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Manual de Practicas Microbiologia
Manual de Practicas Microbiologia
ndice
ndice
Introduccin _______________________________________________________ 0 1
Normas generales y conocimiento del laboratorio de microbiologa _____________ 0 2
Gua de microscopio _________________________________________________ 1 4
Mtodos de siembra _________________________________________________ 2 6
Coloracin de Gram _________________________________________________ 3 2
Medios de cultivo ___________________________________________________ 3 8
Distribucin de los microorganismos en el medio __________________________ 4 5
Clasificacin de los microorganismos segn su temperatura de crecimiento _______ 4 9
Control microbiano por agentes qumicos ________________________________ 5 9
Obtencin de hongos a partir de la tierra _________________________________ 6 6
Gua prctica anlisis de aguas _________________________________________ 7 1
Determinacin de sustancias inhibidoras del crecimiento bacteriano ____________ 7 8
Control microbiolgico de manipuladores ________________________________ 8 5
Control de calidad de cosmticos _______________________________________ 8 9
Curva de crecimiento bacteriano _______________________________________ 9 3
Fermentacin alcohlica - elaboracin del vino ____________________________ 9 9
Fermentacin lctica - elaboracin del yogurt _____________________________ 1 0 5
Bibliografa _______________________________________________________ 1 1 0
Introduccin
La microbiologa es la rama de la Biologa que estudia los fenmenos de dependencia entre dos seres vivos.
Histricamente los microorganismos han sido asociados a procesos infecciosos del hombre, plantas y
animales y atendemos con urgencia los microorganismos patgenos, ignorando en muchos casos y siendo
indiferentes con aquellos que son un aporte fundamental en el desarrollo de los procesos biolgicos,
trascendentales en los entornos naturales, con capacidad transformadora y productiva en procesos
industriales como en la produccin de pan, bebidas alcohlicas, productos lcteos, antibiticos , hormonas,
y enzimas entre otros.
En los laboratorios de Microbiologa, el buen uso del microscopio, la aplicacin de tcnicas de cultivo
indicadas para diagnstico, estudios epidemiolgicos, investigacin biotecnolgica, permite avances
cientficos y tecnolgicos que propenden por el bienestar de los seres vivos. Es as como cada vez se
profundiza ms en los estudios fisiolgicos, genticos y evolutivos de los microbios, lo que permite
entender su comportamiento en hbitat naturales, su reaccin ante medios adversos, sus cambios
biolgicos cclicos que sorprenden al mas incauto y motivan al cientfico visionario.
La Ciencia, ha convertido a estos seres microscpicos en herramientas de trabajo que nos inquietan por su
dominio en el mundo y por la participacin que tienen cada da en la vida cotidiana.
El profesional de tecnologa qumica cada da ampla su campo laboral en muchas industrias que tienen que
ver con diferentes tpicos de la Microbiologa, es por eso que surge la necesidad de elaborar un manual de
practicas de laboratorio que permitan dar una visin global de esta rea del conocimiento, de forma tal que
le proporcione al futuro egresado las herramientas necesarias para ejercer su rol profesional.
Introduccin
La microbiologa es una ciencia que a travs de la observacin y de la experimentacin distingue las formas
biolgicas, microscpicas que interactan con el hombre y en general con el medio.
El laboratorio de microbiologa es un lugar convenientemente habilitado donde con las debidas
precauciones, se puede manejar y examinar microorganismos. Cuando se maneja cualquier tipo de muestra
se debe tener en cuenta la posibilidad de riesgos que pueden ser biolgicos, del ambiente de laboratorio o
riesgos asociados como el manejo de sustancias qumicas, elctricas, fugaz de gas. Todos los
microorganismos que se manipulen deben ser manejados con precaucin por su potencial patogenicidad.
Las medidas de seguridad en laboratorios, son un conjunto de medidas preventivas destinadas a proteger
la salud de los que all se desempean frente a los riesgos propios derivados de la actividad, para evitar
accidentes y contaminaciones tanto dentro de su mbito de trabajo, como hacia el exterior.
Ser fundamental la realizacin meticulosa de cada tcnica, pues ninguna medida, ni siquiera un equipo
excelente puede sustituir el orden y el cuidado con que se trabaja.
Objetivos
Inculcar la necesidad y la importancia de las medidas preventivas y elementos de bioseguridad del
laboratorio de microbiologa para garantizar un optimo resultado del trabajo realizado
Desarrollar en el estudiante la capacidad de afrontar situaciones de emergencia en la forma ms
adecuada y pertinente que garanticen su integridad
Ofrecer herramientas para que el estudiante conozca acerca de la instrumentacin y equipos
utilizados en el laboratorio de microbiologa
Recomendaciones
1. Se deber conocer la ubicacin de los elementos de seguridad en el lugar de trabajo, tales como:
matafuegos, salidas de emergencia, mantas ignfugas, lavaojos, gabinete para contener derrames,
accionamiento de alarmas, etc.
Incendio
1. Mantenga la calma. Lo ms importante es ponerse a salvo y dar aviso a los dems.
2. Si hay alarma, accinela. Si no grite para alertar al resto.
3. Se dar aviso inmediatamente al Dpto. de Seguridad y Control informando el lugar y las
caractersticas del siniestro.
4. Si el fuego es pequeo y sabe utilizar un extintor, selo. Si el fuego es de consideracin, no se
arriesgue y manteniendo la calma ponga en marcha el plan de evacuacin.
5. Si debe evacuar el sector apague los equipos elctricos y cierre las llaves de gas y ventanas.
6. Evacu la zona por la ruta asignada.
7. No lleve consigo objetos, pueden entorpecer su salida.
8. Si pudo salir por ninguna causa vuelva a entrar. Deje que los equipos especializados se encarguen.
en un laboratorio de
1. Mantenga el puesto de trabajo solo con el material necesario, disponga del material de tal manera que
pueda usarlo en forma cmoda y segura.
2. Rotule claramente sus cajas de cultivo, placas, tubos, etc., con indicaciones concretas.
3. El asa debe ser esterilizada antes y despus de su uso. Luego, debe colocarse en posicin vertical en el
soporte para tal fin.
4. Utilice con cuidado los equipos y aparatos de laboratorio. selos como si fueran propios.
Peligro : Todo aquello que puede producir un dao o un deterioro de la calidad de vida individual o
colectiva de las personas.
Dao : Es la consecuencia producida por un peligro sobre la calidad de vida individual o colectiva de las
personas.
Riesgo : Probabilidad de que ante un determinado peligro se produzca un cierto dao, pudiendo por
ello cuantificarse.
Desinfeccin (segn la OMS): Eliminacin de agentes infecciosos que estn fuera del
organismo por medio de la exposicin directa a agentes qumicos o fsicos.
Esterilizacin (segn la OMS): Destruccin de todas las formas de vida por calor, radiacin,
gas o tratamiento qumico.
Limpieza (segn la OMS): Eliminacin, mediante fregado y lavado con agua caliente, jabn o un
detergente adecuado, o por el empleo de una aspiradora, de agentes infecciosos y substancias orgnicas de
superficies en las cuales stos pueden encontrar condiciones adecuadas para sobrevivir o multiplicarse.
Superficies interiores : Los suelos, paredes, techo, deben ser impermeables al agua y
resistentes a diferentes productos qumicos, de modo que facilite la limpieza y posterior descontaminacin.
Superficies de trabajo : Las mesas y bancos de trabajo deben ser resistentes al calor, a
disolventes orgnicos, cidos y lcalis.
Cabinas de seguridad : Son recintos ventilados para limitar al mximo el riesgo del
personal del laboratorio expuestos a agentes infecciosos.
Autoclave : Es un equipo para la esterilizacin y desinfeccin del material del laboratorio, debe
tenerse especial cuidado en el control de la presin interna, ya que un incremento por encima de 15 psi
ocasionar una explosin de este instrumento, sin embargo la regulacin de la presin interna por debajo
de los 15 psi tambin se hace importante, ya que un cambio brusco ocasionado por levantamiento de la
vlvula de control provocar un rompimiento del material de vidrio que se encuentra esterilizado.
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Centrfuga : Permite la separacin rpida de bacterias del liquido donde est suspendidas.
Balanza : Cuando se preparan los reactivos, se deben utilizar balanzas cuya exactitud se verifique
frecuentemente.
Cajas de Petri : Recipientes planos de vidrio, destinados para los medios de cultivos que
contengan agar (slidos).
Porta objetos : Son lminas de un vidrio muy delgadas. Para desengrasarlas se deben colocar en
una solucin de ter ms alcohol, lavarlas con agua corriente y hervirlas con solucin detergente por 30
minutos.
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Taller
1. Indique si las siguientes afirmaciones son falsas
o verdaderas.
Todo el material de desecho de laboratorio se deposita en una sola caneca.
SI ___ NO ___
No colocar objetos personales sobre los mesones.
SI ___ NO ___
Los implementos de proteccin personal como guantes, tapabocas pueden ser reutilizables siempre
y cuando no se utilicen sustancias altamente contaminantes.
SI ___ NO ___
No hablar mientras se este realizando un procedimiento de siembra o cultivos.
SI ___ NO ___
3. Qu son agentes
cultivos celulares.
biolgicos,
microorganismos
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5.
Enumere
laboratorio.
cinco
normas
recomendaciones
Normas
Recomendaciones
1. __________________________
1. __________________________
2. __________________________
2. __________________________
3. __________________________
3. __________________________
4. __________________________
4. __________________________
5. __________________________
5. __________________________
de
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Gua de microscopio
Introduccin
Desde la antigedad muchas personas descubrieron ciertas maneras de ver los objetos aumentados de
tamao. Una gota de roco, por ejemplo, nos permite ver con mayor detalle la superficie sobre la cual se
deposita. Este efecto, con seguridad se repiti, cuando el hombre fue capaz de descubrir el vidrio y fabricar
lentes. Hacia el ao 1300 en Holanda, comenz el auge de la utilizacin de lentes en la fabricacin de lupas
o cristales de gafas para mejorar la visin. Estas tenan poco aumento, hasta que se descubri que las lentes
convexas empleadas para corregir la presbicia, serva tambin para ver los objetos aumentados de tamao.
Se afirma que fueron dos Holandeses fabricantes de lentes, Hans y Zacharias Janssen, quienes hacia el ao
1600 inventaron el microscopio de una manera rudimentaria. En efecto, colocaron una lente convexa en
cada uno de los extremos de un tubo y comprobaron que mirando a travs de l, los objetos se vean de
mayor tamao. Galileo, en 1610, se convirti en el gran difusor de las bondades del microscopio, pero ya
en aquella poca existan investigadores para quienes el uso de este aparato resultaba indispensable.
El microscopio es una ayuda importante en el laboratorio de microbiologa, el cual proporciona
amplificaciones de elementos y estructuras que son invisibles con la simple inspeccin ocular, este nos es
de gran apoyo para as lograr diferenciar y caracterizar elementos.
Objetivos
Al finalizar los laboratorios de microscopio el estudiante estar en capacidad de:
Describir las partes del microscopio y manejar adecuadamente cada una de ellas
Realizar diferentes enfoques utilizando todos los objetivos
Reconocer la importancia del microscopio como instrumento bsico en microbiologa
Microscopio
El microscopio es un instrumento esencial en el laboratorio de microbiologa; permite observar
microorganismos y estructuras que no son visibles a simple vista. Con el microscopio se consigue un
amplio margen de aumento ptico del objeto a observar. Existen varios tipos de microscopios y se han
desarrollado varios mtodos que permiten examinar con gran detalle las muestras que contienen
microorganismos. Las clulas y tejidos no coloreados se captan en el microscopio como falto de color y
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Gua de microscopio
transparente, con poca estructura interna, puesto que no presentan
suficiente contraste. Con la ayuda de coloraciones histolgicas se consigue
una absorcin diferencial de luz de modo que las distintas estructuras se
visualizan.
La palabra microscopio viene de micro y del gr. Skopein que significa
mirar, examinar. El microscopio es un instrumento ptico que sirve para
aumentar considerablemente la imagen de los objetos muy diminutos.
Con el microscopio de luz las preparaciones teidas son observadas por
transiluminacin.
El microscopio est compuesto de una parte mecnica y una parte ptica
(sistema de lentes).
Parte mecnica
Entre ellas podemos encontrar el pie o pedestal que va a adquirir diversas formas tales como circular,
cuadrada, rectangular y semilunar. Tambin va a estar compuesto por el tornillo macromtrico (enfoca la
imagen) y por el micromtrico (afina la imagen); ambos tornillos se encuentran en el asa o brazo del
microscopio; y por el otro lado vamos a encontrar al porta objetos, carro de movimientos que nos van a
permitir deslizar el portaobjetos hacia abajo, arriba y a los costados. Las pinzas van a sostener la lmina
porta objetos. En la subplatina vamos a encontrar el condensador, que va a concentrar la luz para poder
observar la imagen, tiene un tornillo que permite hacer ascenso y descenso. Tambin vamos a tener al
diafragma que es una serie de lminas sobrepuestas que se abren y cierran permitiendo el paso de luz; por
debajo de este encontramos filtros que son de color azul que van a transformar la luz amarilla en luz
blanca. En la parte inferior encontramos el espejo que puede ser plano con una cara cncava.
Parte ptica
En cuanto a la parte ptica el microscopio va a usar lentes convergentes: plano convexa, biconvexa,
cncavo-convexa; y est compuesta por tres sistemas de lentes: condensador, objetivos, oculares.
El condensador proyecta un rayo cnico de luz para iluminar el objeto a ser observado.
Los objetivos aumentan el tamao de la imagen y la proyectan en direccin de los lentes
oculares. Son varios y adecuados al revolver porta objetivo; en la parte inferior tiene una lente
frontal plano convexa, y en la superior una sucesin de lentes correctores. Van a tener aumentos de
4x (pequeo aumento), 10x (mediano aumento), 40x (gran aumento), 100x (inmersin).
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Gua de microscopio
El ocular aumenta mucho ms la imagen y la proyecta a la retina del observador o a las
pantallas. El ocular es el responsable del aumento de la imagen, ste va a estar dado por un sistema
de lentes dado por oculares que son tubos huecos que tienen una lente superior e inferior
planaconvexa (aumentos de 4x, 15x, 20x).
1. El sistema de soporte
Consiste en:
a. el pie
b. el bastidor
c. portaobjetivo revlver (cambiador de objetivos)
d. la platina
e. la platina mecnica, que imprime un movimiento lento y regulado al portaobjetos
2. El sistema de aumento
Consiste en un conjunto de lentes.
Las lentes del microscopio se encuentran montadas en dos grupos, uno en cada extremo de un
tubo relativamente largo, o tubo del microscopio.
- El primer grupo de lentes se halla en el extremo inferior del tubo, inmediatamente arriba
de la preparacin que se va a examinar (el objeto), y se denomina objetivo.
- El segundo grupo se encuentra en el extremo superior del tubo, por donde mira el
microscopista y se llama ocular.
a. Los objetivos
Aumento
El poder de aumento de cada objetivo se
indica por un nmero grabado en la manga de
la lente:
- El objetivo x 10 aumenta 10 veces.
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Gua de microscopio
- El objetivo x 40 aumenta 40 veces.
- El objetivo x 100 aumenta 100 veces, (El objetivo x 100 generalmente se encuentra
marcado con un anillo rojo para indicar que se debe usar con aceite de inmersin).
La abertura numrica (AN)
La AN tambin se halla grabada en la manga de la lente, junto a
la indicacin del poder de aumento; v.g.:
- 0,30 en el objetivo x 10
- 0,65 en el objetivo x 40
- 1,30 en el objetivo x 100
A medida que aumenta la AN es mayor el poder de resolucin
(capacidad de hacer perceptibles detalles adyacentes muy cercanos,
separndolos y aclarndolos).
(Adems, a medida que aumenta la AN disminuyen las dimensiones de la lente frontal
montada en la base del objetivo. La lente frontal del objetivo x 100 tiene el tamao de una
cabeza de alfiler, por lo que se debe manejar con cuidado.)
En la manga del objetivo puede haber otros nmeros:
La longitud recomendada en mm para el tubo del microscopio (entre
el objetivo y el ocular), es generalmente de 160 mm
El grosor recomendado en mm para el cubreobjetos utilizado para
tapar el portaobjetos, v.g., 0.17.
Las roscas para atornillar todos los objetivos son uniformes, de .r
aera que estos se pueden intercambiar en el revlver.
Distancia de operacin del objetivo
Esta es la distancia que hay entre la lente frontal del objetivo y el portaobjetos cuando la
imagen se encuentra enfocada, a medida que el poder de aumento del objeto es mayor
disminuye la distancia de operacin.
- Objetivo x 10: la distancia de operacin
es de 5 - 6 mm.
- Objetivo x 40: la distancia de operacin
es de 0,5 - 1,5 mm.
- Objetivo x 100: la distancia de operacin
es de 0,15 - 0,20 mm.
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Gua de microscopio
Poder de resolucin
Cuanto mayor sea el poder de resolucin del objetivo
ser mas clara la imagen y aumentar la capacidad de
poner de manifiesto detalles adyacentes muy cercanos,
separndolos y aclarndolos. El poder de resolucin
mximo de un buen microscopio de laboratorio
mdico es, aproximadamente, de 0,25 m (el poder de
resolucin del ojo humano normal es de 0,25 mm).
El aceite de inmersin aumenta el poder de resolucin al hacer que se conserven muchos
rayos luminosos que se perderan por refraccin al usar un objetivo seco.
b. El ocular
Aumento
El poder de aumento se encuentra marcado en el ocular:
- Un ocular x 4 aumenta 4 veces la imagen que produce el
objetivo.
- Un ocular x 6 aumenta la imagen 6 veces.
- Un ocular y 10 aumenta la imagen 10 veces. Si la imagen
del objeto se hace aumentar 40 veces mediante el objetivo
x 40 y en seguida 6 veces mediante el ocular x 6, el
aumento total ser de 6 x 40 = 240.
Para calcular el aumento total de la imagen del objeto que se observa, multiplquese el poder
de aumento del objetivo por el del ocular.
El poder de aumento de los microscopios utilizados en los laboratorios mdicos oscila
entre 50 y 1000.
3. El sistema de iluminacin
a. La fuente luminosa
De preferencia se emplear luz elctrica, pues es ms fcil de ajustar. Puede proporcionarla
un bombillo contenido en el microscopio por debajo de la platina o mediante un bombillo
exterior colocado frente al microscopio.
De lo contrario se podr utilizar la luz del da. El microscopio nunca se debe utilizar ni debe
permanecer bajo la luz directa sol.
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Gua de microscopio
b. El espejo
El espejo refleja los rayos de la fuente luminosa
sobre el objeto. Por un lado su superficie es plana y
cncava por el otro. El lado cncavo constituye un
condensador de escaso poder y no se debe usar si
ya se cuenta con un condensador propiamente
dicho.
c. El condensador
El condensador lleva los rayos luminosos a un foco
comn sobre el objeto que se habr de examinar.
Se encuentra colocado entre el espejo y la platina. Se
puede elevar (iluminacin mxima) y bajar
(iluminacin mnima). Se debe centrar y ajustar
adecuadamente.
d. El diafragma
El diafragma, que se encuentra dentro del
condensador, se utiliza para reducir o ampliar el
ngulo, y por lo tanto, tambin la cantidad de luz que
entra en el condensador.
Cuanto ms se abre el diafragma mas se ampla el
ngulo y en consecuencia aumenta la AN y se pueden
observar detalles ms pequeos. Sin embargo, al
mismo tiempo se reduce el contraste.
e. Filtros
En algunos microscopios se ajustan filtros de colores (principalmente azules) debajo del
condensador. Se pueden dejar en su sitio o quitarlos, segn el tipo de preparacin que se
vaya a observar.
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Gua de microscopio
4. El sistema de ajuste
Este sistema comprende:
1. La cremallera de avance rpido: es el tomillo
mayor. Se utiliza primero para lograr la
aproximacin del enfoque.
2. El tornillo micromtrico de avance lento:
hace que el objetivo se desplace ms lentamente.
Se emplea para conseguir un enfoque perfecto
del objeto.
3. El tomillo de ajuste del condensador: se
utiliza para elevar el condensador y aumentar la
iluminacin o descenderlo y reducir la
iluminacin.
4. Los tomillos para centrar el condensador: puede haber tres tomillos colocados alrededor
del condensador: uno al frente, uno a la izquierda y uno a la derecha. Se usan para centrar el
condensador exactamente en relacin con el objetivo.
5. El elevador del diafragma iris: este es un pequeo elevador que se encuentra fijo al
condensador. Se puede mover para cerrar o abrir el diafragma, reduciendo o aumentando
as el ngulo y la intensidad de la luz.
6. Reguladores de la platina mecnica: Se utilizan para desplazar el portaobjetos sobre la
platina:
1 tornillo lo desplaza hacia atrs y hacia adelante
1 tomillo lo desplaza a la izquierda o la derecha.
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Gua de microscopio
3. Girar el portaobjetivos, hasta que el objetivo de menor aumento coincida con la abertura de la
platina. Mirando a travs de l, mover el espejo hasta que la luz atraviese la abertura que tiene la
platina; luego ajustar el diafragma para que el campo visual quede iluminado en forma homognea.
Si el objetivo o el ocular se encuentran empolvados o empaados, hay que limpiarlos
cuidadosamente con un pedazo de papel lente. No se debe usar otro material.
4. Comenzar la observacin con el objetivo de 4x (ya est en posicin).
5. Para realizar el enfoque:
- Acercar al mximo la lente del objetivo a la preparacin, empleando el tornillo
macromtrico. Esto debe hacerse mirando directamente y no a travs del ocular, ya que se
corre el riesgo de incrustar el objetivo en la preparacin pudindose daar alguno de ellos o
ambos.
- Mirando, ahora s, a travs de los oculares, ir separando lentamente el objetivo de la
preparacin con el macromtrico y, cuando se observe algo ntida la muestra, girar el
micromtrico hasta obtener un enfoque fino.
6. Pasar al siguiente objetivo. La imagen debera estar ya casi enfocada y suele ser suficiente con
mover un poco el micromtrico para lograr el enfoque fino. Si al cambiar de objetivo se perdi por
completo la imagen, es preferible volver a enfocar con el objetivo anterior y repetir la operacin
desde el paso 4. El objetivo de 40x enfoca a muy poca distancia de la preparacin y por ello es fcil
que ocurran dos tipos de percances: incrustarlo en la preparacin si se descuidan las precauciones
anteriores y mancharlo con aceite de inmersin si se observa una preparacin que ya se enfoc con
el objetivo de inmersin.
7. Empleo del objetivo de inmersin:
a. Bajar totalmente la platina.
b. Subir totalmente el condensador para ver claramente el crculo de luz que nos indica la
zona que se va a visualizar y donde habr que echar el aceite.
c. Girar el revlver hacia el objetivo de inmersin dejndolo a medio camino entre ste y el
de x40.
d. Colocar una gota mnima de aceite de inmersin sobre el crculo de luz.
e. Terminar de girar suavemente el revlver hasta la posicin del objetivo de inmersin.
f. Mirando directamente al objetivo, subir la platina lentamente hasta que la lente toca la
gota de aceite. En ese momento se nota como si la gota ascendiera y se adosara a la lente.
g. Enfocar cuidadosamente con el micromtrico. La distancia de trabajo entre el objetivo de
inmersin y la preparacin es mnima, aun menor que con el de 40x por lo que el riesgo de
accidente es muy grande.
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Gua de microscopio
h. Una vez se haya puesto aceite de inmersin sobre la preparacin, ya no se puede volver a
usar el objetivo 40x sobre esa zona, pues se manchara de aceite. Por tanto, si desea enfocar
otro campo, hay que bajar la platina y repetir la operacin desde el paso 3.
i. Una vez finalizada la observacin de la preparacin se baja la platina y se coloca el
objetivo de menor aumento girando el revlver. En este momento ya se puede retirar la
preparacin de la platina. Nunca se debe retirar con el objetivo de inmersin en posicin de
observacin.
j. Limpiar el objetivo de inmersin con cuidado empleando un papel especial para ptica.
Comprobar tambin que el objetivo 40x est perfectamente limpio.
Procedimiento
El profesor le asignar las diferentes estructuras
que se deben observar, realice esquemas con cada
uno de los objetivos.
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Gua de microscopio
Complete los siguientes esquemas con los diferentes enfoques realizados en esta practica.
Consulta
1. Qu tipos de microscopios existen y cual es su uso
(por lo menos cuatro microscopios diferentes).
_____________________________________________
_____________________________________________
_____________________________________________
_____________________________________________
24
Gua de microscopio
4.
Dibuja
en
el
cuaderno
todos
los
enfoques
realizados con los diferentes objetivos y anota tus
propias conclusiones.
6.
A travs de Internet ingrese a la siguiente
pgina y desarrolle el e jercicio planteado all:
http://encina.pntic.mec.es/~esarment/imagenes/practicas/PDescripcionMOp.pdf
25
26
Mtodos de siembra
Objetivos
Desarrollar habilidades para sembrar microorganismos
Diferenciar las clases de siembra utilizadas en microbiologa y seleccionar de acuerdo a las
condiciones requeridas el tipo mas adecuado de siembra
Conceptos Bsicos
La transferencia de un microorganismo de un ambiente a otro con el propsito de cultivarlos se denomina
Siembra, es la tcnica mas usada en el laboratorio de microbiologa, el medio de cultivo donde se van a
transferir los microorganismos debe poseer todos los elementos necesarios para permitir la multiplicacin
de estos.
El asa microbiolgica constituye un instrumento bsico para las siembras, consta de un mango de 20 cm de
longitud cuyo extremo lleva adosado un filamento de platino o nicrom que puede terminar en argolla,
Estos metales tienen la propiedad de alcanzar rpidamente temperaturas altas cuando se exponen a la llama
de un mechero y de enfriarse de nuevo en pocos segundos, lo que permite rapidez en las manipulaciones.
27
Mtodos de siembra
corriente de aire del flujo laminar arrastra el polvo u otras partculas con el aire hacia arriba o hacia fuera,
impidiendo la contaminacin del medio de cultivo.
El asa y la pipeta pasteur deben ser flameadas adecuadamente y enfriadas antes de tocar el inoculo, o el
medio de cultivo. A continuacin se describe brevemente los mtodos de cultivo de uso ms rutinario.
Siembra en placas:
La caja debe mantenerse en la palma de la mano izquierda ligeramente inclinada , con la mano derecha se
maneja el asa previamente esterilizada , con el asa ya esterilizada se toma una gota del liquido o de la
emulsin de la muestra clnica, se deposita en el costado del agar en una caja de petri, se estra a partir de
ese punto pasando suavemente el asa en zig-zag por la superficie del agar sin rasparlo, rotar la placa en un
tercio y repetir el procedimiento de 2 a 3 veces.
28
Mtodos de siembra
Siembra por picadura:
El inoculo es introducido con el asa recta o pipeta pasteur hasta el fondo del medio con un solo
movimiento y teniendo cuidado en hacer el mismo trayecto de entrada que de salida. Debe flamearse la
boca del tubo antes y despus de la siembra. Antes de introducir el tubo a la incubadora, debe dejarse
suelto el tapn de goma para evitar que los gases expulsen el tapn.
Siembra en profundidad:
Es el tipo de siembra mas utilizado cuando se realizan anlisis de alimentos .y consiste en colocar primero
la muestra de anlisis generalmente 1 ml y luego vertir el medio de cultivo a una temperatura no mayor de
45 C luego homogenizar bien las cajas Tambin se conoce como siembra de vertido en placa.
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Mtodos de siembra
Actividad prctica
Realizar siembra masiva, por profundidad y en tubo
Nota : En toda muestra se debe anotar en forma clara. La fecha, nombre y registro de la muestra.
Preguntas
1. Qu es un cultivo axenico.
___________________________________________________________________________________
___________________________________________________________________________________
___________________________________________________________________________________
2. Qu es un cultivo diauxico.
___________________________________________________________________________________
___________________________________________________________________________________
___________________________________________________________________________________
3. Qu es un inculo microbiano.
___________________________________________________________________________________
___________________________________________________________________________________
___________________________________________________________________________________
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Mtodos de siembra
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32
Coloracin de Gram
Objetivos
Al finalizar la prctica el estudiante estar en capacidad de:
Preparar frotis en fresco de microorganismos
Reconocer las diferentes morfologas bacterianas
Adquirir habilidades para colorear bacterias a travs de la coloracin de Gram
Fundamentacin terica
Todos los compuestos orgnicos absorben luz, pero lo hacen en la regin ultravioleta como esta parte no
es visible aparecen a nuestros ojos incoloros o blancos. Por lo general, las bacterias y otros
microorganismos son transparentes y ello dificulta el estudio de los detalles morfolgicos cuando se los
examina en su estado natural Las cubiertas que rodean la clula bacteriana se han identificado por medio
de tcnicas de tincin en microscopa ptica y electrnica, y tcnicas de aislamiento y caracterizacin
bioqumica de los componentes celulares, la gran mayora de las bacterias poseen una pared celular de
peptidoglicanos que les confieren su forma caracterstica y les provee de proteccin mecnica.
La pared celular es responsable de lo que le sucede al colorante utilizado en la Tincin de Gram (1884). La
propiedad de teirse o no de violeta oscuro (Gram positivas o Gram negativas) por esta coloracin es un
criterio de clasificacin importante correlacionable con otras propiedades bacterianas.
Los colorantes se utilizan en microbiologa para:
Teir los microorganismos y sus estructuras (cpsulas, flagelos, esporas, grnulos)
Para diferenciarlos en grupos segn la forma de tomar dichos colorantes.
Para adicionarlos a los medios de cultivos con el fin de inhibir el crecimiento de un grupo
determinado de grmenes.
Los colorantes bacterianos son anilinas que contienen radicales que imparten su propiedad cromgena al
colorante y grupos auxcromos que permiten que el colorante se una a las fibras o tejidos. Si la porcin
coloreada (cromgeno) acta como base, se les denomina colorantes bsicos (catinicos) y s el cromgeno
acta como cido se llaman colorantes cidos (aninicos).
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Coloracin de Gram
Los ncleos de las clulas se tien mejor con colorantes bsicos y el citoplasma con colorantes cidos.
Como la clula bacteriana tiene su material nuclear distribuido por toda la clula se colorea bien con los
colorantes bsicos.
Las bacterias son clulas transparentes y por su tamao (0.1 a 5 m) se pueden observar en el microscopio
en aumento de 40 X o ms. Por su constitucin tienen una carga negativa y al observarlas en las
preparaciones en fresco se ven en continuo movimiento ya que se rechazan unas a otras (movimiento
browniano).
La coloracin de Gram ideada por Hans Cristian Gram en 1844, permite la diferenciacin de los
microorganismos en dos grupos: Gram positivos y Gram negativos.
Nota: Para que esta reaccin ocurra es necesario que las bacterias que se van a colorear tengan su pared
ntegra, para esto se deben utilizar cultivos jvenes.
Tincin de Gram:
El procedimiento se inicia fijando a la llama las bacterias extendidas en un portaobjetos.
Las mismas se tien con una solucin del colorante bsico cristal violeta , durante un minuto., se
enjuagan con agua corriente para eliminar el exceso de colorante.
El paso siguiente consiste en aplicar solucin de Lugol (iodo/ioduro de potasio). El yodo forma
una laca con el cristal violeta, que es insoluble en agua y soluble en alcohol o acetona se deja
durante un minuto, y se enjuaga
Al preparado se adiciona alcohol acetona , durante 30 segundos, se enjuaga.
Finalmente se procede a realizar una coloracin de contraste (diferenciacin) con otro colorante
(fucsina), el cual se deja durante un minuto , se enjuaga y se deja secar la placa .
Materiales:
Colorantes de la coloracin de Gram
Cristal Violeta
Solucin de Lugol
Alcohol -Acetona
Safranina
Cultivos de bacterias (cocos y bacilos)
34
Coloracin de Gram
Lminas portaobjetos para realizar los frotis o las preparaciones hmedas
Laminillas cubreobjetos
Solucin salina
Lminas demostrativas con mezclas de cocos, bacilos y espiroquetas
Procedimiento
Preparacin del frotis:
Si la muestra no es lquida, colocar una pequea gota de solucin salina sobre el portaobjetos antes de
realizar el frotis y disolver en ella la muestra.
35
Coloracin de Gram
5. Calentar nuevamente el
asa para desinfectarla
Una vez fijada la muestra proceda a la coloracin. Verter el cristal violeta sobre el portaobjetos y dejar
actuar por 1 minuto. Enjuagar con agua corriente y dejar escurrir Agregar la solucin de Lugol y dejar
actuar por 1 minuto Escurrir la solucin y enjuagar el portaobjetos con agua corriente Decolorar con el
alcohol-acetona por 30 segundos y enjuagar con agua corriente.
Observe la demostracin de la preparacin del frotis y de la coloracin realizada por el profesor antes de
proceder.
Realice un frotis de un cultivo slido y uno de un cultivo lquido, realice la coloracin de gram, realice los
esquemas correspondientes identificando la morfologa y la coloracin.
36
Coloracin de Gram
Preguntas
Cmo esta compuesta la estructura qumica de la pared
celular de las bacterias Gram positivas y Gram
negativas.
___________________________________________________________________________________
___________________________________________________________________________________
___________________________________________________________________________________
Cul es la accin
de cada uno de los compuestos que
se utilizan en la coloracin de Gram.
___________________________________________________________________________________
___________________________________________________________________________________
___________________________________________________________________________________
Si usted hiciera la
mirara al microscopio
una
bacteria
gram
negativa. Cules son
bacterias.
___________________________________________________________________________________
___________________________________________________________________________________
___________________________________________________________________________________
37
38
Medios de cultivo
Introduccin
Un mtodo fundamental de estudiar las bacterias es cultivarlas en un medio lquido o en la superficie de un
medio slido denominado medio de cultivo. Los medios de cultivo contienen distintos nutrientes que van
desde azucares simples hasta sustancias complejas tales como la sangre o el extracto de caldo de carne, para
identificar cada tipo de bacteria se estudian sus caractersticas bioqumicas sembrndolas en medios de
cultivos especiales.
Cada bacteria individual genera por escisin binaria una colonia microscpica compuesta por decenas de
millones de clulas similares a la original; si esta colonia individual se siembra a su vez en un nuevo medio,
crecer como un cultivo puro de un solo tipo de bacteria.
Objetivos
Al finalizar esta sesin, el alumno se encontrar en capacidad de:
Comprender las bases tericas que fundamentan la utilizacin de los medios de cultivo, sus
condiciones, preparacin y conservacin; adems de otros trminos relacionados, tales como, tipos
de siembra, tipos de colonia y cepario
Preparar medios de cultivo de mayor utilizacin en el laboratorio
Practicar los distintos tipos de siembras usados frecuentemente
Marco terico
Los medios de cultivo en microbiologa
Uno de los sistemas ms importantes para la identificacin de microorganismos es observar su crecimiento
en sustancias alimenticias artificiales preparadas en el laboratorio. El material alimenticio en el que crecen
los microorganismos se denomina medio de cultivo y el crecimiento de estos es el cultivo.
39
Medios de cultivo
Disponibilidad de nutrientes adecuados
Consistencia adecuada del medio
Presencia o ausencia de oxigeno y otros gases
Condiciones adecuadas de humedad
Ausencias de luz ambiental
pH
Temperatura
Esterilidad del medio
Recomendaciones generales
Para la preparacin de medios de cultivo debe emplearse agua recin destilada o desmineralizada, de
reaccin neutra y dentro de lo posible pobre en microorganismos. A una cantidad de agua
aproximadamente igual a la mitad de la requerida, se agrega la cantidad calculada del medio de cultivo
desecado, agitndose e incorporndose el material que se encuentre adherido a las paredes internas del
recipiente., posteriormente se complementa el volumen de agua Los medios de cultivo cuyo solidificante
sea agar, deben reposar a temperatura ambiente de 10 a 15 minutos para asegurar una buena hidratacin del
solidificante; para conseguir una solucin completa de los medios de cultivo que contienen agar o gelatina
es recomendable su calentamiento, sin embargo debe evitarse la prolongacin innecesaria de este recurso.
40
Medios de cultivo
Depositarla aspticamente en los medios elegidos
Esterilizar los instrumentos empleados antes y despus de cada operacin
La tcnica general de la siembra variara segn el estado fsico del material a sembrar y del medio de cultivo.
Esquematizacin de la preparacin
cultivo
de los medios de
El siguiente esquema muestra una secuencia lgica de los pasos ms significativos en la preparacin de los
medios de cultivo, con el fin de optimizar el proceso.
41
Medios de cultivo
El asa y la pipeta pasteur deben ser flameadas adecuadamente y enfriadas antes de tocar el inoculo, o el
medio de cultivo. A continuacin se describe brevemente los mtodos de cultivo de uso ms rutinario
Actividad prctica
1. Prepare los medios de cultivo que le indique el
profesor, teniendo en cuenta que en cada caja se
deben colocar 20 mL de agar.
de
de
Para consultar
Qu es un cepario y cmo se debe mantener.
___________________________________________________________________________________
___________________________________________________________________________________
___________________________________________________________________________________
42
Medios de cultivo
Describa
dos
bacterianas.
mtodos
de
conservacin
de
cepas
___________________________________________________________________________________
___________________________________________________________________________________
___________________________________________________________________________________
liofilizadas
que
se
___________________________________________________________________________________
___________________________________________________________________________________
___________________________________________________________________________________
Sustancias selectivas
Sistema diferencial
Agar eosina-azul
de metileno
(EMB)
- Lactosa
- Sacarosa
- Los colorantes son
reveladores del sistema
diferencial
Agar xilosa-lisina
Desoxicolato
(XLD)
- Tiosufalto sdico
- Citrato frrico amnico
- Lisina
Utilizacin
- Poco inhibidor
- Permite el crecimiento de
enterobacterias y enterococos
- Diferencia E. coli de otras lactosa
positivas
- Posee gran carcter diferencial para
Candida y actinomicetales aerobios
43
Medios de cultivo
- Xilosa, lactosa, sacarosa
- Citrato frrico amnico
- Tiosulfato sdico
- Lactosa, sacarosa,
salicina
- Azul de bromotimol
- Indicador de Andrade
Medio de
Hektoen
- Sales biliares
- Desoxicolato
sdico
Agar
salmonela-shigela
(SS)
- Sales biliares
- Verde brillante
- Citrato sdico
Agar Verde
Brillante
- Verde brillante
- Permite el crecimiento de
salmonelas
- Permite el crecimiento de
salmonelas y shigelas
44
45
Marco terico
Los microorganismos se encuentran en muchos ambientes naturales. Pueden ser localizados en hielo,
tierra, aceite, gasolina, agua, aire, alimentos, tracto intestinal, piel, etc. Slo unos pocos lugares en la
naturaleza como crteres de volcanes y tejidos vivos estn libres de ellos. Su amplia distribucin puede ser
demostrada exponiendo medios estriles a varios ambientes y observando su crecimiento.
El laboratorio como los otros lugares est poblado de microorganismos suspendidos en el aire, o llevados
por el polvo a las superficies. Estos son de particular importancia para quienes trabajan en el laboratorio,
puesto que deben practicar tcnicas mediante las cuales se evite la contaminacin de los materiales con los
cuales se trabaja, tales como: medios, soluciones y equipo estril.
Materiales
Agar nutritivo o Agar Plate Count en tubos de ensayo.
Cajas de Petri estriles.
Bao Maria.
Escobilln de algodn.
Asa metlica.
Lmpara.
Procedimiento
Muestras de la poblacin bacteriana ambiental.
1. Funda el agar nutritivo o agar plate count y enfrelo hasta 45 C aproximadamente (que usted
soporte tener el tubo en la mano).
2. Vierta 15 ml del agar nutritivo en cada una de las cajas de Petri.
46
47
Preguntas
1. Consulte qu sustancias se utilizan para mantener
la poblacin bacteriana en niveles muy bajos en los
siguientes sitios:
Salas de ciruga ___________________________________________________________
Fbricas de alimentos ____________________________________________________
Laboratorios farmacuticos ____________________________________________
48
49
Marco terico
La zona de temperatura en que crecen los organismos es relativamente pequea, y se extiende
aproximadamente entre - 5 y + 80 C. El lmite superior de temperatura para el crecimiento biolgico est
determinado por la termolabilidad de las protenas celulares, y el inferior, por el punto de congelacin del
agua, que es de varios grados bajo cero cuando contiene disueltas, cantidades considerables de solutos.
Debe hacerse notar que los organismos vivos pueden sobrevivir a temperaturas mucho ms bajas que la
mnima requerida para el crecimiento. Los microorganismos pueden conservar su viabilidad durante largo
tiempo si se mantienen a baja temperatura en estado de congelacin; de hecho, un medio excelente para
conservar las bacterias es mantenerlas a la temperatura del nitrgeno lquido (-196C). La temperatura que
permite el crecimiento de cualquier microorganismo particular raramente sobrepasa los 35C. Cuando se
representa la velocidad de crecimiento en funcin de la temperatura, se obtiene una curva de forma
caracterstica.
Entre los microorganismos procariticos son particularmente notables las diferencias respecto a la zona de
temperatura en que ocurre su crecimiento. Basndose en esta propiedad se pueden distinguir tres grupos
fisiolgicos principales: termfilos, mesofilos y psicrofilos.
Al interpretar la influencia de la temperatura en la velocidad del crecimiento microbiano hay que tener en
cuenta el efecto de la temperatura en la velocidad de las reacciones qumicas.
Aproximadamente, la velocidad de la mayora de las reacciones qumicas se dobla por cada incremento de
10 C en la temperatura. La ecuacin de Arrhenius describe matemticamente la relacin existente entre la
velocidad de reaccin y la temperatura:
Log10u = -H
+ C
2.303RT
50
de la
desnaturalizacin de las protenas celulares; por encima de la temperatura ptima, este factor adquiere
rpidamente progresiva importancia, y determina una cada brusca de la velocidad de crecimiento. Debe
hacerse notar que el crecimiento se detiene cuando se destruyen las protenas esenciales ms termolbiles
de la clula.
Diferentes especies microbianas varan ampliamente en sus fluctuaciones de la temperatura ptima para su
desarrollo: las formas psicrofilias crecen mejor a temperaturas bajas (15-20 C), las formas mesofilas lo
hacen mejor a 30 -37C y las termofilas a 50-60 C aunque tambin podemos encontrar microorganismos
termoduricos, los cuales comprende las bacterias que sobreviven pero no son capaces de crecer a las
temperaturas de pasteurizacin.
La mayora de los microorganismos son mesofilos, y se encuentran en casi todos los productos, esto
debido a que su temperatura de desarrollo (30 C) es la temperatura ptima para muchas de las formas de
vida libre; adems se encuentran ampliamente difundidas en el medio ambiente.
El lmite mximo de la gama de temperatura, tolerado por cualquier especie se correlaciona bien con la
estabilidad trmica general de las protenas de dicha especie segn mediciones hechas en extractos
celulares.
T mnima
T ptima
T mxima
Mesofilos
10-25C
30-40 C
43+2C
Termofilos
24-45C
50-55 C
70C
Menor de 55 C
OC
Mayor de 65 C
10-15C
115C
20 C
Microorganismos
Termoduricos
Psicrofilos
51
52
Procedimiento
1. Preparar la muestra y las diluciones de los homogenizadores. Ver adelante.
2. Pipetear por triplicado en cajas de Petri alcuotas de 1 ml de las diluciones.
3. Inmediatamente, verter en cada caja de 15 ml de agar Plate count, fundido y mantenido a
45-50 C.
4. Mezclar el inoculo con el agar, inclinando y girando las cajas.
5. Como prueba de esterilidad, verter la cantidad del medio de cultivo sobre una caja de Petri sin
muestra (marcar = control).
6. Dejar las cajas sobre la mesa hasta solidificacin del agar.
7. Invertir las cajas e incubar a 37 C por 48 horas.
Preparacin de homogenizados
Para realizar un conteo en placa es necesario recurrir al mtodo de las diluciones decimales. Es decir
preparar diluciones de la muestra hasta que se estime conveniente de acuerdo con una poblacin
microbiana esperada. El agua peptonada y la solucin salina fisiolgica con peptona al 0.1% se emplean
como agente diluyente y dan los mejores resultados en la mayora de los casos.
Los alimentos slidos requieren hacerse lquidos, se debe preparar una dilucin 10-1 adicionando 10 g del
alimento y mezclndolos con 90 ml de diluyente o cualquier otra cantidad que conserve la misma
proporcin. Posteriormente se deja homogenizar la mezcla utilizando un vortex o con movimientos de
rotacin hechos con la mano. A partir de all se preparan diluciones en serie 10-2, 10-3, etc.
Para el xito del proceso, es necesario realizar una buena agitacin y utilizar pipetas diferentes para cada
dilucin. Recuerde que este procedimiento pretende diluir los microorganismos presentes en una muestra
y se hace indispensable no mezclar pipetas que vengan de diluciones pequeas (alto contenido de
microorganismos) con diluciones altas.
53
Procedimiento
1. Preparar las muestras y las diluciones de los homogenizados. (Helado)
2. Pipetear por duplicado en cajas de Petri 1 ml de la serie de diluciones.
3. Inmediatamente verter en cada caja 15ml del medio agar para recuento fundido y mantenido a
50 C.
4. Mezclar el inoculo con el agar, inclinado y girando las cajas.
5. Realizar la prueba de esterilidad, vertiendo una cantidad de medio de cultivo sobre una caja de
Petri sin muestra (marcar =control).
6. Dejar las cajas sobre la mesa hasta solidificacin.
7. Invertir las cajas e incubar a 7 C. durante 8 das
54
Procedimiento terico
1. Homogenizar la muestra de leche y transferir 5 ml a un tubo de ensayo con tapa rosca.
2. Colocar el tubo en un bao Mara a 63 C por 30 min.
3. Enfriar inmediatamente el tubo en una cubeta con hielo (aprox 5 min).
4. Agitar el tubo y hacer diluciones hasta 10-3.
5. Sembrar cajas por duplicado de cada dilucin y agregar el agar plate count.
6. Incubar a 35-37 C por 24 - 48 horas.
7. Hacer recuento correspondiente, e informar como # de ufc termoduricas/ml.
8. Realizar el control de esterilidad.
55
Muestra
1ml
1ml
15ml agar
15ml agar
15ml agar
56
10 ml
Muestra
5ml
90ml H2O
peptonada
1ml
bao mara
63C x30
bao mara
por 5
1ml
9ml H2O
peptonada
9ml H2O
peptonada
10-1 1ml
10-2 1ml
10-3 ml
15ml agar
15ml agar
15ml agar
Hacer control
Incubar a 37C durante 48 horas
57
Cules
son
los
principales
contaminantes de la leche.
microorganismos
___________________________________________________________________________________
___________________________________________________________________________________
___________________________________________________________________________________
Qu
es
la
pasteurizacin
pasteurizacin.
que
la
ultra
___________________________________________________________________________________
___________________________________________________________________________________
___________________________________________________________________________________
58
59
Objetivos
Identificar las diferencias entre el efecto bactericida y el efecto bacteriosttico
Realizar pruebas que permitan dilucidar la efectividad de las diferentes soluciones antimicrobianas
empleadas en el laboratorio
Evaluar tiempos de exposicin de los desinfectantes, y explicar su accin frente a los
microorganismos
Marco terico
Antibitico (del griego, anti, contra; bios, vida) es cualquier compuesto qumico utilizado para eliminar o
inhibir el crecimiento de organismos infecciosos. Una propiedad comn a todos los antibiticos es la
toxicidad selectiva: la toxicidad es superior para los organismos invasores que para los animales o los seres
humanos que los hospedan. Los antibiticos pueden lesionar de forma selectiva la membrana celular en
algunas especies de hongos o bacterias; tambin pueden bloquear la sntesis de protenas bacterianas.
La eficacia de los antibiticos algunas veces depende de cun rpido detiene el crecimiento de las bacterias,
cuando se agrega el antibitico a un cultivo stas continan creciendo durante aproximadamente dos o
cuatro generaciones antes de ser inhibido su crecimiento, slo despus de la formacin de muchas clulas,
el frmaco se puede volver bactericida o bacteriosttico. En algunos casos puede ser mejor usar un agente
60
61
Procedimiento
En esta prctica se tendrn en cuenta diferentes variables tales
concentracin del desinfectante y tiempo de exposicin.
como:
clase
de microorganismo,
Repetir el procedimiento para todos los desinfectantes a evaluar. El profesor le asignara el microorganismo
a evaluar, se utilizar como control positivo lmpido y se har control de crecimiento de cada
microorganismo.
5 minutos
utilizando
15 minutos
cruces
para
30 minutos
62
anote
el
nmero
de
___________________________________________________________________________________
___________________________________________________________________________________
___________________________________________________________________________________
Represente
tabla.
Microorganismo
sus
resultados
utilizando
1/10
1/100
la
siguiente
Conclusin
Recuento de UFC
Tiempo de exposicin
Recuento UFC
5
15
30
45
63
Preguntas
Como tecnlogo qumico qu factores tendra en cuenta
para elegir un desinfectante.
___________________________________________________________________________________
___________________________________________________________________________________
___________________________________________________________________________________
Qu significa sustancias
espectro reducido.
de
amplio
espectro
de
___________________________________________________________________________________
___________________________________________________________________________________
___________________________________________________________________________________
Qu
es
un
agente
desinfectante.
esterilizante,
antisptico
___________________________________________________________________________________
___________________________________________________________________________________
___________________________________________________________________________________
Existen
diferentes
mtodos
para
microbiolgico explique dos de ellos. No
incluir el control por sustancias qumicas.
control
se debe
___________________________________________________________________________________
___________________________________________________________________________________
___________________________________________________________________________________
64
Adicione el medio de
Siembra por profundidad.
cultivo.
65
66
Fundamentacin terica
Los hongos son organismos eucariticos portadores de esporas, con nutricin por absorcin, no son
fotosintetizadores (no tienen clorofila) y se reproducen sexual y/o asexualmente.
Junto con las bacterias, los hongos son los causantes de la putrefaccin y descomposicin de toda la
materia orgnica Algunos son parsitos de organismos vivos y producen graves enfermedades en plantas y
animales. Otros hongos filamentosos son utilizados para la produccin de antibiticos. La penicilina fue el
primer antibitico que se produjo industrialmente. Gracias a los aportes de Flemming y sus
descubrimientos, fue posible la produccin a escala del Penicillium notatum.
Las enzimas hidroliticas de los hongos se utilizan en diversos procesos industriales. Cuando crecen sobre
salvado caliente de trigo o de arroz, algunas especies fngicas producen amilasas una clase de enzimas que
se utilizan en fermentacin alcohlica. Las proteasas que se obtienen de otros hongos se emplean en la
fabricacin de pegamento lquido.
Por otra parte cada da se descubren nuevas aplicaciones industriales de los hongos, hasta el punto que
muchos de ellos se comercializan desde alimentos hasta insecticidas biolgicos.
67
La siembra es por superficie en el medio de cultivo PDA (papa, dextrosa , agar) y agar rosa de bengala
Incubar a temperatura ambiente por ocho das, colocando cinta alrededor de las cajas.
Despus de pasado el tiempo de incubacin realice una descripcin macroscpica de las estructuras
Para realizar el anlisis microscpico tome una tirilla de cinta pegante transparente colquela en contacto
con una parte del hongo presione y conservando la polaridad colquela en el portaobjetos, adicione una
gota de azul de lactofenol y cbrala con una laminilla teniendo la precaucin de no dejar burbujas, realice
los diferentes enfoques hasta un aumento de 40X. (Ver demostracin del profesor).
68
Defina lo siguiente:
Micelio : ______________________________________________________________________
Esporas : ______________________________________________________________________
Conidias : _____________________________________________________________________
Hongos filamentosos : _____________________________________________________
Levaduras : ___________________________________________________________________
69
70
71
Introduccin
La presencia de bacterias patgenas, en el agua destinada al consumo humano es un riesgo siempre
presente, que se incrementa en las reas de mayor densidad de poblacin. El agua contaminada puede ser
la causa de muchas enfermedades infecciosas como: Fiebre Tifoidea, Disentera, Clera, entre otras.
Esto ha llevado a la necesidad de realizar anlisis microbiolgicos de rutina a partir de muestras de agua.
Objetivos
Determinar la calidad microbiolgica del agua
Desarrollar habilidades para el manejo de la tcnica de filtracin por membrana
Establecer diferencia entre bacterias Coliformes Totales y Coliformes fecales
Marco terico
Por la gran variedad de bacterias patgenas que se pueden encontrar en una muestra de agua se hace
necesario e indispensable el control rutinario de todos aquellos microorganismos indicadores que deben
cumplir los siguientes requisitos:
- Ser fciles de aislar y cultivar en el laboratorio
- Ser relativamente incuos para el hombre y animales
- Su presencia en el agua debe de estar relacionada cualitativamente y cuantitativamente con la de otros
microorganismos patgenos y/o de aislamiento difcil
72
Otros microorganismos
Estreptococos fecales como la especie lancefield del grupo D y Q que se encuentra en el intestino de
mamferos y aves.
Los Clostridium sulfito reductor: bacterias esporuladas causantes de enfermedades como Botulismo,
Gangrena gaseosa, Ttano, este gnero ofrece gran resistencia a los tratamientos de potabilizacin
del agua por esto es de importancia su anlisis.
El reglamento tcnico sanitario para control de calidad de aguas potables de consumo humano establece
como anlisis microbiolgico mnimo el de coliformes totales y fecales. El anlisis normal incluye los dos
grupos anteriores, ms grmenes totales.
El anlisis completo incluye los tres gneros de grupos antes mencionados, ms Estreptococos fecales,
Clostridium sulfito reductor y otros grmenes patgenos.
Lmites permitidos
- Grmenes totales: Hasta 100 por ml de agua
- Bacterias Coliformes y Estreptococos fecales: Ausencia en 100 ml de agua
- Clostridium sulfito reductor: Ausencia en 20 ml de agua
- Ausencia de microorganismos Parsitos y/o Patgenos
73
Tcnica :
Mezclar el agua por inversin unas 10 veces.
Pasar 100 ml de agua por el filtro de membrana.
Poner el filtro en el medio de Cultivo Cromocult.
Incubar de 35- 37 C por 48 horas.
Leer directamente en el filtro.
Limpiar el mesn de
trabajo con alcohol al
70%
Prender el
mechero.
74
Tcnica :
- Se mezcla bien el agua por inversin 10 veces.
- Se hace dilucin de la muestra 1/10 y 1/100 con APE. (Agua peptonada esteril)
- Se siembra 1ml de la solucin madre y 1 ml de cada dilucin en el medio FLUOROCULT LMX.
- Se incuba a 35-37 C por 48 horas.
Le ctura :
- Tubos positivos para coliformes totales los que presenta turbidez
- Tubos positivos para coliformes fecales:
1. Los que al llevarlos a la Luz UV, presenten fluorescencia.
Para hacer la prueba confirmatoria de E. coli se adiciona directamente sobre el tubo el reactivo de indol
con el reactivo de Kovacs, la prueba sera positiva si aparece un anillo de color rojo, y negativa si aparece
un anillo de color amarillo.
Positivo: presencia de Coliformes fecales (Escherichia coli).
La dilucin de la primera parte tambin puede hacerse aadiendo a la primera serie de tubos con el medio
Fluorocult, 0,1 ml de agua problema.
A la segunda serie 1 ml de agua.
A la tercera serie 10 ml de agua.
No ta : Si el agua para analizar contiene cloro, se debe tomar la muestra en frasco de vidrio estril que
contenga 0,25 ml de tiosulfato de sodio por cada 100 ml de agua.
75
P reguntas
Cul es la normatividad vigente que regula la calidad
del agua.
___________________________________________________________________________________
___________________________________________________________________________________
___________________________________________________________________________________
Q u
significado
tiene
el
hallazgo
de
coliformes fecales en el agua potable.
bacterias
___________________________________________________________________________________
___________________________________________________________________________________
___________________________________________________________________________________
76
el
anlisis
de
agua
utilizando
___________________________________________________________________________________
___________________________________________________________________________________
___________________________________________________________________________________
C ules
son
los
microorganismos
utilizados
como
bioindicadores de contaminacin en agua potable.
___________________________________________________________________________________
___________________________________________________________________________________
___________________________________________________________________________________
77
Objetivos
Al finalizar esta sesin, el alumno estar en capacidad de:
Determinar la presencia no de sustancias antimicrobianas evaluando el efecto
inhibitorio de estas sobre algunos microorganismos
Describir metodologas que permiten evaluar el efecto antibacteriano de diferentes
sustancias
Marco terico
Mtodo de difusin en placa
Se basa en la difusin de una solucin de agente antimicrobiano desde el reservorio a travs de
una capa de agar que ha sido inoculada con un microorganismo. Se colocan cantidades
medidas de las sustancias a ensayar en cajas con medio de cultivo slido inoculado con un
microorganismo. Las cajas se incuban para permitir el desarrollo del microorganismo. La
respuesta obtenida es una zona clara (halo) de inhibicin del crecimiento en torno a los
reservorios. La base cuantitativa del ensayo es la relacin entre el dimetro de la zona de
inhibicin y el dimetro del antibitico.
Procedimiento
Preparacin del inculo
- Tomar de 3 a 5 colonias bien aisladas y del mismo tipo de morfologa, transferir a un tubo con 4 a
5 ml de un medio de cultivo adecuado, tal como infusin cerebro corazn (BHI).
- El caldo de cultivo es incubado a 35C por 24 h.
- La turbidez del caldo se ajusta con solucin salina estril o con caldo para obtener una turbidez de
Abs= 0.1 a = 625 nm ptimamente comparable a un estndar de 0,5 McFarland.
10l
Control
10l
10l
25 mg/ml
100 mg/ml
50 mg/ml
10l
DMSO 99%
Lectura
de
resultados
las
cajas
interpretacin
de
los
Las zonas de inhibicin resultantes deben ser uniformemente circulares en una capa homognea de
crecimiento. Los dimetros de la zona de inhibicin completa son medidos en mm. pasando por el centro
Sensible
Implica que una infeccin debido a una cepa puede ser apropiadamente tratada con la dosis de agente
antimicrobiano recomendado para ese tipo de infeccin y especie infectante.
Intermedio
Incluye aislamientos con agentes antimicrobianos con una concentracin inhibitoria mnima (CIM) que se
aproximan usualmente a nivel de tejido y sangre disponible y para los cuales su velocidad de respuesta
puede ser ms lenta que la de los aislamientos susceptibles.
Resistente
Las cepas resistentes no son inhibidas por la concentracin sistmica usualmente alcanzable de un agente
cuando los esquemas de dosificacin normal son usados. Pueden tener CIM que caen dentro del rango
donde estn disponibles mecanismos de resistencia especficos.
Preguntas
Cul es la importancia de encontrar nuevas fuentes de
sustancias antibacterianas.
___________________________________________________________________________________
___________________________________________________________________________________
___________________________________________________________________________________
Describa
tres
mecanismos
de
accin
antibiticos frente a las bacterias.
_____________________________________________
_____________________________________________
_____________________________________________
de
los
85
Objetivos
Efectuar anlisis microbiolgico de manipuladores
Identificar los principales microorganismos que se encuentran en los manipuladores de alimentos
de las cafeteras de la Universidad Tecnolgica de Pereira
86
Procedimiento
Tome el hisopo estril, desempquelo y mjelo en el caldo, escurra el hisopo contra las paredes internas
del tubo.
El hisopo se debe pasar por todas las superficies de las manos incluyendo las uas, mjelo nuevamente
para dejar en el tubo los microorganismos y luego contine con el recorrido por las manos, completando la
izquierda y la derecha, por ultimo deje el hisopo en el tubo.
A partir del tubo tome 2 ml, 1 ml, 0.1 ml y siembre en cada caja y adicione agar OGY fundido, homogenice
e incube a 22 OC de 3 a 5 das. Este mismo procedimiento se repite pero adicionando agar VRB y llevando
a incubar a 35 C de 24 a 48 horas.
Despus de la incubacin, seleccione la caja que presente el mejor recuento, realice este y haga la
conversin necesaria para informar en trminos de 1 ml.
Nota : Este examen se debe hacer antes y despus de lavarse las manos, para evaluar el proceso de
limpieza y desinfeccin.
Actividad Grupal
Sern distribuidos por el profesor para muestrear las personas de las cafeteras de la UTP, realizaran frotis
de manos y siembra directa de una persona manipuladora de alimentos, luego informaran el recuento y el
tipo de microorganismos aislados.
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Describa
algunos
microorganismos
indicadores
alteracin y contaminacin en los alimentos
de
___________________________________________________________________________________
___________________________________________________________________________________
___________________________________________________________________________________
88
89
Objetivos
Evaluar la calidad microbiolgica de algunos cosmticos
Leer e interpretar los diferentes resultados
Procedimiento
Recuento de bacterias mesofilas
Materiales
- 1 frasco con 90 ml de caldo TAT (caseina lecitina polisorbato)
- 2 tubos con 9 ml de caldo TAT
- 3 pipetas de 1 ml
- 120 ml de agar casoy fundido
- 1.2 ml de solucin de TTC (Cloruro de trifenil tetrazolio) al 0.5%
Pesar 10 g del producto (cosmtico) directamente en el frasco con los 90 ml de caldo TAT, mezclar dejar
15 minutos a temperatura ambiente (esto ayuda a inactivar el preservante)
Hacer diluciones 10-2 y 10-3
Sembrar por duplicado 1 ml de cada una de las diluciones en profundidad
Adicionar 15-20 ml de agar casoy
Mezclar y dejar solidificar
Incubar a 37 0 C por 48 horas
90
Metodologa
A partir de las diluciones realizadas para el recuento de bacterias mesofilas, sembrar 1 ml de cada dilucin
en tres tubos para crear una serie. Mezclar
Incubar a 35 C por 24 horas
Leer de la siguiente manera: coliformes por cambio de color a verde azulado
Para la lectura de E. coli se toman los tubos positivos para coliformes se observan bajo luz uv, los tubos
que presenten fluorescencia azul positiva, se presumen como E. coli, se confirman con la presencia de un
anillo color rojo al adicionar el reactivo de Kovac.
Prueba
de
aerouginosa
ausencia
/presencia
para
Pseudomonas
Materiales
- 1 frasco con 225 ml de caldo triptofano
- 2 cajas de agar cetrimide
- 1 tira de oxidasa
91
Preguntas
Como es la calidad microbiolgica
analizados por usted, Explique.
de los cosmticos
___________________________________________________________________________________
___________________________________________________________________________________
___________________________________________________________________________________
92
93
Introduccin
Se suele definir el crecimiento de cualquier sistema biolgico como el incremento ordenado de todos los
elementos componentes de ese sistema, lo cual implica un aumento de la masa celular que eventualmente
conduce a la multiplicacin celular. En organismos pluricelulares dicha multiplicacin se traduce en un
aumento del tamao del individuo, mientras que en unicelulares que se dividen por fisin o por gemacin,
lo que ocurre es un aumento de la poblacin. En los microorganismos cenocticos (en los que la
duplicacin del genoma no se acompaa de divisin celular) el crecimiento se traduce en aumento de
tamao de la colonia cenoctica. El crecimiento bacteriano podemos estudiarlo desde dos puntos de
vista:
A escala individual
A escala poblacional
Los eventos de crecimiento en el mbito individual hacen referencia al ciclo celular, y dentro de ste
podemos abordar los siguientes temas:
94
Ambos tipos de expresiones son equivalentes entre s en cultivos que estn en crecimiento balanceado o
equilibrado (en el que todos los componentes aumentan una misma proporcin por unidad de tiempo).
Marco terico
Para establecer el crecimiento bacteriano en trminos de masa celular existen diferentes mtodos dentro de
los cuales se destacan: determinacin de peso hmedo, determinacin de peso seco, determinacin de
nitrgeno total, medida de consumo de nutrientes, mtodos turbidimetricos, recuentos en cmara, recuento
de viables en placa, y recuento en filtros entre otros.
El crecimiento bacteriano esta sometido a principios matemticos elementales que permite predecir el
comportamiento del sistema en cualquier momento dado.
La duplicacin de un cultivo bacteriano sigue, inicialmente los principios bsicos de una reaccin de
primer orden con relacin al nmero de clulas existentes, por tanto la rapidez de la duplicacin celular
ser:
dN/dt = KN
En donde N es el nmero de clulas presentes en un momento dado, y K la constante de rapidez de
crecimiento, integrando la expresin anterior entre los tiempos se tiene la expresin:
ln X ln X0= K (t-to)
X y Xo corresponden a la cantidad de cualquier componente de sistema (# de clulas, DNA, RNA o
protenas). La ecuacin tambin puede expresarse como:
X = Xo e k (t-to)
95
Materiales
- Cultivo bacteriano
- Espectrofotmetro
- Erlenmeyer
- Agar Plate Count
- Pipetas
- Tubos con 5 ml de caldo BHI
Procedimiento
Tome una colonia de la cepa a estudiar y dilyala en 10 ml de caldo BHI, incube por 24 horas.
Tome 0.3 ml del medio anterior y adicinelos a un erlenmeyer con 30 ml de caldo BHI (Cultivo inicial).
Tome 5 ml del medio anterior y colquelos en una celda de espectrofotometra. Mida la O.D (densidad
ptica) y denomine este tiempo como tiempo cero. Las mediciones se harn a una longitud de onda de 550
nm Este valor refleja un parmetro proporcional a la concentracin de masa celular (siguiendo la ley de
Lambert-Beer). El blanco es el medio de cultivo sin inocular.
A partir del tiempo considerado como 0 se seguirn tomando muestras de 5 ml cada 30 minutos del
cultivo inicial el cual esta en agitacin a una temperatura de 37 C en las que se medir la turbidez para
reflejarlo con posterioridad en una grfica.
Cada vez que mida la O.D deber preparar 5 diluciones seriadas y sembrar 1 ml de cada dilucin en agar
Plate Count, se debe repetir el anterior procedimiento hasta que se obtengan 8 lecturas.
96
Tabla de datos
Tiempo (min)
0
30
60
90
120
150
180
210
240
O.D.
Recuentos
UFC/ml
97
98
99
Objetivos
Llevar a cabo los pasos que conlleven a la elaboracin del vino a partir de fruta
Identificar la microbiota natural y contaminante del proceso
Marco terico
El vino es el resultado de la transformacin del jugo de la uva o de otros sustratos por medio de la
fermentacin alcohlica. El proceso fermentativo se lleva a cabo mediante la inoculacin de cepas puras
seleccionadas de levadura, las cuales transforman un medio inestable en uno estable del cual resulta el vino.
Dicha estabilidad ha sido el soporte para las industrias vincolas que antiguamente contaban con escasos
medios tecnolgicos.
Materiales
- Fruta en estado optimo de madurez
- Sacarosa (Azcar comercial)
- Vino Blanco
- Benzoato de sodio, sorbato de potasio o anhdrido sulfuroso
- Hipoclorito de sodio
- Botellas de vidrio oscuro con corcho
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Procedimiento
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Primer trasiego
Despus de transcurrido el tiempo de fermentacin, iniciar la
filtracin con una gasa evitando al mximo que se mezcle el
sobrenadante con el sedimento del mosto, ya que ste
contiene cido tartarico, el cual produce una mayor
acidificacin del vino.
Del filtrado, realice coloracin de Gram y siembra en medio
selectivo para hongos y bacterias lcticas.
Adicionar metabisulfito de sodio al 4% al frasco nmero 1.
Ver figura 2. Dejar a medio tapar por tres das.
102
Segundo trasiego
Filtrar nuevamente el mosto, realizar coloracin de gram y siembra en medio selectivo para hongos.
Pasteurizacin
Colocar en un beaker el vino, taparlo con papel aluminio y llevarlo al bao Maria a una temperatura de
60 C durante 30 min. Al terminar este proceso inmediatamente enfriar en nevera.
Adicionar azcar al gusto.
Preguntas
Que se observa en los diferentes pasos, donde se practica
la coloracin de Gram.
___________________________________________________________________________________
___________________________________________________________________________________
___________________________________________________________________________________
103
Por
qu
se
debe
activar
adicionarla al mosto.
la
levadura
antes
de
___________________________________________________________________________________
___________________________________________________________________________________
___________________________________________________________________________________
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105
Objetivos
Desarrollar los procesos necesarios para llevar a cabo una fermentacin lctica y obtener yogurt
Identificar las variables ms relevantes en las propiedades organolpticas del yogurt
Marco terico
El yogurt es un derivado de la leche que se obtiene al aadir a la leche hervida, entera o desnatada los
fermentos que degradan la lactosa y la transforman en cido lctico., los microorganismos responsables de
este proceso son Streptococcus thermophilus y Lactobacillus bulgaricus.
Las propiedades que contiene el yogurt, lo hacen un alimento altamente nutritivo pues aporta al ser
humano protenas de alta calidad, as como vitaminas, carbohidratos y grasas.
Para la elaboracin de yogurt se parte generalmente de una leche con un contenido de slidos no grasos del
15 al 16%. Esto se puede observar en la acidez titulable al trmino de la incubacin ya que los valores que
se especifican son de 75 a 90Th.
106
Las cualidades nutritivas del yogurt provienen no slo de la presencia de los compuestos de la leche, sino
tambin de la transformacin de stos como resultado de la fermentacin cido-lctica causada por los
microorganismos.
La ingestin de este producto es recomendable en todas las edades. Para la mayor parte de los lactantes
intolerantes a las leches constituye un magnfico alimento, pues la reduccin moderada de su contenido de
lactosa, en comparacin con el de la leche, lo hace ms apropiado para los pacientes con deficiencia de
lactasa.
Las propiedades bacteriostticas del yogur contribuyen a la resistencia a las infecciones, es decir , permiten
prevenir los trastornos intestinales evitando la colonizacin y el desarrollo de grmenes patgenos,
estimulando el sistema inmunitario ya que contienen bacterias activas que forman parte de nuestra
microbiota intestinal indispensable, las cuales participan en la descomposicin de los alimentos en el
proceso digestivo.
El yogurt se cataloga como un producto de alta digestibilidad, que aumenta el coeficiente de absorcin de
numerosas sustancias, tales como protenas y grasas. Adems contiene protenas, grasas graduales, hidratos
de carbono (con predominio de la lactosa), vitaminas del tipo A y B, niacina y cidos pantotnico y flico
difciles de encontrar en otros alimentos, as como diferentes minerales, adems de fsforo, potasio,
magnesio, zinc y yodo, entre otros.
El consumo de yogurt intensifica la retencin de fsforos, hierro y calcio en comparacin con la leche;
tambin cabe destacar su participacin en la disminucin de los problemas alrgicos; el componente bsico
del yogurt es la leche, a la que se agregan enzimas que favorecen la fermentacin cido-lctica hasta obtener
la coagulacin. La calidad del producto que se obtiene depende fundamentalmente de la calidad de los
fermentos y del tipo de leche que se utilice, cada una posee distintas proporciones de agua, protena,
lactosa, grasas y sales minerales; no obstante, se puede tomar como base diferentes tipos de leches, como
de vaca, oveja, cabra, o bfala.
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Procedimiento
- Tomar 2 L de leche entera pasteurizada
- Calentar en un bao Mara hasta que se alcance una temperatura de 45 C
- Adicionar el 3 % del cultivo bacteriano (Cepa) o Yogurt natural al 10%
- Adicionar 0.15% de gelatina sin sabor, y el 0.5% de leche en polvo
- Mezclar muy bien con movimientos envolventes y cubrir con papel aluminio
- Dejar quieto mientras se lleva a cabo el proceso de fermentacin, siempre a 42 C
- Una vez este haya finalizado
- Licuar con mermelada o con fruta
- Dejar enfriar
Antes de iniciar con el procedimiento debe titular la leche y determinar el % de acido lctico (este
procedimiento lo debe realizar cada hora durante el proceso de fermentacin). Al cultivo inicial realizarle
una coloracin de gram, y durante cada hora repetir el procedimiento y observar la relacin de Streptoccocus y
Lactobacilus durante la fermentacin.
En los productos lcteos fermentados, la fermentacin culmina cuando se alcanza un valor de 4,2 a 4,5 de
pH aproximadamente, o cuando se observa un valor de 0,75 a 0,8 de acidez titulable. Una vez lograda la
acidez requerida, debe enfriarse a 4 o 5 C para detener la fermentacin y evitar que se siga produciendo
cido lctico.
Preguntas
Qu son probioticos y qu efecto tienen en la salud
humana.
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108
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Elabore
un
diagrama
de
flujo
del
proceso
identifique los PCC (Puntos crticos de control).
109
Bibliografa