z

ILl ILl

tit:!:
ILl
tI)

<C

VI

>

....

GUIA
V)

o o« o
........
~~ ~

w Z

LECTURA

tI)

.....
W

::l

C ~0:::

LU t--

--len al ....

Q_~

=>=

<C

........

0::

W til

Nov. 2006: corte de In Av. Scm Martin en rechozo 010 ocrediloci6n de 10corroro de velerinorio 010 CoNEAU

FACUlTAD DE CIENCIAS VETERINARIAS

UNIVERSIDAD DE BUENOS AIRES

2008

VIROLOGIA
QUIA DE LECTURA
EDlcrON 2008

Autores:

MV, MSc, PhD Gustavo Delhon MV, PhD Ana Cristina Bratanich MV Marcelo Gonzalez Vet. Luis Jauregui Vet Danilo Bucafusco Srta. Susana Zacarias Vet. Maria Amelia Gisbert

Prologo In curso de Virologia Animal tiene el caracter de curso h}lSico: El fundamento de este enfoque es brindar al estudiante las herramientas biologicas con las cuales abordar Ia problernatica de los virus en otros coutextos, sean medicos 0 productivos, Por su simpleza relativa, los virus se ofrecen como excelentes modelos para el analisis del parasitismo a nivel molecular, tanto en el contexto de Ia celula como del huesped. Desafortunadarnente, ninguno de los textos clasicos sobre Virologia Fundamental ha sido traducido a1 castellano. Este apunte ha sido confeccionado en base a esos textos y a publicaciones peri6dicas en la especialidad, Lejos de reemplazar al mencionado material, tanto en nivel de cobertura como en organizacion y extension, el apunte fue concebido como una guia para ayudar al estudiante a conceptualizar los fundamentos que subyacen a los virus como agentes que alteran la homeostasis. Area'de Virologia

FeV

Indice
Pagina

I.,Que es un virus?
Historia de la Virologfa Taxonomla de los virus................ Estructura de los virus Genetica viral CicIo infeccioso Efectos de los virus sobre la funcion celular. Virus y Apoptosis Virulencia Respuesta inmune especifica e inespecffica a las infecciones virales Tipos de interaccion entre virus y celulas Antivirales Evolucion de las enfennedades virales Esterilidad, Desinfeccion, Bioseguridad Cultivos Celulares ., ., .,., .,............................

.
2

8 32 49 64 105 113 117 121 139 154 163 167 176

Aislamiento .., Cuantificacion

Microscopia Electronica PCR

180
186 189 195

i,Que es un_virus'?
Un virus es un parasite intracelular obligatorio, muy pequeiio e infeccioso, constituido por proteinas, acidos nucleicos y, a veces, fosfolipidos. El acido nucleico, que puecIe
SCI'

RNA

DNA, constituye

el genom a viral.

Dentro de una celula huesped apropiada, el genom a viral es replicado hasta obtener multiples copias del mismo. A su vez, el genoma viral dirige 1£1intesis de las proteinas s virales utilizando Lamaquinaria biosintetica de 1£1 celula. La progenie viral se forma a partir del ensamblaje de las proteinas y acidos nucleicos virales. La pro genie viral es el vehiculo para la transmision del genoma viral a una nueva celula o animal, donde su desensamblaie inicia un nuevo ciclo infeccioso. Los virus son mucho mas simples que los microorganismos mas pequefios y carecen de de los sistemas generadores de energia y biosinteticos necesarios para una vida independiente. Pew no par ella los virus son los agentes mas sencillos. POl' ejernplo, los viroides son moleculas de RNA que infectan (y enferman) a una variedad de plantas de irnportancia economica. Los priones son simples moleculas de proteinas capaces de inducir enfermedades desvastadoras en los animales y el hombre.

Historia

de fa Yirologj~

La caracterizacion de los virus mencionada am ba necesrto decadas de investigacion, En rigor, hasta la Segunda Guerra Mundial solo sabiamos que los virus eran agentes infecciosos muy pequefios: producian enferrnedad y atravesaban filtros que retenian a las bacterias. Inicialmente, el termino virus se empleaba eon cierta ambiguedad para referirse a distintos agentes, pero hacia el final del primer cuarto del sigh) XX su uso se limite a los

agentes filtrables Para apreciar el contexte en que surge el concepto de virus debemos retrotraemos a los afios en que se define el concepto mismo de infecciosidad. Hacia el ultimo cuarto del siglo XIX ocurrieron tres avances serninales en 121 historia de la Microbiologia: 1) Louis Pasteur demuestra que la generacion espontanea de organismos no existe, 2) Robert Koch valida fa teoria de los gerrnenes como agentes causales de enferrnedad, 3) Joseph Lister
obtiene un cultivo puro de bacterias. Estos conceptos se volvieron el paradigma dominante de la microbiologia medica hacia fines de siglo y, al misrno tiernpo, establecieron una metodologia experimental a ernplear en todas las situaciones: el agente debla aislarse de las lesiones, cultivarse en estado puro y reproducir la enfermedad luego de Ia inoculacion experimental. En 1892, Dimitri Ivanowski publica la primera evidencia de un agente infeccioso filtrable. Can un extracto de hojas de tabaco enferrnas pasado por un filtro de porcelana (que retiene la mayoria de las bacterias y hongos), Ivanoswki pudo transmitir la enfermedad a plantas sana.'>. Uno de los postulados de Koch (que el agente infeccioso debe ser aislado en cultivo puro) no pudo ser satisfecho por el trabajo de Ivanowski y este opta por pensar que algo falla en sus metodos'. Siete afios mas tarde, Martinus Beijerinck repite los experimentos de Ivanowski y los extiende observando que el agente puede rcproducirse en tejido vivo pero no en medics artificiales como los utilizados can bacterias. Denomina al agente contagium vivum jluidum. Con ello cornienza un largo debate acerca de la naturaleza del agcnte: no era microscopicamente observable; era muy pequefio para ser una bacteria. El hecho que se reproduzca (en las hojas de tabaco) excluia 1a posibilidad de que se trate de una toxina. El desconocimiento de su naturaleza no irnpidio el hallazgo de nuevos agentes filtrables en un breve periodo. Asi se descubre el agente de la fiebre aftosa que causa enferrnedad pustular en el ganado (Loeffler y Frosch) y, poco despues (1901), Walter Reed reporta el primer agente filtrable que causa enferrnedad en hurnanos, el virus de Ia fiebre amarilla. Diez afios despues Francis Peyton Rous demuestra que ciertos agentes filtrables causan sarcomas en las gallinas y en 1915 Frederick Twort descubre accidental mente agentes filtrables capaces de matar bacterias (bacteriofagos). Asi, en el termino de 15 afios sabemos que los agentes filtrables infectan muchos organismos diferentes (eucariotas y procariotas), que algunos son transmitidos par artropodos (fiebre amarilla), y que otros pueden causar tU1110res (virus del sarcoma de ROllS). Para la decada del '30, el termino "virus" comenzaba a reernplazar al de agentes filtrables, pero su naturaleza seguia siendo un misterio.

trabajos que llevaron a! descubrimiento

Curiosamente, casi un siglo mas tarde, el mismo apego a los paradigm as dominantes sembro de dudas Jos de los priones por Prusiner y sus colaboradores,

Fue un virus de plantas, el virus del mosaico del tabaco CTMV) objeto de estudio de Ivanowski, quien jugo un rol decisive en la determinacion de la naruraleza y propiedades de los virus. A principios del siglo se desarrollaron las tecnicas para purificar enzimas. Los virus purificados podian moverse en un campo elecrrico de manera similar que las enzimas. Cuando el virus era inoculado en conejos, se producian anricuerpos que neutralizaban su infectividad en las plantas. Estos ballazgos apuntaban a que los virus eran

de naturaleza protcica. Trabajos C()l1 bacteriofagos dernuestran la presencia de acidos nucleicos. Esta hie la primera sugerencia de 121 naturaleza nucleoproteica de los virus'.
En 1935, Wendell Stanley cristaliza al TMV de la rnisma manera que los quimicos cristalizaban proteinas. Los cristales forman bastoncitos de diametro constante. En 194 I 121 forma de baston del virus es confirmada mediante microscopta electronica. Al promediar el siglo XX sabiamos que el 'fMY estaba representadopor particulas formadas por

subunidades que se ensamblan para original' los bastoncitos de las electromicrograflas. Quimicamente, esta compuesto por proteinas y RNA. Es mas, los bastoncitos podian ser desagregados en subunidades protei cas y RNA a partir de los cuales podia reconstituirse virus infeccioso. Se debieron espcrar algunos afios mas para comprender con mayor exactitud como proteinas y RNA se ensarnblan para constituir una particula viral.
Para entonces se tenia en clam que el TMV, como todas las entidades vivas y

replicativas, podia mutar y que por 10 tanto tenia material genetico. Simultaneamente, los experimentos de Avery con bacterias y de Hershey-Chase con fagos habian finalmente dernostrado que la informacion genetica reside en el DNA de los organismos. En 1953, Watson y Crick resuelven la estructura atomica del DNA Fue en la decada del '60 (Ia misma en que se descifra el codigo genetico, se reconoce al ribosorna como fabrica de proteinas y al RNA como el mensajero intermediadrio) cuando se demuestra que 1a informacion genetica del TMV reside en el RNA viral: no s610 el DNA podia servir como deposito de 1a informacion genetica. Quedaba claro que los virus podian alrnacenar la informacion genetica en DNA (virus a DNA) 0 en RNA (virus a RNA). En 1949, Enders, Weller y Robbins desarrollan un metodo para replicar virus in vitro. Utilizan tejidos hurnanos para crecer virus de la poJiomelitis y con ella revolucionan la forma con que los virologos aislan y analizan las propiedades de los virus, EI requerimiento de los virus de celulas vivas para replicarse los vuelve parasites intracelulares obligatorios y asi los distingue de la mayoria de los agentes infecciosos. Desde 1950 hasta 1975 se producen avances extraordinarics en el estudio de los bacteriofagos. Entre otras cosas se analiza el efecto de 1a infeccion en 1a sintesis macromolecular de las celulas, observandose que el virus codifica nueva informacion expresada como proteinas en Lacelula infectada, y que el virus puede existir en dos estados, litico y lisogenico, La segunda mitad del siglo XX y con el impulso dado por los estudios en fagos, se produce un avance expectacular en el campo de los virus, a tal punto que la Virologia emerge como una disciplina por derecho propio. La cantidad de nuevos virus aislados (asociados 0 no a entidades previamente reconocidas) aumenta exponencialmente y se observa gran variabilidad en su tamafio, resistencia a agentes ffsicos y quimicos y el tipo de
2

Tengamos en cuenta que aun se desconocia que los acidos nucleicos constitulan el material hereditario de los organismos.

enfermedades que producen. El empleo del microscopic electronico demuestra que, pese a las diferencias de tamaiio, los virus caen en unas pocas categorias rnorfologicas. Los trabajos de Enders y col disparan el desarrollo de los cultivos celulares para Ia propagacion de virus animales. Para cuando tween su aparicion tecnicas de Biologia Molecular, los virologos cuentan ya con sofisticados metodos de cultivo celular que les permiten analizar d ciclo replicative de los virus en las celulas a nivel molecular, cuantificar precisamente las preparaciones virales, e incluso elaborar vacunas con mayor eficiencia.

Los biologos celulares tomaron pronto nota de Ia relativa sirnplicidad de los virus y de su potencial para el analisis de las funciones celulares. Muchos avances en Biologia Celular provinieron de estudios con virus animales: cl splicing del RNA, los oncogenes, los factores de transcripcion, la transcripcion reversa, el trafico macromolecular endocelular, In fusion de membranas biologicas, la replicacion del DNA, los enhancers, etc, EI desarrollo de Ia Virologia estuvo tempranarnente asociado al de la Inmunologia y ambas rarnas de la ciencia nos han iluminado en la descripcion del complejo escenario que se menta durante la infeccion de un animal asi como de las estrategias para prevenirla. Aunque los cultivos celulares permitieron examinar las interacciones virus-celula, su relativa simplicidad no pudo reernplazar a los modelos animales para el analisis de las interacciones entre los virus
y los tejidos y sistemas del huesped, especialmente el sistema inmune. Los virus han tenido mucho que ver con los grandes avances en el campo de la respuesta inmune mediada por celulas T Fue un virologo, F. Burnet, quien forrnulo la teoria de la tolerancia inmunologica. Jack Miller, trabajando con retrovirus descubrio que la ausencia del timo al

nacimiento Ileva a ciertos tipos de inmunosupresion, En 1973, Rolf Zinkernagel y Peter Doherty, trabajando can el virus de la coriorneningitis linfocitaria murina (l.,CMV), postulan la restriccion en el reconocimiento antigenico por celulas T impuesta por las moleculas de histocompatibilidad. La Virologia se encuentra en perpetuo movimiento, El cambio de milenio nos encuentra con resonantes exitos: e.g erradicacion deliberada del primer virus humane (viruela; ultimo caso reportado, Somalia, 1977). Y con desaflos enormes: en 1999 se reportaron 5,8 millones de nuevas personas infectadas con el virus del SIDA (HIV).

I 1798
1885 1892 ]898

p5Z~i!1~I:oilo~T(~I;; ,~-z~;-;~t~a-la-~ vacun il~;Zl;l-- enn(:;--'" YCj

I Produccicn
! Transmision
de la vacuna contra la rabia

~-

L. Pasteur.
D_ Ivanowski M.W. Beijerinck F. Loeffler and P. Frosch

de una enfermedad viral en Plantas. Los virus se reconocen como agentes responsables de enfermedades de [as plantas (TMV) y los ani males (aftosa).

1908 191 I 1915 1933

Identificacion de un virus causante de 1a

leucemia aviar. Identificacion de un virus causante del sarcoma aviar. Descubrimiento de los bacteriofagos. Identificacion de un virus causante de cancer en mamiferos. (papiloma del conejo),

V. Ellerman and O. Bang.

P. Rous
F.W. Twort, F. D'Herelle. R.E. Shope.

Aislarniento del virus de Ia influenza

humana. 1937 Reconocimiento de la naturaleza

W, Smith, C.H. Andrews, and P. Laidlaw.

F.C. Bawden, N.W. Pirie.

nucleoproteica de un virus de las plantas.

1938 Datos cornparativos de los tamanos de los virus. Visualizacion electrornicroscopica virus. (TMV). de un

W.l Elford, R. Doerr, C. Hollauer. G.A. Kausche et al.

M. Delbruck

1939 1940
1942

Elucidacion del cicio replicative de un

fago. Descubrirniento de un virus RNA tumorigenico para mamfferos (MMTV) Desarrollo del cultivo de celulas para el crecimiento del virus polio. Demostracion de la induccion del fago lisogenico. Dernostracion de que el DNA de fago es infeccioso. Cristalizacion de polivirus. Demostracion de la infectividad de RNA

r.r. Bittner
J.F. Enders et al.

1949 1950
1952

A.

Lwoff et al.

A.D. Hershey et al.

1955
1956

F.L. Schaffer and C.E. Schwerdt. H. Fraenkel-Conrat and R.C. Williams.

L
19 9 1960 1962 1963 1967

rT.);:m;;Sira(:T6;;d~-T;~--"ii;dUCci6n quimica de
(TMV)

A. Gierer and KW Mundry

rnutaciones

Descubrimiento de los parvovirus.

L KiJham and L Olivier Tsugita et al,

Establecimiento de Ja secuencia de arninoacidos de una proteina de capside

(TMV)

Establecimiento de la estructura icosaedrica

D,

Kaspar and

A_

Klug

de muchos virus.
Se descubren los virus RNA de doble cadena (reovirus). Estab!ecimiento de Ia naturaleza de los viroides, Demostraci6n de la segmentaci6n del genoma del virus de la influenza. Demostraci6n de [a presencia de un oncogen en el virus del sarcoma de Rous. Descubrimiento 1973 de la transcriptasa reversa P.l Gomatos and L Tamm

'I.O. Diener W. Raymer

1968 1970

P.E. Duesberg

P,H. Duesberg and P.K. Vogt

H. M. Temin, S. Mizutani, D.Baltimore

E.M. Scolnick et al.

Demostracion de la transduccion estabJe de informacion viral de la celula a un virus. Se demuestra que un oncogen viral (src) tiene su contrapartida en las celulas. Determinacion de Ja secuencia nucleotldica de un virus (fago)

1976

1M. Bishop.

W. Fiers et al.

1977

Se descubre el splicing de RNA en adenovirus.

L.T. Chow et al.

1978

Secuencia de DNA de un virus animal

(SV40). Descubrirniento de un retrovirus asociado con leucemia en humanos. Erradicacion de un virus epidemico virulenro de humanos (viruela),

W.Fiers, V. Reddy.
BJ. Poiesz et a1.

1980

World Health Association

1981

Fabricacion

de una vacuna por medio de

D.G. Kleid et a!.

tecnologia de DNA recombinante (aftosa).

E! virus vaccinia utilizado para expresar antigenos de otros patogenos, Aislamiento de un retrovirus humane asociado con el SIDA D. Panicali, G.L. Smith

1982

1983

F.Barre-Sinoussi

et al

11
1986

i{-ci,~~)v;ru;~~;';m(;-vectore; Pill-~ 1t1-~~rtar genes en la linea germinal Estructura cristalina de I inovirus con una

~I-i!
!

Pdtten et -ai

M.G Rossmann
I

et al.

resolucion de J A.

Dernostracion de la estructura tipo viroide de! agente de la hepatitis delta del humane.

KWang et al, Chin et al,

1983 1988

Evoluci6n

del concepto

de prion.

S.B. Prusiner

Taxonomia de los virus

En los sistemas biologicos complejos formados por numerosos miembros, se impone necesariamente la clasificacion En Virologia, imcialrnente los sistemas de clasificacion se basaban en caracteristicas tales como [as propiedadespatogenicas de los virus 0 el tropismo tisular. Por ejernplo, el grupo de los "virus de la hepatitis" comprendta varios virus de propiedades bastante distintas que poseen In caracteristica comun de producir enfermedad hepatica en humanos: virus de la hepatitis A, virus de la hepatitis B, virus de la hepatitis C, virus de la fiebre amarilla, virus de 1a fiebre del Valle del Rift Actuamente, todos ellos pertenecen a grupos distintos de virus y la propiedad de inducir hepatitis es una de las pocas caracteristicas que com patten. Para la decada del '60 y ante el descubrimiento exponencial de nuevos virus de animales, plantas y bacterias junto a 1a necesidad creciente de un sistema universal de clasificacion, surgen varios comites de nomenclatura y clasificacion de virus. Los mismos proponen un sistema de agruparniento en base a propiedades comunes que utiliza taxones clasicos como familias, subfamilias, generos y especies. En este afio (2005) el Comite Internacional de Taxonomia de Virus (ICTV) ha propuesto la existencia de, 3 ordenes, 73 farnilias, 9 subfamilias, 287 generos y 1938 especies de virus 1. De las 73 familias, cerca de 24 incluyen patogenos del hombre y los animales. La Taxonornia, al igual que los virus, evolucionan, A medida que sabemos mas de los virus podemos refinar mas la posicion de un virus dentro de un grupo dado. Entonces no es inusual que un virus que hace .5 0 10 afios pertenecia a un genero dado, hoy pertenezca a otro. A medida que se perfeccionen los metodos para el analisis de los virus, nuevas carnbios son de esperar. Por otro lado, existen numerosos virus que aun no se han estudiado profundarnente y que por 10 tanto no han sido asignados a ningun grupo en particular (virus huerfanos). La forma en que los virus son caracterizados con fines taxonomicos cambia rapidamente. En el pasado, se utilizaban unas pocas caracteristicas tales como Ia morfologfa del virion, el tamafio, la estabilidad frente al pH 0 la temperatura, y la antigenicidad. Una tecnica que tuvo gran impato en Ia clasificacion de virus fue la tincion negativa para el examen por microscopia electronica (Brenner and Horne, 1959), La tecnica perrnite determinar en una misma preparacion el tamafio, forma, estructura de la superficie, presencia de envoltura y simetria de los virus. La ultima adquisicion de los sistema taxonomicos fue la incorporacion de los datos provenientes de la secuenciacion de los acidos nucleicos virales. La sccuenciacion del genom a (total a parcial) se realiza hoy a1 principia del proceso de tipificacion de un virus, incluso con fines diagnosticos, Actua1mente se disponen de bases de datos accesibles via Internet donde se encuentran las secuencias genomicas de los principales miernbros prototipos de todos los tax ones. El impacto de esta innovacion fue tal, que la secuenciacion de DNA 0 RNA viral ha promovido por sf sola la creacion de familias y/o generos antes de que se dispongan de otros datos acerca del virus. La secuenciacion de los acidos nucleicos derive en el conocirniento de la organizacion de los genomas y estrategias replicativas, ambas caracteristicas que hoy en dia tambien se utilizan con fines taxonomicos. Las secuencias genomicas son cruciales para el avance de 1a taxonornia filogenetica tal cual veremos
I

Ver la Iista completa de virus con nombre en: www.viro!ogy.net/Big_Virology/BVViruslist.html

despues. En la fig. 1 se resumen taxonomicos

las propiedades de los virus utilizadas con fines

Ei.g!rrEt 1: Propiedades de los virus utilizadas en taxonomia

Propiedades dt;I_yiriQ!1 Morfologia Tamano del virion Forma del virion Presencia de peplorneros Presencia 0 ausencia de envoltura Simerrla y estructura de la caps ide Propiedades flsicoqutrrucas Masa del virion Densidad de flotacion Coeficiente de sedimentacion Estabilidad ill pH Estabilidad termica Estabilidad ante canones, solventes, detergentes,
Genorna

irradiacicn,

etc

Tipo de acido nucleico Tamafio del genorna Presencia de una 0 dos cadenas Linear 0 circular Sentido Numero y rarnano de fragmentos Secuencia de nucleotidos Presencia de secuencias repetidas Presencia de isomerizacion Contenido en GC Presencia 0 ausencia y tipo de cap 5' Presencia 0 ausencia de proteina covalentemente unida a extreme 5' Presencia 0 ausencia de polyA en 3' Proteinas Nurnero, tamafio, y funciones de proreinas estructurales Numero, tamano, y funciones de proteinas no estructurales Secuencia de aminoacidos Glicosilacion, fosforilacion, miristilacion, Mapeo de epitopes Lipidos Contenidos, tipo Carbo h idratos Contenido, tipo Organizacion del genom a y replicacion Organizacion de! genoma Estrategia replicative Numero y posicion de marcos de lectura

Caracteristicas de la transcripcion Caractertsticas de la traduccion

Sitio de acumulacion de proteinas virales Sitio de ensarnblaje del virion Sitio y naturaleza de la maduracion y liberacion de viriones

pro]iedacl9s antigGni[J!s
Relaciones serologicas,

Propiedades bioh}gi£Jl;:i
Range de huesped natural, tropismo Modo de transmision en la naturaleza Rclaciones con el vector Distribucion geografica Patogenicidad

procedimientos

Cuando se aisla un nuevo virus se siguen una serie de procedirnientos generales tendientes a ubicar la nueva entidad en alzuno de los tax ones conocidos. Uno de los ,.'
es Ia tincion negative para microscopia electronica la cual brinda

rapidarnente informacion acerca de la estructura del virion. En rnuchos cases, esto es suficiente para asignar virus en algunas de las farnilias. De no serlo, puede recurrirse ala determinacion del acido nucleico viral, Ia caracterizacion antigenica y/o a la secuenciacion parcial del genoma seguida de la comparacion con secuencias existentes en los bancos de datos. Estas cornparaciones son 'Miles ya que permiten rapidarnente asociar 1a nueva entidad con grupos pre-establecidos de virus. La clasificacion de Baltimore En 1971, David Baltimore sugirio un esquema de clasificacion viral basado en la forma en la cual un virus produce su mRNA durante 1a infeccion. Todos los virus deberan producir un mRNA para Ia sintesis de protein as pero 1a forma en que 10 hacen dependera del tipo de genorna viral ( tipo de acido nucleico y polaridad). Asi surgen: Clase I: DNA doble cadena Clasell: DNA simple cadena po Iaridad positiva Clase III: RNA doble cadena Clase IV: RNA simple cadena polaridad posit iva Clase V: RNA simple cadena, polaridad negativa, Clase VI: RNA simple cadena, polaridad positiva, con retrotranscripcion a DNA. En realidacl, el numero para cada clase no se aplica usualmente pero la division segun acido nucleico y polaridad es uno de los criterios mas importantes utilizados hoy en dia, junto con las caracteristicas morfologicas de la capside y la presencia 0 no de envoltura.

EI sistema se basa en la existencia de niveles jerarquicos. Las familias de virus ocupan Ia jerarquia superior' y las mismas se denotan empleando el sufijo viridae. Una familia comprende un grupo de virus que comparten caracteristicas comunes que los diferencian de los miembros de otra familias (tabla 1), La mayo ria de las familias de virus tienen una morfologia, organizacion gen6mica y estrategia replicativa caracteristicas, indicando una asociacion filogenetica'. En cuatro familias de virus se han incorporado
En rigor, los ordenes ocupan ese sitio. Sin embargo, hasta el presente s610 un orden de virus ha sido asignado y par ello no nos extenderemos mas al respecto. El orden Mononegavirales cornprende las familias Paramyxoviridae, Rhabdoviridae, y Filoviridae. Notar el sujijo virales utilizado para designar ordenes, 3 Ello no quiere decir que dentro de una familia, dos virus muestren una gran distancia filogenetica, Aun en ese caso, la distancia que los separa sera menor que la existente con un tercer virus perteneciente a otra familia.
2

10

subfamilias para permitir una jerarquia mas cornpleja de taxones entre virus que muestran relaciones mas complejas entre sus rniembros. Las subfamilias se dcnotan con el sufijo

vtrtnae. Los generos de virus representan agrupamientos de virus que POSCCil caracteristicas cornunes pem distintas de los miembros de otros generos. Los generos se designan con el sufijo virus. Los criterios para definir un genera varian entre familia y familia. E! taxon "especie' ha sido el mas diflcil de caracterizar en Virologia. Despues de alios de controversia, 1£1 ICrV acepto 1a siguiente definicion de especie: "una especie de virus se define como una clase politetica (esto es. definida por mas de una propiedad) de virus que constituye un linaje replicative y ocupa un nicho ecologio: particular". Esta definicion acomoda la variabilidad inherente de los virus y no depende de ninguna caracteristica (mica del virus. Queda clare que el termino especie es definido de manera similar al terrnino virus, pera en varias ocasiones el termino virus se corresponde mejor con subespecies, cepas 0 variantes. Muchas veces, £11 aislar un virus y caracterizarlo, es

_.-,--,

~,·,c."

Familia

Caracteristicas RN A simple cadena polaridad positiva sin envo ltura

RNA simple cadena

Familia
Virus DNA Hepadnaviridae

."

-------,~,~

Caracteristicas
--- _-------_._---

Virus RNA
Picornaviridae Caliciviridae Astroviridae Togaviridae Flaviviridae

---

DNA doble y simple cadena Con envoltura Conversion de RNA genornico a DNA DNA simple cadena sin envoltura DNA doble cadena
sin envoltura

polaridad positiva Con envol tum RNA simple cadena Polaridad posit iva Can envoltura Transcripcion discontinua RNA simple cadena polaridad negativa con envoltura

Circoviridae Parvoviridae Papovaviridae Adenoviridae Herpesviridae Poxviridae Iridoviridae Sin nombre: ASFV

Coronaviridae

DNA doble cadena con envoltura

Paramyxoviridae

Rhabdoviridae
Filoviridae

11

Agentes subvirales:
Orthomyxoviridae Bunyaviridae RNA simple cadena
polaridad negativa
0

satelites, viroides y Priones

RN/\ simple cadena Polaridad negative

en. ambos sentidos

Genero huerfano: Deltavirus

Genoma scgrnentado Con envoltura

Defectuoso. sate lite Taxon sin definir: agentes de las encefalitis espongiformes (nombres a asignar) Sin acido nucleico

Reaviridae
Birnaviridae

RNA doble cadena

polaridad positiva

Genorna segmentado Sin envoltura Retroviridae

L....... ••• ...

Priones C'proteinas
autoreplicativas")

RNA simple cadena Polaridad positive

Conversion
_

a DNA

......... _----------'

diflcil determinar si eJ mismo debe ser design ado como una especie 0 como una cepa de una especie. Para ilustrar los problemas asociados a la definicion de especie, mencionaremos eI caso de dos retrovirus que afectan a los ovinos, el virus del tumor nasal enzootico (ENTV) y el virus del Jaagsiekte (JSRV), EI EN TV causa tumorcs en la cavidad nasal mientras que el JSRV causa tumores pulmonaresv El genoma de ambos virus po see una longitud prornedio de 7000 bases y la comparacion de las secuencias revela una similaridad del 9YYO.Cube preguntarse si un 5% de diferencias es suficiente como para cataloger a dos virus como entidades diferentes. Sin embargo, al inocular el ENTV en una oveja se desarrollan tumores nasales y no pulmonares, y al inocular el JSRV se desarrollan adenomas pulmonares pero no tumores nasales. Segun nuestra definicion de especie, se trata de virus distintos, muy similares, pero distintos, Cada uno se relaciona can dos patologias caracteristicas. Es interesante considerar que parte de ese 5% de diferencias se concentran en los genes que codifican para la proteina que usan los retrovirus para ingresar a las celulas. Los virus RNA son un verdadero problema para la nocion de especie. Durante la infeccion natural del hue sped por un virus RNA se producen muchas variantes genomicas (por razones que tratarernos oportunamente). Cada una de estas variantes tiene el potencial de adaptarse rapidamente a distintos ambientes. Actualmente se refiere a estas variantes naturales can la denorninacion de "cuasiespecies". El siguiente cs un ejemplo de la terminologia taxonornica aplicada al virus de la rabia: Orden Mono negavirales, familia Rhabdoviridae, genero Lyssavirus, virus de la rabia, Muchas veces se emplean terrninos vernaculos como, por ejemplo, "los paramixovirus", pero aqui no sabemos a ciencia cierta si se esta haciendo referencia a la familia Paramyxoviridae, al genera Paramyxovirus, 0 a alguna de las especies del

genero.
Taxonomia filogenetica

Como los virus no dejan fosiles, se pens6 que nunca se encontraria evidencia para pro bar que dos taxones tenian raices evolutivas comunes. Cuando surgio la secuenciacion del genoma como herramienta para la clasificacion, fue evidente que existian muchos

12

dominies funcionales conservados en sus proteinas. A pesar de que los genomas pertenecientes a especies de distintas farnilias son muy diferentes, tambien es obvio que virus distintos (incluso fami 1ias distintas) poseen ciertas sernejanzas a nivel genetico (ya sea la organizacion de sus genes, 0 Ia existencia de secuencias para dominies proteicos

que posecn funciones similares). Estas relaciones filogeneticas empezaron a reflejarse en el esquema taxonornico. POl' ejemplo, la razon por la cual sc creo el orden Mononegavirales surgio al reconocer que los genes para las protein as del nucleocapside de las familias constituyentes se organizaban de manera similar y sus productos eran parecidos. A medida que mas y mas similitudes se rcconozcan, mayor sera Ia tendencia a construir ordenes de virus, Nosotros volverernos sobre estos ternas mas adelante en el
curso a proposito de tratar la evolucion de los virus,

13

14

'sr:
:1

!!YJifIQ!lLO!1g'~J211~lllg~0rus

•. QtQ~1Jifhrww!litlfl. !JL§y"iO/lIn1_YiU!5.p JV
:j:~c(_()mU!IIS,~ii Gulps is.J'.ir1ls i il1efl!fosJgm(l a&.(lshi]fl)_ virus

»:

15

.Qrt!70JlQx.v1rU,i.

'Y{1!Jil1il{)f1ke;yJJjI11Ql.

.M e}QI olltbiL!1!I,[()j(Wfjy!
.f_flWm
!2])J)XV

ass.

dt1iSpcta
'(j[rQf1Ql?1!!S

IIIQQ_[1,i

J!lllol]WJ!OXY[Cl!S

Iw"jd1!,I

------------

Chloriridovirus

- ---- -------------

•BQ!.1<D!.i!J1'y

'le!(!LiU:,'\:UJEilW.ii?_

··:J~111JgligJlfmQ~=ike I
'_yj!:!.lS.Cc.::"'}

itf[lrdhj_}_:!f_,~(_WIi?'~Mm:t;_[s';; [Jallid hft:J2fl§vinlsl dl?C:_<!?t::JiL_Q_.yjIllHQ0_")

•L!l()_Vltlls(vv:,g;_"Il1fi;(:(

iQl!§

JElryn_g_(2::f[i1c11eitis:!lk~

iOallid herpesvirus I

16

ll(/1.1IJ dhl;'_tP(z.y!jru§l
flJlli!wrhWH:·<tjrl/iLQ

17

Beeomovirus
• .. r•• ,)", .. " _....;,. __ .

Ali nul e titus__ I}jI?ZLc::f: BL2...\ijnfs

7Jtng.rQrilt!.\'.(Y,,~l5._ ..~.Rj.<;.5'.J~mgIQ ' .ha{;_i! U ::tl?fl}lJikgy_l_1-~I0Q~'J

18

v ~.i.rL\:n£~;EljCJ.ike:.Vjf~U..?g ~".i

5::_lg".rin g:likeyjnl~<::5.")

Ff!f.1n'iIJfi(W.!J'i ... IglllniiJ Vc:ID "

'&)!UY!!'lI.l:
:(" of tiv irus

19

Ellis: uu:
P !n'fm:CU\::!(1!,I'

l!!.jlrQJ11XIQY i fEJJ!fll •&~l'J2jl!J)Jiru.~

•M!2d2!.lh:in!J
.RlIhujgV!1I1S

iL&nipaviru,'j_ iAvu!avirus

20

Leu ufLIU[c~£TOl{crcl/(}u§
virus

2]

CU[Ll/rtyin!,1

.(1j2bJ/?Qyjr

l!S

22

.fIj QIJ!Yit1uJ}Y[!S" NQf:>Y:ilJ~: l.i,.k ~yinl s_c"?::J

NQt1j'uH.."lrll,\

'QLIJJltiZJ!.l:i!HS: 'M!JfO}.Q_f[l_Qy.tnLs.

23

·tLW:.Ei rile>'
BUH.11pXln!') .(IIC!I[!IOy/tUS

24

'('arf/g@li I (If cnLJit]j§_ /11;pjr;_§!f!!LKLQQYll1g

y(n.l.,\

25

;;il!gl~:$tr:lJ1Qe.(L f.\HA Silk! litQ_\,iiI!1}.Q$

.11)b_(f(~:O

nsausis

SaTellite

vuus

:_._:__~~~,~b,~.'~'m~,.m~ ..~""""

Larue Satellite RNAs

..,.. '.• ".~ .._._ ..'_' __

Rel~renc~_§
Fauquet, CM., Mayo, M.A., Maniloff, J, Desselberger, U., and Ball, LA. (eds) (2004). Virus Taxonomy, Vlllth Report of the fCTV. Elsevier/Academic Press, London, pp. 1258. Copyright 2002 ICTV. All rights reserved: Last Updated January-2005 Assembled for ICTVdB by Dr. Cornelia Bttchen-Osmond, ICTV Database Management, Earth Institute Mailman School of Public Health, Columbia University, New York, N

and Department of Epidemiology,

26

C,

'm_

__

__.~.~~,.~

..

__

~_

~,

...

~~.~~

.. m~"""'",_,

."",

••• """

!J~?yino 'i~l_ _ _._.._._ cutaneo .. ~ __ idem caballo Sarcoide Tipo 2 bovine

Papilornavirus

H9.Ylm!

Fibropapilorna

_----- ..~ .. ~- __ _---....

Fibropapilorna
.•......

cutaneo

I:ipqJ
Ti]J-_.. 04

boyino

...... •.... ...

1112.0 6

QgyinQ
--

.-.-------1

PiQfQPJll.iJQma RQIQH
...--.- .... ----

cLel

--

__

._------

papilQll1i~(k:Jl)ezon ---- ------. Fibropapilorna cutaneo ~ -- ._ ........ -E~lpi lomacutang~~

..

RY![1Q _"____
§.911!nQ
--."-~ ..

r~~wJ.hml!ly:Lm:_;
p_ajli\QIDflyirus
._

..

_----

pVlfjg

____.
QflP l!l_Q
~-.----

_-_ _._----..........,
.. .. .. ------.j _.

_-

PCJRilQTlJilv 11'\.15.
g£llital .m.lrcltW
..... .... -.-.. --._- -.. -

mJrCil!Cl p~~Jro
-.------.--t

E.<mLkjjEa

.. -~

~"~_..

-.- -

cut(iJ!CO
..-.. .--... ---------j

-------!~ ~2ilQma\jin§~onG:l!! de! .. --="= coneio -~ -------t Aden {)..Y..i!J,l.§. s;:aballo

....... --

wilL G1I1 inQ- .. ---I---

I~?p_Ugmav ir.. l!;;

...---.-- -... ....

E;:mi !OJI1iLQIa I

-._.--- -.- . _ .. -··---··-------1 _ !:l!pjhm)a qt1<l_1}~Q ._-_ _-..

8deUQyirllS

. __ .._---

L~\!es in((;.fcionf~ ~jJ"J9r.ill1 _ .. ------+_ _.__... .

j;lerro

f_;>c;[Qtipos
- -- -.

---

-.-------;

ti_po_l £\deJ}Qvirus

tlepatiji?jnfeq:;jQ§A ~anjIta

1iPQ_Z

_._

A..di;l19_v:i.!JJ1

_--_._-

2..0!10
w ••••• __

------/-

c-:::- ...,.---:---~

IUJV -1..

\?ovino

I!.«q~1(;9brol1(1Jlitis .in!~g_QJiil_~~lnilla - ----- -~~, fiMamt;:iltt;;_.hepatlt~s y_s_'i_n_d_rQJJ~.~~ai d iUIG +r.llesta__ .. ~. _ _ .![3R

~.1!bfam iE'lJ:llf<i

-_

_--

----1

!Ierpesvirus caprino 1

27

He rp;;s',;i~-l~-S ~qllil~~) 3...

~:;~[;~~j[o-~-----" Exant~;;~.;t _ c.,oital.

.._._..__ __

.~r~tltJfa~IT~.;'Ullig
Slll:l_fam0m <!Ui!
, _ _
.......... -.- .... --------1

Herpesvirus Cimino 1

perro

Enferrnedad

......... _----_ ..._---- -_. __ . -----Herpesvirus gato feline _1 -._ .._- --~~ ......... .._ ----Herpesvirus pollo aviar.. 1 _._ _ _-1-- .. _------_ Herpesvirus bovine bovine J t! erpesvi rus equ mo equirl_o 2~__ ~~_ ~------lHerpesvirus cerdo

hemorragica de los cachorros Rinotraqueitis vi rica

---~-------

..............•.....

felina _ .._ .. _._._--Laringotraqueitis infecciosa -----.-... .. -

.5.W2fmni1 i,U1IH!

c
____ .. ..

SlIQnllJ2ili1!iJeta,
.. _.~ .

-- -- ---------1

Rinitis

futQfamiUfl_ be!,!

p~~?im~?_ ~_
bovino

---

~_._,_.

Virus de Marek ~)oxvirus

pollos bovine ovino cerdo

Fiebre catarral malizna --_._.Paralisis,

~ __ ,_o_., __ .....•

------

_._._._ . _.. __ -----j .. __ _ _.

S~ll;ttlHJlUi'Lg~ma
..- ...-- ..- ...--.-----~ parapoxvirus

linfomatosis

Pseudoviruela Viruela ovilla

bovina

.. _ ....

capnpoxvirus suipoxvirus

_-_ _-----...

f-------+------::-------f·~~__:··~··~········ .. .-.~-~___+~~.~--. ···

Viruela pore ina

~-----l

1----------+
..~-_..

Bovino, gato, ortopoxvirus eleK'~I}te, conej.Q___ .... --.-------------------+---- --------------1 pollos Viruela avipoxvirus
.~ _.wo_ _ _
m ••

........-._-_ -

- -- -~~-----1

~.-------------___l

Parvovirus
__g_(~H'C}I_~()

cerdo
~

Aborto, muerte

Panleucopenia
felina ............... - -- ~ Parvovirus
-~ .~ .

gato

P~Ei_~_~!_~_1 .... _~
Enteritis, hipo,

............ -.-.. . -.-.------1

Cereb . - -.-.---.-----+-~--- -. perro Enteritis, miocarditis bovina Infecciones subclinicas

,."".~_~ __ ~ ~L

canine

Enterovirus bovine tipos 1 a7 Enterovirus

- -.----;-.-.--.--.----t-

--

-.~.. -+::--;----

Picorna entero Picorna

'~L

porcino

Idem pero el !

...... -.------.------1

porcinos I a 11 __ ._ ... ---:-_+- __ , .~ Enferrnedad porcino vesicular

lES)fcina Enterovirus aviares '----Pallo ....L._P_at_o-","-p_a_v_o

produce entero _+'p~~?~ .. rI--c.e.falomielitis

Enfermedad

vesicular porcina
Encefalornielitis aviar ---'--!{epatitis

Picorna entero Picorna entero

28

! bovinos

\'11 ~~ d;- i~~encefalomiocar [ d!!_is_ . __ _ I Rinovrrus

1-3

T M-an;l-feros

I contacto

en - -- - I~l~0 t'!~~dll-i(;~m(}car j;ic;;Knd con dins cardio _ro~~(~e~-____ _ t ~bovine Rinitis

I
I

Rinovirus

equmo Rurniantes y cerdo

. ---c--~~---

Rinitis Fiebre aftosa

_ . _ .. .. __

"3u.f:'.~~?_L}_
Virus dela

fiebre aftosa: 7
tip~):o. Virus de!

cerdo

Vesiculas

J I

.a

exanterna vesicular
•• ~.

Calicivirus feline

gato

Enfermedad respiratoria alta, 11eUlY!0n ~-,-_!~l~eras

Equino (hombre) Virus de la encefalitis equina del este, oeste y Venezuela -...------.~--- -_ -- -.---Virus Getah Equine Virus de la Bovino,ovinn diarrea viral bovina ·Vin;-~-de la--cerdo---·--~ peste porcine
.- - --._ -

Encefalitis

1--------_ .. _

Fiebre

------

- ... -

Signos respiratorios
y entericos

111f~~cc~' i~(}-n··--·--~--·-·-···
generalizada Aborto, inf
..

cquino

_---_._--1--------

- ------

arteritis equina ._..._.--.... - .....~- -..--.- ..... ... -Virus de Oveja (hombre)
~--

Generalizada
....

---~Encefalitis

------

louping

ill

Oveja (hombre) Virus de la enfermedad de .. Wesselsbron _ _~ .._c._,c_._, ~ __ ~~ Cerdo (hombre) Virus de la encefal itis
,_.cc_, __

-._

-_._-1--- ..... ----_

Inf. Generalizada, aborto

.--""'-"""--""'-"-"~"~~""

Encefa litis, aborto

tlp_~llles!l:.. Influenzas
porcina,
~~__il, ..a~~.

_
Cerdo, caballo, polio, resp,
.__ .

Respiratorio
_ __ .__

V.

Conejo, roedores perro ._. rumiantes 3

.. --_._--

Respiratorio

: parainfluenza _l_(§Y 5 ) ..
V_ parainfluenza Virus de
--- ----.--

_parail1!luc.r.:s__(l1

~---.--.Respiratorio
1-------_ .-..-.--._

..-... ---.

Respiratorio
--1--

aves

Signos nerviosos Generalizado

.. _._---_._-------.-- ..

-------1-.---- ..... -.---.-.

29

Canidos

y otros

General,

nervioso

Virus respiratorio

··..··..····f--····-.·-··-..······-~-··· Vacaoveja
o c •• ""'~ .. __

respiratorio
.. <

Paramixovirus,

pneuma

sincitial bovine Virus de la

o

~'_CO<

..

.'_'

,··C_~.~.T_·

~_~,

, Cerdo

gastroenteritis

Coronavirus, grupo 1 -~--------- . -~-.-.".--.--Coronavirus, grupo 1

.. -.-

gastroenteri

(is

transmisible porcina ~ r--c:---~.------. ~--~--~.------~ --.-~.---- -.- ---.-Virus de la peritonitis Gato Peritonitis, neumonia,
Corona virus canine

~1f~c.t:_i!:'~~fl'![!~_~ .. _f'!.~l~ (
_ _ __ -._ ___

Coronavirus,

----

-.---

grupo

----

.. --.---__1

. _._--

-_.. __

._ __ ..

_-----j

Virus de la hepatitis del

raton

Raton
_ ....

Coronavirus

bovino

... -

Vaca

__ _---..

---.-.---... --

Hepatitis, encefalomielitis, enteritis

- ----

Coronavirus, Grupe 2 Coronavirus,

__ __ . _~
-.--------.------

gastroenteritis
~

Grupe 2

-~ ----I

_________

~_._.o_~

_.

Virus de la encefalornielitis Virus de la bronquitis

infecciosa aviar

Cerdo

Vomitos, consuncion, encefalom ie litis

Coronavirus, Grupe 2
- - -.-.---.. .. --.-------__l -

~_~!!lEg!~i_!lJlaTlte porcir~a~ ---c---~------Po!lo Pavo

-.-.- -- .. -----. -

~~ ---~ ~--~____,f____- -~__ Traqueobronquitis, Coronavirus

nefritis

aviar grupo 1
.. _----.--

Virus de la cresta azul

-._ -.. _--.----

enteritis

... ----- .. ... ------.. ---.

--f-

Coronavirus

.... _-

aviar, grupo 2
--._--

Fiebre del Valle del Oveja, cabra, bufalo, Hepatitis, aborto Bunyavirus, ph lebo Rift hombre ~~- .. __ . __ _ ._--._---+ _ _-_._-Vaca congenita BunY~lvirus, bur~yaAkabane
(mosquito)

.. ---- .- -.......

- f____---.-.-.--.-.-.~ ..

. ---~--

---- ~-...

Vall<: del Cache Enfermedad ovina de

......... ~-------------

Vacaoveja

conge nita

···················· .. ----··-·· .. -----i-------

Bunyavirus, bunya

... --------·----I

······cj~~Ja,-~j;;~;------e;;t~~ii-is-·----··--

(~rltJ~guit()) +.~(nl()~lJito)

Nairobi ____ .__ .____ ... _ _ ..__ f---... ----------.-------Fiebre hemorragica de Rumiantes, hombre L Cri!:!l~<l__ _ .~ _ .----- ..----~-Andam Roedores, hombre
~-.---.--.--

fe

Bunyavirus, naira
.. ~ . __ .
--j

.._ __ ...

Bunyavirus, naira (garrapata) -~ ..-------- ..-.--'"""'"'.- -.-.~--------ninguno Bunyavirus, hanta

--f____----.--.--

ninguno

~----

[stomatitis vesicular, rnuchos serotipos Rabia

.------

.... --.-

.. ---.-

------------.--

Caballos,

vacas, cerdo

vesiculas

.. -

---

Rabdovirus,

.. - .. - ----::-----:--:---.--------1

vesiculo lyssa

-- .. ---.---...... -----

Mamiferos

---.----.--.. .. .. ----.-~--.

encefalitis

Rabdovirus,

--.-------

.. ------1 -

-c:-......-----.--.--------

Rabdovirus de peces Peces (5) -~--------1--------Virus de la leucosis Polio aviar Virus del sarcoma

..-.... -

----.-----------

varies
o

-.--.------.~.~.....---+c- "--"-'-'-"-

Rabdo, lyssa y vesiculo

---~---------,--.----__l

--~~.--. Linfomas, leucemia, anemia, osteopetrosis

• .~

• __

__+_

PolIo

sarcoma ---

1-------

-----.---1----------. Virus de la Pollo reticuloendoteliosis

aviar

Linfomas, anemia, sarcoma

Retrovirus, (v-onc +) ... - ----:-------+= --:--(v-onc +)

----~r-~-.----

Retrovirus, (v-onc -)

oncovirinae oncovirinae

..... .... .. -.-----__1 -.--.- --- ---,:-:-------!

Retrovirus, oncovirinae

30

Virus bovina

oncovirinae

Virus

t:~~Jl<l_(Y!t:Y2_.. ...
~ .~ "'~" """"""cnW"""' __

d~l

_.............

-_

leucemia

_-

-~
Gato

-_.-

__

__

-.-.

_...

...

_~ ---..

leucemia

-_

.-._

_._

_.-.._.-

Virus del sarcoma

(Jato
+--_ _---

sarcoma
-_ _ _- ---_._._
I-

feline
--+-~

Virus de mardide la artritis

Oveja
Cabra

NCUl110nia progesiva
....... -... -_.. ~ .._-_._. __.... ----_-__

_- .. -

--- -~

visna _.......................... .-.. . ~.~-+..... ---.-----~-encefalomicl iti S (;.~pr_iT~ __ _. Virus de la anemia

infecciosa cquina

.. ..~-.~-.---!---

Artritis,
:__-_

encefalomielitis

Retrovirus,
.-_ _

lentivirinae

f__

_ .. ____ _ .. _-------I

Caballo

anemia

Retrovirus,

lentivirinae

(~:l~).__ __ ._ __ ~.~ ..
Virus vacuolizante bovine
----_.__

... .. _~ _ _
ninguno Retrovirus,
•...- ..•. ----

Vaca
_ 1--- ---.- ---.------

spumavirinae

,----.---

Virus vacuolizante

Gato Pollo

ninguna Artritis, nefrosis, azul enteritis,

Retrovirus, spumavirinae

feline
Ortoreovirus aviares

etc Virus de la lengua azul

Virus lbaraki
...

Rumiantcs
Vaca
..

Lengua

Parecido a lengua azul

- ..

-..-- ~.~-- --- ---.- ~ - -- --.. ~.. ..--- --Virus de la peste Caballo, asno, cebra, peste
--~

~--

-~

..-.".-~--

equina africana

---_ ... _-_--_ ... Virus de la 1-5

__

.._.

-..-.--"-~'-----~
Caballo

mula

.. r·

~'_"~~~"""'~_._

•••

'_"'~"_"~

C<_

Aborto, encefalitis

Reovirus, orbi - -----~.-... .. Reovirus, rota

... ....

encefalosis equina Rotavirus Bursitis infecciosa

aviar

-,-.. ·----:-------t----La mayoria enteritis Polio

.... ~---.---... -----

... -------j

--... -.---.---I----------l-------

Diarrea, deshidratacion hemorragias

........ -.-.--.~----.~-----_1 birnavirus

-.. ---------1

t
I

Virus de la necrosis Peces pancreatica de los peees ---------_

--------------~------------------1------..

_-_

.. -------l---

------------l-----

--'L-_-·~- .. __ .. .,

.. -_-_~__'__ _ __ .. _ .. ~~~._ _ ~~- .. --

_.

---.-----------------l

31

Cada partlcula

individual

de virus recibe el nornbre

de

VIrion

Las particulas

virales estan disefiadas para la transmision efectiva del genorna viral de una celula a la otra 0 de un animal a otro. Una funcion del virion es proteger al genorna viral de Ia

ruptura

de la mutacion

durante su Else extracelular.

En particular,

la capside del virion

en la proteccion del genoma. Las proteinas de la capside poseen sofisticados plegamientos y se hallan empaquetadas de forma muy compacta, de tal forma que resisten la digestion por las enzimas proteoliticas. cumple un rol fundamental Al referirnos a la estructura terminos: de un virion es conveniente distinguir

entre los siguientes

Protomero (0 unidad estructural): conjunto de proteinas (iguales 0 distintas) que forman el bloque unitario de un ensamblaje mayor. Por ejemplo, VP 1, VP2, VP3 y VP4 son cuatro proteinas distintas que constituyen los protomeros del virus de la
polio
0

poliovirus,

Unidad de ensamblaje. conjunto de proteinas o de protorneros que operan como intermediaries en Ia formacion de una estructura mayor (ej, el pentamero de VPI en el virus SV40). Unidad morfologico (capsomere): se refiere a las regiones 0 "clusters" observables sobre la superficie del virion con cl microscopic electronico. Generalmente se trata de las partes de las proteinas que se proyectan desde la superficie viral alrededor de los ejes de simetria. Capside: la cubierta proteica que rodea al genoma viral. Los terminos ingleses coat 0 shell se refieren a Ia capside. Nucleocopsider se refiere al complejo completo de proteinas y acido nucleico que suele utilizarse especial mente en cases donde la nucleocapside es una subestructura de particulas virales mas complejas. Envoltura: bicapa Iipidica y proteinas asociadas que rodean muchos tipos de
particulas virales. Virion: la particula viral cornpleta.

En principio, cualquier tecnica destinada al estudio de 1a estructura de los virus requiere la obtencion de una suspension pura de virus. En la figura 1 se muestra un protocolo clasico para producir virus libre de restos celulares. La microscopia electronica es la mejor manera de determinar la estructura general de los virus. Aunque pueden examinarse cortes ultradelgados de tejidos infectados, se obtiene mayor detalle cuando se emplean suspensiones virales purificadas que han sido tefiidas negativamente con, por ejemplo, fosfotungstato de potasio. Mientras que en un corte podernos observar partfculas virales en diversos grades de maduracion, cuando se examinan suspensiones de virus purificado predorninan las forrnas maduras 0 completas, La microscopia crioelectronica es una variante en fa cual la muestra se congela a muy bajas temperaturas (-160°C) Y se mantiene as! durante la observacion. No se

32

'; ~~~ 'f;,

- ", ~ ,(virus

sobrenadante + restos

celulares]

restos cekt~ares

pellet
(virus purificado)

r~~centrifug-aci6n

Figura 1: Esquema de un protocolo de propagaci6n y purificaci6n de virus

33

requiere fijacion ni tincion. Los contrastes bajo el microscopic dependen de las propias subestructuras virales y no del efecto de Ia tincion negative. Cuando el material esta bien preservado, las micrografias pueden ser sornetidas a analisis de imagenes eon la ayuda de softwares apropiados. Tales analisis permiten In reconstruccion tridimensional a partir de micrografias con una resolucion del orden de los 30-40 A!, esto es, 10 suficiente como para poner en evidencia unidades de ensamblaje proteicas". 1-::1 fundamento de tales reconstrucciones es el siguiente. Bajo el microscopic electronico, una (mica molecula de proteina da una sefial may debil y borrosa. Una forma de solucionar este problema es combinar la informacion proveniente de muchas moleculas identicas de tal forma de poder promediar y sustraer los deficits de las irnagenes individuates. Tal situacion se da en los virus porque estan constituidos pm subestructuras repetitivas. Las micrografias de suspensiones virales incluyen miles de particulas y es posible utilizar los analizadores de imagenes para computar la imagen promedio de una macrornolecula individual, revelando detalles usualmente oscurecidos por el "ruido" de la micrografia original. En la figura 2 se muestran las reconstrucciones tridimensionales de algunos virus con simetria

icosaedrica (ver mas abajo).

Aunque la microscopia electronica ofrece gran detalle, este nunca es suficiente como para visualizar 1a forma en que Jas proteinas individuates del virus interactuan entre sf en la particula. Esto ocurre porque los atornos de una molecula estan separados por distancias del orden de 0.1-002 nrn. Tal resolucion a nivel submolecular s610 puede lograrse mediante metodos de difraccion de rayos X Como 13 luz, los rayos X son una forma de energia electromagnetica pero con una longitud de onda mucho mas pequena. Si se dirige un haz de rayos X a un cristal de proteina (con millones de moleculas de proteina pura), un porcentaje de los rayos seran difractados por los atomos de 1£1 muestra. En ciertos puntos, las ondas difractadas se reforzaran entre sf y formaran puntos de difraccion que scrim captados por un detector. La posicion e intensidad de cada punto contiene informacion acerca de la posicion de los atomos en el cristal. EI producto inmediato de un anal isis de difraccion es un complejo mapa de densidad electronica tridimensional, Su interpretacion requiere conocer Ia secuencia de Ia proteina del cristal. Con ayuda de una cornputadora, el mapa y Ia secuencia son cotejados hasta obtener la maxima coincidencia. La fidelidad del modele atomico final depende de la resolucion de los datos cristalograficos originales. Por ejemplo, una resolucion de 5 A produce una baja resolucion del esqueleto de la proteina, mientras que una resolucion de 1,5 A permite posicionar todos los atornos de la proteina (excepto los de H). Muchas clases de proteinas han sido analizadas de este modo. Algunos virus no envueltos, al igual que las proteinas, pueden purificarse y formar crist ales de suficiente calidad como para analizarlos mediante difraccion de rayos X. Asi, se ha deterrninado la estructura tridimensional del virus de Ia fiebre aftosa con una resolucion de 2 A y Ia del parvovirus canino con una resolucion similar. Es importante recalcar que el exito completo de cualquier estudio estructural a este nivel requiere eI conocimiento previo de las macromoleculas constitutivas del virus y sus proporciones relativas, de Ia misma manera que necesitamos
I Un diametro atornico equivale a 2 o 3 A; una helice alfa de arninoacidos = 10 A, y Ia doble he lice de DNA, 20 A. 1 A = 0, I nm (nanornetros), Inm= 10.9 m, 1 A= 1O.jO m, 2 Para observar reconstrucciones coloreadas y animaciones de distintos grupos de virus, visitar www. bocklabs. wise, edu/virusviztop. html

34

Ia secuencia

de aminoacidos

en el

CHSO

de las proteinas

puras. Virus mas complejos

no

han podido cristalizarse atm. En esos cases, las particulas son disociadas en unidades de ensamblaje menores las cuales sf pueden purificarse y cristalizarse. Estes datos suelen cornbinarse con los obtenidos por analisis de crioelectro-micrografias de particulas cornpletas para obtener una imagen cornpleta y detallada de la estructura del virion.

Eig_2_: A) Virus Sindbis (RNA, envuelto, Togaviridaei. Vista de la superficie del virion. Derecha: corte transversal mostrando las glicoproteinas de la envoltura (periferia mas clara) y la nucleocapside por dentro. Debajo se muesrra la superficie de la nucleocapside, B) La capdide de un calicivirus (RNA. no envuelto, Caliciviridaey. C) Rotavirus (RNA, no envuelto, Reoviridaes. La partfcula tiene tres capas concentricas de
proteinas. Las espiculas que ernanan de In superficie estan forrnadas por la proteina VP4 la cual esta

implicada en el reconocimiento del receptor celular, D) Herpesvirus (DNA, envuelto, Herpesviridaei. La envoltura no se incluye a los fines de rnostrar la nucleocapside euya superficie contiene una proteina estructural principal, VP5. (de Fundamental Virology, Fields, Bet al, a= edicion).

35

Existe una gran variedad de tipos morfologicos entre los virus. En la figura J sc muestra un esquema sencillo de una parricula viral con sus componentes. El clemente mils externo corresponde a Ia envoltura, cuya estructura general es identica a la de

cualquier membrana biologica. Como no todos presentan membrana, los virus se clasifican enyjrus enyueltos y yirus 119 envueltos. Rodeada por Ia envoltura se encuentra 1a capside, de naturaleza proreica y presente en todos los virus. La capside sirve a su vez
de cubierta protectora para el genorna viral, RNA
0

DNA, d cual esta asociado

a otras

proteinas, Como la capside y el genoma viral de ciertos virus estan intimarnente relacionados, suele utilizarse el terrnino nucleocapside para referirse al complejo complete de proteinas-acidos nucleicos. En algunos virus, la envoltura se halla
fuertemente asociada a la nucleocapside. En otros, por el contrario, se describe un espacio

(tegumenta) que es ocupado por otro set de proteinas, Las variaciones sobre esta arquitectura basica, que pueden ser significativas, se veran oportunamente al tratar
individualmente las distintas familias de virus.

tegumento fuura La envoltura La envoltura esta constituida por una bicapa de lipidos y proteinas asociadas. La presencia de la envoltura no s610 es un rasgo morfologico, sino que imprime al virus eon un estilo de penetracion en la celula target 0 blanco y con una manera de interactuar con la rama efectora del sistema inrnune. Las proteinas de la envoltura pueden ser transmembrana 0 asociarse con la bicapa por otras rnodalidades. La cadena polipeptldica de las proteinas transrnernbrana
atraviesan una
0

3: Componentes de la particula viral.

mas veces la bicapa. Tlpicamente

presentan

tres dominies:

uno interne,

uno transmembrana y otro externo. Si se trata de una glicoproteina (gp), las cadenas de oligosacaridos se unen ai dominic externo. Los dominios extern os son particularmente importantes pues contienen los sitios de union a los receptores celulares, evento que marca el inicio de la penetraci6n de los virus en las celulas. Por 10 tanto, Ia integridad de la envoltura es esencial para la infectividad de los virus envueltos. Los dominies extemos

36

son importantes en otro sentido: son los blancos predilectos de la rama efectora de Ia respuesta inmune. FJ rol de las protein as de [a envoltura en la penetracion, no se limita 11 la union a los receptores. Para que el genoma viral pueda expresarse en la celula, debe desprenderse de las estructuras que 10 rodean. Los virus envueltos se deshacen de su membrana, ya sea en la superficie celular 0 en los endosornas, al fusionarse con Lamembrana de la celula. La fusion entre las membranas dependen de las aptitudes fusogenicas de algunas proteinas de Ia envoltura. ;,CuAntos tipos diferentes de proteinas de membrana tienen los virus? Ella depende del virus en cuestion. Por ejemplo, el virus de Ia rabia (Rabdovirus, RNA), posee s610 dos tipos, la glicoproteina G y la proteina M. Existen unas 1200 copias de gp G pm virion. La gp G es una protcina transrnembrana con un peso molecular de 63 Kd3, y es responsable de la union a los receptores y de la fusion de Ia envoltura con la membrana plasmatica. La proteina M (26 Kd, 1800 copias pm virion) se encuentra del lado interne de la envoltura y realiza contactos con la nucleocapside. En los paramixovirus (RNA), la glicoproteina fIN se encarga de la union a los receptores mientras que la gp F es el factor fusogenico. Otros virus mas cornplejos, como ciertos virus DNA, contienen mas de 10 tipos de proteinas distintas en su envoltura. Observese, que el reconocimiento de los receptores celulares y la fusion de membranas son funciones que pueden recaer sobre un tipo de proteina 0 bien repartirse entre dos 0 mas proteinas distintas. Otras funciones irnportantes de las proteinas de la envoltura son la destruccion de receptores e intervenir en el denudamiento de 1a nucleocapside, aunque las mismas estan restringidas a un numero menor de virus. La envoltura es adquirida en las etapas finales de In infeccion, antes de la liberacion de la pro genie viral. El proceso por el cual la nucleocapside adquiere la envoltura se conoce como gemacion ("budding" en ingles) y puede ocurrir en Ia membrana plasmatic a, en el aparato de Golgi en el reticule endoplasmico, segun el virus. Las proteinas de envoltura se congregan en la membrana relevante y las nucleocapsides luego "arrastran" la membrana resultando envueltas en el proceso, (,C<'nno "saben" las proteinas virales que deben congregarse en un compartimiento deterrninado? Las proteinas virales usan los mismos codigos de segregacion que las proteinas celulares. Por ejernplo, si un virus gerna a traves de la membrana del reticule endoplasmico, las proteinas de la envoltura viral deberan tener sefiales que las retengan especificamente en Ia membrana del reticule. Por otro lado, ciertas proteinas de la envoltura viral juegan un papeI decisive en el proceso mismo de gemacion. Mientras que las proteinas virales estan codificadas por el genorna del virus, la sintesis de los fosfolipidos no lo esta. Como consecuencia, la composicion de lipidos de la envoltura viral suck ser un reflejo de la membrana celular de la cual se origino. Ello no quita que algunos virus, por mecanismos poco claros, puedan enriquecer sus bicapas en ciertos fosfolipidos durante la gemacion, Tampoco se conoce bien como en la gemaci6n se excluyen las proteinas celulares.

Kd= kilodalton

37

La capside es esencialrnente una cubierta formada por repeticion de unas pocas proteinas (de un solo tipo de proteina en algunos virus). estructura de Ia c<lpside debe ser 10 suficientemente estable como para proteger el genom a ante ambientes hostiles.

Pero una vez en el interior celular, debe SCr 10 suficientemente

inestable como para

permitir 121 liberacion del genoma, paso esencial para 121 replicacion, Por 10 tanto, las particulas virales son estructuras metaestables, esto es, aun no han alcanzado una conformacion que represente el est ado de minima energia Iibre. Esta ultima condicion se Iogra cuando se promueven cambios de conforrnacion irreversibles asociadas con Ia adhesion y entrada de la particula ala celula. La capside es la estructura mas expuesta en los virus no envueltos, 10 cual implica

que contiene los sitios necesarios para reconocer los receptores celulares, Aun en los virus envueltos, la forma de la capside suele determinar Ia forma global del virion. Sin embargo, en virus mas complejos otras estructuras subvirales pueden incidir en la forma de la particula. Aunque Ia capside generalmente esta constituida pOI' una capa (mica de proteinas, ciertos virus presentan capsides estratificadas. El numero de proteinas distintas presentes en la capside varia de virus a virus. En algunos pocos, la repeticion de un solo tipo de proteina basta para conformar Ia capside. En In mayoria de los virus, tres 0 cuatro proteinas forman los bloques de construccion con los cuales se forman las estructuras de ensarnblaje de mayor jerarquia,
Una forma conveniente de describir la estructura de los virus es a traves de sus ejes de simetria rotacional. En este sentido, predorninan dos tipos: los de simetrla icosaedrica y los de simetria helicoidal. Muchos virus esfericos poseen simetria icosaedrica mientras que muchos virus bastoniformes presentan sirnetria helicoidal, EI icosaedro es una de las figuras platonicas, Se caracteriza por tener 20 caras

cada una de las cuales es un triangulo equilatero. La simetria del icosaedro incluye ejes

Figura 4. Icosaedro mostrando los ejes de rotacion. La mayoria de los virus con simetria icosaedrica no tienen forma de icosaedro, pero sf poseen los ejes de rotacion dobles (2), triples (3) y quintuples (5) que caracterizan a! icosaedro, (de Fundamental Virology, Fields, B et al, 3ra edicion),

38

dobles, triples y quintuples de rotacion, un patron que parecc ser la forma mas eficiente pam la disposicion de subunidades estructurales en una conforrnacion cerrada (figura 4),

Existen exactamente 60 elementos identicos en fa superficie de cualquier estructura con simetria icosaedrica que ,)'C relacionen entre sf por ejes de rotacion dobles, triples y quintuples. Esto significa que 51 una capside esta formada par 240 unidades, las mismas deben estar agrupadas en 60 sets identicos. En la figura 5, las unidades, representadas por comas, se disponen obedeciendo a las leyes del icosaedro. Las comas relacionadas por ejes dobles de sirnetria contactan por sus cabezas, las relacionadas pm ejes triples, por sus cuellos, y las relacionadas por sus ejes quintuples, por sus colas. La siruetria del icosaedro establece que 3610 60 (como en la figura) 0 un multiple de 60 unidades iQ~l1t.ica~ pueden acornodarse en la estructura. En fa mayorla de los virus, cada unidad (coma) esta formada por !lUIS de una cadena polipeptidica. En algunos, se trata de cadenas de la misma proteina mientras que en otros las cadenas son quimicarnente distintas.

fJ.rura 5. Estructuras con simetria icosaedrica conteniendo 60 (a) 0 180 (b) subunidades,
(de Fundamental Virology, Fields, Bet al, 3ea edicion).

El multiple de 60 unidades que utiliza un virus para conforrnar su capside viene indicado por el valor T. Asi, un virus con un valor T= 4 indica que posee 240 unidades totales agrupadas en 60 sets identicos. El valor T tarnbien se conoce como valor de triangulacion por que da idea del modo en que la superficie del icosaedro puede ser subtriangulada para acomodar un gran numero de unidades. Los virus con capsides mas grandes general mente ernplean diferentes tipos de subunidades para formar los vertices con ejes quintuples de rotacion (hay 12 de tales vertices en un icosaedro) y presentan adernas otros tipos de cornplejidad. En algunos virus envueltos, los dominies internos de las proteinas de membrana presentan contactos con la capside. En estos casos se piensa que la movilidad lateral de las proteinas en la bicapa esta restringida, y que las proteinas se ordenan siguiendo los principios de la simetria del icosaedro.

39

Pi\=g_mjly!nJ:;> (FtNA, no envueltos)

Debido a su pequeiio polaridad positive.' han podido con precision. En la figura 6 Picornaviridae. Contiene 60 contiene cuatro subunidades, !')olypeptide). Como hay 180 protorneros identicos, 'reel. tamafio y a la falta de envoltura, varies virus RNA de cristalizarse y su estructura tridimensional determinarse se muestra la organizacion estructural de la capside en unidades estructurales 0 protomeros. Cada protornero las proteinas VPI, VP2, VP3 y VP4 (del Ingles Yirion de tales subunidades en el virion, organizadas en 60

EiglJra6~ Organizacion
3'" edicion).

de la capside de picornavirus.

(de Fundamental Virology, Fields, B et 'II,

Aunque VP4 se sefiala en la figura, esta proteina se encuentra

enterrada

en Ia capside y

no contribuye a fa superficie del virion. Cuando sc tratan viriones purificados con una solucion de Bel 0.1 M, pll 6, el virion se disocia liberando el genoma de RNA, VP4 Y 12
pentameros compuestos por 5 protorneros cada una. Los pentameros presencia de urea 2 M en sus protorneros constituyentes (figura 7). pueden disociarse en

Esto es, cuyo RNA aetna como un mRNA dentro de la celula,

40

ac. clorhldr. 0.1 M pH 6.37 C

....fI>-

urea 2 M

-----------pentamero prot6mero

virion
[igUI1!I Disociacion del virion en picornavirus.

Este esquema de disociacion

sugiere el mecanisme

de ensamblado.

Tanto VPl, VP2 como VP3 poseen un dominio cornun de unos 200 aminoacidos, organizado como hoja plegada B y denominado "barril B" de la capside, La forma en que se pliega la cadena polipeptldica se muestra en Ia fig 8. Las cadenas B forman dos hojas (B, I, D, G y C, II, E, F)_ Las doble mayusculas (Be, HI, etc) indican los "loops" (partes del polipeptido que unen las regiones 13 y que pueden adoptar varias configuraciones) donde sc encuentran las mayores diferencias entre las VPs. Los cilindros indican regiones de c{,helices. Aunque los barriles B son comunes a rnuchas proteinas, el tamafio y disposicion de los loops son exclusives de las proteinas virales. La forma de estos dominies les permite empaquetarse firmernente alrededor de los ejes de rotacion. De hecho, dominios sirnilares se encuentran en las capsides de muchos tipos de virus,
superficie externa del virus
Be HI DE FG

OH
CD

FigUrjL~;_ modele de barril f3 de las proteinas

de Ia capside.

Los loops asf como los extremes carboxi-terminales protruyen hacia la superficie externa del virion contribuyendo aSI a la antigenicidad del virion y al reconocimiento de los receptores celulares, Alrededor de los ejes quintuples de rotacion, cinco molecules de VPI interactuan (fig, 6, centro de la figura), se forma una depresion denorninada cation; En los rinovirus, el canon es el sitio de interaccion con el receptor celular ICAM- I, una proteina de adhesion de la superfamilia de las inrnunoglobulinas. Los extremos Nterrninales de los barriles se encuentran en el lado interno de let capside interdigitandose y formando una red que dirige y estabiliza el ensarnblado.

41

En algunos picornavirus, el virion sufre un carnbio conformacional a! interactuar con la superficie celular. EI cambio es de tipo expansive, va acompafiado de 1f:1 perdida de VP4 del interior, y serfa disparado por la union a uno 0 unos pocos receptores. POl' ]0 tanto, la union con el receptor no s610 prornueve Ia adhesion especifica del VJnIS ala celula, sino que inicia el desensamblaje.
..... _~

Adenovirus
'_~

•__.

(DNA, no envucltos)
,_,_,_"c.,~ ,_,_,_._ ~.~ ..m~

,__ ,_mT

Los adenovirus (Adenoviridaes poseen una estructura mas cornpleja que la descripta anterior mente (fig.v). La estructura tridimensional de la particula fue determinada con una resolucion de 35 A mediante reconstruccion tridimensional a partir de micrografias crioelectronicas. Las particulas de adenovirus son icosaedricas y miden entre 70 y 100 nm (unas tres veces mas que los picornavirus).

, ftbra

Hexer. protema asociada al hex6n

protema asociada al penlonbase

DAP (protelna asociada al DNA)

fjgUta._2._Diagrama de la particula de adenovirus Analisis electroforeticos indican la presencia de unos 11 polipeptidos diferentes en el virion, 7 de los cuales estan en Ia capside formando 252 subunidades 0 capsorneros (240 hexones y 12 pentones). Cada hexon es un trirnero de un mismo polipeptido de 110 Kd (polipeptido II), el cual po see dos dominies con una configuracion global sernejante a Ia del barril {3, Los loops del barril se proyectan hacia fuera interactuando firmernente con los loops de los otros barriles del hexon. Los loops contienen los principales determinantes antigenicos especfficos de cada tipo de virus. EI penton esta formado por una base pentarnerica (polipeptido Ill) y una fibra trimerica (polipeptido IV) y se Iocaliza en los ejes quintuples de rotacion (12 par parncula)". Cada base esta rodeada par 6 hex ones . La proteina de Ia fibra posee 22
5

Los nornbres de hexon y penton derivan del hecho de que cada uno esta rodeado por 6 y 5 elementos identicos, respectivamente,

42

repeticiones que forman importantes base refuerza

que conforman el largo tallo y un extreme Cvterminal de 181 aminoacidos la dilatacion en el extrerno. Se piensa que tanto la fibra como la base son para ingresar a In celula. La dilatacion de la fibra media la union inicial y la la union al interactuar con integrinas de In celula.

En los virus con simetria helicoidal, las unidades de la capside forman una helice alrededor del genoma con un eje de rotacion coincidente con el eje de la helice. POI" ejernplo, el TMV es un bastoncito rigido de 300 nm de largo POf 18 de ancho. Las 2130 unidades de la capside se disponen en una helice hacia In derecha con 161/3 unidades por vuelta, El RNA se Iocaliza entre las vueltas sucesivas de la helice (fig. 10).

&ur~lQ.

Estructuta helicoidal del virus del mosaico del rabaco (TMV) (de Fundamental B et al, 3r9 edicion).

Virology, Fields,

Los virus codifican en su genoma las proteinas que necesitan para replicarse, ensamblarse, formar el virion, etc. Cuando hablamos de proteinas del virion nos estarnos refiriendo a aquellas proteinas virales que forman parte de Ia particula viral,
diferenciandolas de otros productos virales que, aunque esenciales para la replicacion del

virus, no integran las mismas. La mayoria de las proteinas del virion, como hemos visto, cumplen roles estructurales y, a veces, proteinas del virion y proteinas estructurales del
virus se utilizan como terminos equivalentes. Algunos virus poseen enzimas incorporadas en el virion. Por ejemplo, los retrovirus poseen en la capside varias copias de la enzima

43

transcriptasa vtrus.

reversa la cual cum ple un papel decisive en el cilo de vida de este grupo de

La forma mas directa de identificar las proteinas del virion es purificandolo. disociando sus proteinas y separandolas luego mediante electroforesis. Una forma de lograr esto es infectar cultivos celulares en un rnedio en el cual Ia metionina normal

presente en 51J cornposicion es reemplazada por 35S-metionina. En estas condiciones, todas las proteinas que incorporan metionina (y Ia gran rnayoria 10 haec) van a ser
radioactivas, y por extension, las particulas virales que se forman. Luego se cosecha el virus y se 10 purifica siguiendo algun protocolo de purificacion, La purificacion es irnportante ya que tam bien las proteinas celulares seran radioactivas y si no se las separa el gel contendra tanto bandas correspondientes a proteinas celulares como virales. La suspension viral luego se trata con un detergente como e1 SDS (dodecil sulfate de sodio) el cual disocia las proteinas del virus y anula sus cargas. Las proteinas disociadas Iuego se separan mediante electroforesis en gel de poliacrilamida. En estas condiciones, la separacion de las protein as en el gel es una funcion de su tamafio relative, y el misrno puede estimarse si se corren simultaneamente proteinas con pesos moleculares conocidos (marcadores de peso molecular). Transcurrida Ia electroforesis, el gel de seca y se pone en contacto con un film. La radioactividad emitida por las bandas proteicas impresiona la emulsi6n del film y tras el revel ado se detecta como una mancha negra. Este ultimo procedimiento se denomina radioautografia (fig" 1I),

Vp·1 ~-

VP3VP4 »<>:

VP2_ ..

mum l.l. Polipeptidos de rotavirus en particulas purificadas.

Otro metodo muy utilizado que tarnbien emplea marcacion metabolica con un aminoacido radioactive, requiere la produccion previa de anticuerpos especificos para proteinas virales. En esta tecnica, denominada inmunoprecipitacien, las celulas infectadas y marcadas son lisadas con un detergente, A este lisado (que contiene tanto proteinas celulares como virales) se le agrega un anticuerpo especlfico acoplado a particulas inertes, En el lisado, los anticuerpos sc uniran a una proteina viral de tal forma
que se formaran cornplejos resto de los componentes proteina-anticuerpo-particula, los cuales pueden separarse del del lisado mediante centrifugacion. Las proteinas virales fraccionarse en un gel de poliacrilamida y visualizarse mediante

pueden

luego

radioautografla, La tecnica entre anti cuerpos

de inmunoblotting

y proteinas

virales

(0 Wester blott) tambien pero en fonnato distinto

y sin Ia necesidad

se basa en reacciones de

44

marcacion metabolica. Sc infectan celulas, se lisan con detergente y se separan mediante electroforesis. Posteriormente, el gel se po De en contacto con una membrana sintetica que po see afinidad pm las proteinas y, con ayuda de un aparato especial, las bandas de proteinas del gel S()!1 obligadas a transferirse a la membrana ocupando las mismas posiciones que guardaban en el gel. Notese que hasta aqui, no hubo ninguna seleccion: tanto bandas celulares como virales son transferidas a la membrana. Luego se coloca la membrana en una cuba llena de buffer que contiene anti cuerpos contra una proteina viral determinada. Estos anticuerpos se uniran a la banda transferida que contenga la proteina contra la cual fueron generados los anti cuerpos, pew no al resto de las bandas de [a membrana. Para poner en evidencia la banda en cuestion, se recurre a uno de varios protocolos de inmunotincion como, por ejemplo, los basados en los sistemas peroxidase 0 avidina-biotina. Tanto la inrnunoprecipitacion como el inmunoblotting van mas alla de la simple deteccion de proteinas virales, Solas 0 combinadas pueden usarse para estudios de cinetica, Iocalizacion subcelular, 0 asociacion de proteinas virales con otros productos, El inmunoblotting es asi mismo un metodo rnuy sensible de diagnostico,

EI genoma de los viru;::

EI genorna viral suele encontrarsc en el centro de la particula asociado a proteinas. Durante el ensamblaje, cortas secuencias del genoma actuan como senates de empaquetarniento las cuales dirigen Ia encapsidacion. En algunos virus, la replicacion del genoma esta coordinada con el empaquetamiento, El genoma viral no suele estar "desnudo", pm el contrario, ciertas proteinas se unen para neutralizar las cargas negatives de los grupos fosfato del RNA a DNA En algunos virus pequefios a DNA como los poliornavirus, el cromosoma viral esta empaquetado por histonas celulares, no teniendo necesidad el virus de codificar proteinas de empaquetamiento. Los virus a DNA con mayor capacidad genomica (herpesvirus, adenovirus), utilizan proteinas especiales codificadas par el virus. En muchos virus RNA las rnismas proteinas de la capside interaccionan con el RNA, En general, el genoma viral no pareee adoptar una configuracion unica dentro de la capside. Po clIo, 110 sc suelen obtener datos cristalograficos de estas estructuras, Los genom as virales comparten rasgos comunes con los genornas de otros organismos. Como ya se habia rnencionado, una de las caracteristicas de los genomas virales que los diferencia del resto es que la infomacion genetica puede alrnacenarse tanto en la forma de DNA como en la de RNA. Asi, los virus se dividen en dos grandes grupos: virus DNA y virus RNA. Las diferencias entre los dos grupos van mas alla de Ia mera distincion quirnica entre sus acidos nucleicos. Por ejemplo, los virus RNA se repliean en el citoplasma mientras que los virus DNA 10 hacen en el nucleo. Siempre hay excepciones: los virus de la influenza (RNA, Orthomyxoviridaes, POf ejemplo, se replican

en el nucleo,

La capacidad de los genomas virales (0 sea, el numero de genes que contienen) esta limitada por la capacidad de empaquctamiento de Ia capside, Incluso los virus mas complejos no suelen tener mas de 300 genes, mientras que los mas simples solo poseen 5 o 61! . Una bacteria como E. Coli posee 2400 genes y una celula de mamifero, unos

45

70000, 10 cual

j lustra

Ia relative

sirnpleza

de los virus" En este contexte,

sorprende

la

manera en que los genes virales dorninan la escena de Ia expresion genica una vez dentro de las celulas. En Ia figura 12 se compara Ja cantidad de DNA entre diversos orgamsmos.

150

r; 100

g
~

to

50 I}~o.~_._~.~

~~ __

._o~ ~ ..... .. ·.

virus

bacterias

levaduras

mosca

mosca

mamffero

rlg!lf. 12. Cantidad de DNA en diversos organismos (en millones de pares de bases) .1!

Las restricciones espaciales de los virus obligan a una alta densidad genica, esto es, disponer de muchos genes en un corto tramo de acido nucleico, mientras que en la celula eucariota los genes estan separados por largas secuencias no codificantes. En los virus mas sencillos, los genornas contienen genes para las protein as estructurales y poco mas. En los mas complcjos, como los grandes virus DNA, el genorna se expande para aceptar genes para enzimas del metabolisrno nucleotidico, la replicacion del DNA, e incluso para proteinas destinadas a modular al gran enernigo: el sistema inmune. No existe correlacion entre el nurnero de genes de un virus y Ia severidad de la enfcrmedad que ocasionan. Virus con un bajo mimero relativo de genes pueden ser desvastadores para eI huesped, e.g. el HIV, mientras que virus con un numero relative alto de genes (e.g. poxvirus) pueden ocasionar enferrnedades benignas, No debemos perder de vista Ia premisa de que los virus solo "buscan" perpetuarse en la naturaleza adaptandose al nicho que mas le convenga. Ello puede requerir de una cantidad variable de productos virales de acuerdo a Ia estrategia utilizada.

EI pequeiio

tarnafio de los genornas

virales

ha permitido

let secuenciacion

cornpleta de incontables virus de plantas, bacterias y animales. La organizacion de los genornas suele representarse con diagrarnas de distinto tipo, siguiendo ciertas convenciones. En la figura 13 se esquematizan dos versiones de 1a organizacion genomica del virus de la papilomatosis bovina 1 0 BPV-1 (DNA, Pap ilomaviridaei. El genorna del BPV-l es una rnolecula de DNA circular de doble cadena con 7946 pares de bases, Su organizacion puede esquernatizarse en su version circular nativa (A) 0 en su version linearizada (B} El BPV -1 poscc 10 genes. Algunos se expresan temprano durante Ia infeccion y reciben el nombre de genes E (Early= temprano), los otros se expresan tarde durante la infeccion y reciben el nombre de genes L (Late= tardios). Una caracteristica de todos los papilornavirus es que todos sus genes estdn codificados en una

sola de las dos cadenas de DNA.

46

BPV-1

2
3

del BPV- L Arriba) Version circular. EI clrculo interne representa el genorna complete de DNA de doble cadena. 79461! indica la posicion de la union del primer y ultimo par de bases que, por convencion, se coloca a las 12 hs de un hipotetico reloj. Las bases van aumentando hacia Ia derecha en el sentido de las agujas del reloj. Las lineas curvas externas representan las posiciones de los distintos genes dentro del circulo. Por ejemplo, el genE6 esta codificado entre las bases 1 y 500, aproximadamente, el gen E4 entre las bases 3000 y 3500, etc. Las flechas que se apoyan sabre el circulo indican dos casas: J) la posicion del sitio donde se inicia la transcripcion del gen, 2) el sentido (bacia la derecha 0 hacia la izquierda) en que se transcriben. POI' ejemplo, PS9rJ indica el sitio donde cornienza a transcribirse el gen E I; P indica que hay un promotor y 890 es Ia primer base transcripta para E]_ Notese que todas las flechas seftalan hacia la derecha indicando que, en este virus, todos los genes estan codificados en la misma cadena del DNA. f\ es el promotor para los genes tardios y LCR (Long Control Region, region de control larga) es una region del genoma viral que no conriene genes pero si senales para el control de la transcripcion y la replicacion de! DNA. AL Y AE (posiciones 7175 y 4203) indican seftales de poliadenilacion para genes LyE, respectivamente. Adviertase que en muchos cases existe superposicion de genes E. Los genes E6 y E7 son particularmente interesantes ya que se asocian con la transforrnacion celular. Abajo) Version lineal. En la parte inferior se muestra la escala de bases del. DNA. Arriba 5C rnuestran los genes como bloques con sus llmites en numero de bases. Como en A, la eleccion del lugar donde ernpieza eJ genoma es arbitraria, La direccion de la transcripcion es de izquierda a derecha por 10 que se deduce que el extreme 5' de la cadena codificante esta a la izquierda y el extreme 3' a la derecha, (Fundamental Virology, 3'" ed., Fields et al., 1995).

Eig_lJr~J}_. Mapa genomico

47

Los genomas

de los virus vienen en varios forrnatos.

En la figura 14 se muestran

los mas comunes entre los virus de animales.

circular

papilomavirllS polyomavin.!s

lineal simple cadena

Picornavirus.

doble cacena

Togavirvs Corona virus. Rabdovirus

Paramyxovirus

lineal doble cadena

======~ herpesvirus
pOXVJfUS

Imeal, seqmentado,

simple cacena

......... -----

Orthomyxovirus, Arenavirus Reovirus

Bunysvinis,

lineal simple C'c:ldena

ciroular, parcialmente

doble cadena
____ ,_" •• ,._. __ w __

0
,~
._,_ ••

oorvovuus

hneal, segmentado, doble cadena

= -::;::::::.=; ~

hvpadnavims
._,~. __ • ,c ••

_~'0_'

.1~.

.'~'m

__

'~

...~_"~_._,.,_.

__

"~_,

__

.•_ ..~~

..

••

EiguraU. Diversos formatos de los genomas virales.EI cuadro corresponde a los genomas tal cual se encueruran dentro de las parttculas virales, ignorando el heche de que algunos pueden carnbiar de configuracion durante el ciclo infective dentro de la celula, NQlW los esquemas no tienen en cuenta las diferencias de tarnafio entre los genomas de los distintos grupos de virus.

i,CCmlO se determina si el acido nucleico de un virus cs DNA 0 RNA? La forma mas sencilla es purificando virus como, por ejemplo, se ilustra en la figura 1, y Iuego separando el acido nucleico de las proteinas virales mediante cualquier procedimiento de extraccion de acidos nucleicos (aunque estes procedimientos no son exactamente iguales para el RNA 0 DNA). Estos son luego incubados con DNasa 0 Rnasa las cuales digeriran selectivamente el DNA 0 el RNA, respectivamente, El efecto de 1a digestion puede seguirse electroforeticamente 0 espectrofotometricamente.

48

La razon ultima por la cual nos interesa In genetica de los virus en Ciencias Veterinarias es comprender como funcionan los genes virales cn el contexte del huesped y como manipuleamos para nuestro provecho. El conocimiento de la funcion genica es indispensable para comprender los mecanismos Intimos por los cuales los virus producen enfermedad. De hecho, los virus, por su relativa simplicidad, constituyen una oportunidad unica para descifrar las bases geneticas del parasitismo. Este conocimiento, a su vez, puede sugerir nuevas estrategias para combatir 0 prevenir las infecciones virales, La genetica de los virus ha pasado rapidamente de la genetica clasica a la basada en las modernas tecnicas de Biologia Molecular. Una de las formas mas poderosas para conocer la funcion de un gen viral es producir un virus que no pueda expresar esc gen y par 10 tanto producir su proteina. Este mutante puede ser usado para infectar cultivos de tejidos y/o ani males y luego cornparar el fenotipo de la infeccion con el del virus normal. Supongarnos que se construye un virus mutante al cual se Ie deleciona (se le quita) un gen, el gen W, Cuando infectamos celulas cultivadas con el virus mutante observamos que no se produce progenie viral. Esto puede deberse a una de rnuchas razones: 1) el gen W codifica para la proteina encargada de reconocer al receptor celular, 2) el gen W codifica para una proteina esencial para el desmantelamiento de la capside, 3) el gen W codifica para un factor de transcripcion viral, 4) etc. Cualquiera de estas razones podria justificar el fenotipo observado, esto CS, Ia falta de produccion de progenie. En el primer caso, el virus no puede entrar ala celula; en el segundo, no puede liberar su genoma; en el tercero, no puede expresar sus genes y POf 10 tanto producir las proteinas del virus. Supongamos ahora que se toman micrografias electronicas de las celulas infectadas y, sorprendentemente, se observan particulas completas en el lugar adecuado en tiernpos tardios de 1a infeccion. Una linea de razonamiento nos llevaria a pensar que las posibilidades I, 2 Y 3 son falsas, y que el gcn W debe cumplir algun ro1 en la Iiberacion de las particulas ya rnaduras. Refinarnientos posteriores nos llevaran a conocer en que fase del ciclo infective el gen W resulta crucial. Por 10 tanto, no nos sorprenderia constatar que cuando infectamos un animal con el virus rnutante, este no se enferma pues el virus no puede replicarse. Provisoriamente podemos concluir que el gen W (0 si se quiere, la proteina par 61 codificada) es esencial para el virus, pues sin 61 el virus fracasa en su objetivo: replicarse. Supongamos ahara que se construye otro mutante del misrno virus, pero esta vez se deleciona el gen Z, Cuando infectamos celulas con el mutante no encontramos diferencias al cornpararlo con el virus normal, Produce progenie en la cantidad esperada y en los tiempos esperados. Decimos que Z es un gen no esencial para Ia replicacion viral. Sin embargo, cuando inoculamos animales con el virus rnutante, los sintomas tardan en aparecer y la enfermedad es mucho mas benigna que la causada tras Ia inoculacion con el virus normal 0 salvaje. La conclusion es que el gen Z no es esencial para la replicacion viral in vitro pew sf es irnportante para producir la enferrnedad. La conclusion se veda reforzada si comprobasernos que el rnutante Z se replica a niveles norrnales en los tejidos del animal, reforzando la idea de que las diferencias en el fenotipo no se deben a un inconveniente en la replicacion, Entonces deberiamos pensar que el gcn Z cumple algun rol mcdulando la interaccion del virus con su huesped, quizas a traves del sistema

49

inmune, Por ejemplo, la proteina Z podria interferir con alguna citokina interfiriendo con la respuesta inmune, Al estar ausente el gen Z el sistema inmune puede eliminar mas rapidamente al virus impidiendo que induzca patologia severa. In concepto a retener es que muchos genes virales que 110 parecen esenciales In vitro pueden ser cruciales para fa

induccion de enfermedad en el animal.

En el pasado, los virus mutantes se obtenian accidentalmente en el Iaboratorio, 0 se inducian especificamente con algun tratarniento. En la actualidad, con cl conocimiento de las secuencias de los genornas virales y la capacidad de alterarlos de manera predecible mediante tecnicas de DNA recombinante, los mutantes virales pueden obtenerse sobre una base racional, ya fuera para conocer las funciones de 10 genes 0 para producir cepas vacunales.

cepa, tipo, variante, y mutante se suelen emplear en Virologia sin dernasiada discriminacion para indicar un virus que difiere de manera heredable de una forma parental 0 salvaje ("wild type" en ingles). En la mayoria de los cases, un virus salvaje es una cepa adaptada en el laboratorio a partir de la cual se obtienen versiones mutantes y con la cual se compara el cornportamiento de dichos mutantes, Por 10 tanto, el termino salvaje es un termino arbitrario que se asocia a una poblacion especifica de virus. Sabemos que en rnuchos casos 10 que consideramos salvaje puede que no refleje con exactitud al virus predominante en Ia naturaleza. Para subsanar esta arbitrariedad se diferencia claramente entre cepa::;salvajes de laboratorio y nuevos aislamientos de campo a partir del huesped natural los cuales se designan como aislamientos de campo 0 sirnplemente aislamientos. El terrnino cepa ("strain" en ingles) se usa para designar diferentes versiones salvajes del mismo virus. Por ejemplo, las cepas Orsay y New Jersey del virus de In estomatitis vesicular, VSV (RNA, Rhabdoviridaey. EI termino tipo se ha transfonnado con el tiempo en sinonimo de serotipo, tal cual se determina con ensayos de neutralizacion de In infectividad, por ejemplo los serotipos A, C, 0, etc del virus de Ia fiebre aftosa (RNA, Picornaviridaei. E1 termino variante se usa generalmente para indicar un virus que es fenotlpicamente distinto del salvaje pero del cual se desconoce ia base genetica de Ia diferencia.
Los terminos

I) Mutaciones

Algunos virus producen una alta proporcion de mutantes durante la propagacion en ausencia de mutagenos. Cuando estas rnutaciones espontaneas se acumulan en el genorna terrninan reflejandose en el fenotipo. La tasa de mutacion en los virus DNA es del orden de 10-8, esto es, se produce una mutacion cada 100.000.000 de nucleotidos incorporados en el genorna durante la replicacion. En los virus RNA, la rasa es de 10-4, un error cada 10.000 nucleotidos incorporados. Existe consenso en atribuir la gran tasa de rnutacion de los virus RNA a la baja fidelidad de Ia replicacion de los genom as RNA. La

baja fidelidad depende de la falta de actividad "editora" (proofreading) de las enzimas

50

que replican el RNA J. Par 10 tanto, los genom as de los virus DNA son estables mientras que los genornas de los virus RNA son inestables, a tal punto que se vuelve dificil aplicar el concepto de "especie" cuando tratamos de un virus RNA. Para ilustrar cste importante concerto tengamos en cuenta que cuando infectamos un animal can ciertos virus I~NA, es frecuente aislar del mismo animal una poblacion heterogenea de virus con diferencias sustanciales a nivel genomico. Los virologos constantemente propagan virus en cultivos de tejidos 0 en animales. Con el tiempo, las mutaciones espontaneas se van acumulando y, como resultado, las preparaciones de virus se vuelven hcterogeneas, con la subpoblacion de virus salvage representando solo una fraccion del total. Para paliar este inconveniente y mantencr una poblacion hornogenea de virus, los virologos recurren a la clonacion periodica de sus preparaciones. Aun 3s1, probablernente se trate de una utopia mantener poblaciones de virus geneticamente homogeneas. La forma mas sencilla de inducir mutaciones es agregar un mutageno al rnedio de cultivo durante la propagacion de virus. Entre los rnutagenos mas usados se encuentran los agentes alkilantes, el acido nitroso, y los agentes intercaladores, cada uno con su mecanisme particular de accion. EI problema de esta estrategia reside en i que generalrnente se obtienen multiples mutaciones y no es posible atribuir un determinado fenotipo a una lesion puntual del gcnorna. Una propiedad de las mutaciones es Ia capacidad de revertir a1 estado salvaje, y cada mutacion tiene una frecuencia caractertstica de reversion.

Como habiamos mencionado anteriormente, las tecnicas de Biologia Molecular permiten hoy introducir cualquier tipo de mutacion en rnuchos virus. EI primer paso en esa direccion es clonar la secuencia de interes (la que queremos mutar) en un vector. El segundo paso es sorneter a nuestra secuencia a algun metodo de mutagenesis in vitro. Luego debernos introducir 1a secuencia mutada en el genoma del virus, Finalmente, debemos asegurarnos de que cualquiera sea el fenotipo observado, el mismo se debe a la mutacion discnada. Las tecnicas para generar virus mutantes por disefio varian entre los grupos de virus ya que el tipo de genorna y las caracteristicas del virus determinan 1a estrategia a seguir. Examinemos brevcmente las estrategias mas frecuentes, 1) Para clonar la secuencia de interes, de alguna manera debe aislarse un fragmento del genorna que la contenga. La manera usual de hacerlo es cortando el genoma con enzimas de restriccion y separando el fragmento deseado mediante electroforesis en agarosa, El fragrnento es luego ligado en un vector, par ejemplo un plasmido, y las moleculas recombinantcs son introducidas en bacterias para su amplificacion (ver fig, 15)" Mientras que este procedimiento es apropiado para virus

I Por eI contrario, las polimerasas de DNA poseen actividad editora, esto es, la capacidad de detectar un nucleotide inccrporado por error e intercambiarlo par el correcto. EI hecho de que el 80% de los virus animates sean virus RNA indica que la faits. de edicion no es un impedirnento para tener exito en la naturaleza. Sin embargo, la falta de edicion parece ser una limitante para el tamafio de los genornas: los genomas de los virus RNA no sobrepasan las 32 Kb,

51

DNA de doble cadena, los £Ie simple cadena as! como los virus RNA requieren pasos adicionales ya que las enzimas de restriccion no operan sobre ellos. Por ejemplo, los genomas de virus RNA pueden transformarse en eDNA (copia de DNA) mediante incubacion con la enzirna transcriptasa reversa. 2) Una vez clonada Ia secuencia de interes, es po sible introducir Ia mutacion, Tres tipos basicos de mutacion pueden introducirse. La mL1S sencilla es 18 delecion, en Ia cual se remueve un fragmento de DNA de nuestra secuencia mediante incubacion con enzimas de restriccion. La delecion es Ia mejor mantra de obtener mutaciones nulas, que

sttlos de coste /pm3 eflzims X

genoma vilal b:dd~, .J:c:2L' ..

C" ..

"~'"

~cL

.',"

•• O"~,. X

-~

@:=)

t:

purificaci6n do plasrnido

00000000 00000000 00000000 00000000 00000000 00000000 00000000 00000000

Eigp@_U. Ejemplo de clonacion de un gen viral

completarnente inactivan la funcion de un gen (ver mas abajo), Tambien resultan de interes cuando queremos averiguar la funcion de una parte de una proteina (en estos casos en vez de remover el gen entero se remueve una segmento del mismo). Sin embargo, no siempre los genornas contienen sitios de restriccion adecuados para el investigador. Para estos casos existen metodos alternatives como la mutagenesis dirigida por oligonucleotides 0 el peR (reaccion en cadena de Ia polimerasa), requiriendo ambos un conocimiento previo de las secuencias involucradas. Un segundo tipo de mutaciones

52

son las llarnadas rnutaciones por insercion, en las cuales no se rernueven secuencias del viral :--:UIU sin ~ foraneas (.~n ~l'j'l lugar determinado rl~ ge!lUJU.d vua ~C' inse rtan .tV ~u.
')'C"~_.~'''''~ ~', c"-o~~.r::. Y_UCI ....... ~ ..

Ul2;<

tl-QH

n0~-';:~'f_c..~",...,~t);D .:)l",..o\....<u.O"".lli"0,H,t.:)

_.I;

U,L)

~L!

lU

\..n ......'>r..rJ...t;. \

c..t,o,,_J;'IJ

'\--J.v

secuencia viral de interes, Un caso particular es aquel en el cual se insertan pequefias secuencias de DNA dentro de la region codificante del gen, que causan terminacion prematura de la cadena polipeptidica. Como resultado pueden obtenerse virus que producen polipeptidos de largo variable con actividades parciales. EI tercer tipo de mutaciones son las denominadas mutaciones puntuales diseiiadas para explorar la funcion de un aminoacido en particular 0 de alguna secuencia regulatoria que opera en cis. En contra de 10 supuesto, 1£1sustitucion de una sola base de una secuencia puede tener enorme repercusion en el fenotipo. La manera mas frecuente de obtener una mutacion puntual es mediante mutagenesis dirigida a un sitio. Existen metodos basados en el empleo de vectores a base de fagos como el M 19 (fig. 16) 0 basados en peR. Todos los metodos mencionados tienen sus ventajas y desventajas y la eleccion depende del problema que se desea estudiar. Generalmente la combinacion de distintos metodos permite contestar can mayor exactitud Ia pregunta formulada.

deleci6n
DNA viral salva]e

b-- e)--(!)---o
anillar oligo mutagenizado slotetlzar segunda

vector fago M 19 de simple cadena

mutaci6n puntual
DNA viral salvaje

caoeoa y Jigar

transtectar bactenas y buscar fago con mutaci6n

vector fago M 19

t)-o-o-o
0

de simple caoena

FigUI<!lQ. Mutagenesis dirigida a un sitio para crear mutaciones par delecion (arriba) de DNA viral.

puntuales (abajo)

diversos

3) Una vez generada In mutacion debe ser introducida en el genoma viral. Existen rnetodos para este fin y, nuevamente, Ia eleccion del metodo depende del

53

sistema bajo estudio. En virus DNA medianos 0 pequefins el metodo mas cornun es Iigar el fragmento conteniendo la secuencia mutada directamenre con el genoma viral. Para grandes virus DNA el metodo de la transferencia del marcador es uno de los mas us ados y se basa en el proceso de recornbinacion homologa. La idea central es introducir DNA gen6mico viral dentro de celulas junto con el fragmento de DNA que contiene la secuencia mutada. La forma mas corriente de hacerlo es mediante transfeccion. Con baja frecuencia, el fragmento con la secuencia mutada sera insertado en el gcnoma viral reernplazando al fragmento con la secuencia normal (recornbinacion hornologa). Para que

clio ocurra, es critico que la secuencia mutada en el fragmento este flanqueada

pm

secuencias normales. EI problema aquf es como detectar el virus mutante producido por las celulas. Como la recornbinacion hornologa es un fenomeno raro, dentro de la progenie el virus mutante estara menos representado que cl salvaje. Por 10 tanto se debe recurrir a algun metodo de busqueda de esas raras especies. Unos pecos genes, debido a su particular funcion, penni ten directamente seleccionar en favor 0 en contra de su expresion, Para In mayoria de los casos, pueden introducirse ciertos genes foraneos (e.g. el gen bacteriano J3 galactosidasa) junto con la secuencia mutada, La expresion de H galactosidase en el virus permitira su seleccion ya que las placas originadas por el virus mutante se tefiiran de azul en presencia de un sustrato cromogenico como el Xvgal. La introduccion de secuencias en ciertos virus RNA se ha visto facilitada con Ia produccion de clones infecciosos. Basicamenre, se obtiene eDNA a partir del RNA genornico y el mismo se dona entero en un vector apropiado. De csta forma se manipula el genoma como un vector y pueden introducirse secuencias mutadas mediante enzimas de restriccion. Luego se transfecta el vector en celulas las cuales produciran virus mutado (si Ia mutacion es viable). Otros rnetodos fueron desarrollados para In introduccion de mutaciones en virus RNA de polaridad negativa. 4) La necesidad de asegurarse de que los fenotipos observados son resultado de la

mutaci6n disefiada se debe a que durante los metodos mencionados arriba pueden introducirse cambios en otras partes del genorna. Para reducir estos problemas pueden
seguirse di versas caminosLlno de ellos es rnanejarse con secuencias cortas, con el fin de comprobar pm medio de secuenciacon que no se han producido otras mutaciones. Es conveniente obtener aislamientos virales independientes del mismo plasmido mutante. Si los aislarnientos independientes exhiben el mismo fenotipo, es probablemente debido ala mutaci6n diseriada. La forma mas convincente, sin embargo, es mapear Ia mutacion para demostrar que la mutaci6n que confiere el fenotipo se encuentra en una secuencia definida. I-C) Tipos de mutaciones Se pueden obstener distintos tipos de virus mutantes. Los mejores son aquellos faciles de evaluar, razonablemente estables y portadores de una (mica mutacion. Mutaciones nulas: inactivan la funcion del gen. En principio, distintos carnbios en los acidos nucleicos (deleciones, inserciones, mutaciones por cambio de marco de Iectura) pueden generar el fenotipo nulo, aunque tambien es posile que esos carnbios dejen intactos segmentos de la proteina que retienen la funcion 0 parte de la rnisma. Ineluso es posible que los cambios introducidos sean eludidos por mecanismos de traduccion, Por ello, cuando se disefian mutaciones, conviene delecionar el gen entero, cuando esto es

54

posible. Las mutaciones nulas son especialmente convenientes para determinar si un gen es esencial 0 no para un proceso en particular. Mutaciones sensibles a fa temperatura ((51): historicarnente, las mutaciones Is han sido amy utiles en Virologia debido a su fenotipo condicional/letal. Las rnutaciones
is

pueden

producirse mediante tratamiento con mutagenos seguido de seleccion por temperatura. En estas condiciones el virus crece a Ia ~~!ill?QIaturaQyrmisiya (37 C) pero no a la no permisiva (por ejernplo, a 42 C). A Ia t~mJ2s~ratura no PSD.!:!isivase presuponc que la protema del gen mutado se ve impedida de alcanzar una configuracion funcional,
mientras que a la temperatura permisiva adquiere dicha configuracion y el mutante puede ser propagado. En algunos virus como los reovirus y ciertos orthomyxovirus, las mutaciones ts han servido para idcntificar todos los genes virales, Mutaciones de morfologia de placa: estos mutantes producen placas en cultivo can una morfologia alterada debido a alguna diferencia rnetabolica entre el virus mutante y el virus salvaje. Se han obtenido mutantes sincitiales en algunos virus que causan que las celulas vecinas se fusionen en vez de sufrir los cambios citoliticos usuales. Estes fenotipos pueden proveer marcadores geneticos utiles y los mutantes pueden emplearse para estudiar procesos tales como la fusion de membrana y el egreso del virus,

Mutaciones de escape a 10,'1 anticuerpos: pueden seleccionarse mutantes con alteraciones en las proteinas de superficie por la resistencia del virus a Ia neutralizacion por un antisuero contra esas proteinas. Estos mutantes de escape a la neutralizacion pueden luego analizarse por media de la secuenciacion del DNA para deterrninar las posiciones de las mutaciones. Por medic de sa reactividad frente a un panel de anti cuerpos monoclonales se pueden determinar los efectos sobre epitopes especificos. Los mutantes de escape han sido rnuy utiles para analizar las proteinas de la superficie de muchos virus.

La reversion de un virus rnutante al fenotipo salvaje puede ocurrir por 3 vias distintas: 1) reversion por una mutacion que restituye el nucleotide correcto en el sitio original (reversion verdadera), 2) la mutacion puede ocurrir en un segundo sitio del mismo gen restaurando el fenotipo salvaje (supresion intragenica), 3) la reversion es mediada por una segunda mutacion en un gen distinto (supresion extragenica), Observese que en los dos ultimos casos se mantiene la mutacion original, pero la segunda rnutacion suprime el defecto resultando en un virus can genotipo alterado pero con fenotipo salvaje. Estos dos casos son referidos como seudorevertantes para distinguirlos de los revertantes verdaderos. La supresion extragenica tiene su utili dad en la deteccion y analisis de interacciones entre proteinas 0 entre proteinas y DNA. El metoda se basa en el hecho que el fenotipo mutante de una proteina 0 de una secuencia reguladora de DNA es suprimido por medio de interaccion ftsica con una segunda proteina mutante (supresor). Esto requiere que el supresor sea especifico de alelo, El aislamiento de suprcsores para mutaciones en el origen de replicacion del DNA del virus SV40 (DNA, Papovaviridaes, permitio mapear la mutacion dentro del antigeno T (un gen de SV 40), demostrando que el antigcno T interactua can el origen de replicacion in vivo. En algunos virus RNA, la frecuencia de supresion extragenica es muy alta. Ella suiere que en estos virus 1a supresion es un mecanismo por el cual Ios virus RNA eluden los efectos de mutaciones deletereas, Otro aspecto en el cual la supresion se vuelve un

55

mecanisme importante es en produccion de vacunas, Durante un ensayo de vacunacion con una vacuna del virus de la influenza que habia sido atenuada per la presencia de mutaciones ts, se origino un seudorevertante. Ensayos realizados con voluntarios revelaron que el seudorevertante habra adquirido el fenotipo salvaje como resultado de una supresion (0 supresiones) de las muraciones atenuantes.

En genetica de organismos superiores 13 heterocigosis irnplica que los crornosomas diploides difieren en marcadores alelicos en uno 0 mas: locus. Este tipo de fenorneno no suele observarse en los virus de los animales porque, salvo excepciones, los genornas de estos virus son haploides. Una excepcion importante son los retrovirus (RNA, Retroviridaes. E1 genoma de los retrovirus consiste en dos rnoleculas identicas de RNA de simple cadena. Por 10 tanto, los retrovirus pueden SCI' heterocigotas para todos los rnarcadores. Algunos virus DNA como los herpesvirus (Herpesviridaey posecn secuencias repetidas en su genorna Io eual permite que algunos genes esten presentes en dos capias. Aunque las capias en el genoma son generalrnente identicas, se han demostrado casos de heterocigosis donde la misma afecta la isomerizacion del genoma que ocurre en los herpesvirus.

En la rnayoria de los casas, los investigadores deben propagar los virus fuera del huesped natural para facilitar sus estudios. Ello requiere propagacion en animales de laboratorio 0 en lfneas celulares para los cuales los virus aislados no se encuentran adaptados. Cuando se usan anirnales de laboratorio (raton, rata, hamster, conejo, etc) se observan diversas situaciones, Estos animales pueden 0 no reflejar la enferrnedad tal cual se presenta en el huesped natural. Si la reflejan, puede que solo 10 hagan en las inoculaciones iniciales, En algunos casos, el animal de laboratorio no reproduce las caracteristicas de Ja enferrnedad pero, con los pasajes sucesivos, las mismas aparecen, De la misma manera, muchos aislamientos crecen pobremente en lineas celulares pem, con los pasajes sucesivos, se Began a obtener altos titulos virales. Cualquiera sea el metodo utilizado, se llega a una etapa en la cual el virus se adapta al sistema de propagacion. La adaptacion va acompafiada de cam bios geneticos que, en general, atenuan al virus respecto a BU hue sped natural. Por ejemplo, el pasaje sucesivo del virus de la hepatitis canina (DNA, Adenoviridaey en celulas de ririon porcino disminuye Ia patogenicidad del virus para el perro. Las mutaciones que acompafian a la adaptacion pueden caracterizarse por alguno de los metodos rnencionados en este capitulo y suelen revelar genes que son importantes para la patogenicidad en el hueped natural.

56

_.

II-A'1_,_, Mezcla de~~ ...... ~~~ fenotinos __ :::!.!....

Cuando se infectan celulas con dos virus distintos pero relacionados (por ejemplo, poliovirus y virus Coxsacky, RNA, Picornaviridaei, la progenie resultante contiene proteinas estructurales provenientes de ambos virus parentales. Esta rnezcla de genornas y proteinas estructurales produce particulas virales en las cuales las propiedades fenotipicas del virion no reflejan el potencial fenotipio del genorna. Sin embargo, en una infeccion subsecuente Ia expresion del genorna resulta en progenie con genotipos y fenotipos cognados. Por 10 tanto, la mezcla de fenotipos es un fenomeno transitorio. Se observa con mayor frecuencia en pequenos virus sin envoltura, {/)curre la mezcla de fenotipos en In naturaleza? LcuEiJespodrian ser sus consecuencias?

Aunque existen muchos tipos de interferencia entre virus, desde e1 punto de vista genetico la de mayor interes es la interferencia homologa que ocurre dentro de la celula entre virus estrechamente relacionados. En cualquier preparacion de virus, el virus infeccioso representa solo una fraccion del virus total. Aunque el virologo no to desea, las preparaciones cornienzan a acurnular particulas defectuosas, Esto es mas notorio cuando se pasan de manera seriada virus a alta multirlicidad (esto es, alta proporcion de viriones relativo al nurnero de celulas presentee)". En estas condiciones se observa que la cosecha de virus infeccioso es menor con cada pasaje sucesivo. Esto se interpreta como una interferencia can la poblacion infecciosa de nuestra preparacion. Cuando se analizan las preparaciones se puede demostrar que muchas particulas posecn genomas con deleciones. Se postula que los mutantes de delecion interfieren con la replicacion del virus salvaje (infeccioso) al competir por los componentes del aparato de replicacion, Por ello, estas partlculas se conocen como particulas defectuosas 0 particulas 01 (del Ingles Defective Interfering particles). El hecho que las particulas DI posean defectos genomicos haec que no puedan crecer autonomarnente. Para hacerlo, requieren Ia presencia de virus completo el cual aporta las funciones faltantes en las particulas OI. Asi, el virus salvaje se comporta como un virus "colaborador" 0 "helper", Estrictamente hablando, si las celulas usadas para propagrn' el virus defectuoso aportaran las funciones virales faltantes, no seria necesaria la presencia de un virus helper. De hecho, lineas celulares capaces de expresar genes virales se producen can frecuencia en los laboratories. Estas lineas son ideales para propagar virus con lesiones geneticas Ietales. Las particulas DI tambien se forman durante la infeccion de anirnales pew se desconoce como contribuyen al cursu de la enferrnedad. Tambien se han encontrado particulas Dr en preparaciones de vacunas atenuadas vivas, disminuyendo la eficacia de la inmunizacion, Un caso particular de virus defectuosos son los virus sate lites los cuales requieren de otros virus, a menudo no relacionados, para su replicacion, El ejemplo clasico son los virus asociados a adenovirus (AAV, Adeno-associated virus, DNA, Parvoviridaes,
2

Por ello es deseable prop agar los virus a baja multiplicidad de infeccion,

57

pequefios virus icosaedricos cuyo genorna codifica solo para tres proteinas, todas de Ia
capside. Estes virus s610 pueden replicarse en el nucleo celular si coexisten en Ia celula adenovirus 0 herpesvirus, AI hacerlo, interfieren con la replicacion del virus helper. EI virus hepatitis della (I{NA, sin familia asignada) es un virus satelite de humanos que requiere Ia presencia del virus de la hepatitis B (HBV, DNA, Hepadnaviridaei para su replicacion. Su presencia en personas se asocia con las formas mas severas de hepatitis

cronica y aguda.

En la jerga genetico-rnolecular "mapear" (del ingles, mapping) una rnutacion significa asignar un fenotipo mutante a un gen especifico. Muchas veces, el proceso puede conducir a la identification misrna de un gene Inicialmente, el rnapeo de muraciones se basil en el proccso de recornbinacon, esto es, en la interaccion fisica entre genornas virales dentro de la celula. En virus DNA, la forma mas cornun en que esto ocurre es par ruptura y pegado de secuencias. Si se coinfectan celulas con dos virus mutantes, se forma progenie con genom as que contienen informacion genetica en combinaciones no parentales. En virus con genomas monopartitos, la probabilidad de ocurrencia de un evento de recornbinacion entre dos mutaciones es proporcional a la, distancia fisica que separa a las mutaciones en el genom;L Esto permite ubi car las mutaciones en rnapas lineales,

Parentales

Reasortantes ts

EigtII'!._l], Cruzamiento

intertipico entre mutantes Is de reovirus, Se muestran diagramaticamente los segmentos genomicos parentales luego de la electroforesis en poliacrilamida (izquierda). Cada serotipo parental tiene un patron unico de corrida. En los reasortantes puede deducirse el origen de cada segmento de acuerdo a su movilidad.

58

En virus con genomas segmentados tales como los de reovirus 0 el virus de la influenza (RNA, Reoviridae y Orthomyxoviridae, respectivamente), 13 recombinacion adquiere un sentido diferente. Cuando se coinfectan celulas can dos mutantes de reovirus, los segrnentos genornicos son segregados al azar entre Ia progenie; aqui no hay ruptura y pegado de secuencias. En la literatura inglesa se utiliza el termino reassortment (reasociacion) para referirse al proceso. En la figura 17, se esquematiza un experirnento de "cruzamiento" entre dos rnutantes ts de reovirus (cruzarniento intertipico). Actualmente, el mapeo de mutaciones se basa en metodos moleculares, sobretodo en la secuenciacion de acidos nucleicos. EI analisis posterior de las secuencias seguida de experirnentacion ha revolucionado la forma en que identificarnos los genes virales y las mutaciones, Par ello 10 trataremos con algun detalle en Ia siguiente seccion. JY1_Secuenciaci6n de Dl'fA

Determinar la secuencia de un virus tiene varias ventajas. Actualmente existen programas de computacion que perrniten analizar la secuencia y extraer informacion relevante. Por ejemplo, es posible una inmediata aproxirnacion al numero total de genes virales. Al leer una secuencia estos programas pueden detectar un marco de lectura abierto u ORP (Open Reading Frame) que, si no son interrumpidos por sefiales de terminacion, sugieren la presencia de secuencias codificantes (genes), Incluso ORFs cortos que pueden solapar otras secuencias codificantes pueden codificar proteinas, particularmente por via del splicing del RNA. El virus del SIDA (HIV -1, RNA, Retroviridaey es un claro ejernplo de un virus que haec uso extensivo del solapamiento de ORFs cortos. Una vez detectados los ORFs (potenciales genes"), se puede tener idea de la funcion de la proteina codificada usando otros programas que cornparan la secuencia de la proteina viral can otras proteinas (virales y no virales) de secuencia similar y funcion conocida. Por ejemplo, un analisis semejante del genom a del virus vaccinia (DNA, Poxviridae) detecto un ORF similar aI utilizado por factores de crecirniento celulares. La prediccion era que el virus codifica para un factor de crecimiento, 10 cual fue posteriorrnente corroborado. El analisis de la secuencia predecida de la proteina puede revelar otros rasgos irnportantes. Por ejemplo, las glicoproteinas de membrana pose en una serie de sefiales caracteristicas. S1 estamos tratando can un virus envuelto, cualquier secuencia con esas caracteristicas es candidata a perteneccr a una glicoproteina de la envoltura. De la rnisma rnanera, es posible detectar seriales tipicas de prornotores, seiialcs de splicing, sefiales de poliadenilacion, etc, ya que las mismas han sido conservadas a 10 largo de Ja evolucion del universe eucariota4, A pesar que tales anal isis de secuencia tiencn gran valor predictive, no dejan de SCI' justamente predicciones. E1 virologo sabe que luego del analisis le sigue Ia experirnentacion, esto es, dernostrar que un gen hipotetico es un gen real, que la
3 4

Los llamaremos potenciales hasta que experimental mente constatemos que codifican una proteina Como los virus animales han coevolucionado con sus huespedes, no es de extrafiar que conserven los mecanismos basicos utilizados para la expresion de sus genes,

59

secuencia

asignada como gen, realrnente

termina expresada

en forma de una proteina

con
SOil

una secuencia de aminoacidos

acorde a los codones del ORF. En este senti do

fundamentales los mapeos de transcriptos, 0 sea, mRNAs, para interpretar los datos del analisis de secuencias, Tenicas como In extension del primer 0 mapeo S- I brindan datos acerca del cornienzo del transcripto y la estructura de ex ones e intrones del gen. Los rnetodos de traduccion in vitro pueden usarse para mapear proteinas presentes en las celulas infectadas a regiones especificas del gcnorna viral. La determinacion final de la funcion de un gen y de su regulacion solo es posible mediante uno 0 varies rnetodos, algunos de los cuales se describen a continuacion.

La cornplementacion se refiere a 1£1 interaccion de productos genicos virales en celulas co-infectadas que resulta en la produccion favorecida de uno 0 ambos mutantes parentales al tiempo que sus genotipos permanecen inalterados. Esta definicion refleja e1 heche de que uno 0 los dos virus mutantes proveen una proteina que le falta al otro, perrnitiendo que uno 0 ambos virus se repliquen en la celula. Si los dos virus son defectuosos en la rnisma proteina, ninguno va a poder complementar al otro. De esta manera, el ensayo de complementacion puede usarse para reunir mutantes virales en grupos funcionales 0 grupos de complementacion. Si dos mutantes no se complernentan decirnos que tienen el defecto en el rnismo gen. En teoria, pueden haber tantos grupos de cornplernentacion como genes tiene el virus, pero como muchas mutaciones son letales y algunos genes no son esenciales, siempre se obtienen monos grupos que genes. La forma mas facil de realizar el ensayo de complementacion es con mutantes ts, Supongamos que tenemos dos rnutantes, Is I Y IS2. Infectamos algunas celulas con Is}, otras can tS2, Y un tercer grupo con ambos mutantes a la vez, Se incuban las celulas infectadas a la temperatura no permisiva y despues de un tiempo se determina Iaproduccion de virus en los tres casos a la temperatura permisiva. Con los tres valores se calcula un indice de complementacion, como se muestra a continuacion: Jitulo en lajrrfecciol.l.IuiK!_a_IC titulo can Is r+ titulo con IS2 En teoria, cualquier valor mayor que 1 indica complementacion, pero generalmente se usa el valor 2 como limite para corregir el efccto de otros factores. Se observan dos tipos de complernentacion, La mas tipica es la denominada complernentacion no alelica 0 intergenica en la cual mutantes en dos genes diferentes se asisten mutuarnente para replicarse. La complementacion no alelica ha sido IUUY uti! en la cacarterizacion de genes en virus ani males. La complementacion alelica 0 intragenica, mucho menos frecuente, ocurre cuando el producto genico (proteina) defectuoso en ambos rnutantes es una proteina multimerica, y cada rnutante tiene defectos en distintos dorninios de la misma proteina.

60

el virologo que de sea caracterizar los genes de un virus empieza is, par ejemplo, utilizando un mutageno en el media de cultivo. Luego de seleccionar los rnutantes de acuerdo a su cornportamiento frente a los cam bios de temperatura, realiza ensayos de complementacion tal cual 10 describimos. y termina con sus mutantes encasillados en grupos de cornplernentacion. Un resultado tipico sc muestra en Ia figura 18, Estes ensayos son extremadarnente utiles en virus en los cuales no hay recombinacion, como en los togavirus, rhabdovirus y paramyxovirus (RNA),

En conclusion,

por inducir mutaciones

De acuerdo a 10 visto en II-B, Ia cornplementacion es un fenorneno que ocurre durante el pasaje de los virus en cultivo de celulas. Las particulas DI se mantienen en la poblacion por complcmentacion con un virus helper. Otro ejernplo son los retrovirus (RNA, Retroviridaei. Un subgrupo denominado retrovirus agudos suelen po seer deleciones que los vuelven defectuosos. Para propagar estos virus se requiere de un virus relacionado pero competente para 121 replicacion que "roseate" al defectuoso par complementacion.

Nive! de cornpf€mefllacioll

en irtfecrjones mixtas con 1::;;1 176 '20 30 g 4.2 1.56 20D

ts2

Grupo dH COin"
plementaci6n

Mulanteis21 ts19 1.';17 ts~t 1,24

!s21

ts19
[)2

Isl?
Q,1 0.<1

184

18:24

Is5 27 16

lslO

1s2]

Is20 r1d 12
23

fA

01
O,tJ
ri(j

L5
3,2

43 nd 25
H)

24
Hl !l

no
4:! 1"

455
:393 127 3,,4 280

"

:l,5 ()4

31

"

no
~;g 50 93

zr
1H
43 G~

..

nd 16
nil

Ie ,V
E

2.2 H; 52

s
12 21 5.2 8 16.7

,>;11
(s6

H8

c
C D D
[;

ts-z ts·S IslO 1~!23 (s20

36
345

??
61 0.7

8.5

figur1!.JJL_Complcmentaci6n

entre mutantes

Is

del virus Sinbdis

RC§Eille del maffador:

este metodo es una variante de la complementacion,

pero en vez

de usar do:'> virus mutantes se usa uno solo. Basicamente, se infectan celulas con el mutante y, a continuacion, se introduce en las celulas un fragmento de genorna del virus

salvaje por transfeccion'.

Supongamos que tenernos un virus rnutante pero no sabemos

5 Transfeccion es e! terrnino que alude ala introduccion de acidos nucleicos dentro de las celulas. Para ello se requiere purificar el DNA (e,g. un vector conteniendo un fragmento de DNA viral) para fuego adicionarlo al media de cultivo en forma de coprecipitado con fosfato de calcio (metoda del fosfato de

6l

donde se localiza la rnutacion, Podemos purificar DNA genomico viral 11 partir del virus salvaje y cortarlo en fragmentos con enzimas de restriccion, de tal rnanera que los genes virales quedan ahora repartidos entre distintos fragrnentos de DNA. Infectarnos varias placas de cultivo con el virus rnutante (el cual es defectuoso y por 10 tanto no producira progenie viral) y, a continuacion, transfectarnos cada placa con un fragmento distinto de DNA de! virus salvaje. En aqucllas placas en las wales no detectarnos virus, los fragrnentos salvajes de DNA no han podido suplir el defecto en el mutante. 81 en una placa detectamos produccion de virus, interpretamos que el fragmento de DNA de la cepa salvaje contiene el gen en el cual el mutante es defectuoso. En otras palabras, el fragrnento "rescata" el defecto del mutante y Ie permite replicarse (fig 19). La ventaja del metodo es que permite una asignacion cuasi-inmediata ya que el fragmento que cornplementa al rnutante yet esta clonado y 10 unico que resta es Ia identificacion del gen (e.g. mediante secuenciacion). La estrategia ha tenido y tiene sus utilidades adicionales. Hemos mencionado que existen mutaciones en los virus que son letales, esto es, no son toleradas por el virus. Estos rnutantes son dificiles sino irnposibles de propagar y, por 10 tanto, de exarninar funcionalmente. Una forma de solucionar el

problema es transfectar

establemente celulas con la version normal del gen, de tal forma

la proteina viral. AI infectar estas celulas con el defecto y se obtiene progenie vira]6.

que las celulas expresen constitutivarnente el virus mutante, las celulas complernentan

c__ ;('"",'",i6"
no hay replicaci6n viral

j;d6"

virus rnutante

vector con gen A

virus rnutante

},O

6::~;60
1

....

vector con gen P

COo
transteccion

(:~~~)
..,"----..

... ~.~."~~

reptlcacion

viral

fuJIra 19. Diagrama mostrando un caso hipotetico donde el gen B complementa el defecto del virus mutante,

calclo) 0 en asociacion con liposomas. Un porcentaje de las celulas capture el DNA y 10expresa en su proteina correspondienre. Como el DNA foraneo no se integra a los crornosornas celulares, la expresion es transitoria, alcanzando su pica a [as 48-72 hs. Otros metodos existen para forzarla integracion y perrnitir la expresion prolongada del gen (transfeccion estable), 6 Observese que la lesion genica de! mutante no resulta corregida. La unica razon por la cual puede replicarse es porque las celulas operan como un helper aportando la funcion faltante.

62

de rnutantes por diseno es actual mente el metodo de eleccion para el anal isis de las proteinas de los virus, otros metodos prornisorios estan en desarrollo con el fin de aplicarlos en virus donde no es sencillo obtener mutantes. Uno de tales metodos es la interferencia de genes virales especificos mediante acidos nucleicos. Supongarnos que queremos conocer el efecto de una proteina viral especlfica en 1a fisiologia celular 0 enIa replicacion viral. Se puede sintetizar en el laboratorio moleculas de RNA antisentido', Cuando se introduce el RNA antisentido en celulas infectadas, el mismo se uniria al mRNA por complernentariedad de bases forrnando un duplex de RNA EI mRNA en estado de duplex no puede ser traducido por los ribosornas. La especificidad del RNA antisentido par su mRNA cornplementario garantiza que s610 la proteina de interes va a resultar bloqueada. Al]!!:.nale~Jransgenicos: una forma de analizar Ia funcion de productos virales en el contexte no ya de una celula cultivada, sino del organisrno, es la produccion de animales que expresen una determinada proteina viral. Basicamente, un fragmento conteniendo el gen viral bajo el control de secuencias regulatorias apropiadas, es introducido en oocitos fecundados (general mente de raton) mediante rnicroinyeccion. Los embriones son luego transferidos a hernbras receptoras. Con eierta frecuencia, el gen viral (transgen) es integrado tempranamente en el genorna del embrion y .como consecuencia, va a estar presente en todas 0 algunas celulas del animal. Un ejemplo del uso de estas tecnicas en Virologia fue el analisis del gen para la proteina T (antigeno T grande) del virus SV40 (Simian Virus 40, DNA, Papovaviridaes, un oncogen viral. Se microinyectaron ernbriones con distintos segrnentos del gen T y se correlaciono el fenotipo de los turnores en los animales transgenicos con los distintos dominies de la proteina T. InIs;rf£IenCI£!_~~;JQ~roduc::JQ§_g£rlicos~ aunque la construccion

Los virus son un excelente vehiculo para introducir genes virales (0 celulares) en celulas de mamifero. Dependiendo del virus utilizado como vector, los genes pueden expresarse de manera transitoria 0 estable, Los adenovirus, herpesvirus y retrovirus se utilizan para transferir genes dentro de las celulas, Sin embargo, para convertirlos en verdaderos vectores, estos virus deben modificarse geneticarnentepara atenuar aquellas funciones que los vuelven liticos para las celulas. Los vectores virales se utilizan en dos areas principales: 1) para estudios de inmunologia y construccion de vacunas; 2) para introducir genes celulares can fines terapeuticos (terapia genica). Trataremos can mas detalle este t6pieo al final del curso.

7 En la literatura anglosajona, las dos cadenascornplementarias del DNA se indican como sense (sentido) y antisense (antisentido). La cadena sense es la que tiene la misma secuencia que el mRNA (excepto que las U del RNA estan representadas por Ten el DNA) ; la antisense es la que sirve de templado para la transcripcion Y Sll secuencia es complementaria a la cadena sense y al mRNA Por 10 tanto, un RNA antisense tiene una secuencia complementaria al mRNA e identica a Ia cadena antisense del DNA.

63

Cicio infeccioso de los virus

Los virus requieren celulas intactas para multiplicarse. En este sentido, las envolturas del virion deben visualizarse como un dispositive para: I) proteger al genoma viral durante Ia fase extracelular del virus, 2) garantizar la entrcga del gcnoma viral a la maquinaria biosintetica celular apropiada. Una vez dentro de 121 celula, el virus usurpa esta rnaquinaria para replicar 3U genoma y producir las proteinas del virion. Como consecuencia, la celula, privada de materiales esenciales y expuesta a productos virales potencialrnente toxicos, muere, 211 tiempo que 121 progenie viral es liberada. Este esquema tipico de multiplicacion viral ha sido analizado al detalle en cultivos celulares

infectados.
En la fig. 1 se rnuestran las tres etapas tipicas del crecirniento viral en cultivos celulares. Durante un tiempo luego de la inoculacion con el virus parental 1, solo pequefias cantidades de virus pueden detectarse. Este periodo, denominado fase de eclipse, dura unas horas dependiendo del tipo de virus, y en esc lapso el virus parental se adhicre y penetra las celulas, Luego le sigue un intervalo en eI cual la progenie viral comienza a acumularse exponencialmente en las celulas 0 fuera de ellas. Es la/ase de maduracion y liberacion. A medida que la cantidad de virus de progenie aumenta, las celulas comienzan a rnorir y, con ello, decrece la produccion viral ifase de decaimiento). EI ciclo descripto describe el comportamiento de virus liticos (e.g que inducen Ia muerte celular) durante una infeccion productiva, esto es, que resulta en la produccion y liberacion de progenie. La cantidad de virus producido varia con el tipo de virus pero puede oscilar entre 20.000 y 100,000 particulas por celula infectada,
100
r;

fase de eclipse
"'~""""""~

_,~

:Q
u
0 :l

u
0 '-

2 .;;

III

10

fase de decaimiento

ill D_u -m v (5

m_

+--'

";? 0

0.1

fase de maduracion y liberacion

0.01

.~---.tlempo

Figura 1. Ciclo infective de los virus en cultivos celulares

En oposicion al virus de la progenie, producto de la multiplicacion en el cultivo.

64

No todos los virus son liticos ni todas las infecciones son productivas, 10 cual sugiere que la modalidad del ciclo infectivo cs variable. Es mils, algunos virus resultan liticos para algunos tipos celulares y no liticos en otros. El tipo 0 tipos celulares infectados por un virus se conoce como rango de huesped': Existen virus con ranges de huesped amplios, mientras que otros solo pueden infectar un tipo celular (0 especie animal). La capacidad de un tipo celular (0 especie animal) de ser infectado por un virus viene espccificado por el termino susceptibilidad. ASl, podemos decir que las celulas epiteliales son susceptibles al virus influenza A, 0 que el raton no es susceptible al herpesvirus bovine. Que un tipo celular sea susceptible a un virus no implica necesariamente que produzca y libere progenie viral. La capacidad de un tipo celular de garantizar la multiplicacion completa del virus se indica con cl termino permisividad. La infeccion de celulas susceptibles puedc ser productiva, abortiva, restrictiva 0 laterite. La infeq:iQrU[Qguctiv9: ocurre en celulas permisivas. Aunque In celula sea susceptible puede no ser permisiva para el virus: el virus puede entrar en in celula pero ningun gen 0 solo unos pocos genes virales pueden expresarse. En este caso estamos frente a una infccci6n~(lboliivJ.l. En otros casos, las celulas pueden scr pennisivas transitoriamentc y las consecuencias son que el virus perrnanece en las celulas hasta que las mismas se vuelvan perrnisivas, 0 bien solo una fraccion de las celulas de la poblacion producen virus en un momenta determinado. Este tipo de infeccion se conoce como restrictiva. En la infeccipll latent~, el genom a viral persiste pero no existen particulas virales dentro de la celula. En algunos casos de persistencia viral, los genes virales interfiercn con las funciones cclulares que controlan el crecimiento resultando en la transformacion celular, No solo la celula no se muere como producto de la infeccion sino que la misma se rnultiplica descontroladamente. La cadena de eventos que ocurren desde que un virus toma contacto con una celula, hasta Ia progenie viral la abandona, se denomina ciclo irfeccioso celular y, para su estudio, se ha dividido en las siguientes fases: Las proteinas de capside 0 envoltura cstablecen su primer .interaccion con una molecula celular,

1. Adhesion/Anclaje:

del

VIruS

Tambien se usa el terrnino para indicar la especie

especies animates infectadas por el virus.

65

2. Entrada: Componentes citoplasmatica. 3. Denudamiento:

del virion cruzan la barrera de la membrana

Liberacion

del acido nucleico en el sitio de replicacion

4. Replicacion: Produccion de nuevas proteinas y acidos nucleicos virales para format nuevas viriones 5. Ensamble componentes
0

ensamblaje: Reunion y ordenamiento de todos los virales ncosintctizados para Ia formacion de nuevas viriones de algunos componentes del virion para que

6. Maduracion: Reorganizacion se convierta en infective 7. Egrcso/SaHda: Adhesion Receptor. Liberacion

de los nuevas viriones a1 espacio extracelular

Molecula a la que el virus se une para ingresar a una celula.

Para algunos virus el receptor es la {mica rnolecula con la que necesita interactuar para entrar en la celula. Para otros, solo la union al receptor no es suficiente para desencadenar el ingreso, en estos casas requieren la interaccion con otras rnoleculas de la superficie celular, a las cuales se las denornina

Correceptores. La susceptibilidad de una celula a fa infeccion depende de la disponibilidad de receptores ();correceptores) en fa superficie celular. Las celulas de polIo
no son susccptibles a la infeccion con el virus de la polio (RNA, Picornaviridae) porque no poseen reccptores para el virus" Pero si se inyecta el genoma viral dentro de estas celulas, se produce progenie viral en gran cantidad. Por 10 tanto, las celulas de pollo son permisivas a la infeccion, Evolutivamente los virus parecen haber seleccionado como receptores moleculas que son muy abundantes en las celulas del hucsped (incluyendo las permisivas y las no perrnisivas) 0 aquellas que solo estdn presentes en determinado tipo celular (a pesar de que otros tipos celulares puedan ser perrnisivos), Por ejemplo, el virus de influenza utiliza como receptor una molecula de acido sialico Ia cual esta ampliarnente distribuida por el organismo, sin embargo no todas las celulas del cuerpo son permisivas, en este caso cl tropismo esta determinado por factores intracelulares. En las cepas altamente patogenas de influenza aviar, uno de los principales factores
66

implicados en 10.patogcnia, es la capacidad de estas cepas de aumentar su tropisrno, e infectar productivamente organos que cornunmente no son afectados par las cepas de baja patogenicidad, que s610 tienen tropismo respiratorio y digestive. En otros casas, como el Virus de Hepatitis B (HBV) o ~. r •.... /l'ln r, lOS • 1 ios \r· rrus d e I· c mmunoc d eticrencra. 1·v· Humana (,.ny v ) y r euna \1' 1 V), 1 receptores t-U solo estan presentes en un determinado tipo celular (hepatocitos y celulas de sistema inmune respectivamente) 10 cual no irnplica que sean las {micas celulas perrnisivas. Vemos entonces que el tropismo de un viruspor determinado tejido no es
r-; -r-t .

solamente causa de fa presencia celular.

ausencia de receptores en fa membrana

Debido a que los reccptores son moleculas con variada funcion celular, la union a ellas no solo permite la entrada del virus sino que, en rnuchos casas,

desencadena

una cascada

de sefiales citoplasmaticas

que favorecen

la

infeccion. La interaccion virus-receptor,

puede ser de tres tipos: A. Receptor simple: un solo receptor es el mayor responsable del ingreso a la celula, Es e1 caso del receptor Pvr de Poliovirus, y el acido sialico

para Influenza (Fig 2)

H HC)'~C'--

Receptor celuler de,lnfluerraaAy

Figl1ra 2. Estructura del Acido Sialico. Molecula utilizada como receptor por el virus Influenza

67

B, Co-receptor: hay un receptor principal pero se requiere de otra molecula para asegurar la entrada. En HIV la proteina gp 120 se une al receptor CD4 en todas la celulas que infects. Pero aquellas cepas que infectan macrofagos requieren de ia interaccion con Ccr5 para poder ingresar al citoplasma. Las cepas que infecran linfocitos T utilizan tambien gp120 como receptor pero un correceptor distinto (CXCr4),. (ver fig.J)

H!V (X1)

((.(h~m()kinc

HiV (RS)

receptot (CXCr4)

!)·chcmckine receptor (eerS)

.EigunL3~. Receptores

y Correceptores

utilizados

por distintas variantes

de IIIV

C. Receptores alternativos: Un virus puc de utilizar mas de un receptor en el animal 0 en diferentcs especies anirnales. Ei virus rabico se une al receptor de Ia acetilcolina en la placa neuromuscular, pero tam bien utiliza las NCAM (Neural Cell Adhesion Molecule) para ganar acceso al SNC. Tambien es posible que algunos virus que poseen baja afinidad por un
receptor que no es el habitualmente utilizado, muten sus proteinas de
0

superficie hasta alcanzar una afinidad igual

mayor a la que ternan por

su receptor original. Esto puede lograrse en el laboratorio infectando celulas que normalmente no son susceptibles luego de varios pasajes

ciegos 0 rnuchas veces es 10 que ocurre cuando los virus "sultan de especie" e infectan huespedes que no eran susceptibles con anterioridad,

68

Los virus tambien pueden ingresar a celulas que no posean rcceptorcs especificos mediante dos procesos: par fusion de cclulas sanas can celulas infectadas y por medio de la formacion de complejos antlgeno-anticuerpo que luego son fagocitados por celulas permisivas.I vel' fig. 4)

Coops: :tlvidad La densidad y destribucion es un factor a considerar de Rs

Fusion

eel. infectada

eel, no susceptible

esta

€IS

una form,;;!

de infecdon inde).l$n. aiente de) R

Entrada mediada per Anticuetpas

ADEV: antibody-dependent enhancent virus infection

Dengue FMDV ESV

en celulas epi:teiiar~s

Fig._~1.Vias de entrada alternativas, ADEV (entrada mediada por anticuerpos) FMDV (Virus de Fiebre Aftosa) EBV ( Virus Epstein Barr)

Entrada

En algunos casos la entrada y el denudamiento pueden estudiarse como eventos diferentes, pero en otros, puede considerarse que ocurren en sirnultaneo, Es ampliamente aceptado que la membrana plasmatica no es permeable a particulas del tarnafio de los virus, sin embargo los virus deb en atravesarla sin producir dafio en Ia misma, y de esta forma, mantener la intcgridad celular. Para esto, utilizan mecanismos de transporte que la celula normalmente utiliza para incorporar grandcs moleculas.

69

La celula posee mecanismos inespecificos (fagocitosis, pinocitosis) y especificos (endocitosis rnediada por receptor) para ingresar particulas al citoplasma. Todos procesos no son pasivos sino que requieren un gasto de eneraia involucran orocesos F1cl'r,J/YJ!f"(\Q d· celula como endocitosis, tc>" .. fusion de membranas, transporte al DUel eo} etc. La mayoria de los virus ingresan en las celulas por mecanismos especificos, especialmente endocitosis mediada por receptor.
\:...4.-' ~J. . .l.,6,l1·&.A.

p "'"!

'/;'~1,_

.,.. ..1

_v!-_L

..... -'I-~J.

"...J"

'~t

•.l"--',,,;r

.iI-.

I,,,"

"--';<-,.

b~·",",,"_'_T"-,~

,""""

t»

ViI'us Envueltos Todos los virus envueltos debenfusionar su envoltura con alguna membrana celular para poder ingresar a la celula. En algunos casos la fusion ocurre a nivel de la membrana citoplasmatica (fig, 5a y b) y en otros puede ocurrir a nivel endosomal 0 Iisosomal (fig. 5c). Pero la fusion de membranas no es un proceso que ocurre al azar. Ocurre todo el tiempo dentro de las celulas 0 incluso entre celulas y por 10 tanto esta finamente regulado. De otro modo las celulas constantemente se fusionarian entre sl, las organelas celulares se fusionarfan y la celula seria un caos. Incluso los virus envueltos se fusionarian entre si y perderian infectividad. Todas las membranas (celulares y envolturas virales) contienen protein as integrates que pueden interactuar can proteinas de otras mernbranas. Alguna de estas proteinas portan 10 que se conoce como peptide de fusion, una porcion hidrofobica capaz de anclarse a otra membrana y permitir el acercamiento estrecho de las misrnas. EI peptide de fusion no esta siempre expuesto y listo para ejercer su funcion, sino que se eneuentra oculto 0 enmascarado dentro de la proteina hasta que algun estimulo especifico (cambio de PH, accion enzimatica, interaccion con otras proteinas) produzca un carnbio conformacional y 10 exponga. Muchas de las reacciones de fusion de membrana que oeurren normalmente dentro de Ia celula, fueron esclarecidas a partir de estudios con proteinas de fusion virales. En algunos casos el peptido de fusion puede estar en la misma proteina que el

virus utiliza para su anclaje yen otros estar en una proteina distinta (tambien de envoltura), veremos ejemplos de estas variantes a continuacion.

70

Figura 5. Diferentes

mecanismos

de entrada a la celula.

y fusion separadas: El ejemplo mas estudiado de medicina veterinaria son los Pararnixoviridae (Distemper, Newcastle). La proteina HN es la encargada de proveer el anclaje a Ia celula y la proteina F es la portadora del peptide de fusion. Como puede verse en la Fig. 6a, F tiene dos subunidades Fly F2. El peptide de fusion se encuentra en el extrema de la porcion Fl oculto par 1a porcion F2, Para algunos paramixovirus, la sola interaccion de lIN con su receptor parece ser suficiente para provocar un cambio conformacional de F de modo que el peptide de fusion puede insertarse en la membrana celular, En otros paramixovirus, esta comprobada la necesidad de una segunda proteina celular que interactua con F y es responsable del reordenamiento proteico que conlleva a la fusion, Este proceso ocurre siempre a PI! neutro por 10 tanto debe estar muy bien regulado para que oeurra en ticrnpo y lugar correcto.

+ Proteinas de anclaje

71

R(~t~!ptb"r

Co·r,k~{(n~"r('Cit·2:i

-~~~~
bhd,i~.g

dnn[cr.

---------,..,
CD4

Eiill!Xa6, Mecanisrnos

de fusion a nivel de membrana citoplasmatica .

• Una unica proteins como mediadora de anclaje y fusion: un ejemplo de virus que utilizan esta estrategia es el de los Retroviridae, (fig. 6b) La glicoprotcina Env esta formada par 2 subunidades, SU y TM (portadora del peptide fusion). Reconoce su receptor a traves de SU yen ese momento se produce un desplazamiento de las subunidad TM que permite acercar el peptide de fusion a la membrana celular. Este modeIo se aplica, por ejemplo, al Virus del sarcoma y Iuecosis aviar (AS LV s) mientras que los virus FIV y IIIV necesitan que la SU interactue, ademas, con un correceptor (CCR) para que se produzcan los carnbios en la 'TM.

Entrada par via endociti.~1l: Otros virus envueltos entran por endocitosis mediada por receptor y por 10 tanto deben traspasar, en este case, la membrana endosomal para ingresar al

citoplasma (fig. 5c). El caso mas ampliamente virus Influenza.

72

estudiado y que tomaremos como ejemplo es el del

Este virus interactua con su receptor (Acido Sialico) pm medio de S11 principal glicoproteina de envoltura, la hemoaglutinina (HA) (fig, 7)~ Esta proteina fue una de las primeras proteina de fusion descubiertas y pm ende fue estudiada en detalle. La IIA se encuentra en la envoltura del virus formando un homotrirnero (tres protein as identicas), en el cual cada monornero presenta dos subunidades (IIA 1 y HA2) unidas por un puente disulfuro. HA 1 forma una cabeza globular y conticne el sitio de reconocimiento para el receptor, es la porcion geneticamentc mas variable de la proteina y sus mutaciones son las responsables de las variantes antigcnicas que afio tras afio escapan a la

inmunidad adquirida par la poblacion. I-IA2 tiene forma fibrilar, uno de sus extremes contiene una porcion de trasmembrana responsable de la union a la envoltura y el otro contiene el peptide de fusion en una region que se encuentra oculta por HA I cuando el virus se encuentra fuera de la celula.

"Pi)(:k01"

par$!

Ell reCf.ij:;ilor

SiUo de reeonocJm ie n to, deEreceptor

HA1

trirnero de HA <_,;.._"

Fiu. Estructura de Ia proteina HA de Influenza.

73

Cuando HA 1 toma contacto con el receptor se produce una cascada de sefializacion intracelular que descncadena la endocitosis (fig. 8). Una vez forma rl,-~ el v "'nAA,,'Af.,...F_l (,1 rni 0rnn S{~ acidifies t.... -"-*.~"J"''''_ nnr imnortacion de iones 1...... v f-l+ .) '!':t ~ este cambio de PI-I produce un cambio conforrnacional de Ia HA dejando expuesto el peptide de fusion 10 que dcsencadena la entrada de las Rihonucleoproteinas virales (vRNPs) al citoplasma. En este caso se produce en sirnultaneo el denudamiento que tarnbien es depcndicnte de PIt La envoltura viral contiene una proteina M2 que es un canal de iones (el mas pequeiio descripto hasta el momento) por 10 tanto a medida que se acidifica el endosoma tambien 10 haec el interior del virion y como consecuencia las vRNPs se disocian de la proteina de matriz Ml quedando libres para poder ingresar al nucleo.
.\'}.111 UV ! l\"'l1l..Ji.J"'~_1_lt...-iL;
,."..,1.. 1.1.

,-~~:r.."."'J

\'..r

1;.,

"""'1..

""__'0'<-

"<..-';!;.

_±_

""-c...-c. ...... ~ ..... ,'_.._"

_"'-.'' '

~,~~

EiEura 8. Mecanisme

de fusion de virus Influenza

Virus No Envueltos Los virus carentes de envoltura deben traspasar las membranas celulares sin la posibilidad de utilizar un proceso de fusion. Deben romper estas barreras sin eomprometer la integridad de la celula de la cual depende para su posterior replicacion. Se reconocen entonces dos mecanisrnos principales para sortear este obstaculo, producir pequehos paras en las membranas 0 desintegrar
74

algun componente membranoso que no sea vital para la celula (p.e. el

endosoma). Para graficar estos mecanismos presentaremos algunos ejemplos.

L\.liQWf<J_Qc; lamembrzma endoso1}J§l Un caso bien estudiado de virus que

utilizan esta estrategia es el de los Adenoviridae. Recordemos que Ia capside de los mismos se caracterizan POf po seer proteinas que protuyen de Iamisrna en forma de fibras (protein a IV) (ver fig" 9), El extrerno de dichas fibras es el encargado del reconocimicnto del receptor, mientras que la parte basal se cncuentra anclada a un pentamero de una segunda proteina que recibe el nombre de "base pentarnerica" (proteina Hl). Esta ultima es responsable del reconocimiento del correceptor, evento indispensable para desencadenar la endocitosis del complejo, Una vez dentro del endosorna, Y como consecuencia del descenso de PlI, Ia capside se disgrega parcial mente y alguna/s proteina/s que se desprenden (aparentemente la HI) tedrian unafunci6n Utica de membrana activada por acido. De esta forma el endosoma picrde su integridad yes resto del virion gana el acceso al citoplasma.

Figura 10, Mecanisme de entrada utilizado por Picornaviridae

Blodi'l); to lwde~r ~6r'" 'ompt~x .. ..

Figura ~" Entrada de Adenovirus

75

Poro eJ1JalTIe'!pbrall~Lrl~li£rrli_ltLQ;_l:: Otros virus desnudos como es el caso de los i;j~~~;aviridae (virus de Poliornelitis y Fiebre Aftosa) utilizan este tipo de estrategias un poco mas "conscrvadoras"(fig, 10)" La interaccion de la proteina VP 1 con el receptor altera la estructura del virion exponicndo regiones de la capside que hasta entonces se encontraban ocultas. Se pierde 121 VP4 que es una protein a de capside interna con funciones de estabilizacion y quedan expuestas regiones de VPI que son altamonte hidrofobicas y tienen capacidad de insertarse en la membrana. De esta manera se forma un poro por el cual puede ingresar el vARN unido solo a la proteina VPg. Como puedc deducirse en este caso tambien entrada y denudamiento son simultaneos. Para el caso de Poliovirus esta reorganizacion de la capside parece ser independiente de PII y por 10 tanto puede llevarse a cabo a nivel de la membrana citoplasmatica sin neccsidad de endocitosis, Sin embargo, para el Virus de Fiebre Aftosa, los cambios estructurales de VPl solo se producirian a PH acido una vez dentro del endosorna.

D_~nunQarQiel1Joa nivel dellisosQn:13: Como vimos en ejernplos anteriores, muchos virus entran a la celula utilizando Ia via endocitica, y la mayoria abandonan la misma antes de llegar al
compartimento lisosomal. Esto es logico ya que los lisosomas portan proteasas y nucleasas que degradarian el material viral. Contrariamente, otros, como los Reovirus (p.e. Virus de Lengua Azul) toman provecho de estas enzimas lisosomales. Este virus se caracteriza por tener una doble capside muy resistente y por 10 tanto tarnbien bastante dificil de desacoplar. La capside es atacada parcial mente por proteasas lisosornales, quedando entonces expuestas regiones que antes no 10 estaban (fig. 11). Las proteinas que rcsisten la accion del lisosoma protegen al ARN de la accion de las nucleasas y junto con el rnismo conforman 10 que se conoce como "particula subviral infecciosa" (ISVP), que por mecanismos aun no aclarados es capaz de atravesar la membrana del lisosoma, Experimentos realizados con particulas subvirales aisladas demuestran que las mismas son eapaces de permeabilizar membranas y perrnitir e1 paso de distintas toxinas 0 incluso traspasar directamente la membrana citoplasmatica y ser infectivas (aunque este no es su mecanisme natural de infeccion),

76

Virlon

Figura 11. Entrada de reovirus a nivel del Iisosoma.

Tnmsporte hada ei nucleo

Para aquellos virus de replicacion citoplasmatica homos visto como acceden directamente al Iugar indicado sin necesidad de pasos adicionales, La mayoria de los virus ADN y algunos ARN como Retrovirus e Influenza requieren ademas que sus acidos nucleicos ingresen al nucleo para 3U replicacion, comportandosc 1£1 membrana nuclear como una nueva barrera semipermeable que cruzar.

77

Para cumplir este objetivo pueden sencillarnente esperar que Ia membrana nuclear se disgrcgue como ocurre durante el proceso de mitosis de la celula (FLC, Oncorctrovirus). Como consecuencia de elJo, esto virus solo podran replicar en celulas en division, Pero la mayoria de estos virus que deben Ilegar al nucleo utilizan un mecanisme mucho mas especifico que; una vez mas, es propio de la fisiclogia de la celula. Recordemos que 121 estructura de 121 membrana nuclear esta conformada por una doble bicapa Iipidica interrumpida por pores, los cuales permiten el paso selective de determinadas macromoleculas hacia un lado U otro de Ia membrana mediante mecanismos finamente regulados. Todas las proteinas celulares son sintetizadas en el citoplasma pero algunas cumplen 3U funcion en el nucleo (p.e DNA polimerasa) y por 10 tanto deben ser importadas dentro del mismo. Para ello estas proteinas portan "sefiales de localizacion nuclear'{Nl.S), regiones de aprox. 20 aminoacidos de carga basica, que van a ser reconocidas por alms proteinas (Himportinas") encargadas de transportarlas dentro del nucleo. (ver Fig. 12)
Nuclear protein

Cytosol
Nuclear envelope

f~f' iGLNLS //~'~~ CD---+

Figura 12:. Entrada al nucleo. Complejo del poro nuclear.

78

Muchos virus tienen entre sus proteinas (p.e, NP de Influenza), motives que irnitan a las NLSs y que permanecen unidas al acido nucleico u a otras proteinas vii-ales que deben ingresar al nucleo. De esta forma la irnportinas celulares ingresan esta proteina (y todo 10 que permarlezea unido a ella) al nucleo. Otros retrovirus, los Lentivirus, no requieren celulas en division sino que tambien poseen proteinas estructurales can NLSs (en este caso la integrasai Tarnbien hay virus que tienen un mecanisme propio, independiente de los celulares, para colonizar el nucleo. El ejemplo tipico es el de los Adenovirus en los cuales alguna protein a de capside tiene afinidad por proteinas que conforman el poro nuclear, se unen al rnismo y el genoma es "inoculado" en el interior del nucleo. (ver Fig, 9)

Replicacion
Cualquiera sea el virus que se trate, todos deben ser capaces de ofrecer sus mRNAs al aparato de traduccion celular. Recordando la variabilidad genornica viral, tenemos que tener en cuenta que I) las celulas carecen de las enzimas para producir tnRNA a partir de RNA; por 10 tanto, los virus RNA deben poseer alguna estrategia para suplir el deficit, 2) las celulas no pueden replicar DNA en el citoplasma. Por 10 tanto, solo los virus DNA que replican en el nucleo (y la rnayoria 10 hacen) pueden aprovechar la maquinaria celular para generar mRNA. 3) el aparato celular de traduccion solo es capaz de operar can transcriptos monocistronicos ya que no reconoce sitios internes de iniciacion de la traduccion. Por 10 tanto, los virus deben sintetizar un mRNA individual para cada proteina. De 10 contrario, como ocurre en muchos virus RNA, se sintetiza un solo mRNA que sirve para la sintesis de una poliproteina la cual es luego clivada para generar las protein as virales individuales. 4) las celulas tienen sus propios mRNAs. En 13 infeccion los virus deb en imponer sus propios mRNAs ya sea otorgandoles una ventaja competitiva 0 selectivamente bloqueando los mRNAs celulares, positiva (+) y de polaridad negativa (/ Los genomas de polaridad (+), una vez dentro de fa celula, operan directamente como mRNA, esto es, $'e unen a los ribosomas y son traducidos a proteina. Los de polaridad (-) no pueden ser leidos directamentepor 10,), ribosomas y deben ser primero copiados a mRNA. Un corolario de esta diferencia es que, cuando se introduce el genoma purificado de un virus RNA (+) en celulas, el mismo es infeccioso, generando progenie
79

Los virus RNA pueden ser de dos tipos: depolaridad

viral Por el contrario, siguiendo el mismo procedimiento, los gtmomas de virus RNA (-) no son infecciosos. Esto sucede porque las enzimas necesarias para transformar RNA (-) en (+) se encuentran en el virion y son excluidas

cuando se introduce el genom a purificado.

A continuacion, describircmos las principales estrategias replicativas de los virus, basandonos para ello en la clasificacion de Baltimore, 10 cual permitira

un estudio

nH1S

ordenado.

El fundarnento de la clasificacion de Baltimore se basa en como los virus gene ran su mARN, POl' 10 tanto recordando a que grupo pertenece cad a virus se podria tener una idea de como sera su replicacion.

Clasificacion de Baltimore
Grupo I: Virus ADN Grupo II: Virus ADN Grupo III: Virus ARN Grupo IV: Virus ARN doble cadena simple cadena

de doble cadena de polaridad (+) Grupo V: Virus ARN de polaridad (-) y de doble sentido Grupo VI: Retrovirus
ss D<hJA

GRUPO U/ims

~nNi\M
fBt((wirUs

mRNA
(+

GRUPOIU GRUPO nl
GRUPOV

(h; PN!\
V1ru.~

h)

80

Cuando estos virus se desnudan, el genoma es directarnente traducido a proteina en los ribosomas, 0 sea que el primer pa;?9 en J?Lre.Rngacit)lL~S la IRADU(~i=l(~N O:i&JJ__El producto de la traduccion es siernpre I (una) t proteina, ya que el aparato de traduccion celular, como ya rnencionaramos, solo produce una proteina de un mensajero (rnonosistronico). Picornavirus y Flavivirus: En estas flias, en realidad, 10 que se traduce directamente del mRNA es una J19.li.Rro~eina.que es luego clivada en proteinas individuales. Para el aparato de traduccion es una sola proteina ya que solo tiene un codon de inicio y uno de stop y por 10 tanto se traduce de corrido. Pero, pOf autoclivaje, la misma genera fragmentos cada uno con funcionalidad distinta (enzirnas, capside) (Fig. 14) EI RNA es, ademas, utilizado como ternpl ado para la sintesis de RNA (-) complementario, pm accion de la polimerasa viral, lIDO de los productos de clivaje de fa poliprotefna. EI RNA (__ sirvc a 8U vez de templado para generar ) copias de RNA (+) (RNA genomico), El RNA (+) se usa: 1) para sintetizar mas pol iproteina, 2) de templado para producir mas RNA (-), 3) como genoma viral para 511 encapsidacion (Fig. 15)
cadena (+) RNA parental ~ .. .. _~ ~~ stntesis de poliproteina cliveje cadena (+) RNA parental proteinas no estructuralss del extremo 5'del genama __.~,-~
.... ---."" - ....

.----~--.//

cadena H de RNA

cadena H de RNA

-:!ff------N'~._",._.._.~-___.--

~~'<?'

__ ~_o~·o_

.......... cadena (+) de RNA

cadena (+) de RNA

cadena (+) de RNA progenie

~ --~w ~
0

proteinas codificadas en el extrema 3'de! RNA gen6mica

e_~e~

progenie

'-----

progenie

Figura U__ . Diagrama de la replicacion de virus HNA (+), Ala izquierda se

rnuestra el caso de los virus RNA (+) que codifican un unico mH.NA de tamafio genomico. A la derecha se muestra la replicacion de aquellos que

codifican para un mRNA de tamafio genomico y, ademas, uno subgenornicos.

mas mRNAs

8]

Eig_. L1,. Mapa genetico y clivaje de la poliproteina de Picornaviridae.

r.;~"'·--""'_,;Iioi···i§IIi'''''''-''''''"",;.o·

';/i rkn~;;_r;.~I:!~:r~~if:· ; ~:,\i~i

jIII.. ..........

_.a;~rzP·

,:-1'

Figura 15. Replicacion <lei genoma de Picornaviridae

H;--

Wsav;_ .. "'

r=z ...
Nm~ gNIDfI'<').z'll))1W PiI,JA

82

Togavirus, cornnavirus y calicivirus usan una estrategia distinta. El genom a de estos virus en realidad mRNA polisistronico, 0 sea, contiene varios codones de inicio can sus respectivos stops. Es decir, contiene varios marcos abiertos de lectura (ORtiS). Al denudarse las particulas, solo ei codon de inicio mas cercano al extreme 5', podra ser reconocido como tal y por cnde ser traducido. 1__ productos de este 03 primer round de sintesis copian (transcriben) el RNA genornico en un RNA (-) el cual sirve de ternplado para formar dos tipos de moleculas RNA (+): a) mRNAs de largo subgenornico que codifica para los genes no traducidos en e1 primer round de sintesis, nuevamente, cada uno utilizado como mRNA monosistronico b) RNA (+) de largo genomico que es empaquctado en viriones (Fig 13 y 16). En el caso de los Togavirus, solo contienen 2 ORFs pero los Coronavirus, por ejemplo, contienen varios mas. (fig. 17) Este tipo de estrategia permitiria al virus una produccion mas secuencial de los distintos tipos de proteinas, retrasando, por ejemplo, la sintesis de proteinas de capside 0 envoltura (reconocidas por el sistema inrnune) hasta tanto haya garantizado la replicacion del genoma.

Figura~J6. Replicacion de Togavirus

3'

H!-2 [

6'

5~C:';'1P ~

~fG:

.'

L~,~;~yrr=5%.',lIkji

1 2 )~~

..., , -"

}\lu~

83

Gerroma

.;~-':

i'\i

. ',. ~-,~., ,,: c:'::~.:';.~~"A~A,fi .;W , ,

(~t;u:'g~n::j'j'· i~~illnr:Jf

t
(if:;)'#'i~iflt~,X- -{~ft4t "

2 Virus RNA (-), Cla.)'ev~ Los virus RNA (-) poseen genomasRNA de simple cadena, monopartito (una sola molecula) 0 segmentado (mas de una molecula), Cuando un virus RNA () penetra en Ia celula, debe transcribirse para generar RNAs (+), Como adelantabamos, las celulas carecen de enzimas para copiar RNA a partir de RNA, Por 10 tanto, la enzima viene incorporada en el virion como una proteina estructural mas (RNA pol RNA dependiente). EL[.1rimerpaso en la
84

[c;J21i(~f£ciQn~ estQ_§__yjrus @__lI9.nS_f:rjJ?_giQn11l~~li<!_9"aJ2QLun_~ten:{in:t9~iral. La d es

transcripcion genera varios mRNAs (subgenornicos) que son traducidos. Tambicn se forman cadenas (+) de longitud genomica que sirvcn de ternplados para generar nuevas RNAs (-) . (Fig] 8)
enzim as del virion

cadena (-) RNA parental segmentado

-~------~

(+) mRNAs

proteinas

segmentos de RNA (+)

tt t

~ ~

...-

At-~---~(-)

Cadena

RNA

progenie

progenie

viral
Figura 1&. Replicacion de virus RNA (-).

Virus de Ia Estomatitis Vesicular (VSV), es ei prototipo de virus RNA (-) rnonopartito, dentro de los cuales se encuentran muchos virus de interes veterinario y zoonotico. Como, a pesar de pertenecer a flias distintas, tienen estrategias replicativas similares, so los ha agrupado bajo el Orden Mononegavirales. Dentro de la celula, la RNApol de VSV comienza a sintetizar HNA de polaridad +, partiendo siempre desde el extreme 3' del RNA genomico (ver Fig. 19). Cuando la enzima llcga a la region intergenica encuentra una secuencia que Ia hace "tartarnudear" y de esta manera genera un poli A, con la liberacion de un mRNA y, al azar, puede continuar con la generacion del proximo mRNA 0 liberarse y empezar de nuevo del extremo 3' . Esto genera mRNAs y por ende proteinas en las siguientes proporciones N>NS>M>G>L. Cuando hay una concentracion alta de N en el citoplasma la rnisma se va complejando con el vRNA y evita que la RNApol "tartamudee", De esta

manera no se generan poliAs ni interrupciones y comienza a producir RNA

85

(+) de lago gen6mico que serviran como molde para los RNAs (-) genomico que seran parte del virion.

FigurC! 19. Estructura y replicacion

VSV

de

Virus de Influenza, es el virus RNA (-) segmentado de mayor irnportancia. Cada segmento contiene un gen, por 10 tanto al ingresar en la celula cada uno
es transcripto par la RNApol viral en un RNA (+) que funciona como mRNA. Dos de los ocho mensajeros generados deben sufrir splicing para poder expresar todas las proteinas virales (8 segrnentos dan origen a 10 proteinas). Corno el virus no porta ni codifica ningun factor de splicing se ve obligado a ingresar al nucleo para tener acceso a la maquinaria de splicing celular, a pesar

de ser un virus RNA. (ver Fig, 20)

86

Figura 20, Orthornyxovirus Replicacion nuclear De virus Influenza

Los arenavirus (dos segmentos de RNA (- y unos pocos miembros de los bunyavirus (tres segrnentos RNA (-)) contienen RNA de doble sentido. Notese que a pesar de que parte de su genoma es de polaridad (+) Y podria ser traducido directamente, se encuentran agrupados con los RNA (-) porque s;:l primer paso cn1a renl!C~E;i6n es la transGrl.p.f_i6ndS8Lendient~e una enzima

viraljFig.

2 I)

Primero se forma RNA (+) de tamafio subgenomico, a partir de la region de polaridad (-) que se utiliza como mRNA para la sintesis de ciertas proteinas, Estas proteinas se encargan de sintetizar RNA de largo genomico, el cual sirve de mensajero para la sintesis de las proteinas que estan codificadas en la region (+) y como RNA progenie. (Fig. 22)

87

£:i'F!21"tJ?BS v/t/,fJJ:j

Gal

FiglJra 21" Esquema replicativo de virus ARN doble sentido.

t'l~i;t ~trnN.A,

C{1P •

g ... ~

:.J: ,.

$. T(3ft,J"h5h

....: ...0*

~:~

rol,¥'1!

~tl:)"

Eigura 2~. Replicacion de Arenavirus 88

Este grupo esta integrado por los geovirus xJos J?jrnaviru~ CUYOS genornas poseen lOa 12 segrnentos de doble cadena. A pesar de que cada segmento posee una hebra de polaridad (+), la estabilidad de este tipo de moleculas impide la separacion completa de las hebras, 10 cual seria necesario para que cumpla funcion de mH.NA. Entonces necesitan generar RNAs simple cadena (+) para comenzar a producir proteinase Esta accion solo puede ser llevada a cabo par una RNApol incluida en el virion, En el caso particular de los Reovirus, esto ocurre dentro de la capside que nunea se desensambla totalmente. (ver FiK 23) Los mI.tNAs resultantes son traducidos a proteinas y/o se ensamblan parcialrnente con las proteinas de la capside y alli sirven de templ ados para la sintesis de la cadena complernentaria. EI resultado es la formacion de segmentos de doble cadena.

FigUI§LZ1. Ciclo replicative

de Reovirus

89

La mayoria de los virus DNA se replican en el nucleo. Como estos virus hacen usn de la. maquinaria de transcripcion celular, el DNA viral purificado introducido en las celulas suele ser mfeccioso (aunque no esta rnuy claro como son dirigidos al Dueleo). Los virus UNA simple cadena, como los Parvovirus, pueden portar la cadena de polaridad (+) 0 (-) indistintamente, ya que una vez en el ambientc nuclear

son "reparados' por enzimas celulares transformandose en doble cadena.

Como regla general, cuanto mas corto sea el genoma del virus mas dependiente sera de la replicacion celular. Siguiendo con el ejemplo de los Parvovirus, requieren infectar celulas que esten en division ya que ni siquiera codifican una DNA polimerasa entre sus genes. Otro rasgo comun a muchos virus DNA, es Ia expresion temporal de genes} es decir, 2 0 mas ciclos de transcripcion de proteinas virales. En los primeros ciclos se transcriben genes relacionados con el control de la expresion genica viral, el control del ciclo celular 0 la replicacion del genoma viral. En fases mas tardias de transcripcion se originan los mRNAs para las protein as estructurales del virion. (Figs. 24 y 25)

Fig. 24. Ciclo replicative de Herpes Simplex Humano

90

iclo replicative

de Adenovirus

t!'m1(.·lli;)l1·~ ear!v

-rr:

€2~_/:>(
/

..........

,
J.

\.../'\../v .... v\../" ............... ';.,/,\/'"/,/,,

\.AA/'v"".J

Los genes expresados en forma ternprana suelen estar bajo el control de promotores muy potentes y utilizar factores de transcripcion celulares mientras que los tardios, dependen de la presencia de alguna proteina viral (temp ran a) como factor para permitir su transcripcion. Una importante excepcion dentro de los virus DNA la constituyen los Poxvirus, los cuales se replican en eJ citoplasma, Por 10 tanto, estos virus codifican para todos los lac tores necesarios para fa transcripcion y replicacion del genoma. No sorprcnde entonces que los poxvirus posean los genomas mas grandes dentro de los virus animales.

Los retrovirus contienen un genoma bipartite de RNA, dos segmentos identicos de simple cadena, Por 10 tanto, el genoma de los retrovirus es
91

diploide. Las particulas de estos virus contienen una enzima, la transcriptasa reversa (R'T), capaz de sintetizar DNA a partir de RNA~ Luego de 121 infeccion, el H.NA viral es convertido en DNA lineal de doble cadena (DNA Copia (eDNA)) por la RT en el citoplasma (ver Fig. 26). EI DNA viral es lucgo traslocado al nucleo donde se integra en los cromosomas celulares tambien por accion de una enzima estructural (integrasa). A partir del genoma integrado se sintetizan RNAs de largo genomico asi como mRNAs mas cortes (por splicing) que son traducidos a poliproteinas y proteinas virales como 8i fuera cualquier gen celular. Las poliproteinas son luego clivadas por proteasas virales (fig. 27). Algunos retrovirus codifican sus propios factores de transcripcion que regulan el orden temporal de expresion y la abundancia de las proteinas virales.
enzim<3S ",tel .... RN A.

~ parema!IlIII!o... •

vJd.ofi

0·· ........ N· --.'A. "-

_..
-...,.

protelnas .,....~~

11lRNAs

DNA integrado

RNA progenle

\
,,~ pr09t)n., \ii.ml
Figura 26.: Replicacion en Retroviridae. LH~.l2'l.dnavirus (i1g. 28) La estrategia replicativa de esta familia se aclaro rccientemente, es pOl' eso que ha quedado fuera de la clasica clasificacion de Baltimore. EI genorna de este virus esta compuesto por DNA lineal con una cadena de polaridad (-) completa y otra de polaridad (+) incompleta. Se dice que es doble cadena parcial. Ademas, porta en el virion una enzima retrotranscriptasa parecida a Ia de los retrovirus, Pero siendo un virus DNA, (, para que necesitara una RT para replicar? Una ve: dentro de Ia celula el DNA ingresa

a1nucleo donde enzirnas celulares se encargan de completar Ia hebra (+).

Luego la molecula se circulariza pero no se integra al genoma celular. Puede

92