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Separacion de Biomoleculas
Separacion de Biomoleculas
Bioqumica
Separacin de biomolculas
Mtodos cromatogrficos
Los mtodos cromatogrficos son aquellos en que los diferentes componentes de una mezcla
de biomolculas se separan al interaccionar diferencialmente con una matriz porosa inmvil
dentro de una columna. El medio mvil (solvente) puede ser lquido o gaseoso, dependiendo
de la tcnica, y puede ser de composicin constante o variable.
La nomenclatura bsica no ha cambiado desde los primeros intentos hechos ya hace casi un
siglo por Tswett: se denomina columna cromatogrfica al tubo en que se realiza la corrida,
eluente al lquido o gas usado como medio mvil y cromatograma al resultado del anlisis
cromatogrfico.
La cromatografa se emplea con fines analticos, en microescala, o preparativos, ya sea en
procesos industriales o de laboratorio, para purificar diversas sustancias: protenas, cidos
nucleicos, medicamentos, etc.
Las columnas son tubos de vidrio, metal o plstico, dependiendo de la tcnica empleada, de
dimetro constante y preferentemente de un material biocompatible, es decir que no cambie la
funcin biolgica del material en estudio ni interaccione con el eluente.
Las interacciones que dan lugar a la separacin se dan sobre la matriz o soporte y pueden ser
de diversa naturaleza. As se tiene la cromatografa de intercambio inico, de interaccin
hidrofbica, de filtracin o exclusin molecular, de afinidad, etc.
Dependiendo de las
necesidades
de
Bomba
resolucin,
diferentes
tcnicas pueden ser
Figura 1
empleadas
para
la
cromatografa,
tales
Columna
como
HPLC
(High
performance
liquid
Solvente
chromatography, FPLC
(fast
protein
liquid
chromatography),
en
que varan la presin a
la que se administra la
fase
mvil,
la
constitucin
de
las
Detector
columnas,
las
caractersticas de los
solventes y en general
Figura 1. Configuracin
la precisin con que se
bsica para una
miden los diferentes
cromatografa
parmetros
de
una
Colector de fracciones
cromatografa.
Acme Corp.
Bioqumica - Cromatografa
Figura 2
Molculas medianas:
difusin en una fraccin limitada
del soporte
Direccin de flujo
Un soporte muy comn es la celulosa, fcilmente hidratable pero que no permite elevados
flujos debido a su compresibilidad. Est compuesto de fibras de celulosa purificadas. Adems
de su compresibilidad, este soporte no es compatible con algunos solventes orgnicos ni
lcalis, que hidrolizan la celulosa.
De gran uso son las matrices derivadas de dextranos, de polisacridos diversos que pueden
ser mezclados con otros sustancias para dar diferentes caractersticas a la matriz. Se
presentas como microesferas porosas con diferentes tamaos de partcula y poro.
Ejemplos de stas son la Sepharose y el
Figura 2. Partculas de Sepharosa
Sephadex. La primera est compuesta por
agarosa, un polmero lineal de residuos alternados
de D-Gal y 3,6 anhidro-L-gal. La agarosa es un
componente del agar, junto a la agaropectina. La
agarosa forma geles debido a la multiplicidad de
puentes H y es un excelente medio debido a su
biocompatibilidad. La tcnica de fabricacin permite
que se formen partculas esfricas, cuentas de
collar, de tamao ms o menos uniforme y alta
porosidad. El Sephadex, por su parte, es un
dextrano entrecruzado. Todos los dextranos son
susceptibles a valores extremos de pH, en especial
en el lado alcalino de la escala. Esto se debe a la labilidad de los enlaces glucosdicos a la
hidrlisis alcalina.
El Sephacryl se prepara por entrecruzamiento covalente de alildextrano con
N,N'metilenbisacrilamida, dando un gel rgido con resistencia a la compresin. El BioGel es un
polmero de acrilamida que es especialmente resistente a valores extremos de pH.
Cuando se requieren velocidades de flujo y presiones elevadas se utilizan matrices ms
rgidas, constituidas por polmeros
sintticos o slica.
Especialmente
en
soportes
para
intercambio inico se usa poliestireno
Fase mvil
entrecruzado con divinilbenceno, que
forma una estructura tridimensional
grande de forma esfrica.
Separacin en base al tamao.
Cromatografa de exclusin molecular
Molculas pequeas: difusin
(CEM)
libre en la fase estacionaria
Molculas grandes:
exclusin de fase estacionaria
Figura 3. Cromatografa
de exclusin molecular
Bioqumica - Cromatografa
la partcula y por lo tanto vern su trnsito a travs de la columna acelerado. El tamao mnimo
que debe poseer una molcula para incluirse, entrar a los poros, se denomina lmite de
exclusin. P.ej. un lmite de exclusin de 106 significa que molculas con tamao mayor a 106
kDa no sern incluidas. Esta tcnica separa no solamente molculas muy grandes de
molculas muy pequeas, como en el ejemplo anterior, sino que adems permite la separacin
de molculas con tamaos parecidos. Esta ltima caracterstica hace que uno pueda calibrar
una columna con patrones de tamao (peso molecular) conocido, los cuales eluirn siempre en
la misma forma, y luego utilizar esta informacin para construir una curva de calibracin. La
cromatografa se realiza sembrando la muestra y eluyendo con un buffer de composicin
constante.
1
No se utiliza el volumen de elucin
Figura 4
directamente sino el coeficiente de
particin, que es la relacin:
Abs 280
Kav=(Ve-Vo)/(Vt-Vo)
0.5
Donde:
Vo es el volumen vaco o de
exclusin, el espacio que queda
por fuera de las partculas del gel,
0
el nico disponible para las
Vo
Ve1
Ve2
macromolculas que no se
incluyen en el gel.
Ve es el volumen de elucin de la macromolcula, medido en la altura mxima del pico
(ver Fig. 4)
Vt es el volumen total de la columna
900
700
600
500
400
Figura 5
300
200
100
0.05
0.10
0.15
0.20
0.25
0.30
0.35
0.40
0.45
Kav
Bioqumica - Cromatografa
Los grupos inicos se hallan unidos en forma covalente a la matriz. Por ejemplo, una protena
con punto isoelctrico menor a 7 o un cido nucleico estarn cargados negativamente a pH 7.0.
De esa manera, si se tiene una matriz con sustituyentes cargados positivamente, por ejemplo
una amina cuaternaria, las macromolculas se unirn a los sustituyentes con una fuerza
proporcional a la carga que detenten al pH al que se realiza la corrida y al nmero y naturaleza
de los sustituyentes presentes en la matriz. Dado que las protenas son iones multivalentes, las
resinas pueden ser de intercambio aninico o catinico, de acuerdo a la carga neta que
posean. Dependiendo de la macromolcula en estudio se usar una u otra. Los ms comunes
son:
Cargado de la columna
+
- -+
Elucin
+ --
Lavado
- +
Fuerza
inica
+ +
Figura 6
- +
- +
+ +
-+
- +
+ --
Bioqumica - Cromatografa
embargo, esta tcnica posee sus desventajas. Dado que en este caso las protenas eluirn a
un pH igual a su pI, su solubilidad estar disminuida y pueden precipitar. Adems, la protena
puede perder su actividad biolgica a los valores de pH usados para establecer el gradiente. Es
de uso muy restringido.
El volumen que se puede cargar la columna no est restringido en la CIO. Por el contrario,
usualmente esta es una etapa de concentracin, al sembrarse grandes volmenes y recuperar
la muestra en volmenes reducidos.
Las matrices usadas para la CIO son diversas: Sepharosa (dextranos), acrilamida, celulosa,
Figura 7. Cromatograma obtenido en una CIO de una mezcla de protenas. Luego de la siembra se observa
un pico de Absorbancia (la tcnica de deteccin puede ser otra) que corresponde a la fraccin de protenas
que no se unen a la matriz. Luego de lavar con el mismo buffer de siembra hasta eliminar aquello que no se
une a la matriz, se comienza a elevar la fuerza inica en el buffer y se observa la aparicin de picos que
corresponden a macromolculas unidas. El primero es un pico doble que contiene al menos dos protenas que
eluyen a fuerzas inicas parecidas.
Bioqumica - Cromatografa
Abs 280 nm
Fuerza inica
% buffer B
Figura 9
6
Siembra y lavado
Elucin
Bioqumica - Cromatografa
Cromatografa de afinidad
Cromatografa de afinidad
La cromatografa de afinidad es
Interaccin
muy usada en el laboratorio como Cargado de la columna
con el ligando
herramienta analtica y preparativa.
Se basa en la interaccin de
protenas con ligandos unidos a la
matriz de forma muy especfica. En
general se trata de anlogos
(sustancias estructuralmente muy
parecidas)
a
ligandos
que
naturalmente interaccionan con la
protena, p.ej. el sustrato, inhibidor
o cofactor de una enzima; el
mensajero
(hormona,
neuroElucin
Lavado
transmisor, toxina) en el caso de
un
receptor,
aminocidos
(proteasas;
ligandos pseudoespecficos
como
pigmentos
(Cibacron blue, dextran blue, etc.)
que se parecen a nucletidos
usados
como
cofactores,
o
secuencias complementarias de
un cido nucleico que se desee
Figura 10
aislar de una mezcla compleja.
Se utilizan matrices diversas:
agarosa, dextranos, acrilamidas, etc., prefirindose aquellas con poros grandes de modo que
posean un lmite de exclusin elevado.
La seleccin del ligando depende de dos factores. En primer lugar, el ligando debe poseer una
elevada afinidad por la sustancia a ser purificada, pero la interaccin debe ser reversible. En
segundo trmino, debe ser posible unir el ligando a la matriz por algn medio sin que esto
modifique sustancialmente su interaccin con la macromolcula. La afinidad del ligando
debera situarse entre 10-4 y 10-8 M en solucin. Afinidades pobres (Ki > 10-4 M) son
usualmente demasiado dbiles para proveer una especificidad adecuada. Si la afinidad es
grande (Ki < 10-8 M), va a ser muy difcil remover la macromolcula una vez unida sin
desnaturalizar la muestra. El ligando interacciona mejor si est situado en el extremo de un
brazo espaciador que lo aleje de la matriz, lo que evita impedimentos estricos o de otro tipo
relacionados con el tamao o las propiedades de unin inespecficas de la matriz.
Los mtodos de unin del ligando a la matriz son variados, e incluyen:
Activacin por CNBr: permite la unin de ligandos que contengan grupos amino
primarios (Fig. 10).
Bioqumica - Cromatografa
Activacin por tioles: tiene un espaciador de glutatin que permite unir a travs de
grupos tioles
NH
Figura 11
OH
O C NHR
CNBr
Derivado de
tiourea
RNH2
OH
OH
Cromatografa de quelado
Carga de la columna
Activacin de la columna
Me ++
Me ++
Me ++
Me ++
Se
usan
matrices
que
contienen grupos que pueden
unir en forma no covalente pero
muy
fuertemente
iones
metlicos, como Zn o Co, a
travs
de
grupos
especializados como molculas
de
c.
iminodiactico
(-CH2N(CH2COOH)2).
A
menudo la interaccin se
produce a travs de residuos
de His presentes en la
superficie de la macromolcula.
Estos residuos pueden estar
presentes naturalmente en la
protena
o
haber
sido
artificialmente introducidos por
tcnicas biologa molecular en
el caso de protenas que han
sido clonadas y expresadas en
un sistema heterlogo.
Me ++
Me ++
Me ++
Me ++
Elucin
Lavado
Me ++
Quelante de Me ++
en el solvente
Me ++
Me ++
Me ++
Figura 12
La tcnica consiste en cargar la columna con el in metlico, p.ej. una solucin 1 M de Cl2Zn,
luego equilibrar con el buffer, cargar la muestra, y luego eluir con una solucin (o establecer un
gradiente) de EDTA, un quelante que secuestra el Zn y despega por tanto a la protena.
Bioqumica - Cromatografa
Otros
En general uno puede generar
Purificacin de protenas
columnas de prcticamente lo
mediante protena A Agarosa
que desee debido a que se
dispone de matrices activadas,
p.ej. con grupos epoxi, a los que
Fc
puede unirse una gran gama de
A
A
ligandos.
IgG
Un
caso
especial
de
+
cromatografa
de
alta
Fc
especificidad lo constituye la
A
A
unin de anticuerpos a matrices.
1
Los anticuerpos se pueden
inmovilizar
mediante
una
variedad de tcnicas, pero una
2
de las ms usadas es la unin a
Fc
Fc
A
travs de protena A agarosa. La
A
protena A es una protena
3
bacteriana que se une con
Fc
elevada afinidad al dominio Fc
Fc
A
de la molcula de IgG. De esa
A
manera, al pasar una solucin
de
anticuerpos
especficos
contra
una
determinada
macromolcula a travs de una
columna de protena A-agarosa,
Figura 13
estos quedarn inmovilizados y
formarn un soporte con una
muy elevada especificidad por la macromolcula en cuestin. De esta manera se pueden
purificar protenas con elevados rendimientos. En la Figura 12 se observa un esquema de este
tipo de cromatografa. En el paso 1, se carga la columna con la solucin de anticuerpos. Se
hace pasar luego la mezcla de protenas a separar, quedando unidas slo las que son
reconocidas por el anticuerpo (Paso 2). La elucin se realiza de diversas maneras, por ejemplo
sustituyendo el buffer en que se trabaj hasta el momento (por lo comn cercano a pH 7), por
100 mM glicina pH 3.0.
Por supuesto, la tcnica puede ser usada para la purificacin de anticuerpos de otras
protenas, por ejemplo para la purificacin de IgG total de suero.
La cromatografa de adsorcin es muy usada. En esta las macromolculas se unen por
interacciones no necesariamente de alta especificidad pero con distinta fuerza de acuerdo con
las propiedades particulares de la macromolcula. Ejemplos de matrices de este tipo son la
fosfocelulosa (fosfato de celulosa) o la hidroxiapatita.
Deteccin
Las macromolculas eluidas pueden detectarse por varios mtodos: absorcin en el UV o a la
longitud de onda de absorcin mxima si fueran coloreadas, por variaciones en el ndice de
refraccin, la conductividad, etc. La Fig. 4 muestra un perfil de elucin de una cromatografa de
exclusin molecular en el cual la deteccin se realiza a 280 nm. Obviamente, este recurso
puede utilizarse para protenas que contengan residuos aromticos. Los cidos nucleicos
9
Bioqumica - Cromatografa
10
pueden detectarse por absorcin a 260 nm y las protenas tambin a 254 nm (enlace
peptdico). Los hidratos de carbono pueden detectarse haciendo uso de cambios en el ndice
de refraccin. Tambin pueden tomarse alcuotas de los tubos recogidos y hacer all la
determinacin de la concentracin de la macromolcula en cuestin ya sea por sus
propiedades pticas, por su actividad biolgica (actividad enzimtica) o por alguna reaccin
especfica (p.ej. por Coomassie en caso de protenas).
Flujo del solvente
Con respecto a este parmetro, la administracin del solvente se puede realizar por gravedad
o con bombas. El primer caso es posible slo cuando el soporte es suficientemente laxo como
para permitir el flujo sin necesidad de presin adicional. En este caso entran la mayora de
medios cromatogrficos basados en Sephadex. En el segundo caso, pueden usarse equipos
totalmente automatizados que permiten variar el flujo en forma muy controlada y realizar
automticamente los gradientes. La velocidad de flujo est en estrecha relacin con la
resolucin de la tcnica, de modo que este punto se ampla en el siguiente apartado.
Tcnicas cromatogrficas de alta resolucin. HPLC y FPLC.
En general, se pretende que las corridas duren el menor tiempo posible para minimizar la
prdida de actividad biolgica, pero sin sacrificar la resolucin del mtodo.
La distribucin de las macromolculas en una columna durante la elucin hace que se detecten
a su salida de la columna como picos,
1
caracterizados por su altura y su anchura. Lo
Figura 14
ideal es que cada pico sea tan angosto como
sea posible, para separarlo de sustancias
Abs 280
que eluyan en la vecindad. En la Fig. 14 se
observa una separacin completa de los
0.5
picos 1 y 2. Sin embargo, existe un
solapamiento de los picos 3 y 4 , por lo que
las fracciones intermedias entre ambos
contendrn
ambos
componentes,
y
obviamente la purificacin no es en este
1
2
3
4
caso perfecta.
0
Dos procesos causan el ensanchamiento del
Volumen
pico: la difusin y la turbulencia. La difusin
es el proceso por el cual la macromolcula, que se concentra en una banda a medida que se
separa de los otros componentes, tiende a difundir hacia atrs y adelante hacia zonas en que
su concentracin es menor. La difusin depende del tiempo, por lo tanto puede controlarse con
corridas cortas, aumentando la velocidad de flujo. Sin embargo, esto causar que el flujo
alrededor de las partculas no sea laminar, formndose turbulencias en el lado de la partcula
cercano a la salida que ensancharn el pico. Por otra parte, muchos soportes no aceptan
velocidades muy altas debido a que al aumentar el flujo aumenta la resistencia al avance y en
consecuencia la presin. Con ello la fase inmvil tiende a comprimirse, dificultando an ms el
flujo y aumentando mas la presin.
La turbulencia puede controlarse haciendo la partcula cada vez ms chica. A su vez, al achicar
la partcula se aumenta la superficie, aumenta el rozamiento con el solvente y esto hace que se
requiera ms presin para poder lograr un flujo determinado. Para esto se usa un equipo
especializado llamado HPLC (High performance liquid chromatography). En HPLC se utiliza un
sistema de bombas de alta precisin, capaz de entregar flujos muy precisos y constantes a
diferentes velocidades y a elevada presin. Este factor determina que se utilicen caeras y
columnas de acero u otros materiales capaces de soportar hasta 6000 psi (400 atm). Los
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