La ciencia es el alma de la prosperidad de las naciones y la fuente de vida de todo progreso.

LOUIS PASTEUR

Improvement of bioinsecticides production through adaptation of Bacillus thuringiensis cells to heat treatment and NaCl addition

Mejoramiento de la produccin de bioinsecticidas a travs de la adaptacin de las clulas de Bacillus thuringiensis al choque trmico y la adicin de Nacl

Tatiana Rangel Rubio cd. 1610458 Dayana Andrea Vsquez Barajas cd. 1610457

INTRODUCCION OBJETIVOS MATERIALES Y METODOLOGIA

RESULTADO Y DISCUSIONES
CONCLUSIONES

BIBLIOGRAFIA

Bacillus thuringiensis

Las toxinas Cry de B. thuringiensis

Es una bacteria Gram-positiva, aerobia estricta, que durante su ciclo de vida presenta dos fases principales: crecimiento vegetativo, donde las bacterias se duplican por biparticin, y esporulacin, un programa de diferenciacin de bacteria a espora.

http://ecosiembra.blogspot.com/2011_05_01_ archive.html

Los sntomas que se observan a partir de que las larvas de insectos susceptibles ingieren los cristales y esporas de Bacillus thuringiensis son: cese de la ingesta, parlisis del intestino, diarrea, parlisis total y finalmente la muerte.

Aumentar los rendimientos de la produccin de delta- toxinas mediante la adaptacin de clulas Bacillus thuringiensis al choque trmico y el cloruro de sodio y para investigar sus implicaciones en bioinsecticidas mejorando la produccin.

M2 Cepa de Bacillus thueingiensis M4

M5 M11
http://www.elhabanero.cubaweb.cu/2010/febrero/ nro2785_feb10/cienc_10feb043.html

M14

Bacillus thuringiensis variedad kurstaki BNS3.

M14-1

Fuentes de gacha y harina de pescado

Gacha almidon carbohidratos celulosa gluten nitrgeno total

60% 5% 1-5% 12% 2-1%

Harina de pescado protenas nitrogeno total 43% 7-23%

Preparacin del inoculo

Alcuota de 0,2 ml
O.D.600 de 0,15, correspondiente a casi 2*108 UFC/mL y 0,05 g/L en biomasa seca

Cepa
3ml de LB/ incubar durante toda la noche a 30C

50ml de LB/ incubar durante 6h a 30C, agitacin de 200 rpm y O.D 600

Medio LB (LURIA BERTANI) Para 1L Bacto tristona 10g Extracto de levadura 5g NaCL 10g

1 ml se siembra en agar LB /O.D.600 fue de 0,185 con respecto a 2*108 clulas viables por mL.

Produccin de bioinsecticida en medio de glucosa

Esterilizar a 121C/20min(F .C y CaCO3 se esteriliza por aparte) Volumen del medio 50ml en matraz de 1000ml Incubacin a 72h/30C/200rpm

Medio liquido de glucosa Para 50 mL y un pH de 7 Fuente de Glucosa 15g/L carbono Glicerol 5g/L sulfato de amonio 5,4g/L extracto de levadura 5g/L KH2PO4 1g/L K2HPO4 1g/L Minerales MgSO4 0,3g/L MnSO4 0,01g/L FeSO4 0,01g/L Estabilizador de pH CaCO3 20g/L

Produccin de bioinsecticida en medio de glucosa

Esterilizar a 121C/20min(F .C y CaCO3 se esteriliza por aparte) Volumen del medio 50ml en matraz de 1000ml Incubacin a 72h/30C/200rpm Medio complejo de gacha y harina de pescado Gacha en 42g/L crudo harina de 20g/L pescado sulfato de 6,6g/L C:N=7 amonio KH2PO4 1g/L K2HPO4 1g/L Minerales MgSO4 0,3g/L MnSO4 0,01g/L FeSO4 0,01g/L NaCL 0,5g/L Tween 80 1g/L Estabilizador CaCO3 1g/L de pH

Tratamiento de choque trmico Suplemento con NaCL

(15 o 20 minutos) en un agitador con 200 rpm y temperaturas adecuadas (30, 40, 42, 50 o 60 C). Cultivo a varias concentraciones de NaCl (5 7 g/L)

Combinacin de los dos tratamientos

incubaron a diferentes concentraciones de NaCl (5 o 7 g/L) a diferentes tiempos (15 o 20 min) en un agitador rotatorio a 200 rpm a 42 C.

http://www.taringa.net/pos ts/saludbienestar/2265195/12aditivos-alimentarios-queconviene-evitar.html

Determinacin de biomasa y delta-endotoxina

Zouari et al.(1998) y Metodo de Bradford (1976)
10 -x 10 -x 10 -x 10 -x 10 -x

El medio Despus de 72h

80C/10min

Diluciones adecuadas

Incubar 30C/durante la noche

Se siembra de las diluciones en medio solido de LB

1ml del medio 10min/10000 rpm

Lavar el pellet 2 veces con NaCL (1mmol/L)

Lavar el pellet 2 veces con agua destilada

Se empela Bio-Rad para recuento de las protenas en el sobrenadante

Delta-endotoxina (ml/L)/UFC(espora /L)

Incubar 30C/2h

Pellet suspendido en 1ml de 50mmol/L NaOH (pH 12,5) Con el fin de solubilizar los cristales

Ensayo de actividad Proteoltica

Kembhavi et al. (1993)

Anlisis de los Resultados

Todos los resultados relacionados con la determinacin de delta-endotoxina produccin, las UFC, y la actividad proteoltica fueron los promedio de tres rplicas de dos experimentos separados para cada condicin de cultivo. Ellos fueron analizados estadsticamente por el programa SPSS (versin de 100) mediante la prueba de Duncan realiz despus de ANOVA.

Ciclo de crecimiento de B. thuringiensis en respuesta al choque trmico

Efecto del tratamiento trmico en la viabilidad de las clulas de B. thuringiensis y la sntesis de la deltaendotoxina

Independencia del efecto del estrs sobre la composicin de los medios de cultivo

Efecto de la combinacin del choque trmico y el cloruro de sodio en la sntesis de la deltaendotoxina

Investigacin de la adaptacin de clulas de B. thuringiensis a factores de estrs combinados

Investigacin del efecto del NaCl en el crecimiento de B. thuringiensis y la produccin de deltaendotoxina

Efecto del tratamiento trmico en la viabilidad de las clulas de B. thuringiensis y la sntesis de la deltaendotoxina

Efecto del tratamiento trmico a 20 minutos en la produccin de esporas y deltaendotoxinas

T (C) UFC despus del tratamiento (108 esporas /mL) UFC final (108 esporas /mL) Supervivencia (%) Crecimiento posttratamiento (%) Toxinas (mg/L) Rendimiento relativo de toxinas (mg/ 1011 esporas) Mejoramiento en la produccin (%)

30 40 42 50 60

14,4 10,8 10,0 6,1 4,2

22 17 15 8 6

100 77,3 68,2 36,4 27,3

34,5 36,5 33,5 23,8 30,0

560 628 634 382 267

25,5 37,0 42,0 47,8 44,5

---12 13 -29 - 58

Efecto del tratamiento trmico a 40 C () y 42 C () en la supervivencia de las clulas de Bacillus thuringiensis

Efecto del tratamiento trmico a 40 C () y 42 C () sobre el crecimiento post-tratamiento

Efecto del tratamiento trmico a 40 C () y 42 C () rendimiento relativo de toxinas de clulas esporuladas

Ciclo de crecimiento de B. thuringiensis en respuesta al choque trmico

Efecto del tratamiento trmico realizado a 42 C a diferentes tiempos de incubacin del cultivo
Rendimiento relativo de toxinas (mg/ 1011 esporas) Mejoramiento en la produccin de toxinas (%)

Clulas tratadas

Duracin del tratamiento (min)

Toxinas (mg/L)

UFC (108 esporas /mL)

---Inoculacin Inoculacin 6h 6h 9h 9h 11 h 11 h

0 15 20 15 20 15 20 15 20

552 534 523 716 764 724 718 673 623

21 20 20 17 16 17 16 16 15

26 17 26 42 48 43 42 42 39

------------30 38 31 30 22 13

Efecto de la adicin de 7 g/L NaCl en la produccin de esporas y delta-endotoxinas

Tiempo de adicin del NaCl (h) Rendimiento relativo de toxinas (mg/ 1011 esporas) Mejoramiento en produccin de toxinas (%)

Toxinas (mg/L)

UFC (108 esporas/ mL)

----0
6 9 11

535 684
675 609 587

20 24
25 22 21

27,0 28,5
27,0 27,7 26,8

----28
27 18 5

Efecto de la adicin de 7 g/L de NaCl en el crecimiento y produccin de delta-endotoxinas por varios mutantes
UFC (+ NaCl)/ (-NaCl) Toxinas (+NaCl)/ Toxinas (-NaCl) Incremento en la produccin de toxinas

Incremento UFC (%)

BNS3 M2 M 11 M5 M4

25/20 30/30 30/31 20/17 19/16

25,0 0 0 17,6 18,7

684/654 758/755 780/772 834/763 807/742

24,0 0 0 9,3 8,8

M 14

25/21

19,0

992/941

5,3

MARIO SOBERON Y ALEJANDRA BRAVO. Las toxinas Cry de Bacillus thuringiensis: modo de accin y consecuencias de su aplicacin. [En lnea]. http://www.ibt.unam.mx/computo/pdfs/libro_25_aniv/capitulo_27.p df. [citado 1 de junio del 2011].

La ciencia es respecto del alma lo que es la luz respecto de los ojos, y si las races son amargas, los frutos son muy dulces. ARISTOTELES