Laboratorio de Bioqumica y Biologa Molecular I Segundo Laboratorio Agua, pH y Accin Amortiguadora de los Aminocidos I.

Introduccin

Las biomolculas polares orgnicas e inorgnicas de las clulas vivientes existen y reaccionan de manera primaria en un ambiente acuoso. El agua, una molcula notablemente escencial para la vida, solubiliza y modifica las caractersticas de biomolculas como cidos nucleicos, protenas y carbohidratos al formar puentes de hidrgeno con sus grupos funcionales, interacciones que modifican las propiedades de dichas biomolculas y sus conformaciones en una solucin. La comprensin de los mecanismos homeostticos utilizados por los organismos para conservar un entorno intracelular relativamente constante debe considerar el pH, el amortiguamiento del mismo a nivel de los lquidos corporales y compartimientos subcelulares. Por otro lado tenemos que una de las mltiples funciones de los aminocidos es que, tanto aminocidos libres, as como, algunos que an formando parte de las protenas, pueden potencialmente funcionar como buffers. Esto se debe gracias a que los aminocidos en un medio acuoso contienen un grupo carboxilo que funciona como cido dbil, y un grupo amino que funciona como base dbil. II. Objetivos

1. Definir el concepto de amortiguador (buffer) y estudiar sus funciones y modo de accin. 2. Conocer los componentes de un buffer. 3. Demostrar la accin de los amortiguadores en el pH. 4. Demostrar la accin amortiguadora de los aminocidos. III. III a) Sustancia buffer 1. Se toman tres beakers de 25ml y se preparan de la siguiente manera: a) Beaker 1 (Problema 1): 10ml de agua destilada + 2 gotas de anaranjado de metilo. b) Beaker 2 (Problema 2): 8ml de agua destilada + 1ml de cido actico + 1ml de acetato de sodio + 2 gotas de anaranjado de metilo. c) Beaker 3 (Control de color): 8ml de agua destilada + 1ml de cido actico + 1ml de acetato de sodio + 2 gotas de anaranjado de metilo. Procedimiento

Se toman los beakers 1 y 2 se procede a titular con gotas de cido clorhdrico 0.1N hasta observar un cambio de color en comparacin con el beaker 3. Cuente y anote las gotas utilizadas en cada caso. 2. Se toman tres beakers de 25ml y se preparan de la siguiente manera: a) Beaker 1 (Problema 1): 10ml de agua destilada + 2 gotas de fenolftalena. b) Beaker 2 (Problema 2): 8ml de agua destilada + 1ml de cido actico + 1ml de acetato de sodio + 2 gotas de fenolftalena. c) Beaker 3 (Control de color): 8ml de agua destilada + 1ml de cido actico + 1ml de acetato de sodio + 2 gotas de fenolftalena. Se toman los beakers 1 y 2 se procede a titular con gotas de hidrxido de sodio 0.1N hasta observar un cambio de color en comparacin con el beaker 3. Cuente y anote las gotas utilizadas en cada caso. III b) Accin buffer de los amonocidos 1. Se toman 2 beakers y se agrega 10ml de glicina 0.1N a cada uno y se procede a medir el pH de la misma (pH basal) 2. Se toma uno de los beakers y con el electrodo del pHmeter dentro de la solucin, se procede a titular con HCl 0.1N de la siguiente manera: 5 veces 0.1ml (2 gotas) 5 veces 0.2ml (4 gotas) 14 veces 0.5ml (10 gotas) 5 veces 0.2ml (4 gotas) 5 veces 0.1ml (2 gotas) En cada adicin de HCl, esperar y anotar la medida de pH 3. Se toma el otro beaker con glicina y con el electrodo del pHmeter dentro de la solucin, se procede a titular con NaOH 0.1N de la misma forma descrita en el paso anterior. LEER DE SU LIBRO DE TEXTO 1. AGUA, pH y BUFFER 2. GENERALIDADES, PROPIEDADES Y TITULACION DE LOS AMINOACIDOS

Accin Buffer de los Aminocidos pH Basal de Glicina Volmen HCl pH Volmen NaOH pH

Laboratorio de Bioqumica y Biologa Molecular I Tercer Laboratorio Actividad de la Anhidrasa Carbnica y Acidez Titulable I. Introduccin

El mantenimiento estable de la concentracin de hidrogeniones a nivel del organismo es escencial para la vida. Generalmente el pH tanto a nivel intra como extracelular es mantenido a niveles muy constantes. El pH del organismo es estabilizado gracias a la capacidad amortiguadora que poseen los lquidos corporales. Uno de los buffers en el organismo es el cido carbnico; este cido en solucin se encuentra parcialmente disociado en hidrogenin y bicarbonato: H2CO3 H+ y HCO3. Si a una solucin de cido carbnico le aadimos H+, el equilibrio de la ecuacin anterior tiende a desviarse a la izquierda, y por el contrario si agregamos grupos OH a la solucin el equilibrio tiende a ir a la derecha de la ecuacin. Como ejemplo de otros buffers a nivel del organismo tenemos a las protenas tanto intra como extracelulares. Uno de los rganos que contribuye con el mantenimiento del pH a nivel sistmico son los riones durante la formacin de la orina. En el laboratorio podemos determinar la cantidad de H+ aadidos al lquido tubular (orina) que se han combinado con el amortiguador de fosfato y otros amortiguadores orgnicos. El procedimiento consiste en titular la orina con una base fuerte como NaOH hasta un pH de 7.4, que es el pH normal del plasma. El nmero de miliequivalentes de NaOH necesarios para hacer que el pH de la orina vuelva a 7.4 es igual al nmero de miliequivalentes de H+ aadidos a la orina que se han combinado con el amortiguador de fosfato y otros amortiguadores orgnicos. El cido titulable medido no incluye a los H+ unidos a NH4+ porque el pK de la reaccin del amonaco/amonio es de 9.2 y slo llevamos con NaOH hasta un pH de 7.4. II. Objetivos

1. Conocer los principales sistemas amortiguadores del organismo y su localizacin. 2. Estudiar la funcin, localizacin y modo de accin de la anhidrasa carbnica. 3. Definir la importancia y determinar la acidez titulable de la orina

III.

Procedimiento

III a) Accin de la Anhidrasa Carbnica 1. A un estudiante voluntario se le extraen 3 ml de sangre y se procede a desfibrinarla en un beaker pequeo con perlas de cristal. 2. Se toman tres tubos de ensayo rotulados como A, B y C respectivamente y se preparan de la siguiente manera: a) Tubo A: 15 ml de agua destilada + 1 ml de azul de bromotimol 0.04% + 0.5 ml de bicarbonato al 5%. b) Tubo B: 15 ml de agua destilada + 1 ml de azul de bromotimol 0.04% + 0.1 ml de sangre desfibrinada + 0.5 ml de bicarbonato al 5%. c) Tubo C: 15 ml de agua destilada + 1 ml de azul de bromotimol 0.04% + 0.1 ml de sangre desfibrinada + 0.5 ml de bicarbonato al 5% + 1 ml de acetazolamida al 1 %. NOTA: Todos los tubos se preparan y se mantienen en hielo para lograr y mantener una temperatura de 4 grados centgrados. 3. Usando el pHmeter se procede a tomar el pH a cada tubo. 4. Luego se colocan los tubos en una corriente de CO2 y se tomar el tiempo necesario para que el contenido de cada tubo de ensayo cambie de color. 5. Finalmente se procede a tomar nuevamente el pH de cada tubo. Anote y analice los resultados obtenidos: pH antes del Tubo A B C CO2 pH luego del CO2 Tiempo

III b) Acidez Titulable 1. Un estudiante voluntario procede a depositar orina en un beaker. 2. En otro beaker se toman 25 ml de la orina y se mide el pH. 3. Con el electrodo del pHmeter dentro del beaker se titulan los 25 ml de orina con NaOH 0.1N hasta llegar a un pH de 7.4. 4. Se calculan los miliequivalentes de cidos excretados en la orina utilizando la siguiente equivalencia: 1 ml de NaOH 0.1N 0.1 mEq de cidos urinarios

LEER DE SU LIBRO DE TEXTO PRINCIPALES SISTEMAS AMORTIGUADORES DEL ORGANISMO Y SU LOCALIZACION

Laboratorio de Bioqumica y Biologa Molecular I Cuarto Laboratorio Reconocimiento de los Aminocidos y las Protenas I. Introduccin

Las protenas son las biomolculas ms abundantes despus del agua y desempean un gran nmero de funciones, que las caracterizan como componentes escenciales e indispensables para la vida. Virtualmente todos los procesos en los organismos vivos dependen de este tipo de molculas. Por ejemplo, las enzimas y las hormonas polipeptidicas dirigen y regulan el metabolismo en el cuerpo, mientras que las protenas contractiles del msculo permiten el movimiento. En el hueso, forman el esqueleto necesario para el depsito de cristales de calcio y fosfato, actuando como lo hacen las varillas en el concreto armado. En el torrente sanguneo, las protenas como la hemoglobina y la albmina plasmtica son molculas escenciales para la vida, igualmente las inmunoglobulinas participan en la destruccin de bacterias y virus. En resumen, las protenas realizan una increible diversidad de funciones. Las protenas no son ms que polmeros de 20 L alfa aminocidos unidos mediante enlaces peptdicos y van a mostrar una amplia variacin en sus tamaos, formas y propiedades. Sus propiedades qumicas y fisiolgicas dependen no slo de su tamao y forma, sino tambien de las propiedades de los aminocidos que las componen. II. Objetivos

1. Estudiar la estructura, propiedades, clasificacin y funcin de de los aminocidos, pptidos y protenas. 2. Identificar aminocidos y protenas utilizando pruebas de laboratorio especficas. 3. Desmostrar el efecto de la desnaturalizacin de las protenas por accin del pH, metales pesados y la temperatura. III. Procedimiento

III a) Pruebas utilizadas para la identificacin de aminocidos y protenas: 1. Reaccin de la Ninhidrina: Los aminocidos en general reaccionan con la nihidrina (hidrato de hicelohidrindeno) en presencia de calor dando dixido de carbono, amonico y un aldehdo que contiene un tomo de carbono menos que el compuesto original. La reaccin da lugar a la formacin de un producto de color azul o prpura, que es til para la estimacin cualitativa y cuantitativa de los aminocidos. No obstante, el color azul no es especfico para aminocidos debido a que el amonaco y la mayora de los polipptidos y protenas desarrollan el color con la ninhidrina.

Para realizar la prueba se toman 2 ml de la solucin a analizar en un tubo de ensayo y se le agregan 5 gotas de la solucin de ninhidrina. Se calienta en un bao de mara por 1 a 2 minutos y si la prueba es positiva se desarrollar un color azul. 2. Reaccin de Biuret: La reaccin de Biuret est dada por aquellas sustancias cuyas molculas contienen 2 grupos carbamino (-CO.NH) ligados directamente o a travs de un solo tomo de carbono o nitrgeno. Sustancias similares que contienen en lugar del grupo carbamino, grupos CS.NH, tambin responden a la prueba. Esto implica que compuestos no proteicos que contienen los grupos necesarios respondern a la prueba. Las protenas disuelven el hidrxido cprico del reactivo y forman compuestos coloreados violeta o violeta-rosado que depende de la naturaleza de las protenas. Para realizar la prueba se toman 2 ml de la solucin a analizar en un tubo de ensayo y se le agregan 2 ml del reactivo de Biuret, mezcle bien y si la prueba es positiva se desarrollar un color violeta. 3. Reaccin de Milln: Esta reaccin se debe a la presencia de grupos hidroxifenilos (C6H5OH) en la molcula proteica. Cualquier compuesto fenlico que no est sustituido en la posicin 3, 5, como la tirosina, fenol y timol, dan lugar a la reaccin. De estos compuestos, solamente la tirosina o tirosina halogenada se encuentran presentes en las protenas, de manera que la reaccin de Milln tiene lugar nicamente con las protenas que tienen tirosina. La prueba no es satisfactoria para soluciones que contienen sales inorgnicas en gran cantidad, ya que el mercurio del reactivo de Milln es precipitado y se vuelve inactivo, razn por la que este reactivo no se usa para medir albmina en la orina. Si la solucin a examinarse es muy alcalina debe ser previamente neutralizada, ya que el lcali precipita tambin el mercurio en forma de xidos amarillos. Para realizar la prueba se toman 2 ml de la solucin a analizar en un tubo de ensayo y se le agregan 3 a 4 gotas del reactivo de Milln. Se mezcla y se calienta en un bao de mara por 1 a 2 minutos. Las protenas se precipitan por accin de los cidos minerales fuertes del reactivo, dando un precipitado blanco que se vuelve gradualmente rojo al calentar. Si no se desarrolla color aada 2 o 3 gotas ms del reactivo y caliente otra vez. Se debe evitar un exceso de reactivo ya que puede producir un color amarillo, el cual no indica reaccin positiva. 4. Reaccin Xantoproteica: Esta reaccin se debe a la presencia en la molcula proteica de grupos fenilos (-C6H5), con el cual el cido ntrico forma compuestos nitrados amarillos. Los complejos de la molcula proteica de importancia en esta reaccin son los de tirosina y triptfano. La fenilalanina no responde a este ensayo en las condiciones en que se ha desarrollado. La reaccin no es satisfactoria para el examen de orina debido al color amarillo de la reaccin final. Para realizar la prueba se toman 2 ml de la solucin a analizar en un tubo de ensayo y se le agrega 1 ml de cido ntrico concentrado. Se calienta en un bao de mara y se observa la formacin de un precipitado amarillento que se vuelve gradualmente amarillo y se disuelve impartiendo el color a la solucin. Deje enfriar y aada cuidadosamente un exceso de hidrxido de amonio o de sodio y observe que el color amarillo se intensifica y pasa a anaranjado.

III b) Identificacin de aminocidos y protenas: 1. Tome 4 tubos de ensayo y coloque en ellos 2 ml de agua destilada y proceda a realizar las pruebas de Ninhidrina, Biuret, Milln y Xantoproteica. 2. Tome 4 tubos de ensayo y coloque en ellos 2 ml de la solucin de glicina y proceda a realizar las pruebas de Ninhidrina, Biuret, Milln y Xantoproteica. 3. Tome 4 tubos de ensayo y coloque en ellos 2 ml de la solucin de albmina de huevo diluida y proceda a realizar las pruebas de Ninhidrina, Biuret, Milln y Xantoproteica. Anote y analice los resultados obtenidos. Sustancia Analizada Agua Destilada Glicina Albmina III c) Desnaturalizacin de las protenas por accin del pH: Se toman 3 tubos de ensayo y se les agrega 2 ml de solucin de albmina de huevo a cada uno de ellos. Al tubo nmero 1 agregue 10 gotas de HCl concentrado y observe, al nmero 2 agregue 10 gotas de cido actico glacial y observe, al tubo nmero 3 agregue 10 gotas de agua destilada como control. Luego realice la prueba de Biuret a cada tubo. Anote y analice los resultados obtenidos. Tubo 1 Albmina+HCl 2 Albmina+CH3COOH 3 Albmina+Agua destilada Observacin Prueba de Biuret Ninhidrina Prueba Realizada Biuret Milln Xantoproteica

III d) Desnaturalizacin de las protenas por accin de los metales pesados: Se toman 3 tubos de ensayo y se les agrega 2 ml de solucin de albmina de huevo a cada uno de ellos. Al tubo nmero 1 agregue 10 gotas de nitrato de plata y observe, al nmero 2 agregue 10 gotas de nitrato de potasio y observe, al tubo nmero 3 agregue 10 gotas de agua destilada como control. Luego realice la prueba de Biuret a cada tubo. Anote y analice los resultados obtenidos.

Tubo 1 Albmina+Nitrato de plata 2 Albmina+Nitrato de potasio 3 Albmina+Agua destilada

Observacin

Prueba de Biuret

III e) Desnaturalizacin de las protenas por accin de la temperatura: Se toman 1 tubo de ensayo y se le agrega 2 ml de solucin de albmina de huevo. Lleve el tubo al calor y observe. Luego realice la prueba de Biuret. Anote y analice los resultados obtenidos. Tubo 1 Albmina+Calor Observacin Prueba de Biuret

LEER DE SU LIBRO DE TEXTO: ESTRUCTURA Y FUNCION DE AMINOACIDOS, PEPTIDOS Y PROTEINAS.

Laboratorio de Bioqumica y Biologa Molecular I Quinto Laboratorio Obtencin e Identificacin de la Casena de la Leche I. Introduccin

La leche es un alimento muy nutritivo, ya que contiene protenas, lpidos, lactosa, sales inorgnicas y vitaminas. La casena es la protena principal, siendo esta una protena conjugada que posee fsforo como grupo prosttico. Como muchas otras protenas de origen animal, esta es de un alto valor biolgico, ya que posee todos los aminocidos escenciales para el desarrollo y crecimiento normal del hombre. La separacin de la casena se realiza mediante la precipitacin con cido y junto a sta, cierta cantidad de grasa que ser extrada con solventes orgnicos en los que la casena es insoluble. II. 1. 2. 3. Objetivos

Conocer los fundamentos bioqumicos del aislamiento de la casena. Conocer la importancia de las reacciones de Biuret, Milln y Xantoproteica en la identificacin de la casena y algunos de los aminocidos que la componen. Determinar la presencia en la leche de fosfatos utilizando la prueba de Molibdato de Amonio y la presencia de cloruros mediante la prueba de Nitrato de Plata. III. Procedimiento

III a) Aislamiento de la casena: 1) Caliente 100 ml de leche hasta 40 grados centgrados y luego agregue 1 ml de cido actico glacial hasta que precipite toda la protena. Filtre con una gaza o al vaco hasta sacar el mximo de lquido. Guarde el filtrado para la determinacin de fosfatos y cloruros identificandolo como filtrado acuoso. Suspenda el precipitado del paso anterior en 50 ml de etanol al 95% y agite. Filtre con una gaza o al vaco hasta sacar el mximo de lquido. Guarde el filtrado para la determinacin de fosfatos y cloruros identificandolo como filtrado alcohlico. Repita el proceso aadiendo 50 ml de una solucin alcohol-ter 1:1 y filtre al vaco. Guarde el filtrado para la determinacin de fosfatos y cloruros identificandolo como filtrado alcohol-ter. El resduo obtenido es la casena que procederemos a identificar.

2)

3)

III b) Identificacin de la casena y aminocidos de la misma: En 3 tubos de ensayo diferentes aada 0.5 gramos de la casena obtenida y realice las pruebas de Biuret, Milln y Xantoproteica. Observe y anote los resultados. Prueba Resultados Biuret Milln Xantoproteica

III c) Determinacin de fosfatos y cloruros: 1) 2) Tome los filtrados obtenidos durante el aislamiento de la casena; si tienen turbidez llevelos a centrifugar y tome el sobrenadante. Determinacin de fosfatos con la prueba de Molibdato de Amonio: En 3 tubos de ensayo por separados tome una muestra de 2 ml de cada uno de los filtrados obtenidos en el paso A. Acidifique el medio aadiendo cido ntrico y luego aada 2 ml de molibdato de amonio. Observe el cambio de color. Determinacin de cloruros con la prueba de Nitrato de Plata: En 3 tubos de ensayo por separados tome una muestra de 2 ml de cada uno de los filtrados obtenidos en el paso A y aada a cada uno nitrato de plata al 1% gota a gota. Observe la formacin de un precipitado blanco. Tabla de resultados Filtrado Acuoso Alcohlico Alcohol-ter Nitrato de plata Molibdato amonio

3)

Laboratorio de Bioqumica y Biologa Molecular I Sexto Laboratorio Digestin de Carbohidratos por la Amilasa Salival I. Introduccin

Virtualmente todas las reacciones que ocurren en el organismo estn mediadas por enzimas, protenas catalticas que incrementan la velocidad de las reacciones sin que ellas se consuman durante el proceso que ellas catalizan. Sin enzimas la vida no sera posible ya que las mismas llevan a cabo funciones capitales relacionadas con la salud y la enfermedad. La velocidad de ciertas reacciones catalizadas por enzimas responde a las variaciones sutiles del pH intracelular que caracterizan la acidosis o alcalosis metablica. Adems, dado que esta velocidad se eleva o disminuye en respuesta a las fluctuaciones correspondientes en temperatura, la fiebre y la hipotermia perturban la homeostasia al modificar numerosas reacciones catalizadas por enzimas. Sin embargo estos cambios mnimos pueden convertirse en ventaja para el mdico si ste manipula controladamente dichos cambios. Otros factores que afectan la velocidad de las reacciones catalizadas por enzimas son los cambios en la concentracin, ya sea, de los sustratos sobre los cuales acta la enzima, as como, cambios en la concentracin de la propia enzima. Tambin la cintica enzimtica puede verse afectada debido a la presencia de sustancias inductoras o inhibidoras de la actividad enzimtica. II. 1. Estudiar el concepto de enzima. 2. Analizar los diferentes factores que afectan la cintica enzimtica. 3. Estudiar el papel de la amilasa salival en la digestin de los carbohidratos. 4. Introducir otras enzimas que participan en la digestin de los carbohidratos. III. Procedimiento Objetivos

III a) Efecto de la temperatura sobre la accin de la amilasa salival: 1. Tome 4 tubos de ensayo y agregue a cada uno de ellos 1 ml de solucin saliva 1:9 y luego, lleve cada tubo a la temperatura indicada para cada uno de ellos en el cuadro que aparece ms adelante y deje incubar durante 5 minutos. 2. Luego de incubar agregue a cada tubo 5 ml de solucin almidn al 1%. 3. Dejando los tubos en su temperatura correspondiente, proceda a realizar la prueba de Yodo a cada tubo a los 0, 3, 6 y 9 minutos luego de agregado el almidn.

4. Al cabo de los 9 minutos, realice la prueba de Benedict a cada uno de los tubos de ensayo. 5. Complete el siguiente cuadro con los resultados obtenidos: Tubo # 1 2 3 4 Temperatura 0 Grados Temp. Ambiente 38 Grados 100 Grados Prueba de Yodo 3 Min 6 Min Prueba de Benedict

0 Min

9 Min

III b) Efecto del pH sobre la accin de la amilasa salival: 1. Tome 7 tubos de ensayo y agregue a cada uno de ellos 1.5 ml de solucin saliva 1:9 y luego, agregue 3 ml de la solucin buffer correspondiente a cada tubo (indicado en el cuadro que aparece ms adelante). Deje en incubacin durante cinco minutos. 2. Luego de incubar agregue a cada tubo 5 ml de solucin almidn al 1%. 3. Proceda a realizar la prueba de Yodo a cada tubo a los 0, 3, 6, 9 y 12 minutos luego de agregado el almidn. 4. Al cabo de los 12 minutos, realice la prueba de Benedict a cada uno de los tubos de ensayo. 5. Complete el siguiente cuadro con los resultados obtenidos: Tubo # 1 2 3 4 5 6 7 Solucin Buffer pH 2.5 pH 5.4 pH 6.0 pH 6.8 pH 7.4 pH 8.0 pH 10.0 Prueba de Yodo 3 Min 6 Min 9 Min Prueba de Benedict

0 Min

12 Min

III c) Efecto de la presencia de inductores e inhibidores enzimticos: 1. Tome 6 tubos de ensayo y agregue a cada uno de ellos 1 ml de solucin saliva 2:8, aada luego, a cada tubo, 1 ml de la sustancia indicada en el cuadro que aparece ms adelante, deje en incubacin durante cinco minutos. 2. Luego de incubar agregue a cada tubo 5 ml de solucin almidn al 1%. 3. Proceda a realizar la prueba de Yodo a cada tubo a los 0, 5, 10, y 15 minutos luego de agregado el almidn. 4. Al cabo de los 15 minutos, realice la prueba de Benedict a cada uno de los tubos de ensayo. 5. Complete el siguiente cuadro con los resultados obtenidos: Prueba de Yodo 5 Min 10 Min Prueba de Benedict

Tubo # 1 2 3 4 5 6

Sustancia Agua destilada Cloroformo NaF NaCl 0.9% Fenol puro HgCl2 1%

0 Min

15 Min

Leer de su libro de texto: Propiedades generales de las enzimas Cintica enzimtica Factores que afectan cintica enzimtica

Laboratorio de Bioqumica y Biologa Molecular I Sptimo Laboratorio Caracterizacin de Carbohidratos I. Introduccin

Los carbohidratos se presentan en forma de azcares, almidones y fibras, y son uno de los tres principales macronutrientes que aportan energa al cuerpo humano (los otros son los lpidos y las protenas). Actualmente est comprobado que al menos el 55% de las caloras diarias que ingerimos deberan provenir de los carbohidratos. Los carbohidratos o hidratos de carbono glcidos constituyen compuestos qumicos formados principalmente por carbono, hidrgeno y oxgeno, elementos que se conjugan para formar diversos tipos, en una proporcin generalmente de 1:2:1, respectivamente. Estas biomolculas ejercen funciones fundamentales en los seres vivos, como: soporte (celulosa), reserva de alimento (almidn), reserva energtica (glucgeno), energa inmediata (glucosa). Pueden clasificarse atendiendo a varios criterios: de acuerdo al nmero de monmeros que constituyen al carbohidrato, al nmero de carbonos de sus monmeros o segn el grupo funcional que posee ese monmero. Entre los polisacridos que son fisiolgicamente importantes tenemos al almidn y el glucgeno. El primero est formado por una cadena -glucosdica. Compuesto que solo produce glucose en la hidrlisis, es un homopolmero denominado glucosano o glucano. Constituye la fuente ms importante de carbohidratos de los alimentos. Los dos constituyentes principales del mismo son: la amilosa (15-29%) que tiene estructura helicoidal no ramificada y la amilopectina (80-85%), que consiste en cadenas muy ramificadas. Por su parte, el glucgeno es el polisacrido que se almacena en el organismo animal y contiene una estructura mucho ms ramificada que la amilopectina. II. 1. 2. Objetivos

Estudiar las propiedades, diferencias y clasificacin de los carbohidratos. Utilizar distintas pruebas de laboratorio para caracterizar y clasificar los carbohidratos. III. Procedimiento

III a) Pruebas utilizadas para la identificacin de carbohidratos: 1. Reaccin de Molish: La presencia de carbohidratos en una muestra se pone de manifiesto por la reaccin de Molish, que a cierto punto es la reaccin universal para cualquier carbohidrato. Se basa en la accin hidrolizante y deshidratante del cido sulfrico sobre los hidratos de carbono. En dicha reaccin el cido sulfrico cataliza la hidrlisis de los enlaces glucosdicos de la muestra y la deshidratacin a furfural (en las pentosas) o

hidroximetilfurfural (en las hexosas). Estos furfurales se condensan con el alfa naftol del reactivo de Molisch (reaccin de Molisch) dando un producto coloreado. Realizacin de la prueba: en un tubo de ensayo se depositan 2 ml de la muestra a ensayar, agregue dos gotas de reactivo de Molisch y mezcle bien. Luego incline el tubo y deposite 1 ml de H2SO4 concentrado deslizndolo lentamente por la pared del tubo. No mezcle. Slo coloque el tubo en posicin vertical y observe la formacin del anillo rojo violeta que aparece en la zona de contacto de los dos lquidos. 2. Reaccin de Benedict: Una de las reacciones ms comunes en la identificacin de carbohidratos es la reaccin de Benedict. Esta reaccin es especfica para azcares con grupo reductores libres (C=O). Todos los monosacridos poseen un grupo reductor libre. Los disacridos maltosa y lactosa tienen grupos reductores libres, pero la sacarosa no los posee, ya que se pierden los grupos reductores de sus componentes cuando sta es formada. Esta prueba se basa en la capacidad del carbohidrato de reducir el Cu2+ en un medio alcalino. Este Cu1+ se oxida y precipita en forma de Cu2O, lo que proporciona la coloracin positiva de la reaccin. La coloracin depender de la concentracin de xido de cobre y sta a su vez de la reduccin del cobre; va desde verde, amarillo, anaranjado o rojizo, dependiendo de la coloracin. Realizacin de la prueba: en un tubo de ensayo se depositan 2 ml de la muestra a ensayar, agregue 2 ml del reactivo de Benedict y proceda a colocar el tubo de ensayo en un bao de Mara a 100 C durante dos minutos. 3. Reaccin de Seliwanoff: Los carbohidratos se clasifican como cetosas o aldosas. Vale decir, que las cetosas en el carbono 2 tienen una funcin cetona, que en presencia de un cido fuerte producen rpidamente derivados furfricos que reaccionan con un difenol llamado resorcina que est contenido en el reactivo de Seliwanoff. La sacarosa (un disacrido formado por glucosa y fructosa) y la inulina (un polisacrido de la fructosa) dan positiva la reaccin, ya que el HCl del reactivo provoca en caliente la hidrlisis del compuesto liberando fructosa (responsable de la reaccin positiva). Realizacin de la prueba: en un tubo de ensayo se depositan 2 ml de la muestra a ensayar, agregue 2 ml del reactivo de Seliwanoff y proceda a colocar el tubo de ensayo en un bao de Mara a 100 C durante dos minutos. 4. Reaccin de Bial: Consiste en la formacin de un producto de color azul-verdoso entre el furfural de los carbohidratos y el orcinol del reactivo de bial en medio clorhdrico. Es especfica de pentosas. Realizacin de la prueba: en un tubo de ensayo se depositan 2 ml de la muestra a ensayar, agregue 1 ml del reactivo de Bial + 2.5 ml de cido clorhdrico concentrado y proceda a colocar el tubo de ensayo en un bao de Mara a 100 C durante 5-10 minutos. 5. Identificacin de polisacridos mediante la prueba de yodo: Los polisacridos dan un color especfico en presencia de yodo. El almidn que est compuesto de amilosa (estructura lineal) y amilopectina (estructura ramificada) cuando se le agrega yodo se obtiene un color azul ya que a pesar de que la amilosa es el componente menos abundante, est en la parte externa del grnulo de almidn, sin embargo, si realizaramos la prueba a la amilopectina nicamente obtuvieramos una coloracin rojo-violeta en presencia de yodo. La prueba es igualmente satisfactoria para el glucgeno.

III b) Identificacin de carbohidratos: 1. Utilizando 4 tubos de ensayo para cada uno de los carbohidratos indicados en la tabla que aparece ms adelante, deposite 2 ml de cada uno de ellos en cada uno de los tubos y proceda a realizar las pruebas de Benedict, Molish, Seliwanoff y Bial a los tubos respectivamente.

Carbohidrato Glucosa 1% Maltosa 1% Manosa 1% Ribosa 1% Galactosa 1% Fructosa 1% Lactosa 1% Sacarosa 1% Agua destilada

Molish

RESULTADOS Benedict Seliwanoff

Bial

2. En un plato de petri o en un vidrio de reloj coloque un poco de solucin de almidn y agregue gotas de una solucin de yodo. Repita el mismo procedimiento con un poco de yuca y papa. Sustancia Solucin almidn Yuca Papa Resultados prueba de yodo

LEER DE SU LIBRO DE TEXTO: CARBOHIDRATOS DE IMPORTANCIA FISIOLOGICA CLASIFICACION, NOMENCLATURA Y ESTRUCTURA CARBOHIDRATOS

DE

LOS

Laboratorio de Bioqumica y Biologa Molecular I Octavo Laboratorio Caracterizacin de Lpidos I. Introduccin

Los lpidos son biomolculas orgnicas formadas bsicamente por carbono e hidrgeno y generalmente tambin oxgeno; pero en porcentajes mucho ms bajos. Adems pueden contener tambin fsforo, nitrgeno y azufre. Es un grupo de sustancias muy heterogneas que tienen en comn estas dos caractersticas: 1. Son insolubles en agua 2. Son solubles en disolventes orgnicos, como ter, cloroformo, benceno, etc. Son compuestos de gran importancia bioqumica, ya que desempea grandes funciones como la liberacin y reserva de energa qumica, proven de una barera hidrofbica que permite la compartimentalizacin del contenido acuoso de las clulas y estructuras subcelulares. En adiccin a esto, los lpidos llevan a cabo varias funciones en el organismo, por ejemplo, algunas vitaminas liposolubles tienen funciones regulatorias o funciones como coenzimas, y las prostaglandinas y hormonas esteroideas juegan papeles mayores en el control de la homeostasis del organismo. Hay ciertos cidos grasos poliinsaturados esenciales que deben ser suministrados en la dieta como lo es el cido linoleico dndole esto mayor valor nutricional. Los lpidos se clasifican de varias formas, una de ellas es atendiendo a que posean en su composicin cidos grasos (Lpidos saponificables) o no lo posean (Lpidos insaponificables), dividiendose as en dos grupos: 1. Lpidos saponificables A. Simples 1. Acilglicridos 2. Cridos B. Complejos 1. Fosfolpidos 2. Glucolpidos 2. Lpidos insaponificables A. Terpenos B. Esteroides C. Prostaglandinas Los triglicridos son los ms abundantes en los vegetales y uperio uperiors. Se acumulan en los depsitos grasos y en las semillas como forma de reserva alimenticia.

II. 1. 2.

Objetivos

Estudiar los lpidos; su importancia, estructura, clasificacin, funcin y caractersticas fsico-qumicas. Estudiar la importancia de las diferentes pruebas usadas en la identificacin de los lpidos y reacciones de importancia biolgica para la identificacin de las caracteristicas de los lpidos. III. Procedimiento

III a) Solubilidad de los lpidos: Los lpidos son insolubles en agua. Cuando se agitan fuertemente en ella se dividen en pequesimas gotas formando una emulsin de aspecto lechoso, que es transitoria, pues desaparece en reposo por reagrupacin de las gotitas de grasa en una capa que, por su menor densidad, se sita sobre el agua. Por el contrario, las grasas son solubles en disolventes orgnicos, como el ter, cloroformo, acetona, benceno, etc. Su solubilidad en alcoholes depender del tamao del mismo as como de su ramificacin (a mayor nmero de carbonos ms soluble ser el lpido no as con la ramificacin). Procedimiento: Tome 10 tubos de ensayo y aada a cada tubo 2 mL de cada una de las siguientes sustancias o disolventes: Agua destilada, cido clorhdrico concentrado, benceno, cloroformo, tetracloruro de carbono, ter, alcohol metlico, alcohol etlico, alcohol isoproplico, alcohol butlico . A todos los tubos aada 1 mL de aceite. Observe los resultados. III b) Nmero de yodo: Es una medida del grado de insaturacin de los componentes de una grasa. Ser tanto mayor cuanto mayor sea el nmero de dobles enlaces (C=C) por unidad de grasa, utilizndose por ello para comprobar la pureza y la identidad de las grasas. Es la cantidad (gramos) de yodo absorbidos por 100 gramos de grasa. El nmero de yodo oscila entre 0 (cidos grasos saturados) a 350. Fundamento terico del mtodo: La grasa disuelta se hace reaccionar con monobromuro de yodo en exceso. El yodo por s mismo no reacciona con los dobles enlaces. En su lugar se utilizan bromo o halogenados mixtos como yoduro de cloro ICl o el bromuro de yodo IBr. La cantidad de monobromuro de yodo que no se adiciona a los dobles enlaces oxida una solucin de yoduro (I-) a yodo (I2), y ste se determina por valoracin con una disolucin de tiosulfato sdico (2Na2S2O3). La reaccin de adicin se lleva a cabo en oscuridad para evitar que se produzcan reacciones laterales de radicales inducidos por la luz y ello provocara un gasto aparente mayor de halgeno, falseando los resultados. A continuacin se muestran las tres reacciones involucradas:

1) 2) 3) Procedimiento:

IBr + R1-CH=CH-R2 R1-CHBr-CHI-R2 IBr + KI KBr + I2 I2 + 2Na2S2O3 2NaI + Na2S4O6

1) Tomar dos matraces de 500 ml cada uno. Uno de ellos ser nuestro matraz blanco o control y el otro, nuestro matraz experimento o problema. Agrega las siguientes sustancias en sus debidos matraces. Control: Experimento: - 10 ml de Cloroformo. - 12 ml de yodo Hanus. - 10 ml de Cloroformo. - 12 ml de yodo Hanus. - 1.0 ml de aceite.

2) Lleve estos dos matraces, debidamente tapados, a la oscuridad por un perodo de 30 mins. Agitar ambos matraces cada 5 minutos. 3) Pasado este tiempo, retrelos de la oscuridad y agregue a cada matraz lo siguiente: 7 ml de KI (solucin de yoduro de potasio). Agitar. 100 ml de agua destilada (lavar el tapn del matraz con esta agua para no perder yodo libre en l) quien aadir volumen a la mezcla. 4) Titular el exceso de yodo de cada matraz con tiosulfato de sodio 0.1N hasta que la mezcla contenida en cada matraz tome una coloracin amarillenta. Una vez que esto suceda, tape cada matraz y agtelo para conseguir que cualquier cantidad de yodo libre quede atrapado en la capa de cloroformo y se ponga en contacto con la solucin de yoduro de potasio. 5) Agregue 1 ml de una solucin de almidn al 1% como indicador para asegurarnos de que no quede yodo libre en la solucin. 6) Calcule el nmero de yodo para la muestra dada. Clculos: Calcule los gramos de yodo absorbidos por cada 100 grs. de grasa. 1) Para esto primero necesitamos saber qu cantidad de yodo se consumi en el matraz problema. Esto lo conseguimos restando la cantidad de tiosulfato de sodio 0.1N requeridos por el blanco menos la cantidad de tiosulfato de sodio 0.1N requeridos por el problema ya que esto representa el tiosulfato equivalente al yodo absorbido por la materia grasa. Ej. Suponiendo que el matraz control consumi 50 ml de tiosulfato mientras que el experimento slo consumi 20 ml : 50-20 = 30ml que representan los ml de yodo consumidos ya que 1 ml de tiosulfato equivale a 1 ml de yodo. 2) Con una regla de tres busque los mililitros de yodo consumidos por 100 gramos de grasa. Ej. 10 gr de grasa (usados en el experimento) ---- 30 ml de yodos consumidos 100 gramos de grasa -----x

3) Por ultimo ajuste estos ml de yodos a gramos que es lo que nos interesa. Esto lo puedes lograr por la siguiente regla de tres: Ej. 1ml de yodo ----- 0.0127 gramos de yodo. ml de yodos consumidos* ---- x

* = resultado del clculo anterior. 4) Por ultimo debes calcular el nmero de yodo en base al peso de la grasa, calculando la misma utilizando la formula de la densidad. D=m/V donde D = densidad, m = masa, V= volumen. D= 0.916 para la grasas. III c) Nmero de saponificacin: La saponificacin consiste en una hidrlisis alcalina de la preparacin lipdica (conKOH o NaOH). Los lpidos derivados de cidos grasos (cidos monocarboxlicos decadena larga) dan lugar a sales alcalinas (jabones) y alcohol, que son fcilmente extrables en medio acuoso.

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El nmero de saponificacin no es ms que los miligramos de KOH necesarios para saponificar 1 gramo de materia grasa. Esta prueba es otra prueba cualitativa que podemos aplicar a los lpidos. Esta nos permite ver si el tipo de lpido es saponificable (contiene cidos grasos) o no (no contiene cidos grasos). En los lpidos saponificables nos orienta hacia cul sera el peso molecular de la molcula expresando una relacin inversa entre esta molcula y el nmero de saponificacin. Se describe una relacin inversa ya que a menor peso de la molcula mayor cantidad de molculas existirn en cierta cantidad grasa dada, as que mayor cantidad de cidos grasos habrn. Debido a esto ltimo tambin habrn muchos grupos carboxlicos con los cuales reacciona el KOH. Por lo tanto, mayor cantidad de KOH consumida dar un nmero mayor de saponificacin. Tomemos los dos ejemplos siguientes de Tripalmitina (PM=819)y Tributirinina(PM=412). En 1 gramo de tributirina hay mayor nmero de molculas de tnglicridos que en 1 gramo de tripalimtina, ste ltimo por tener mayor peso molecular, completa el gramo de grasa con menor nmero de molculas de triglicridos.

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Efectivamente, teniendo en cuenta que el peso molecular de la tripalmitina es 819 y de la tributirina es 302, habr 819/302 6 2.7 veces ms molculas de tributirina que de tripalmitina en un mismo peso de cada una de las grasas indicadas. En conclusin, el nmero de saponificacin de la tributirina ser tambin 2.7 veces mayor que el de la tripalnitina. Procedimiento: 1) Tomar dos matraces de 250 mL cada uno. Agrega las siguientes en sus debidos matraces: Control: - 50 mL de KOH Experimento: - 50 mL de KOH. - 5mL de aceite. 2) Conecte cada matraz a un condensador de reflujo enfriado por aire y lleve a bao de mara por 30 minutos. Agite con frecuencia. 3) Aada 1mL de fenolftalena (indicador de medio bsico) a cada matraz y luego titule con HCl 0.5N para corregir cualquier consumo de lcali del control. Anote los mL consumidos por cada matraz. 4) Calcule el nmero de saponificacin. Clculos: Calcule los miligramos de KOH necesarios para saponificar 1 gramo de materia grasa. 1) Para esto primero necesitamos saber qu cantidad de KOH que se consumi en el matraz problema que lo conseguimos restando la cantidad HCl 0.5N consumidos por el blanco menos la cantidad de HCl 0.5N requeridos por el problema. Ej. Suponiendo que el matraz control consumi 50 mL de HCl mientras que el experimento slo consumi 20 mL : 50-20 = 30mL. 2) Como lo deseado es saber los gramos de grasa y no los ml de ella, convierta los mL consumidos a gramos con la frmula de la densidad de la grasa: D=m/V donde D = densidad, m = masa, V= volumen. D= 0.916 para la grasas. Ej. 10 mL de aceite; m=D*V= 0.916*10mL=9.16gr. 3) Con una regla de tres busque los mililitros de HCl consumidos por 1 gramo de grasa. Ej. 9.16 gr de grasa (usados en el experimento) ---- 30 mL de HCl consumidos

1 gramos de grasa ---- -x 4) Por ultimo ajuste estos mL de HCl a su equivalente en KOH que es lo que nos interesa. Esto lo puedes lograr por la siguiente regla de tres: Ej. 1mL de HCl ----- 28.05 mg de KOH. mL de HCl * ---- x *= resultado del clculo anterior.

LEER DE SU LIBRO DE TEXTO: LIPIDOS DE IMPORTANCIA FISIOLOGICA, FUNCIONES, CLASIFICACION, CARACTERISTICAS FISICO-QUIMICAS.

Laboratorio de Bioqumica y Biologa Molecular I Noveno Laboratorio cidos Nucleicos I. Estructura Primaria. En todas las clulas vivas hay cidos nucleicos; en su mayora estn constituyendo las nucleoprotenas, complejos formados por protenas bsicas (protaminase histonas) y cidos nucleicos. Desde que Miescher aislara por vez primera una nucleoprotena, en 1869, se han puesto a prueba numerosas tcnicas para separar los cidos nucleicos de las protenas a las que estn unidas. Se sabe que no todos los cidos nucleicos son iguales; en los tejidos constituidos por clulas provistas de grandes ncleos, como el Timo, predomina un tipo de cido nucleico, llamado antes cido timonucleico; en otras clulas, que tienen ncleos diminutos, como las levaduras, predomina un tipo distinto: cido nucleico de levadura. Estos dos tipos de cidos nucleicos se denominan hoy, atendiendo a su composicin qumica, cido desoxirribonucleico (ADN) y ribonucleico (ARN) respectivamente. El ADN est fundamentalmente compuesto de fosfato, las bases pricas: adenina y guanina, las bases pirimdicas: timina y citosina, y el azcar 2-desoxi-d-ribosa. El ARN difiere del ADN por contener la base pirimdicas uracilo en lugar de la timina y el azcar d-ribosa en lugar de la 2-desoxi-d-ribosa. Los datos que hoy poseemos ponen de manifiesto la existencia de una frmula qumica bsica, comn a ambos tipos de cidos nucleicos y consistente en una cadena o esqueleto constituido por grupos alternados de fosfato de azcar furanosa unidos por enlaces regulares 35fosfodiester. Las bases pricas o pirimdicas se unen a este esqueleto o cadena de azcar fosfato a travs de enlaces BetaNglicsilo en la posicin 1de la ribosa o de la desoxirribosa. A cada sub-unidad estructural, formada por una base nitrogenada y un azcar, se le denomina nuclesido. A estos que contienen un fosfato en las posiciones 2, 3 5 se les llama nucletidos (el nmero seguido del signo () indica la posicin en la base. A los compuestos formados por asociacin de dos o ms nucletidos, constituyendo pequeas molculas, se les denomina oligonucletidos. Estructura Secundaria. Los diversos estudios fisioqumicos del ADN en solucin acuosa han demostrado que se trata de un polmero del elevado peso molecular (5x10 elevado a la sexta potencia) y que ofrece una configuracin mas bien rgida y distendida. Entre las consecuencias de su elevado peso molecular y de la rigidez de sus molculas se destaca la elevada viscosidad de las soluciones acuosas de ADN. Solucin con 104 g/ml de ADN, es dos veces ms viscosa que el agua. Otra consecuencia de las citadas propiedades de la molcula de ADN es la gran Introduccin

facilidad con que las fuerzas de friccin (agitacin a gran velocidad, paso a travs de una pipeta o jeringa) reducen su peso molecular por rotura de su cadena. Es prcticamente imposible obtener a partir de material biolgico ADN sin que tenga cierto grado de friccin, por lo que es muy probable que los pesos moleculares del ADN aislado (5x10 a la sexta potencia) tengan poco que ver con el tamao de la molcula del ADN en vitro. El ADN fibroso aislado tiene un modelo de difraccin de rayos X muy neto, indicio experimental directo de una estructura secundaria muy regular. Watson y Crick propusieron en 1953 una estructura secundaria del ADN, que dedujeron de stos modelos de difraccin de rayos X, y que estaban de acuerdo con las observaciones de Chargaff (4), mostrando que ciertos pares de base de ADN, se presentan en cantidades equimoleculares. Esta estructura de Watson y Crick est constituida por dos cadenas de ADN que se enrollan helicoidalmente en torno a un eje central comn, originando una molcula de cadena doble y de unos 20 Amgstron de dimetro. Las cadenas de azcar-fosfato estn situadas en la parte externa de estas hlices orientadas con direccin de enrollamiento a la derecha; las bases pricas y pirimdicas se encuentran enlazadas por puentes de hidrgeno, en la parte interna de las citadas hlices, con los planos de sus anillos orientados perpendicularmente al eje central. Slo se tolera el apareamiento de bases entre la adenina y la timina o uracilo, en el caso del RNA, y entre la guanina y citosina. Nucleoprotenas. Como se dijo anteriormente, los cidos nucleicos se encuentran conjugados con protenas. Las nucleoprotenas el ADN y ARN pueden degradarse en sus components y ser identificados por separados. II. Objetivos

1. Estudiar los cidos nucleicos: clasificacin, diferencias estructurales y funcionales, localizacin y sus componentes. 2. Analizar la importancia de la homogenizacin de las levaduras, pruebas de Bial, Biuret y de identificacin de fosfatos y bases nitrogenadas en el reconocimiento de los componentes que formas los cidos nucleicos. III. Procedimiento

1. Suspenda 15 grs de levadura en 125 ml de NaOH 0.04 M y homogenice con licuador por 5 minutos. Transfiera el contenido a un matraz Erlemeyer y caliente en un bao de Mara por 20 minutos. Luego debe centrifugar por 3 minutos y tomar el sobrenadante el cual llevar a un beaker (250ml) donde le agregarn gotas de cido actico glacial hasta que el medio este cido. 2. Tome la muestra y agregue 100mL de una solucin de HCl/Etanol 95% (1:99). Proceda a centrifugar por 3 minutos. Tome precipitado y lave con Etanol 95%. Centrifugue nuevamente, tomando luego el precipitado. - Tome una muestra del precipitado y haga la prueba de Biuret.

3. A cada tubo de ensayo con el precipitado restante de la muestra agregue 3mL de H2SO4 3N y lleve a bao de mara durante 3 minutos. Hecho esto realice las siguientes pruebas: A. Identificacin de la Ribosa. Tome 4 tubos de ensayo y agregue lo siguiente en cada uno: Tubo 1 2 3 4 Sustrato 1 ml Agua destilada 1 ml de ribosa 1% 1 ml de ribosa 0.5% 1 ml del precipitado Reactivo de Bial 1 ml 1 ml 1 ml 1 ml HCL concentrado 2.5 ml 2.5 ml 2.5 ml 2.5 ml

Lleve al calor por 5 minutos o hasta que observe un cambio de color. El reactivo de Bial est compuesto por iones frricos, etanol y orcinol. Consiste en la formacin de un producto de color azul-verdoso entre el furfural y el orcinol en medio clorhdrico. Es especfico de pentosas. B. Identificacin Base Nitrogenada. Agregue gotas de Hidrxido de amonio (NH4OH) concentrado hasta obtener un medio bsico y algunas gotas de Nitrato de Plata 0.1 M a una pequea cantidad del precipitado obtenido que ha sido colocado en un tubo de ensayo. Observe. C. Identificacin de Fosfatos. Agregue un poco del precipitado en un tubo de ensayo y aada Hidrxido de Amonio (NH4OH) concentrado hasta obtener un medio bsico, acidifique con algunas gotas de HNO3 y agregue Molibdato de Amonio (1mL). Observe.

LEER DE SU LIBRO DE TEXTO LA ESTRUCTURA Y FUNCION DE LOS ACIDOS NUCLEICOS