Southern Blot

El Southern blot es un método en biología molecular de mejorar el resultado de una e

lectroforesis en gel de agarosa al marcar secuencias específicas de ADN. El método e
s el nombre de su inventor, el biólogo británico Edward Southern. Esto causó otros métod
os blot ser identificado de manera similar como obras de teatro sobre el nombre
del Sur (por ejemplo, Western blot, Northern blot, seque suroeste).
Método:
1. endonucleasas de restricción se utilizan para romper las cadenas de ADN en frag
mentos.
2. Los fragmentos son entonces a electroforesis en un gel con el ADN cortado por
separado en función del tamaño.
3. Si el ADN es mayor de 15 kb, antes de la secante, el gel puede ser tratada co
n un ácido débil, como por ejemplo HCl diluido, que actúa para depurinate los fragment
os de ADN. Esto rompe el ADN en pedazos más pequeños que serán capaces de completar la
transferencia más eficiente que los fragmentos más grandes.
4. El gel de electroforesis de ADN se trata con una solución alcalina (por lo gene
ral contienen hidróxido de sodio) para hacer que el ADN de doble cadena para desna
turalizar, que lo separa en cadenas simples. La desnaturalización es necesario par
a que el ADN se adhieren a la membrana y se hibridan con la sonda (ver más abajo).
5. Una hoja de nitrocelulosa (o, alternativamente, de nylon) de la membrana se c
oloca en la parte superior del gel. La presión se aplica de manera uniforme para e
l gel (ya sea mediante aspiración, o mediante la colocación de una pila de toallas d
e papel y un peso en la parte superior de la membrana y el gel). Esto hace que e
l ADN de pasar de la gel sobre la membrana por acción capilar, donde se pega.
6. La membrana entonces al horno (en el caso de nitrocelulosa) o expuestos a la
radiación ultravioleta (nylon) para entrecruzar de forma permanente el ADN a la me
mbrana.
7. La membrana está tratado con una sonda de hibridación - una molécula de ADN aislado
con una secuencia específica que las parejas con la secuencia apropiada. La sonda
de ADN tiene la etiqueta para que pueda ser detectado, por lo general mediante
la incorporación de la radiactividad o de marcado de la molécula con un colorante fl
uorescente o cromogénico. En algunos casos, la sonda de hibridación se puede hacer d
e ARN, en vez de ADN.
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8. Después de la hibridación, el exceso de sonda se lava de la membrana, y el patrón d
e hibridación se visualiza en la película de rayos X por autorradiografía en el caso d
e una sonda radiactiva o fluorescente, o por el desarrollo de color en la propia
membrana si una detección cromogénica se utiliza .
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