtodo NO es veraz en caso que se haya pasado o no la prueba de veracidad, respectivamente. f. Para concluir que el mtodo es veraz el t calculado debe ser menor al t tabla en los tres niveles de concentracin. 5.6.2. Estudio de Precisin a. Se evaluar el grado de dispersin entre los resultados de ensayos.

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b. Se selecciona 3 analistas para realizar los ensayos, as como el material de referencia con el que se va a trabajar por un periodo de tres das y 4 repeticiones en cada da (se necesita un mnimo de 36 datos en total). Estos ensayos se realizan para los niveles de concentracin bajo, medio y alto. c. Se realiza el escrutrinio de datos a travs de las pruebas de Mandel, Cochran y Grubbs, antes de continuar con este estudio de precisin (ver anexo 1). d. Ingresar los datos que han pasado las pruebas de Mandel, Cochran y Grubbs a la hoja Estudio de Precisin del formato electrnico FLMA63 Validacin de Mtodos de Ensayo., en donde se determinara la desviacin estndar de repetibilidad ( Sr) y desviacin estndar de reproducibilidad ( SR) e. La hoja electrnica Estudio de Precisin posee frmulas que se ejecutarn en forma automtica. Estas frmulas realizarn los clculos para luego evaluar los datos y determinar el lmite de repetibilidad (Lr) entre analistas y lmite de reproducibilidad interna (LR) de los analistas. f. El formato emitir una seal de Aceptable en caso pase la prueba de repetibilidad y reproducibilidad por lo tanto el mtodo de ensayo presenta condiciones de repetibilidad y reproducibilidad.

5.7.

ESTUDIO DE SELECTIVIDAD DEL MTODO a. Se selecciona la muestra con la matriz a evaluar. b. Se determinan los niveles de concentracin bajo, medio y alto para realizar el estudio de selectividad. c. Preparar una serie de siete LFB: Blanco Fortificado de Laboratorio para cada nivel de concentracin. d. Preparar una serie de siete LFM: Matriz Fortificada de Laboratorio. La muestra de preferencia no debe contener el analito de inters o debe estar en bajas concentraciones. Preparar esta serie para cada nivel de concentracin. e. Se ingresan los resultados en la hoja Selectividad del formato FLMA63 Validacin de Mtodos de Ensayo. Este formato posee frmulas DOCUMENTO NO CONTROLADO EN FORMATO IMPRESO

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que determinarn si el mtodo es selectivo o no, de acuerdo a lo siguiente: Se realiza la prueba F de Fisher para verificar si las varianzas pueden ser consideradas igual: F = S12/S22 Donde S12 y S22 son las varianzas de cada serie. El valor de la mayor varianza se coloca en el numerador. Al mismo tiempo, se obtiene el valor de F de tablas con (n1-1) grados de libertad en el numerador y (n2-1) grados de libertad en el denominador, con un nivel de confianza del 95 %. La prueba F no es significativa, si el F calculado es menor que el F de tablas, es decir la matriz no tiene efecto importante sobre la precisin del mtodo en el nivel de concentracin en estudio. La prueba F es significativa, si el F calculado es mayor que el F de tablas, es decir la matriz de la muestra tiene efecto importante sobre la precisin del mtodo al nivel de concentracin en estudio, por lo tanto el mtodo no es selectivo.

5.8.

INFORME DE VALIDACIN DEL METODO 5.8.1. Cada proceso de validacin de los mtodos de ensayos se archiva en forma independiente. Cada mtodo validado posee un informe de validacin (FLMA-76 Informe de Validacin ), el mismo que es revisado por el Coordinador de Sistema de Calidad y aprobado por el Supervisor del Laboratorio. El Coordinador del Sistema de Calidad archiva el informe de Validacin y los registros generados durante la validacin del mtodo.

5.8.2.

5.8.3.

6. FORMATOS / REGISTROS 6.1. 6.2. 6.3. 6.4. FLMA-63 Validacin de Mtodos de Ensayo. FLMA-76 Informe de validacin FLMA-95 Estudio de Revalidacin FLMA-110 Programa de Revalidacin de los Mtodos de Ensayo DOCUMENTO NO CONTROLADO EN FORMATO IMPRESO

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7. REFERENCIAS 7.1. 7.2. Lmites de Deteccin y Cuantificacin (ILMA-22) NTP ISO 5725-1:1999, Exactitud (Veracidad y Precisin) de los mtodos y resultados de la medicin. Parte 1: Principios generales y definiciones. NTP ISO 5725-2:1999, Exactitud (Veracidad y Precisin) de los mtodos y resultados de la medicin. Parte 1: Mtodos bsicos para la determinacin de la repetibilidad y reproducibilidad de un mtodo de medida normalizado. NTP ISO 5723-4:1999, Exactitud (Veracidad y Precisin) de los mtodos y resultados de la medicin. Parte 1: Mtodos bsicos para la determinacin de veracidad de un mtodo de medicin normalizado. Instituto Nacional de Metrologa" Orientacin sobre Validacin en Mtodos de Ensayos Qumicos"

7.3.

7.4.

7.5.

8. CONTROL DE ELIMINACIONES En relacin a la revisin anterior este documento presenta las siguientes eliminaciones:
Numeral 5.2.5, Pg. 3 Se elimino: El Coordinador del Sistema de Calidad, en coordinacin con el Supervisor del Laboratorio, designa a un analista para realizar una pruebas de validacin en muestras de aguas (mediante pruebas estadsticas), para lo cual se extraen los datos de los muestras control aplicadas en el Laboratorio. Este se anexa en el file de cada mtodo de ensayo. Se elimino: Estudio de Veracidad Estudio de Validacin en muestras de agua

Numeral 5.3.1, Pg. 3

9. ANEXOS 9.1. Escrutinio de Datos 9.1.1. Se colecta los datos obtenidos en el estudio de realizado durante tres das por tres analistas y con 4 repeticiones. DOCUMENTO NO CONTROLADO EN FORMATO IMPRESO

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9.1.2.

Se pasan los datos a la hoja Escrutinio de Datos del formato electrnico FLMA-63 Validacin de Mtodos de Ensayo para que se ejecute el escrutinio de datos en forma automtica a travs de las pruebas de Mandel Cochran y Grubs: a. Prueba de Mandel Se calcula h y K de Mandel de la siguiente manera:
SD total

h = yij - y K = SD ( p) 1/2 ( sij2 )1/2 Donde : yij = promedio de los datos obtenidos por 1 analista durante 3 das. y = promedio total. SD total = desviacin estndar de los promedios. SD = desviacin estndar de los datos obtenidos por 1 analista durante 3 das. p = varianza total. sij = desviacin estndar. Los valores de h y K nominales al 5 %se encuentran en tablas. Se comparan los valores de h y K experimentales (obtenidos con las frmulas anteriores) con los valores nominales (obtenidos de la tabla) por cada analista. Los valores experimentales de h y K deben ser menores a los valores de la tabla para probar la inexistencia de valores atpicos.

b. Prueba de Cochran DOCUMENTO NO CONTROLADO EN FORMATO IMPRESO

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Para calcular el valor experimental de Cochran se aplica la siguiente frmula: C = Sd 2max Var tot

Donde: Sdmax = desviacin estndar mxima. Var tot = varianza total. Los valores de Cochran nominales al 1 y 5 % se encuentran en tablas. El valor experimental de Cohcran debe ser menor comparada con los valores de la tabla para probar la inexistencia de valores atpicos.

c. Prueba de Grubbs Para probar la significacin del valor del promedio ms alto, se calcula el Gp de la siguiente manera:
Gp = (Promedio mximo Promedio total) / S.D. total

Para probar la significancia del valor del promedio ms pequeo se calcula Gi de la siguiente manera:
Gi= ( Promedio total promedio mnimo ) / S.D. total

Los valores de Grubs nominales al 5% se determinan de tablas. Si los resultados de Gp y Gi son menores o iguales que su valor nominal, el valor es aceptado como correcto.

d. En base a los hallazgos, se puede: Conservar los datos del analista por el momento. Pedir al analista que vuelva a hacer la prueba.

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Retirar del estudio, los datos del analista y designar a otro analista para el estudio.

e. El limite de repetibilidad ( Lr) = 2.8* Sr f. El limite de reproducibilidad ( LR) = 2.8 * SR

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