Manual Enfermedades Chagas

INSTITUTO NACIONAL DE SALUD
MINISTERIO DE SALUD INSTITUTO NACIONAL DE SALUD
SERIE DE NORMAS TCNICAS N 00
MANUAL DE PROCEDIMIENTOS DE LABORATORIO PARA EL DIAGNSTICO DE LA TRYPANOSOMIOSIS AMERICANA (ENFERMEDAD DE CHAGAS)
Instituto Nacional de Salud

Calle Cpac Yupanqui 1400, Lima 11, Per Apartado Postal 471, Telfono: (0511) 471-9920 Fax: (0511) 471-0779 Correo electrnico: revmedex@ins.gob.pe Pgina web: www.ins.gob.pe
MANUAL DE PROCEDIMIENTOS DE LABORATORIO PARA EL DIAGNSTICO DE LA TRYPANOSOMIOSIS AMERICANA
SERIE DE NORMAS TCNICAS N 00
Lima, 2005
MINISTERIO DE SALUD INSTITUTO NACIONAL DE SALUD

Ministerio de Salud
MANUAL DE PROCEDIMIENTOS DE LABORATORIO PARA EL DIAGNSTICO DE LA TRYPANOSOMIOSIS AMERICANA (ENFERMEDAD DE CHAGAS)
ELABORACIN: Biloga Silvia Vega Chirinos Doctor Csar Nquira Velarde Laboratorio de Leishmaniosis y Chagas Centro Nacional de Salud Pblica-INS
Catalogacin hecha por el Centro de Documentacin e Informacin del INS
Vega Chirinos, Silvia ; Nquira Velarde, Csar Manual de procedimientos de laboratorio para el diagnstico de la trypanosomiosis americana (enfermedad de Chagas) / Elaborado por Silvia Vega Chirinos y Csar Nquira Velarde. 2. Ed. Lima : Ministerio de Salud, Instituto Nacional de Salud, 2006. 106 p.: 14.5 x 21 cm. (Serie de Normas Tcnicas; 26) 1. TCNICAS Y PROCEDIMIENTOS DE LABORATORIO 2. ENFERMEDAD DE CHAGAS I. Nquira Velarde, Csar II. Vega Chirinos, Silvia III. Instituto Nacional de Salud (Per) IV. Per. Ministerio de Salud
1. edicin, 1999 ISBN 9972 857 26 3 (O.C.) ISBN 9972 857 30 1 (N26) (2da. ed.) ISSN 1607 4904 Hecho el Depsito Legal N 1501132002-5854 Ministerio de Salud, 2006 Av. Salaverry cuadra 8 s/n, Jess Mara, Lima, Per Telfono: (511) 431-0410 Instituto Nacional de Salud, 2006 Cpac Yupanqui 1400, Jess Mara, Lima, Per Telfono: (511) 471-9920 Fax: (511) 471-0179 Correo electrnico: postmaster@ins.gob.pe Pgina Web: www.ins.gob.pe Publicacin aprobada con R.J. N 164 2006 JOPD/INS Portada: Observacin microscpica de formas mviles del Trypanosoma cruzi. Aspectos de identificacin y diagnstico de la enfermedad de Chagas. Se autoriza su reproduccin total o parcial siempre y cuando se cite la fuente.
CONTENIDO
Resolucin jefatural ................................................................................. 5 Presentacin ............................................................................................. 7 Introduccin ............................................................................................... 9 CAPTULO I Trypanosoma cruzi ................................................................................... 11 CAPTULO II Diagnstico de laboratorio ....................................................................... 21 CAPTULO III Obtencin de la muestra sangunea ....................................................... 29 CAPTULO IV Examen de la sangre: en fresco, gota gruesa, frotis .............................. 33 CAPTULO V Tcnicas de concentracin: microconcentracin, concentracin de Strout .................................................................................................... 37 CAPTULO VI Hemocultivo .............................................................................................. 41 CAPTULO VII Xenodiagnstico ....................................................................................... 47 CAPTULO VIII Hemaglutinacin indirecta (HAI) .............................................................. 51 CAPTULO IX ELISA ......................................................................................................... 57
CAPTULO X Inmunofluorescencia indirecta (IFI) ......................................................... 63 CAPTULO XI Control de calidad .................................................................................... 69 CAPTULO XII Bioseguridad ............................................................................................. 73 Referencias bibliogrficas ...................................................................... 77 Anexo 1: Preparacin de reactivos y medios de cultivo ......................... 79 Anexo 2: Aislamiento y mantenimiento del Trypanosoma cruzi en el laboratorio ............................................................................... 87 Anexo 3: Preparacin de antgenos ........................................................ 89 Anexo 4: Conservacin y envo de muestras Examen de laboratorio solicitado segn tipo de muestra ..................... 93 Anexo 5: Solicitud para el diagnstico de laboratorio de la enfermedad de Chagas Anexo 6: Solicitud de control del diagnstico de laboratorio de la enfermedad de Chagas Anexo 7: Registro de muestras para investigacin y monitoreo de casos de enfermedad de Chagas Anexo 8: Protocolo para la deteccin de anticuerpos anti Trypanosoma cruzi por ELISA Anexo 9: Protocolo para la deteccin de anticuerpos anti Trypanosoma cruzi por inmunofluorescencia indirecta (IFI)
MANUAL
DE PROCEDIMIENTOS DE LABORATORIO PARA EL DIAGNSTICO DE LA TRYPANOSOMIOSIS AMERICANA
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I NSTITUTO N ACIONAL
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MANUAL DE
PROCEDIMIENTOS DE LABORATORIO PARA EL DIAGNSTICO DE LA TRYPANOSOMIOSIS AMERICANA
PRESENTACIN
La trypanosomiosis americana o enfermedad de Chagas es una infeccin parasitaria producida por Trypanosoma cruzi y transmitida por insectos hematfagos de la familia Reduvidae. La presencia de estos insectos infectados ha sido demostrada en todo el pas, por lo que la transmisin vectorial de la infeccin est establecida en el territorio nacional. Al lado de la transmisin vectorial ocurre la no vectorial, principalmente por transfusin sangunea, en forma congnita y tambin por transplante de rganos. Se sabe que las manifestaciones clnicas de la enfermedad no son caractersticas, por lo cual muchos casos pasan desapercibidos. Los mtodos de diagnstico incluyen pruebas tan simples como los exmenes de sangre en fresco, frotis, gota gruesa y ms complicadas como el hemocultivo, el xenodiagnstico, las pruebas serolgicas y moleculares. El presente manual hace una descripcin de los mtodos ms frecuentes e incluye el fundamento, el procedimiento y la lectura de los resultados. En el fluxograma se sealan las pruebas que pueden desarrollarse en los laboratorios locales, intermedios y regionales de la Red Nacional de Laboratorios en Salud Pblica, as como los canales de envo de muestras e informacin. Se han aadido los captulos de bioseguridad, control de calidad y anexos, el cual se refiere a los reactivos y la preparacin requerida para los mtodos de diagnstico. El manual est especialmente dirigido para ser usado en todos los laboratorios de la red por el personal encargado del diagnstico parasitolgico y serolgico de la trypanosomiosis americana o enfermedad de Chagas. Cabe puntualizar que el avance en la bsqueda de mtodos ms especficos y sensibles, permitir disponer de tcnicas ms eficientes y que en su oportunidad sern incorporados a los que usa la red.
El comit de redaccin
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INTRODUCCIN
La enfermedad de Chagas o trypanosomiosis americana constituye un problema de salud pblica en la mayora de pases latinoamericanos; es endmica desde Mxico hasta el sur de Chile y Argentina. Se ha calculado que por lo menos 90 millones de personas estn expuestas a contraer la infeccin y que 18 millones estn infectadas (Organizacin Mundial de la Salud, 1991). Esta enfermedad metaxnica es causada por el protozoario flagelado, Trypanosoma cruzi y transmitida al ser humano, al igual que a otros mamferos, por insectos hematfagos conocidos como triatominos. Afecta diversos rganos, sistemas y aparatos, especialmente el corazn y tubo digestivo. Otras formas de contraer la infeccin son la transfusin sangunea, la va transplacentaria o transmisin congnita y el transplante de rganos. En el Per, el mayor impacto en la salud de los pobladores, ocurre en la zona sur occidental (Ica, Arequipa, Moquegua, Tacna, valles interandinos de Ayacucho y Apurmac), con la presencia del vector Triatoma infestans, comnmente conocido como "chirimacha", cuyo hbitat es domiciliario y en la zona nororiental (Cajamarca, Amazonas, San Martn), con los vectores de los gneros Triatoma, Pastrongylus y Rhodnius, de hbitat peridomiciliario y silvestre. En estas reas, se estima en 24 170 el nmero de infectados por T. cruzi, de los cuales 1209 corresponden a formas agudas u oligosintomticas y 22 962 a formas crnicas de la enfermedad. Se calcula que 3142 casos corresponden a nios menores de cinco aos. La infeccin por sexo es equitativa y el grupo de edad ms afectado est entre los 20 a 50 aos (MINSA,1998). El presente manual tiene por objeto guiar al personal de la Red Nacional de Laboratorios en Salud Pblica, en el diagnstico parasitolgico y serolgico de la trypanosomiosis americana o enfermedad de Chagas, utilizando procedimientos uniformes y comparables. El manual desarrolla los procedimientos de obtencin, procesamiento, envo de muestras y medidas de bioseguridad que deben seguirse durante el trabajo en el laboratorio.
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CAPTULO I
Trypanosoma cruzi
Trypanosoma cruzi agente causante de la enfermedad de Chagas, es un protozoario flagelado que durante su ciclo de vida, utiliza dos hospederos: insectos de la familia Reduvidae, que hacen las veces de vector, y mamferos, incluyendo al ser humano, como reservorio. El parsito presenta tres formas evolutivas (figura 1): a) Trypomastigote: Es la forma infectante para los mamferos y el insecto vector. Se caracteriza por ser de aspecto fusiforme, mide 20 micras, presenta ncleo central y cinetoplasto subterminal del cual emerge una membrana ondulante que recorre el parsito en toda su longitud y cuyo borde libre lleva un flagelo que emerge por el extremo anterior. Se le encuentra en la sangre de mamferos y en las heces del vector. No se divide. b) Amastigote: Es la forma intracelular del parsito, se aloja principalmente en los tejidos del msculo cardaco y del sistema neurovegetativo del tubo digestivo. Es de forma redondeada, mide de dos a cuatro micras, posee ncleo y cinetoplasto. Se dividen y forman seudoquistes conocidos como "nidos de amastigotes". c) Epimastigote: Es la forma libre que se multiplica por fisin binaria en el interior del tubo digestivo del vector. Es de aspecto fusiforme, mide 2030 micras, presenta ncleo y cinetoplasto ubicados en la parte central del parsito, forma que tambin se desarrolla en medios de cultivo.
1.1. CICLO BIOLGICO El ciclo biolgico del Trypanosoma cruzi (figura 2) se inicia cuando el triatomino libre de infeccin se alimenta de sangre humana o de animales infectados que contiene los trypomastigotes. Los trypomastigotes se diferencian en epimastigotes en la parte anterior del tubo digestivo del triatomino, los que se multiplican y mantienen en el intestino medio durante toda la vida del insecto. En el recto del triatomino, se transforman en trypomastigotes llamados metacclicos y son eliminados con las heces.
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AMASTIGOTE (INTRACELULAR EN EL MAMFERO)
TRYPOMASTIGOTE (EN SANGRE CIRCULANTE DEL MAMFERO Y HECES DEL INSECTO)
EPIMASTIGOTE (EN PARTE ANTERIOR DEL TUBO DIGESTIVO DEL INSECTO Y EN CULTIVOS)
Figura 1
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Figura 2
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Cuando el insecto infectado pica o succiona la sangre al reservorio, defeca y deposita sobre la piel las heces que contienen trypomastigotes metacclicos, formas infectantes para el mamfero. Los trypomastigotes atraviesan la piel erosionada por el rascado a causa de la picadura y en ocasiones, por la conjuntiva. Se introducen en las clulas adyacentes y se transforman en amastigotes; despus de multiplicarse rompen la clula que los hospeda y se diseminan en la sangre como trypomastigotes e invaden los tejidos de rganos, sistemas y aparatos importantes como el corazn y plexos nerviosos del tubo digestivo, donde se reproducen como amastigotes.
1.2. MECANISMOS DE TRANSMISIN a) VECTORIAL El principal mecanismo de transmisin se produce por contacto de la piel abierta o mucosas con las heces de los triatominos infectados. Generalmente esto ocurre en forma mecnica al rascarse despus de la picadura del insecto. El perodo de incubacin es aproximadamente de 4 a 15 das. En el Per todas las regiones naturales registran especies de triatominos (figura 3). De las 19 especies descritas hasta el momento, Triatoma infestans, Pastrongylus herreri (figura 4), Rhodnius ecuadorensis, Triatoma carrioni y Pastrongylus chinai, seran los ms importantes que han sido hallados infectados naturalmente (figura 5). b) NO VECTORIAL Otras formas de adquirir la infeccin son: Transfusin sangunea. Transmisin transplacentaria. Transplante de rganos. Accidentes en el laboratorio.
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DISTRIBUCIN DE TRIATOMINOS EN EL PER
Fig. 3. Distribucin de los vectores de la enfermedad de Chagas. Fuente: Lumbreras H. (1972), Caldern F.(1982), Guilln Z.(1992), Cceres et al. (2002).
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Fig. 4. Triatominos vectores de la enfermedad de Chagas. A) Triatoma infestans espcimen adulto (hembra). B) Pastrongylus herreri espcimen adulto (hembra).
Fig. 5. Izq.: Epimastigotes en divisin en el intestino del triatmico infectado, se observa el cinetoplasto anterior al ncleo y agrupados en colonias. Giemsa 1000 X. Der.: Trypomastigote metacclico en heces de triatmico infectado. Se observa el cinetoplasto en el extremo posterior, forma que infecta al hombre. Giemsa 1000 X.
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1.3. ACCION PATGENA Las formas clnicas ms conocidas de la efermedad de Chagas o trypanosomiosis americana son: Forma aguda Se hace evidente despus de las primeras semanas de ocurrida la adquisicin del parsito, con un cuadro febril y presencia o no del chagoma de inoculacin como ndulo o lcera, generalmente en cara o miembros superiores. Ocasionalmente se observa el signo de Romaa, que consiste en edema bipalpebral unilateral y ganglio preauricular aumentado en volumen (Figura 6).
Fig. 6. Paciente que presenta chagoma de inoculacin en el ojo izquierdo. Los trypomastigotes invaden la piel periorbitaria o conjuntiva, produciendo el complejo oftalmo-ganglionar conocido como signo de Romaa (cortesa Dr. A. Guilln).
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Las manifestaciones generales ms importantes son concomitantes con sntomas cardacos, alteraciones electrocardiogrficas e insuficiencia cardaca secundaria a miocarditis aguda. Menos frecuentes son las manifestaciones de otros rganos. En estas formas son abundantes los trypomastigotes en sangre y los amastigotes en tejido (Figura 7).
Figura 7. Arriba: Trypomastigote de Trypanosoma cruzi en sangre circulante. El ncleo se observa en posicin central y el cinetoplasto subterminal. Giemsa 1000 X. Abajo: Amastigote de Trypanosoma cruzi en corte histolgico del corazn. Formas redondeadas muy pequeas, presentan ncleo y cinetoplasto. Se les observa agrupadas en el interior de las fibras musculares (nidos de amastigotes). Hematoxilina-Eosina 1000 X.
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Forma crnica Se hace evidente despus de meses o aos de ocurrido el ingreso del parsito. Las manifestaciones ms frecuentes son de naturaleza cardaca (insuficiencia cardaca), nerviosa y digestiva (megaesfago, megacolon). En estas formas son escasos los trypomastigotes en sangre y amastigotes en tejidos. Forma indeterminada o de portador Se trata de personas aparentemente sanas, en las que la inoculacin del parsito y los sntomas de las formas agudas o crnicas no son reconocidos por el portador del parsito. La situacin del portador se evidencia, generalmente, cuando la persona desea donar sangre y el tamizaje demuestra serologa positiva para Trypanosoma cruzi. Un portador puede ser asintomtico toda la vida o presentar manifestaciones clnicas aun despus de muchos aos de haberse infectado. En esta forma, son muy escasos los trypomastigotes en sangre y amastigotes en tejidos. Forma congnita Corresponde a nios que nacen infectados por pasaje del parsito a travs de la placenta de la madre. Se trata de nios prematuros que presentan generalmente hepatoesplenomegalia con gran cantidad de trypomastigotes en sangre y amastigotes en tejidos.
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CAPTULO II
DIAGNSTICO DE LABORATORIO
Para realizar el diagnstico del laboratorio, existen distintos procedimientos tcnicos. Los directos o parasitolgicos, que se basan en la demostracin de la presencia del parsito en sangre circulante y excepcionalmente en biopsias y los inmunolgicos, que detectan la presencia de anticuerpos antiTrypanosoma cruzi (figura 8). 2.1. TCNICAS PARASITOLGICAS PARA LA DEMOSTRACIN DIRECTA DE LA PRESENCIA DEL PARSITO Gota fresca. Gota gruesa-frotis. Concentracin de Strout. Microconcentracin. Hemocultivo. Xenodiagnstico. PCR. Biopsia.
Su empleo est indicado principalmente cuando existe sospecha clnica o epidemiolgica de la forma aguda. Durante las dos a ocho primeras semanas despus ocurrida la infeccin, existe un gran nmero de trypomastigotes circulando en el torrente sanguneo y pueden detectarse mediante el examen en fresco, gota gruesa-frotis, microconcentracin, concentracin de Strout, hemocultivo y xenodiagnstico. Se usan tambin en la investigacin de Chagas congnito. El xenodiagnstico es una tcnica bastante sensible que consiste en hacer picar al posible portador del parsito con el vector libre de infeccin. Es aplicable tanto en la forma clnica aguda y congnita como en la crnicaportador y permite la multiplicacin del parsito in vivo el cual se detecta examinando las heces del insecto a partir del 30. da de su alimentacin. El PCR o reaccin en cadena de la polimerasa, es una tcnica que amplifica fragmentos de ADN del parsito y se detecta mediante hibridacin con cebadores (fragmentos de DNA) conocidos del Trypanosoma cruzi. Actualmente est siendo ensayada por su alta sensibilidad y especificidad, principalmente en la forma congnita de la infeccin y en el seguimiento del tratamiento.
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La biopsia de msculo esqueltico, ganglio etc., permite la observacin de los "nidos de amastigotes". Esta tcnica est limitada a casos especiales de estudio por lo que no se desarrollar en el presente manual. El resultado parasitolgico positivo confirma la infeccin, pero el resultado negativo no la descarta.
2.2. TCNICAS INMUNOLGICAS PARA LA DETECCIN DE ANTICUERPOS CONTRA Trypanosoma cruzi Las tcnicas ms empleadas en nuestro medio son: Hemaglutinacin indirecta (HAI). Inmunofluorescencia indirecta (IFI). Tcnicas inmunoenzimticas: ELISA.
Son de mayor aplicacin durante la forma clnica crnica-portador cuando la parasitemia en el torrente sanguneo es baja o nula y las tcnicas directas no pueden evidenciar la presencia del parsito. Detectan anticuerpos a partir de la segunda o tercera semana de iniciada la infeccin. Las tcnicas inmunolgicas, adems de aplicarse en el dignstico individual de la enfermedad, son de utilidad en la seleccin de donantes de sangre, los estudios de prevalencia de anticuerpos especficos en poblaciones para conocer la epidemiologa de la enfermedad y la evaluacin del impacto de las medidas de control. En la actualidad se estn ensayando fracciones antignicas del parsito que permitirn la interpretacin del estadio clnico del paciente. As mismo, tcnicas inmunocromatogrficas basadas en protenas recombinantes o pptidos sintticos para un diagnstico rpido de la infeccin (18). Los mtodos son seleccionados dependiendo de la forma clnica por investigar (Figura 9).
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ALGORITMO PARA EL DIAGNSTICO DE LABORATORIO Y SU SEGUIMIENTO
ANTECEDENTE EPIDEMIOLGICO TRANSMISIN VECTORIAL TRANSFUSIN SANGUNEA TRANSMISIN CONGNITA TRANSPLANTE DE RGANOS NO INFECCIN POCO PROBABLE
SINTOMTICO
ASINTOMTICO ( PORTADOR) SOSPECHA
FORMA AGUDA : BSQUEDA DE TRYPANOSOMAS EN SANGRE MTODOS PARASITOLGICOS : EXAMEN EN FRESCO, GOTA GRUESA CONCENTRACIN DE STROUT MICROCONCENTRACIN HEMOCULTIVO , XENODIAGNSTICO, PCR
NEGATIVO
FORMA CRNICA: DETECCIN DE ANTICUERPOS EN SUERO MTODOS SEROLGICOS: HEMAGLUTINACIN INDIRECTA INMUNOFLUORESCENCIA INDIRECTA ENSAYO INMUNOENZIMTICO ELISA OTROS
NEGATIVO
DIAGNSTICO IMPROBABLE
POSITIVO EN DOS PRUEBAS
XENODIAGNSTICO PCR
NEGATIVO
SEGUIMIENTO CLNICO
POSITIVO
POSITIVO
DIAGNSTICO CONFIRMADO
Figura 8
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MANUAL
TCNICAS DE DIAGNSTICO
FORMAS CLNICAS DE LA ENFERMEDAD DE CHAGAS AGUDA CRNICA PORTADOR CONGNITA
GOTA FRESCA
+
++ +++ +++ +++ +++
++++
+/+ ++ +++
+ ++ +++ +++ +++ +++ ++++

IgG +: Ac de la madre IgM +: Ac del recin nacido hasta los seis meses
GOTA GRUESA
MICROCONCENTRACIN CONCENTRACIN DE STROUT HEMOCULTIVO XENODIAGNSTICO
PCR
PRUEBAS SEROLGICAS (HAI, ELISA, IFI)
- Al inicio +++ Despus de 20 das
+/+
Ac
: No til
: :
Utilidad relativa Util : Anticuerpos
Figura 9. Utilidad de las tcnicas de diagnstico en las formas clnicas.
2.3. DIAGNSTICO DE LABORATORIO EN LA RED NACIONAL Los laboratorios de la red pueden realizar la diferentes tcnicas segn sus posibilidades (figura 10). 2.3.1. DIAGNSTICO SEROLGICO. Para el diagnstico de laboratorio de la infeccin chagsica, con mayor frecuencia, se aplican las tcnicas que detectan anticuerpos especficos contra el parsito ya que tienen la capacidad de evidenciarlos a partir de la tercera semana de ocurrida la infeccin (figura 11). Siguiendo las recomendaciones de la Organizacin Panamericana de la Salud, que considera necesaria la deteccin de anticuerpos anti T. cruzi con por lo menos dos tcnicas de principio diferente, empleamos las tcnicas de ELISA e IFI, la primera altamente sensible para el tamizaje de la infeccin y la segunda de elevada especificidad que complemente y ratifique el resultado reactivo obtenido en el tamizaje. En conjunto ambas pruebas alcanzan el 95-98% de sensibilidad y especificidad.
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RED NACIONAL DE LABORATORIOS DE SALUD PBLICA ACTIVIDADES POR NIVELES
LABORATORIO DE REFERENCIA NACIONAL
COMPONENTE PARASITOLGICO MICROCONCENTRACIN , CONCENTRACIN DE STROUT, HEMOCULTIVO HAI, ELISA, IFI , INMUNOBLOT CARACTERIZACIN BIOLGICA Y MOLECULAR DE T. cruzi DESARROLO DE TCNICAS BIOMOLECULARES: PCR COMPONENTE ENTOMOLGICO XENODIAGNSTICO CONFIRMACIN TAXONMICA DE LOS VECTORES INVESTIGACIN DE INFECCIN NATURAL DE TRIATOMINOS SUSCEPTIBILIDAD DE LOS TRIATOMINOS A LOS INSECTICIDAS TCNICAS ALTERNATIVAS DE CONTROL VECTORIAL ESTUDIOS MORFOMTRICOS Y DE VARIABILIDAD GENTICA
INFORMACIN Y MUESTRAS
CAPACITACIN
CONTROL DE CALIDAD
LABORATORIO DE REFERENCIA REGIONAL
ENVIO
COMPONENTE ENTOMOLGICO IDENTIFICACIN TAXONMICA, INVESTIGACIN DE INFECCIN NATURAL DEL TRIATOMINO DETERMINACIN DE LA DENSIDAD POBLACIONAL DEL VECTOR E NDICE TRIPANO - TRIATMINICO
CAPACITACIN
CONTROL DE CALIDAD
LABORATORIO DE NIVEL LOCAL
EXAMEN DE GOTA FRESCA , GOTA GRUESA FROTIS CONCENTRACIN DE STROUT , MICROCONCENTRACIN OBTENCIN DE MUESTRAS PARA EL DIAGNSTICO SEROLGICO RECONOCIMIENTO DEL HBITAT Y CAPTURA DE TRIATOMINOS
Figura 10. Fluxograma de estudio de la enfermedad de Chagas en la red
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ENVIO
EXAMEN DE GOTA FRESCA , GOTA GRUESA - FROTIS CONCENTRACIN DE STROUT , MICROCONCENTRACIN HEMOCULTIVO HAI, ELISA, IFI
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RESULTADOS
MANUAL
FLUXOGRAMA PARA EL DIAGNSTICO SEROLGICO DE LA ENFERMEDAD DE CHAGAS EN LA RED

LABORATORIO REFERENCIA REGIONAL LABORATORIO REFERENCIA NACIONAL
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ELISA (Tamizaje) ELISA e IFI
LABORATORIO LOCAL
OBTIENE MUESTRA SANGRE
Resultado Resultados
REPORTA NO REACTIVO
-y+
Discordante
+y+
REGISTRA INFORMACIN
REPORTA REACTIVO
+yREPORTA NO REACTIVO
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IFI
Resultado
OTRA PRUEBA (HAI o IB)
SEPARA EL SUERO O PLASMA
Enva muestra
Resultado
Enva muestra
+
REPORTA REACTIVO
+
REPORTA REACTIVO
- : No reactivo +: Reactivo + y +: Reactivo en ELISA y reactivo en IFI + y -: Reactivo en ELISA y no reactivo en IFI
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Figura 11. Las muestras con resultado indeterminado, se vuelve a examinar. Si persiste el resultado se solicita y se examina una nueva muestra.
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FLUXOGRAMA PARA EL DIAGNSTICO E INVESTIGACIN DE LA FORMA CLNICA AGUDA EN LA RED

LABORATORIO LOCAL
OBTENCIN DE MUESTRA DE SANGRE (Persona con sospecha clnica o epidemiolgica )
LABORATORIO REFERENCIA REGIONAL

DIAGNSTICO SEROLGICO
LABORATORIO REFERENCIA NACIONAL
HEMOCULTIVO GOTA GRUESA MICROCONCENTRACIN CONCENTRACIN STROUT
BIOLGICA Y MOLECULAR DE TRYPANOSOMAS
NO SE CONFIRMA EL CASO
Resultado
Resultado
+
Enva cultivo
Una prueba +
CASO CONFIRMADO
Enva muestra de sangre (5mL)
AISLAMIENTO DEL PARSITO
Figura 12. El resultado positivo en la gota gruesa o microconcentracin, confirma la infeccin, pero el resultado negativo no asegura que est libre libre de ella; en este ltimo caso, se examina una nueva muestra y simultneamente se investiga la presencia de anticuerpos (IgG) anti Trypanosoma cruzi.
2.3.2. DIAGNSTICO E INVESTIGACIN DE LA FORMA CLNICA CONGNITA En el recin nacido, hijo de la gestante chagsica, proceder a examinar simultneamente la presencia del parsito por las tcnicas de microconcentracin o PCR y el nivel basal de anticuerpos (IgG) anti Trypanosoma cruzi por ELISA e IFI (Figura 13). Antes de los seis meses, no es posible distinguir si los anticuerpos (IgG) especficos detectados son propios o adquiridos va transplacentaria de la madre por lo que es de importancia realizar el seguimiento de la evolucin del ttulo serolgico al tercer mes, a los seis meses y al ao de vida. Si el examen parasitolgico en el recin nacido resulta negativo, la elevacin o mantenimiento del ttulo de anticuerpos con relacin al nivel basal certificara la infeccin, y, por el contrario, si este disminuye la descartara. Por otro lado, si el examen parasitolgico en el recin nacido resulta positivo, el ttulo de anticuerpos permitir monitorizar el tratamiento. La deteccin de anticuerpos IgM como respuesta de infeccin temprana tiene baja sensibilidad.
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MANUAL
GESTANTE CHAGSICA
RECIN NACIDO
Bsqueda del parsito

MICROCONCENTRACIN PCR
Basal de Ac IgG
ELISA e IFI
Titulacin de suero
+
DIAGNSTICO CONFIRMADO (Tratamiento)
Control serolgico a los 3, 6 y 9 meses
ELISA e IFI
Titulacin de suero
IgG < Basal Resultado IgG > Basal DIAGNSTICO CONFIRMADO (Tratamiento)
NO CONFIRMA EL CASO
Figura 13. Se considera gestante chagsica cuando presenta serologa reactiva en dos tcnicas de principios diferente o cuando es positiva a alguna de las tcnicas que demuestren la presencia del parsito.
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MANUAL DE
CAPTULO III
OBTENCIN DE MUESTRA SANGUNEA

En el diagnstico de la enfermedad de Chagas, empleamos: Sangre capilar para el examen directo en fresco, gota gruesa, frotis y microconcentracin. Sangre venosa total para el examen por concentracin de Strout y el hemocultivo (aislamiento e identificacin del parsito). Suero sanguneo para deteccin por HAI, ELISA, IFI.
Antes de iniciar el procedimiento de obtencin de la muestra de sangre: a) Completar el formato de solicitud de diagnstico de laboratorio (anexo 5). b) Colocar sobre la mesa de trabajo el material necesario para obtener la muestra. c) Lavarse las manos y colocarse los guantes.
d) Rotular el tubo donde se colectar la muestra con los siguientes datos: nombre, cdigo y la fecha de obtencin de la muestra. 3.1. OBTENCIN DE SANGRE CAPILAR 3.1.1. Materiales Guantes. Algodn. Alcohol. Lancetas estriles descartables. Lminas portaobjetos (examen en fresco, gota gruesa, frotis). Laminillas cubreobjetos. Capilares heparinizados (microconcetracin). Plastilina. Depsito para descarte de lancetas. Leja al 3-5%. Plumn indeleble.
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3.1.2. Procedimiento a) Sostener la mano izquierda del paciente con la palma hacia abajo y seleccionar el dedo medio, hacer que el paciente extienda y flexione los dems (en nios pequeos usar el dedo pulgar del pie o taln). b) Limpiar el dedo con una torunda de algodn ligeramente humedecida en alcohol para desinfectar, retirar la suciedad y la grasa de la yema del dedo. c) Pinchar directamente la yema del dedo con una lanceta estril. Hacerlo con un movimiento rpido.
d) Desechar la primera gota de sangre, limpiando el dedo con una torunda seca de algodn. e) Colectar gotas de sangre para la gota gruesa, frotis y examen en fresco en lminas portaobjetos. f) Colecta en tubos capilares heparinizados para microconcentracin: acercar el capilar al lugar de la puntura en posicin horizontal y dejar que la sangre ingrese por capilaridad y llene el tubo. Sellar con plastilina uno de los extremos del capilar y mantenerlo en posicin vertical hasta su procesamiento, que deber ser inmediantamente o dentro de las tres horas posteriores para asegurar el rendimiento de la prueba. Obtener la muestra de sangre en tres o cuatro capilares heparinizados. Para rotular los capilares se recomienda sujetarlos con cinta adhesiva a una lmina portaobjeto o cartn, que servir como soporte y brindar espacio para anotar el nombre, procedencia y fecha.
3.2. OBTENCIN DE SANGRE VENOSA La muestra sangunea se puede obtener mediante el empleo de jeringa descartable o tubos al vaco. Se recomienda su uso de vacutainers para conservar la esterilidad de la muestra y por medidas de seguridad.
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3.2.1. Materiales Jeringas y agujas descartables 21 1/2 G Tubos de ensayo o tubos al vaco sin anticoagulante (serologa). Tubos de ensayo o tubos al vaco con /EDTA (hemocultivo). Ligadura de jebe 2,5 mm de dimetro. Algodn. Alcohol. Guantes. Leja al 3-5%. Depsito de metal o vidrio para descarte de agujas y jeringas. Plumn indeleble.
3.2.2. Procedimiento a) Solicitar al paciente que se siente y coloque el brazo sobre la mesa de trabajo, con la palma de la mano hacia arriba. b) Colocar la ligadura dos dedos por encima de la flexin del codo, ajustarla lo suficiente para aminorar la corriente sangunea y dilatar las venas, sin apretarla tanto, de modo que reduzca el paso de sangre por las arterias. c) Pedir al paciente que abra y cierre la mano varias veces, para favorecer la dilatacin de las venas.
d) Con el dedo ndice de la mano izquierda palpe la vena en la que introducir la aguja. e) Desinfectar la zona de la piel donde se realizar la puncin con un pedazo de algodn embebido en alcohol.
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f)
Introducir la aguja insertada en el tubo al vaco en el centro de la vena (1 a 1,5 cm aproximadamente) y extraiga la sangre.
g) Si usa jeringa: Aplique una porcin seca de algodn sobre la parte donde se encuentra oculta la punta de la aguja. Retirar la aguja con movimiento rpido por debajo de la pieza de algodn. h) Si usa tubo al vaco:Retirar el tubo primero,y luego proceder a sacar la aguja con movimiento rpido por debajo de la torunda de algodn. I) Si la muestra no va a ser sembrada inmediatamente despus de la extraccin, conservarla en refrigeracin (4-8 C). Si no se cuenta con los materiales y condiciones de esterilidad adecuadas, trasladarla inmediatamente al laboratorio de referencia regional de su jurisdiccin (figura 10).
3.3. OBTENCIN DE SUERO SANGUNEO Una vez extrada la sangre, ya sea con jeringa descartable o tubo al vaco sin anticoagulante: a) Dejarla en posicin vertical aproximadamente 30 minutos a temperatura ambiente para que la sangre coagule. b) Centrifugar la muestra a 2000-2500 rpm por 15 minutos. c) Separe el suero y depostelo en un frasco o vial estril con tapa.
d) Rotular el vial con los siguientes datos: Nombre/Cdigo. Fecha de obtencin de la muestra. e) Conservar el suero hasta el momento de uso de la siguiente manera: En refrigeracin (4-8 C) hasta cinco das. En congelacin (-20 C) ms de cinco das. 3.4. REGISTRO DE MUESTRAS Los datos de las fichas de diagnstico deben registrarse en el cuaderno de laboratorio o base de datos.
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CAPTULO IV
EXAMEN DE SANGRE: FRESCO, GOTA GRUESA, FROTIS

4.1. EXAMEN DE SANGRE EN FRESCO Consiste en examinar directamente con el microscopio una gota de sangre de la persona con sospecha de infeccin. Es la prueba ms sencilla, rpida y econmica que permite demostrar la presencia del parsito en la forma aguda o congnita de la enfermedad de Chagas. El rendimiento del examen es bueno,y la prueba es til cuando la parasitemia es elevada. 4.1.1. Materiales Guantes. Lanceta estril. Algodn. Alcohol corriente. Lminas portaobjetos limpias y desengrasadas. Laminillas cubreobjetos. Cmara hmeda (Anexo 1).
4.1.2. Procedimiento a) Rotular tres lminas portaobjetos. b) Obtener la muestra de sangre capilar en lmina, segn 3.1. c) Colocar una gota de sangre sobre cada lmina portaobjeto rotulada.
d) Cubrir la muestra con una laminilla. e) Conservar las preparaciones en cmara hmeda hasta su lectura. 4.1.3. Lectura Observar al microscopio con objetivo de 10X y 40X reduciendo la abertura del condensador. Buscar formas mviles (trypomastigotes) del parsito. Si
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el resultado es negativo repetir el examen interdiario por lo menos durante una semana. Algunas veces no se puede observar al parsito, sin embargo el movimiento de los glbulos rojos indica su presencia, por lo que se recomienda hacer lminas con gota gruesa y frotis en forma simultnea y colorear con Giemsa para la confirmacin.
4.2. GOTA GRUESA La gota gruesa consiste en concentrar y defibrinar la gota de sangre de la muestra, la que posteriormente ser deshemoglobinizada y teida con Giemsa durante 30 minutos. 4.2.1. Procedimiento Obtener la muestra de acuerdo con lo indicado en 4.1 a) Colocar una gota de sangre sobre la superficie limpia de una lmina portaobjetos. b) Empleando la esquina de otra lmina, realizamos movimientos circulares, desde el centro de la gota, de modo que la sangre se distribuya uniformemente (en un rea de 1cm2). c) Dejar secar a temperatura ambiente.
d) Colorear con Giemsa. 4.2.2. Coloracin Giemsa 4.2.2.1. Materiales Solucin Giemsa stock (Anexo 1). Solucin amortiguadora (Anexo 1). Probeta 10 mL. Varilla de coloracin.
4.2.2.2. Procedimiento a) Colocar las lminas sobre la varilla de coloracin. b) Preparar el volumen necesario de solucin Giemsa diluida, aproximadamente 2 mL por lmina.
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En la probeta colocar 0,1 mL (2 gotas) de solucin Giemsa stock por cada mL de solucin amortiguadora. Homogeneizar la solucin colorante. c) Cubrir la muestra con la solucin Giemsa diluida, (figura 14).
d) Dejar actuar el colorante durante 30 minutos. e) Lavar con agua corriente y dejar secar a temperatura ambiente.
Figura 14. La coloracin Giemsa, facilita la identificacin del parsito en base a sus caractersticas morfolgicas tintoriales.
4.3. FROTIS El frotis es el extendido de una gota de sangre en una lmina portaobjetos seguida de la fijacin de la muestra y posterior tincin con Giemsa (Figura 15). 4.3.1. Procedimiento Obtener la muestra de acuerdo con lo descrito en el tem 3.1. a) Colocar una gota de sangre en el extremo de la superficie de una lmina portaobjetos limpia. b) Acercar a la muestra el borde de otra lmina portaobjetos, posesionndola de tal manera que formen un ngulo de 45 y dejar que la muestra se distribuya en el borde de la lmina. c) Conservando el ngulo de 45, deslizar la lmina auxiliar sobre la superficie de la lmina con la muestra. El extendido de sangre o frotis debe ser una pelcula fina.
d) Dejar secar a temperatura ambiente.
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e) Fijar la muestra con metanol absoluto P.A durante un minuto f) Colorear con Giemsa.
4.4. LECTURA DE LA GOTA GRUESA Y FROTIS Enfocar con el objetivo de 10X, luego, colocar una gotita de aceite de inmersin sobre la muestra y examinar con el objetivo de inmersin 100X. Examinar toda la lmina en el microscopio. Resultado Informar la presencia o ausencia de formas trypomastigotes de Trypanosoma cruzi.
Figura 15. Trypomastigote de Trypanosoma cruzi en preparaciones de frotis y gota gruesa de sangre circulante. Se observa el cinetoplasto posterior al ncleo central, la membrana ondulante y el flagelo.
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CAPTULO V
TCNICAS DE CONCENTRACIN
5.1. MICROCONCENTRACIN La tcnica consiste en concentrar los parsitos de una muestra de sangre colectada en tubos capilares heparinizados por centrifugacin. Los elementos de la sangre se separan por gradiente de densidad, concentrndose los glbulos rojos en la parte inferior del capilar, sobre ella se ubica un anillo blanquecino de 1 mm de altura conformado por los glbulos blancos y en la parte superior lquida transparente constituida por el plasma. Los tripanosomas presentes en la muestra se ubicarn entre los glbulos blancos y el plasma.
Figura 16. Separacin de los elementos sanguneos por gradiente de densidad.
5.1.1. Equipos y materiales Microscopio con objetivos de 10X y 40X. Microcentrfuga o centrfuga. Tubos capilares heparinizados. Lminas portaobjetos. Laminillas cubreobjetos.
5.1.2. Procedimiento a) Obtener la sangre en los capilares heparinizados segn tem 3.1.2. b) Centrifugar la muestra durante un minuto a 5000 rpm.
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c)
Sujetar el capilar a una lmina portaobjetos con cinta adhesiva (Figura 16) .
d) Conservar el capilar en forma vertical hasta el momento de la lectura.
5.1.3. Lectura Observar directamente en el microscopio la zona del plasma aproximadamente a 10 mm de los glbulos blancos. Focalizar inicialmente con el objetivo de 10X de aumento y luego buscar las formas trypomastigotes mviles del parsito con el objetivo de 40X (Figura 17).
Figura 17. Microconcentracin.
Tambin se puede realizar la lectura colocando la muestra entre la lmina y laminilla, para ello, con el borde de una lmina portaobjetos hacer una marca en la zona donde se ubican los parsitos y luego quebrar el capilar con cuidado. Dejar caer la muestra sobre un portaobjetos, cubrirla con una laminilla y observar el microscopio.
5.1.4. Resultado Positivo: Se observan formas flageladas mviles de trypomastigotes de Trypanosoma cruzi. Negativo: No se observan formas de trypomastigotes de Trypanosoma cruzi.
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5.2. CONCENTRACIN DE STROUT Esta tcnica se basa en la concentracin de los parsitos en la muestra sangunea por centrifugacin y examen del sedimento al microscopio en busca de trypomastigotes mviles de Trypanosoma cruzi. Es una tcnica simple y de buena sensibilidad en casos agudos de enfermedad de Chagas y en el seguimiento de congnitos. El suero se debe conservar para ser examinado por tcnicas inmunolgicas.
5.2.1. Equipos y materiales Microscopio. Centrfuga. Jeringa hipodrmicas estril o sistema de tubos al vaco sin anticoagulante. Tubos de ensayo de 13 x 100 mm. Tubos de centrfuga. Lminas portaobjetos. Laminillas cubreobjetos. Asas microbiolgicas.
5.2.2. Procedimiento a) Extraer 5-10 mL de sangre venosa en un tubo sin anticoagulante, segn tem 3.3. b) Dejar a temperatura ambiente hasta que se coagule. c) Separar el suero.
d) Centrifugar este suero a 160g (800 rpm) durante dos minutos para descartar los glbulos rojos. e) Centrifugar nuevamente el sobrenadante a 300-600 g (2000-2500 rpm), durante diez minutos. f) Separar el sobrenadante (suero) y conservarlo a 4 C para el anlisis serolgico.
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g) Colocar una alcuota del sedimento obtenido en una lmina portaobjetos. h) Cubrir la muestra con una laminilla y proceder a la lectura.
5.2.3. Lectura Observar en el microscopio la presencia de trypomastigotes mviles de Trypanosoma cruzi, con objetivos de 10X 40X de aumento. Es aconsejable observar cuidadosamente varias preparaciones en busca de formas mviles del parsito.
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CAPTULO VI
HEMOCULTIVO
Consiste en sembrar una muestra de sangre en medio de cultivo artificial o celular, con la finalidad de amplificar el nmero de parsitos presentes y confirmar el diagnstico. Presenta una sensibilidad alta en los casos agudos y congnitos. El cultivo en medio artificial es factible de realizar en cualquier laboratorio bacteriolgico, no as en medio celular que requiere de laboratorio mejor equipado. La limitacin de la prueba est en el prolongado tiempo de incubacin que se requiere (hasta dos meses) para emitir el informe del resultado. El cultivo en medio artificial requiere: 6.1. EQUIPO Estufa 28 30C. Centrfuga. Microscopio ptico 10x, 40x, 100x de aumento y ocular 10x. Cabina de flujo laminar o cubculo. Balanza. Refrigerador. Micropipeta 5 50 uL, 50 1000 uL.
6.2. MATERIALES Y REACTIVOS (Figura 18) Tubos al vaco heparinizados. Agujas para tubos al vaco. Portaobjetos. Cubreobjetos 22 x 22 mm. Gradillas para tubos de ensayo. Asa de siembra. Puntas amarillas y azules estriles. Tubos con medio de cultivo agar sangre (Anexo 1). Solucin salina estril (Anexo 1). Solucin de antibiticos (Anexo 1).
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Figura 18. Materiales y reactivos empleados en el hemocultivo.
6.3. MUESTRA. 5 mL de sangre de la vena del brazo obtenido en tubo heparinizado segn 4.2.
6.4. PROCEDIMIENTO (Figura 19) Trabajar en condiciones de esterilidad bajo la cabina de flujo laminar o en un cubculo con luz UV o mechero. a) Retirar los tubos conteniendo medio de cultivo del refrigerador. b) Rotularlos con un marcador tinta indeleble la fecha y cdigo de muestra. Cinco tubos por cada muestra. c) Adicionar la solucin salina estril (0,5 mL) a cada tubo. d) Sembrar 1 mL de la sangre heparinizada en cada tubo. e) Colocar los tubos en estufa graduada a 28 C. Agitarlos una vez al da. f) A los siete das revisar el cultivo. Con el asa de siembra extraer una gota del cultivo, colocarla entre lmina y laminilla y observar al microscopio con objetivo de 10 X.
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HEMOCULTIVO
SANGRE OBTENCIN DE MUESTRA
CONCENTRACIN POR CENTRIFUGACIN 5 MIL rpm x 15minutos
CULTIVO
28 C
LECTURA 7 DA
EN FRESCO Observacin al microscopio 10 x 40 x Formas mviles del parsito
15 DA
COLORACIN GIEMSA Formas tpicas, con citoplasma, azul claro, ncleo y cinetoplasto de color azul violeta SUBCULTIVO CADA 15 DIAS
28 C
LECTURA FINAL 60 DA
EN FRESCO Observacin al microscopio 10 x 40 x Formas mviles del parsito
COLORACIN GIEMSA Formas tpicas, con citoplasma, azul claro, ncleo y cinetoplasto de color azul violeta
Figura 19. Pasos para el hemocultivo.
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6.5. LECTURA a) El movimiento caracterstico de los epimastigotes (figuras 20 y 21) permite detectarlos con facilidad, sin embargo, es necesario colorearlos para confirmar su morfologa. b) Realizar un extendido con el asa de siembra, luego fijar con metanol durante tres minutos y colorear con Giemsa. c) Observar en el microscopio la forma tpica, el ncleo de color azul violeta y el cinetoplasto ms denso y oscuro. Se les visualiza aislados o agrupados a manera de rosetas. d) Si no se observan formas mviles continuar la incubacin a 28 C y repetir la lectura a los siete das. e) Cada 15 das repicar 0,5 mL de los cultivos negativos en medio fresco. (resiembra a ciegas). f) El tiempo que se requiere para demostrar la positividad del cultivo, depende de la densidad parasitaria de la muestra sembrada y de la adaptabilidad del parsito al medio. Generalmente esto ocurre despus de uno a dos meses. g) Antes de realizar la lectura final, centrifugar el sobrenadante del cultivo y observar en el sedimento, la presencia o ausencia del parsito.
Figura 20. Observacin directa de epimastigotes de Trypanosoma cruzi en alcuota de cultivo positivo. Se caracterizan por ser de aspecto fusiforme y presentar movimiento ondulante (1000X).
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Figura 16. Epimastigote de Trypanosoma cruzi en medio de cultivo. Giemsa 1000 X.
6.6. RESULTADO Cultivo positivo: Se observa la presencia de epimastigotes de Trypanosoma cruzi. Cultivo negativo: No se observa la presencia de epimastigotes de Trypanosoma. cruzi.
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CAPTULO VII XENODIAGNSTICO

Es una tcnica que permite la multiplicacin del parsito in vivo y consiste en hacer picar a la persona sospechosa de infeccin por el vector libre de infeccin, de preferencia la especie de triatomino de mayor importancia en la regin. Es aplicable tanto en la forma clnica aguda como en la crnica portador.
7.1. Equipos Microscopio con objetivo de 20X de aumento.
7.2. Material biolgico Ninfas de III o IV estadio de triatominos que proceden de criaderos en laboratorio.
7.3. Materiales Cajas de madera o plstico apropiadas (Figura 22). Tul. Bandas elsticas. Sujetadores de tela. Pollos para alimentacin de triatominos. Pinzas punta fina. Lminas portaobjetos. Laminillas cubreobjetos.
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Figura 22. Caja para xenodiagnstico.
7.4. Procedimiento a) Colocar en cada caja de cinco a diez ninfas de triatominos del III y IV estadio, los que deben estar en ayuno por lo menos 15 das. b) Cubrir la caja con tul, asegurndolo con una banda elstica. c) Rotular la caja con el nmero de muestra, nombre y fecha de aplicacin.
d) Sujetar la caja sobre el brazo del sospechoso de infeccin mediante una venda de tela, permitiendo que los triatominos se alimenten por 20 minutos o hasta observar que las ninfas hayan aumentado su volumen por la sangre ingerida (Figura 23). e) Conservar la caja con los triatominos a temperatura del laboratorio 25-30 C y 70% de humedad relativa. f) Alimentarlos cada 15 das, sujetando las cajas con las ninfas sobre la piel desnuda de un ave (pollo, paloma u otro).
g) A los 30 das, examinar en el microscopio una muestra de heces de los triatominos. Obtener la muestra sobre una lmina portaobjetos por presin del abdomen del insecto con una pinza. h) Cubrir la muestra con una laminilla para examinarla en el microscopio. Se puede realizar el examen individual de cada triatomino o una alcuota del pool de las muestras fecales. i) De ser negativo, examinar otra alcuota del contenido digestivo del triatomino a los 60 das.
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Se aconseja la aplicacin de por lo menos cuatro xenodiagnsticos para alcanzar su mayor sensibilidad en los casos de infeccin crnica o portador.
Figura 23. Aplicacin del xenodiagnstico.
7.5. Lectura Examinar la muestra en el microscopio (objetivo de 20X de aumento), buscando formas mviles: epimastigotes o trypomastigotes metacclicas del parsito que son identificadas por el movimiento ondulante caracterstico (Figura 24).
Figura 24.
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7.6. Resultado Xenodiagnstico positivo: Se observan formas trypomastigotes o epimastigotes de Trypanosoma cruzi. Xenodiagnstico negativo: No se observan tripanosomas o epimastigotes. De ser la prueba positiva, se puede realizar el aislamiento del parsito sembrando la muestra en medios de cultivo o inoculando experimentalmente en ratones (anexo 2) para posteriores estudios de caracterizacin e identificacin.
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CAPTULO VIII
HEMAGLUTINACIN INDIRECTA (HAI)

La hemaglutinacin indirecta emplea glbulos rojos de carnero, previamente tratados con cido tnico, como soporte de extractos solubles del parsito (antgeno). Es una prueba altamente sensible y especfica. En la figura 17 se muestra un diagrama de la prueba. Los kits comerciales simplifican la ejecucin de la tcnica, proporcionando el antgeno absorbido a los glbulos rojos.
8.1. MATERIALES Y REACTIVOS Placas de poliestireno con fondo en U. Micropipeta de 5 a 50 L. Micropipeta multicanal de 5 a 50 . Puntas para micropipeta. Solucin Alsever (Anexo 1). Sangre de carnero. Suero fisiolgico (Anexo 1). Buffer fosfato salino pH 7,2 (Anexo 1). Buffer fosfato salino pH 6,4 (Anexo 1). cido tnico (Anexo 1). Solucin diluyente (Anexo 1). Suero control positivo a Trypanosoma cruzi. Suero control negativo a Trypanosoma cruzi. Antgeno de Trypanosoma cruzi (Anexo 3).
8.2. MUESTRA: Suero problema.
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8.3. SUSPENSIN DE GLBULOS ROJOS a) Obtener sangre estril de carnero mediante puncin de la vena yugular en un recipiente tambin estril que contiene igual volumen de Alsever. b) Lavar los glbulos rojos por tres veces con suero fisiolgico, centrifugando a 3000 rpm durante diez minutos. c) Preparar una suspensin de glbulos rojos al 2,8% buffer fosfato pH 7,2. Ej: para preparar 5 mL de suspensin de glbulos rojos, tomar 0,14 mL del sedimento de glbulos rojos y resuspenderlo en 4,86 mL de buffer fosfato pH 7,2.
8.4. ADSORCIN DE ANTICUERPOS HETERFILOS a) A 0,1 mL de suspensin de glbulos rojos, adicionar 0,5 mL del suero problema. b) Incubar 30 minutos a 37 C (bao Mara). c) Mantener durante dos horas a 4C.
d) Centrifugar por diez minutos a 2000 rpm Separar el suero absorbido de los glbulos rojos. 8.5. TANIZACIN DE LOS GLBULOS ROJOS a) Mezclar 5 mL de suspensin de glbulos rojos con 5 mL de cido tnico diluido 1/20 000 e incubar por 10 minutos a 37 C. b) Centrifugar durante siete minutos a 2000 rpm. c) Descartar el sobrenadante.
d) Resuspender el sedimento en 10 mL de buffer fosfato pH 7,2. e) Centrifugar durante siete minutos a 2000 rpm. f) Descartar el sobrenadante.
g) Resuspender el sedimiento en 5 mL de solucin salina. 8.6. SENSIBILIZACIN a) Tubo N. 1: Colocar 5 mL de Antgeno (diluido 1/20 en buffer fosfato pH 6,4). Adicionar 5 mL de suspensin de glbulos rojos tanados. Tubo N. 2 (Control): Colocar 5 mL de buffer pH 6,4. Adicionar 5 mL de suspensin de glbulos rojos tanados.
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b) Incubar los tubos durante 20 minutos a 37 C. c) Centrifugar por siete minutos a 2000 rpm.
d) Eliminar el sobrenadante. e) Lavar el sedimento con 10 mL de solucin diluyente. f) Centrifugar por siete minutos a 2000 rpm.
g) Descartar el sobrenadante. h) Resuspender el sedimento en 5 mL de solucin diluyente.
HEMAGLUTINACIN INDIRECTA
TANIZACIN
+
HEMATES
CIDO TNICO
HEMATES TANADOS
SENSIBILIZACIN
+
HEMATES TANADOS ANTGENO DE T. cruzi HEMATES SENSIBILIZADOS
DESAROLLO DE LA PRUEBA
+
HEMATES SENSIBILIZADOS ANTICUERPOS ESPECFICOS HEMAGLUTINACIN
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8.7. PROCEDIMIENTO DE LA PRUEBA a) Rotular una placa de microtitulacin para realizar diluciones de los sueros a evaluar al doble, incluyendo los sueros controles positivo y negativo. Iniciar en la dilucin hasta 1/512. Seguir el esquema adjunto (Figura 26). b) Se recomienda colocar la placa de microtitulacin sobre un papel, toalla o franela humedecida para prevenir el efecto de la electricidad esttica. c) Colocar en los pozos de la fila A, 75 uL de la solucin diluyente y 50 uL en los pozos de las filas B, C, D, E, F, G y H.
d) Agregar a cada pozo de la fila A, 25 uL del suero a evaluar, homogeneizar aspirando y expeliendo varias veces con la pipeta. e) Luego realizar diluciones sucesivas al doble. Con la ayuda de una micropipeta multicanal tomar 50 uL de la dilucin de cada suero por evaluar y verterlo en los pozos de la fila siguiente, homogeneizar y repetir igual con la siguiente fila. f) Agregar 50 uL de la suspensin antignica en cada pocillo.
g) Agitar con suaves golpes en los bordes de la placa. h) Dejar la placa en reposo sobre una superficie plana. i) Realizar la lectura despus de una hora y a las 24 horas.
Cuando se evalan muchos sueros (Figura 27) es apropiado, primero, realizar el tamizaje con la dilucin de valor diagnstico (). De esta manera, seleccionar los positivos y, en un segundo ensayo, proceder a titularlos realizando las diluciones correspondientes. 8.8. LECTURA (Figuras 26 y 27). La falta de reactividad (negativo), se manifiesta por la sedimentacin del antgeno en forma de botn. La reactividad del suero (positivo), se manifiesta por la formacin de una malla de bordes irregulares que cubre al 50-100% del fondo del pocillo. Se considera positiva la muestra a partir de la dilucin y se informa con el ttulo de la ltima dilucin positiva.
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8.9. RESULTADO Reactiva: Se detecta la presencia de anticuerpos contra Trypanosoma cruzi. Ttulo: segn lectura.
No reactiva: Ausencia de anticuerpos contra Trypanosoma cruzi.
DILUSIN DEL SUERO
Figura 26
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Tamizaje de sueros en la dilucin de valor diagnstico 1/4
CP: SUERO CONTROL POSITIVO A T. cruzi CN: SUERO CONTROL NEGATIVO A T. cruzi CGR: CONTROL DE GLBULOS ROJOS
En esta placa los pozos D4, G12 y H12 corresponden a sueros reactivos (positivos)
Figura 27
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CAPTULO IX
ELISA
La tcnica ELISA emplea antgenos solubles de Tripanosoma cruzi, adheridos a soportes inertes (placa de microtitulacin) y antiglobulinas humanas conjugadas con enzimas, como detectores de la reaccin antgenoanticuerpo (Figura 28). Es un mtodo de gran sensibilidad, pero cuya especialidad est sujeta a la calidad de los antgenos y reactivos empleados por lo que exigen una rigurosa estandarizacin. Los kits comerciales contienen las placas con antgeno y reactivos. La reaccin suele hacerse positiva despus de 20 das de infeccin. 9.1. EQUIPOS E INSTRUMENTOS Estufa de incubacin 37 C. Reloj. Balanza de precisin. Refrigeradora. Lector ELISA. Lavador de placas ELISA. Micropipeta de 0,5 a 10 L y 10 a 100 L. Micropipeta multicanal de 50-200 L. Potencimetro.
9.2. MATERIALES Y REACTIVOS Placas con fondo plano, sensibilizadas con antgeno de Trypanosoma cruzi (ver anexo 3). Antigammaglobulina G humana conjugada con peroxidasa (titulado). Suero control positivo a Trypanosoma cruzi. Suero control negativo a Trypanosoma cruzi. Suero control interno. Perxido de hidrgeno 30%. Buffer fosfato salino (PBS) pH 7,2 (Anexo 1). Buffer de lavado. PBS pH 7,2 - Tween 20 al 0,05% (Anexo 1).
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Solucin de bloqueo (PBS pH 7,2 - BSA 3%) (Anexo 1). Solucin diluyente (PBS pH 7,2 - BSA 1%) (Anexo 1). Solucin estabilizadora para el sustrato. Cromgeno: Orto-phenilendiamina (OPD). cido sulfrico 2,5 M.
ELISA
MTODO INDIRECTO PARA LA DETECCIN Y MEDICIN DE ANTICUERPOS ANTI Trypanosoma cruzi
Figura 28
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9.3. PROCEDIMIENTO (Figura 28). 9.3.1. Retirar del refrigerador la placa sensibilizada con el antgeno y dejar que tome la temperatura ambiente. Lavar los pozos adicionando a cada uno de ellos 300 L de PBS Tween 0,05%. Repetir el lavado por tres veces. En el ltimo lavado eliminar por completo el lquido residual, invirtiendo la placa sobre papel absorbente (aplicar golpes firmes). 9.3.2. Bloqueo de sitios inespecficos mediante la adicin de 100 L de PBS - BSA 3% en cada pozo. Dejar una hora a temperatura ambiente. Lavar al igual que en 9.3.1. 9.3.3. Incubacin de los sueros: Rotular la placa de acuerdo con el esquema de distribucin de suero (Figura 29). Se aconseja realizar duplicados. Incluir en cada ensayo dos controles positivos y tres controles negativos, un control interno y un blanco de reactivos. Colocar 100 L por pocillo, de las diluciones de los sueros (1/100). Mezclar aplicando suaves golpes en las paredes laterales de la placa. Incubar 30 minutos en estufa a 37 C, con la placa tapada para evitar la evaporacin. Retirar el lquido de los pozos con la ayuda de una micropipeta y descartar dicho lquido en un recipiente que contenga hipoclorito de sodio al 5%. Lavar los pozos al igual que en el punto 9.3.1. 9.3.4. Incubacin del conjugado: Colocar 100 L por pozo del conjugado preparado de acuerdo con el ttulo obtenido previamente. Incubar 30 minutos en estufa a 37 C. Lavar al igual que en 9.3.1. 9.3.5. Reaccin con el sustrato: Preparar minutos antes de su uso la solucin del sustrato ms cromgeno (OPD) ver anexo. Colocar 100 L en cada pozo. Dejar en oscuridad y a temperatura ambiente durante 15 minutos. Detener la reaccin adicionando 100 L de cido sulfrico 2,5 M, por pozo. 59
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9.4. REACTIVOS COMERCIALES (KITS) En caso de usar kits, seguir estrictamente las instrucciones del inserto contenido en la caja tanto en el procesamiento, como para determinar la validez del ensayo y calcular el valor de corte. 9.5. LECTURA Para que el examen tenga validez, los controles positivo, negativo y control interno deben reaccionar como tales, es decir que la absorbancia de cada uno de ellos corresponda al valor predeterminado. 9.5.1. Con lector de ELISA La presencia o ausencia de anticuerpos anti Tripanosoma cruzi se determina, relacionando la absorbancia de la muestra a 450 nm respecto al valor del corte. Se ha definido el valor del corte (VC) como el punto de cruce entre el promedio de las lecturas de los sueros controles no reactivos y reactivos ms dos desviaciones estndar (DS). VC = CN + 2 DS El valor de corte promedio encontrado en nuestro laboratorio es de 0,320 Reactivo: Muestras con absorbancias mayores de 0,384. No reactivo: Muestras con absorbancias menores de 0,256. Indeterminado: Se consideran as aquellas cuyas absorbancias caen entre 20% del valor de corte. Estas muestras deben ser ensayadas nuevamente, si el resultado persiste solicitar una nueva muestra luego de un mes, tiempo suficiente para que el nivel de anticuerpos sea mayor en caso de tratarse de una infeccin reciente. 9.5.2. Lectura visual: Si se opta por este mtodo de interpretacin debe considerarse: Reactiva: Muestra con coloracin netamente amarillo-naranja. Colores tenues mayores que el del control negativo, requieren la interpretacin instrumental. No reactiva: Toda muestra que no presente coloracin o que sta sea igual que la de los controles negativos. 9.5.3. Titulacin Para obtener el ttulo de las muestras reactivas en el tamizaje, se realiza diluciones dobles de los sueros a partir de 1/100 y se procede de acuerdo con el punto 9.3.
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9.6. INFORME E INTERPRETACIN DE RESULTADOS Reactivo: Se detecta anticuerpos (lgG) anti Trypanosoma cruzi. Ttulo: el ttulo de la muestra es la dilucin del suero en la que la absorbancia resulta mayor o igual que el valor de corte. No reactivo: No se detecta anticuerpos (lgG) anti Trypanosoma cruzi.
Figura 29
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CAPTULO X
INMUNOFLUORESCENCIA INDIRECTA (IFI)

La tcnica de inmunofluorescencia indirecta (IFI), emplea como antgeno epimastigotes de Trypanosoma, obtenidos de cultivo y fijados en lminas sobre las que se realiza la reaccin antgeno-anticuerpo. La formacin de este complejo es evidenciada por una antiglobulina humana marcada con fluorescena (Figura 30). Los kits comerciales proporcionan la lmina preparada y los reactivos. Prueba altamente sensible y especfica.
10.1. EQUIPO Microscopio para fluorescencia. Estufa graduada a 37 C. Balanza de presicin. Potencimetro. Reloj. Refrigerador. Secadora o ventilador.
10.2. MATERIALES Y REACTIVOS Placas para microtitulacin, fondo en U. Couplin o recipientes para lavado de lminas. Puntas de 10-100 L y de 0,5-10 L. Pizetas. Papel, toalla o secante. Laminillas cubreobjetos de 24 x 48 mm. Cmara hmeda.
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Solucin de azul de Evans. Suero control positivo a Trypanosoma cruzi. Suero control negativo a Trypanosoma cruzi. Lminas IFI impregnadas con Trypanosomas (Anexo 3). Conjugado Anti lgG humana - FITC, titulado (Anexo 1). Buffer fosfato salino pH 7,4 (Anexo 1). Glicerina tamponada pH 8,5 (Anexo1).
INMUNOFLUORESCENCIA INDIRECTA
PRIMERA ETAPA
+
ANTGENO DE TRYPANOSOMA ANTICUERPO COMPLEJO Ag-Ac
SEGUNDA ETAPA
COMPLEJO Ag-Ac
ANTIGLOBULINA MARCADA CON FLUORESCEINA
COMPLEJO Ag-Ac MARCADO
Figura 30
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10.3. PROCEDIMIENTO Elaborar el protocolo de trabajo en el fomato del anexo 9, asignar un casillero para cada suero por evaluar y anotar en l su cdigo.
En cada corrida se debe incluir el control positivo (CP), control negativo (CN), control interno para IFI (CI) y control de reactivos o blanco (B). a) Retirar del congelador las lminas IFI fijadas con Trypanosomas y dejarlas secar a temperatura ambiente o con la ayuda de un ventilador o secador. b) En una placa para microtitulacin, realizar la dilucin 1/32 de cada suero y de los controles. Para ello, dispensar en cada pozo 155 L de buffer diluyente y 5 L de cada suero por evaluar. c) Homogeneizar el suero diluido absorbiendo y expeliendo con la micropipeta varias veces, luego siguiendo el protocolo elaborado, dispensar 15 uL de la dilucin 1/32 de cada suero sobre el rea del crculo correspondiente en la lmina IFI. d) Colocar la lmina en una cmara hmeda y llevarla a incubar a la estufa 37 C durante 30 minutos. e) Retirar la lmina de la estufa y lavarla por tres veces consecutivas con PBS-Tween 80 al 1% de la siguiente manera: la primera vez con la ayuda de una pizeta retirar los sueros de la lmina, la segunda y tercera vez en un frasco Coplin mantenido en agitacin suave durante ocho minutos cada vez. f) Colocar la lmina sobre papel secante y dejar secar a temperatura ambiente o con la ayuda de un ventilador o secador.
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g) Agregar 15 uL del conjugado Anti IgG humano marcado con fluorescena (titulado), en cada rea circular e incubar a 37 C por 30 minutos. h) Retirar la lmina de la estufa y lavar al igual que en el tem e, despus del ltimo lavado, enjuagar con agua destilada y dejar secar al igual que en el tem f. i) Agregar 15 uL de la solucin diluida de azul de Evans en cada pocillo y dejar durante cinco minutos a temperatura ambiente. j) Enjuagar la lmina con agua destilada, empleando una pizeta. Luego, dejarla secar a temperatura ambiente. k) Colocar una gotita de glicerina tamponada y sobre ella una laminilla cubreobjetos l) Conservar la lmina en oscuridad hasta la lectura, se recomienda que sea el mismo da del procesamiento para evitar la prdida de fluorescencia.
10.4. LECTURA La lectura se realiza en microscopio para fluorescencia, con objetivo de 20X. Primero revisar los controles, en el control positivo debe observarse la superficie y el flagelo de los parsitos de un color verde manzana fluorescente. (Figura 31) y en el control negativo al igual que en el blanco de reactivos, debe observarse el parsito de color rojizo opaco, sin fluorescencia. Si los controles responden como tales, la corrida es vlida y se continua con la lectura de las muestras examinadas De acuerdo con la intensidad o ausencia de fluorescencia que muestran los trypanosomas se registran las lecturas como: REACTIVO (+). Cuando la superficie o los bordes de los parsitos fluorescen francamente de un color verde manzana. NO REACTIVO (-). Si los parsitos se observan opacos entre rojizos y marrones oscuros INDETERMINADO (I), se observa una dbil fluorescencia no homognea en los parsitos.
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Figura 31: Epimastigotes de T. cruzi en la prueba de Inmunofluorescencia Indirecta. a) Suero Reactivo, b) Suero No reactivo
10.5. INFORME E INTERPRETACIN DE DE RESULTADOS El ttulo de valor diagnstico en el laboratorio es 1/32 REACTIVO: Se detectan anticuerpos IgG anti Trypanosoma cruzi. NO REACTIVO: No se detectan anticuerpos IgG anti Trypanosoma cruzi. INDETERMINADO: No concluyente. Es necesario repetir el ensayo y de persistir el resultado se debe evaluar una nueva muestra, obtenida tres semanas despus de la primera, tiempo necesario para que el nivel de anticuerpos sea mayor y detectable en caso la infeccin sea reciente.
10.7. TITULACIN DE SUERO REACTIVO Realizar la titulacin del suero reactivo 1/32, de acuerdo con el esquema siguiente.
DILUCION 1 1/32 S6 2 1/64 3 1/128 4 1/256 5 1/512 6 1/ 1024
SUERO
S6
CN
CI
CP
10
11
12
CP: SUERO CONTROL POSITIVO A T. cruzi CN: SUERO CONTROL NEGATIVO A T. cruzi
CI: SUERO CONTROL INTERNO B: BLANCO (control de reactivos)
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Efectuar el procedimiento de la tcnica IFI evaluando cada suero en diluciones seriadas al doble a partir de 1/32 Se considera el ttulo a la mayor dilucin que presente franca fluorescencia en la superficie del parsito.
10.8. INVESTIGACIN DE ANTICUERPOS IgM Para investigar la presencia de anticuerpos IgM anti T. cruzi, se seguir el procedimiento descrito en 9.3, 9.4 y 9.5, seguir los mismos pasos, la diferencia est en el uso, en este caso, de conjugado anti IgM humano.
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CAPITULO XI
CONTROL DE CALIDAD
La evaluacin de la calidad del diagnstico de laboratorio o proceso de aplicacin de medidas de control de calidad interno y externo, permiten determinar la fiabilidad de los resultados que emite el laboratorio. CONTROL DE CALIDAD INTERNO El objetivo del control de calidad interno es asegurar que los procesos se ejecutan correctamente, desde que la muestra ingresa al laboratorio hasta la emisin de los resultados y que los equipos e instrumentos usados tengan ptimo desempeo. Una de las actividades del control de calidad interno en el diagnstico serolgico de la enfermedad de Chagas, consiste en la inclusin de un Suero Control Interno (CI), en el trabajo diario, adems de los habituales controles positivos y negativos. El CI es un suero caracterizado como reactivo dbil a la deteccin de anticuerpos (IgG), anti Trypanosoma cruzi, con ttulo conocido y cercano al valor de corte, es especfico para cada tcnica o kit y debe ser tratado al igual que las dems muestras por examinar. Permite monitorizar la calidad del procedimiento ya que su resultado refleja objetivamente las variaciones ocurridas en cada ensayo y facilita la toma de decisin oportuna para corregir fallas o errores. Las lecturas diarias de absorbancia del CI se anotan en la grfica de Levey Jennings y se analizan e interpretan de acuerdo con las reglas de Shewart (9). (Figura 32). Cuando la lectura de absorbancia del suero control interno cae fuera de los lmites permitidos (+/- 2 desviaciones estandar), se debe repetir el ensayo y si se reitera el resultado se proceder al anlisis para detectar las posibles causas de error. Recomendaciones generales Las muestras de suero por procesar no deben presentar hemlisis ni contaminacin (turbidez). Deben estar rotuladas con el cdigo y fecha de obtencin de muestra y ser conservadas en refrigeracin (4-8 C), hasta su procesamiento. 69
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DO/VC
Valores de Absorbancia / Valor de Corte
+ 3 ds
+ 2 ds
0,3
x
- 2 ds
- 3 ds
Ensayos
1 4 8 12 16 20
Figura 32. Grfico de Levey y Jennings. X : media ds: desviacin estndar
No usar reactivos o kits con fechas vencidas. Emplear equipos e instrumentos en ptimas condiciones, con mantenimiento y calibracin (balanza, potencimetro, lector ELISA, lavador de placas, microscopio para inmunofluorescencia, micropipetas). Seguir los instructivos de uso de cada equipo. Tener en cuenta la rutina bsica de mantenimiento requerido por cada equipo (8). Chequear los filtros del lector ELISA antes de iniciar los ensayos y llevar el registro de tiempo de uso de la lmpara del microscopio para inmunofluorescencia. Realizar el control diario de la temperatura ambiente del laboratorio y de los siguientes equipos: refrigerador donde se conservan los kits, estufa empleada para los pasos de incubacin 37 C y congeladora donde se conservan los sueros controles y otros reactivos. En el procesamiento de las muestras se debe seguir estrictamente las instrucciones descritas en el manual de procedimientos o en los insertos proporcionados por el fabricante de reactivos comerciales (kits), en uso. Incluir en cada ensayo el CI adems de los controles positivo, negativo, y blanco de reactivos propio de cada tcnica.
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Analizar la validez del ensayo considerando los parmetros establecidos en el kit y el resultado del control interno.
CONTROL DE CALIDAD EXTERNO O EVALUACIN EXTERNA DEL DESEMPEO La participacin en programas de evaluacin externa, permite evaluar el desempeo del laboratorio, esta actividad la desarrolla el Laboratorio de Referencia Nacional del Instituto Nacional de Salud mediante un panel de sueros caracterizados, remitidos a los laboratorios de la red nacional anualmente. A su vez, el Laboratorio de Referencia Nacional del INS, participa en programas de evaluacin externa internacional.
CONTROL DE CALIDAD INDIRECTO Para fines de control indirecto del diagnstico parasitolgico y serolgico de la enfermedad de Chagas, los laboratorios de referencia regionales, envian al Laboratorio de Referencia Nacional, todas las lminas positivas y sueros reactivos examinados durante el trimestre y 10% de las lminas negativas y sueros no reactivos, seleccionados aleatoriamente. Es indispensable adjuntar el formato de solicitud de control de diagnstico (Anexo N 6), con los datos y resultados de las muestras y reactivos empleados.
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CAPTULO XII
BIOSEGURIDAD
Las medidas de bioseguridad son indispensables para proteger la salud y seguridad del personal que trabaja en laboratorios donde se manipulan productos biolgicos. Sangre, suero sanguneo, biopsias y material fecal de triatominos, son productos biolgicos que se procesan en las pruebas de diagnstico parasitolgico e inmunolgico de la enfermedad de Chagas. Los laboratorios que procesan las muestras mencionadas, son de nivel de bioseguridad 2, es decir, se trata de laboratorios que cuentan con cmaras de bioseguridad y otros dispositivos para la proteccin personal. 12.1. DEL PERSONAL DE LABORATORIO Toda persona que manipula sangre o sus derivados, debe estar vacunada contra el virus de la hepatitis B. Al momento de extraer la sangre: Vestir mandil, usar guantes, jeringas y agujas descartables o tubos al vaco. Nunca extraer sangre solamente con la aguja. El cabello largo debe conservarse sujetado o usar gorro. No usar brazaletes ni collares.
El personal que va a manipular al parsito ya sea cultivo, material fecal de triatominos infectados o sangre de individuos infectados, debe: Inicialmente trabajar bajo supervisin cercana. Conocer aspectos biolgicos del parsitos. Someterse a evaluacin serolgica por lo menos una ves al ao. Practicar las normas de bioseguridad y conocer el procedimiento que se debe seguir en caso de accidente.
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12.2. DEL AMBIENTE DEL LABORATORIO a) Las paredes deben ser lisas, preferiblemente enchapadas con maylica y los pisos de marmolina o cemento. Esto facilitar la limpieza con soluciones desinfectantes. b) Los pisos deben limpiarse todos los das con soluciones desinfectantes (pinesol, cresol, etc.). No se debe barrer en seco ni encerar. c) Al sistema de desague, slo se debe eliminar los agentes biolgicos o qumicos, previamente descontaminados, neutralizados o inactivados.
d) El ambiente debe estar adecuadamente ventilado e iluminado y los servicios de agua, luz y gas deben funcionar satisfactoriamente. e) Las mesas de trabajo deben estar confeccionadas de material slido, con superficies lisas, impermeables de fcil limpieza resistentes a las sustancias corrosivas. Uso de cabinas de seguridad: Clase I y II: Cabina clase I: Son de frente abierto, presin negativa y con filtros HEPA (alta eficiencia en filtrado de partculas). Se puede usar con ventanas a medio abrir. Cabina clase II: Son de flujo laminar vertical, similar a la anterior, pero con aire filtrado por HEPA circulando.
12.3. MANIPULACIN Y ELIMINACIN DE SANGRE Y SUS PRODUCTOS a) La extraccin, centrifugacin y separacin de suero debe hacerse usando guantes. b) Las agujas usadas no deben devolverse al capuchn de plstico. Antes de ser eliminadas colocarlas junto con las jeringas usadas en un recipiente que resista la esterilizacin en autoclave o hervido. c) El operador es el responsable de desinfectar el rea de trabajo antes y despus de su uso con fenol al 5%, cresol al 3% u otro desinfectante, dejndolos actuar durante 30 minutos.
d) El cogulo y suero innecesarios deben eliminarse en un recipiente con leja. e) Los tubos de prueba, pipetas y lminas de microscopio pueden descontaminarse sumergindolas en mezcla sulfocrmica o leja antes de lavarlas.
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12.4. EN CASO DE ACCIDENTES La forma celular infectante de Trypanosoma cruzi al hombre es el trypomastigote, ste se encuentra en la sangre de los pacientes chagsicos y de animales infectados experimentalmente en el laboratorio, en las heces de los triatominos y en cultivos de parsitos. El personal que trabaja con estos materiales est expuesto a infecciones accidentales. Los mecanismos son variables, entre ellos tenemos la autoinoculacin con agujas, ingesta de aerosoles o gotitas en mucosas, ojos o piel. 12.4.1. Inoculacin accidental, cortes o abrasiones, quemaduras pequeas La persona accidentada debe lavarse la zona afectada con jabn, alcohol o desinfectante. Informar el accidente al jefe inmediato y concurrir al servicio mdico ms cercano. Solicitar el examen de una muestra de sangre (microconcentracin) en busca de parsitos a partir del quinto da de producido el accidente. En caso de resultar negativo solicitar el examen de nuevas muestras de sangre cada semana durante dos meses, asmismo la evaluacin serolgica para la deteccin o el seguimiento del nivel de anticuerpos contra Trypanosoma cruzi. Si la probabilidad de adquirir la infeccin es alta, el accidentado debe recibir tratamiento preventivo inmediato con Nifurtimox o Benznidazol.
12.4.2. Ingestin de material peligroso Acudir al servicio mdico ms cercano para el tratamiento adecuado. 12.4.3. Contacto con material infectado con virus de la hepatitis B o virus del VIH (sangre, suero, fluidos corporales) a) Se debe lavar la zona afectada con agua y jabn. En caso de herida, favorecer el sangrado de la lesin y, si es necesario, cubrir la herida con un apsito. b) Se concurrir al servicio mdico ms cercano para determinar la gravedad del caso e informar del accidente a las autoridades competentes. c) Se tomar una muestra de suero del accidentado para descarte de infeccin de hepatitis B y VIH. Tambin debe examinarse la muestra del paciente, posible contaminante.
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d) Si la muestra es negativa para VIH, este examen debe repetirse mensualmente hasta el sexto mes. La continuidad negativa de la muestra indica que el trabajador no se ha contaminado. 12.5. DESINFECCIN, LIMPIEZA Y ESTERILIZACIN 12.5.1. Desinfeccin a) Los procedimientos para eliminar elementos causantes de infecciones virales, bacterianas, micticas y parasitarias, dependern de la naturaleza del agente presente en el material de vidrio u otro. b) Los ms comunes son: agentes qumicos en estado lquido (mezcla sulfocrmica, leja, etc.) y los agentes fsicos como el calor, hervido, autoclave, irradiacin ultravioleta, etc. 12.5.2 Lavado Despus de la eliminacin de los agentes infecciosos (desinfeccin), el material de vidrio sucio debe ser lavado, recomendndose el uso de detergentes. 12.5.3.a Autoclave (vapor saturado a presin) Permite controlar la temperatura (121 C) y la presin (15 atmsferas). Se usa para soluciones, material de goma, plstico, vidrio o metal. Material de vidrio con medio de cultivo. Se puede emplear tambin una olla a presin provista de una rejilla. 12.5.3.b Horno (calor seco) Suele ser elctrico y permite el control de la temperatura (180-200 C) Por este sistema no puede esterilizarse papel, material plstico, de goma, etc.). 12.5.3.c Agentes fsicos Para reactivos biolgicos degradables por calor seco o hmedo, se emplean membranas de filtracin (0,22 m).
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REFERENCIAS BIBLIOGRFICAS
1. 2.
Atias A, Neghme A. (1979). Parasitologa clnica. Primera edicin editorial Inter. Mdica. Buenos Aires. p. 216-227. Cceres A, Troyes L, Gonzles A, Llontop E, Bonilla C, Murias E, Heredia N, Velsquez C, Yez C. (2002). Enfermedad de Chagas en la region nororiental del Per. I. Triatominos (Hemiptera, Reduviidae) presentes en Cajamarca y Amazonas. Red Peru Med Exp Salud Publica. 19(1); 17-23. Cornejo A. (1958). Enfermedad de Chagas. Estado actual en el Per. Anales de la Facultad de Medicina, tomo XLI-N. 3 - Tercer trimestre. pp. 421-453. Doctrina, normas y procedimientos para el control de la enfermedad de chagas en el Per. MINSA, 1998. Enfermedad de chagas y otras parasitosis. (1996). Instituto Nacional de Chagas. Dr. Mario Fatala Chaben. Manual de laboratorio. Octava edicin. Buenos Aires p. 60. Guilln A, Beltrn M, Quispe N, Valverde A, Zavaleta A (1996). Manual de normas de bioseguridad. (Zavaleta A, Carrillo C, Cabezas C, Chang J, eds.) Ministerio de Salud, Instituto Nacional de Salud, Centro Nacional de Laboratorios de Salud Pblica. Red Nacional de Laboratorios de Salud Pblica. Serie de normas tcnicas n 18, Lima, art. Lautrec, 61 pgs. Guilln Z, Cceres et al. (1977). Triatominos del Per, infeccin natural por tripanosomas. IV Congreso Peruano de Microbiologa y Parasitologa. p. 143. Lumbreras H. (1972). El problema de la enfermedad de Chagas en los diferentes departamentos del Per. Tesis de la Facultad de Medicina - Universidad Peruana Cayetano Heredia. Manual de mantenimiento para equipos de laboratorio. Organizacin Panamericana de la Salud, Washington DC, 2005. Manual de procedimientos de control de calidad para los laboratorios de serologa de los bancos de sangre. Organizacin Panamericana de la Salud. Febrero 1994.
3.
4. 5.
6.
7.
8.
9. 10.
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11.
Margini R.A. (1996) Inmunologa e inmunoqumica. Fundamentos. Editorial Mdica Panamrica. Quinta edicin. Buenos aires. p. 198, 800. Nquira C, Guilln A, Palacios R, Guevara M, Guerra H, (1995). Manual de procedimientos de laboratorio para la obtencin y envo de muestras (I). (Zavaleta A, Carrillo C, Cabezas C, Chang J, eds.) Ministerio de Salud , Instituto Nacional de Salud, Centro Nacional de Laboratorios de Salud Pblica. Red Nacional de Laboratorios de Salud Pblica. Serie de normas tcnicas n 15, Lima, art. Lautrec, 98 pgs. Ponce C, et al. (2005). Validation of a rapid and reliable test for diagnosis of Chagas disease by dectection of Trypanopsoma cruzi specific antibodies in blood of donors and patients in Central America. Journal of Clinical Microbiology. 43 (10); 5065-68. Roitt I. (1988). Essential Inmunology Sixth Edition, Blackwell Scientific Publications Boston. P. 286. Schmunis G.A. (1994). American Trypanosomiasis as a public health problem. 23 pgs. Solari A, Lorca M. (1998). Tecnologas aplicadas al diagnstico e investigacin de enfermedades parasitarias. Network for research and training in parasitic diseases in the southern cone of Latinoamrica SIDA/SAREC. Santiago de Chile. p. 50. Wendel S, Brenner Z, Camargo M.E. (1992). Chagas disease (American Tripanosomiasis): Its impact on transfusin and clinical medicine. Sao Paulo. Cart. Graf. Editorial. 270 pgs. WHO. (1991). Control of Chagas disease. Report a WHO Expert Committee, Geneva. WHO Technical Report Series 811 95 pgs. Zaman V. (1997). Atlas color de parasitologa clnica. Segunda edicin. Editorial Mdica Panamericana, Buenos Aires. p. 82. Validation of a rapid and reliable test for diagnosis of Chagasdisease by detection of Trypanosoma cruzi-specific antibodies in blood of donors and patients in Central America. Carlos Ponce et al. Journal of Clinical Microbilogy. Vol 43, N 10, p 5065 - 68. 2005.
12.
13.
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17.
18. 19. 20.
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ANEXO 1
PREPARACIN DE REACTIVOS Y MEDIOS DE CULTIVO

1. COLORACIN GIEMSA 1.1. Solucin Giemsa stock Colorante Giemsa en polvo, certificado ................................... 0,75 g Metanol puro (sin acetona) ........................................................ 65,00 mL Glicerina pura ............................................................................. 35,00 mL En un frasco mbar que contiene perlas de vidrio, mezclar los reactivos agitndolos vigorosamente varias veces al da. Generalmente el colorante est listo al tercer da cuando, en el ensayo de tincin, los parsitos muestran los colores apropiados. Filtrar la solucin Giemsa stock con papel de filtro y conservarla en frasco oscuro a temperatura ambiente.
1.2. Solucin diluyente (agua amortiguada) Fosfato disdico anhidro (Na2HPO4) ........................................ 4,0 g Fosfato monopotsico (KH2PO4) ............................................... 5,0 g Mezclar las sales a homogeneidad. Diluir un gramo de la mezcla de sales en un litro de agua destilada, agua de lluvia o de cao. El rango de pH apropiado oscila entre 6,6 y 7,2.
1.3. Solucin Giemsa diluida Preparar el volumen necesario en una probeta. Colorante Giemsa stock ............................................................ 0,10 mL Solucin diluyente ..................................................................... 0,90 mL Otra forma de preparar la solucin Giemsa diluida es agregando dos gotas de Solucin Giemsa stock por cada mililitro de solucin diluyente.
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2. CULTIVO 2.1. Solucin de estreptomicina: (500 mg/mL) Diluir 5 gr de sulfato de estreptomicina en 10 mL de agua destilada estril. La concentracin final del antibitico en el medio de cultivo o solucin salina debe ser 500 g/mL. Ejemplo: Para 100 mL de medio de cultivo agregar 0,1 mL de la solucin de estreptomicina.
2.2. Solucin de penicilina G sdica : (200 000 UI/mL) Diluir 1 milln de unidades de penicilina en 5 mL de agua destilada estril. La concentracin final del antibitico en el medio de cultivo o solucin salina debe ser 200 000 UI/mL. Ejemplo: Para 100 mL de medio de cultivo agregar 0,1 mL de la solucin de penicilina.
2.3. Solucin de 5-fluorocitosina (500 mg/mL) Diluir 5 gr de 5-fluorocitosina en 10 mL de solucin salina estril. Concentracin final: 500 g de 5-fluorocitosina por cada mililitro de medio de cultivo o solucin salina. Ejemplo: Para 100 mL de medio de cultivo agregar 0,1 mL de la solucin de 5-fluorocitosina. Nota: Esterilizar las soluciones por filtracin (0,22 de porosidad). 2.4. Obtencin de sangre desfibrinada de conejo 2.4.1. Materiales y reactivos Conejo adulto. Matraz o baln que contenga perlas de vidrio (estril). Aguja N. 18 y jeringa de vidrio de 50 mL (estril). Tijeras. Alcohol yodado y algodn. Mechero Bunsen o de alcohol.
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2.4.2. Procedimiento a) Sujetar al conejo en posicin cbito dorsal. b) Ubicar la zona de puncin (latido cardaco), cortar con una tijera el pelaje y desinfectar con alcohol yodado el rea elegida. c) Obtener por puncin al corazn de 20 a 40 mL de sangre.
d) Muy cerca al mechero, para conservar la esterilidad de la sangre, vaciar la sangre a un matraz o baln estril, el cual contiene perlas de vidrio. e) Agitar suavemente con movimientos rotatorios para desfibrinar la sangre durante cinco minutos.
2.5. Medio de cultivo agar sangre 2.5.1. Materiales y reactivos Medio base para agar sangre ................................................... 4 g Agua destilada ........................................................................... 100 mL Solucin de estreptomicina ...................................................... 0,1 mL Solucin de penicilina ............................................................... 0,1 mL Sangre desfibrinada de conejo ................................................ 15 mL Tubos de prueba de 13 x 100 2.5.2. Procedimiento a) En un baln de 500 mL diluir el agar (bao Mara 80 C) en 100 mL de agua destilada y autolavar a 121 C por 15 minutos. b) Dejar enfriar a temperatura ambiente hasta, aproximadamente, 46 C y aun estando el agar licuado, agregar 15 mL de sangre desfibrinada de conejo, en ambiente de esterilidad. c) Agregar las soluciones de antibiticos 0,1mL de la solucin de estreptomicina y 0,1 mL de penicilina.
d) Revertir 1,5 mL del medio en tubos de prueba con tapa rosca. e) Controlar la esterilidad del medio a 37 C durante 18 horas. f) Guardar a 4 C hasta el momento de uso.
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3. HEMAGLUTINACIN INDIRECTA 3.1. Solucin de Alsever Glucosa anhidrida ..................................................................... 18,66 g Cloruro de sodio ........................................................................ 4,18 g Citrato de sodio .......................................................................... 8,00 g cido ctrico ................................................................................ 0,55 g Agua destilada ........................................................................... 1000 mL
3.2. Solucin salina tamponada - buffer fosfato salino (PBS) 0,15 mL Preparar: Solucin 1: KH2PO4 ...................................................... 2,04 g H2O destilada .................... 100 mL
Solucin 2: NA2HPO4 .................................................. 2,13 g H2O destilada .................... 100 mL

REACTIVOS Solucin 1 Solucin 2 NaCI Agua destilada PBS ph 7,2 7 mL 18 mL 2,1 g 250 mL PBS ph 6,4 18,4 mL 6,7 mL 2,1 g 250 mL
3.3. Solucin diluyente Suero humano negativo al 1% en PBS pH 7,2 Ejemplo: 0,5 mL suero humano 45 mL de PBS pH 7,2
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3.4. cido tnico solucin stock al 1% cido tnico ................................................................................ 10 mg Solucin salina .......................................................................... 1 mL Solucin de trabajo 1/20 000 cido tnico solucin stock ....................................................... 100 L Solucin salina .......................................................................... 20 mL
4. ELISA 4.1. Buffer fosfato salino (PBS) pH 7,2 KCI .............................................................................................. 0,2 g Na2HPO4 anhidro ....................................................................... 1,148 g Na H2PO4 anhidro ...................................................................... 0,2 g NaCI ............................................................................................ 8,0 g Agua destilada ........................................................................... 1000 mL Conservar a 4 C.
4.2. Buffer de lavado Buffer fosfato salino + Tween 20 al 0,05%.
4.3. Solucin de bloqueo Buffer fosfato salino + seroalbmina bovina al 3%
4.4. Solucin diluyente Buffer fosfato salino + seroalbmina bovina al 1%
4.5. Conjugado Antiinmunoglobulina humana marcada con peroxidasa Para determinar el ttulo del conjugado ejecutar el procedimiento de la tcnica ELISA con sueros controles positivo (con ttulo conocido), negativo y control de inespecificidad y evaluar diluciones dobles del conjugado mayores y menores a la dilucin propuesta por el laboratorio fabricante.
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MANUAL
Considerar como ttulo del conjugado a la mayor dilucin con la que se obtiene la lectura de la absorbancia esperada en los sueros control.
4.6. Solucin estabilizadora para el sustrato pH 6 cido ctrico ................................................................................ 3,0 g Na2HPO4 anhidro ....................................................................... 10,7 g Agua destilada ........................................................................... 100 mL Ajustar el pH a 6 Antes de su uso, diluir la solucin estabilizadora del sustrato (8 mL) con agua destilada (17 mL).
4.7. Solucin del sustrato Solucin estabilizadora para el sustrato .................................. 25 mL Orto-phenilendiamine ............................................................... 10 mg Perxido de hidrgeno al 30% .................................................. 10 L 4.8. cido sulfrico 2,5 M cido sulfrico ............................................................................ 1,4 mL Agua destilada ........................................................................... 8,6 mL
5. INMUNOFLUORESCENCIA INDIRECTA (IFI) 5.1. Buffer fosfato salino (PBS) 0,001 M pH 7,4 Para preparar un litro de PBS, pesar: NaCI ............................................................................................ 8,1g Na2HPO4 12 H2O ........................................................................ 2,6 g Na2HPO4 1 H2O ........................................................................... 0,3 g Diluir las sales en 900 mL de agua destilada. Ajustar el pH a 7,4 utilizando NaOH 1 M
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En una probeta, enrasar a un litro con el agua destilada. Conservar en refrigeracin (4 C).
5.2. Buffer diluyente (PBS + tween 80 al 1%) PBS ............................................................................................. 99 mL Tween 80 .................................................................................... 1 mL
5.3. Solucin de azul de Evans Preparar la solucin stock de la siguiente manera: Azul de Evans ............................................................................. 100 mg PBS - tween 80 ........................................................................... 100 mL Conservar en refrigeracin (4 C)
Preparar la solucin de trabajo antes de usarla Solucin stock ............................................................................ 1 parte PBS tween 80 ............................................................................. 9 partes
5.4. Buffer carbonato - bicarbonato 0,5 M pH 8,5 Solucin A Na2CO3 ........................................................................................................................................................ 5,3 g Agua destilada c.s.p. ................................................................. 100 mL
Solucin B NaHCO3 ..................................................................................................................................................... 4,2 g Agua destilada c.s.p. ................................................................. 100 mL Mezclar 0,4 mL de la solucin A con 10 mL de la solucin B. Verificar o ajustar el pH a 8,5. Utilizar la solucin A si est por debajo de 8,5 y la solucin B si est por encima de este valor.
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5.5. Glicerina tamponada Buffer carbonato - bicarbonato 0,5 M, pH 8,5 ........................... 1 mL Glicerina bidestilada .................................................................. 9 mL
5.6. Titulacin del conjugado antiinmunoglobulina humana asociada a isocianato de fluorescena El fabricante estima el ttulo del conjugado, sin embargo, antes de su uso corroborarlo o determinarlo evalundolo en diluciones dobles mayores y menores al ttulo indicado. Emplear en la evaluacin un suero control positivo de ttulo conocido y un suero control negativo. Elaborar el protocolo de trabajo siguiendo el esquema siguiente y efectuar el procedimiento de la tcnica IFI,
TTULO RECOMENDADO
CONJUGADO
1/50
1
1/100
2
1/200
3
1/400
4
1/800
5 6
CP
1/32
1/32
1/32
1/32
1/32
1/32
CN
1 /32
1/32
1/32
1/32
1/32
1/32
B
12
10
11
CP : SUERO CONTROL POSITIVO A T. cruzi CN : SUERO CONTROL NEGATIVO A T. cruzi
CI: SUERO CONTROL INTERNO B: BLANCO (control de reactivos)
El ttulo del conjugado es la mayor dilucin del conjugado en la que fluoresce el suero positivo en su ttulo conocido. Titular cada lote nuevo del conjugado; asimismo, cuando se cambia el lote de antgeno, los controles o alguno de los reactivos de la batera IFI.
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ANEXO 2
AISLAMIENTO Y MANTENIMIENTO DE Trypanosoma cruzi EN EL LABORATORIO

1. AISLAMIENTO El parsito se puede aislar a partir de: 1.1. Pacientes, por hemocultivo o xenodiagnstico 1.1.a. Hemocultivo: Sembrar la muestra de sangre heparinizada de un paciente chagsico agudo en medio de cultivo bifsico agar sangre - suero fisiolgico. Proceder igual que en el hemocultivo para el diagnstico. Generalmente, la parasitemia en sangre circulante es baja por lo que, a mayor volumen de sangre sembrada, mayor posibilidad de xito en el aislamiento.
1.1.b. Xenodiagnstico: Aplicar el xenodiagnstico a un paciente chagsico agudo. Seguir el procedimiento que se detalla para el aislamiento a partir de los vectores.
1.2. Vectores Procedimiento: Desinfectar el insecto positivo a la infeccin por T. cruzi sumergindolo durante un minuto en una solucin alcohlica al 70%. Cortar la parte terminal del abdomen del insecto con la ayuda de unas pinzas y tijeras finas desinfectadas retirar el tubo digestivo y colocarlo sobre una lmina porta objetos. Sembrar el material fecal y el tubo digestivo en medio de cultivo bifsico agar sangre-suero fisiolgico e incubar a 28 C.
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2. MANTENIMIENTO 2.1. En medio de cultivo Los parsitos aislados se mantienen en cultivo por repiques semanales en nuevos tubos con agar sangre. Es recomendable mantener dos tubos del mismo cultivo y manipular solamente uno de ellos, esto permitir continuar los cultivos en caso de contaminacin.
2.2. En animales La lar za en inoculacin en animales de experimentacin es otra forma de aisy mantener el parsito. Se usa ratones jvenes y el control se realiexaminando peridicamente la parasitemia en una gota de sangre, fresco, obtenida por corte en la porcin terminal de la cola.
El traspaso de animal a animal se hace por inoculacin intraperitoneal de sangre positiva. As se conserva la capacidad de infeccin del parsito.
2.3. Criopreservacin Es la conservacin de los parsitos a -80 C, este procedimiento mantiene las caractersticas nativas del parsito. Se realiza colocando una suspensin de parsitos procedentes de cultivo en medios de conservacin con glicerol a diferentes concentraciones.
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ANEXO 3
PREPARACIN DE ANTGENOS
1. ANTGENO PARA LA INMUNOFLUORESCENCIA INDIRECTA Las lminas empleadas para la prueba de inmunofluorescencia indirecta, se preparan con epimastigotes de Trypanosoma cruzi obtenidos en medio de cultivo y tratados con formol. Se emplean cultivos de cuatro das (fase exponencial del crecimiento). Los parsitos deben estar aislados para fijarse en las lminas, evitar las rosetas.
1.1. EQUIPOS, MATERIALES Y REACTIVOS 5 mL de cultivo de epimastigotes. Tubos de centrfuga 10 mL, 1,5 mL con tapa. Lminas para inmunofluorescencia. Buffer fosfato salino (PBS) 0,01 mL pH 7,4 (Anexo 1). Solucin formolada: PBS + formol al 2% V:V. Acetona. Centrfuga. Cmara de Newbauer
1.2. PROCEDIMIENTO PARA OBTENER LA SUSPENSIN DE PARSITOS a) Filtrar el cultivo a travs de una capa fina de gasa o lana de vidrio. b) Centrifugar el cultivo a 4000 rpm durante diez minutos. c) Retirar el sobrenadante, en el sedimento se encuentran los parsitos
d) Lavar los parsitos por tres veces de la siguiente manera: - Resuspender los parsitos en 5 mL de PBS, 0,01 M pH 7,4. - Centrifugar a 4000 rpm por diez minutos. - Retirar el sobrenadante. - Repetir el lavado.
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e) Resuspender el sedimento en 0,50 mL de PBS 0,01 M pH 7,4. f) Adicionar 0,50 L de solucin formolada y dejarlo durante una hora en refrigeracin (4%C). Luego proceder al lavado al igual que en el punto d.
g) Resuspender el sedimento en 0,25 mL de PBS 0,01 M pH 7,4. h) Colocar una alcuota de la suspensin de parsitos en una cmara de Newbauer y realizar el contaje de parsitos en el microscopio a 40X. i) Diluir la suspensin con PBS hasta obtener de 25 a 40 parsitos por campo microscpico a 40X.
1.3. FIJACIN DE LOS PARSITOS A LAS LMINAS Depositar 25 L de la suspensin diluida de parsitos sobre el rea de los crculos de la lmina IFI. Dejar secar a temperatura ambiente o con la ayuda de un secador o ventilador. En un frasco couplin que contiene acetona fra, sumergir las lminas para fijar el parsito. Mantenerlo en refrigeracin (4 C) durante diez minutos. Las lminas fijadas envolverlas en papel aluminio o guardarlas en una caja portalminas, sellando los bordes con esparadrapo para evitar la humedad. Conservarlas en congelacin (-4 a -20C) hasta el momento de su uso.
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1.4. RECOMENDACIONES Emplear lminas limpias, libres de grasa, para facilitar la fijacin uniforme de la suspensin de parsitos a la lmina y para evitar los artefactos que dificultan la lectura. Proceder de la siguiente manera para la limpieza: En un frasco couplin o frasco con tapa, que contiene alcohol acetona V:V, sumergir las lminas IFI nuevas, durante 1 a 24 horas. Secarlas con una gasa limpia y conservarlas envueltas con papel hasta el momento de su uso. Las lminas IFI usadas, lavarlas previamente con detergente y luego proceder al igual que con las nuevas. Los cubreobjetos dejarlos en un recipiente que contenga alcohol al 70% durante 30 minutos, luego secarlos con gasa limpia una a una. Conservarlas en su caja o en una placa Petri hasta su uso.
2. ANTGENO PARA LA HEMAGLUTINACIN INDIRECTA El antgeno es un extracto acuoso de epimastigotes de Tripanosoma cruzi, obtenido de cultivo in vitro.
2.1. EQUIPOS, MATERIALES Y REACTIVOS 50 mL de cultivo de epimastigotes. Tubos de centrfuga, 50 mL y 10 mL con tapa. Buffer fosfato salino pH 7,4 (PBS) (Anexo 1). Solucin NaCL 1,7%. Merthiolate 1:10 000. Solucin salina estril. Gasa. Centrfuga. Congeladora -20 C. Bao Mara.
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2.2. PROCEDIMIENTO a) Filtrar el cultivo a travs de una capa de gasa o lana de vidrio. b) Centrifugar el cultivo a 4000 rpm durante 10 minutos. c) Retirar el sobrenadante, en el sedimento se encuentran los parsitos.
d) Lavar los parsitos de la siguiente manera: -Resuspender el sedimento en 5 mL de PBS. -Centrifugar a 4000 rpm por 10 minutos. -Retirar el sobrenadante. e) Repetir el lavado. f) Resuspender los parsitos en agua destilada (1:10).
g) Congelar (-70 C) y descongelar (37 C) por seis veces sucesivas. h) Agregar un volumen igual de solucin Nacl al 1,7%. i) j) k) Centrifugar durante 30 minutos a 4000 rpm y 2 C. El sobrenadante constituye el antgeno. Agregar la solucin de Merthiolate al 1:10 000. Conservar en congelacin (-4 a -20 C) hasta el momento de su uso.
3. ANTGENO PARA ELISA El antgeno es un extracto soluble acuoso de epimastigotes lisados mecnicamente (por presin o congelamiento y descongelamiento sucesivo), o por ultrasonido (sonicacin). Los epimastigotes son obtenidos de preferencia en medio lquido LIT; el cual contiene infusin de cerebro y corazn, caldo de infusin de hgado, extracto de levadura y como suplemento hemina, suero fetal bovino. La suspensin antignica alicuotada se conserva a -20 C hasta su uso.
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ANEXO 4
CONSERVACIN Y ENVO DE MUESTRAS

El laboratorio enviar las muestras de sangre o suero y la ficha correspondiente (anexo 5) al laboratorio del nivel inmediato superior para realizar el estudio de lminas, el hemocultivo o el examen serolgico, cuando lo considere necesario. Al realizar el embalaje, considerar las temperaturas adecuadas de conservacin de las muestras: Suero en congelacin (<0 C). Sangre en capilares y en tubos en fro (4-8 C).
Procedimiento: a) Colocar las muestras en una bolsa plstica, luego acondicionarlos en un contenedor secundario (recipiente de cartn grueso o plstico, rodeado con hielo seco o cubos de hielo). b) El recipiente secundario debe ser colocado en una caja de tecnoport (poliestireno) u otro material que conserve las temperauras bajas. Incluir la ficha de solicitud de examen en bolsa plstica sellada. c) Cerrar y sellar hermticamente la caja trmica.
d) Rotular la caja trmica con los siguientes datos: destino direccin y nombre del laboratorio al que se envia las muestras, ejemplo.
URGENTE MATERIAL BIOLGICO PERECIBLE DESTINO: INSTITUTO NACIONAL DE SALUD DIRECCIN: CALLE CPAC YUPANQUI 1400 JESS MARA - LIMA 11 TELEFONOS: 471-9920 / 471-2529 ATENCIN: LABORATORIO DE LEISHMANIOSIS Y CHAGAS
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MANUAL
Anotar en lugar visible la temperatura de conservacin de la muestra, refrigeracin (4-8 C) o congelacin (0 - 20 C). Colocar una flecha indicando la posicin en la que debe mantenerse la caja. La va de transporte debe ser la ms rpida posible. En caso de contar con contenedores prefabricados, seguir las instrucciones que indica el envase.
MUESTRA EXAMEN DE LABORATORIO OBTENCIN DE SANGRE CARACTERSTICAS PROCESAMIENTO
TIPO
CANTIDAD
CONSERVACIN
TRANSPORTE
GOTA GRUESA
Sangre capilar Sangre capilar
En lminas
2 Lminas
Homognea Evitar las burbujas de aire en el capilar
Temperatura ambiente Temperatura ambiente y en posicin vertical
Inmediato
Temperatura ambiente
MICROCONCENTRACIN
En capilares con EDTA
4 - 6 tubos capilares
Antes de las cuatro horas
Con refrigerante
CONCENTRACIN STOUT Y HEMOCULTIVO
Sangre venosa
En tubo 5 mL vacutainer sin anticoagulante
Refrigeracin Esteril (4 - 8 C )
Inmediato o antes de siete das
Con refrigerante
ELISA IFI HAI IB
Suero o En tubo plasma 1 - 2 mL vacutainer sanguneo sin anticoagulante
No hemolizado No contaminado
Hasta 5 das: Refrigeracin 4-8 C Mediato Mayor de 5 das: Congelacin -20 a - 80 C
Con refrigerante
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Anexo 5
Solicitud para diagnstico de laboratorio de la enfermedad de Chagas
Establecimiento de salud
Direccin Regional de Salud
Banco de sangre
No S
I. DATOS PERSONALES
Apellidos y Nombres Direccin
Calle y N Localidad Distrito
Fecha
Edad
Aos
_____/_____/_____
Da Mes Ao
Sexo
Meses Fem Masc
Provincia
Departamento
II. ANTECEDENTES Diagnstico clnico

Sintomtico Agudo Asintomtico Signo de Romaa Chagoma de inoculacin Fiebre Manifestaciones cardiacas Crnico Insuficiencia cardiaca Disfagia Estreimiento Megaesfago Megacolon Congnito Aumento de ganglios Prematuro Hepato-esplenomegalia Recibi transfusin sangunea
No S Hace cunto tiempo
Aspectos epidemiolgicos
Presencia de chirimachas en su vivienda Vivienda rociada con insecticida
No S Hace cunto tiempo Cdigo de vivienda No S Hubo Dnde Cundo
Familiar con Dx . de Chagas

No S Quin
Vivi o visit rea endmica

No S Lugar / Hace cunto tiempo
Antecedente de Uta o Espundia

(Leishmaniosis ) No S Hace cunto tiempo
Gestante
No S Fecha ltima regla Fecha probable parto
Resultados anteriores de laboratorio y tratamiento recibido

No S Fecha Donde se realiz el dx . Tcnica empleada /Nombre reactivo Abs. ELISA: OTRA: Valor de corte
Parasitemia positiva Serologa reactiva
Recibi medicamento
No S Hace cuanto tiempo Nombre del medicamento
Complet el tratamiento
No
III. EXMENES DE LABORATORIO SOLICITADO

Diagnstico Confirmacin del diagnstico Seguimiento del tratamiento
Examen parasitolgico
Fecha obt . muestra Fecha recep. muestra Resultado
Examen serolgico
Fecha obt. muestra Fecha recep. muestra Resultado Abs. V. de C Ttulo
Gota gruesa - frotis Microconcentracin Concent. Strout Hemocultivo Xenodiagnstico
ELISA HAI IFI IB
Responsable de solicitud de diagnstico

Nombres y apellidos Firma
Responsable del diagnstico

Nombres y apellidos Firma
INSTRUCTIVO DE LA SOLICITUD PARA DIAGNOSTICO DE LABORATORIO DE LA ENFERMEDAD DE CHAGAS

Llenar los casilleros con los datos solicitados. I. DATOS PERSONALES En el casillero direccin, anotar el lugar de residencia habitual II. ANTECEDENTES Diagnstico clnico Sintomtico: marcar con X si hay alguna sintomatologa compatible con la enfermedad. En caso de infecciones agudas o crnicas, identificar con una X el casillero correspondiente a los sntomas presentes. Asintomtico o indeterminado: marcar con una X cuando no hay sintomatologa pero hay antecedentes epidemiolgicos que hacen sospechar de la infeccin. Aspectos epidemiolgicos Llenar o marcar con una X los casilleros correspondientes. Precisar en lo posible las fechas de los datos solicitados. reas endmicas: Arequipa, Moquegua, Tacna, Ica, Cajamarca, Amazonas y San Martn. Resultados anteriores de laboratorio y tratamiento recibido Marcar el casillero que corresponda. Anotar la fecha, el nombre del establecimiento que realiz el diagnstico, la tcnica y nombre del kit usado, en caso de ELISA absorbancia (Abs) de la muestra y el valor de corte (Vc) correspondiente. III. EXAMEN SOLICITADO Los exmenes solicitados sern los apropiados para confirmar el diagnstico presuntivo y estarn de acuerdo a la situacin clnica de la persona: agudo, crnico portador, congnito. Marcar con una X el casillero confirmacin del diagnstico, en caso de tener resultados de laboratorio anteriores y el de seguimiento cuando se solicita el examen de laboratorio de persona con tratamiento. Debe colocarse las fechas segn el momento del proceso: al obtener la muestra y al ingresar al laboratorio que efectuar el examen. Dejar en blanco los casilleros de resultados hasta el momento de emitirlos. El solicitante ser el responsable del laboratorio local o regional.
Anexo 6
Solicitud de control del diagnstico de laboratorio de la trypanosomiosis americana
DIRECCIN REGIONAL DE SALUD ESTABLECIMIENTO DE SALUD RESPONSABLE DEL DIAGNSTICO ACTIVIDAD EN CONTROL NOMBRE DE LA ACTIVIDAD (Lugar) PERIODO N Muestras evaluadas N Muestras Reactivas/Positivas Vigilancia serolgica Diagnstico de laboratorio Proyecto de investigacin Otro
N.
Cdigo Laboratorio
Nombres y Apellidos
Resultados Laboratorio Referencia Regional Gota ELISA IFI HAI V.c. Abs . 1/32 gruesa
Observaciones
: Nombre de reactivos o kits empleados por el laboratorio de referencia regional
NOTA: Enviar todas las lminas o sueros positivos y 10% de los negativos examinados en el trimestre (lminas coloreadas con Giemsa de exmenes de sangre por gota gruesa, concentracin). Adjuntar el presente formato con la informacin solicitada empleando una hoja para cada actividad y el formato de solicitud de diagnstico de las muestras positivas o reactivas .
Lugar y fecha
Nombres y apellidos del responsable del laboratorio
Firma
ANEXO 7
REGISTRO DE MUESTRAS PARA INVESTIGACIN Y MONITOREO DE CASOS DE ENFERMEDAD DE CHAGAS

N. FECHA
CDIGO DE LABORATORIO
NOMBRES Y APELLIDOS
EDAD SEXO PROCEDENCIA
SOLICITA (*)
GG
EXAMEN DE LABORATORIO CONC. CULT. HAI ELISA IFI
OBSERVACIONES
(*) D CD M
: : :
Diagnstico Confirmacin diagnstico Monitoreo o seguimiento de caso
GG : CONC. : CULT. :
Gota gruesa Concentracin Cultivo
HAL ELISA IFI
: : :
Hemaglutinacin indirecta Ensayo inmunoenzimtico Inmunofluorescencia indirecta
ANEXO 8
DETECCIN DE ANTICUERPOS ANTI Trypanosoma cruzi POR ELISA
Ejecutor del ensayo Nombre del kit
Fecha
Valor de corte
1 A
1 1 1 1 1 1
2 3 4 5 6
7
1 1
8
1
9
1
10
11
12
B
1 1 1 1 1
C
1 1 1 1
D
1 1 1
E
1 1 1
F
1 1
G H
1
NOMBRE DEL KIT Lote N Fecha de vencimiento
Da
Mes
Ao
CONJUGADO Ttulo Fecha de vencimiento Cdigo N Suero control negativo a T.cruzi Suero control negativo a T.cruzi Suero control negativo a T.cruzi Suero control positivo a T. cruzi Suero control positivo a T. cruzi Suero control interno Blanco de reactivos
CN CN CN CP CP CI B
CONTROLES
Lectura (Abs)
VALIDACION DE LA CORRIDA
No
CALCULO DEL VALOR DE CORTE
Valor de corte
(Vc):
OBSERVACIONES
Firma Responsable del control interno Fecha

Da Mes Ao
ANEXO 9
DETECCIN DE ANTICUERPOS ANTI Trypanosoma cruzi POR IFI
Ejecutor del ensayo 1 2 3 4 5 Fecha 6
7 1
8 2
9 3
10 4
11 5
12 6
7 1
8 2
9 3
10 4
11 5
12 6
7 OBSERVACIONES
10
11
12
ANTIGENO IFI Lote N Fecha de vencimiento

Da Mes Ao
CONJUGADO Lote N Ttulo
CONTROLES Cdigo N Suero control positivo a T.cruzi Suero control negativo a T.cruzi Suero control interno Blanco de reactivos
CP CN CI B
Sin suero
Ttulo 1/ 1/ 1/
-
Lectura
LECTURA E INTERPRETACIN Ttulo de valor diagnstico: 1/32 Leyenda de lecturas: Fluorece francamente No fluorece Fluorece dbilmente Validez de la corrida
S No
Leyenda de resultados:
Reactivo No reactivo Indeterminado
R
NR
+/-
OBSERVACIONES
Firma Responsable del control interno Fecha

Da Mes Ao
CEPREDIM
SE TERMIN DE IMPRIMIR POR ENCARGO DEL INS EN EL MES DE ABRIL DE 2006,

EN LOS TALLERES GRFICOS DEL
CENTRO DE PRODUCCIN EDITORIAL E IMPRENTA DE LA UNIVERSIDAD NACIONAL MAYOR DE SAN MARCOS JR. PARURO 119. LIMA 1. TELFONO: 619-7000, ANEXO: 6009 / FAX: 6015 E-MAIL: CEPEDIT@UNMSM.EDU.PE TIRAJE: 1000 EJEMPLARES

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MINISTERIO DE SALUD INSTITUTO NACIONAL DE SALUD

SERIE DE NORMAS TCNICAS N 00

MANUAL DE PROCEDIMIENTOS DE LABORATORIO PARA EL DIAGNSTICO DE LA TRYPANOSOMIOSIS AMERICANA (ENFERMEDAD DE CHAGAS)

Instituto Nacional de Salud

MANUAL DE PROCEDIMIENTOS DE LABORATORIO PARA EL DIAGNSTICO DE LA TRYPANOSOMIOSIS AMERICANA

SERIE DE NORMAS TCNICAS N 00

MINISTERIO DE SALUD INSTITUTO NACIONAL DE SALUD

MANUAL DE PROCEDIMIENTOS DE LABORATORIO PARA EL DIAGNSTICO DE LA TRYPANOSOMIOSIS AMERICANA (ENFERMEDAD DE CHAGAS)

Catalogacin hecha por el Centro de Documentacin e Informacin del INS

DE PROCEDIMIENTOS DE LABORATORIO PARA EL DIAGNSTICO DE LA TRYPANOSOMIOSIS AMERICANA

MPR - INS - 002

PROCEDIMIENTOS DE LABORATORIO PARA EL DIAGNSTICO DE LA TRYPANOSOMIOSIS AMERICANA

MPR - INS - 002

DE PROCEDIMIENTOS DE LABORATORIO PARA EL DIAGNSTICO DE LA TRYPANOSOMIOSIS AMERICANA

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PROCEDIMIENTOS DE LABORATORIO PARA EL DIAGNSTICO DE LA TRYPANOSOMIOSIS AMERICANA

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PROCEDIMIENTOS DE LABORATORIO PARA EL DIAGNSTICO DE LA TRYPANOSOMIOSIS AMERICANA

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DE PROCEDIMIENTOS DE LABORATORIO PARA EL DIAGNSTICO DE LA TRYPANOSOMIOSIS AMERICANA

AMASTIGOTE (INTRACELULAR EN EL MAMFERO)

TRYPOMASTIGOTE (EN SANGRE CIRCULANTE DEL MAMFERO Y HECES DEL INSECTO)

MPR - INS - 002

PROCEDIMIENTOS DE LABORATORIO PARA EL DIAGNSTICO DE LA TRYPANOSOMIOSIS AMERICANA

MPR - INS - 002

DE PROCEDIMIENTOS DE LABORATORIO PARA EL DIAGNSTICO DE LA TRYPANOSOMIOSIS AMERICANA

MPR - INS - 002

PROCEDIMIENTOS DE LABORATORIO PARA EL DIAGNSTICO DE LA TRYPANOSOMIOSIS AMERICANA

DISTRIBUCIN DE TRIATOMINOS EN EL PER

MPR - INS - 002

DE PROCEDIMIENTOS DE LABORATORIO PARA EL DIAGNSTICO DE LA TRYPANOSOMIOSIS AMERICANA

MPR - INS - 002

PROCEDIMIENTOS DE LABORATORIO PARA EL DIAGNSTICO DE LA TRYPANOSOMIOSIS AMERICANA

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PROCEDIMIENTOS DE LABORATORIO PARA EL DIAGNSTICO DE LA TRYPANOSOMIOSIS AMERICANA

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PROCEDIMIENTOS DE LABORATORIO PARA EL DIAGNSTICO DE LA TRYPANOSOMIOSIS AMERICANA

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DE PROCEDIMIENTOS DE LABORATORIO PARA EL DIAGNSTICO DE LA TRYPANOSOMIOSIS AMERICANA

MPR - INS - 002

PROCEDIMIENTOS DE LABORATORIO PARA EL DIAGNSTICO DE LA TRYPANOSOMIOSIS AMERICANA

ALGORITMO PARA EL DIAGNSTICO DE LABORATORIO Y SU SEGUIMIENTO

ASINTOMTICO ( PORTADOR) SOSPECHA

POSITIVO EN DOS PRUEBAS

MPR - INS - 002

DE PROCEDIMIENTOS DE LABORATORIO PARA EL DIAGNSTICO DE LA TRYPANOSOMIOSIS AMERICANA

FORMAS CLNICAS DE LA ENFERMEDAD DE CHAGAS AGUDA CRNICA PORTADOR CONGNITA

+ ++ +++ +++ +++ +++ ++++

MICROCONCENTRACIN CONCENTRACIN DE STROUT HEMOCULTIVO XENODIAGNSTICO

PRUEBAS SEROLGICAS (HAI, ELISA, IFI)

- Al inicio +++ Despus de 20 das

Utilidad relativa Util : Anticuerpos

Figura 9. Utilidad de las tcnicas de diagnstico en las formas clnicas.

MPR - INS - 002

PROCEDIMIENTOS DE LABORATORIO PARA EL DIAGNSTICO DE LA TRYPANOSOMIOSIS AMERICANA

RED NACIONAL DE LABORATORIOS DE SALUD PBLICA ACTIVIDADES POR NIVELES

LABORATORIO DE REFERENCIA NACIONAL

LABORATORIO DE REFERENCIA REGIONAL

LABORATORIO DE NIVEL LOCAL