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CTB Hemoparasitos Farber PDF
CTB Hemoparasitos Farber PDF
30S
33S
Boophilus microplus
Babesia enzootic area
A. marginale enzootic area
65W
Ciclo de vida
LABORATORIO DE HEMOPARASITOS
Un poco de historia
Comenz por el Diagnstico
Continu con Vacunas
Se extendi a la Epidemiologa
Aprovechamiento de la informacin
genmica para el desarrollo de
herramientas aplicadas al Estudio de la
Babesiosis y Anaplasmosis Bovinas
GENOMICA FUNCIONAL:
ANTIGENOS
VACUNAS
GENOMAS
EPIDEMIOLOGIA
DIAGNOSTICO
En qu trabajamos?
Estudios bsicos
Protenas de exportacin y factores de virulencia
en Anaplasma
- Familia de Perforinas en Babesia sp.
En qu trabajamos?
Estudios bsicos
Protenas de exportacin y factores de virulencia
en Anaplasma
- Familia de Perforinas en Babesia sp.
RLB
Primers:
Anaplasma ssp.
HER-F: AGAGTTGGATCMTGGYTCAG
EHR-R: AGAAGAAGTCCCGGCAAACT
Babesia ssp.
RLB-F2: GACACAGGGAGGTAGTGACAA
RLB-R2: B-CTAAGAATTTCACCTGTGACAGT
Sondas:
A. centrale especfica:
TCGAACGGACCATACGC
A. marginale especifica:
GACCGTATACGCAGCTTG
Anaplasma ssp. catch all:
GGGGGAAAGATTTATCGCTA
B. bovis especfica:
CAGGTTTCGCCTGTATAATTGAG
B. bigemina especfica:
CGTTTTTTCCCTTTTGTTGG
Babesia ssp. catch all.
CTGTCAGAGGTGAAATTCT
Name
MEXICO
BgM2P
BgS1A
BgS1A
BgS2P
BgS2P.clone1
Pathogenic B. bigemina
G
G
G
T
T
T
T
T
T
T
T
T
T
T
T
T
T
T
T
T
T
Sequence
C C C T
C C C T
C C C T
BgM2P
Attenuated B. Bigemina
C
C
C
BgS2P.clone2
BgS2P.clone3
BgS2P
BgM1A
BgM1P
C
C
C
C
C
C
G
G
G
G
G
G
T
T
T
T
T
T
T
T
T
T
T
T
T
T
T
T
T
T
T
T
T
T
T
T
T
T
T
T
T
T
T
T
T
T
T
T
C
C
C
C
C
C
C
C
C
C
C
C
C
C
C
C
C
C
T
T
T
T
T
T
C
C
C
C
C
G
G
G
G
G
T
T
T
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T
T
T
T
T
T
T
T
T
T
C
C
C
C
C
C
C
C
C
C
C
C
C
C
C
T
T
T
T
T
Details
T
C
C
G
T
C
T
G
C
G
G
C
C
C
C
C
C
C
G
G
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T
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T
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C
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G
T
T
T
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T
G
T
T
T
G
G
T
G
T
T
T
T
T
T
T
G
T
T
T
T
T
T
C
T
T
T
T
T
G
G
G
G
G
G
G
G
G
G
G
G
T
T
T
T
T
T
T
T
T
T
G
G
G
G
G
G
G
G
G
G
C
T
C
C
C
T
T
T
G
T
G
T
T
G
G
T
T
T
T
G
T
T
T
T
T
T
T
T
C
T
C
T
T
G
G
G
G
G
G
G
B. bigemina P
B. bigemina A
B. bigemina T
C
C
C
C
G
G
G
G
T
T
T
T
T
T
T
T
T
T
T
T
T
T
T
T
T
T
T
T
T
T
T
T
C
C
C
C
C
C
C
C
C
C
C
C
T
T
T
T
T
C
G
C
CLONED
Jul-04
PCR
Nov-04
PCR
Nov-04
CLONED
Jul-04
PCR
Sep-II-04
CLONED
Jul-04
CLONED
Sep-04
CLONED
Sep-04
CLONED
Sep-04
PCR
Sep-II-04
PCR
Nov-05
PCR
Nov-05
PCR
Nov-05
Reference sample
G
G
G
G
Number of sera
6
5
4
3
2
1
>1
01
91
-1
00
81
-9
0
71
-8
0
61
-7
0
51
-6
0
41
-5
0
31
-4
0
21
-3
0
10
-2
0
F.A.U at 670 nm
25
Negativos
IS
En qu trabajamos?
Estudios bsicos
Protenas de exportacin y factores de virulencia
en Anaplasma
- Familia de Perforinas en Babesia sp.
Marcadores moleculares
Regiones repetidas en tandem en genes que codifican para
protenas de superficie: A. marginale (MSP1a), B. bovis (Bv80, TRAP,
P200, Antigen 3, Desmoyokin), B bigemina (P200, PLP)
Primer For
MACF
Primer Rev
1 2 3 4 5 6 7 8 9
Marcadores moleculares
VNTR (Variable number of tandem repeats) : A. marginale (AMTR 15 y
AMTR11). En desarrollo para Babesia sp
DataBase
The ACCESS data base (DB) includes information about
4189 bovine samples from Northeast (1198) and
Northwest (2991) Argentina.
DB fields correspond to information describing sampling
(date, responsible, place of work), the field (region,
province, locality, department, field coordinates), the
cattle (breed, age, tick control strategies), the sample
evaluation (ELISA, PCR, RLBH), molecular
characterization: Polymorphic genes, VNTR, MLST.
Based on the information required, different queries were
designed. These queries enable the DB user to easily
extract information about the 4189 samples.
RLBH detection
NE A
NOA
100
T ota l
90
80
70
60
50
40
30
20
10
Eo
m
bi
A
B
bo
B
%
bo
A
iA
Eo
Eo
m
bi
Eo
Bb
%
bo
B
B
%
bo
bi
A
Eo
o
iE
Am
%
Bb
%
bi
A
B
bo
Eo
bi
bo
B
%
bo
eg
Eo
%
m
A
i%
Bb
bi
o-
B
Bb
%
%
A+
bo
to
t
%
Eo
to
t
%
bi
%
B
%
bo
to
t
to
t
En qu trabajamos?
Estudios bsicos
Protenas de exportacin y factores de virulencia
en Anaplasma
- Familia de Perforinas en Babesia sp.
Bibliografa
Bioinformtica
Caracterizacin bioinformtica
Antigeno
Identificacin
Caractersticas
TolC
Library PhoAC
OMP conservada.
Sistema secrecin TipoI.
OMP85
Library PhoAC
OMP conservada.
Antgeno protectivo
OMP 4
Library PhoAC
PhoAc
Library PhoAC
L22
PCR sustractiva
Adh
Dominios
transmembrana
Probable adhesina
AM 742
Dominios
transmembrana
Hypotetical protena -
Verificar la transcripcin
Expresin de protenas recombinantes
Ensayos de linfoproliferacin
Perfil de estimulacin de citoquinas
Western blot
NH2
MEDIO EXTERNO
NH2
Membrana externa
NH2
PERIPLASMA
NH2
NH2
Membrana interna
CITOPLASMA
NH2
NH2
Segmento hidrofbico
de transmembrana
Ensayos de linfoproliferacin
Perfil de estimulacin de citoquinas
Western blot
Predicted
ORF
Signal
peptide
TM
Domains
TM Pred
ID
Name
Annotation
Nucleotide
Signal P
AM
1108
PhoAC
Hypothetical
protein
2076
AM
127
L22
Hypothetical
protein
3000
AM
216
Adh
Hypothetical
protein
PhoAC Orf
1
2
1
Ortologos
Conserved
domain
Pentapeptide
repeat
B-Lectin
Blast2GO
Uniprot
Pentapeptide
repeat
Pentapeptide
repeat domain
protein
Acetamidase
formamidase
family protein
Conserved
cluster within
Anaplasmas
and Ehrlichias
2529
+
1
L22
Conserved
cluster within
intracellular
pathogens and
endosymbionts
Adh
Ensayos de linfoproliferacin
Perfil de estimulacin de citoquinas
Western blot
Ensayos de linfoproliferacin
Perfil de estimulacin de citoquinas
Western blot
Caracterizacin bioinformtica
Verificar la transcripcin
Infectados/ no
infectados
Msp5-PCR
Control
No
infectado
282
Infectado
Aguda
285
Infectado
Crnico
99
Infectado
Crnico
Ensayos de linfoproliferacin
Perfil de estimulacin de citoquinas
Western blot
Confirm la infeccin por pcr diagnostica del gen msp5
Respuesta positiva fuerte para PhoAC ORF y Adh Cterm y
mas dbil para los antgenos L22 N term y Adh Nterm
msp5
PhoAC
Adh-
Adh+
Ensayos de linfoproliferacin
Perfil de estimulacin de citoquinas
L22 Cterm
Western blot
PhoAc 5
PhoAC
Factorof UP-regulatation
AM216 Adh-
4,5
4,5
3,5
3,5
2,5
2,5
1,5
1,5
0,5
0,5
IL2
IL10
IL12p35
TNF
INF
IL2
IL10
IL12p35
TNF
INF
Results were presented as ratios calculated with the Relative expression software tool (REST@)
application described by Plaffl et al. The value of PCR efficiency for all transcripts was 2, as
calculated following the formula: E = 10[-1/slope].
IL10
IL12p35
TNF
IFN
Enhanced expression
PhoAC
1,18
1,39
1,49
2,71
1,98
TNF, IFN
Adh- (C-term)
1,41
2,27
1,46
1,63
2,52
Ensayos de linfoproliferacin
Perfil de estimulacin de citoquinas
Western blot
en el genoma en las
alphaproteobacterias.
Anaplasma marginale
Brucella abortus
tatAB
Dispersa
Operon
tatBC
tatC-Ser
E coli TatA-
pUNIp
E coli TatB-
3404 bp
Anaplasma marginale
E coli TatC-
Brucella abortus
Viabilidad en SDS 2%
A marginale
B abortus
Tat A
Funcional
TatB
No funcional
Funcional
TatC
No funcional
Funcional
En qu trabajamos?
Estudios bsicos
Protenas de exportacin y factores de virulencia
en Anaplasma
- Familia de Perforinas en Babesia sp.
BbiPLP1
Seal TATA
Pptido seal
BbiPLP2
ADNg
B
ADNg RT+ RT-
C
RT+ RT-
ADNg
En qu trabajamos?
Estudios bsicos
Protenas de exportacin y factores de virulencia
en Anaplasma
- Familia de Perforinas en Babesia sp.
Gel en 2D teido. IEF: tiras de 7 cm, rango de pH 4-7 y SDSPAGE 10%. A: protenas de merozotos de BbiS2P. B: protena de
eritrocitos no infectados
Atributos Positivos
Atributos Negativos
-Secuenciaas conservadas en el proteoma bovino
-Secuencias conservadas en el proteoma de
Theileria
En qu trabajamos?
Estudios bsicos
Protenas de exportacin y factores de virulencia
en Anaplasma
- Familia de Perforinas en Babesia sp.
Genticamente atenuados.
Llevar secuencias de inters en posiciones que no sean esenciales para la
replicacin viral.
Estables, inocuos.
Vector de transferencia
pE- X - t
poxvirus
poxvirus recombinante
recombinacin
homloga in vivo
pE- X - t
Vector de transferencia
pH6- GUS- t
Poxvirus
pE/L-XX - t
Gen no esencial
Poxvirus recombinante
pH6-GUS- t
pE/L -XX - t
5- Obtencin de un stock
puro.
6- Caracterizacin molecular y biolgica de los recombinantes
seleccionadas.
Objetivo
Disear, construir y caracterizar un MVA recombinante (MVAr) que exprese un
multiantgeno consistente en epitopes de tipo B y T de tres protenas
inmunognicas de B. bovis.
Epitopes T
Espitopes B
Produccin INF -
Estado donde esta presente
Rap-1
S
S
S
Merozoto
Msa-2c
ND
S
ND
Esporozoto
Hsp20
S
S
S
Espor/Mero
Localizacin subcelular
Roptrias
Mem. Plsm.
Citosol y MP
ND: No determinado
Construccin del
Multiantgeno
Extraccin de ADNg o ARN de merozotos y amplificacin de los genes
en cuestin con primers especficos.
Clonado en vector de tipo T por separado e ingeniera gentica para
subclonar y fusionar los genes.
Secuenciacin para verificar correcta orientacin.
22
C
23
24
1.8
21 22 23
WT C
24
WT M 21
1.8
0.54
0.54
Pasaje 5
Pasaje 9
22
23 24