34

O NACION UT A IT
DE
SALUD
MINISTERIO DE SALUD DEL PER

D
INSTITUTO NACIONAL DE SALUD

Organismo Pblico Descentralizado de Sector Salud
IN IST LU ERIO DE SA
MANUAL DE PROCEDIMIENTOS BACTERIOLGICO Y SEROLGICO PARA EL DIAGNSTICO DE LA LEPTOSPIROSIS
IN ST
Serie de Normas Tcnicas N 34
MANUAL DE PROCEDIMIENTOS BACTERIOLGICO Y SEROLGICO PARA EL DIAGNSTICO DE LA LEPTOSPIROSIS
Serie de Normas Tcnicas N 34
Manual de procedimientos bacteriolgico y serolgico para el diagnstico de la leptospirosis
MINISTERIO DE SALUD Ministro Dr. Fernando Carbone Campoverde

Vice-Ministro Dr. Oscar Ugarte Ubillz
Sub-Comit Editor Presidente Dra. Aida Palacios Ramrez Secretario Tcnico Dr. Csar Cabezas Snchez
INSTITUTO NACIONAL DE SALUD Jefe Dr. Luis Fernando Llanos Zavalaga

Sub-Jefe Dra. Ada Cecilia Palacios Ramrez Centro Nacional de Salud Pblica Dra. Susana Zurita Macalup Directora General Centro Nacional de Alimentacin y Nutricin Dra. Napolen Chvez Villanueva Director General Centro Nacional de Control de Calidad Dra. Rosa Guevara Ormeo Directora General Centro Nacional de Produccin de Biolgicos O.F. Ricardo Valera Snchez Director General
Miembros Dr. Jorge Alarcn Villaverde Q.F. Zulema Arvalo Chong Dr. Jorge Barnaby Rodrguez Dr. Zuo Burstein Alva Lic. Ivn Gmez-Snchez Prieto Dra. Ivonne Guerrero Alva Dr. Alfredo Guilln Oneeglio Dr. Csar Nquira Velarde Dr. Enrique Prez Ramos Lic. Margarita Rodrguez Gutarra Dr. Vctor Surez Moreno Editor Dr. Leonid Lecca Garca Revisor Dra. Sonia Macedo Aguirre
Portada: Frontis del local central de Instituto Nacional de Salud
MPR - CNSP - 009
Instituto Nacional de Salud
MANUAL DE PROCEDIMIENTOS BACTERIOLOGICO Y SEROLGICO PARA EL DIAGNOSTICO DE LA LEPTOSPIROSIS
ELABORACIN: Manuel Cspedes Zambrano Bilogo Laboratorio de BTS y Leptospiras Centro Nacional de Laboratorios en Salud Pblica Instituto Nacional de Salud Martha Glenny Araujo Bilogo Laboratorio de BTS y Leptospiras Centro Nacional de Laboratorios en Salud Pblica Instituto Nacional de Salud
MPR - CNSP - 009
Catalogacin hecha por el Centro de Documentacin del INS
Cspedes Zambrano, Manuel Manual de procedimientos bacteriolgico y serolgico para el diagnstico de la leptospirosis / Elaborado por Manuel Cspedes Zambrano y Martha Glenny Araujo. -Lima : Ministerio de Salud, Instituto Nacional de Salud, 2002. 53 p. : 30 cm. -- (Serie de Normas Tcnicas; 34) 1. LEPTOSPIROSIS /diagnstico 2. TESTS SEROLOGICOS/normas I. Cspedes Zambrano, Manuel II. Glenny Araujo, Martha III. Instituto Nacional de Salud (Per) IV. Per. Ministerio de Salud
ISBN 9972 857 -26 -3 (O.C.) ISSN 9972 - 857 - 25 5 (N 34) ISSN 1607 - 4904 Hecho el Depsito Legal N 1501012002-3185
Ministerio de Salud, 2002 Av. Salaverry cuadra 8 s/n, Jess Mara, Lima, Per Te1f.: 431-0410 Instituto Nacional de Salud, 2002 Cpac Yupanqui 1400, Jess Mara, Lima, Per Te1f.: 471-9920 Fax 471-0179 e-mail: postmaster@ins.sld.pe Pgina Web: www.ins.sld.p
Publicacin aprobada con R.J. N 250-J-OPD/INS Se autoriza su reproduccin total o parcial siempre y cuando se cite la fuente.
MPR - CNSP - 009
II
CONTENIDO

INTRODUCCION SECCION 1: 1.1 1.2 1.3 1.4 1.5 1.6 SECCION 2: SECCION 3: 3.1 3.2 3.3 3.4 3.5 SECCION 4: 4.1 4.2 4.3 4.4 SECCION 5: 5.1 5.2 5.3 5.4 5.5 5.6 SECCION 6: 6.1 6.2 6.3 6.4 SECCION 7: 7.1 7.2 BIBLIOGRAFIA ANEXO A: ANEXO B: ANEXO C: ANEXO D:
MPR - CNSP - 009
IV 1 1 1 1 1 2 4 5 6 6 8 9 11 12 13 13 13 13 13 14 14 16 17 19 20 23 25 25 27 31 33 40 40 42 45 47 48 49 52
GENERALIDADES Objetivo Campo de aplicacin Responsabilidades Documentos de referencia Definiciones y abreviaturas Condiciones generales para la obtencion y manejo de muestra MEDIDAS DE BIOSEGURIDAD

OBTENCION DE LA MUESTRA Obtencion de muestra de sangre para cultivo Obtencion de muestra de liquido cefaloraquideo para cultivo Obtencion de muestra de orina para cultivo Obtencion de muestra de suero Obtencion de muestras de tejido para cultivo ENVIO Y TRANSPORTE DE LA MUESTRA Objetivo Condiciones generales Procedimiento Criterios para rechazar una muestra
PROCEDIMIENTOS PARA EL DIAGNOSTICO BACTERIOLGICO DE LEPTOSPIRAS Siembra de muestra de sangre Siembra de muestra de liquido cefaloraquideo Siembra de muestra de orina Siembra de muestra de organos Examen directo de leptospiras Examen directo de leptospiras con coloracin rojo de congo PROCEDIMIENTO PARA EL DIAGNOSTICO SEROLGICO DE LA LEPTOSPIROSIS Diagnostico mediante la prueba de macroaglutinacion Diagnostico mediante la prueba de Elisa indirecto IgM Diagnostico mediante la prueba de Elisa indirecto IgG Diagnostico mediante la prueba de microaglutinacion (MAT) IDENTIFICACIN DE LEPTOSPIRAS Identificacion de leptospiras patgenas Serotipificaion de leptospiras patgenas
CINTICA DE LA LEPTOSPIROSIS ESQUEMA PARA EL DIAGNSTICO DE LA LEPTOSPIROSIS MEDIOS DE CULTIVO COLORACIONES

III
Manual de procedimientos bacteriolgico y serolgico para el diagnstico de la leptospirosis Manual de procedimientos bacteriolgico y serolgico para el diagnstico de la leptospirosis
INTRODUCCIN
La leptospirosis es una enfermedad de distribucin mundial y forma parte del grupo de enfermedades zoonticas. El hombre es un husped accidental que se infecta directamente con orina, tejidos, semen y secreciones vaginales de animales infectados, e indirectamente con el agua de lagunas, acequias, ros, charcos y otros, con suelo hmedo y vegetacin contaminada con orina infectada. Los huspedes reservorios son los animales silvestres y domsticos, los que eliminan las leptospiras con la orina por periodos de tiempos variables, dependiendo de la especie animal. La leptospirosis puede ser causada por cualquiera de los ms de 250 serovares de las especies Leptospira alexanderi, Leptospira interrogans, Leptospira borgpetensenii, Leptospira fainei, Leptospira inadai, Leptospira kirschneri, Leptospira meyeri, Leptospira noguchi, Leptospira santarosai y Leptospira weilii. Desde 1947, en el Instituto Nacional de Salud, se iniciaron estudios epidemiolgicos de Leptospirosis en ratas de los desages, gatos, perros y cerdos sacrificados en el camal del Callao, y en el personal del Mercado Central de Lima. A partir de 1962, se intensificaron estos trabajos, principalmente fuera de Lima, efectundose estudios en Tumbes, Ancash, Cajamarca, Arequipa, Amazonas, San Martn, Hunuco, Ayacucho, Loreto y Madre de Dios concluyendo que sta era una enfermedad ocupacional de presentacin espordica producida principalmente por leptospiras del serogrupo Icterohaemorrhagiae. Se aislaron numerosas cepas de Leptospiras, tanto del hombre como de animales domsticos y silvestres, algunos de los cuales fueron nuevos serovares. En 1997, el INS report 11 casos positivos; en 1998, debido a la presencia del fenmeno del Nio, 98 casos; en 1999, 93 casos; en el 2000, 101 positivos; y en el 2001, 113 casos; siendo todos diagnosticados por mtodos serolgicos. El clima hmedo, subtropical y tropical de muchas regiones, la falta de reconocimiento de la enfermedad por el personal de salud, las condiciones socio-econmicas de gran parte de la poblacin especialmente rural, el insuficiente nmero de laboratorios regionales de diagnstico, la existencia de otras enfermedades con caractersticas clnicas similares y la carencia de programas de vacunacin obligatoria de animales domsticos susceptibles, contribuyen a la ocurrencia de Leptospirosis en nuestro pas. En este contexto, el INS en su rol de Centro de Referencia Nacional, ha aprobado el MANUAL DE PROCEDIMIENTOS BACTERIOLOGICO Y SEROLGICO PARA EL DIAGNOSTICO DE LA LEPTOSPIROSIS, cuyo objetivo es establecer y estandarizar estos procedimientos diagnsticos en los establecimientos de salud que desarrollan actividades vinculadas a su manejo y control de la leptospirosis humana. ponemos a disposicin del personal de salud del pas este manual, resultado del esfuerzo de los profesionales del Laboratorio de Leptospirosis y Bacterias de Transmisin Sexual del Instituto Nacional de Salud.
MPR - CNSP - 009
IV
SECCIN 1 GENERALIDADES 1.1 OBJETIVO Establecer los procedimientos para realizar el diagnstico serolgico y bacteriolgico de la leptospirosis.
1.2 Comprende: 1.2.1 1.2.2 1.2.3 1.2.4 1.2.5 1.3 1.3.1
CAMPO DE APLICACIN
Obtencin de muestras de los pacientes Envo de muestras al laboratorio Procedimientos de laboratorio para el diagnstico serolgico de la leptospirosis Procedimientos de laboratorio para el aislamiento e identificacin de leptospiras Control de calidad del diagnstico serolgico de la leptospirosis RESPONSABILIDADES El Centro Nacional de Salud Pblica (CNSP) a travs de su Direccin Ejecutiva de Laboratorios de Referencia (DELARE), es responsable de autorizar la elaboracin, revisin y actualizacin del presente manual, de acuerdo a los procedimientos aprobados por el Instituto Nacional de Salud (INS). Los directores de los establecimientos de salud son responsables de autorizar, proporcionar los recursos necesarios y designar al personal responsable para la aplicacin de las disposiciones contenidas en el presente manual. El personal de los establecimientos de salud, es responsable de planificar las acciones, organizar, controlar y capacitarse para cumplir las disposiciones contenidas en el presente Manual. Los jefes o responsables de los laboratorios deben asegurar el control de calidad interno, la idoneidad del personal, equipos, materiales, reactivos e instalaciones. El personal mdico, tcnico y operativo son responsables de seguir las especificaciones contenidas en el presente manual y aplicar los procedimientos especficos indicados. DOCUMENTOS DE REFERENCIA Instituto Nacional de Salud. Manual de procedimientos de laboratorio para la obtencin y envo de muestras (I). Lima: INS; 1997. Serie de Normas Tcnicas No 15. Instituto Nacional de Salud. Manual de Normas de Bioseguridad. Segunda Edicin, Lima: INS; 1998. Serie de Normas Tcnicas No18.
1.3.2
1.3.3
1.3.4
1.3.5
1.4 1.4.1
1.4.2
MPR - CNSP - 009
1.5 1.5.1 1.5.2
DEFINICIONES Y ABREVIATURAS aerbico: Organismo que metaboliza solamente en presencia de oxgeno molecular. agente infeccioso: Microorganismo (virus, rickettsia, bacteria, hongo, protozoario o helminto) capaz de producir una infeccin. aglutinacin: Reaccin por la que se provoca la agrupacin de partculas, bacterias y clulas suspendidas en un medio lquido. aislamiento: Aplicado a los enfermos, es la separacin de personas o animales infectados, durante el perodo de transmisibilidad de la enfermedad, en lugares y condiciones tales que eviten o limiten la transmisin directa o indirecta del agente infeccioso a personas susceptibles de infectarse. aislamiento primario: Desarrollo inicial de microorganismos a partir de una muestra clnica. antimicrobiano: Agente biolgico o qumico que inhibe el crecimiento de microorganismos. bacteria: Microorganismo unicelular microscpico perteneciente a los procariotes que se multiplica por fisin binaria y carece de clorofila. Se diferencian por la coloracin de Gram. bioseguridad: Conjunto de medidas preventivas para proteger la salud y la seguridad humana y del ambiente frente a diferentes riesgos producidos por agentes biolgicos, fsicos, qumicos o mecnicos. cepa bacteriana: Cultivo puro de bacterias formada por los descendientes de un solo aislamiento. chorro medio de orina: Muestra de orina obtenida despus que el paciente deja discurrir cierta cantidad inicial y luego realiza la colecta en un recipiente. contacto: Cualquier persona o animal cuya asociacin con una persona o animal infectado o con un ambiente contaminado haya creado la posibilidad de contraer la infeccin. contaminacin: Presencia de un agente infeccioso en la superficie del cuerpo, vestimenta, ropa de cama, juguetes, instrumentos quirrgicos, apsitos u otros objetos inanimados o sustancias, inclusive el agua y los alimentos. desinfeccin: Eliminacin de agentes infecciosos que estn fuera del cuerpo por medio de la exposicin directa a agentes qumicos o fsicos. La desinfeccin de alto grado puede destruir todos los microorganismos, con excepcin de un nmero importante de esporas bacterianas, para lo cual se necesita una exposicin ms extensa que asegure su destruccin. desinfectante: Agente qumico utilizado para el proceso de desinfeccin. ELISA: Prueba de ensayo inmunoenzimtico ligado a enzima que se usa para detectar antgenos o anticuerpos. endemia: Presencia contnua de una enfermedad o un agente infeccioso en una zona geogrfica determinada. Tambin puede denotar la prevalencia usual de una enfermedad particular en dicha zona. enfermedad infecciosa: Enfermedad clnicamente manifiesta del hombre o de los animales resultado de una infeccin.
1.5.3
1.5.4
1.5.5 1.5.6 1.5.7
1.5.8
1.5.9 1.5.10
1.5.11
1.5.12
1.5.13
1.5.14 1.5.15 1.5.16
1.5.17
MPR - CNSP - 009
1.5.18
enfermedad transmisible: Cualquier enfermedad causada por un agente infeccioso especfico o sus productos txicos, que se manifiesta por la transmisin del mismo agente o sus productos, de una persona o animal infectados o de un reservorio inanimado a un husped susceptible, de forma directa o indirecta por medio de un husped intermediario. establecimiento de salud: Hospital, clnica, centro de salud o lugar debidamente autorizado y equipado para la atencin de pacientes. esterilizacin: Proceso validado que permite la eliminacin de toda forma de vida microbiana, incluyendo endosporas bacterianas. Puede conseguirse por medio de mtodos qumicos, fsicos o gaseosos. fuente de infeccin: Persona, animal, objeto o sustancia de la cual el agente infeccioso pasa a un husped. infeccin: Penetracin y desarrollo (de mltiples parsitos) o multiplicacin de un agente infeccioso en el organismo de personas o animales. inmunidad: Estado de resistencia que suele provenir de la presencia de anticuerpos o clulas que poseen una accin especfica contra el microorganismo causante de una enfermedad infecciosa o contra su toxina. inculo: Alicuota de una muestra que es transferida a un medio de cultivo limpieza: Es la remocin mecnica de toda materia extraa con el objetivo de disminuir el nmero de microorganismos. Se realiza a travs de arrastre mecnico; sin embargo, no se asegura la eliminacin de stos. medio de cultivo: Medio artificial de sustancias nutritivas que puede ser slido, semislido o lquido, necesario para el crecimiento y multiplicacin de las bacterias in vitro. notificacin de una enfermedad: Comunicacin oficial a la autoridad correspondiente de la existencia de una enfermedad transmisible o de otra naturaleza en humanos o animales. patogenicidad: Caracterstica de un agente infeccioso que rige la extensin o magnitud con la cual se manifiesta una enfermedad en una poblacin infectada o la capacidad del microorganismo para producir enfermedad. perodo de incubacin: Intervalo que transcurre entre la exposicin inicial a un agente infeccioso y la aparicin de sntomas de la enfermedad. En el caso de un vector, es el lapso que media entre el momento en que un microorganismo penetra en el vector y la fecha en que dicho vector transmite la infeccin (perodo de incubacin extrnseco). portador: Persona o animal infectado que alberga un agente infeccioso especfico de una enfermedad, sin presentar signos o sntomas clnicos y que constituye una fuente potencial de infeccin. reconstituir: Restablecer la forma original de una sustancia previamente alterada para su conservacin y almacenamiento, mediante la combinacin con un lquido adecuado. registro: Documento que provee evidencias objetivas de las actividades efectuadas o de los resultados obtenidos.
3 Instituto Nacional de Salud
1.5.19
1.5.20
1.5.21 1.5.22
1.5.23
1.5.24 1.5.25
1.5.26
1.5.27
1.5.28
1.5.29
1.5.30
1.5.31
1.5.32
MPR - CNSP - 009
1.5.33
reservorio (de agentes infecciosos): Cualquier ser humano, animal, artrpodo, planta, suelo o materia (o una combinacin de stos), donde normalmente vive y se multiplica un agente infeccioso, del cual depende para su supervivencia, y donde se reproduce de manera que pueda ser transmitido a un husped susceptible siembra primaria: Inoculacin de una muestra a un medio de cultivo simple, selectivo o de enriquecimiento. sospechoso: Con respecto al control de las enfermedades infecciosas, persona cuya historia clnica y sntomas sugieren que podra tener o estar desarrollando una enfermedad transmisible. susceptible: Cualquier persona o animal que supuestamente no posee suficiente resistencia contra un agente patgeno determinado que lo proteja contra la enfermedad. tasa de prevalencia: Nmero total de personas enfermas o que presentan cierto trastorno en una poblacin especfica y en determinado momento (prevalencia puntual), o durante un perodo predeterminado (prevalencia de perodo), independientemente de la fecha en que comenz la enfermedad o el trastorno, dividido entre la poblacin en riesgo de presentar la enfermedad o el cuadro patolgico en un punto en el tiempo (o en un punto que est a la mitad del perodo en que aparecieron). transmisin de agentes infecciosos: Cualquier mecanismo por virtud del cual un agente infeccioso se propaga de una fuente o un reservorio a una persona. virulencia: Grado de patogenicidad de un agente infeccioso, indicado por las tasas de letalidad o por su capacidad para invadir y lesionar los tejidos del husped o por ambos parmetros. Zoonosis: Infeccin transmisible en condiciones naturales de los animales vertebrados a los humanos. Puede ser enzotica o epizotica. CONDICIONES GENERALES PARA LA OBTENCIN Y MANEJO DE LA MUESTRA Informar al paciente en forma clara y sencilla, de acuerdo a su grado de instruccin, sobre los procedimientos a realizar. Obtener la muestra empleando la tcnica apropiada y teniendo en cuenta el perodo de la enfermedad y el lugar correcto de muestreo, evitando su contaminacin. Obtener suficiente cantidad de muestra para asegurar el aislamiento de la bacteria. Obtener la muestra antes del inicio de la terapia antibacteriana. Si el paciente ya hubiera recibido alguna dosis del antibacteriano, el laboratorio debe ser informado al respecto. Para prevenir riesgos, colocar las muestras en un recipiente secundario apropiado para su transporte al laboratorio. Enviar las muestras al laboratorio para su procesamiento inmediatamente despus de haber sido obtenidas.
1.5.34
1.5.35
1.5.36
1.5.37
1.5.38
1.5.39
1.5.40
1.6 1.6.1
1.6.2
1.6.3 1.6.4
1.6.5
1.6.6
MPR - CNSP - 009
SECCIN 2 MEDIDAS DE BIOSEGURIDAD 2.1 El personal involucrado en los diferentes procesos para el diagnstico serolgico y bacteriolgico de la leptospirosis debe aplicar las medidas de bioseguridad establecidas en el Manual de Normas de Bioseguridad (Serie Normas Tcnicas No18), editado por el Instituto Nacional de Salud. Se deben controlar las medidas necesarias aplicables a: El personal La vestimenta Los ambientes La obtencin de muestras El envo de muestras al laboratorio Los casos de accidentes El laboratorio
2.2 2.2.1 2.2.2 2.2.3 2.2.4 2.2.5 2.2.6 2.2.7
MPR - CNSP - 009
SECCIN 3 OBTENCIN DE LA MUESTRA El xito de los resultados de las pruebas de laboratorio para el diagnstico de leptospirosis depende en gran medida del cuidado que se ponga en la obtencin, transporte y conservacin de las muestras. Estos procedimientos son de mucha importancia para que el laboratorio contribuya eficientemente en el diagnstico bacteriolgico y serolgico de la enfermedad (Anexos A y B). 3.1 3.1.1 OBTENCIN DE LA MUESTRA DE SANGRE PARA CULTIVO Objetivo Sealar las recomendaciones y procedimientos para la obtencin de muestras de sangre para el diagnstico de leptospirosis. 3.1.2 3.1.2.1 Condiciones especficas Para obtener una muestra adecuada es necesario conocer la dinmica de la enfermedad. En la evolucin clnica de la leptospirosis se reconocen dos fases: la primera, corresponde a la fase leptospirmica o septicmica caracterizada por sntomas clnicos variables, que en promedio dura entre 4 a 7 das. Despus de un lapso de quietud de 1 a 3 das, se inicia la segunda fase inmune, con signos o sntomas diversos o se presenta como asintomtica. Durante esta fase las leptospiras pueden excretarse transitoriamente con la orina en los humanos, aunque el hombre no constituye un reservorio. La muestra para el hemocultivo debe obtenerse durante el periodo febril agudo de la fase septicmica (entre el primer y stimo da), antes del inicio de la terapia antibitica. Obtencin de la muestra de sangre mediante uso de tubo al vaco o jeringa Procedimiento: Identificar el tubo al vaco con el nombre completo o cdigo del paciente de quien se obtendr la muestra de sangre. Utilizar un tubo al vaco con anticoagulante: EDTA, heparina u oxalato de sodio. No usar citrato de sodio por su accin inhibitoria de desarrollo de algunos serovares de leptospiras. Extraer 5 mL de sangre venosa y mantener a temperatura ambiente. Remitir la muestra inmediatamente al laboratorio. De no ser posible, se puede mantener la misma por un periodo mximo de 5 das a temperatura ambiente, aunque no es recomendable (Ver Tabla No 1). NOTA: El proceso de transporte de la muestra de sangre con anticoagulante para el aislamiento de la bacteria no se refrigera, se mantiene a temperatura ambiente.
MPR - CNSP - 009 6 Instituto Nacional de Salud
3.1.2.2
3.1.3 3.1.3.1 a.
b.
c. d.
Tabla N 1. Condiciones de toma y envo de muestra para el diagnstico bacteriolgico y serolgico de la leptospirosis
TIPO DE MUESTRA SEROLOGIA Suero agudo PERODO DE TOMA 4 a 10 das del inicio de los sntomas 7 a 30 das despus de la primera toma Entre el 1er al 7mo da (perodo agudo febril de la fase septicmica). 5 a 10 das desde el inicio de los sntomas. 14 -28 despus del inicio de la enfermedad Al practicar la necropsia CANTIDAD 3mL CONDICIN Estril. Enviar congelado o a 4oC
Suero convalesciente AISLAMIENTO Sangre completa
3mL
Igual al suero agudo
5mL
Estril con anticoagulante EDTA. Heparina 2 gotas u oxalato de sodio 0,5 mL de una solucin a 1% a temperatura ambiente. No usar citrato* Estril, enviar a temperatura ambiente dentro de los 4 das de su obtencin. Estril, enviar a temperatura ambiente, dentro de las 2 horas de su obtencin. Estril, enviar a 4 C en recipientes estriles y bien cerrados en un plazo mximo de 6 horas. Para estudios histopatolgicos, enviar 2 mL de cada tejido en 5 mL de formol al 10%.
o
Lquido cefaloraqudeo Orina
0,5 - 1 mL 50 mL
EN CASO DE FALLECIMIENTO Tejido (rin, hgado, mdula, hueso largo y globo ocular)
2 mL
* Enviar inmediatamente al laboratorio. De no ser posible, remitir mximo dentro de los 5 das siguientes.
3.1.4 3.1.4.1 a.
Obtencin de la muestra de sangre venosa para cultivo directo (en pacientes hospitalizados) Consideraciones especficas Tomar la muestra durante el perodo agudo febril (1er - 7mo da de iniciada la enfermedad) de la fase leptospirmica. Solicitar al laboratorio de referencia 4-5 tubos con medio de cultivo los que se mantendrn a temperatura ambiente por 30 minutos antes de la toma de muestra. Realizar el hemocultivo al lado de la cama del paciente Procedimiento Obtener 2-3 mL de sangre venosa con una jeringa de 5 mL (sin anticoagulante). Con ayuda de un mechero de alcohol, flamear la boca de los tubos con medio de cultivo. Inocular 1 gota (aproximadamente 50 L) en el primer tubo, 2 gotas en el segundo y 3 gotas en el tercer y cuarto tubo.
b.
c. 3.1.4.2 a. b. c.
MPR - CNSP - 009
d. e. 3.2 3.2.1
Cerrar las tapas hermticamente y mezclar inclinando los tubos y rotndolos sin agitar. Identificar y remitir inmediatamente al laboratorio en posicin vertical. OBTENCIN DE LA MUESTRA DE LQUIDO CEFALORAQUDEO PARA CULTIVO Objetivo Describir el procedimiento de obtencin de muestras de lquido cefaloraqudeo (LCR) para el diagnstico de leptospirosis.
3.2.2 3.2.2.1
Condiciones especficas El conocimiento de la patognesis de la enfermedad es importante en la seleccin de la muestra clnica apropiada en cada fase de la enfermedad. En pacientes con compromiso menngeo se puede observar y aislar leptospiras de LCR entre los 4 a 10 das despus de iniciada la enfermedad. El LCR es de fcil contaminacin bacteriana, por ello debe procesarse inmediatamente, como mximo a los 4 das de tomada la muestra. No congelar ni refrigerar la muestra. La obtencin de la muestra la debe realizar el mdico de acuerdo a los procedimientos normativos de su institucin. Materiales Algodn Gasa estril Tubo o frasco con tapa rosca estril Guantes de ltex estriles Jeringas estriles de 5 mL Procedimiento Limpiar la piel con alcohol 70% alrededor de la puncin en la columna lumbar. Poner al paciente en posicin fetal y realizar la puncin lumbar con una aguja No 20 especial y extraer aproximadamente 5 mL de LCR en forma asptica. Con un mechero Bunsen, flamear la tapa del frasco o tubo y luego trasvar el LCR de la jeringa. Rotular y transportar la muestra inmediatamente al laboratorio.
3.2.2.2
3.2.2.3 3.2.2.4
3.2.3 3.2.3.1 3.2.3.2 3.2.3.3 3.2.3.4 3.2.3.5 3.2.4 3.2.4.1 3.2.4.2
3.2.4.3 3.2.4.4
MPR - CNSP - 009
3.2.4.5
En el caso de no poder enviarse inmediatamente, mantener la muestra a temperatura ambiente hasta por un perodo mximo de 4 das. Registrar el procedimiento.
3.2.4.6
3.3 3.3.1
OBTENCIN DE LA MUESTRA DE ORINA PARA CULTIVO Objetivo Describir el procedimiento de obtencin de muestras de orina para el diagnstico bacteriolgico de leptospirosis.
3.3.2 3.3.2.1
Condiciones especificas La leptospiruria es debido a la colonizacin de los tbulos renales y se presenta a partir de los 14 a 28 das despus de la infeccin. En pacientes con dieta alcalina y tratados con antibiticos este estado es limitado. Tomar las muestras de orina aspticamente, por coleccin del chorro medio o catter (en pacientes hospitalizados). Para la alcalinizacin de la orina, el paciente debe beber la noche anterior un vaso de agua con una cucharadita de 1 g de bicarbonato de sodio. Una alternativa es tomar una pastilla de acetazolamida en el desayuno del da anterior a la toma de muestra. La orina es un lquido biolgico donde proliferan muy fcilmente las bacterias contaminantes, por lo cual la muestra debe ser procesada dentro de las 2 horas despus de haber sido obtenida. Es necesario protegerla de la luz y mantenerla a temperatura ambiente. Se puede refrigerar a 4oC hasta su procesamiento, (mximo hasta 6 horas) pero no es lo adecuado. Obtencin de la muestra de orina del chorro medio Obtencin de muestras de orina en mujeres Materiales: Guantes de ltex estriles Cinco o ms piezas de gasa estril de tamao adecuado, pudiendo ser de 4 x 4. Jabn Agua tibia estril Frasco estril de boca ancha con tapa de rosca
3.3.2.2
3.3.2.3
3.3.2.4
3.3.3 3.3.3.1 a. -
MPR - CNSP - 009
b. -
Procedimiento: Rotular el frasco con el nombre de la paciente, fecha y hora de obtencin de la muestra. Lavarse las manos con jabn y abundante agua. Preparar una pieza de gasa para la limpieza de los genitales externos humedecindola con agua y una pequea cantidad de jabn. Preparar dos piezas ms de gasa para el enjuague con agua tibia. Separar los labios mayores con dos dedos de una mano y limpiar el rea expuesta pasando de adelante hacia atrs. Descartar la gasa Con otra gasa humedecida, enjuagar el rea de adelante hacia atrs. Repetir el procedimiento con otra gasa. Finalmente secar el rea de adelante hacia atrs con un trozo de gasa seca Mantener separados los labios mayores mientras la paciente empieza a orinar. Luego del chorro inicial, colocar el frasco estril para colectar el chorro medio. Al terminar de orinar, inmediatamente tapar el frasco y limpiar la superficie del mismo. Transportar el frasco con la muestra de orina inmediatamente al laboratorio. Obtencin de muestra de orina en varones Materiales Guantes de ltex Cinco o ms piezas de gasa estril Jabn Agua tibia estril Frasco estril de boca ancha Procedimiento Rotular el frasco con el nombre del paciente, fecha y hora de obtencin de la muestra y el procedimiento a utilizar para su obtencin. Lavarse las manos con jabn y abundante agua.
3.3.3.2 a. b. -
MPR - CNSP - 009
10
Preparar una pieza de gasa con agua y una pequea cantidad de jabn. Preparar dos piezas ms de gasa para el enjuague con agua tibia. Realizar la higiene de los genitales, retraer el prepucio antes de lavar el glande con la gasa humedecida con jabn y descartar la gasa. Enjuagar el glande, usando una gasa hmeda. Repetir el procedimiento con otra gasa. Secar la zona, usando uno o ms piezas de gasa seca. Indicar al paciente que mantenga el prepucio retirado e inicie la miccin directamente en un recipiente (orina para descartar). Despus del chorro inicial, colocar el frasco estril para colectar la muestra del chorro medio. Obtenida la muestra, inmediatamente tapar el frasco y limpiar la superficie del mismo. Transportar el frasco con la muestra de orina inmediatamente al laboratorio. OBTENCIN DE LA MUESTRA DE SUERO Objetivo Describir el procedimiento de obtencin de muestra de suero para el diagnstico serolgico de leptospirosis.
3.4 3.4.1
3.4.2 3.4.2.1
Condiciones especficas Para obtener de una muestra adecuada es necesario conocer la dinmica de enfermedad (ver tem 3.1.2.1). Para un diagnstico acertado de leptospirosis, obligatoriamente se requiere de dos muestras pareadas: una en la fase leptospirmica donde los niveles de anticuerpos son muy bajos, y otra en la fase inmune donde los ttulos de anticuerpos son ms altos. En una infeccin por leptospiras entre la primera y segunda muestra debe haber un incremento del ttulo de anticuerpos de 2 a 4 veces. La toma de la primera muestra se har en la fase aguda o leptospirmica, 4 a 10 das de iniciado los sntomas y la segunda muestra obligatoriamente en la fase convaleciente o inmune, a los 7-30 das posterior a la primera muestra. Mantener en cadena de fro. Obtencin de la muestra de suero Procedimiento Identificar los viales con el nombre completo o cdigo del paciente. Utilizando un tubo al vaco o una jeringa, extraer 5 mL de sangre venosa sin anticoagulante.
3.4.2.2
3.4.2.3
3.4.3 3.4.3.1 a. b.
MPR - CNSP - 009
c.
Colocar la muestra en un tubo estril y dejarlo reposar en plano inclinado por 30 minutos, luego centrifugar a 1500 rpm por 10 minutos. Utilizando una pipeta Pasteur estril, separar el suero y colocar por alcuotas en crioviales, cuidando de no incluir hemates. Conservar en una refrigeradora o en un congelador de -20oC hasta su transporte al laboratorio donde ser procesado. OBTENCIN DE LA MUESTRA DE TEJIDO PARA CULTIVO Objetivo Describir el procedimiento de obtencin de muestra de tejido heptico, cerebral y renal para el diagnstico bacteriolgico de leptospirosis.
d.
e.
3.5 3.5.1
3.5.2 3.5.21
Condiciones Especficas Realizar la toma de la muestra de rganos (rin, hgado y cerebro) en pacientes fallecidos con sospecha de leptospirosis. Los rganos, son un excelente medio de cultivo para la proliferacin bacteriana. Por ello, la muestra debe ser procesada dentro de las 4 horas de su obtencin, mantenindola protegida de la luz y a temperatura ambiente o en refrigeracin a 4oC-8oC (mximo 6 horas) hasta su procesamiento. Materiales Guantes de ltex Cinco o ms piezas de gasa estril Jabn Agua tibia estril Frasco estril de boca ancha Procedimiento Rotular el frasco con el nombre del paciente y la fecha de obtencin de la muestra Una vez realizada la autopsia en forma estril, cortar con un bistur una pequea porcin de hgado, cerebro y rin y traspasarlo en un frasco de boca ancha Obtenida la muestra, inmediatamente tapar el frasco y limpiar la superficie del mismo Transportar el frasco con la muestra hacia el laboratorio
3.5.2.2
3.5.3 3.5.3.1 3.5.3.2 3.5.3.3 3.5.3.4 3.5.3.5 3.5.4 3.5.4.1 3.5.4.2
3.5.4.3 3.5.4.4
MPR - CNSP - 009
SECCIN 4 ENVO Y TRANSPORTE DE LA MUESTRA 4.1 OBJETIVO Describir los procedimientos y condiciones para la conservacin y transporte de las muestras al laboratorio. 4.2 CONDICIONES ESPECFICAS Las muestras deben ser mantenidas y conservadas con sus caractersticas lo ms cercanas a su estado originario, debiendo evitarse temperaturas extremas, pH extremos o desecamientos excesivos. 4.3 4.3.1 4.3.2 4.3.3 PROCEDIMIENTO Para transportar las muestras al laboratorio deben colocarse en un envase secundario, de material resistente a roturas o filtraciones. Todas las muestras son enviadas al laboratorio lo ms pronto posible (Ver Tabla No 1). En caso sea necesario transferir las muestras a otros laboratorios. Los responsables de su envo eligirn el sistema de embalaje apropiado para la conservacin de las muestras durante el tiempo que demanda el transporte hasta llegar al laboratorio. CRITERIOS PARA RECHAZAR UNA MUESTRA Controlar la hoja de pedido y etiqueta de la muestra, verificando la informacin esencial. Antes de rechazar una muestra debido a una informacin inapropiada o incompleta, debe establecerse contacto con la persona responsable para efectuar las correcciones necesarias. Es necesario seguir estrictamente los procedimientos descritos. La muestra obtenida puede ser rechazada por el personal de laboratorio de acuerdo a los siguientes criterios: No indicar tipo de muestra o procedencia Inadecuada temperatura de transporte Demora en el envo al laboratorio Medio de transporte inadecuado Muestra sin rotular o mal rotulada Recipiente inadecuado (por ejemplo, con rajaduras) Muestra con contaminacin obvia Volumen inadecuado En casos de muestras rechazadas, el personal de laboratorio debe explicar al mdico solicitante las razones y observaciones en la ficha de solicitud de diagnstico correspondiente.
4.4 4.4.1 4.4.2 4.4.3 4.4.3.1 4.4.3.2 4.4.3.3 4.4.3.4 4.4.3.5 4.4.3.6 4.4.3.7 4.4.3.8 4.4.4
MPR - CNSP - 009
SECCIN 5 PROCEDIMIENTOS PARA EL DIAGNSTICO BACTERIOLGICO DE LEPTOSPIRAS Las leptospiras son bacterias exigentes que requieren para su crecimiento condiciones nutricionales adecuados y ser incubado en condiciones de aerobiosis, pH y temperatura ptimos. Las leptospiras requieren medios que contengan suero albmina bovina fraccin V, pudiendo alternativamente utilizarse medios que contengan 8-10% de suero de conejo. El diagnstico de laboratorio de leptospirosis ser exitoso, si la muestras clnicas son las apropiadas y han sido obtenidas en el perodo apropiado, dependiendo de la fase de la enfermedad en que se encuentra el paciente (Anexos A y B). 5.1 5.1.1 SIEMBRA DE LA MUESTRA DE SANGRE (HEMOCULTIVO) Objetivo Describir el procedimiento para la siembra de muestra de sangre total para el diagnstico bacteriolgico de infeccin por leptospiras. 5.1.2 5.1.2.1 5.1.2.2 5.1.2.3 5.1.2.4 5.1.2.5 5.1.2.6 5.1.2.7 5.1.2.8 5.1.2.9 5.1.2.10 5.1.2.11 5.1.2.12 a. b.
MPR - CNSP - 009
Materiales y equipos Cabina flujo laminar Estufa de 28oC-30oC Mechero Bunsen Propipeta o pipeteador automtico Microscopio de campo oscuro Pipeta Pasteur Jeringas descartables Lminas porta-objetos Laminillas cubre-objetos Guantes de ltex Contenedor de material contaminado Medios de cultivo: Tubo con medio semislido Fletcher Tubo con medio EMJH
5.1.3 5.1.3.1
Procedimiento Mantener la muestra a temperatura ambiente durante el transporte hasta su procesamiento, por un perodo mximo de 5 das despus de su obtencin. Los cultivos deben realizarse en una cabina de bioseguridad o cerca de un mechero Bunsen. Los medios deben mantenerse a temperatura ambiente 30 minutos antes de realizar los cultivos. los tubos debern rotularse con el nombre o cdigo del paciente y la fecha. Se emplearn 4 6 tubos por paciente. Tomar el tubo que contiene la sangre con anticoagulante, sacar el tapn y flamear la boca con el mechero Bunsen. Tomar aproximadamente 1 mL de muestra de sangre con una pipeta pasteur estril ayudado por una propipeta, luego volver a tapar el tubo que contiene la muestra. Abrir la tapa del tubo que contiene el medio y flamear la boca, inocular 1 o 2 gotas de sangre en la parte central del medio, volver a flamear la boca, tapar el tubo y colocarlos en una gradilla sin agitar. Realizar el mismo procedimiento para los otros tubos con medio. Concluda la siembra y colocados los tubos sembrados en una gradilla, incubar los tubos con medio EMJH o Fletcher a 28oC-30oC, en condiciones aerbicas por 4-8 semanas. Registrar en el protocolo las fechas de siembra y las observaciones subsecuentes. Lectura Trabajar en una cabina de bioseguridad o cerca del mechero de Bunsen. Controlar los cultivos cada 5-7 das, transfiriendo 1-2 gotas del cultivo sobre una lmina porta-objeto, limpia y sin ralladuras, cubrir con una laminilla y observar al microscopio de campo oscuro con objetivo de 40X. Observar por lo menos 5 preparaciones de cada cultivo. Si se observa la presencia de leptospiras, microorganismos muy mviles, tanto en el medio lquido o semislido, realizar el subcultivo en 2 tubos con nuevo medio para la conservacin de la cepa e identificacin posterior. Incubar los cultivos originales y los subcultivos por 7 das a 28oC-30oC Si los hemocultivos son negativos, seguir incubando y controlando cada 7 das hasta 4-8 semanas antes de descartar como negativa la muestra. Si el volumen inicial es pequeo, se puede agregar nuevo medio de cultivo.
5.1.3.2 5.1.3.3 5.1.3.4
5.1.3.5
5.1.3.6
5.1.3.7
5.1.3.8 5.1.3.9
5.1.3.10 5.1.4 5.1.4.1 5.1.4.2
5.1.4.3
5.1.4.4 5.1.4.5
MPR - CNSP - 009
15
5.1.5 5.1.5.1 5.1.5.2
Interpretacin La presencia de leptospiras indica la positividad del caso. Generalmente, el aislamiento de otras bacterias indica que la muestra se contamin durante el procedimiento de toma de muestra o siembra en los medios. El no aislamiento de leptospiras posterior a las ocho semanas de realizado la siembra, nos puede indicar que el paciente no estuvo con leptospirosis o la muestra se tom en un perodo no adecuado posterior a la leptospiremia. El crecimiento de leptospiras en un medio semislido, es usualmente caracterstico por la aparicin de un disco visible que se forma por debajo de 1-3 cm de la superficie, el cual contiene una gran cantidad de leptospiras. Sin embargo, la ausencia del disco no indica necesariamente la ausencia de leptospiras (Figura N 1).
5.1.5.3
5.1.5.4
Figura N 1. Cultivo positivo de leptospiras en medio EMJH
5.1.5.5
Para observar el desarrollo macroscpico en el medio lquido, caracterizado por la opalescencia nube, agitar suavemente el cultivo y observar a travs de la luz natural o artificial. La presencia de sedimento o turbidez indica que el cultivo est contaminado. SIEMBRA DE LA MUESTRA DE LQUIDO CEFALORAQUDEO Objetivo Describir los procedimientos para el cultivo de muestra de LCR para el diagnstico bacteriolgico de infeccin por leptospiras.
5.2 5.2.1
5.2.2 5.2.2.1 5.2.2.2 5.2.2.3 5.2.2.4

MPR - CNSP - 009
Materiales y equipos Cabina flujo laminar Estufa de 28oC-30oC Mechero Bunsen Propipeta o pipeteador automtico
5.2.2.5 5.2.2.6 5.2.2.7 5.2.2.8 5.2.2.9 5.2.2.10 5.2.2.11 5.2.2.12 a. b. 5.2.3 5.2.3.1
Microscopio de campo oscuro Pipeta Pasteur Jeringas descartables Lminas porta objetos Laminillas cubre objetos Guantes de ltex Contenedor de material contaminado Medios de cultivo Tubo con medio semislido Fletcher Tubo con medio EMJH Procedimiento Mantener la muestra a temperatura ambiente durante el transporte hasta su procesamiento por un perodo mximo de 4 das despus de tomada la muestra. Los cultivos deben realizarse en una cabina de bioseguridad o cerca de un mechero Bunsen. Mantener los medios a temperatura ambiente 30 minutos antes de realizar los cultivos. Rotular los tubos con el nombre o cdigo del paciente y la fecha. Se emplearn 4 6 tubos por paciente. Tomar el frasco que contiene la muestra de LCR, abrir la tapa del frasco y flamear la boca con el mechero Bunsen. Tomar la muestra con una pipeta de 5 mL estril ayudado por un pipeteador automtico aproximadamente 3 mL, luego tapar el frasco con la muestra. Abrir la tapa del tubo que contiene el medio y flamear la boca, luego inocular en el tubo con medio 0,5mL de LCR, cerrar el tubo y colocarlo sin agitar en una gradilla. Realizar el mismo procedimiento para los otros tubos con medio Incubar a 28oC-30oC en condiciones aerbicas por 4-8 semanas Lectura Seguir instrucciones segn tem 5.1.4
5.2.3.2 5.2.3.3 5.2.3.4
5.2.3.5
5.2.3.6
5.2.3.7
5.2.3.8 5.2.3.9 5.2.4 5.2.4.1
MPR - CNSP - 009
17
5.2.5 5.2.5.1 5.3 5.3.1
Interpretacin Seguir instrucciones segn tem 5.1.5 SIEMBRA DE LA MUESTRA DE ORINA Objetivo Describir los procedimientos para la siembra de muestra de orina para el diagnstico bacteriolgico de infeccin por leptospiras.
5.3.2 5.3.2.1 5.3.2.2 5.3.2.3 5.3.2.4 5.3.2.5 5.3.2.6 5.3.2.7 5.3.2.8 5.3.2.9 5.3.2.10 5.3.2.11 5.3.2.12 5.3.2.13 a. b. 5.3.3 5.3.3.1
Materiales y equipos Cabina flujo laminar Estufa de 28oC - 30oC Centrfuga Mechero Bunsen Propipeta o pipeteador automtico Microscopio de campo oscuro Pipeta pasteur Jeringas descartables Lminas porta-objetos Laminillas cubre-objetos Guantes de ltex Contenedor de material contaminado Medios de cultivo: Tubo con medio semislido Fletcher Tubo con medio EMJH Procedimiento Mantener la muestra a temperatura ambiente durante su transporte hasta su procesamiento por un periodo mximo de 2 horas despus de tomada la muestra o refrigerado a 4oC por un perodo mximo de 6 horas, aunque no es lo adecuado.
MPR - CNSP - 009
5.3.3.2 5.3.3.3 5.3.3.4
Los medios deben mantenerse a temperatura ambiente 30 minutos antes de realizar la siembra. Rotular los tubos con nombre o cdigo del paciente y la fecha. Se emplearn 4 o 6 tubos por paciente. Traspasar la muestra de orina a tubos de vidrio (13 mL) y luego centrifugar a 3000 rpm por 10 minutos, eliminar el sobrenadante y resuspender el sedimento con 1 mL de buffer fosfato salino pH 7,4 o solucin salina fisiolgica a 0,9%. A partir del sedimento resuspendido, realizar diluciones sucesivas hasta 1:10 000. Sembrar 0,5 mL de la resuspensin en 4,5 mL de medio EMJH o Fletcher que contiene el antibitico 5-fluorouracil (100-200 mg/mL) de este primer tubo (dilucin 1:10) sembrado, extraer 0,5mL y sembrar en un tubo que contiene 4,5 mL de medio. De este segundo tubo (dilucin 1:100), extraer 0,5 mL y sembrar en un tubo con 4,5 mL de medio. Realizar este procedimiento hasta que la dilucin final de la orina sea 1:10 000. Concluda la siembra, colocar los tubos sembrados en una gradilla e incubar a 28oC-30oC, en condiciones aerbicas por 4-8 semanas. Lectura Seguir instrucciones segn tem 5.1.4 Interpretacin Generalmente, la muestra de orina tiende a contaminarse y acidificarserpidamente. Por ello, es importante realizar el cultivo en el menor tiempo posible despus de colectado la muestra. Seguir instrucciones segn tem 5.1.5 SIEMBRA DE LA MUESTRA DE UN ORGANO Objetivo Describir los procedimientos para la siembra de muestra de rin, hgado y cerebro para el diagnstico bacteriolgico de infeccin por leptospiras.
5.3.3.5 5.3.3.6
5.3.3.7
5.3.4 5.3.4.1 5.3.5 5.3.5.1
5.3.5.2 5.4 5.4.1
5.4.2 5.4.2.1 5.4.2.2 5.4.2.3 5.4.2.4 5.4.2.5
Materiales y Equipos Cabina flujo laminar Estufa de 28o-30oC Mechero Bunsen Morteros Propipeta o pipeteador automtico
MPR - CNSP - 009
19
5.4.2.6 5.4.2.7 5.4.2.8 5.4.2.9 5.4.2.10 5.4.2.11 5.4.2.12 5.4.2.13 a. b. 5.4.3 5.4.3.1
Microscopio de campo oscuro Pipeta Pasteur Jeringas descartables Lminas porta-objetos Laminillas cubre-objetos Guantes de ltex Contenedor de material contaminado Medio de Cultivo Tubo con medio semislido Fletcher Tubo con medio EMJH Procedimiento Mantener la muestra a temperatura ambiente durante su transporte hasta su procesamiento por un perodo mximo de 4 horas despus de tomada la muestra o refrigerado de 4oC-8oC por un perodo mximo de 6 horas. Los medios deben mantenerse a temperatura ambiente 30 minutos antes de realizar la siembra. Rotular los tubos con nombre o cdigo del paciente y la fecha. Se emplarn 4 o 6 tubos por paciente. Trasvasar la muestra a un mortero, luego realizar un macerado con arena lavada y estril, hacer un machacado del rgano, agregar 2 mL de PBS y absorber la suspensin y pasarlo a un tubo con PBS de 5 mL, luego se mezcla enrgicamente y se deja reposar en posicin vertical. A partir del sobrenadante, extraer 0,5 mL y sembrar en 4,5 mL de medio EMJH o Fletcher. Repetir este mismo procedimiento para tres tubos ms. Concluida la siembra, colocar los tubos sembrados en una gradilla e incubar a 28oC-30oC en condiciones aerbicas por 4-8 semanas. Lectura Seguir instrucciones segn tem 5.1.4 Interpretacin Seguir instrucciones segn tem 5.1.5
5.4.3.2 5.4.3.3 5.4.3.4
5.4.3.5
5.4.3.6
5.4.4 5.4.4.1 5.4.5 5.4.5.1

MPR - CNSP - 009
5.5 5.5.1
EXAMEN DIRECTO DE LEPTOSPIRAS Objetivo Describir los procedimientos para la observacin en microscopio de campo oscuro de muestras de sangre, LCR, orina y tejidos para el diagnstico presuntivo bacteriolgico de infeccin por leptospiras.
5.5.2 5.5.2.1
Condiciones generales Morfolgicamente, los diferentes serovares de leptospiras patgenas o saprofitas observados al microscopio de campo oscuro o en coloraciones son idnticos. Las leptospiras son microorganismos helicoidales, flexibles, con las espiras estrechamente unidas, semejando un collar de perlas, con una longitud de 6 a 20 m y aproximadamente 0,1 m de dimetro. Ambos extremos terminan en semigancho, rara vez se observan rectos y son muy mviles. El microscopio electrnico revela la presencia de dos endoflagelos periplasmticos insertados subterminalmente en cada extremo del cilindro protoplasmtico y sus extremos libres de cada endoflagelo se extiende hacia el centro de la clula. Una membrana externa cubre ambas estructuras. La observacin directa de leptospiras al campo oscuro en muestras clnicas de sangre, LCR, orina y tejidos requiere de destreza y experiencia, debido a su mnima concentracin en estas muestras. El examen directo al microscopio de campo oscuro no debe ser usado como nico procedimiento de diagnstico, sino como un mtodo auxiliar. Materiales y equipos Mechero Bunsen Propipeta o pipeteador automtico Microscopio de campo oscuro Pipeta pasteur Lminas porta-objetos Laminillas cubre-objetos Guantes de ltex Contenedor de material contaminado Procedimiento En sangre Se realizar despus del procedimiento de cultivo sealado en el tem 5.1.3. Centrifugar la sangre con anticoagulante a 500 rpm durante 15 minutos para remover los elementos celulares sanguneos.
5.5.2.2
5.5.2.3
5.5.3 5.5.3.1 5.5.3.2 5.5.3.3 5.5.3.4 5.5.3.5 5.5.3.6 5.5.3.7 5.5.3.8 5.5.4 5.5.4.1 a. b.
MPR - CNSP - 009
c.
Transferir el sobrenadante a otro tubo y centrifugar a 1500 rpm durante 30 minutos, a fin de incrementar el nmero de leptospiras. Descartar el sobrenadante, transferir con una micropipeta con punta estril aproximadamente 100 L (1-2 gotas) del sedimento a una lmina porta-objeto de 1-2 mm de dimetro limpia y sin ralladuras, y cubrir con una laminilla de 22 mm. Observar aproximadamente 50 campos con objetivo de 40X al microscopio de campo oscuro. En LCR Se realizar despus del procedimiento de cultivo sealado en el tem 5.2.3. Centrifugar la muestra a 1500 rpm por 30 minutos. Repetir los pasos de acuerdo al tem 5.5.4.1.c-d En orina Se realizar despus del procedimiento de cultivo sealado en el tem 5.3.3. Centrifugue la muestra a 1500 rpm por 30 minutos Repetir los pasosde acuerdo al tem 5.5.4.1.c-e En rganos Se realizar despus del procedimiento del cultivo sealado en el tem 5.4.3. Centrifugar lasuspensin a 500 rpm durante 15 minutos para remover los elementos celulares. Repetir los pasos de acuerdo al tem 5.5.4.1.c-e Lectura Realizar la lectura de cada lmina, buscando leptospiras en aproximadamente 50 campos del microscopio de campo oscuro. La evaluacin consiste en observar en una gota de cada muestra en microscopio de campo oscuro leptospiras y ver sus caractersticas morfolgicas y de motilidad. Interpretacin La presencia de leptospiras en cualquiera de las muestras indica la positividad del caso. La orina puede contener algunas bacterias, pero la presencia de microorganismos en LCR, sangre y tejidos indica la contaminacin durante el procedimiento de la toma de muestra o transporte de la misma. En el examen de muestras de sangre al microscopio de campo oscuro, se debe diferenciar las leptospiras mviles de elementos como fibrillas o extrusiones celulares, que poseen movimiento browniano.
d.
e. 5.5.4.2 a. b. c. 5.5.4.3 a. b. c. 5.5.4.4 a. b. c. 5.5.5 5.5.5.1
5.5.5.2
5.5.6 5.5.6.1 5.5.6.2
5.5.6.3
MPR - CNSP - 009
5.5.6.4 5.5.6.5 5.5.6.6
La concentracin de leptospiras en sangre y LCR es mnima. Sin embargo, no observar espiroquetas no significa que en la muestra completa no estn presentes. En el machacado de rganos como rin e hgado es posible observar mayor nmero de leptospiras. El diagnstico presuntivo por observacin directa al microscopio de campo oscuro debe ser necesariamente confirmado y correlacionado con los hallazgos en el cultivo y los resultados serolgicos. EXAMEN DIRECTO DE LEPTOSPIRAS CON COLORACIN ROJO DE CONGO Objetivo Describir los procedimientos para la coloracin rojo de congo de muestras de LCR, rganos y orina para el diagnstico bacteriolgico directo de infeccin por leptospiras.
5.6 5.6.1
5.6.2
Condiciones generales Morfolgicamente los diferentes serotipos de leptospiras en el examen directo por la coloracin rojo de congo son indistinguibles, estas bacterias son helicoidales aproximadamente de 0,1 m de dimetro, 6-20 m de largo y usualmente en los extremos presentan la forma de un semigancho.
5.6.3 5.6.3.1 5.6.3.2 5.6.3.3 5.6.3.4 5.6.3.5 5.6.3.6 5.6.3.7 5.6.3.8 5.6.3.9 5.6.3.10 5.6.4 5.6.4.1 a.
Materiales y equipos Set para coloracin rojo de congo Mechero Bunsen Propipeta o pipeteador automtico Microscopio de campo oscuro Microscopio de campo claro Pipeta pasteur Lminas porta-objetos Laminillas cubre objetos Guantes de ltex Contenedor de material contaminado Procedimiento En LCR Despus de haber realizado el procedimiento del cultivo de LCR de acuerdo al tem 5.2.3, extraer con una pipeta pasteur estril aproximadamente 100 L de LCR del frasco y traspasarlo a tres lminas porta-objetos, colocando una gota de LCR por lmina.
MPR - CNSP - 009
b. c. d. e. f. 5.6.4.2 a.
Seguidamente, en la lmina al lado de la muestra poner una gota de una solucin acuosa de rojo de Congo 2%. Mezclar con una platina la muestra con el colorante y realizar un extendido similar a un frotis para hemograma. Secar a temperatura ambiente por 30 minutos Cubrir la lmina con una solucin alcohol y cido clorhdrico a 10N hasta adquirir una coloracin azl. Examinar con objetivo de inmersin. En Orina Despus de haber realizado el procedimiento del cultivo de orina de acuerdo al item 5.3.3, extraer con una pipeta Pasteur estril aproximadamente 100 L de sedimento de orina y traspasarlo a tres lminas porta objetos (una gota de sedimento de orina por lmina). Realizar los pasos de acuerdo al tem 5.6.4.1. b-f. En rganos Despus de haber realizado el procedimiento del cultivo de acuerdo al item 5.4.3, extraer con una pipeta pasteur estril aproximadamente 100 L de sedimento de rgano y traspasarlo a tres lminas porta-objetos (una gota de sedimento de rgano por lmina). Realizar los siguientes pasos de acuerdo al tem 5.6.4.1. b-f. Lectura Realizar la lectura de cada lmina buscando leptospiras. La evaluacin consiste en observar un frotis de cada muestra en microscopio de campo claro con un objetivo de inmersin en la bsqueda de leptospiras y sus caractersticas morfolgicas. Interpretacin Las espiroquetas aparecen inmviles e incoloras en fondo azul. La presencia de leptospiras en cualquiera de las muestras indica la positividad del caso. Generalmente, la presencia de otras bacterias en la orina es normal, pero en LCR, y rganos indica que la muestra se contamin durante el procedimiento de toma de muestra o transporte de la muestra. La observacin de las muestra de sangre con esta coloracin de rojo de Congo no es aplicable. La concentracin de leptospiras en LCR en muchos casos, es mnima. No observar leptospiras no significa que las bacterias estn ausentes. En el machacado de rganos como el rin e hgado se pueden observar mayor nmero de leptospiras. El diagnstico presuntivo por observacin con coloracin de congo debe confirmarse y correlacionarse con los hallazgos en el cultivo y por los resultados serolgicos.
b. 5.6.4.3 a.
c. 5.6.5 5.6.5.1 5.6.5.2 5.6.6 5.6.6.1 5.6.6.2 5.6.6.3 5.6.6.4 5.6.6.5 5.6.6.6 5.6.6.7
MPR - CNSP - 009
24
SECCIN 6 PROCEDIMIENTO PARA EL DIAGNSTICO SEROLGICO DE LEPTOSPIRAS El diagnstico presuntivo precoz, tanto de la forma leve de tipo catarral o de la forma ictrica severa es esencial para evitar los daos patolgicos subsecuentes en el paciente. La seleccin y uso de las pruebas convenientes para el diagnstico de laboratorio dependen del conocimiento del curso de la enfermedad. El diagnstico definitivo se basa en el aislamiento de la espiroqueta de muestras de sangre, LCR y orina; aunque debido al desarrollo lento y las pocas posibilidades de aislamiento (del 1-3 %), inicialmente se emplean mtodos serolgicos, complementndose con el diagnstico bacteriolgico (Anexos A y B). En la leptospirosis los anticuerpos son detectados a partir de 5-10 das de iniciado los sntomas de la enfermedad. Cuando la primera muestra es tomada en la primera semana de la enfermedad, es importante obtener una segunda muestra despus de 1-3 semanas para ver el incremento del ttulo de anticuerpos. La seroconversin indica que es una infeccin producida por leptospiras. Los anticuerpos que predominan inicialmente en la leptospirosis son de tipo IgM y luego IgG, estos pueden ser detectados por diferentes mtodos: fijacin de complemento y hemoaglutinacin. Estas pruebas usan antgenos gnero-especfico obtenidos por diferentes mtodos. Otros mtodos actuales son las pruebas de ELISA, pero todo resultado positivo por esta prueba necesariamente debe confirmarse con la prueba de aglutinacin microscpica (MAT).
6.1
DIAGNSTICO MEDIANTE LA PRUEBA DE MACRO AGLUTINACIN
6.1.1
Objetivo Describir el procedimiento para la realizacin de la prueba de aglutinacin macroscpica con suero, para el diagnstico serolgico de la leptospirosis humana y animal.
6.1.2
Condiciones generales La prueba de aglutinacin macroscpica para el diagnstico de leptospirosis es similar a la prueba en placa para brucelosis. El antgeno que se usa es una suspensin densa de leptospiras, preparada a partir de un serovar patgeno y que ha sido tratado por mtodos fsicos con la finalidad que exprese la mayor cantidad de sitios antignicos de la bacteria y pierda la especificidad del serogrupo. Esta prueba ha sido elaborada y estandarizada en el Instituto Nacional de Salud y se usa como tamizaje para el diagnstico serolgico de la leptospirosis en humanos y animales.
6.1.3 6.1.3.1 6.1.3.2 6.1.3.3 6.1.3.4
Materiales y equipos Kit de aglutinacin macroscpica Micropipetas rango graduable: 2-20 l, 10-100 l y 100-1000 l Reloj Puntas para micropipetas
25
MPR - CNSP - 009
6.1.3.5 6.1.3.6 6.1.3.7 6.1.3.8 6.1.3.9 6.1.4 6.1.4.1 6.1.4.2
Lminas para aglutinaciones Rotador de 125 rpm Solucin salina fisiolgica 0,85% (SSF) Buffer fosfato salino(PBS) pH 7,4 Contenedor de material contaminado Procedimiento Mantener a temperatura ambiente la muestra y los reactivos del kit 15 minutos antes de realizar la prueba. Incluir en cada corrida un control positivo (suministrado por el Kit) y un control negativo (para lo cual se puede usar la SSF o PBS) Agregar 30 l de SSF o PBS a la lmina, tomar el criovial que contiene el suero, extraer 30 l, agregar una gota de SSF o PBS (dilucin 1:2) que se encuentra en la placa y mezclar. Tomar 30 l de la dilucin 1:2 y poner en el primer cuadrante de la lmina, en el siguiente cuadrante aadir 30 l del control positivo en el siguiente 30 l del control negativo que es SSF o PBS. Aadir seguidamente 30 l de antgeno a cada cuadrante y mezclar bien con una paletita. Someter la lmina a movimientos rotatorios manualmente durante 5 minutos. Si se contara con un rotador elctrico, colocar la lmina sobre ella y hacerla rotar por 5 minutos a 125 rpm. Lectura (Ver Figura N 2) Realizar la observacin inmediatamente con auxilio de una fuente luminosa indirecta sobre un fondo oscuro y comparando con los controles positivo y negativo. La presencia evidente de una aglutinacin densa en un medio ms o menos limpio indica positividad. La ausencia de aglutinacin en un medio opalescente indica una reaccin negativa.
6.1.4.3
6.1.4.4
6.1.4.5 6.1.4.6 6.1.4.7 6.1.5 6.1.5.1
6.1.5.2 6.1.5.3
Positivo
Negativo
Figura N 2. Reaccin de la prueba de macroaglutinacin con suero positivo y negativo
MPR - CNSP - 009
26
6.1.6 6.1.6.1
Interpretacin Los sueros que resultaron negativos a esta prueba debern ser diluidos 10 veces con SSF o PBS y ser probados nuevamente. Los sueros contaminados pueden indicar una reaccin falsa y confundir en la interpretacin del resultado. Los resultados dudosos deben ser repetidos con un suero nuevo despus de una semana. La presencia de anticuerpos residuales debido a una infeccin pasada puede dar resultados falsos positivos. En la fase temprana predominan los anticuerpos aglutinantes a lipopolisacridos de membrana tipo IgM, luego estos tienden a disminuir y aparecen los IgG, que pueden persistir por meses o aos. La especificidad de esta prueba es limitada en comparacin con la prueba MAT. Todos los resultados positivos obtenidos con esta prueba necesitan una confirmacin por MAT. DIAGNSTICO MEDIANTE LA PRUEBA DE ELISA INDIRECTO IgM Objetivo Describir el procedimiento para la realizacin de la prueba de ELISA indirecto IgM en suero para el diagnstico de la leptospirosis humana en la fase temprana de la enfermedad.
6.1.6.2 6.1.6.3 6.1.6.4
6.1.6.5 6.1.6.6 6.2 6.2.1
6.2.2 6.2.2.1
Condiciones generales El mtodo de ELISA es usado como una prueba adicional o como una alternativa a la prueba de MAT. Es el mtodo ms usado para detectar leptospirosis precoz. Los anticuerpos de tipo IgM son los que se presentan en una reciente infeccin y estas se pueden detectar especficamente por ELISA. Se han desarrollado una gran variedad de ELISAs y comparndolos con la prueba MAT mostraron una concordancia muy alta. Usando un solo antgeno o pool de antgenos en la prueba de ELISA se pueden determinar anticuerpos IgM frente a varios serovares antignicamente relacionados. Los sueros positivos deben ser confirmados por MAT. Esta prueba es aplicable en diferentes zonas y a temperaturas diferentes, ya que los reactivos son estables por largos perodos. Los anticuerpos contra leptospira en el suero, se combinan con el antgeno de leptospira (antgeno total) fijado a la superficie de los micropocillos de poliestireno. El suero residual es removido por medio de lavados y luego es aadido el conjugado anti-humano IgM ligado a una enzima (peroxidasa). Posterior a la incubacin, los micropocillos son lavados y se aade el sustrato (perxido de hidrgeno) ms un cromgeno. El sustrato es hidrolizado por la enzima y el cromgeno vara de color, la reaccin se detiene por la adicin de una solucin de pare. La intensidad de color est directamente relacionado con la concentracin de anticuerpos contra leptospira presentes en la muestra.
6.2.2.2
6.2.2.3
6.2.2.4
MPR - CNSP - 009
27
6.2.3 6.2.3.1 6.2.3.2 6.2.3.3 6.2.3.4 6.2.3.5 6.2.3.6 6.2.3.7 6.2.3.8 6.2.3.9 6.2.3.10 6.2.3.11 6.2.3.12 6.2.3.13 6.2.4 6.2.4.1
Materiales y equipos kit de ELISA IgM Lector de microplacas Lavador de microplacas Estufa de 37oC Micropipetas rango graduable : 2-20l, 10-100 l y 100-1000l Micropipeta multicanal 30-300 l Reloj Potencimetro Rotador o Shaker Puntas para micropipetas Buffer fosfato salino(PBS) pH 7,4 Tween 20 Contenedor de material contaminado Procedimiento El antgeno de leptospiras producido se guarda a -70oC. Su uso en la prueba se calcula de acuerdo a la cantidad de placas que se desea impregnar. Descongelar el antgeno y diluir (1:16) con buffer fosfato salino pH 7,4. Una vez diluido, agregar 100 l del antgeno a cada pocillo de la microplaca e incubar durante 18-20 horas en refrigeracin entre 4oC-8oC. Lavar 6 veces con buffer de lavado (PBS y Tween 20 a 0,05%), cada vez con 300 l de buffer por pocillo. Agregar a cada pocillo 200 l de una solucin bloqueante (5% de Skin Milk diludo en PBS y Tween 20 a 0,05%), incubar por una hora a 37oC y 6 veces la placa con buffer de lavado (cada vez con 300 l de buffer). Guardar a la microplaca 20oC dentro de una bolsa con absorbente hasta su uso. Mantener la muestra y los reactivos del kit por 15 minutos a temperatura ambiente antes de realizar la prueba.
28
6.2.4.2 6.2.4.3
6.2.4.4
6.2.4.5
6.2.4.6 6.2.4.7
MPR - CNSP - 009
6.2.4.8
Los controles positivo, negativo y calibradores de corte se encuentran prediluidos (1:10) con un preservante. Diluir los controles 1:10 (20l) con diluyente de suero (180 l) (un positivo, dos calibradores y un negativo) en tubos de dilucin. Diluir las muestras 1:100(5 l) con el diluyente de suero(495l). Agregar 100l a cada pocillo de cada dilucin de controles y muestras e incubar por 30 minutos a 37oC. Lavar 6 veces con PBS y Tween 20 a 0,05%, cada vez con 300l de buffer por pocillo. Agregar 100 l de conjugado anti-humano IgM en cada pocillo de la microplaca e incubar por 30 minutos a 37oC. Lavar 6 veces con PBS y Tween 20 a 0,05%, cada vez con 300l de buffer por pocillo. Agregar 100 l de sustrato ABTS a cada pocillo e incubar a 37 C por 30 minutos. Terminado la incubacin, agregar 100l de SDS a 1% (reactivo de pare). Lectura (Figura N 3) Realizar la lectura en un lector de microplacas a 405 nm. Para realizar la observacin visual de la prueba, debe haber una marcada diferencia entre el control positivo y el negativo. El control positivo presentar una coloracin verde intenso y el control negativo ser transparente. Los calibradores estarn ligeramente coloreados. Una muestra positiva presentar una coloracin verde semejante al control positivo.
6.2.4.9
6.2.4.10 6.2.4.11
6.2.4.12 6.2.4.13
6.2.4.14 6.2.4.15 6.2.4.16 6.2.5 6.2.5.1 6.2.5.2
6.2.5.3
6.2.5.4
P+ C1 C2 C3 N-
Figura N 3. Prueba de ELISA IgM con muestras y controles
MPR - CNSP - 009
29
6.2.6 6.2.6.1
Interpretacin Posterior a la lectura realizar el clculo de la unidad lepto para cada muestra mediante la siguiente frmula (Tabla N 2): D. Om (UL) = 10 x X UL = Unidades lepto D.Om = Densidad ptica de la muestra X = Promedio de densidad ptica de calibradores de corte
6.2.6.2
Se considerar una muestra como positivo, si las unidades obtenidas mediante este clculo son mayores a 11, debiendo ser evaluada mediante la prueba MAT para su confirmacin diagnstica. Se considerar una muestra como negativa, cuando las unidades obtenidas mediante el clculo son menores a 9. Si en una muestra se detectan valores intermedios entre 9 y 11, realizar un segundo anlisis y, de persistir este resultado, solicitar una segunda muestra despus de una semana, siendo esta vez el resultado analizado con la ficha clnica para evaluar la etapa de la enfermedad. Un incremento del 50% en unidades lepto en muestras pareadas es significativo y confirmara el caso como leptospirosis. Posteriormente, esta se tiene que confirmar con la prueba MAT. Pueden presentarse falsos negativos, cuando el paciente se encuentre en los primeros cinco das de enfermedad y la cantidad de anticuerpos no son detectables por la prueba. En ese caso, es necesario una segunda muestra 7-15 das posteriores a la toma de la primera muestra.
6.2.6.3
6.2.6.4
6.2.6.5
6.2.6.6
Tabla N 2. Interpretacin de la prueba ELISA Indirecto Ig M
UNIDADES LEPTO <9 9-11 > 11
RESULTADOS Negativo Indeterminado Positivo
INTERPRETACIN No evidencia de anticuerpos IgM contra leptospira Sugiere segunda muestra Presencia de anticuerpos IgM contra leptospira
MPR - CNSP - 009
30
6.3 6.3.1
DIAGNSTICO MEDIANTE LA PRUEBA DE ELISA INDIRECTO IgG Objetivo Describir el procedimiento para la realizacin de la prueba de ELISA indirecto IgG en suero para el diagnstico en fase convalesciente de la enfermedad y para estudios epidemiolgicos de la leptospirosis humana.
6.3.2 6.3.2.1
Condiciones generales El ELISA IgG es utlizado para estudios epidemiolgicos como una prueba adicional a la prueba MAT. Los anticuerpos de tipo IgG son los que se presentan posterior a la presencia de anticuerpos de tipo IgM. Esta prueba se usa como tamizaje para el diagnstico serolgico y epidemiolgico de la leptospirosis humana. Cuando los anticuerpos IgG contra leptospira estn presentes en el suero, se combinan con el antgeno de leptospira (antgeno total) fijado a la superficie de los micropocillos de poliestireno. El suero residual es removido por medio del lavado, aadindose el conjugado anti-humano IgG ligado a una enzima (peroxidasa). Los micropocillos son lavados y coloreados por un substrato (perxido de hidrgeno) ms un cromgeno. El substrato es hidrolizado por la enzima y el cromgeno vara de color, la reaccin se detiene por la adicin de una solucin de pares. La intensidad de color est directamente relacionado a la concentracin de anticuerpos contra leptospiras presentes en la muestra. Materiales y equipos Kit de ELISA IgG Lector de microplacas Lavador de microplacas Estufa de 37oC Micropipetas rango graduable : 2-20 l, 10-100 l y 100-1000 l Micropipeta multicanal 30-300 l Reloj Potencimetro Rotador o Shaker Puntas para micropipetas Buffer fosfato salino(PBS) pH 7,4 Tween 20 Contenedor de material contaminado
31
6.3.2.2
6.3.2.3 6.3.3 6.3.3.1 6.3.3.2 6.3.3.3 6.3.3.4 6.3.3.5 6.3.3.6 6.3.3.7 6.3.3.8 6.3.3.9 6.3.3.10 6.3.3.11 6.3.3.12 6.3.3.13
MPR - CNSP - 009
6.3.4
Procedimiento Realizar el procedimiento segn el tem 6.2.4, excepto el tem 6.2.4.13 en que se deber agregar el conjugado anti-humano lgG.
6.3.5 6.3.5.1 6.3.5.2
Lectura (Figura N 4) Realizar la lectura en un lector de microplacas a 405 nm. Para realizar la observacin visual de la prueba, debe haber una marcada diferencia entre control positivo y el negativo. El control positivo presentar una coloracin verde intenso, el control negativo ser transparente, los calibradores estarn ligeramente coloreados. Una muestra positiva presentar una coloracin verde semejante al control positivo.
6.3.5.3
6.3.5.4
P+ C1 C2 C3 N-
Figura N 4. Prueba de ELISA IgG para leptospiras con muestras y controles
6.3.6 6.3.6.1
Interpretacin Posterior a la lectura, realizar el clculo de la unidad lepto para cada muestra, mediante la siguiente frmula (Tabla N 3): D. Om (UL) = 10 x X UL = Unidades lepto D.Om = Densidad ptica de la muestra X = Promedio de densidad ptica de calibradores de corte
MPR - CNSP - 009
32
6.3.6.2
Una muestra se considerar positiva si las unidades obtenidas mediante este clculo son mayores a 11. Adems, esta muestra deber ser evaluada mediante la prueba MAT para su confirmacin diagnstica. Una muestra se considerar negativa cuando las unidades obtenidas mediante el clculo son menores a 9. Si en una muestra se detectan valores intermedios entre 9 y11, se debe realizar un segundo anlisis y, de persistir este resultado, se debe realizar la prueba MAT para descartar si tuvo una infeccin pasada.
Tabla N 3. Interpretacin de la prueba de ELISA Ig G.
6.3.6.3
6.3.6.4
UNIDADES LEPTO <9 9-11 > 11
RESULTADOS Negativo Indeterminado Positivo
INTERPRETACIN No evidencia de anticuerpos IgG contra leptospira Repetir la prueba Presencia de anticuerpos IgG contra leptospira
6.4 6.4.1
DIAGNSTICO MEDIANTE LA PRUEBA DE MICROAGLUTINACIN (MAT) Objetivo Describir el procedimiento para la realizacin de la prueba MAT en suero para el diagnstico serolgico de leptospirosis humana y animal en la fase temprana y convalesciente de la enfermedad.
6.4.2 6.4.2.1
Condiciones generales La prueba MAT es el mtodo de diagnstico estndar de referencia internacional para la confirmacin serolgica de una infeccin reciente y pasada de leptospirosis. Usa antgenos vivos y, es de alta sensibilidad y especificidad al serovar infectante. Esta tcnica se emplea para detectar anticuerpos anti-leptospiras en el suero, identificar los aislamientos, clasificar cepas y servir de base para evaluar cualquier otro mtodo serolgico para el diagnstico de esta enfermedad. La batera que se usa como antgeno est representada por los serovares ms prevalentes del rea. Sin embargo, en aquellas regiones en donde no se conoce los serovares circulantes, la OMS recomienda por lo menos una cepa de referencia de los serovares ms representativos de las especies ms frecuentes. En la estandarizacin del MAT, es muy importante considerar: La densidad correcta del cultivo usado como antgeno. Esta densidad debe ser aproximadamente de 1,5 a 2x108 leptospiras. La determinacin del ttulo final de la aglutinacin.
33
6.4.2.2
6.4.2.3
6.4.2.4 a.
b.
MPR - CNSP - 009
6.4.2.5
Se emplean como antgeno las cepas de referencia que deben ser replicados semanalmente para realizar la prueba. Una vez revisado los cultivos, se eligen aquellos que tengan buen crecimiento y no formen aglutinaciones entre ellas. Cuando los cultivos estn muy densos se deben diluir con buffer fosfato salino PBS pH 7,2-7,4 o solucin salina fisiolgica 0,85%. Para que el antgeno sea ptimo para la prueba tiene que observarse en el microscopio de campo oscuro entre 150 a 200 leptospiras por campo o hasta lograr una opalescencia de 0,5 de la escala de Mac Farland. La prueba se basa en enfrentar diluciones seriadas de suero con igual volumen de una suspensin de leptospiras (antgeno) para luego observarse en microscopio de campo oscuro para estimar el 50% de aglutinacin como el punto final de la reaccin antgeno-anticuerpo. Materiales y equipos Estufa de 30oC Microscopio de campo oscuro Microplacas de poliestireno Micropipetas rango graduable : 2-20 l, 10-100 l y 100-1000 l Micropipeta multicanal 30-300 l Reloj Potencimetro Rotador o Shaker Puntas para micropipetas Tubos de dilucin Lminas porta-objetos Laminillas cubre-objetos Buffer fosfato salino(PBS) pH 7,4 Solucin salina fisiolgica 0,85% Antgeno de leptospiras de 5-7 das de crecimiento Contenedor de material contaminado
6.4.2.6
6.4.2.7
6.4.3 6.4.3.1 6.4.3.2 6.4.3.3 6.4.3.4 6.4.3.5 6.4.3.6 6.4.3.7 6.4.3.8 6.4.3.9 6.4.3.10 6.4.3.11 6.4.3.12 6.4.3.13 6.4.3.14 6.4.3.15 6.4.3.16
MPR - CNSP - 009
6.4.4 6.4.4.1 a.
Procedimiento Tamizaje Preparar diluciones separadamente del suero 1:50, 1:100 y 1:200 en un volumen final de 1,5 mL con PBS o SSF en un tubo de dilucin. Distribuir la microplaca en 8 columnas para la dilucin de suero y 24 filas para los antgenos. Agregar 50 l a cada pocillo de la dilucin de suero 1:50 en la primera y quinta columna. Agregar 50 l a cada pocillo de la dilucin de suero 1:100 en la segunda y sexta columna. Agregar 50 l a cada pocillo de la dilucin de suero 1:200 en la tercera y sptima columna. Agregar 50 l a cada pocillo de PBS SSF en la cuarta y octava columna para el control del antgeno. A cada pocillo de la primera fila (columna 1, 2, 3 y 4), agregar el antgeno correspondiente al primer serogrupo (Ver Tabla N 4). La dilucin de suero sera el doble. Realizar este procedimiento sucesivamente de la 2da fila hasta el 24va fila. Posterior a la adicin de los antgenos, poner la microplaca sobre el shaker y rotar a una revolucin 500 rpm durante cuatro segundos para que la muestra de suero y antgeno se mezclen adecuadamente. Cubrir la microplaca con papel platino e incubar por 2 horas a 30oC.
Tabla N 4. Esquema para el tamizaje por la prueba MAT
Dil. suero 1:50 1:100 dilusin final 1 50 l (suero) +50 l(Antig) 1:100 1:200 Ctrl 1:50 1:100 1:200 Ctrl
b. c. d. e. f. g.
h. i.
j.
1:200 1:400 dil final dil final
1:100 1:200 1:400 dil final dil final dil final 13
2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12
14 15 15 17 18 19 20 21 22 23 24
Serovares
Serovares
MPR - CNSP - 009
35
6.4.4.2 a.
Titulacin Despus de realizar el tamizaje de las muestras y si se observa que en la dilucin 1:400 presentan aglutinaciones igual o mayor a 2+ con uno ms serogrupos, se tiene que titular el suero. Preparar una placa de microtitulacin, rotular el cdigo de los serovares en las filas y en las columnas y anotar las diluciones correspondientes que empiezan con 1:50, 1:100 hasta 1: 51200. A partir de la segunda columna, agregar 50 l de PBS o SSF hasta la columna 12. Diluir el suero en una dilucin 1:25 con SSF o PBS en un volumen final de 1mL. Agregar 50 l del suero diludo 1:25 en las dos primeras columnas. Usando una micropipeta multicanal, mezclar el suero diludo con el PBS o SSF en la segunda columna, luego extraer 50 l y verterlo en la tercera columna y, as sucesivamente, continuar con todas las diluciones a lo largo de la fila, hasta la dcimo primera columna (Tabla N 5). Descartar los ltimos 50 l y dejar libre la dcimo segunda columna, la que se usar como control de antgeno. En cada fila, agregar 50 l del correspondiente antgeno. Posterior a la adicin de los antgenos, colocar la microplaca sobre el shaker y rotar a una revolucin 500 rpm durante cuatro segundos. Cubrir la microplaca con papel platino e incubar por 2 horas a 30oC.
Tabla N 5. Esquema para la titulacin de la prueba MAT
1:25 Dilusin suero 1:50 dilusin final 1 Ser 1 A 2 50 l (suero) +50 L(Antig) Ser 2 Ser 3 Ser 4 Ser 5 Ser 6 Ser 7 Ser 8 B C D E F G H 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 1:100 1:200 1:400 1:800 1:1600 1:3200 1:6400 1:12800 1:25600 1:50 1:100 1:200 1.400 1:800 1:1600 1:3200 1:6400 1:12800 ctrl.
b.
c. d. e. f.
g.
h. i.
j.
MPR - CNSP - 009
36
6.4.5 6.4.5.1 6.4.5.2 6.4.5.3 6.4.5.4 6.4.5.5
Lectura Utilizando las puntas de la micropipeta multicanal extraer 15 l de mezcla antgeno-suero y 15 l del control y traspasarlos a una lmina porta-objeto. La lectura se realizar utilizando un microscopio de campo oscuro con objetivo de 10X, sin cubre-objetos. Observar el grado de aglutinacin de cada antgeno en relacin con el antgeno control segn la escala de la Tabla N 6. El titulo final estar dado por la dilucin del suero que presenta 50% de aglutinacin, y que se reporta como cruces de aglutinacin (de 1+ a 4+). Cuando una muestra es negativa, no se presenta aglutinacin, observndose la muestra de suero igual al antgeno control.
Tabla N 6. Lectura por la prueba MAT
CRUCES (AGLUTINACIN) + ++ +++ ++++
OBSERVACIN 25% Aglutinacin con 75% de clulas libres. 50% Aglutinacin con 50% de clulas libres. 75% Aglutinacin con 25% de clulas libres. 100% Aglutinacin lisadas con 0-25% de clulas libres.
6.4.6 6.4.6.1
Interpretacin (Tablas N 7 y N 8) Un suero se considera positivo cuando se observa una aglutinacin de 2+ en una dilucin de suero igual o mayor a 1:100 (Figura N 5).
Figura N 5. Diferentes grados de aglutinacin en la prueba MAT para leptospiras
6.4.6.2
Un suero se considera negativo cuando no se observa aglutinacin con ningn serovar en una dilucin de suero menor a 1:100.
MPR - CNSP - 009
6.4.6.3
En una infeccin temprana es frecuente observar reacciones cruzadas en ms de dos serovares homlogos que reaccionan con el suero. Es necesario una segunda muestra 721 das posterior de tomada la primera muestra. Durante la tercera y cuarta semana de producida la enfermedad, el ttulo de anticuerpos hacia el serovar infectante es mayor, facilitando su identificacin. Durante los primeros das de enfermedad, cuando la produccin de anticuerpos aglutinantes es menor, esta prueba puede salir negativa o reaccionar a ttulos menores a una dilucin 1:100. Para considerar una muestra positiva en muestras pareadas, es necesario que se produzca un incremento del ttulo de anticuerpos de dos a cuatro diluciones con respecto a la primera muestra. En algunos casos se puede observar un ttulo bajo persistente con un serovar. Esto pueda deberse a que el serovar infectante no est incluido en la batera de antgenos. En aquellos casos que no se observe un incremento en el ttulo de anticuerpos entre la primera y segunda muestra, se puede interpretar que es una infeccin pasada.
6.4.6.4 6.4.6.5 6.4.6.6 6.4.6.7 6.4.6.8
Tabla N 7. Interpretacin de los resultados serolgicos en humanos para el diagnstico de la leptospirosis

Resultados serolgicos
S U E R O S P A R E A D O S
Muestra de suero Suero I Suero II Suero I Suero II Suero I Suero II
ELISA IgM
Microaglutinacin (MAT)
Interpretacin
Negativo Negativo o indeterminado Positivo Positivo Positivo
Negativo (Ttulos <100) Negativo (Ttulos <100) Positivo (Ttulos 100) Positivo (Ttulos > 100) Positivo (Aumento de 4 veces el ttulo con respecto a la primera muestra)
Caso negativo Infeccin Reciente
Infeccin Reciente
Suero I Suero II
Negativo Negativo
Positivo (Ttulo <100) Positivo (Ttulos iguales a la primera muestra)
Infeccin pasada
Suero nico
Negativo o Positivo
Negativo Positivo
Negativo Positivo Solicitar Segunda muestra
S U E R O S N I C O S
(Fase Aguda)
Suero nico (Fase Convaleciente > 1 mes) Suero nico
Negativo
Negativos (Ttulo <100)
Caso Negativo
Positivo
Positivo (Ttulos>100 a diferentes serovares)
Infeccin reciente
(Fase convaleciente)
MPR - CNSP - 009
38
Tabla N 8. Serovares de referencia utilizados como antgenos para la prueba de aglutinacin microscpica (MAT)
N 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25
Especie L.biflexa L. interrogans L. interrogans L. interrogans L. borgepetersenii L. borgepetersenii L. interrogans L. weilii L. interrogans L. interrogans L. kischneri L. interrogans L. interrogans L. santarosai L. interrogans L. interrogans L. interrogans L. borgepetersenii L. santarosai L. interrogans L. interrogans L. santarosai L. interrogans L. biflexa L. borgepetersenii
Serogrupo Andamana Australis Australis Autumnalis Ballum Ballum Bataviae Celledoni Cancola Cancola Cynopteri Djasiman Grippotyphosa Hebdomadis Icterohaemorrhagiae Icterohaemorrhagiae Icterohaemorrhagiae Javanica Mini Pomona Pyrogenes Pyrogenes Sejroe Semaranga Tarassovi
Serovar andamana australis bratislava autumnalis ballum ballum bataviae celledoni cancola canicola cynopteri djasiman grippotyphosa borincana icterohaemorrhagiae copenhageni mankarso javanica georgia pomona pyrogenes alexi wolffi patoc tarassovi
Cepa CH 11 Ballico Jez Bratislava Akiyami A Mus 125 S 102 Van Tienen Celledoni Hond Utrecht IV Ruebush 3522 C Djasiman Moskva V HS 622 RGA M20 Mankarso Veldrat Batavia 46 LT117 Pomona Salinem HS 616 3705 Patoc 1 Perepelicin
MPR - CNSP - 009
39
SECCIN 7
IDENTIFICACIN DE LEPTOSPIRAS Para establecer un adecuado sistema de vigilancia de leptospirosis es necesario conocer el serovar de leptospiras que circulan en los reservorios y pacientes y determinar el rea geogrfica del espectro clnico epidemiolgico, para aplicar las medidas de control. Asimismo, el antgeno debe poseer una buena reactividad para las pruebas de diagnstico. La espiroqueta que causa la leptospirosis pertenece el gnero Leptospira, familia Leptospiraceae, orden Spirochaetales. Los estudios moleculares taxonmicos han demostrado un alto nivel de heterogeneidad gentica dentro, de las especies tradicionales L. interrogans y L. biflexa. Esto ha permitido desarrollar el sistema taxonmico filogenetico, el cual comprende las especies patgenas L. interrogans, L. alexanderi, L. borgpetersenii, L.fainei, L. inadai, L kirschneri, L. meyeri, L. noguchi, L. santarosai, L.weilii y las especies saprofitas L. biflexa, L. genomospecies 1, 3,4,5, L. wolbachii, L. parva y Leptonema illini 7.1 7.1.1 IDENTIFICACIN DE LEPTOSPIRAS PATGENAS Objetivo Describir los procedimientos para la identificacin de leptospiras patgenas aisladas de muestras clnicas. 7.1.2 7.1.2.1 Condiciones generales Las leptospiras pueden caracterizarse por sus caractersticas fenotpicas, como el crecimiento a 13C, 30C y 37C, crecimiento en la presencia de 8-azaguanina o CaSO4 , actividad de la lipasa y la apariencia de formas esfricas con la presencia de 1M NaCl. Para diferenciar entre las leptospiras patgenas y no patgenas, el mtodo ms apropiado son el crecimiento en diferentes temperaturas y la 8-azaguanina. Materiales y equipos Estufa de 13oC, 30oC y 37oC Microscopio de campo oscuro Microplacas de poliestireno Micropipetas rango graduable : 2-20 l, 10-100 l y 100-1000 l Reloj Potencimetro Rotador o Shaker Puntas para micropipetas
7.1.2.2
7.1.3 7.1.3.1 7.1.3.2 7.1.3.3 7.1.3.4 7.1.3.5 7.1.3.6 7.1.3.7 7.1.3.8
MPR - CNSP - 009
7.1.3.9 7.1.3.10 7.1.3.11 7.1.3.12 7.1.3.13 7.1.3.14 7.1.3.15 7.1.4 7.1.4.1 a. b. c. d. e. f. 7.1.4.2 a. b.
Tubos de dilucin Lminas porta-objetos Laminillas cubre-objetos Buffer fosfato salino (PBS) pH 7,4 Solucin salina fisiolgica 0,85% Medio de cultivo Fletcher o EMJH Contenedor de material contaminado Procedimiento Prueba 8-azaguanina Preparar una solucin de 8-azaguanina (225mg/L) en agua destilada. Disolver la 8-azaguanina por varias horas en un frasco con una barra magntica mediante un rotador magntico. Esterilizar en autoclave. Agregar aspticamente 1 mL de la solucin de 8-azaguanina en 9 mL de medio EMJH. Inocular al tubo 100 l de cultivo joven e incubar a 30oC. Chequear interdiariamente en microscopio de campo oscuro. Repetir este mismo procedimiento tanto para las cepas patgenas, como para las no patgenas que se usarn como controles. Prueba de la temperatura Inocular 100 mL de cultivo joven de la cepa en investigacin a un tubo con medio e incubar a 13oC. Inocular 100 mL de cultivo joven de la cepa patgena a un tubo con medio e incubar a 13oC el cual se usar como control. Repetir el mismo procedimiento para la cepa no patgena. Observar interdiariamente en microscopio de campo oscuro. Lectura Utilizando una pipeta pasteur estril, extraer una pequea cantidad de cultivo y traspasar a una lmina porta-objeto. La lectura se realiza utilizando un microscopio de campo oscuro con objetivo de 40X y con cubreobjetos. Observar la densidad poblacional de cada control y comparar con los obtenidos en los controles.
c. 7.1.5 7.1.5.1
7.1.5.2
7.1.5.3
MPR - CNSP - 009
7.1.6 7.1.6.1 7.2 7.2.1
Interpretacin Las leptospiras patgenas se caracterizan por no crecer en presencia de 8-azaguanina y a temperatura de 13oC, a diferencia de las no patgenas que logran desarrollarse en estas condiciones. . SEROTIFICACIN DE LEPTOSPIRAS PATGENAS Objetivo Describir los procedimientos para la serotificacin de leptospiras patgenas aisladas de muestras clnicas.
7.2.2 7.2.2.1
Condiciones generales El serovar es la unidad taxonmica, ejemplo: serovar pomona; el serovar tipo son subgrupos determinados por el anlisis genmico, ejemplo: serovar hardjo tipo hardjoprajitmo. La cepa de referencia para cada serovar se indica con la letra superscritt, ejemplo: Van tienenT. El serogrupo no tiene status taxonmico y son convenientes para su aplicacin en el manejo de agrupacin de los serovares en el laboratorio. El mtodo convencional para la serotipificacin es la tcnica del anlisis de inmunoabsorcin de la estructura antignica de leptospiras. Se considera que dos cepas asiladas pertenecen a diferentes serovares, si despus de la absorcin cruzada con adecuada cantidad de antgeno heterologo, 10% o ms del titulo homlogo permanecen regularmente en al menos uno de los antisueros en pruebas repetidas. Otras alternativas para la tipificacin, son mediante el uso de anticuerpos monoclonales, mtodos moleculares como PFGE, PCR, RFLP, DNA fingerprinting y anlisis de factor. Materiales y equipos Estufa de 13oC, 30oC y 37oC Microscopio de campo oscuro Microplacas de poliestireno Micropipetas rango graduable : 2-20l, 10-100 l y 100-1000l Micropipeta multicanal Reloj Potencimetro Rotador o Shaker Puntas para micropipetas Tubos de dilucin Lminas porta-objetos Laminillas cubre-objetos
7.2.2.2
7.2.2.3 7.2.3 7.2.3.1 7.2.3.2 7.2.3.3 7.2.3.4 7.2.3.5 7.2.3.6 7.2.3.7 7.2.3.8 7.2.3.9 7.2.3.10 7.2.3.11 7.2.3.12
MPR - CNSP - 009
7.2.3.13 7.2.3.14 7.2.3.15 7.2.3.16 7.2.4 7.2.4.1
Buffer fosfato salino(PBS) pH 7,4 Solucin salina fisiolgica 0,85% Medio de cultivo Fletcher o EMJH Contenedor de material contaminado Procedimiento (Tabla N 9) Preparar una placa de microtitulacin, rotular con el cdigo del aislamiento de los serovares en las filas y anotar en las columnas las diluciones correspondientes que empiezan con 1:50, 1:100 hasta 1: 51200. Se necesitan 3 microplacas, debido a que son 24 antisueros diferentes. A partir de la segunda columna, agregar 50 L de PBS SSF hasta la columna 12. Diluir los antisueros en una dilucin 1:25 con SSF PBS en un volumen final de 1 mL. Agregar en las dos primeras columnas 50 L del antisuero diludo 1:25. Usando una micropipeta multicanal, mezclar los antisueros diludos con el PBS o SSF en la segunda columna, luego extraer 50 L y verterlo en la tercera columna y as sucesivamente continuar con todas las diluciones a lo largo de la fila, hasta la dcima primera columna. Descartar los ltimos 50 L y dejar la libre la dcimo segunda columna, la que se usar como control de antgeno. En toda la placa, agregar 50 L del correspondiente antgeno aislado. Posterior a la adicin de todos los antgenos, colocar la microplaca sobre el shaker y rotar a una revolucin 500 rpm durante cuatro segundos. Cubrir la microplaca con papel platino e incubar por 2 horas a 30oC.
Tabla N 9. Esquema para la titulacin de la prueba MAT de una cepa aislada
Dilucin 1:25 de antisuero 1:50 Dilucin final 2 50l (antisuero) +50 l (Antig) 1:50 1:100 1:200 1.400 1:800 1:1600 1:3200 1:6400 1:12800 ctrl.
7.2.4.2 7.2.4.3 7.2.4.4 7.2.4.5
7.2.4.6 7.2.4.7 7.2.4.8 7.2.4.9
1:100 3
1:200 4
1:400 5
1:800 6
1:1600 1:3200 1:6400 1:12800 7 8 9 10
1:25600 11 12
Antisuero 1
1 A
Ant 2 Ant 3 Ant 4 Ant 5 Ant 6 Ant 7 Ant 8
B C D E F G H
MPR - CNSP - 009
43
7.2.5 7.2.5.1
Lectura Utilizando la punta de la micropipeta multicanal, extraer 15l de mezcla antgeno-suero y 15 l del control y traspasar a una lamina porta-objeto. La lectura se realiza utilizando un microscopio de campo oscuro con objetivo de 10X, sin cubreobjetos. Observar el grado de aglutinacin de cada antgeno en relacin con el antgeno control segn la escala de 1+ a 4+ (Ver Tabla N 10). El ttulo final estar dado por la dilucin del suero que presenta 50% de aglutinacin.
Tabla N 10. Lectura para la serotipificacin de leptospiras patgenas
CRUCES (AGLUTINACIN) + ++ +++ ++++ OBSERVACIN 25% Aglutinacin con 75% de clulas libres. 50% Aglutinacin con 50% de clulas libres. 75% Aglutinacin con 25% de clulas libres. 100% Aglutinacin lisadas con 0-25% de clulas libres.
7.2.5.2
7.2.5.3
7.2.5.4
7.2.6 7.2.6.1
Interpretacin Si la cepa aislada reacciona con un antisuero a ttulo alto, significa que la cepa pertenece a dicho serogrupo. Se puede observar aglutinacin cruzada para varios serogrupos con la cepa de referencia. Para determinar si la cepa aislada pertenece a un serovar conocido o es un nuevo serovar se realiza la prueba de absorcin. Otras alternativas para la tipificacin son el uso de anticuerpos monoclonales, anlisis de factor y los mtodos moleculares (PCR, RFLP, PFGE y DNA fingerprinting).
7.2.6.2 7.2.6.3
7.2.6.4
MPR - CNSP - 009
44
BIBLIOGRAFA Alexander A, Gochenour W, Reinhard K, Warda M, Yagar R. Leptospirosis diagnostic procedures and reagents. 5ta edicin. USA; 1978. Adler B, Murphi AM, Locarni SA, Faine S. Detection of specific anti-leptopiral immunoglobulin M and G in human serum by solid-phase-enzime-linked immunosorbent assay. J Clin Microbiol 1980; 11:452-47. Brandao A, Camargo E, Da Silva ED, Silva M, Abrao RV. Macroscopic agglutination test for rapid diagnosis of human leptospirosis. J Clin Microbiol 1998; 36(11): 3138-42. Centers for Disease Control. MMWR Recommendations and reports. Case definitions for infectious conditions. Vol 46/N.RR-10; 1997. Cura E, Wendel S. Manual de procedimientos de control de calidad para los laboratorios de serologa de los bancos de sangre. Organizacin Panamericana de la Salud; 1994. Faine S. Guidelines for the control of leptospirosis Geneva: WHO; 1982. WHO off-set publication N 67. Faine S, Adler B, Bolin C, Perolat P. Leptospira and leptospirosis. 2 a ed; MediSci. Melbourne, Australia; 2000. Hartskeerl R, Smits H, Korver H, Terpstra W. International course on laboratory methods for the diagnosis of Leptospirosis. Royal Tropical Institute Department of Biomedical Research. The Netherlands; 2001. Herrer A, Liceras J. Leptospirosis en el Per II: Incidencia de la infeccin en las ratas (Rattus nevergicus) de la ciudad de Lima e identificacin de la cepa infectante. Rev Med Exp 1960; 13: 85-108. Liceras J. Leptospirosis humana en las provincias de Lima y Callao. Rev Med Per 1973; 34: 27-34. Liceras J. Leptospirosis en San Martn, Per. Bol Of Sanit Panam 1975; 74: 410-21. Liceras J. Leptospirosis en Tingo Mara, departamento de Hunuco, Per. II Estudio en animales silvestres. Bol Of Sanit Panam 1981; 68: 297-306. Macedo S, Cornide R, Cceres I. Cepas endmicas de Leptospiras patgenas en Amrica Latina y en el Caribe. Rev Cub Med Trop 1983; 35: 186-92. Merien F, Amouriaux A, Perolat P, Baranton G, Girons SJ. Polymerase chain reaction for detection of Leptospira spp. J Clin Microbiol 1992 ; 30: 2219-24. Milner AR, Jackson KB, Woodruff K, Smart IJ. Enzyme linked immunosorbent assay for determining specific immunoglobilin M in infection caused by Leptospira interrogans serovar hardjo. J Clin Microbiol 1985; 22: 539-42. Romero EC, Caly CR, Yasuda PH. The persintence of leptospiral aglutinins titers in human sera diagnosed by the microscopic aglutination test. Rev Inst Med Trop Sao Paulo 1988; 40: 183-4.
MPR - CNSP - 009
45
Silva da MV, Camargo ED, Vaz AJ, Souza AMC, Veda M, Sakata EE. Teste inmunoenzimatico (ELISA) para deteccao de anticorpos circulantes da clase Ig M na la leptospirose humana. Rev Inst Med Trop Sao Paulo 1988; 30: 95-100. Silva da MV, Camargo ED. Teste imunoenzimatico (ELISA) para deteccao de anticorpos circulantes da clase Ig A na leptospiroses humana. Rev Inst Med Trop Sao Paulo 1992; 34: 239-42. Sulzer C, Jhones W. Leptospirosis. Methods in laboratory diagnosis. Publication N 748275. Department of Health Education and Welfare. Washigton DC; 1976. Watt G, Alquiza LM, Padre LP, Tuazon ML, Laughlin LW. The rapid diagnosis of Leptospirosi a prospective of the dot enzime-linked immunosorbet assay and the genus specific microscopic aglutination test at different stages of illnes. J Infect Dis 1988; 157: 840-2. Winslow WE, Merry DJ, Pir MM, Devine PL. Evaluation of a commercial enzime-linked immununosorbent assay for detection of an immunoglobulin M antibody in diagnosis of human leptospiral infection. J Clin Microbiol 1997; 35: 1938-42.
MPR - CNSP - 009
46
ANEXO A
CINTICA DE LA LEPTOSPIROSIS
Figura A. Cintica de la enfermedad (Tomado del Manual de Leptospirosis. Royal Tropical Holanda)
MPR - CNSP - 009
47
ANEXO B
ESQUEMA PARA EL DIAGNSTICO DE LEPTOSPIROSIS HUMANA
Figura B. Esquema para el diagnstico de la leptospirosis
MPR - CNSP - 009
48
ANEXO C MEDIOS DE CULTIVO C1. MEDIO DE CULTIVO LQUIDO KORTHOF MODIFICADO
Composicin: Peptona Cloruro de sodio (NaCl) Hidrgeno carbonato sdico (NaHCO3) Cloruro potsico (KCl) Cloruro clcico (CaCl2) Agua destilada Buffer: Dihidrgeno fosfato de potasio (KH2PO4) Hidrgeno fosfato disdico hidratado (NaHPO4.2H2O) Preparacin: C2.
1,00 g 1,40 g 0,02 g 0,04 g 0,04 g 900,00 mL
9,00 mL..... (9,072g/L) 91,00 mL.... (11,866g/L) pH 7,3 0,1
Pesar individualmente cada uno de los ingredientes y colocarlos en un baln de 2L, agregar 900mL de agua destilada ms 100 mL de buffer recin preparado o estril conservado. Disolver y calentar brevemente. Una vez enfriado, medir el pH y llevarlo a 7,3 0,1. Filtrar el medio a travs de papel filtro Wattman N4 por dos veces. Repartir 250 mL en balones de 500 mL de capacidad. Esterilizar en autoclave a 121C/15 lb./15 minutos. Dejar enfriar a temperatura ambiente y aadir 20 mL de suero de conejo inactivado a 56oC x 30 minutos para obtener una concentracin final de 8% suero de conejo. Repartir 5mL. del medio en tubos de 18x150 con tapa rosca. O Controlar la esterilidad a 37 C x 24 horas. O Conservar a 4 C (hasta 3 meses). Agitar antes de usar. MEDIO DE CULTIVO SEMISLIDO FLETCHER
Composicin: Proteosa peptona Cloruro de sodio (CLNa) Agar Buffer pH 7.8 (*) Agua destilada Extracto de carne
1,00 g 0,50 g 2 ,00 g 100,00 mL 900,00 mL 0,20 gr pH 7,20,1
MPR - CNSP - 009
49
Buffer pH 7,8: Dihidrgeno fosfato de potasio (KH2PO4) Hidrgeno fosfato disdico hidratado (NaHPO4 2H2O)
9 mL.....(9,072gr/L). 91 mL....(11,866gr/L) pH 7,80,1
Preparacin: Pesar por separado cada uno de los componentes del medio y colocarlos en un baln Adicionar 900 mL de agua destilada, disolver cada uno de los componentes hasta la completa disolucin y adicionar 100 mL de buffer, calentar mediante hervor. O O Dejar enfriar a 45 C-50 C. Ajustar el pH a 7,2 y repartir 100 mL del medio en balones de 250 mL de capacidad. O Esterilizar a 121 C / 15 minutos. O Al medio tibio o fro, agregar suero de conejo estril e inactivado (56 C/30 minutos) a una concentracin final de 8-10% Repartir 5 mL. del medio en tubos de 16x150 con tapa rosca. O Controlar la esterilidad del medio en estufa a 37 C por 24 horas. Conservar en refrigeracin. C3.
MEDIO TWEEN 80- ALBUMIN BOVINE SERUM (MEDIO EMJH )
SOLUCIONES STOCK: Preparar cada stock en 100 ml. de agua tridestilada NH4Cl ZnSO4 7H20 MgCL2 6H2O CaCl22H2O FeSO47H20 piruvate sodium glycerol tween 80 thiamine .hcl cyanocobalamina No es necesario ajustar el pH SUPLEMENTO DE ALBUMINA: Disolver el BSA en 50 mL BSA (powder) 25,00 g 0,40 g 1,50 g 1,50 g 0,50 g 10,00 g 10,00 g 10,00 g 0,50 g 0,02 g
10,00 g
MPR - CNSP - 009
50
Agregar de cada stock: CaCl2 MgCl2 ZnSO4 FeSO4 Cyanocobalamina tween 80 1,00 mL 1,00 mL 1,00 mL 10,00 mL 1,00 mL 12,50 mL
Completar a 100 mL y ajustar el pH a 7,4 y esterilizar por filtracin. MEDIO BASAL: En 996 mL de agua destilada Na2HPO4 (anhydrous) KH2PO4 (anhydrous) Na Cl Agregar las siguientes soluciones stock: NH4CL Thiamine Piruvate Glycerol Ajustar el pH A 7,4 y autoclar. MEDIO LQUIDO : Mezclar 1 volumen de suplemento albmina y 9 volmenes de medio basal. 1,00 mL 1,00 mL 1,00 mL 1,00 mL 1,00 g 0,30 g 1,00 g
MPR - CNSP - 009
51
ANEXO D COLORACIONES TINCIN NEGATIVA CON ROJO DE CONGO D1. D1.1. REACTIVOS Solucin acuosa de rojo de Congo Agua destilada Rojo de Congo Alcohol etlico 95% Acido clorhdrico concentrado PROCEDIMIENTOS Colocar sobre una lmina porta-objetos una solucin acuosa de rojo de Congo al 2% y sobre ella una gota de cultivo de Leptospiras, extenderla suavemente y dejar secar. Cubrir la lmina con la mezcla alcohol etlico-cido clorhdrico, dejar secar. Observar en microscopio de campo claro, con objetivo de inmersin. Las Leptospiras aparecen incoloras sobre un fondo azul oscuro. BUFFER FOSFATO SALINO(PBS) NaCl Na2HPO4 KH2PO4 KCl H2O d pH = 7.2 ******** autoclavar a 121o C, 15 libras de presin D4. SOLUCIONES DE LAVADO 8,00 g 0,91 g 0,14 g 0,20 g 1 000 mL 2% 100,00 mL 2,00 gr 99,00 mL 1,00 mL
D1.2.
D2. D2.1 D2.2 D2.3 D2.4 D3.
NaCl Na2HPO4 KH2PO4 KCl H2O d pH = 7,4
8,00 g 0,91 g 0,14 g 0,20 g 1 000,00 mL
MPR - CNSP - 009
52
Agregar al PBS previamente esterilizado: 500 l Tween 20 D5. SOLUCIN DE INCUBACIN NaCl Na2HPO4 KH2PO4 KCl H2O d pH = 7.4 Agregar al PBS previamente esterilizado : 500 l Tween 20 De esta solucin tomar 100 mL y agregarle 2,0 g. de BSA 8,00 g 0,91 g 0,14 g 0,20 g 1 000,00 mL
MPR - CNSP - 009
53
ARTES Y DISEOS LASER S.R.Ltda. Teodoro Crdenas 124 - B Santa Beatriz Lima 01 - Per Telf.: 470-6172 Telefax: 472-4525 3,000 ejemplares Julio del 2002
MPR - CNSP - 009
54

34

Cargado por

Información del documento

Derechos de autor

Formatos disponibles

Compartir este documento

Compartir o incrustar documentos

Opciones para compartir

¿Le pareció útil este documento?

¿Este contenido es inapropiado?

Copyright:

Formatos disponibles

34

Cargado por

Copyright:

Formatos disponibles

O NACION UT A IT

MINISTERIO DE SALUD DEL PER

INSTITUTO NACIONAL DE SALUD

MANUAL DE PROCEDIMIENTOS BACTERIOLGICO Y SEROLGICO PARA EL DIAGNSTICO DE LA LEPTOSPIROSIS

Serie de Normas Tcnicas N 34

MANUAL DE PROCEDIMIENTOS BACTERIOLGICO Y SEROLGICO PARA EL DIAGNSTICO DE LA LEPTOSPIROSIS

Serie de Normas Tcnicas N 34

Manual de procedimientos bacteriolgico y serolgico para el diagnstico de la leptospirosis

MINISTERIO DE SALUD Ministro Dr. Fernando Carbone Campoverde

INSTITUTO NACIONAL DE SALUD Jefe Dr. Luis Fernando Llanos Zavalaga

Portada: Frontis del local central de Instituto Nacional de Salud

MPR - CNSP - 009

Instituto Nacional de Salud

Manual de procedimientos bacteriolgico y serolgico para el diagnstico de la leptospirosis

MANUAL DE PROCEDIMIENTOS BACTERIOLOGICO Y SEROLGICO PARA EL DIAGNOSTICO DE LA LEPTOSPIROSIS

MPR - CNSP - 009

Instituto Nacional de Salud

Manual de procedimientos bacteriolgico y serolgico para el diagnstico de la leptospirosis

Catalogacin hecha por el Centro de Documentacin del INS

MPR - CNSP - 009

Instituto Nacional de Salud

Manual de procedimientos bacteriolgico y serolgico para el diagnstico de la leptospirosis

CINTICA DE LA LEPTOSPIROSIS ESQUEMA PARA EL DIAGNSTICO DE LA LEPTOSPIROSIS MEDIOS DE CULTIVO COLORACIONES

Instituto Nacional de Salud

MPR - CNSP - 009

Instituto Nacional de Salud

Manual de procedimientos bacteriolgico y serolgico para el diagnstico de la leptospirosis

1.2 Comprende: 1.2.1 1.2.2 1.2.3 1.2.4 1.2.5 1.3 1.3.1

MPR - CNSP - 009

Instituto Nacional de Salud

Manual de procedimientos bacteriolgico y serolgico para el diagnstico de la leptospirosis

1.5 1.5.1 1.5.2

1.5.5 1.5.6 1.5.7

1.5.14 1.5.15 1.5.16

MPR - CNSP - 009

Instituto Nacional de Salud

Manual de procedimientos bacteriolgico y serolgico para el diagnstico de la leptospirosis

MPR - CNSP - 009

Manual de procedimientos bacteriolgico y serolgico para el diagnstico de la leptospirosis

MPR - CNSP - 009

Instituto Nacional de Salud

Manual de procedimientos bacteriolgico y serolgico para el diagnstico de la leptospirosis

2.2 2.2.1 2.2.2 2.2.3 2.2.4 2.2.5 2.2.6 2.2.7

MPR - CNSP - 009

Instituto Nacional de Salud

Manual de procedimientos bacteriolgico y serolgico para el diagnstico de la leptospirosis

Manual de procedimientos bacteriolgico y serolgico para el diagnstico de la leptospirosis

Suero convalesciente AISLAMIENTO Sangre completa

Igual al suero agudo

Lquido cefaloraqudeo Orina

MPR - CNSP - 009

Manual de procedimientos bacteriolgico y serolgico para el diagnstico de la leptospirosis

3.2.3 3.2.3.1 3.2.3.2 3.2.3.3 3.2.3.4 3.2.3.5 3.2.4 3.2.4.1 3.2.4.2

Manual de procedimientos bacteriolgico y serolgico para el diagnstico de la leptospirosis

MPR - CNSP - 009

Instituto Nacional de Salud

Manual de procedimientos bacteriolgico y serolgico para el diagnstico de la leptospirosis

MPR - CNSP - 009

Instituto Nacional de Salud

Manual de procedimientos bacteriolgico y serolgico para el diagnstico de la leptospirosis

Manual de procedimientos bacteriolgico y serolgico para el diagnstico de la leptospirosis

3.5.3 3.5.3.1 3.5.3.2 3.5.3.3 3.5.3.4 3.5.3.5 3.5.4 3.5.4.1 3.5.4.2

Manual de procedimientos bacteriolgico y serolgico para el diagnstico de la leptospirosis

MPR - CNSP - 009