ELECTROFORESIS

GENERALIDADES
Y
APLICACIONES CLINICAS

Marcelo Castillo Navarrrete, T.M. MsCs (C)

Facultad de Medicina
Carrera Tecnología Médica
18 de Noviembre de 2004
 Fundamentos de Electroforesis
• Alta sensibilidad, resolución y versatilidad.
• Método de separación de
– Ácidos nucleicos
– Proteínas
– Otras biomoléculas
• Entrega criterio de pureza.
• Separa mezclas complejas
• Permite determinar
– El peso molecular de una proteína
– Punto isoeléctrico.
– Número de cadenas polipeptídicas de una proteína
Fundamentos de Electroforesis
• Migración de solutos en
un campo eléctrico.
• Se mueven las partículas
en base a:
– Su carga neta.
– Peso molecular
– Estructura tridimensional
Fundamentos de Electroforesis
“La velocidad de migración (V) de la
partícula es directamente al producto de
su carga efectiva (q) y el gradiente de
potencial eléctrico (E) e inversamente
proporcional al coeficiente de fricción (f)
relativo a la talla y forma de la molécula, o
sea, a la resistencia que le ofrece el
medio”

V = qE/f
 Fundamentos de Electroforesis
• La Movilidad electroforética (Me)
– Es un caso particular de la migración
de un ión.
– En un campo eléctrico de 1V/cm
– Su signo es igual al de la carga de la
partícula.
• La velocidad de Migración
electroforética
– Carga de la molécula
– Voltaje aplicado
• Exceso de voltaje = Incremento del
calor.
• Bajo voltaje = pobre separación (por
difusión)
– Porosidad del gel
Fundamentos de Electroforesis
• Las biomacromoléculas.
– Poseen carga eléctrica.
– Grupos catiónicos y
aniónicos disociables.
• La carga neta de una
molécula
– pH del medio
– La interacción con otras
pequeñas moléculas de
iones.
– La interacción con otras
macromoléculas.
Fundamentos de Electroforesis
• La carga neta de una
molécula (2)
– El pH influye en la
migración de una
molécula
– En el punto
isoeléctrico, la
proteína no migra.
• Por debajo del pto.
Isoelectrico migra hacia
el cátodo.
• Por encima del pto.
Isoeléctrico migra hacia
el ánodo.
ADN PROTEINAS
Fundamentos de Electroforesis
• Los soportes usados
– Polímeros
– Gel poroso
• Restringe el movimiento de las moléculas
• Disminuyen los flujos de convección del solvente.
– Se han usado como soporte
• Papel (celulosa)
• Almidón
• Poliacrilamida
• Agarosa
• Acetato de Celulosa
 CELULOSA ALMIDON

POLIACRILAMIDA AGAROSA
Fundamentos de Electroforesis
• La electroforesis
presenta gran
poder resolutivo
– Pequeña cantidad
de proteína
– Zona estrecha
(carril)
– Gran longitud de
trayecto (longitud
del carril).
Fundamentos de Electroforesis
• Equipamiento
necesario.
– Fuente de poder,
– Cubeta vertical u
horizontal.
– 2 electrodos
– Actualmente
existen sistemas
automatizados de
electroforesis.
 Electroforesis en gel de
poliacrilamida
• La poliacrilamida:
– Soporte empleado
frecuentemente
(3.5 – 20 %)
– Químicamente
inerte
 Electroforesis en gel de
poliacrilamida
• La poliacrilamida:
– De propiedades uniformes
• Geles transparentes
• Estabilidad mecánica
• Insolubles en agua
• Relativamente no iónicos
• Rango pequeño de
separación
• Alta resolución
• El tamaño del poro, varía
de manera uniforme con la
cenctración del gel.
– De preparación rápida, pero
trabajosa
– Reproducible
 Electroforesis en gel de
poliacrilamida
• Formación del gel
– Polimerización vinílica
• monómero de
acrilamida (CH2=CH-
CO-NH2)
– Potente neurotoxina
• Monómero
entrecruzador N,N’-
metilen-bis-acrilamida
(CH2=CH-CO-NH-CH2-
NH-CO-CH=CH2)
 Electroforesis en gel de
poliacrilamida
• Formación del gel
– Se inicia
• formación de radicales libres del
monómero
• Que producen radicales libres del
oxígeno
• Por acción de iones persulfato.
– Las aminas terciarias (N,N,N,N’-
tetrametilen-diamina, TEMED)
• Catalizadores de la reacción
• Formación de radicales libres del
persulfato
• Se inhibe fuertemente por niveles
altos de Oxígeno.
 Electroforesis en gel de
poliacrilamida
• Separación electroforética
– Función importante:
• pH
• Fuerza iónica
• Gradiente de potencial
• Tiempo de corrida
• Concentración de acrilamida y bisacrilamida
– Las condiciones óptimas
• Determinadas experimentalmente
 Electroforesis en gel de agarosa
• Polisacárido
– extraido de algas marinas
– Usado de 0.5 – 2%
• Geles fáciles de
preparar
• No es tóxico
• Amplio rango de
separación
• Baja resolución
• Usado típicamente para
ADN
 Electroforesis de proteínas
plasmáticas
• En clínica
– se usa normalmente acetato de celulosa
– Soporte Inerte
– Se lee en un fotodensímetro
• Dibuja un trazado de absorbancia
• Se obtiene una curva
– El proteinograma
• Permite orientación rápida y clínicamente
significativas
MIELOMA MULTIPLE
GAMAPATIAS MONOCLONALES
REACTANTES DE FASE AGUDA
ENFERMEDAD HEPATICA
PATRON ELECTROFORETICO EN ENFERMEDADES GASTROINTETINALES
PT ALB. Alfa1 Alfa2 Beta Gamma
Ulcera Péptica D D Puede estar A Puede estar A

Colitis D D Puede estar A Puede estar A D

Ulcerosa

Enteropatía D Notable A A D
perdedora de
proteínas

Hepatitis vírica D, D D(indica lesión D D V, A

aguda N hepatocelular
aguda)
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