Capitulo 09

CAPITljLO 9
Enzimas:

mecanismo, estructura y regnlaclon

Uno de los atributos mas sobresalientes de los enzimas es el de su especificidad de actuacion, de suerte que tan solo ciertos sustratos experimentan su accion y unicamente tiene lugar un tipo de reaccion sin que se produzcan reacciones laterales a subproductos. EI quimico organico se considera afortunado si al efectuar una reaccion en el laboratorio, logra obtener un rendimiento del 90 %. Sin embargo.si el rendimiento de cada producto a 10 largo de una secuencia metabolica de 10 etapas fuese solamente de un 90 %, siqnificaria que en el producto final solo se habria recuperado un tercio del producto inicial. Se percibe claramente que si no fuese par la especificidad de los enzimas, las celulas quedarian rapidamente inmersas en un conjunto de reacciones laterales y productos secundarios.

Otro import ante atributo de los enzimas es su enorme poder catalitico. Aunque los enzimas son proteinas y par tanto moleculas relativamente fragiles, desarrollan sus extraordinarios efectos cataliticos en disoluciones acuosas diluidas, a pH biologico y a temperatura moderada, en agudo contraste can las condiciones mas bien extremas que can frecuencia necesitan en el laboratorio para acelerar las reacciones quimicas.

En este capitulo estudiaremos no solamente la especificidad y el mecanismo de accion de los enzimas, sino tambien las propiedades y estructura de diferentes clases de enzimas reguladores, los cuales actuan como ajustadores de los sistemas multienzimaticos en las celulas y como elementos en la integracion de las rutas metabolicas.

Especificidad de sustrato de los enzimas

Uno de los primeros estudios import antes sabre la especificidad de los enzimas Iue el efectuado par Emil Fischer, quien descubrio que los enzimas que eran capaces de hidrolizar glu~ cosidos podian distinguir entre formas estereoisomeras de estos. Esta observacion le condujo, en 1894, a enunciar el principia de que la molecula del sustrato se adapta al centro activo del enzima del mismo modo que 10 harian una llave y una cerradura, es decir, que tienen una relacion complementaria.

Aunque los enzimas, en campara cion can los catalizadores manufacturados son muy especificos, su grado de especifici-

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PARTE 1 COMPONENTES MOLECULARES DE LAS CBLULAS

dad puede en general ser muy variado. Algunos poseen una especlflcidad casi absoluta respecto a un sustrato determinado, y no atacaran a moleculas aunque esten muy relacionadas, mientras que otros enzimas atacan toda una clase de moleculas con un com un denominador estructural, aunque 10 hagan a velocidades diferentes. La aspartato-amoniaco-liasa, designada corrientemente como aspartasa, constituye un ejemplo de enzima con una especificidad de sustrato casi absoluta (fig. 9~1). Posee adem as una estereoespecificidad estricta: asi, no es capaz de desaminar al n-aspartato ni adicionar amoniaco al malea to, el isomero geometrico del fumarate. En realidad, 10 que es especialmente destacable es la esterecespecificidad de muchos enzimas ya que los catalizadores manufacturados son, en general, incapaces de seleccionar una de las dos formas de un par de estereoisomeros. Otros enzimas estereoespecificos son la lactato-deshidrogenasa que es especifica para el estereoisomere de conftquracion L del lactato, y la n-aminoacido-oxidasa, que es especlfica para el estereoisomero de confiquracion 0 de diversos aminoacidos. Algunos enzimas, tales como la aconitasa (pag. 464) son incluso capaces de distinguir entre dos sustituyentes identicos situados en un atomo de carbono no asimetrico,

En el otro extremo del espectro se encuentran los enzimas con especificidad relativamente amplia, que son capaces de actuar sobre un cierto numero de diferentes sustratos de estructura relacionada, aunque 10 hagan con velocidades ampliamente diferenciadas. Se encuentra en este grupo la fosfatasa elceline, que hidroliza a much os esteres diferentes del acido Iosforico, la cerboxiesterese, que hidroliza esteres de diversos acidos carboxilicos, y la cerboxipeptidese, que cataliza la hidrolisis del enlace peptidico Cstermtnal de los peptidos cualquiera que sea la longitud de la cadena 0 la identidad del resto aminoacido C~terminal.

Los estudios de especificidad de sustrato de los enzimas, muestran que las molecules del sustrato reflejan en general. por el principio de complementaridad, la estructura del centro activo del enzima mediante dos rasgos distintivos estructurales: 1) el sustrato debe poseer un enlace quimico susceptible que pueda ser atacado por el enzima: 2) generalmente posee otra caracteristica estructural necesaria para efectuar su union al centro activo del enzima, probablemente para situar la molecula del sustrato en la adecuada relacion geometrica de modo que el enlace susceptible pueda ser atacado. Por ejemplo, los estudios de especificidad de sustrato sobre la ecetilcolinestera'sa (pag. 176) han demostrado que aunque el enlace susceptible es el enlace ester entre la colina y el grupo acetilo, la parte de la molecula necesaria para situ arlo sobre el centro activo es el grupo amonio cuaternario con carga positiva que se halla unido a un grupo no polar (fig. 9~2). La presencia de este grupo orientador es tambien necesaria en la estructura de los inhfbidores competitivos de la acetilcolinesterasa (pa~ gina 203). De hecho, el analisis de los requerimientos estructurales de la inhibicion competitiva ha proporcionado infermaci6n muy valiosa sobre los. centros activos de los enzimas, ya que los inhibidores competitivos se pueden unir al centro activo pero no se transforman.

La especificidad de. sustrato de la quimotripsina estudiada detalladamente por M. Bergmann y J. S. Fruton, ofrece un

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FIGURA 9-1

Reaceion de la aspartasa. La aspartasa posee una especiticided de substrato relativamente estricta. Bs incepez de catalizar le adicion de amoniaco al metiliumereto, a los esteres 0 a las amidas del ileido fumilrico, a los ileidos a./J-insaturados 0 sl maleato; tampoco cataliza la deseminecion de los ileidos eminomelonico, glutilmico ni le de varios ectdos a-emino-monocsrboxilicos,

coo-
I
CH
II Fumarato
HC
I
COO-
+
NH.,+
II
COO-
I
CH.
I L-Aspartato
HCNH.
I
COO-
+
H+ FIGURA 9-2

Grupo determinante de le posicion

y enlace susceptible de le ecetilcoline, sustrato de le ecetilcolinesterese.

Grupo enlazante o determinante de la posicion

Enlace susceptible

FIGURA 9-3

Especificidad de substrato de la quimotripsina. A partir de estudios de especiiicided efectuados sobre substratos sinieticos (derecha}, seha deducido que Is quimotripsine es mas bien una trensiersse de gtUpos ecilo hidtofobicos, que una peptidasa estrictemenie hablando. Sus requerimienios esttuctureles minimos se muesttan abajo.

Grupo hidrofoblco determinante de la posicion

-C-x

~\

Enlace susceptible

Capitulo 9 Enzimas: mecanismo, estructura y eequlecion

Algunos compuestos hidrolizados POt 18 quimotripsina. Las flechas coloreedes sefialan los puntos de rupture,

CH3

I !

CH3-C-CHzCH2C-OCH3

I II

CHa 0

caso especialmente revelador (fig. 9~3). Como quiera que la quimotripsina es segregada al intestino delgado, se crey6 en un principio que era especifica para efectuar la hidrolisis de los polipeptidos, relativamente largos, que se formaban al actuar la pepsina en el est6mago sobre las proteinas ingeridas: sin embargo, posteriores trabajos revelaron que la quimotripsina puede atacar tambien a peptidos cortos. Los experimentos efectuados con peptidos sinteticos como sustratos mostraron que este enzima es una endopeptidasa; es decir, que puede romper ciertos tipos de enlaces peptidicos en cualquier lugar de la cadena peptidica en que se hallen situados, en contraste con las exopeptidasas, que solamente pueden escindir enlaces peptidicos terminales. Ademas, la quimotripsina es especifica para aquellos enlaces peptidicos en los que la funci6n carbonilo es aportada por restos aminoacidos aromaticos: por ejemplo, la tirosina, el fript6fano y la fenilalanina: tambien hidroliza las amidas de estos aminoacidos.

Constituy6 una sorpresa considerable el trabajo posterior sobre los sustratos sinteticos, al revelar que la quimotripsina puede hidrolizar no solamente peptidos y amidas de aminoacidos aromaticos, sino tambien a sus esteres. En realidad, los esteres de la tirosina son los sustratos mas activos que se conocen para la quimotripsina. Otro hallazgo inesperado fue que la quimotripsina cataliza la transfcrencia del grupo acilo aromatico a aceptores de acilo distintos del agua, por ejemplo, el amoniaco, otros aminoacidos y alcoholes. Ademas, los anillos aromaticos que tradicionalmente se creia eran indispensables para la actuaci6n de la quimotripsina pueden ser dispensables, ya que la sustituci6n del anillo bencenico de un resto de fenilalanina por un anillo de ciclohexilo 0 de alqim otro grupo hidrocarbonado voluminoso no introduce un gran

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PARTE 1 COMPONENTES MOLECULARES DE LAS CELULAS

descenso de la actividad. Es mas, se ha demostrado que ni siquiera el grupo wamino del aminoacido aromatico es necesario, ya que puede sustituirse por un atomo de hidr6geno, por un grupo hidroxilo 0 por un atomo de cloro (fig. 9~3) . Estrictamente hablando, puede afirmarse pues que la quimotripsina no es, en absoluto, una peptidasa; podria designarse, con mayor exactitud, como una «transferasa de grupos acilo hidrofobicos». Su centro activo posee dos rasgos distintivos, una zona hidrofobica para la uni6n y la orientaci6n del sustrato sobre el centro activo, y una porci6n catalitica para separar y transferir el grupo acilo (fig. 9~3). A partir de tales estudios sobre especificidad de sustrato y sobre los requerimientos estructurales de los, inhibidores competitivos (paq. 203), ha sido posible delinear los centros activos de muchos enzimas.

Identificaci6n de grupos funcionales esenciales para la catalisis

Otro metodo util de abordar el trazado de los centros activos es el empleo de reactivos capaces de modificar covalentemente diferentes tipos de grupos funcionales en las moleculas de los enzimas, con objeto de establecer si tales grupos son necesarios para la actividad catalitica. Un ejemplo clasico 10 constituye la acci6n del iodoacetato. agente de alquilaci6n (pagi~ na 102). Si tratamos la ribonucleasa con iodoacetato a pH 5.5, el enzima se alquila y pierde su actividad catalitica. Se forman dos form as inactivas del enzima: en una de elias el anillo imidazol del resto histidina 119 resulta alquilado; en la otra el resto de histidina 12 es el que experimenta la alquilacion. Puesto que ninqun otro grupo funcional de la molecule de ribonucleasa resulta alquilada en estas condiciones, puede concIuirse que los restos de histidina 12 y 119 de la ribonucleasa son necesarios para la actividad catalitica.

Otro ejemplo importante es la acci6n del agente fosforilante fluorofosfato de diisopropilo sobre ciertos enzimas, que produce unos derivados inactivos en los que se fosforila el hidroxilo de un resto de serina (fig. 9A). Este reactivo pertenece a un grupo de compuestos organofosforados toxicos, lIamados a veces venenos nerviosos ya que se combinan, inactivandolo completamente, con el enzima ecetilcolinesterese; que interviene en la actividad del sistema nervioso. Algunos de estos compuestos se emplean como insecticidas. EI fluorofosfato de diisopropilo inhibe no solamente a la acetilcolinesterasa sino tambien a otros enzimasque poseen un res to de serina esencial en sus centres activos; por ejemplo, la quimotripsina, la tripsinji, la fosfoglucomutasa y divers as esterasas. En la quimotripsina, el fIuorofosfato de diisopropilo fosforila selectivamente eI res to de serina en posici6n 195, con 10 que identifica dicho resto como esencial para la catalisis. Cuando se somete a hidrolisis parcial un enzima fosforilado por este reactivo, el resto de fosfoserina permanece intacto y puede encontrarse en uno de los fragmentos peptidicos. EI analisis quimico de estos peptidos fosforilados ha proporcionado importante infermaci6n sobre las secuencias aminoacidas de las proximidades del centro activo de este grupo de enzimas, que reciben a veces el nombre de enzimas serinicos (tabla 9~ 1 ). Los mencionados enzimas, inactivados tal como se ha descrito, pueden ser, a veces, lentamente reactivados mediante sustancias cuya

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FIGURA 9-4

Formaci6n de un derioedo fosforilado inectivo de un enzima de la clase serine.

o

H II

N C

r >:»>:

CH

I

CH.

I OH

+

C~3 I lH3

HC-O-P-O-CH Fluorofosfato

/ II \ de diisopropilo

CH3 0 CH3

Resto de serina

activo del enzima

o II N C

»<:»>:

CH

I

C~ I

C~3 ? lH3

HC-O-P-O-CH

/ II \

CH3 0 CH3

H

Sster diisopropil fosforico del enzima

TABLA 9-1. Secuencias de los aminoacidos en torno a los restos de serina reactivos de algunos enzimas.

Outmotripstna -Gly-Asp-Ser-Gly-Gly-

Tripsina -Gly-Asp-Ser-Gly-Pro-

Trombina

-Asp-Ser-Gly-

Elastasa -Gly-Asp-Ser-Gly-

Fosfoglucomutasa

- Thr-Ala-Ser~His-Asp-

Fosforilasa -Glu-IIe-Ser-VaI-Arg-

FIGURA 9-5

Reeccion de un agente de marcaje pot: afinidad con la quimotripsina. El marcador de afinidad, Nstosil-t.-ienilelenil-clorometilcetone (TPCK). [ue ideedo de modo que

se pereciese a un sustreto normal de la quimottipsine. Sin embargo, en lugar de la estructura susceptible habitual del

sustreto (-CO-NH-). el TPCK

coniiene el grupo -CO-CH2Cl. que es

un agente de elquilecion potenie. La incubacion del TPCK con quimotripsina produce la union de equel al centro activo, del mismo modo que 10 hace el sustreto normal. Sin embargo, en lugar de producirse la hidrolisis del sustreto, se alquila el resto esencial de His 57. indicendo que el eminoecido se halla proximo al enlace susceptible que normalmente experimenta la hidrolisis, EI resto de His alquilado puede eislerse a continuecion de la hidrolisis completa de todos los enlaces peptidicos del enzima.

Capitulo 9 Enzimas: mecanismo, estructure y requlecion

reaccionabilidad can el agente fosforilante es superior a la que. muestra el propio enzima.

Es muy significativo que los grupos funcionales de los enzimas necesarios para la actividad catalitica son par 10 general, mucho mas accesibles, a reactivos, que grupos seme'[antes situados en cualquier otra parte de la molecula, pero que no intervienen directamente en la catalisis. Par ejemplo, la ribonucleasa contiene muchos grupos funcionales cap aces de reaccionar can el iodoacetato, pero los grupos imidazol de los restos de histidina 12 y 119 son mucho mas reactivos que todos los dernas. De modo parecido, la quimotripsina contiene muchos restos de serina, pero solamente el que se haIIa en posicion 195 es el que se fosforila can el fluorofosfato de diisopropilo, en condiciones suaves.

En el marcaje de afinidad. que es otro metodo de identificar grupos funcionales esenciales en los centros activos de los enzimas, se deja que el enzima reaccione can una molecula que se ha preparado sinteticamente de modo que se parezca al sustrato verdadero para que se una especificamente Cll centro activo como si fuese el verdadero sustrato, pero que contenqa, ademas, un grupo funcional capaz de reaccionar con rapidez y establecer un enlace covalente can alqun grupo especifico del enzima, situado en el centro activo del enzima 0 muy proximo a el. La figura 9-5 muestra la estructura, de un marcador de afinidad de la quimotripsina, que pone de manifiesto la semejanza de gran parte de su molecula con la estructura de los sustratos normales de la quimotripsina. asi como su grupo quimico reactive, el cual se combina con el resto histidina 57 de la quimotripsina. De este modo se han identificado los restos histidina 57 y serina 195 (vease mas atras] de la quimotrips ina como participantes en su actividad catalitica.

Se han empleado otras estratagemas quimicas para identificar restos aminoacidos especificos de diversos enzimas im-

Estructura del TPCK.

Reacci6n del TPCK con quimotripsina (R representa a los grupos determinantes de la posicion en el TPCK).

Q

O=S=O I

NH

0-1

CH2-CH -~-CH2CJ

o

R
I
C=O
I TPCK
CH2
I
Cl
+ Anillo
H+
#N Imidazolico
HC~3-:CH de la His 57
\ , 5 II de la
HN-C- quimotripsina
tHCl
R
I
C=O
I Anillo
CH2 imtdazollco
I alquilado
#N
HC~3-:CH
\ i 51!
HN-C- Grupo determinante de la posicion

Grupo alquilante

Estructura de un sustrato normal.

NH2 R

0- I I

CH.-CH-~- \"CHCOOH

Grupo determinante de la posicion

Enlace susceptible

227


plicados en la actividad catalitica. Por ejemplo, en el capitulo anterior (pag. 217) vimos que la reduccion de un complejo enzima-sustrato de la aldolasa mediante el potente agente reductor borohidruro de sodio, atrapa al complejo en su forma reducida estable. La hidrolisis parcial del compuesto enzimasustrato reducido proporciona un peptide que contiene un gli~ ceril-derrvado de un resto especifico de lisina, con el cual el sustrato forma una base de Schiff intermediaria.

Factores que contribuyen a la eficacia catalitica de los enzimas

lSon muy eficaces los enzimas como catalizadores? lQue incremento de la velocidad de la reaccion producen en realidad? Se han obtenido datos cuantitativos referentes a la hidrolisis de la urea,

catalizada por la ureasa aislada de Cenneoelis enzyformis. La constante aparente de velocidad de la reaccion de primer orden de esta reaccion en el agua, en ausencia de enzimas. es de 3 X 10-10 S-I, a pH 8.0 y a 20oC. En contraste con ello, el valor de la constante de velocidad de primer orden de la ruptura del complejo urea-ureasa, para dar los productos, es de 3 X 104 S-1 en las mismas condiciones. Por tanto, el enzima acelera la reaccion no catalizada unas 1014 veces. Otros calculos semejantes indican que las reacciones catalizadas enzimaticamente tienen lugar a velocidades que son de 108 a 1020 veces mayores que las correspondientes reacciones no catalizadas. Hay todavia pocos catalizadores manufacturados. que comiencen a aproximarse a la actividad de los enzimas, y Ia mayoria son mucho menos eficaces.

Cuatro son los facto res principales que parecen contribuir al gran incremento de velocidad producido por los enzimas:

1. EI enzima puede fijar la molecula de sustrato de tal modo que el enlace susceptible se halle a) muy proximo al grupo catalitico sobre el centro activo y b) orientadod~ tal modo en relacion con el centro catalitico, que el estado de transicion se forme con facilidad.

2. Algunos enzimas se pueden combinar con el sustrato para formar un intermediario covalente inestable que reacciona con mas facilidad para formar los productos.

3. Al proporcionar grupos funcionales cap aces de actuar como dado res 0 aceptores de protones, el enzima puede efectuar una catalisis general acida 0 basica.

4. El enzima puede inducir una tension 0 una dis torsion en el enlace susceptible de la molecula del sustrato, determinan do que la ruptura del enlace sea mas Iacll.

Todos estos factores seran estudiados a continuacion,

Proximidad y orientaci6n del sustreto: orientaci6n orbital

El camino mas sencillo posible para que un enzima acelere la velocidad de una reaccion es el actuar como medio de union. o de Hjacion, de la molecule del sustrato al centro activo, in-

228

FIGURA 9-6

Efecto de la proximidad del grupo cetelitico sobre la velocided de la reacei6n. En estos modelos iniremoleculsres,

la base general, -COO- es el cetelizedor, mienires que el enlace ester desempefia el papel de sustreto. R es un grupo p-bromoienilo. La rupture del enlace ester va acompafiada de la ciclecion, rindiendo un enhidrido de aeido.

A medide que se restringe la posibilidad de que el grupo -COO- adopte muchas posieiones diferentes en relecion al

grupo ester. en esta serie de compuestos se incrementa su capaeidad cetelitica, mostrando con' ella la importaneia del factor de proximidad. (Adaptado de T. C. Bruice y S. T. Benkovic, Bio-organic Mechanisms. Vol. 1. pag. 178, W.

A. Benjamin. Inc .• Nueva York. 1966).

2ster

Veloeidades relativas de hidrolisis del

ester

rCOOR tc_COO-

1.0

Me~COOR Me~COO-

20

\COOR Lcoo-

230

(COOR COO-

10000

~OR

"---\( COO-

o

53000

FIGURA 9.7

Representaci6n esquematica de la hipotesis de la orientaci6n orbital, que propone

que el sustrato y el gropo catalitico

del enzima no solamente deben hallarse ptoximos, sino tembien alineados adecuadamente de modo que los orbitales importantes se solapen. De este modo puede alcanzarse el estado de transici6n con una probabilidad muy alta. [Adaptado de A. Dafforn y D. E. Koshlend, t-:

Biochem Biophys. Res. Commun., 52: 780 (1973) J.

Orientacton desfavorable, proximidad des favorable

Proximidad favorable, orientacion desfavorable

Proximidad favorable, ortentacion favorable

Capitulo 9 Enzimas: mecanismo, estructura y regulaci6n

crementando mucho de esta manera la concentracion e£ectiva del sustrato en una zona muy localizada. De hecho, se ha calculado que la concentracion efectiva del sustrato en el centro activo podria llegar hasta 100 M, siendo un as 105 veces mayor que la concentracion global del sustrato en la disolucion enzimatica, que seria solamente 0,001 M. Puesto. que las reacciones quimicas avanzan a velocidades que son proporcionales a las concentraciones de los reaccionantes, puede esperarse un incremento muy grande de la velocidad en el area local donde la concentracion es muy elevada.

Se han llevado a cabo muchos experimentos interesantes con objeto de evaluar el factor de proximidad mediante reacciones orqanicas modelo. En uno de estes modelos, dos grupos reaccionantes est an integrados covalentemente en una misma molecula, de modo que los dos han de hallarse necesariamente muy proximos. La reaccion es, entonces, intremoleculer en lugar de intermolecular, y se dice que esta promovida por una asistenda enquimerice. Un caso muy conocido, estudiado por T. C. Bruice y sus colaboradores, es la catalisis intramolecular de la hidrolisis de los esteres monofenilicos de los acidos dicarboxllicos, en las que el grupo carboxilato libre actua como catalizador (fig. 9~6). En este modelo, cuanto mayor es la proximidad del grupo carboxilato catalitico al enlace ester susceptible, tanto mayor es la velocidad de reaccion, En el caso mas espectacular, el incremento de la velocidad de reaccion fue de unas 53 000 veces,

Podria con razon preguntarse si tales incrementos de velocidad se deben exclusivamente al efecto de proximidad 0 son resultado de la relativa orientacion especiflca mutua de las moleculas reaccionantes. D. R. Storm y D. E. Koshland Jr. han postulado que una de las funciones principales del centro activo de un enzima es que produce orientaci6n orbital; es decir, la orientacion precisa del sustrato y del grupo catalitico del enzima uno respecto al otro de modo que sus orbitales de enlace se alineen en la relacion especifica necesaria para llevar al complejo enzima-sustrato directamente, al estado de transicion (fig. 9~7). Esta hipotesis ha provocado acaloradas discusiones; volveremos a examinar el tema mas adelante (pa~ gina 236).

Catalisis covelente

Otro medio por el que algunos enzimas pueden incrementar la velocidad de una reaccion quimica se obtiene formando un intermediario covalente muy reactivo entre el enzima y el sustrato, que tiene una probabilidad elevada de alcanzar el estado de transicion, y permite asi que el sustrato halle un paso inferior a traves de la barrera de energia de activacion (pag. 194).

Muchos enzimas forman intermediarios enzima-sustrato covalentes (tabla 9~2). Uno d~sos es la formacion de un intermediario covalente constituido por una base de Schiff en la accion de la Iructosa-difosfato-aldolasa (pag. 217), que ya se ha descrito. La quimotripsina forma tambien un intermediario covalente. Cuando se mezc1a este enzima con una cantidad equimolar del ester acetato de p-nttrofenilo, que es un sustrato relativamente «lento», se Iibera p-nitrofenol a mayor velocidad que el acetate, el otro producto. El estudio

229


TABLA 9-2. Algunos enzimas que forman compuestos enzima-sustrato covalentes.

Enzima

Tipo de iniermediario covelente

Clase serina Fosfoglucomutasa Acetilcolinesterasa Tripsina Quimotripsina Elastasa

Clase cisteina Gllceraldehido-Iosfatodeshidrogenasa

Papaina Acetil-CoA-acetiltransferasa

Clase histidina Glucosa-e-fosfatasa Succtntl-Co.A-stntetesa

Clase Iisina .

Fructosa-difosfato-aldolasa Transaldolasa n-Amtnoacido-oxidasa

Fosfoenzima Acll-enztma Actl-enzlma Acrl-enzlma Acfl-enzima

Actl-enzlma Acil-enzfma Actl-enzima

Fosfoenzima Fosfoenzima

Base de Schiff Base de Schiff Base de Schiff

cuantitativo de este efecto conduce a la conclusion de que la hidrolisis del ester se verifica en dos eta pas:

Quimotripsina + acetato de p-nitrofenilo ~

acetil-quimotripsina + p~nitrofenol (1 )

Acetil-quimotripsina + H20 ~ aceta to + quimotripsina (2)

La primera reaccion es relativamente rapida, pero la segunda, en la que se produce la liberacion del aceta to libre, es muy lenta. El intermediario, la acetil-quimotripsina, es bastante estable a pH bajo y puede aislarse. Cuando se emplea un ester del acido trimetilacetico como sustrato de la quimotripsina, se forma trimetilacetil-quimotripsina, que es tan estable que puede cristalizarse. El grupo funcional de la quimotripsina que resulta acilado durante su ciclo catalitico es el grupo hidroxilo del res to de serina 195 que, como hemos vis to, se fosforila en el tratamiento con fluorofosfato de diisopropilo.

Los enzimas .que actuan a traves de la formacion de complejos enzima-sustrato covalentes se clasifican de acuerdo con el tipo de resto aminoacido con el que reacciona el sustrato (tabla 9~2). La clase serina comprende a la acetilcolinesterasa, la quimotripsina, la tripsina y la fosfoglucomutasa. En estos enzimas, el grupo hidroxilo de un resto especifico de serina participa en la formacion de un ester mtermediario, bien con un grupo acilo, como en la quimotripsina, con la que forma un acil~enzima, 0 con un grupo fosfato, que es 10 que ocurre en la fosfoglucomutasa [paq. 445), para formar un fosfoen~ zima. En la clase de enzimas cistein«, que comprenden la qliceraldehido-fosfato-deshidrogenasa y la papaina, un enzima proteolitico, se establece un enlace covalente tioester entre el grupo acilo del sustrato y el grupo sulfhidrilo de un resto de cisteina especifico situado en el centro activo del enzima. La clase hist.idina comprende a algunos enzimas que intervienen en la transferencia de fosfato; por ejemplo, la succinil-Co.A> sintetasa, en la que el grupo imidazol de un resto de histidina

230

FIGURA 9-8

Grupos nucleolilicos import antes de las protelnes

Grupos nucleofilicos

Atomo electrofilico

_______. -CH2-g:

H Grupo htdroxilo de la

serina

________. -CH2-~:

H Grupo sulfhidrilo de la

Grupo imidazol de la histidina

FIGURA 9-9

Incremento de fa velocided de reeccion pot catfllisis nucleolilice. Observese que el catalizador nucleoiilico Y se regenera

al final del ciclo cetelitico,

Reacci6n no catalizada:

Catallsls por el agente nucleofilico Y

rapida RX+Y-- RY+ x-

raptda

RY+ H20--ROH+ Y+ H+

Suma:

rapida

RX+ H20--ROH+ X-+ H+

Capitulo 9 Enzimas: mecenismo, estructura y requlecion

especlfico del enzima se fosforila. En la clase lisine, representad a por la fructosa-dlfosfato-aldolasa, se forma una base de Schiff intermedia entre el grupo € -amino de un resto de lisina del enzima y un grupo carbonilo del sustrato. Muchos enzimas que forman intermediaries covalentes muestran el comportamiento cinetico caracteristico de las reacciones de doble desplazamiento 0 de ping-pong (paqs. 210 y 211).

iDe que modo la formacion intermedia de un compuesto covalente enzima-sustrato, provoca un gran incremento de la velocidad de la reaccion global? Para contestar a esta pregunta debemos revisar, en primer lugar, unos cuantos principios de los mecanismos de las reacciones orqanicas. El tipo de reaccion mas corriente en la catalisis covalente es el ataque de un grupo nucleolilico del catalizador sobre un atomo de carbone electrofilico del sustrato. Los grupos nucleofilicos contienen atomos ricos en electrones, y son capaces de donarlos. Los nucleofilos son catalizadores muy. eficaces y versatiles: por ejemplo, promueven la hidrolisis de esteres orqanicos sencillos y la transferencia de grupos acilo desde un compuesto a otro. Las molecules de los enzimas contienen, por 10 menos, tres clases de grupos nucleofilicos que al menos en potencia son capaces de actuar cataliticamente: son los siguientes :el grupo imidazol de la histidina, el grupo hidroxilo de la serina y el grupo sulfhidrilo de la cisteina (fig. 9~8). Ademas, muchos coenzimas poseen centres nucleofilicos.

Un grupo nucleofilico puede catalizar una reaccion de transIerencia de acilo, de la cual la hidrolisis de un ester constituye un caso especial, ya que el nucleofilo ataca a la mole cul a que contiene el grupo acilo, llamada dador del grupo acilo, y rinde un derivado acilado del grupo nucleofilico. El acil-derivado del catalizador actua como intermediario de la reaccion: en: una segunda etapa el grupo acilo se transfiere desde el catalizador nucleofilico a la molecula aceptora de acilo final, que puede ser alqun otro alcohol 0 simplemente el agua. Tal como se muestra en los ejemplos esquematicos de la figura 9~9, para que la catalisis nucleofilica tenga lugar, el sustrato debe reaccionar con el catalizador nucleoftllco mas rapidamente de 10 que haria con el aceptor final de los grupos acilo en ausencia del catalizador. Ademas, el catalizador acilado que asi se ha formado debe reaccionar tambien mas rapidamente con el aceptor final de los grupos acilo de 10 que haria el sustrato original en ausencia del catalizador. De este modo la formacion de un intermediario covalente puede rebajar la barrera de energia de activacion de las reacciones implicadas en la transferencia de grupos acilo.

Cetelisis acido~base

Los acidos y las bases, definidos en su sentido mas amplio, son los catalizadores mas versa tiles y universales de las reacciones orqanicas. Existen dos tipos principales de catalisis acido-base r la especi{ica y la general. La catalisis acida especifica y la catalisis basica especifica son definidas como los incrementos de velocidad que solamente son proporcionales a la concentracion de los iones H+ y OH-, respectivamente. La catalisis acida general y la catalisis basica general explican los inc_~tos de velocidad que son proporcionales a la con-

231


centraci6n de sustancias que se comportan como acidos 0 como bases de un modo general; por ejemplo, los dadores de protones y los aceptores de protones, respectivamente, tal como los definen J. N. Bronsted y T. M. Lowry (pag. 49).

La catalisis especifica acido-base por H+ 0 OH- tiene una importancia relativamente limitada, en las reacciones enzimaticas, pero la cat ali sis acido-base general tiene muchas mas probabilidades de intervenci6n en la acci6n de los enzimas. Muchos tipos de reacciones orqanicas que tienen lugar en las celulas, como la adici6n de agua a los grupos carbonilo, la hidrolisis de los esteres carboxilicos y fosforicos, la eliminacion de agua de los enlaces dobles, diversas reordenaciones moleculares, y much as reacciones de sustitucion, estan sujetas a este tipo de catalisis, Ademas, se sabe que las moleculas de los enzimas conti en en diversas cIases de grupos funcionales capaces de actuar como acidos generales y como bases generales; por ejemplo, los grupos amino. carboxilo, sulfhidrilo, el hidroxilo fenolico y los grupos. imidazol (fig. 9~1O).

En las reacciones catalizadas por los acidos 0 bases gene~ rales, en alqun punto del ciclo catalitico el catalizador funciona como aceptor 0 dador de protones. La etapa critica de transferencia de protones tiene luqar, como regIa general. por cesi6n 0 por captacion de un atomo de carbone de la especie que se halla en el estado de transicion, Por ejemplo, la velocidad de algunas reacciones enzimaticas disminuye grandemente cuando se lIevan a cabo en 6xido de deuterio (020) en lugar de agua (H20). 10 que indica que una etapa de protonaci6n es limitante de la velocidad, ya que el ion deuterio (0+) reacciona mucho mas lentamente que el proton (H+) con una base general. A veces intervienen al mismo tiempo como catalizadores una base y un acido generales. como ocurre en las transferencias concertadas de protones. En este tipo de reacciones, el acido general cede un proton a la especie del est ado de transicion y la base general acepta otro.

Dos factores Importantes afectan a la velocidad de las reacclones catalizadas por un acido 0 una base generales. El primero de ellos es la fuerza del acido 0 de la base generales; es decir, su constante de disociaci6n del prot6n. Entre los catalizadores acido-base generales mas activos se encuentra el grupo imidazol de la histidina, cuyo pK' es de alrededor de 6.0 (pag. 77). 10 que le permite actuar tanto de dador como de aceptor de protones a valores de pH pr6ximos a los de los fluidos bioloqicos. El segundo factor importante es la velocidad a la que el acido 0 la base pueden ceder 0 aceptar protones. De nuevo es el grupo imidazol el que se muestra particularmente eficaz, ya que sus velocidades de protonizacion y desprotonizacion son no solamente casi iguales a un pH proximo a la neutralidad, sino que tambien son muy rapidas y el tiempo mitad es menor de 0.1 ns. En realidad, el grupo imidazol de los rest os especificos de histidina interviene en el ciclo catalitico de muchos enzimas diferentes. El grupo imidazol, como hemos vis to. es tambien un potente nucleofilo. Puesto que en la mayor parte de las proteinas existen relativamente pocos restos de histidina, este aminoacido puede haber sido seleccionado durante el curso de la evoluci6n bioloqica para desempefiar un papel especial en la catalisis enzimatica.

232

FIGURA 9-10

Grupos funcionales de las proteinas capaces de ectuer como ecldos y bases de cerectet: general.

Algunos grupos €tcidos generales de las proteinas (dadores de protones)

-COOH

-NHa+

-o-OH

-SH

-C=CH

/ \+

HN"c!'NH

H

Algunos grupos basicos generales de las proteinas (aceptores de protones)

-COO-

-NH2

-S-

-C=CH

/ \

HN N:

"C~ H

FIGURA 9-11

Necesidad del peptido-S y de la proteine-S para fa ectioided de la ribonuclease.

No es necessrio que los fragmentos esteti coveleniemenie unidos para que se testeblezce le ectividad, basta metemeni> con mezclerlos.

Ribonucleasa

Despues de 1a escisi6n

con subtilisina

1 r Lys NecesarioJ ~ ~ Lys

His t 12 His

16

20 + 21

intacta

Peptldo-S

41 Lys 41 Lys

subtilisina

Proteina-S

119 His 119 His

124 124

Capitulo 9 Enzimas: mecanismo, estructura y requlecion

La catalisis acido-base general proporciona un medic para efectuar la catalisis a pH neutro, en el que las concentraciones de H+ y de OH- son muy bajas, de reacciones quimicas que de otro modo necesitarian concentraciones muy elevadas de los mencionados iones. Por ejemplo, en ausencia de enzimas, la hidrolisis de los enlaces peptidicos precisa de concentraciones muy elevadas de H+ 0 de OH-, de periodos de reaccion prolongados y de temperaturas elevadas (pagi~ na 102), mientras que la hidrolisis de los enlaces peptidicos por la quimotripsina se realiza rapidamente a pH neutro, promovida por la catalisis acido-base general en el centro activo.

Factor de tension en fa cetelisis enzimeticei Relecion

entre la conjormecion del enzima y le ectioided cetelitice

Hay dos cuestiones que han confrontado durante mucho tiempo a los bioquimicos dedicados a la enzimologia: lPor que se precisa, en general. que la molecula del enzima se halle en su conformacion tridimensional nativa para ejercer su actividad catalitica? i Como es que las moleculas de los enzimas son tan voluminosas en relacion con las estructuras susceptibles de la molecula del sustrato? La Investiqacion sobre la ribonucleasa y sobre otros enzimas ha proporcionado algunas claves. Hemos visto que los restos de histidina 12 y 119 son necesarios para la actividad catalitica de la ribonucleasa. advirtiendo que la cadena polipeptidica se halla plegada de tal manera que est as dos histidinas, que se hallan separadas por 107 restos en el esqueleto, se encuentran muy proximas en el centro activo. Este parecer esta confirmado por unos interesantes experimentos debidos a F. M. Richards y sus colaboradores sobre el efecto de la escision de la cadena polipeptidica que constituye el esqueleto de 'la ribonucleasa. La subtilisina, una proteasa bacteriana, escinde la cadena de la ribonudeasa de 124 restos entre los restos 20 y 21 (fig. 9~11). El fragmento mas largo, llamado proteina-S. contiene el resto histidina 119, y el fragmento mas corto, llamado peptido~S, contiene el resto histidina 12. Tanto la proteina-S como el peptido-S son cataliticamente inactivos si se ensayan por separado, pero cuando simplemente se mezclan de nuevo a pH 7,0, se recupera su actividad enzimatica, aunque no se establece enlace covalente alguno entre los dos fragmentos. El peptido-S se une evidentemente a la proteina-S mediante fuerzas debiles tales como enlaces de hidrogeno e interacciones hidrofobicas, pero de tal modo que los dos restos de his tid ina esenciales se han reunido en el centro activo, a pesar de que la cadena polipeptldica originalmente tendida entre ambos haya side previamente escindida.

Otro ejemplo semejante es la quimotripsina, la cual es secretada en forma de un precursor inactive, 0 zimoqeno, el quimotripsinogeno. Dicho precursor esta constituido por una sola cadena polipeptidica de 245 restos que se mantiene unida mediante cinco puentes disulfuro intracatenarios (fig. 9~12). El quimotripsinogeno se convierte en o-qufmotnpsina act iva por la hidrolisis enzimatica de cuatro enlaces peptidicos, qracias a la accion consecutiva de la tripsina y de la quimotripsina; en esta hidrolisis se liberan dos dipeptidos. La a~quimo~ tripsina activa producida por este metoda esta constituida por

233


FIGURA 9-12

Representacion lineal de la conversion del quimotripsinoqeno en quimotripsine, Despui« de la escision de los dos dipeptidos Ser-Arq y Thr-Asn, las

cadenas A. B y C de la quimotripsina

se hallan unidas isnicemente por los puentes -S-S-. Los restos cataliticamente ectivos (en color) proceden de las

dos cadenas.

Quimotripsin6geno

13
16
t: 42
I
S S His
I ~ 57
S
122

136

146
149
S 168
I
S I
182
191
4t Ser 1
195
201 I
S
221 I

245 14 15

147 148 Thr-Asn

)

activaci6n por escisi6n de dipepttdos

S S

S

r: 42
I
S S tHis
I ~ 57
S 146 149
Cadena
B a-Quimorripsina

Cadena

A 13

16

'-- __ -1122

)

.-----1136 146 149

S 166

I Cadena 1------.1

S C S

1821----~

221!- __ _J

245

tres cadenas polipeptidicas que se mantienen unidas mediante dos puentes - S - S -. Ast, los dos rest os especificos que son esenciales para la actividad catalitica, la histidina 57 y Ia serina 195. se hallan situados en dos cadenas diferentes. Sin embargo. se ha podido establecer directamente, mediante analis is por Rayos X de Ia estructura terciaria de Ia quimotripsina, que ambos restos se hallan realmente muy proximos en Ia conformacion del enzima nativo (figs. 9-12 y 9-13).

234

Representacion plegada de la quimottipsine, en la que puede verse como se acercan los restos esenciales en el centro activo, aunque se hallen en cadenas separadas.

Restos cataliticos en el centro activo

FIGURA 9-13

Modelo tridimensional del esqueleto de la cadena polipeptidica de la quimoiripsine, determinado mediante enelisis de rayos X. Los tesios HIs 57 y Ser 195 actuan

en el cielo catalitico. Las ires cadenas polipeptidicBS se representen pot A. B y C. Vease figura 9-12. [Reproducido de

B. W. Mathews. P. B. Sigler, R., Henderson y D. M. Blow, Nature. 214: 652 (1967) J.

Capitulo 9 Enzimas: mecanismo, estructure y regulaci6n

Durante mucho tiempo se ha sospechado que el cambio de conformacion en las curvaturas estrechamente plegadas de la cadena polipeptidica puede contribuir, en cierto modo. al proceso catalitico. De hecho, muchos enzimas experimentan un cambio de conformacion durante su cielo catalitico, como puede determinarse por medidas de rotacion optica (pag. 154). Ademas, el analisis por difraccion de rayos X muestra que la conformacion de la carboxipeptidasa libre es significativamente diferente de la de carboxipeptidasa saturada con un sustrato perezoso como por ejemplo gliciltirosina.

Existen diferentes puntos de vista sobre el significado de estas diferencias de conformaclon entre el enzima libre y el combinado. Uno de ellos sostiene que una vez que el sustrato se ha unido al centro activo en una relacion complementaria como la de la lIave y la cerradura, se produce un cambio de conformacion que impone 'una tension sobre la molecula del sustrato, algo parecido a un potro de tortura medieval. El Inconveniente de esta hipotesis es que si e1 centro activo posee una estructura rigida como la que implica la analogia de la Have y la cerradura, no podra adaptarse a ambos, al sustrato y a los productos de una reaccicn reversible, de un modo optimo. Este dilema ha conducido a otras hipotesis. Una de elIas es que el centro activo del enzima libre no encaja exactamente ni con el sustrato ni con los productos, sino unicamente con las especies del estado de transicion. Es evidentevsegun este punto de vista, que algunos enzimas son inhibidos muy potentemente por compuestos que se parecen especificamente a los del estado de transicion en lugar de guardar semejanza con la molecula de sustrato libre.

Otra idea es la hipotesis de la adaptaci6n 0 encaje inducido de Koshland, que fue postulada para explicar cierto numero de anomalias observadas en la accion de los enzimas. Muchos enzimas, por ejemplo, son incapaces de actuar sobre homologos inferiores de su sustrato normal. El punto queda aelarado mejor por Ia hexoquinasa que cataliza la reaccion.

ATP + n-qlucosa ~ ADP + glucosa~6~fosfato

235


Como la hexoquinasa puede Iosforilar al grupo hidroxilo 6 de varias hexosas, podria esperarse que fuese capaz de utilizar moleculas de sustrato menores que la glucosa. Pero la hexoquinasa no puede Iosforilar hom61ogos inferiores de la glucosa tales como el gliceraldehido ni alcoholes mas sencillos como la glicerina. el etanol 0 aun el aqua, la cual por su pequefio tamafio y su concentraci6n muy elevada en un sistema acuoso, aproximadamente de 55 M (pag. 48), podria esperarse que penetrase con facilidad en el centro activo y actuase como un aceptor muy eficaz de grupos fosfato procedentes del ATP. ;E:stas y otras consideraciones condujeron a Koshland a postular que los grupos funcionales esenciales situados en el centro activo del enzima libre no se hallan en sus posiciones 6ptimas para prom over la catalisis cuando . dicho centro activo no esta ocupado, pero que cuando la molecula del sustrato se encuentra unida al enzima, la afinidad de enlace obliga a la molecula del enzima a adoptar una confermaci6n en la que los grupos cataliticos adquieren una posici6n geometrica favorable para formar el estado de transici6n; es decir, se produce un encaje 0 ajuste inducido (fig. 9~ 14). La molecula del enzima es inestable en esta conformaci6n activa y, en ausencia del sustrato, tiende a recuperar su forma libre. Un mal sustrato, es decir, uno que se una al centro activo con poca afinidad, es menos capaz de forzar a la molecula del enzima a adoptar su forma de maxima actividad debido a que 0 bien es demasiado pequefio, 0 bien posee propiedades estericas inadecuadas. Ello explica por que el agua, que se halla habitualmente en concentraci6n de 55 M, no puede competir con el sustrato normal, la glucosa. en la reacci6n catalizada por la hexoquinasa.

Los cambios de conformaci6n inducidos que se producen cuando la molecula del sustrato esta Iiqada, pueden ser tambien un factor significativ~ en el incremento de velocidad de la reacci6n de los enzimas. Es probable que distorsionen tanto al enzima como al sustrato y sean la causa de que ambos alcancen el estado de transici6n mas facilmente.

Despues de haber revisado los cuatro factores principales que pueden contribuir a la eficacia catalitica de los enzimas, [podemos establecer la contribuci6n de cada uno de ellos mas cuantitativamente? Probablemente ninquno de los Iactores puede, por si solo, responder de la actividad catalitica completa de todos los enzimas, y 10 que es mas probable es que para cada enzima haya una combinaci6n de factores especifica, responsable de la aceleraci6n global de la velocidad de reacci6n. Los calculos efectuados por W. P. Jencks y colaboradores indican que una combinaci6n de los facto res de proximidad y de orientaci6n podrian proporcionar un incremento de velocidad de hasta lOS, 10 cual se acercaria mucho a una justificaci6n de la eficacia catalitica de algunos enzimas. EI establecimiento de un contacto intimo entre el sustrato y el grupo catalitico y su mutua orientaci6n con un anqulo precise, puede reducir 10 suficiente la Iibertad para efectuar movimientos de translaci6n y de rotacion, es decir, su entrepia, podria reducirse 10 suficiente como para permitirles alcanzar el estado de transici6n con facilidad). La catalisis covalente y la catalisis acido-base son muy importantes en la acci6n enzimatica, pero contribuyen probablemente a incrementos relativamente pequefios, no superiores quizas a 103•

236

FIGURA 9-14

Hipotesis del acoplamiento inducido.

Se postula que el centro activo es flexible y ajusta su . conlormecton a la de le molecule del sustreto,

Sustrato

+

Centro 0

activo

(forma relajada)

1l

Complejo enzimasustrato que muestra el acoplamiento inducido

del centro activo al sustrato.

Centro activo (forma inducida) .

FIGURA 9-15

Uno de los mecanismos propuestos para la eccion de la quimotripsina sobre un dipeptido. Constituye solemente una de

las muchas hipotesis para explicer las etapas de le cetelisis co oelenie, que van indudablemente acompafiadas pOl' otros ejectos conducentes el incremento de

le oelocided.

Sustrato dipeptidlco

H 0 H R

I II I I' R-C-C-N-CH-COO-

I

+NH3

Ser 195 His 57

Proteina Proteina

Quimotripsina libre

Capitulo 9 Enzimas: mecanismo. esitucture y requlecion

Ademas de los factores principales estudiados anteriormente, se ha observado tambien que en algunos enzimas la cavidad en que se halla situado el centro activo es relativamente no polar, de modo que el centro catalitico se halla rodeado de un entorno dielectrico debil. La consecuencia es que se polariza no solo el grupo catalitico sino tambien el enlace susceptible del sustrato, haciendo que ambos exhiban mayor reactividad. Esta circunstancia puede contribuir, tambien, al incremento total de velocidad provocado por algunos enzimas.

Algunos mecanismos de reaccion

en los centres activos de los enzimas

Aunque todavia no se conoce con detalle el mecanismo catalitico de ninqun enzima, se estan realizando grandes avances en esta direccion gracias a estudios cineticos y especificos, al anal isis quimico de los centros activos de los enzimas, y a la comparacion mediante rayos X de las estructuras de algunos enzimas y de sus complejos con sustratos perezosos 0 con inhibidores competitivos.

La quimotripsina constituye un ejemplo bien estudiado. Su actividad depende de los restos His 57 y Ser 195, que se haHan muy cercanos en el centro activo. Ademas se forma un intermediario acil-enzima que implica al grupo hidroxilo de la Ser 195. Este dato se ha utilizado, junto con otros mas para formular un mecanismo de reacci6n para la hidrolisis de un enlace peptidico por la quimotripsina. Sequn una primera hip6tesis (fig. 9~ 15), e1 grupo imidazol de la His 57 actuando como una base general provoca el ataque nucleofilico del grupo

EI proton es transferido muy repidemenie desde

le Ser 195 el nitrogeno imidezolico

de le His 57. Se forma trensitoriemente un enlace de hideoqeno entre el imidezol y el sustreto que sittie el dipeptido para el ataque nucleofilico del oxigeno de la serine sobre el atomo de cerbono cerboxilico del sustrato.

H 0 H R

I II I I'

R -C-C--N-CH-COO-

I :

+NH3{ \

0- iI-N~NH I

CH2

EI grupo hidroxilo

de le Ser 195 se une mediante enlace de hidroqeno el nitrogeno imidezolico

de la His 57.

Producto

R

I +

H-C-NH

I 3

C=O

I

o

I

CH2

Producto 2

R

I + H-C-NH3 I

COOH

H,O __..

O-H .... :N~NH I

CH2

Ser 195 His 57

Proteina Protein a

Acil-

quimotripsina

EI grupo amino-

ecilo es desplazado del dipeptide: el grupo saliente es el aminoecido Csterminel del sustreio,

Quimotripsina

libre

EI grupo ecilo

es desplezedo de la Ser 195 pot: el H20 reqenerendose, de este modo. el enzima libre.

237


FIGURA 9-16

Estructura y modo de actuaci6n postulados para el complejo lisozimesustreto. El dibujo inferior muestre los esqueletos de la molecule

de lisozima {linees perceptlbles en primer termino y posteriotes coloreadas) y de la molecule. del sustreto (de color mas intense] en

el complejo cristelino. (Los esquemas de esta pagina y de la contigua han sido reproducidos con la eutorizecion de R. E. Dickerson y I. Gels, The Structure and Action of Proteins. W. Benjamin. Inc. Menlo

Park. California. Copyright. 1966 by Dickerson y Geis. Coordenadas

pot dejerencie de D. C. Philips. Oxford.)

hidroxilo de la Ser 195 sobre el atomo de carbono carboxilico del grupo aminoacilo del sustrato, desplazando asi al grupo amino del otro aminoacido, el grupo saliente, y provocando la formaci6n del derivado aminoacilado del grupo hidroxilo de la Ser 195. En la segunda etapa de este doble desplazamiento, que es el inverso del primero, el grupo imidazol de la His 57 promueve la transferencia del grupo aminoacilo desde

238

La empliecion inferior muestra el mecanismo postulado de le eccion de le lisozima. Aparece solamente una parte

de le molecule del sustrato (en color).

EI anillo D es un resto del acido Nsecetilmursmico (pag. 275) y el anillo

E es un resto de N-acetilglucosamina.

En la figura superior un atomo de hidrogeno del resto Glu 35 ataca el oxigeno gll1cosidico situado entre los dos restos

i:le azricar. En la Figura iniermedie el iltomo de carbono 1 del anillo D se transforma en un ion cerbonio que resulta estabilizado pot: el grupo carboxilo

vecino del Asp 52; el anillo D se tuerce y adopta una coniormecion de media

sills, Lln ion hidroxido (procedente de una molecule de agua) ataca al ion carbonio completando la escision

(figura inferior).

asp'\. /0

52 \:

o

/H

o

l>H H_O~~gIU

/ ~ 35

o

.......... H 0_

H

d'-""'.. .--A glu f ~35

o

0..-/

asp I\.. ....... 0

52 '\"

o

H-O

H

\

O~~

o

Capitulo 9 Enzimas: mecenismo, esttuctute y requlecion

el grupo hidroxilo de la serina del enzima al segundo sustrato, el aceptor de grupos aci1o, que es el agua en este caso, pero que tambien puede ser un alcohol un aminoacido 0 una amina (paq. 225). Aunque existe un gran numero de datos que apoyan este mecanismo de reaccion (fig. 9~15) no son suficientes, tal como se ha formulado, para explicar las elevadas velocidades cataliticas provocadas por la quimotripsina; es probable que los facto res de proximidad, de orientacion y tension, deban superponerse sobre e1 mecanisme de desplazamiento nucleofilico de catalisis basica general.

La lisozima es otro enzima cuyo mecanisme de catalisis esta en estudio. EI analisis de este enzima cristalizado por rayos X muestra que contiene una larga hendidura, identificada como su centro activo (fig. 9~ 16), a la cual puede acomodarse su sustrato normal, el peptido-glucano de cadena larga, presente en las paredes celulares bacterianas. La liso ... zima forma complejos enzima-sustrato con ciertos sustratos perezosos 0 con inhibidores competitivos (pag. 203) que son estructuralmente semejantes al sustrato normal; estos se unerr especificamente a la hendidura pero no son atacados por el enzima. Se ha cristalizado un complejo enzima-sustrato de la. lisozima analizandose su estructura por rnetodos de rayos X. En la figura 9~16 se percibe claramente la estructura de su centro activo en relaci6n con el enlace susceptible de la mole-s cula del sustrato. Es de la mayor importancia la identificacion del grupo carboxilo del res to glutamico 35 y del grupo carboxilo del resto de aspartico 52 que residen en la hendidura, pr6ximos al enlace que se va a escindir: de este modo los grupos aceptores y dadores de protones parecen actuar en un

FIGURA 9-17

Representacion esquemtdio« del centro activo de la carboxipeptidasa. EsM constituido POl' una fisura capaz de acomodar a los seis restos C-terminales del substrato polipeptidico y POl' una bolse que acepta el grupo R del resto C-terminal. Los testes Tyr 248, Arg 145, Glu 270 y el atomo de Zn2+ unido del enzima sitrian a le molecule del sustrato

en posicion adecuada .

Flsura para el

sustrato

(Ia molecula

del sustrato

en color)

239


mecanisme catalitico acido-base general de caracter concertado. Resulta tambien interesante. el hecho de que el resto glutamico 35 se halle rodeado por grupos R no polares, 10 cual podia esperarse que aumentara las transferencias de protones.

La carboxipeptidasa, una exopeptidasa que cataliza la hidrolisis del enlace peptidico C~terminal de los peptidos, posee un centro activo en forma de orificio 0 de cavidad en cuyo interior el resto Cvterminal del sustrato polipeptidico se acopla por el extremo. Esta cavidad contiene un atomo de cine, as! como los grupos R caracteristicos de los restos Arg 145. Tyr 248 y Glu 270. Estos grupos se hallan situados de tal modo en el centro activo. sequn se deduce por el analisis con rayos X. que la hidrolisis del enlace peptidico del aminoacido Cstermfnal del sustrato se ve facilitada (fig. 9~17).

Aunque casi todos los enzimas cuyas estructuras han sido determinadas por el rnetodo de rayos X son hidrolasas, se ha establecido ya la estructura de la lactato-deshidroqenasa, enzima intracelular que cataliza una reaccion de oxidacion-reduccion bisustrato ordenada. Mas adelante (pags. 251 y 494) se describen las propiedades generales de este enzima, la estructura de su centro activo y el mecanisme que se postula.

Enzimas reguladores

Todos los enzimas exhiben diversas caracteristicas, que puede pensarse que constituyen elementos de la requlacion de sus actividades en las celulas vivas. Todos ellos poseen un pH optimo caracteristico, que hace posible la alteracion de sus velocidades cataliticas con los cambios de pH intracelulares. Las velocidades de todas las reacciones enzimaticas dependen tambien de la concentracion del sustrato, que puede varia! significativamente en las' condiciones que prevalecen en el interior de las celulas. Ademas, muchos enzimas precisan de iones metalicos como Mg2+ 0 K+. 0 de coenzimas (pag. 343) para su actividad, indicando que las fluctuaciones en la concentracion de estos metales 0 coenzimas en la celula pueden regular la actividad del enzima. Sin embargo. ademas de estas propiedades comunes a todos los enzimas, algunos de ell os poseen otras, que les confieren especificamente papeles requladores del metabolismo. Estas formas, mucho mas especializadas, se denominan enzimas reguladores. Existen dos tipos principales de enzimas reguladores: 1) los enzimas elostericos, cuya actividad catalitica es modulada por la union no covalente de un metabolito especifico a un centro de la proteina distinto del centro catalitico, y 2) los enzimas modulados cooslentemente, con formas activas e inactivas interconvertidas por la accion de otros enzimas. Algunos de los enzimas de esta segunda c1ase responden tarnbien a moduladores alosteric os no covalentes. Ambos tipos de enzimas reguladores son responsables de alteraciones en el estado metabolico de la celula 0 del tejido en un intervalo de tiempo relativamente corto (los enzimas alostericos en un intervalo de sequndos, y los regulados covalentemente en unos minutos). Exammaremos. a continuacion, las propiedades de estas c1ases de enzimas reguladores.

240

FIGURA 9-18

Retroinhibicion de le [ormecion de isoleucine a partir de le treonine.

La isoleucine, producto final de le secuencie, inhibe el primer enzima El [treonin-deshidretese}, Los enzimas que catalizan las etapas intermedies vienen represeniedos por E,. E,. E4 Y E,.

Los metabolitos intetmedios de le secuencie, es decir, el a-oxo-butireio, el a-ecetohidroxibuiirsto, etc., no inhiben a El•

La retroinhibicion se halla represeniede por la linea de trezos (en color) que conduce desde el producto final a le berre coloreede que etreviese a le flecha en

le reeccion modulede, Esta nctecion

se emplee a 10 largo de todo el libro,

CH3

I HO-C-H

I L-Treonina

H-C-NH2

I COOH

E,

ee-Oxo-butirato + NH, E,lCH,CHO a-Acetohidroxibutirato

a./3-Dihidroxi-/3-metilvalerato

E.l

,a-Oxo-/3-metilvalerato

E.l

CH3

I

CH2

\ I

,--------- HCCH L-Isoleucina

I 3

HCNH2

I COOH

'IGURA 9-19

'Modelos de modulaci6n elosterice, En las tutas lineales el producto final inhibe generalmente al primer enzima de la secuencie. A veces el precursor S puede actual' como modulador positive y estimulet la primera reeccion, tal como muestra

la flecha coloreada. En las tutas ramificadas, el metebolito del punta de ramificacion es, [recuentemente, el retroinhibidor del primer enzime, mientras que los dos productos finales de las remiiiceciones (P, y P2) actuan muchas eeces como tetroinhibidores de los

primetos enzimas siiuedos despues del punta de rsmiiicecion.

Rutas lineales
S ~
,--+,.
A E
t t
B F
! !
c G
I ! !
I
I
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Capitulo 9 Enzimas: mecenismo, estructure y requlecion

Enzimas alostericos

En muchos sistemas multienzimaticos el producto final de la secuencia de reacciones puede actuar como un inhibidor especlfico de un enzima situado al comienzo de la secuencia 0 muy proximo a el, 10 cual determina que la velocidad de la secuencia completa de reacciones resulte condicionada por la concentracion de producto final, en el estado estacionario. EI ejemplo clasico es la secuencia multienzimatica que cataliza la conversion de t-treonina en t-isoleucma. que precede en cinco etapas catalizadas enzimaticamente (fig. 9~ 18). EI primer enzima de la secuencia, Ia t-treontn-deshidratasa. es Iuertemente inhibida por la t-Isoleucina, que es el producto final, pero no 10 es por ningiin otro producto intermedio de la secuencia. Las caracteristicas cineticas de la inhibicion por la isoleucina son atipicas; la inhibicion no es ni competitiva con el sustrato, la L~treonina, ni tampoco no competitiva 0 acornpetitiva. La isoleucina es muy especifica como inhibidor, sin embargo otros aminoacidos 0 compuestos relacionados no inhiben. Este tipo de inhibicion se designa de divers as maneras s inhihici6n por el producto final, inhihici6n feed~back y retroinhibicion. El primer enzima de esta secuencia el cuales inhibido por el producto final, se llama enzima elosterico, nombre propuesto por J. Monod, J. P. Changeux y F. Jacob, del Instituto Pasteur de Paris, que fueron los primeros que desarrollaron una amplia teoria para la funcion de este tipo de enzimas reguladores. El termino alosterico siqnifica «otro espacio» u «otra estructura»; los enzimas alostericos poseen, ademas del centro catalitico, el «otro espacio» al que se enlaza de modo reversible y no covalente el elector 0 moduledor. En general, el centro alosterico es tan especifico para la union del modulador, como el centro catalitico 10 es para la union del sustrato. Algunos moduladores, como por ejemplo la L",isoleucina para la treonin-deshldratasa (fig. 9~ 18) son inhibidores. y por ello se les denomina moduladores inhibidores 0 negativos. Otros enzimas alostericos pueden tener moduladores positivos 0 estimuledotes. Cuando un enzima alosterico posee solarnente un modulador especifico. se dice que es monovalente. Algunos enzimas alostericos respond en a dos 0' mas moduladores especificos. cada uno de ellos unido a un centro especifico del enzima; se dice entonces que son polivalentes. Ademas un mismo enzima alosterico puede poseer tanto moduladores positivos como negativos. Dos 0 mas sistemas multienzimaticos pueden estar conectados mediante uno o mas enzimas polivalentes, constituyendo una red de control (fig. 9~ 19); mas adelante se describen algunos ejemplos (capitulos 23 al 26).

La primera etapa en una secuencia de reaccion multienzimatica, es decir, la etapa catalizada por el enzima alosterico es, por 10 general, irreversible en las condiciones intracelulares. Con frecuencia se Ia designa como reacci6n detetminente: una vez que se ha producido, se verifican todas las demas reacciones subsiguientes de la secuencia, Desde luego, constituye una estrategia por parte de la celula el regular una ruta metabolica en la etapa inicial, para conseguir asi la rnaxima economia de metabolitos.

Los enzimas alostericos poseen, generalmente. pesos moleculares mucho mayores, son mas complejos y con frecuencia

241


mas dificiles de purificar que los enzimas ordinaries, debido a que casi todos los enzimas alostericos conocidos son 01ig6~ meros y poseen, por tanto, dos 0 mas subunidades constituidas por cadenas polipeptidicas, por 10 general en numero par; hay. algunos que contienen muchas cadenas. Los enzimas alostericos muestran cierto mimero de propiedades anornalas. Algu~ nos son inestables a 0 °C, pero estables a temperatura ambiente o a la del cuerpo; en ello se diferencian de los enzimas unicatenarios, que no muestran inestabilidad frente al frio. La mayor parte de los enzimas alostericos exhiben una dependencia atipica de la velocidad inicial de reaccion frente a la concentracion del sustrato y no cumplen la clasica relacion de MichaelisMenten (paqs. 195 y sigs.). Ademas, la inhibicion producida por el metabolito modulador no se ajusta siempre a los bien conocidos prototipos de inhibicion competitiva, no competitiva y acompetitiva.

Los enzimas alostericos muestran dos tipos de control diferentes: heterotropico y homotropico, segiin la naturaleza de la molecula moduladora. Los enzimas heterotropicos son estimulados 0 inhibidos por la molecula de un modulador 0 efector dis tint a de la de sus sustratos. El sustrato de la treonin-deshidratasa es la treonina, mientras que su modulador es la L~iso~ leucina. Por otra parte, en los enzimas homotropicos, el sustrato actua tambien como modulador. Estos enzimas homotropicos contienen dos 0 mas centros de union para el sustrato; la modulacion de estos enzimas dependen de cuantos sean los centros del sustrato que esten ocupados. Sin embargo, una gran parte (si no todos) de los enzimas alostericos son del tipo mixto homotropico-heterotropico sobre los cuales pueden actuar como moduladores, tanto el sustrato como alqun otro metabolito (0 varios).

Cinetice de los enzimes elostericos

Los enzimas alostericos no muestran generalmente la clasica relacion cinetica de Michaelis-Menten entre la concentracion del sustrato, V max y KM, porque su comportamiento cinetico esta muy alterado por las variaciones de concentracion del modulador alosterico, Muchos enzimas alostericos, especialmente los homotropicos, muestran una curva sigmoide al relacionar graficamente la velocidad inicial con la con centra cion del sustrato, en lugar de la hiperbole que aparece en la relacion de Mlchaelis-Menten (fig. 9~20). La curva sigmoidal implica que la union de la primera molecula de sustrato con el enzima intensifica la union de las moleculas de sustrato subsiguientes a los otros centros a los que se fija el sustrato, del mismo modo como la union de una molecula de oxigeno a la hemoglobina intensifica la union de nuevas moleculas de oxigeno (pag. 150). Las curvas sigmoidales son a veces muy inclinadas de suerte que un pequefio incremento de la concentracion del sustrato puede provocar una aceleracion muy gran~ de de la velocidad de catalisis, mucho mayor incluso que el exhibido por un enzima sencillo no regulador que obedezca a la relacion hiperbolica de Michaelis-Menten. Tal relacion siqmoidal constituye un ejemplo de cooperatividad positiva, ya que el enlace de una molecula de sustrato en un centro incrementa la union de las moleculas subsiguientes en los demas centros. Debe aclararse, sin embargo, que no todos los enzi-

242

FIGURA 9-20

Comparaci6n de represenieciones ideeles de porcentaje de saturaci6n de los centres del sustrato frente a concentraci6n de sustrato para (A) un enzima no regulador, (B) un enzima regulador que muestra cooperatividad position y (C) un enzima regulador que muestre cooperatividad negativa.

A. Enzima no regulador que obedece a la ecuecion de velocided de MichaelisMenten {hiperbole rectangular). Se necesite un incremento de 81 veces en

[S J, para que la ectioided pase desde el 10 al 90 pot cienio de la maxima.

100r-------------~=_----

[8]

B. Enzima regulador que muestra una curve sigmoidal [cooperetioided positive}, Solamente se necesite que [S] aumente nueve veces, para que se incremenie

la actividad desde el 10 al 90 por ciento de la maxima.

[8]

C. Enzima regulador que muestra cooperatividad negativa. La concentraci6n del sustrato debe aumentarse unas

6000 veces para que la actividad se eleve desde el 10 al 90 pot ciento de la maxima.

100r---------~~

[8]

Capitulo 9 Enzimas: mecenismo, esttucture y regulaci6n

mas alostericos exhiben curvas sigmoidales al representar Vo frente a [S]; ademas, no todos los enzimas que muestran tales curvas son necesariamente alostericos.

Algunos enzimas alostericos muestran un comportamiento opuesto: la union de una molecula de sustrato provoca un descenso en la union de las moleculas de sustrato subsiquientes. El hecho se designa por el nombre de cooperatividad ne~ gativa, la cual da por resultado una curva mas aplanada en la representacion de la velocidad inicial frente a la concentracion del sustrato (fig. 9~20). En este caso, el enzima es mucho menos sensible a cambios pequeiios de concentracion del sustrato, y se aproxima a la saturacion mucho mas lentamente que los enzimas no reguladores 0 que los de cooperatividad positiva.

Algunos enzimas alostericos responden a la union de un modulador con un cambio en el valor de la KM aparente para el sustrato sin que varie la V max (fig. 9~20). Un modulador negativo producira entonces un incremento en la KM aparente y un modulador positivo un descenso de dicho valor. [Se emplea agui e1 termino «KM aparente» para desiB'nar unicamente la concentracion de sustrato con la que se obtiene la mitad de la velocidad maxima; este valor no puede emplearse para calcular la velocidad inicial de un enzima alosterico, ya que la representacion de Vo frente a [S] no es una hiperbole rectangular tal como requieren la hipotesis y ecuaciones de MichaelisMenten, (pag. 195)]. Por tanto, un modulador negativo disminuira la velocidad de reaccion a una concentracion de sustrato no saturante y constante, mientras que un modulador positive producira un incremento de la velocidad. Los enzimas alostericos que responden a los moduladores positivos 0 neqativos con un cambio en el valor de la KM aparente, pero sin que varie el valor de V max· reciben, a veces, el nombre de enzimas K (fig. 9~21). Inversamente, los enzimas alostericos que muestran un cambio en el valor de V max en respuesta al modulador sin que varie el valor de la KM aparente, se llaman enzimas M; existen menos ejemplos de esta clase. Sin embargo. no todos los enzimas alostericos pueden situarse en una de estas dos clases. Desde un punto de vista general, la interpretacion de las propiedades reguladoras de los enzimas alostericos, deducida de las representaciones de la velocidad inicial frente a la concentracion del sustrato, solo es bioloqicamente significativa, en el intervalo mas inferior de concentraciones de sustrato, ya que las concentraciones de los metabolitos en las celulas intacta:s estan muy por debajo de los niveles de saturacion de los enzimas que actuan sobre ellas (pag. 218).

La capacidad de un enzima alosterico para ser activado, 0 inhibido, por sus moduladores especificos puede ser abolida, a veces, sin que se lesione su actividad catalitica, muchas veces por medio de calefaccion suave, por exposicion a la urea 0 bien tratando el enzima con un agente que produzca una modificacion quimica del centro modulador. Se dice entonces, que el enzima se ha desensibilizado. Un enzima alosterico desensibilizado no solamente pierde su sensibilidad frente a los moduladores, sino que puede incluso mostrar una cinetica normal de Michaelis-Menten. Las mutaciones geneticas producen, en ocasiones, la biosintesis de un enzima alosterico defectuoso no sensible frente a su modulador normal, pro-

243


FIGURA 9-21

Electo de moduladores positives (aceleradores) y negativos [inhibidores} sobre las curvas de Vo [rente a [S 1

en los enzimas elostericos de las

clases K y M.

A. Enzimas K. Estos enzimas respondeti a las concentreciones crecientes de los moduladores ecelerenies, con un descenso de la KM eperente, y al incremento

de las concentreciones de los moduladores inhibidores, con un incremento de la

KM epetente, de modo que a una concentraci6n lija no saturante del sustreio, la velocidad de reacci6n aumenta en presencia de un modulador acelerante

y disminuye en presencia de un modulador inhibidor, La V max de los enzimas K petmenece constante.

B. Enzimas M. Estos enzimas experimentan cambios en su V max. pero no en el valor de su KM eperente, en presencia de moduladores aceleradores e inhibidores. Los tetminos KM y V max no pueden eplicerse en rigor a los enzimes elostericos que no obedecen a la telecion hipetbolice de Micheelis-Menten, se emplesn aqui solamente para designar la concentraci6n de sustrato con la que se obtiene la mitad de la velocidad maxima y dicha velocided, maxima, respectioemente,

244

Efecto

del modulador

1

Efecto de un modulador inhibidor para concentraciones

i y 2i

Concentracion de sustrato que produce Yz V max en ausencia de modulador

[8]--'"

Efecto

del modulador acelerante para las concentraciones a y 2a

1

Efecto de un modulador inhibidor para concentraciones i y 2i

[8]--+-

Capitulo 9 Enzimas: mecenismo, esttucture y requlecioti

bablemente por haberse producido una sustituci6n no funcional de un resto aminoacido critico.

Aspetteto-trenscerbemilese: Cinetice e lnhibicion

Aunque se conocen muchos enzimas alostericos, el mejor conocido es la aspartato~transcarbamilasa de E. coli, que con frecuencia se designa abreviadamente ATCasa (el nombre re .. comendado por la EC es aspartato~transcarbamiltransferasa). No debe ser considerada como tipica de todos los enzimas alostericos, sino solo como representante de una clase.

El enzima cataliza la reacci6n

Fosfato de carbamilo + r-aspartato ~ N~carbamil~L~aspartato + Pi

que es una etapa inicial en la biosintesis enzimatica del nucle6tido de pirimidina llama do trifosfato de citidina (CTP) y que se discutira mas adelante (paq. 746). El CTP, producto final de est a secuencia biosintetica, es el modulador negativo especifico de la ATCasa; el difosfato de citidina (CDP) y el monofosfato de citidina (CMP) no poseen actividad. La A TCasa tiene tambien un modulador positivo, el A TP, el eual invierte el efecto inhibidor del CTP. La figura 9~22 muestra el efecto de la eoncentraci6n de aspartato sobre la actividad de la A TCasa sola y en presencia de sus moduladores, A TP y CTP. Este ultimo produce el incremento del valor de KM aparente del enzima, mientras que el A TP 10 disminuye.

La ATCasa de E. coli ha sido aislada y estudiada con gran detalle por J. C. Gerhart. A. B. Pardee y H. K Schachman en los Estados Unidos y por KW eber en Alemania. entre otros. Su peso molecular es de alrededor de 310 000, pero puede disociarse por tratamiento con reactivos de mercurio para dar dos subunMades cataliticas identicas y tres subunidades reguladoras tambien iguales. Cada una de las dos subunidades cataliticas posee un peso molecular de alrededor de 100000 y contiene tres cadenas polipeptidicas cuyo peso molecular es 34000. llamadas cadenas C. Cada subunidad catalitica eontiene tres centros de uni6n para el sustrato aspartato, uno en cada una de las tres eadenas. Las subunidades cataliticas poseen actividad enzimatica pero no son sensibles al modulador CTP. Cada una de las tres subunidades reguladoras, que no poseen actividad catalitica, contiene dos cadenas polipeptidicas (eadenas R), cuyo peso molecular es 17000; un atomo de Zn2+ se halla unido a cada una de las cadenas R. Cada subunidad regula dora puede unir dos moleculas del modulador CTP una a cada una de las dos cadenas R.

Cuando la molecula de la ATCasa nativa se disocia en una mezcla de subunidades cataliticas y reguladoras, la mezcla retiene actividad catalitica, pero la reacci6n no es inhibida por el CTP en tanto que las subunidades cataliticas y reguladoras se halleri separadas unas de otras. Para que se produzca la inhibici6n por CTP. las subunidades cataliticas y requladoras deben estar Iisicamente asociadas en la molecula de A TCasa oliqomerica intacta. Asi, la uni6n del CTP a las subunidades reguladoras disminuye la actividad enzimatica de

245


FIGURA 9-22

Propiedades de fa esperteto-trsnscerbemilasa. Representecton de fa velocidad iniciel Vo [rente a fa concenirecion de esperteto. Si fa concentrecion de aspartato se mantiene a nivel constante muy

pot debajo de la concentrecion de seturecion, la edicion del modufador negativo CTP disminuye la actividad del enzima, porque la KM aparente resulta aumentada. lnoersemente, si se afiade ATP. moduledor positivo, aumenta la actividad del enzima porque disminuye el valor

de KM eperenie,

Representacion esquematica de la estructure en subunidades del enzima que se disocia por tratamiento con Hq" an dos subunidades cataliticas trimeres y en tres subunidades reguladoras dimeras

(en color). Estas pueden disocierse mas tarde para dar un total de seis cadenas C monomeras y seis cadenas R tembien monomeras. Cada una de estas subunidades puede existir en dos conformaciones, indicadas mediante circulos y cuadrados.

La coniormecion activa de le ATCasa se representa pot circulos, y la conjormscion inactiva, inducida poria union del CTP

a las subunidades reguladoras, viene indicada mediante cuadrados.

Vmh

Con CTP

/" KM aparente

[Aspartato]

Estructura en subunidades

~ ~

~

+ .....

Molecule de enzima intacta (forma activa)

Subunidades cataliticas (trtmeros)

Subunidades reguladora [dimeros]

Transici6n de la conformaci6n

~ ~

CTP _____....

~ ATP

Conformaci6n activa

Conformaci6n inactiva

las subunidades cataliticas asociadas. Se cree que esta sefial es transmitida mediante un cambio de conformaci6n; en efecto, es creencia general que cuando el CTP se une a sus centres especificos, las subunidades reguladoras experimentan un cambio de conformaci6n que se transmite estericamente a las subunidades cataliticas. Estas experirnentan, a su vez, una transici6n cooperativa desde una conformaci6n cataliticamente act iva a otra que muestra menor actividad, a una misma concentraci6n de sustrato. La figura 9~22 resume el comportamiento cinetico de la ATCasa y su modulaci6n por el efector negativo CTP y por el efector positivo A TP mediante cambios de conformaci6n cooperativos. La ATCasa puede ser representativa de aquellos enzimas alostericos cuyos centres de enlace del sustrato y del modulador se hallan sft-.uados sobre subunidades diferentes. Existen otros enzimas alostericos cuyos dos centres estan presentes en la misma subunidad. Existen incluso otros enzimas alostericos que no poseen mas que una sola cadena polipeptidica.

246

Capitulo 9 Bnzimas: mecenismo, esttucture y tequlecion

Una caracteristica importante de la ATCasa, asi como de otros enzimas alostericos, es que el modo como se ejerce su requlacion alosterica es especifico de la especie. Aunque la A TCasa de E. coli y de algunas otras bacterias es Iuertemente inhibida por el CTP y estimulada por el ATP, la A TCasa correspondiente a los tejidos animales no se ve afectada por ninguno de los dos nucleotidos (pag. 747). Los enzimas alostericos homoloqos de diferentes especies y orqanismos pueden tener moduladores alostericos completamente diferentes.

Mecanismo de le ectioided requledore de los enzimes elosteticos

Se ha dedicado mucha at en cion a los mecanismos moleculares mediante los cuales la union del modulador al centro requlador de un enzima alosterico puede alterar la actividad del centro catalitico. Una de las rutas mas fructiferas de investiqacion y de especulacion ha surgido merced a las notables analogias funcionales existentes entre los enzimas alostericos y la hemoglobina (pag. 148), en particular por la semejanza de la relacion sigmoidal entre la concentraci6n de sustrato y la velocidad inicial de algunos enzimas alostericos por una parte, y por otra, entre la concentracion (presion parcial) de oxigeno y su capacidad de union a la hemoglobina.

Hemos visto (paq. 151) que se han propuesto dos tipos de modelos para las interacciones cooperativas de las subunidades de la hemoglobina: el modelo secuenciaL propuesto por D. E. Koshland y el modelo de s,imetria de J. Monod y colaboradores. Ambos modelos son tambien aplicables a los enzimas alostericos que poseen multiples subunidades, y que se sup one existen en dos con formaciones diferentes. La fiqura 9~23 muestra la aplicacion de estos modelos a un enzima homotropico alosterico que posee cuatro subunidades, cada una de ellas capaz de unir una molecula de sustrato, con una relacion sigmoidal entre la con centra cion del sustrato y la actividad (vease fig. 9~20). De acuerdo con el modelo de si~ metria, la union de la primera mole cuI a de sustrato incrementa la tendencia de las restantes subunidades a experimentar transicion a la forma de elevada afinidad a traves de un efecto de todo 0 nada, hallandose todas. las subunidades 0 bien en estado de baja afinidad 0 en la forma de afinidad elevada (fig. 9~23).

EI modelo secuencial tam bien postula que las subunidades cataliticas poseen dos estados de conformacion. pero difiere del modelo de simetria en que postula que las subunidades pueden experimenter cambios secuenciales indioidueles en su conformacion: entre los estados extremes, todas en una conformacion, 0 todas en la otra, pueden existir diversos estado~ de conformacion intermedios de la molecula del enzima, cad a uno de los cuales con su propia actividad catalitica intrinseca (fig. 9~23). El modelo secuencial ofrece, asi, la posibilidad de una sintonizacion 0 modulacion mas fin a de la actividad del enzima alo~rico que la que podria proporcionar el modelo simetrico.

Se han propuesto otros tipos de mode1os para interpretar la modulaci6n caracteristica y la cinetica de varios enzimas alostericos. Algunos investigadores creen que no podra en-

247


FIGURA 9~23

Dos modelos para la interconversion de las [ormes active e inective

de los enzimas elosteticos, En el modelo simetrico, 0 de todo 0 nada (oeese tembien fig. 6~23), se postula que todas las subunidedes se hallan en la misma conlormecion: 0 bien todas como 0 (baja afinidad),

o todas como 0 (afinidad eleveda}. Segrin el equilibria, K" entre las [ormes 0 y las 0, la union de una 0 mas molecules de sustreto (S) empujere el equilibtio hacia la forma Dono. La ruta probable se halla indicada por el sombreedo gris. En el modelo secuencisl cada subunided individual puede hallarse bien en la forma 0 0 0 de la proteine oliqomerice. Es posible, de este modo, un gran nrimero de coniormeciones, pero la ruta sombreada mostrada por las [leches en diagonal. es le mas probable.

Modelo de simetria

Modelo secuencial

+S

~t

S+~

Jt

m+4S ~t

~+3S Jt

4S +

3S +

2S +

+2S

contrarse ninqun modelo sencillo que permita explicar la conducta de todos los enzimas alostericos: otros sostienen la idea de que puede bastar un modelo sencillo. Para interpretar el comportamiento cinetico tan complejo de algunos enzimas alostericos, se ha postulado que sus subunidades experimentan interacciones conformacionales muy lentas.

Modulaci6n covalente de los enzimas reguladores

En la segunda clase de enzimas reguladores, las Iormas activa e inactiva son intereonvertidas por modificaciones covalentes de sus estrueturas que son eatalizadas por otros enzimas. EI ejemplo clasico de este tipo de enzima regulador es la glucogeno-fosforilasa de los tejidos animales, la eual cataliza la degradaci6n del polis acari do de reserva gluc6geno, polimero de la glucosa (pag. 272), para rendir glueosa-l-fosfato:

(Glucosa); + Pi ~ (glueosa}n_' + glucosa-l-fosfato

Gluc6geno

Molecula de gluc6geno acortada

Este enzima, cuya funci6n bio16gica se estudiara mas adelante [paqs. 444 y 659), existe en dos formas: la fosforilasa a, que es la forma mas activa, y la fosforilasa b. que es la forma

248

FIGURA 9-24

Modulacion de la ectioidad de la glucogenofosforilasa por modiiicecion covelenie.

La forma ective del enzima, fosforilasa a, que es un tetremero, es desfosforilada enzimaticamente por fa fosforilasa-fosfatasa para rendir la fosforilasa b inective,

que es un dimero, Por eccion de la fosforilasa-quinasa se regenera la fosforilasa a mediante la fosfor-ilacion

de cuatro restos de serine especijicos

a expensas del ATP.

p

Fosforilasa a (activa)

co

+

Fosforilasa b (inactiva)

co

Capitulo 9 Enzimas: mecanismo, esttucture y requlecion

menos activa. La fosforilasa a es una proteina oliqomerica que posee cuatro subunidades principales (fig. 9~24). Cada subunidad contiene un resto de serina que esta fosforilado en su grupo hidroxilo: los grupos fosfatos son necesarios para la plena actividad catalitica. Estos grupos fosfato presentes en la fosforilasa a, pueden separarse mediante hidrolisis catalizada por el enzima fosforilasa~fosfatasa,

Fosforilasa a + 4HlO

fosforllasa fosfatasa

2 fosforilasa b + 4Pi

La separacion de los grupos fosfato provoca que la Iosforilasa a se disocie en dos semimoleculas. la fosforilasa b, que son mucho menos activas que la fosforilasa a en la escision del glucogeno.

La fosforilasa b, relativamente inactiva, puede reactivarse y formar de nuevo fosforilasa a, por accion del enzima [osiorilasa~quinasa, que cataliza la fosforilacion enzimatica de los restos de serina a expensas del A TP:

fosforilasa

4ATP + 2 fosforilasa b __;,qu_in_as_a~ 4,ADP + fosforilasa a

La actividad de la fosforilasa del glucogeno es regulada, de este modo, por la accion de dos enzimas que desplazan el equilibrio entre sus form as activa e in act iva (fig. 9~24).

El segundo atributo notable de la fosforilasa del glucogeno y de otros enzimas reguladores semejantes, modulados por modificacion covalente, consiste en que pueden amplificar mucho una sefial quimica. Todos los enzimas pueden llevar a cabo amplificaciones; es decir, una molecula de un enzima puede catalizar la formacion de millares de moleculas del producto de un sustrato determinado en un periodo de tiempo dado. Pero de 10 que se trata ahora es de que un enzima actua sobre otro enzima como sustrato suyo. Una molecule de la fosforilasa-quinasa puede convertir a mill ares de moleculas de la fosforilasa b inactiva en la fosforilasa a activa, la cual, a su vez, cataliza la produccion de millares de moleculas de glucosa~l~fosfato procedentes del glucogeno. La fosforilasa-quinasa y la fosforilasa constituyen una cascada de am~ plificaci6n con dos escalones. Veremos mas adelante (pag. 823) que ambos enzimas son realmente elementos integrados en una cascada mayor, con dos fases de amplificacion ulteriores, cuya funcion hioloqica consiste en amplificar una sefial muy pequefia producida por unas cuantas moleculas de la hormona adrenalina transformandola en una deqradacion relativamente masiva de glucogeno en el tejido.

Se conocen hasta el momento, dos tipos de modificacion quimica implicados en los enzimas reguladores modulados covalentemente. La fosforilasa y algunos otros enzimas, son modulados por la transferencia de un grupo fosfato desde el A TP al enzima para rendir un fosfoenzima. El otro tipo de modificacion covalente se realiza gracias a la transferencia de un grupo adenililo desde el A TP al enzima, como ocurre en la requlacion de 1a glutamina~sl'ntetasa de E. coli, que cataliza la reaccion

ATP + glutamato + NH3 .~ ADP + glutamina + Pi

249


La glutamina~sintetasa es convertida desde su forma relativamente act iva a su forma menos activa por la transferencia de grupos adenililo desde el A TP a rest os de tirosina especificas de cada una de las 12 subunidades del enzima, con 10 que se forman derivados covalentes adenilados de los grupos hidroxilo fenolicos de las tirosinas. El enzima puede desadenilarse tambien enzimaticamente, a su forma activa. Las complejas propiedades reguladoras de este enzima se des crib en detalladamente mas adelante (pag. 707).

Activacion covalente de los zimogenos

Un tipo de regula cion de la actividad enzimatica algo diferente. es la activacion catalizada enzfrnaticamente de los precursores inactivos de los enzimas (zimogenos) para dar las formas cataliticamente activas. Los ejemplos clasicos son los enzimas digestivos pepsina, tripsina y quimotripsina (pag. 108), que se sintetizan como zimoqenos inactivos pepsinogeno, tripsinogeno y qUimotripsinogeno, respectivamente. Cuando estos enzimas son secretados al tracto gastrointestinal, se transforman en sus formas activas mediante la escision hidrolitica selectiva de uno 0 varios enlaces peptidicos de la molecula del zimoqeno. El pepsinogeno se convierte en pepsina activa en el estomaqo por accion de la pepsina libre a pH bajo, que libera 42 restos aminoacidos en forma de una mezcla de peptidos, procedentes del extreme N -terminal del pepsinogeno:

P .• pepsma • id

epsmogeno --~ pepsina + pepti os

El tripsinoqeno se convierte en tripsina activa por eliminacion de un hexapeptido del extremo N -terminal, por la accion del enzima enteroquinasa:

Tripsinogeno enteroquinasa) tripsina + hexapeptido

La conversion del quimotripsinoqeno en quimotripsina act iva se produce por la actuacion de la tripsina, la cual provoca la eliminacion de dos fragmentos dipeptldicos, tal como se describio con anterioridad (pag. 234):

Quimotripsinogeno tripsina quimotripsina + 2 dipeptidos

Estos -zlmoqenos se yen impedidos de ejercer su actividad proteolitica sobre las proteinas intracelulares en tanto que permanecen en el interior de las celulas en las que han sido sintetizados. Solamente se haIIan en disposicion de generar la forma activa cuando son secret ados al tracto gastrointestinal. Sin embargo, este tipo de requlacion covalente solo se realiza en una sola direccion: no se conocen reacciones enzimaticas que puedan transformar de nuevo a estos tres enzimas en sus formas zimogenas respectivas.

Isozimas

Otro tipo de regulacion de la actividad metabolica tiene lugar mediante la participacion de los isozimas, formas multiples de un enzima determinado que pueden presentarse en una sola especie de organismo e incluso en una sola celula. La existen-

250

FIGURA 9-25

Isozimas de la lecteto-deshidroqenese. Separaci6n de los isozimas del truisculo esqueletico y del coraz6n de rata por electroloresis zonal. Los extractos se aplican en la linea de origen. Cuatro de los isozimas emigran hacia el electrodo

positiuo, y el otro hacia el neqetivo,

EI tamaiio y le densidad de las manchas reflejan la cantidad de cada uno de los isozimes. IReproducido de 1. H. Fine,

N. O. Kaplan y P. Kuitinec, Biochemistry, 2: 116 (1963)].

M. M,H M,H, MH, H.
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Origen Contenido relativo de isozimas de la lectsto-deshidroqenese en los tejidos humanos. Los niueles de isozimes en el suero humano son utilizados para el diagn6stico clinico; la cantidad de isozimss H, y MH, es elevada en las eniermededes hepaticas.

M. M,H M,H, MH, H.

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Hiqado " • ~ Capitulo 9 Bnzimas: mecanismo, estructura y requlscion

cia de estas formas multiples puede detectarse y separarse mediante electroforesis en geles de los extractos celulares; puesto que estan codificados por genes diferentes, los isozimas difieren en su composici6n aminoacida y por tanto en los valores de sus pH isoelectricos.

La lactato-deshidroqenasa, uno de los primeros enzimas de esta clase en ser intensamente estudiado, aparece en cinco formas Isozimicas diferentes en los tejidos de la rata y de otros vertebrados (fig. 9~25). Todos los isozimas de la rata han sido aislados; catalizan la misma reacci6n global,

Lactato + NAD+ ~ piruvato + NADH + H+

en la que el NAD+ y el NADH representan, respectivamente, a las formas oxidada y reducida del dinucleotido de nicotina~ mida y adenina (pag. 346). Los cinco isozimas poseen el mismo peso molecular, alrededor de 134000, y todos ellos conti en en cuatro cadenas polipeptidicas cuyo peso molecular es de 33500. Los cinco isozimas estan constituidos por cinco cornbinaciones diferentes de dos clases de cadenas polipeptidicas, designadas por M y H. El isozima que predomina en el museu .. 10 esqueletico posee cuatro cadenas M identicas y se designa como M4; otro, que predomina en el corazon, posee cuatro cad en as H identicas y se designa por H4• Los otros tres isozimas tienen la composici6n M3H, M2H2 y MH3. Se han aislado las cadenas sencillas M y H, y se ha comprobado que difieren significativamente en su contenido en aminoacidos y en su secuencia. Cuando las cadenas M y H sencillas, inactivas por si solas, se mezclan en proporciones adecuadas, pueden formarse espontaneamente «in vitro» todos los isozimas de la lactato deshidroqenasa, poseyendo todos ellos plena actividad catalitica.

La investigaci6n genetica indica que las secuencias aminoacidas de las dos cadenas polipeptidicas diferentes M y H de la lactato-deshidroqenasa se hallan codificadas por dos genes diferentes. La biosintesis de los dos tipos de cadenas, y por tanto, las cantidades relativas de los isozimas de la lactato-deshidroqenasa presentes en una determinada celula se encuentran bajo regulaci6n genetica. La fig. 9~25 muestra que los isozimas de la lactato-deshidroqenasa existen, en diferentes proporciones, en los diferentes tejidos. Ademas, las proporciones relativas de los isozimas de la lactato-deshidrogenasa en un tejido pueden cambiar durante el desarrollo embrionario. Constituyen, tambien un elemento importante para el diagn6stico de las enfermedades del coraz6n y del higado (fig. 9~25).

El cuidadoso estudio cinetico de los isozimas de la lactatedeshidrogenasa ha demostrado que aunque todos ellos catalizan la misma reacci6n, difieren significativamente en sus valores de KM respecto a sus sustratos, particularmente respecto al piruvato, asi como en los valores de V max cuando el sustrato es el piruvato. El isozima M4, caracteristico del musculo esqueletico y de los tejidos embrionarios, posee un valor relativamente bajo de KM para el piruvato y una velocidad relativamente elevada en la reducci6n del piruvato a lactato. EI isozima H4, es caracteristico del coraz6n y de otros museu los rojos, posee una KM relativamente elevada para el piruvato y 10 reduce a una velocidad relativamente baja. Ademas, la

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deshidroqenacion del lactato catalizado por el isozima H4 es Iuerternente inhibida por el piruvato. Los demas isozimas de la lactato-deshidrogenasa poseen propiedades cineticas intermedias entre las de los isozimas M4 y H4 en proporcion a sus contenidos relatives de cadenas My H.

Estas caracteristicas cineticas, si se comparan con las caracteristicas metabolicas de los tejidos en los que predominan los isozimas M4 y H4• proporcionan cierta comprension acerca de la fun cion de los isozimas de la lactato-deshidroqenasa. El musculo esqueletico y el tejido embrionario tienden a utilizar la glucosa anaerobicamente, deqradandola hasta formar lactato en el proceso de la glucolisis (pag. 427). La lactato-deshidrogenasa cataliza la ultima etapa de la glucolisis. la reduccion del piruvato a lactato. De este modo. el musculo esqueIetico, en el que predomina el isozima M4 que posee una KM baja y una V max elevada para el piruvato, esta bien adaptado para convertir rapidamente el piruvato en lactato. Por otra parte. el musculo cardia co no forma normalmente lactato a partir de la glucosa; oxida el piruvato a dioxide de carbono aerobicamente, sin que tenga lugar la Iormacion Intermedia de lactato. El isozima H4 se haIIa bien adaptado para esta ruta diferente del metabolismo de la glucosa. ya que la KM para el piruvato es elevada y la V max para la reduccion del piruvato a lactato es baja, y tambien resulta inhibido por el exceso de piruvato; todos estos facto res disminuyen, en gran medida, su actividad en la direccion de la Iormacion de lactatoo Aunque el musculo cardia co no emplea, por 10 general. Iactato-deshidrcqenasa en la oxidacion de la glucosa. en cases de emergencia en que e1 suministro de oxigeno se reduce. la presencia de la Iactato-deshidroqenasa permite al corazon obtener su energia de la conversion del glucogeno en lactato, (paqs. 849 y 850).

Hoy dia conocernos isozimas de un gran numero de enzimas diferentes. Generalmente estan constituidos por mezclas intimamente asociadas de diferentes clases de cadenas polipeptidicas, en las que estan combinadas las propiedades cineticas y de enlace especificas ' aportadas por cada tipo de cadena. Muchos enzimas alostericos se encuentran en forma de dos o mas isozimas que varian en su sensibilidad respecto a sus mod uladores alostericos [paqs. 711 y 724). En otros casos pueden encontrarse diferentes isozimas en los diversos compartimien tos in tracelu lares.

El estudio de los isozimas es de fundamental siqnificacion en la investiqacion de la base molecular de la diferenclacion celular y de la morfoqenesis, Muchas proteinas, y no solo las, que tienen actividad catalitica, pueden presentarse en formas multiples en las celulas.

Resumen

La topografia del centro activo de los enzimas puede ser estudiada mediante la determinacion de la especificldad de sustratos, utilizando reactivos quimicos especlficos cap aces de modificar covalentemente los grupos funcionales esenciales para la catalisis, por marcaje de afinidad y mediante analisis por rayos X de los complejos cristalizados enzlma-sustrato 0 enzima-inhibldor. Los grupos R de la serina, la histidina, la Iisina y la cisteina, presentes en las proteinas enztmaticas, intervienen frecuentemente en la catalisis en el centro activo.

Las reacciones catalizadas por los enzimas son de 108 a 1020 veces mas rapidas que las correspondientes reacciones no catalizadas. Una parte

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Capitulo 9 Enzimas: mecanismo, estructura y regulaci6n

principal del incremento de velocidad depende probablemente de la colocacion exacta del sustrato en la proximidad y orlentacion apropiadas respecto al grupo catalitico, de modo que se alcance con facilidad el estado de transicion. En algunos enzimas se produce un incremento de velocidad menor debido al funcionalismo de la catalisis covalente, en la cual un compuesto covalente enzima-sustrato se forma y se destruye rapldamente. EI incremento de velocidad se hace tambien posible mediante la catalisis acido-base de caracter general promovida por los grupos dadores 0 aceptores de protones situados en el centro activo. La velocidad experimenta tambien un incremento en una medida que por el momento no puede evaluarse debido a los cambios de conformaclon que se producen cuando se combinan el enzima y el sustrato. Por otra parte. se esta comenzando a comprender el mecanisme de accion de algunos enzimas como la quimotripsina y la lisozima.

Algunos enzimas estan bioloqicamente adaptados para desempeiiar una funcion catalitica ademas de una reguladora. Los enzimas alostericos resultan modulados por enlace no covalente con alqun metabolito especifico. Por regia general. catalizan la primera reaccion de una secuencia multienzimatica y con frecuencia son inhibidos por el producto final de la secuencia que se une a un centro regulador especiflco, 0 alosterico de la molecula enzimatica. Algunos enzimas alostericos son estimulados por su modulador, que puede ser el mismo sustrato. Los enzimas alostericos muestran una cinetica atipica que no parece seguir la ecuacion de velocidad clasica de Mtchaells-Menten. Algunos enzimas alostericos muestran curvas sigmoidales en la representacion de la velocidad inicial frente a la concentracion del sustrato, mientras que otros muestran curvas hiperbolicas no rectangulares. Cuando la molecula del modulador se hall a unida a su centro especlfico, cambia el valor de KM aparente 0 de V max del enzima. ·Casi todos los enzimas alostericos conocidos poseen multiples subunidades, que en algunos casos son de dos tipos; cat ali tic as y reguladoras. Se han propuesto varios modelos para explicar el mecanismo de la requlacion alosterica. EI modele de simetria propone que la molecula del enzima alosterico existe solamente en una de las dos conformaciones posibles, activa 0 inactiva, mientras que el modele secuencial postula que las subunidades cambian de conformacion en una secuencia determinada; es decir, que no 10 hacen simultaneamente, de modo que pueden existir estados intermedios con diferente actividad catalitica.

Otra c1ase de enzimas reguladores experimenta su interconversion entre las formas activa e inactiva por modificacion covalente de alqun grupo especlfico de la molecula del enzima debido a la accion de otros enzimas. Constituye un ejemplo la qlucoqeno-fosforllasa, que se convierte en su forma b, inactiva, por hldrolisls enzlmatica de sus restos serina fosforilados y por disociacion de su estructura tetramerica en una forma dimera; esta Ultima puede convertirse de nuevo en fosforilasa a, activa, mediante fosfortlacion enztmatica,

Algunos enzimas aparecen en formas multiples. llamadas isozimas, dentro de una especie determinada 0 tipo de celula, Contienen diferentes proporciones de dos 0 mas tipos de cadenas polipeptidicas 10 que determina que las formas isozimicas difteran en KM 0 V max'

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Otras referencias sobre enzfrnas, se encuentran al final del capitulo 8 [paq. 219).

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