OBJETIVO GENERAL.

 Obtener conocimiento general sobre la tinción de Gram, sus bases teórico-practicas y las
características prácticas del frotis.

OBJETIVOS ESPECÍFICOS.

 Familiarizarnos con la elaboración de frotis a partir de colonias obtenidas en cultivos.

 Realizar correctamente una coloración de gram
 Reconocer cada unas de las flora bacterianas que habitan en muchas partes del cuerpo.
 Identificar correctamente las diferentes formas de bacterias en un frotis.
 MATERIALES.

 portaobjetos
 cubreobjetos
 cultivos de bacterias (cocos y bacilos)
 solución salina
 fosforo
 asas
 colorantes:
Cristal violeta
Solución de lugol
Alcohol-acetona
Safranina

 Cultivo de bacterias:
Escherichia coli
Cocos y bacilos.
 ESQUEMA DE PROCEDIMIENTOS.

Para realizar el frotis en fresco se utiliza muestra de partes de nuestro cuerpo como: fosas
nasales, oreja, boca y uñas, con ayuda de un copito o un palillo.

Esta muestra se coloca en una portaobjetos, a este portaobjeto se le coloca una gota de solución
salina para que la muestra se impregne y se pueda ver en el microscopio. Ya listo este se coloca
un cubreobjetos y se coloca en el microscopio en el objetivo de 40x.

Elaboración de frotis para la escherichia coli.

1. Calentar el asa de inoculación hasta que este al rojo.

2. Tomar la porción de la muestra (colonia del cultivo) que se va a examinar por medio de un asa
o escobillón.

3. Colocar la muestra sobre un portaobjetos limpio y sin grasa, debidamente marcado.

4. Trazar con la muestra un espiral en el centro a la periferia. Si la muestra no es liquida, colocar
una pequeña gota de solución salina sobre el portaobjetos antes de realizar el frotis y disolver
en ella la muestra.

5. Calentar nuevamente el asa para desinfectarla

6. Se deja secar al aire.

7. Fijarlo pasándolo tres veces a través de la llama con la muestra hacia arriba

PROCEDIMIENTO PARA LA COLORACIÓN

1. Verter el cristal violeta sobre el portaobjetos y dejar actuar por 1 minuto

2. Enjuagar con agua corriente y dejar escurrir

3. Agregar la solución de Lugo y dejar actuar por un minuto

4. Escurrir la solución y enjuagar el portaobjetos con agua corriente

5. Decolorar con alcohol - acetona por 5 segundos y enjuagar con agua corriente.

6. Agregar la solución de safranina y dejar actuar por 30 segundos, enjuagar, escurrir y dejar secar.
 MARCO TEÓRICO

Los microorganismos son seres vivos con múltiple complejidad ya que estos suelen vivir en
condiciones extremas, tienen partes del cuerpo que se mueven con facilidad, que tienen
diferentes formas , como por ejemplo las bacterias estas tienen la facilidad de vivir en ambientes
extremos y pueden tomar diferentes formas: cocos, bacilos, espirilos, etc. Las bacterias disponen
de una pared celular que rodea a su membrana citoplasmática. Las paredes celulares bacterianas
están hechas de peptidoglicano (llamado antiguamente mureína). Esta sustancia está compuesta
por cadenas de polisacárido enlazadas por péptidos inusuales que contienen aminoácidos D. Estos
aminoácidos no se encuentran en las proteínas, por lo que protegen a la pared de la mayoría de
las peptidasas. Las paredes celulares bacterianas son distintas de las que tienen plantas y hongos,
compuestas de celulosa y quitina, respectivamente.

Desde hace muchos años se han experimentado procesos para poder observar las bacterias,
porque estas suelen ser muy difíciles de ver en un microscopio.
En el laboratorio tratamos de ver diferentes floras de nuestro cuerpo (como: oreja, uñas, fosas
nasales y boca) para observar las bacterias que viven ahí, estas las pudimos observar haciendo un
frotis en fresco.
Pero para mayor observación y para poder identificar las formas de esta se utilizo una coloración
muy utilizada que es la tinción de gram.

El método de tinción de Gram es una de las técnicas que se emplea con más frecuencia para el
diagnóstico rápido de infecciones bacterianas. Los fundamentos de la técnica se basan en las
diferencias entre las paredes celulares de las bacterias Gram positivas y Gram negativas. La pared
celular de las bacterias Gram positivas posee una gruesa capa de peptidoglucano, además de dos
clases de ácidos teicoicos: Anclado en la cara interna de la pared celular y unido a la membrana
plasmática, se encuentra el ácido lipoteicoico, y más en la superficie, el ácido teicoico que está
anclado solamente en el peptidoglucano (también conocido como mureína). Por el contrario, la
capa de peptidoglucano de las Gram negativas es delgada, y se encuentra unida a una segunda
membrana plasmática exterior (de composición distinta a la interna) por medio de lipoproteínas.
Tiene una capa delgada de peptidoglucano unida a una membrana exterior por lipoproteínas. La
membrana exterior está hecha de proteína, fosfolípidos y lipopolisacárido. Por lo tanto, ambos
tipos de bacterias se tiñen diferencialmente debido a estas diferencias constitutivas de su pared.
La clave es el peptidoglucano, ya que es el material que confiere su rigidez a la pared celular
bacteriana, y las Gram positivas lo poseen en mucha mayor proporción que las Gram negativas.
ELABORACIÓN DE FROTIS Y COLORACIÓN DE GRAM

SANDY MORENO UPARELA

VICTOR VILLAMIZAR VARGAS

NERLYS THOMAS SERRANO

MICROBIÓLOGA MÉDICA

UNIVERSIDAD DE SUCRE
FACULTAD CIENCIAS DE LA SALUD
DEPARTAMENTO MEDICINA
PROGRAMA MEDICINA
SEMESTRE IV

SINCELEJO – SUCRE
2010