Cromatografa de afinidad

NDICE
Introduccin
Interaccin ligando-afinante
Matrices
Matrices de polisacridos
Agarosa
Celulosa
Dextrano
Matrices sintticas
Poliacrilamida
Vidrio
Otros soportes
Hidroxialquilmetacrilato
Copolmeros de etileno
Oxiranos acrlicos
Mtodos de activacin y acoplamiento
Matrices de polisacridos
Halidas de ciangeno
Triazinas
Oxidacin por periodato
Oxiranos
Bizaridinas
Divinil sulfonas
Benzoquinonas
Algenos
Grupos tioles
Matrices sintticas
Poliacrilamida
Modificacin directa
Aminoetilacin
Hidrazinacin
Hidrlisis alcalina
Modificacin indirecta
Copolimerizacin
Vidrio
Otras
Brazos espaciadores
Bloqueo de los sitios inactivos
Ligandos
Anexos
Ejemplos prcticos
Bibliografa

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A. Carbajal-Saucedo

CROMATOGRAFA DE AFINIDAD
INTRODUCCIN
En 1906 Michael Tswett public un arculo donde describe la separacin y
purificacin de los pigmentos de una planta y estableci la cromatografa como un
mtodo en el cual una mezcla es separada mediante un adsorbente en un sistema
fluido. A partir de entonces y hasta ahora se han logrado separar una enorme cantidad
de macromolculas mejorando el sistema propuesto por Tswett hace ms de 95 aos.
Existen varios tipos de cromatografa desarrolladas para diversos propsitos
(Oh-ishi y Maeda, 2002). La cromatografa de exclusin molecular se basa en las
diferencias en pesos moleculares de los componentes para separarlos; la
cromatografa de intercambio inico toma en cuenta las cargas de las molculas; la de
interaccin hidrofbica se basa en la hidrofobicidad de las partculas a separar; y la
cromatografa de afinidad, tema principal de este trabajo, retrasa la elucin de alguna
macromlecula especfica mediante la unin de sta con un ligando particular
La cromatografa de afinidad se basa en la interaccin, especfica y reversible,
que se presenta entre una partcula de inters (llamada genricamente afinante) con
alguna molcula particular que va a ser inmovilizada en un soporte slido (a esta
partcula se le conoce como ligando). La interaccin de estas dos molculas es similar
a la que se presenta entre una enzima y su sustrato. Durante finales de los 60s y
principios de los 70s se escribieron los primeros trabajos que tomaban en cuenta esta
interaccin para separar protenas especficas.
Cuatrecasas (1969, 1970) y Cuatrecasa et al. (1968) sentaron las bases que son
utilizadas hasta ahora para la purificacin de diversos afinantes. En estos artculos se
describen tanto las caractersticas que deben presentar los diferentes soportes como
las primeras metodologas de activacin que se usaron para unir el ligando al soporte.
Como se ver a lo largo de este trabajo la cromatografa de afinidad ha sido una
herramienta de enorme importancia para el aislamiento, purificacin y caracterizacin
de diversas macromolculas. Adems, se ha usado ampliamente para determinar
diferentes parmetros que rigen la interaccin de dos macromolculas: constantes de
asociacin, de disociacin, concentracin mximas y mnimas de sustratos, entre otras
(Baczek y Kaliszan, 2001, Dunn et al., 1983)

INTERACCIN LIGANDO-AFINANTE

La afinidad que tenga un ligando por algn afinante especfico es una consideracin de
enorme importancia para la correcta seleccin del ligando a inmovilizar. Un modelo
matemtico simple para describir la adsorcin de algn afinante a la columna en

Cromatografa de afinidad

trminos de unos cuantos parmetros medibles puede ser itl para evaluar el posible
uso de un ligando (Lowe, 1979)
Si la concentracin de un afinante la denominamos como E y la del ligando
como L entonces:
KD
E+L
EL
Donde la constante de disociacin (K
por

D)

del complejo enzimaligando (EL) est dada

[E] [L]
KD=
[EL]
Sin embargo, tanto el trmino [E] como [L] se refieren a la cantidad absoluta de afinante
y ligando inmovilizado respectivamente y por lo tanto la siguiente afirmacin es cierta
[Eo EL] [Lo EL]
KD =

ec. 1
[EL]

Donde Eo y Lo se refieren a las concentraciones iniciales de afinante y ligando

inmovilizado. En la mayora de los casos Lo >> Eo y por tanto Lo >> EL, por lo tanto:
[Eo] [EL]
KD =

Lo
[EL]

y rearreglando
[Lo]
[EL]

KD
=

ec. 2
1 + [Lo]
KL
La ecuacin 2 define la fraccin de afinante unido a la matriz a una
concentracin fija de afinante inicial (Eo) cuando la concentracind de ligando es
variable. Esta ecuacin permite una estimacin aproximada del valor mximo de KD
entre un ligando inmovilizado y un afinante a fin de que se efecte una unin til del
afinante a la matriz.
[Eo]

As si el adsorbente comprende un ligando inmovilizado cuya concentracin es,

tpicamente, 5 mol/g (o ml) de matriz, es decir, 5 mM y se pretende una adsorcin
cuantitativa (98 %) del afinante a la matriz por lo tanto la KD del complejo afinanteligando inmovilizado debe ser por lo menos de 0.1 mM siguiendo los parmetros de la
ecuacin 2.

A. Carbajal-Saucedo

A una Lo = 10 mM los clculos basados en la ecuacin 1 sugieren que para

efectuar una buena unin del afinante la KD debe ser al menos de 0.5 mM. Con
ligandos que exhiben valores de KD > 0.5 mM el problema se traduce en que es
necesario acoplar el ligando a una concentracin suficientemente alta y para eso existe
un lmite prctico impuesto por la matriz.
Por lo tanto, basados en los datos anteriores se muestra que a una
concentracin tpica de ligando inmovilizado de 5-10 mM se permiten constantes de
afinidad de entre 0.1-0.5 mM. Los probables ligandos cuya KD sea mayor a 0.5 mM
deben descartarse y buscar otros con mayor afinidad. La figura 1 muestra como la
relacin [EL] / [Eo] es una funcin hiperblica de [Lo] de la misma forma en que el
porcentaje de saturacin de una enzima esta en funcin de la concentracin de
sustrato adicionado. En la figura 2 se muestra la importancia que tiene la constante de
disociacin sobre la cantidad de enzima unida a la matriz.
Sin embargo se debe tener en cuenta que los clculos basados en la ecuacin 2
deben utilizarse slo como una gua ya que asumen que:

La concentracin absoluta del ligando (Lo) es equivalente a la concentracin

efectiva de ligando.
La KL del complejo afinante-ligando inmovilizado es comparable a la del complejo
afinante-ligando libre.

120

Cantidad de unin (%)

100

80
LDH ratn
LDH cerdo
Glicerocinasa

60

40

20

0
0

100

200

300

400

500

600

700

800

[Ligando] (nmoles/ml)
Figura 1 Efecto de la concentracin de ligando sobre la unin de diferentes enzimas a una matriz de N6(6-aminohexil)-AMP-Sefarosa. LDH, lactato deshidrogenasa

Cromatografa de afinidad

-4

K =10

Fraccin de enzima unida

0.8

-3

10

0.6
-2

10
0.4

0.2
-1

10

0
0

10

15

20

Concentracin total de ligando (Lo) mM

Figura 2. Unin fraccional de enzima (EL/Eo) para bajas concentraciones de enzima calculado a partir de la ecuacin
2 a varios valores de Lo y KL

MATRICES
Las matrices o soportes utilizados en cromatografa de afinidad son genenralmente
geles que deben cumplir con una serie de requisitos a fin de lograr obtener el producto
deseado en con menores dificultades y en mayor grado de pureza. La matriz ideal
debera tener as siguientes propiedades (Cuatrecasas, 1970; Lowe, 1979; Turkov,
1983, Dean et al., 1978)

Insolubilidad. Este punto es muy importante, no solo para prevenir la prdida del
adsorbente sino tambin para evitar la contaminacin de la muestra.

Gran permeabilidad y rea especfica. Si una matriz no posee la suficiente

permeabilidad (referida como el tamao del poro) no se permitir la libre interaccin
del ligando con el afinante impidiendo una buena adsorcin de este ltimo a la
columna y por tanto una buena purificacin. Es muy importante hacer notar que el
rea de superficie especfica (aquella rea que se encuentra en contacto directo con
la molcula que se desea aislar) est directamente relacionada con la cantidad de
afinante que se desea aislar, por lo tanto entre mayor sea el rea especfica de la
columna se esperar purificar mayor cantidad de afinante.

Rigidez. Esta propiedad, junto con la forma de la partcula de la matriz, estn

directamente relacionadas con el problema de la velocidad de flujo. En general,
5

A. Carbajal-Saucedo

para cromatografa de afinidad se utilizan flujos lentos con el fin de dar oportunidad
al afinante de penetrar los poros de la matriz y encontrar a su ligando. Altas
velocidades de flujo provocan que las partculas de la matriz se deformen por
compactacin incrementando la resistencia al flujo. Como recomendacin el tamao
de la partcula debe estar entre los 5 y los 200 m

Adsorcin inespecfica. Como es de imaginarse las matrices deben adsorber lo

menos posible (idealmente cero) al afinante. La adsorcin inespecfica del afinante
a la matriz provoca cantidades sub-ptimas de recuperacin y puede provocar la
desnaturalizacin de la molcula de inters. Es por esta razn que debe evitarse el
uso de matrices que contengan grupos ionognicos (p. ej. co-polimeros de etileno
con anhidrido malico) principalmente cuando se trabaja a baja fuerza inica (20
mM NaCl).

Reactividad y baja fuerza inica. La matriz debe tener suficientes grupos

qumicamente reactivos que puedan ser activados o modificados de tal forma que
sean capaces de unir a la molcula de inters. La capacidad de una columna, es
decir, cuantas molculas de afinante puede unir, esta en funcin directa del nmero
de grupos reactivos que existan en la matriz. La modificacin o activacin de la
matriz deben hacerse bajo condiciones que no alteren su estructura. De igual forma
es importante que la matriz no se altere bajo las condiciones de trabajo as como a
diferentes valores de pH, temperatura, fuerza inica y bajo la presencia de agentes
desnaturalizantes.y caotrpicos. El hecho de poder reutilizar una columna depende
de estas capacidades.

Resistencia a biolgicos. La matriz no debe ser degradada por microorganismos y/o

enzimas. Este requerimiento lo cumplen muy satisfactoriamente las matrices
inorgnicas como las de vidrio o polimeros sintticos (poliacrilamida o
hidroxialquilmetacrilato)

Las matrices ms utilizadas en cromatografa de afinidad pueden ser de varios tipos.

En este trabajo solo mencionaremos las ms populares, las cuales se dividiran an tres
grandes grupos:

Matrices de polisacridos
Agarosa
Celulosa
Dextrano
Matrices sintticas
Poliacrilamida
Vidrio
Otras matrices

Cromatografa de afinidad

MATRICES DE POLISACARIDOS
AGAROSA
La agarosa es un polmero lineal de 1,3-D galactopiranosa 1-4,3,6 anhidro L-galactosa
CH3OH

O
O
OH
O
CH2
O

O
O
OH

Se obtiene descomponiendo el agar en las dos molculas que lo forman:

agarosa y agaropectina. Esta descomposicin puede llevarse a cabo mediante
acetilacin, extraccin de la agarosa a un fase insoluble (cloroformo) con una
subsecuente regeneracin del polisacarido por precipitacin fraccional con
polietilenglicol, o bien por precipitacin selectiva de la agaropectina con cloruro de cetil
piridino.
La agarosa (cuyo nombre comercial ms comn es Sefarosa) pura permite
utilizarla en concentraciones muy bajas (< 0.5%) y facilita la formacin de poros de
tamao muy grande. El agar como tal (agarosa + agaropectina) tambin permite la
formacin de poros muy grandes adems de ser muy estable mecnicamente bajo las
condiciones que se requieren en cromatografa de afinidad. Sin embargo, la
agropectina contiene grupos sulfato y, en menor nmero, grupos carboxilo que le
proporcionan al agar caractersticas inicas que no son deseables en el tipo de
cromatografa que nos atae
La estructura de la matriz de agarosa no se mantiene por enlaces covalentes,
como sucede en las matrices de dextrano, si no que se debe a puentes de hidrgeno
entre cadenas vecinas (probablemente hlices triples). Sin embargo, cuando se
adicionan agentes que destruyen estos puentes, como urea, cloruro de guanidino,
iones y algunos detergentes utilizados para recuperar la muestra, no se aprecia una
disminucin en la estabilidad de la matriz. Por lo tanto existen otras fuerzas
involucradas en ste fenmeno pero an no ha quedado claro la naturaleza de las
mismas. Una matriz de agarosa pierde su estabilidad cuando es expuesta a calor por
periodos prolongados. Se recomienda que no se les utilice por debajo de los cero
grados centgrados ni por arriba de los 40o C. La esterilizacin por calor debe evitarse
en cualquier momento.
7

A. Carbajal-Saucedo

Por otro lado, estas matrices son estables en un rango de pH de 4-9 y muestran
una tolerancia adecuada a la exposicin de 0.1 M NaOH o 1 M HCl de 2-3 hrs.
Tambin se ha demostrado que estas matrices no se deforman durante la exposicin a
1-2 M NaCl, 8 M urea, 6 M cloruro de guanidino, 0.4% deoxicolato de sodio, 3% SDS y
0.5% Triton X-100 aunque esta tolerancia no es indefinida. Tambin toleran bajas
concentraciones de solventes orgnicos como etiln glicol, etanol, metanol, acetona,
butanol, piridina (80% v/v) y dimetil formamida (50%), se sabe que el dimetil sulfxido
puede perturbar la estructura del gel.
A fin de proporcionar una mayor estabilidad a la matriz se puede adicionar
epiclorohidrna, 2,3 dibromopropanol o divinil sulfona. Estos agentes entrecruzan las
cadenas vecinas de agarosa lo cual permite su utilizacin en un mayor rango de pH (312) e incluso el uso de solventes orgnicos como tetrahidrofurano, cloroformo,
diclorometano, dicloroetano y dicloroetano:piridina (1:1).
Un parmetro para conocer la pureza de la agarosa implica conocer el contenido
de sulfato orgnico de la matriz, este ndice se basa en el hecho de que los grupos
sulfato le otorgan a la matriz ciertas propiedades inicas no deseables. Las agarosas
comerciales contienen cerca del 0.37% (w/v) de sulfuros y varian enormemente en el
contenido de grupos sulfato. Es recomendable dar un tratamiento previo a la matriz con
hidroborato de sodio para remover esto grupos.
CELULOSA
Es un polmero linear de D glucosa 1-4 con uniones ocasionales 1, 6.

OH

CH2OH
O

OH

O
O

CH2OH

OH

OH
n

Es una matriz que, debido a su naturaleza fibrosa y poco uniforme, no permite la

formacin de poros grandes impidiiendo el paso de grandes macromolculas. Las
fibras de celulosa comprenden una agregacin de cadenas glucosdicas unidas unas a
otras por varios puentes de hidrgeno. Esta estructura da lugar a zonas cristalinas de
alto grado de agregamiento y a zonas amorfas o desordenadas. La relacin entre las
zonas cristalinas y amorfas es particularmente sensible a las condiciones

Cromatografa de afinidad

fisicoqumicas utilizadas en la preparacin del ligando. Usualmente se utilizan

condiciones que permitan la formacin de un mayor nmero de zonas amorfas
permitiendo una micro heterogenenidad en la sustitucin del ligando creando as un
espectro de afinidades para la macromolcula de inters. Esta microheterogenenidad
puede generar efectos adversos en la capacidad del adsorbente y en la adsorcin y
subsecuente elucin de las macromolculas.
A pesar de los inconvenientes antes mencionados las caractersticas de la
celulosa han permitido emplearla en varios protocolos de purificacin. La celulosa
comercial esta preparada en forma de microfibras o microcristales esferoides que
exhiben buenas velocidades de flujo. Actualmente tambin puede conseguirse celulosa
en forma de gotas. La celulosa en gotas es un producto en forma de partculas
esfricas altamente porosas que se componen de celulosa pura (15%) y agua. Cuando
las partculas se inchan se produce una estructura macroreticular.
Cuando la celulosa se regenera a partir de soluciones de xantato se forma una
estructura microhterogenea que consta de regiones microcristalinas conectadas por
regiones amorfas. Debido a esta micro heterogeneidad las macropartculas esfricas
de gotas de celulosa son mucho ms rigidas que las partculas de otros geles de
polisacridos homogneos. La introduccin de grupos de entrecruzamiento u otros
sustituyentes a las macromolculas pueden reducir la formacin de zonas cristalinas.
Gracias a esto las gotas de celulosa son ms estables mecnicamente que, por
ejemplo, los geles de dextrano de porosidad comparable. La celulosa en gotas es,
tericamente, una matriz muy til para cromatografa de afinidad dada su estructura
esfrica, alto grado de porosidad, buena estabilidad mecnica y fuerte caracter
hidroflico (ver Gemeiner et al., 1998).
DEXTRANO
Es un polmero de glucosa unidos por enlaces 1, 6, que es producido por varias
cepas de Leuconostoc mesenteroides y comercialmente se prepara en soluciones
acuosas con alto contenido de azcar.
El dextrano soluble, preparado por precipitacin fraccional con etanol de
dextrano parcialmente hidrolizado contiene ms del 90% de enlaces 1, 6 y se ramifica
en enlaces 1, 2-, 1, 3- y 1, 4. Cuando se entrecruza con 1-cloro, 2,3-epoxipropano en
solucin alcalina el dextrano obtiene una conformacin tridimensional parecida a la de
la figura 3.
La forma comercial de las matrices de dextrano se conoce como Sephadex la
cual se prepara entrecruzando las cadenas de glucosa con epiclrohidrna y se presenta
en forma de gotas.
Esta matriz tiene una naturaleza altamente hidroflica debido al gran nmero de
grupos hidroxilo presentes lo cual permite que se hinche fcilmente en agua y en
solucines electrolticas. El proceso de hinchado y secado es reversible y no afecta de

A. Carbajal-Saucedo

forma significativa las propiedades cromatogrficas de la matriz an despus de varios

ciclos.
O CH2
O-CH2
O
|
CH2
|
CHOH
|
CH2
|
O

O CH2
Figura 3. Estructura del dextrano

El Sephadex es muy estable qumicamente. Por ejemplo, resiste dos meses en

0.25 M NaOH a 60o C, 6 meses en 0.02 M HCl o 1-2 hrs en 88 % cido frmico. Ms
an puede ser calentado a 110o C por 40 min sin prdida de propiedades, aunque al
exponerlo a agentes oxidantes se forman grupos aldehdo o carboxilo que le confieren
ciertas caractersticas de intercambiador inico. Puede hincharse tambin, hasta cierto
lmite, en etanol, etilnglicol, formamida, N, N dimetil formamida y dimetil sulfxido..
Las caractersticas antes mencionadas hacen de esta matriz una de las ideales
para cromatografa de afinidad, sin embargo tiene un grado de porosidad muy bajo.
Comercialmente el Sephadex puede tener un rango de exclusin de hasta 800, 000
(Sephadex G-200) aunque la activacin de estas matrices por los mtodos
convencionales da lugar a un considerable grado de entrecruzamiento lo cual baja su
rendimiento an en la purificacin de afinantes de bajo peso molecular.
El hecho de tener un poro de pequeo tamao tambin puede ser tomado como
una ventaja. Dado que el afinante no va a penentrar los poros se puede unir el ligando
a la superficie de las partculas de la matriz a fin de permitir el mayor grado de
interaccin. Esta idea ha sido particularmente explotada para purificar complejos
supramoleculares como ribosomas, polisomas, virus, organelos, fragmentos de
membrana o hasta clulas completas.
Para liberar al afinante suelen utilizarse dextranasas o bien puede adicionarse
un puente de gelatina al momento de activar la matriz con bromuro de ciangeno para
despus digerirlo con colagenasa.

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Cromatografa de afinidad

MATRICES SINTTICAS
POLIACRILAMIDA
La acrilamida es un polmero completamente sinttico compuesto de un esqueleto
hidrocarbonado al que se unen grupos carboxiamida
CH2 =CHCONH2
Para producir la poliacrilamida se mezcla acrilamida en diferentes proporciones,
con el agente entrecruzante N,N metilen bis acrilamida
CH2=CHCONHCH2 NHCOCH=CH2
Para dar lugar a una estructura de tipo:
--- CH2 - CH - CH2 - CH - CH2 -CH ---C=O

C=O

NH

NH2

CH2
NH
C=O
--- CH2 - CH - CH2 - CH - CH2 -CH ---C=O

C=O

NH

NH2

CH2
NH2

NH

C=O

C=O

--- CH2 - CH - CH2 - CH - CH2 -CH ---C=O

NH2

Al variar la concentracin de acrilamida y la proporcin de bis acrilamida se

obtienen geles de poliacrilamida de diversas porosidades que proporcionan diferentes
propiedades a las matrices para cromatografa de afinidad.
NOTA IMPORTANTE: la acrilamida en solucin es altamente txica y debe utilizarse
con precaucin.

11

A. Carbajal-Saucedo

Los geles comerciales ms comunmente utilizados son los de Bio-Rad que

llevan el nombre de Bio-Gel P. Se pueden conseguir matrices con poros de tamaos
muy variados con lmites de exclusin que van desde 100-1800 (Bio-Gel P 2) hasta
60000-400000 (Bio-Gel P300).
Las matrices Bio-Gel P son estables en rangos de pH de 2-10. El uso de las
matrices fuera de ste lmite puede provocar la hidrolisis de grupos amida dando lugar
a grupos cargados que pueden funcionar como intercambiadores inicos. Tampoco se
recomienda el uso de oxidantes fuertes como hipoclorito o perxido de hidrgeno. Son
totalmente inertes a ataques biolgicos y no sufren degradacin enzimtica. Por otro
lado, estos geles se adhieren fuertemente a superficies de vidrio limpias as que para
evitarlo se recomienda el uso de silicn o polietileno
La falta de grupos cargados en la matriz evita la adsorcin no especfica del
afinante. Sin embargo, las molculas fuertemente cidas o bsicas as como
componentes aromticos pueden adsorberse al esqueleto de la matriz. El intercambio
inico que pueda presentar la matriz_no tiene significancia prctica a menos que se
trabaje en fuerzas inicas menores a 0.02 M.
Una ventaja de las matrices de poliacrilamida es el gran nmero de grupos
potencialmente activables lo que, unido a una gran versatildad en las tcnicas de
derivatizacin permiten unirle covalentemente muchos posibles ligandos. sto resulta
particularmente til cuando se desea purificar un compuesto que muestra baja afinidad
por el ligando inmovilizado. Al aumentar el nmero de sitios en los que el afinante
pueda unirse se aumentan las probabilidades de obtener mayor cantidad de producto
purificado.
An cuando han sido matrices muy tiles para aislar una gran cantidad de
compuestos (anticuerpos, lisozima, peroxidasa, tripsina, linfocitos, clulas B, entre
otros) su uso sigue restringido debido al bajo grado de porosidad que posee lo cual
puede provocar que el ligando inmovilizado se encuentre lejos del alcance del afinante.
VIDRIO
Las matrices de vidrio han sido ampliamente usadas para inmovilizar molculas
biolgicamente activas pero su uso en cromatografa de afinidad ha sido relativamente
poco explotado.
stas matrices se obtienen al calentar borosilicato de sodio de 700 a 800o C
para posteriormente lixiviarlas con cido. Durante el tratamiento se forman dos fases:
una rica en silica y resitente al tratamiento con cidos y una segunda fase formada,
principalmente, por xido brico y fcilmente atacada por cidos. La fase de silica
corresponde a cerca el 96% del total mientras que la de borato a cerca del 4% adems
pueden encontrarse trazas de otros xidos inorgnicos. La fase de cido brico se
lixivia para dar lugar a una estructura porosa con canales interconectados cuyos
dimetros varan entre los 30 y 60 . El tratamiento posterior con NaOH remueve los

12

Cromatografa de afinidad

silicatos que puedan haber quedado atrapados dentro de los poros, lo cual ayuda a
acrecentar el dimetro.
La distribucin del tamao de poro en estas matrices es muy restringida (452500 ) lo que la convierte en la matriz ms uniforme de todas las disponibles y
permite una buena resolucin y excelente reproducibilidad. El rango de porosidad es
suficientemente bueno para incluir la mayora de las biomolculas desde sustratos
hasta clulas completas. En cuanto a las caractersticas mecnicas, son matrices
completamente insolubles y no se ven afectadas por cambios en el eluyente, presin,
velocidad de flujo, pH o fuerza inica. No son atacadas por microorganismos y pueden
ser esterilizadas tanto por autoclave como mediante el uso de desinfectantes.
Como ya se haba mencionado, estas matrices contienen cerca del 4% de
borato, de ste alrededor del 30% se encuentra en la superficie del vidrio. Los
numerosos sitios que pueden formar un cido de Lewis, dado por los grupos boro,
pueden adsorber inespecficamente nuclefilos tales como las aminas de las protenas
y/o grupos amonio, que dan lugar a centros cargados positivamente. Adicionalmente, al
igual que todos los vidrios de silica, las superficies de las partculas de estas matrices
contienen grupos silanol (Si-OH) que exhiben una superficie ligeramente negativa en
soluciones acuosas aumentando la adsorcin no especfica
Sin embargo se han desarrollado ciertas estrategias para evitar la adsorcin no
especfica. Por ejemplo, se pueden cubrir las partculas de la matriz con dextrano lo
cual inactiva los grupos ionizables y, tericamente, permite su activacin con bromuro
de ciangeno y otras tcnicas usualmente reservadas para matrices de polisacaridos.

OTROS SOPORTES

HIDROXIALQUILMETACRILATO

Los grupos hidroxilo de la matriz exhiben propiedades similares a los de las

matrices de polisacaridos y son potencialmente activables por bromuro de ciangeno.
El nmero de grupos reactivos, la porosidad y el tamao de la partcula de stos geles
puede variar significativamente durante su produccin. Los rangos de exclusin de
estas matrices van de 105 a 108 y han sido usados para aislar molculas como
inhibidores de tripsina y quimotripsina, proteasas, y otros mas.

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A. Carbajal-Saucedo

CH3

CH3

CH3

CH3

- C - CH2 - C - CH2 - C - CH2 - C C=O

C=O

(CH2)2OH (CH2)2OH

C=O

C=O
O

CH2
CH2

CH2
CH2

C=O

CH3

CH3

C=O

- C - CH2 - C - CH2 - C - CH2 - C C=O

C=O

C=O

C=O

(CH2)2OH (CH2)2OH

CO-POLIMEROS DE ETILENO
CH2 - CH2

CH2 - CH2 - CH -CH O=C COOH

O

NH
(CH2)n
NH
C=O

CH2 - CH2

CH2 - CH2 - CH -CH -

Se utilizan particularmente por la unin del grupo amino de las protenas a los
grupos anhdrido de la matriz. Sin embargo, durante la unin de las protenas existe
una liberacin concomitante de grupos carboxilo y la matriz adquiere un caracter
polianinico.
OXIRANOS ACRLICOS
Se obtienen de la co-polimerizacin de metacrilamida, metilen-bis-metacrilamida
glicidil- metacrilato y/o alil-glicidil-eter. Se conocen bajo el nombre comercial de
Eupergit C, son hidroflicas, qumicamente estables en un rango de pH de 0 a 12 por
varias horas a temperatura ambiente en suspensin acuosa, en polvo son estables

14

Cromatografa de afinidad

durante meses a 30o C. Dada la naturaleza qumica de la unin matriz-ligando, los

ligandos se inmovilizan irreversiblemente a la matriz en un rango de pH de 1 a 10.

MTODOS DE ACTIVACIN Y ACOPLAMIENTO

La activacin de la matriz consiste en unir covalentemente el ligando a la matriz.
En algunas ocasiones resulta muy til introducir molculas que alejen el ligando de la
matriz (estas molculas son conocidas como brazos espaciadores), a fin de aumentar
la adsorcin del afinante (ver seccin sobre brazos espaciadores). Algunos autores
piensan que es mejor acoplar el ligando al brazo espaciador antes de unirlos
covalentemente a la matriz. Este mtodo es recomendable dado que se conoce bien la
naturaleza qumica del ligando lo cual es de enorme importancia para el diseo e
interpretacin de los datos de purificacin. Otros autores prefieren acoplar el ligando
cuando el brazo espaciador ya est unido a la matriz activada. Este mtodo permite
cierta flexibilidad en la sntesis de derivados para un problema en particular
(Cuatrecasas, 1969, 1970; Lowe, 1979; Turkov, 1983, Dean et al., 1978, Amersham
Pharmacia Biotech, 2001; Nisnevitch y Firer, 2001).
Sin importar que mtodo se utilice, las condiciones bajo las cuales se va a
acoplar el ligando a la matriz deben ser lo suficientemente suaves para no daar a
ninguno de los componentes.
Matrices de polisacridos
En trminos qumicos estas matrices (agarosa, celulosa y dextrano) son
activadas introduciendo grupos electroflicos al gel a fin de hacerlos ms reactivos a los
grupos nucleoflocos presentes en el ligando o la molcula espaciadora. Los siguientes
grupos son algunos de los ms importantes.
O

Imidocarbamato

C=NH
O

Oxirano

- CH - CH2
O

Aziridina

- CH - CH2
NH

15

A. Carbajal-Saucedo

Doble enlace activado

- S - CH = CH2
O

- CO - CH2 -Br

Algenos activados

- CH2 - C - Br
O

En casi todos los casos la derivatizacin de la matriz sigue dos pasos:

Una activacin preliminar en la que se introduce un grupo electroflico

Un paso de acoplamiento en el que se une el ligando

Halidas de ciangeno
Es el mtodo ms utilizado para unir ligandos a las matrices de polisacridos. Involucra
la activacin de la matriz con halidas de ciangeno seguida del acoplamiento de
aminas primarias alifticas o aromticas.
La naturaleza qumica de esta activacin esta slo parcialmente dilucidada. El
paso inicial de la activacin involucra la formacin de un intermediario de cianato que
puede interactuar con los hidroxilos adyacentes para formar imidocarbonatos cclicos y
acclicos. Esta activacin da lugar a un decremento en la capacidad de hinchamiento
de la matriz y le proporciona mayor estabilidad trmica debido a que el imidocarbonato
reacciona con los hidroxilos de las cadenas vecinas aumentando el entrecruzamiento
entre ellas
Activacin
- O - CO - NH2
H20
- OH
- OH
- OH

CNBr

Carbamato
(inerte)

-O-C=N
- OH
-O
C = NH
-O

16

Imidocarbamato

Cromatografa de afinidad

Acoplamiento

- O - C- NH-protena
- OH

-O

NH2-protena

Derivado de
isourea

-O
C = N - protena

C = NH
-O

NH2

N - Imidocarbamato

-O

- O - C - CO - NH - protena
N - Carbamato
- OH

Como puede verse en la figura anterior el intermediario de cianato puede

hidrolizarse a una forma completamente inerte de carbamato. La hidrlisis alcalina
prolongada bajo condiciones suaves convierte un gel activo en un polmero
carbamilado inactivo. Por esta razn es muy importante llevar a cabo la activacin
dentro de un periodo muy corto, usualmente de 8 a 12 min.
NOTA IMPORTANTE: El bromuro de cianogeno (CNBr) se vende en forma de
polvo blanco que a temperatura ambiente se volatiliza generando un vapor irritante y
venenoso. Ms an, lotes viejos de CNBr presentan coloraciones amarillo-anaranjadas
que tienden a explotar con el tiempo. Estas preparaciones deben destruirse
adicionando sulfato ferroso alcalino para dar lugar a ferrociandas que son
completamente inofensivas y fciles de desechar. Alternativamente el CNBr puede
recuperarse por sublimacin.
Como regla general las matrices de cromatografa de afinidad pueden
reutilizarse varias veces sin una prdida considerable de capacidad de unin. Sin
embargo, se han detectado ciertas fugas, significativas y continuas, del ligando en
algunas aplicaciones. Tal solubilizacin no interfiere con la interaccin entre el ligando
acoplado y el afinante sobre todo si la unin entre ellos no es muy fuerte.
En sistemas donde la afinidad entre el ligando y el afinante es muy alta (Kd
cercana a 1 nM) y el ligando libre resulta ser ms efectivo para formar el complejo con
el afinante se provoca la prdida por elucin de la molcula de inters. Este fenmeno
puede hacer pensar que el afinante ha quedado irreversiblemente unido a la matriz sin
capacidad de recuperarse (dado que el complejo ligando-afinate no puede detectarse)
cuando en realidad nunca fue adsorbido por la matriz. Problemas de este tipo son
particularmente frecuentes en la purificacin de esteroides unidos a protenas
receptoras.

17

A. Carbajal-Saucedo

El problema de la fuga de ligandos puede evitarse mediante lavados

exhaustivos y la manipulacin de variables como el grado de sustitucin del ligando,
velocidad de flujo, temperatura, pH, etc. Otros mtodos incluyen el uso de
espaciadores o el uso de mtodos alternativos para la activacin de la matriz.

Triazinas
La matrices polihidroxiladas tambin pueden ser activadas con dicloro-sym-triazinas o
bien con tricloro triazinas (cloruro de ciangeno). Para hacerlo las triazinas se preparan
sustituyendo algunos grupos con funciones carboximetoxi o carboximetilamino las
cuales reaccionan rpidamente con las matrices adecuadas a pH de 9-11 y a 20o C
para dar lugar a un complejo monocloro-sym-triazinil-polisacrido. Cuando la matriz ha
sido activada reacciona muy lentamente con aminas primarias.
El cloruro de ciangeno (tricloro triazina) reacciona con las matrices hidroxiladas
para dar lugar a un derivado dicloro-sym-triazinil-polisacrido muy adecuado para
acoplar protenas a pH alrededor de 7.

Oxidacin por periodato

En este mtodo se oxidan los grupos dioles vecinos con metaperiodato de sodio
(NaIO4) para generar funciones aldehdo.

- OH
- OH

NaIO4

NH2 - R
- CH = O

- O - CH = N - R

NaBH4

- O - CH2 - N H- R

NaBH3CN

La funcin aldehdo reacciona con las aminas primarias a pH 4-6 para formar
bases de Schiff. A fin de estabilizar este producto se pone a reaccionar con hidroborato
de sodio o, de preferencia, ciano hidroborato de sodio que favorecen el completo
acoplamiento del grupo amino (especialmente el ciano hidroborato cuando la cantidad
de ligando es muy pequea). As mismo tambin es til cuando el ligando es lbil en un
rango de pH de 9-10 (valores requeridos para la reduccin con NaBH4)
El metaperiodato de sodio es soluble en agua y puede removerse rpidamente
al terminar la reaccin. El gel activado puede guardarse, durante un mes, a 4o C sin
prdida de potencial de acoplamiento.

18

Cromatografa de afinidad

Oxiranos
Los bisoxiranos (bisepxidos) o las halohidrnas son compuestos que pueden
formar cadenas largas y cuya caracterstica principal es tener anillos electroflicos de
tres miembros que pueden ser muy tiles para introducir ligandos de bajo peso
molecular que contengan funciones amino o hidroxilo. La reaccin tiene lugar en dos
pasos:
Activacin: Uno de los oxiranos de la molcula (bisglicidil ter o 1, 4 dihidroxi-nbutano) reaccionan con el hidroxilo de la matriz

- OH + CH2-CH-CH2-O-(CH2)4-O-CH2-CH-CH2
O

-O-CH2-CH-CH2-O-(CH2)4-O-CH2-CH-CH2
O

Acoplamiento: Los grupos funcionales restantes reaccionan con el ligando. El

polmero intermediario, con el grupo oxirano, es atacado por nuclefilos cuya
reactividad sigue el orden SH > NH > OH (el pH ptimo de acoplamiento sigue el
rden OH > NH > SH de ms alcalino a ms cido). El acoplamiento de una amina
primaria genera una alquil amina.

-O-CH2-CH-CH2-O-(CH2)4-O-CH2-CH-CH2 -NH2-R
OH

OH

Mientras que los grupos hidroxilo y tioles generan enlaces ter y tioter,
respectivamente

-O-CH2-CH-CH2-O-(CH2)4-O-CH2-CH-CH2-O-R
OH

OH

-O-CH2-CH-CH2-O-(CH2)4-O-CH2-CH-CH2 -O-S
OH

OH

19

A. Carbajal-Saucedo

Los polmeros hidroxilados (por ejemplo las matrices de polisacridos) pueden

convertirse en derivados de oxiranos reaccionandolos con epiclorhidrna en soluciones
alcalinas. En soluciones demasiado alcalinas estas matrices se pueden entrecruzar

--O-CH2-CH-CH2

HO-

-- O - CH2 - CH - CH2 - O O

El entrecruzamiento provoca la insolubilidad de la matriz en agua hirviendo y la

hace mucho ms estable en medio cido.
Este tipo de activacin ofrece ciertas ventajas sobre otros procedimientos ya
que, por ejemplo, los enlaces O-C, N-C y S-C generados al acoplar el ligando son
extremadamente estables. Esta caracterstica es de vital importancia cuando es
necesario tratar a la matriz bajo condiciones demasiado alcalinas. Adems el uso de
bisoxiranos de cadenas largas introduce un brazo espaciador bastante amplio
(equivalente a 12 tomos de carbono) acoplado a la matrz va un enlace ter.

Bizaridinas
Son agentes bifuncionales que pueden utilizarse para unir ligandos con grupos amino o
hidroxilo a la matriz. Desafortunadamente estos agentes son ionognicos pues forman
aminas al acoplar el ligando a la matriz y por tanto la convierten en un intercambiador
inico.
Divinil sulfonas
Estos compuestos reaccionan con polmeros hidroxilados para dar lugar a grupos divinil
sulfona reactivos
O
- OH + CH2=CH-S-CH=CH2
O

O
-O-CH2-CH2-S-CH=CH2
O

El ataque nucleoflico por los ligandos con grupos tioles, amina o hidroxilo sigue
el mismo orden que en el caso de los oxiranos excepto proque la reaccin se lleva a
cabo en una unidad de pH menor. La reaccin con una amina primaria produce una
unin alquil amino.

20

Cromatografa de afinidad

-O-CH2-CH2-S-CH-CH2-NH-R

-O-CH2-CH2-S-CH=CH2 + NH2-R

En pHs mayores a 8 se puede presentar cierta liberacin de ligandos de bajo peso

molecular. Las protenas, por otro lado suelen pegarse ms fuertemente en el mismo
rango de pH.
Benzoquinona
Es una quinona que es mucho ms reactiva que la divinil sulfona para atacar matrices
hidroxiladas.

Activacin
O

-OH +

-OO

Acoplamiento
O

O
_NH-R
+ NH2-R

-O-

-OO

El bloqueo de los grupos residuales se lleva a cabo mediante la adicin de glicina

21

A. Carbajal-Saucedo

Algenos
Los hidroxilos de las matrices de polisacridos pueden acilarse con bromuro de
bromoacetilo seguido de la activacin de un grupo amino adecuado

Activacin
O

O
- OH + Br-C-CH2-Br

- O-C-CH2-Br

Acoplamiento
O

O
-O-C-CH2-Br + NH2-R

-O-C-CH2-NH-R

La reaccin con el ligando puede generar altos niveles de sustitucin de acoplamiento.

Sin embargo, la sensibilidad del enlace ster a pH neutro puede ser una desventaja.
Tambin pueden utilizarse dicloruros de cidos dibsicos, como el dicloruro de cido
glutrico, para inmovilizar los ligandos.
Activacin
O

- OH + Cl-C-X-C-Cl

-O-C-X-C-Cl

Acoplamiento
O

-O-C-X-C-Cl + NH2-R

22

-O-C-X-C-NH-R

Cromatografa de afinidad

Grupos tioles
El mtodo de intercambio de de tioles-disulfuros ha sido un procedimiento muy
atractivo para acoplar ligandos a matrices ya activadas. Los grupos tioles pueden
introducirse a la matriz acoplando cistena o glutation a agarosa activada con CNBr o
reaccionando derivados -aminoalquil [NH2(CH2)nR] con N-acetil homocistena
tiolactona con una pequea cantidad de imidazol como catalizador.

S
=O
- NH-(CH2)n-NH +

pH 9.7
4o C

NH-CO-CH3
O
- NH-(CH2)n-NH-C-CH-CH2-CH2-SH
NH-CO-CH3

Cualquier ligando que contenga algun grupo tiol puede acoplarse a la matriz en
presencia de ferrocianuro alcalino. L unin resultante puede romperse rpidamente
mediante la exposicin a L-cistena, b-mercaptoetanol o ditiotreitol

- SH +

SH - R

-S-S-R

De forma alternativa la tiol-agarosa puede activarse con 2, 2` dipiridin disulfuro o

5, 5`ditiobis (2 acido nitrobenzoico) a pH 8 para, posteriormente, reaccionarlo con un
ligando que contenga un grupo tiol.

Por otro lado, los ligados con grupos tioles tambin pueden acoplarse a
derivados -carboxialquilosmediante condensacin por carbodiimida. El enlace tiolester resultante puede romperse especficamente a travs de la exposicin a pH
alcalino o hidroxilamina neutra 1 M. En contraste, con alquil halidas, como los
derivados de bromoacetamidoalquil de la agarosa, se forma un enlace tiol-eter muy
estable.

23

A. Carbajal-Saucedo

Matrices sintticas
Poliacrilamida

Como se mencion anteriormente, la poliacrilamida consiste bsicamente en

segmentos lineares de polietileno con esqueletos alternados de carbono que poseen
grupos amida (-CONH2). La gran cantidad de estos grupos le proporciona un fuerte
carcer hidroflico y son responsables de la baja adsorcin de macromolculas. La
derivatizacin (activacin y acoplamiento) puede llevarse a cabo de dos formas:

Modificacin directa de la matriz

Co-polimerizacin de la acrilamida/bisacrilamida con un monmero acrlico o vinlico
que posea los grupos funcionales.

Modificacin directa de la matriz

Tiene la ventaja de permitir la preparacin directa de la matriz seleccionando los grupos
funcionales, el grado de sustitucin, la porosidad y el tamao de la partcula. Los
grupos carboxiamida son resistentes a hidrlisis en un rango de pH bastante amplio.
Sin embargo, el nitrgeno de la amida es desplazado rpidamente por ciertos
compuestos nitrogenados dando lugar a amonio

Aminoetilacin

Se adicionan lentamente algunas gotas de etilendiamina anhidro precalentado a

90o C
NH2-CH2-CH2-NH2
- CO - NH2

- CO-NH-CH2-CH2-NH2
90o C

La incorporacin de grupos aminoetilo a la matriz est directamente relacionada

con el tiempo de calentado, a 90o C. En un periodo de 7 hrs pueden obtenerse
densidades de sustitucin cercanas a 1.2 mmol/g de polmero. La velocidad de la
reaccin depende directamente del contenido de agua de la etilendiamina. Se pueden
generar grupos carboxilo en proporcin directa y creciente a la formacin de grupos
aminoetilo.

Hidrazinacin

Se adicionan las gotas secas de la matriz a una solucin de hidrazina (1-6 M) y

se agita levemente a temperatura constante durante el tiempo deseado.

24

Cromatografa de afinidad

NH2-NH2
- CO - NH2

47-50o C

- CO-NH-NH2

El grado de hidrazinacin puede regalarse por medio de la concentracin de

hidrazina en el tiempo y temperatura de la reaccin. La proporcin de grupos carboxilo
generados durante la hidrazinolisis (2-3 %) es menor que la generada durante la amino
etilacin (8 %)

Hidrolisis alcalina

Sucede por la desaminacin de la matriz. Las gotas secas de la amtrz se

adicionan a buffer carbonato/bicarbonato 0.5 M pH 10.5 y el grado de hidrlisis se
controla mediante el tiempo de calentado a 60o C (tambien se puede controlar variando
los valores de pH a temperatura constante)
OH
- CO - NH2

O
-C
O

Los grupos que se obtienen de las diferentes reacciones pueden convertirse

subsecuentemente en una gran variedad de otros derivados con las reacciones
adecuadas antes de acoplar el ligando. Cuando el ligando es una protena, sta puede
acoplarse directamente a la matriz con glutaraldehdo.
Modificacin indirecta

Co-polimerizacin acril-bisacril-ligando

Se obtiene acoplando cido acrlico al amino terminal del ligando para entonces
copolimerizarlo con acrilamida y N, N metilen bisacrilamida. Esta metodologa permite
un fcil control tanto de la porosidad del gel como del nivel de sustitucin del ligando.
Lamentablemente la necesidad de sintetizar ligandos con dobles ligaduras hace
muy poco til la aplicacion de etse mtodo. Sin embargo, la aplicacin de Nhidroxiftalmida permite una rapida reaccin con ligandos que contienen funciones
amina primarias.

25

A. Carbajal-Saucedo

- CH2-CH-CO-NH2
Acrilamida

-CH2-CH2-CO-R

- CH2-CH-CO-NH-CH2-NH-CO-CH-CH2
Poliacrilamida

Co-polimerizacin

- CH2-CH-CO-R
Acriloil ster

NH2-R

-CH2-CH2-CO-NH-R

Donde
O

-O-

R=

-Oo
O

O
N-Hidroxisuccinimida

N-hidroxiftalmidina

Vidrio
La derivatizacin se basa en utilizar compuestos que reacciones con agentes
acopladores de silanos. Estos compuestos cuentan con dos grupos funcionales dentro
de la misma molcula: un grupo rganico en un extremo y; un grupo silil alcoxi en el
otro. Los organo-silanos comerciales incluyen epoxi-, vinil-, tiol-, alquilamina-,
alquilcloro-, y fenil-silanos. El -aminopropil-trietoxisilanose usa comunmente para
introducir aminas primarias a las matrices de vidrio. Subsecuentemente, el producto
puede derivarse a una variedad de grupos funcionales.
O
O-Si-OH
O
O-Si-OH
O

26

O
O-CH2 -CH3
+ CH3 -CH2-O-Si-CH2-CH2 -CH2-NH2
O-CH2 -CH3

OH

O-Si-O-Si-CH2 -CH2-CH2 -NH2

O

O-Si-O-Si-CH2-CH2 -CH2-NH2
O

OH

Cromatografa de afinidad

Por otra parte, los residuos de silanol en la superficie se encuentran disponibles

para la activacin con CNBr. El procedimiento es idntico al que se usa con matrices
de polisacridos.
Otras
Los soportes de hidroxialquil metacrilato contienen grupos hidroxilo que son
suceptibles a la activacin por CNBr adems de los otros procedimientos de que se
habl para las matrices de polisacridos. Por otro lado, los geles pueden formarse copolimerizandolos con monmeros que contengan grupos reactivos de una forma
anloga a la que se usa para las matrices de poliacrilamida.
BRAZOS ESPACIADORES
Son molcualas que alejan al ligando de la matriz permitiendo que el afinante lo
encuentre con mayor facilidad. Son particularmente importantes cuando el ligando es
pequeo, la afinidad de ligando por el afinante es baja (Ki 10-4 M) y en aquellos casos
en los que el ligando involucra protenas de pesos moleculares muy altos. Existen
varios tipos de brazos espaciadores que pueden utilizarse

Hidrofbicos. Un -aminoalquil del tipo NH2(CH2)nR, donde n=2-12 y R puede ser

una funcin amino o carboxilo, se acopla a una matriz activada. Dos de las
combinaciones ms usuales se dan combinando Sefarosa con . -aminoalcanos
(conocido comercialmente como AH Sefarosa 4B) o bien con un -amino, carboxialcano (cuyo nombre comercial es CH Sefarosa 4B). Tambin suele
utilizarse 3. 3 diamino dipropilamina mediante a activacin con CNBr.

Hidroflicos. Usualmente se preparan acoplando 1, 3 diamina-2 propanol amatrices

de agarosa activadas con CNBr. Pueden adicionarse brazos de oligopptidos como
oligoglicina, glicil-glicil-tirosina, glicil-glicil-serina o glicil-glicil,cido glutmico que
proveen a la matriz con grupos fenlicos, tilicos, hidroxilos o carboxilos con lo cual
se introducen nuevos grupos reactivos a la matriz.

Macromolculas multivalentes. Bajo este rubro se utilizan polipetidos o protenas

como espaciadores hidroflicos con multiples uniones que reducen tanto la fuga del
complejo ligando-espaciador como las interacciones hidrofbicas no especficas.
Las molculas ms comunmente usadas son poli-(L-lisil)-, poli-(DL-alanil)-, poli(lisil)-agarosa. Tambin se ha podido acoplar albmina srica bovina a agarosa
activada con CNBr en presencia de una alta concentracin de urea para evitar que
se despliegue y ayudar a que se una en ms sitios.

Molculas libres de carga. Como ya se mencion, al acoplar aminas primarias a una

matriz activada con CNBr se forman N-isoureas que le dan a la matriz fuertes
propiedades de intercambiador inico. Este problema se puede solucionar
adicionando dihidrazida de cido adpico, dihidroazida de cido succnico, hidrazida
de cido poliglutmico o hidrazida de cido poliacrlico a una matriz activada con

27

A. Carbajal-Saucedo

CNBr. Aunque por un lado stos compuestos evitan la aparicin de cargas en la

matriz por otro lado presentan cierta fuga del brazo espaciador.
BLOQUEO DE LOS SITIOS INACTIVADOS
Despus que el ligando ha sido unido a la matriz es recomendable bloquear los
sitios remanentes que puedan tener la capacidad de unirlo. En los casos en los que se
utilizan grupos amino para unir al afinante las molculas ms comunmente utilizadas
para bloqueo son aminas primarias de bajo peso molecular (por ejemplo 2-aminoetanol o glucosamina).
En geles que contienen ster como grupos reactivos los sitios inactivos suelen
bloquearse adicionando Tris 0.1 M pH 8. En los casos en los que los grupos reactivos
son funciones aldehdo los sitios inactivos se bloquean con borohidruro de sodio justo
despus de la unin. Este tratamiento no slo ayuda a la reduccin de los adehdos
remanenetes sino tambin a la estabilizacin de las uniones entre el afinante y la
matriz.
Si el ligando se ha unido a un espaciador puede suceder que una regin del
espaciador, casi siempre en los extremos amino o carboxilo, permanezca activa. En el
caso de ser grupos carboxilo pueden bloquearse con Tris (2-amino,2hidroximetilpropano- 1,3-diol) y con N-ciclohexil N [2 (4-morfolinil) etil-carbodiimida
metap-tolueno sulfonato. Cuando el ligando se ha unido a una CH Sefarosa 4B
mediante unin con carbodiimida se puede bloquear con glucosamina o 2-aminoetanol.
En el caso de una AH Sefarosa 4B se utiliza cido actico o anhdrido actico para
loquear los grupos amino.
Otro paso importante en la preparacin de alguna matriz aprticular para realizar la
cromatografa propiamente dicha consiste en el lavado exhaustivo de todas las
sustancias que no se unieron covalentemente a la superficie de la matriz. Se obtienen
mejores resultados si el lavado se lleva a cabo alternando buffers cidso y alcalinos o
bajo alta fuerza inica.
LIGANDOS
Una molcula puede ser utilizada como ligando siempre y cuando se una
especfica y reversiblemente a un afinante de inters. Al escoger un afinante debe
tenerse en cuenta la naturaleza de la interaccin afinante-ligando y la naturaleza del
ligando mismo para saber si tiene o no (y cuantos) sitios potenciales para para acoplar
a la matrizas como la albilidad que pueda presentar bajo las condiciones de
acoplamiento.
Cuando la macromolcula que se pretende aislar es una enzima los ligandos
que suelen utilizarse pueden ser inhibidores competitivos, sustratos y sus anlogos,
productos, cofactores, efectores alostricos, anticuerpos y hasta compuestos que

28

Cromatografa de afinidad

contengan ines metlicos o grupos SH-. Para enzimas DNA especficas se pueden
utilizar fragmentos de DNA de cadena sencilla.
Una rama muy explotada de la cromatografa de afinidad es la purificacin de
macromolculas mediante el uso de anticuerpos o antgenos. La constante de
disociacin de una interaccin antgeno-anticuerpo cae en un rango de 10-5-10-8 M.
Para la purificacin de anticuerpos se utilizan los mismos antgenos o haptenos usados
para su produccin.
Si la molcula que pretende aislarse es un carbohidrato suelen utilizarse lectinas
comoligandos. Las lectinas son protenas o glicoprotenas que presentan cierta
selectividad por carbohidratos. Cuando la molcula a aislar es una glicoprotena es
recomendable conocer la naturaleza del carbohidrato terminal para poder seleccionar
una lectina especfica. Las lectinas, en la mayora de los casos no son especficos para
un azcar en particular aunque existen grandes diferencias en los grados de
especificidad.
Otras macromolculas que pueden aislarse por cromatografa de afinidad son
algunos receptores membranales utilizando sus correspondientes hormonas como
ligandos. La cantidad de receptores membranales especficos en una clula cualquiera
es muy pequea (por ejemplo, la concentracin del receptor de glucagn en una clula
pancretica es de 26 pmol/mg de protena), es por eso que la interaccin hormonareceptor debe ser muy fuerte (Kd entre 10-6-10-11 M) para asegurar la unin en un
sistema que incluye varios fragmentos de membrana. Aunque las dificultades tcnicas
que se deben sladar en este tipo de purificaciones son muy variadas se han podido
obtener fragmentos membranales con receptores especficos (por ejemplo, el recptor
para la -bungarotoxina del rgano elctrico de Torpedo californica).
Para la purificacin de transportadores especficos o protenas de unin se han
utilizado diversas vitaminas y hormonas. La constante de disociacin de algunos de
estos complejos andan entre 10-7-10-16 M. Debido a la baja concentracin a la cual
pueden encontrarse es necesario modificar lso esquemas convencionales de
purificacin, sin embargo, se pueden obtener buenas cantidades del afinante.
El uso de ligandos de cidos nucleicos como mononucletidos, oligonocletidos
y cidos nucleicos ha sido de enorme importancia tanto para el aislamiento como para
la caracterizacin de enzimas que participan en seintesis o degradacin de stos
compuestos. Resulta fcil pensar que inmovilizarse bases nuclotdicas, nuclesido u
oligonucletidos para separar, fraccionar y determinar la estructura de varios cidos
nucleicos.
La dodecil amina ha sido un ligando muy til para separar lpidos y para
hormonas se pueden utilizar anticuerpos, protenas transportadoras o lectinas.

29

A. Carbajal-Saucedo

ANEXOS
Activacin de matrices de polisacridos por CNBr
Antes de la activacin o derivatizacin la matriz debe lavarse exhaustivamente para
remover agentes bacteriostticos y otros preservativos presentes.
Mtodo de activacin-titulacin

Adicionar 20 g de agarosa (peso hmedo) a 20 ml de agua destilada

Agitar lentamente con agitador magntico a una temperatura de 10-15o C
Ajustar el pH a 10.8 0.1 adicionando NaOH 4N
Adicionar CNBr (10 mg/g gel hmedo) y mantener el pH a 10.8 0.1 con
NaOH 4N
Lavar

Mtodo de activacin por carbonatos

Una cantidad adecuada de gel se suspende en un volumen igual de buffer

carbonato/bicarbonato 2M pH 10.9. Amntener la mezcla de 4-5o C
Agregar CNBr (100 mg/g de gel hmedo disuelto en acetonitrilo)
Incubar 10 min de 4-5o C
Lavar

moles de glicina unidas/ml de agarosa

100

80

60

40

20

0
0

40

80

120

160

mg CNBr adicionados /ml de agarosa

30

Cromatografa de afinidad

Fig. 4 Relacin entre la concentracin de CNBr utilizada para activar una matriz de agarosa y la cantidad de ligando
unido (glicina)

En casos en los que la cantidad de ligando sea muy alta suelen utilizarse
concentraciones de CNBr de 50 y 200-300 mg/g de gel hmedo titulndose,
respectivamente con 2 M y 8 M NaOH. La cantidad de un ligando pequeo, glicina,
unido a agarosa activada fue linealmente proporcional a la concentracin de CNBr
utilizada hasta los 80 mg/g. Los ligandos proticos pueden mostrar comportamientos
similares.
Lavado de las matrices activadas
Una vez que se ha activado una matriz con CNBr debe lavarse rpidamente y
transferirse al medio de acoplamiento puesto que el intermediario de cianato es poco
estable.
Al final de la activacin el gel debe enfriarse rpidamente colocndolo en hielo y
debe transferirise a un tubo de vaco. La suspensin se filtra rpidamente a un
recipiente que contenga sulfato ferroso para remover el CNBr y las cianidas que no
reaccionaron a fin de formar ferrocianidas inofensivas. El gel se lava
subsecuentemente bajo succin con agua fra y el buffer que va a ser utilizado para el
acoplamiento.

Acoplamiento
Las aminas primarias no protonadas pueden acoplarse con considerable eficiencia a
las matrices activadas con CNBr . An cuando no se conoce la naturaleza exacta de
los productos acoplados, existe evidencia de la formacinde N-isoureas
Para evaluar la capacidad de acoplamiento de un compuesto a matrices
activadas por CNBr se utilizan molculas como la alanina que posee un grupo a-amino
y que presenta un rango ptimo de acoplamiento en un pH entre 9.5 y 10

31

A. Carbajal-Saucedo

Alanina acoplada (moles/mlde agarosa)

14

12

10

0
5

10

11

12

pH
.

Figura 5. Efecto del pH en el acoplamiento de [14C] alanina a una matriz de agarosa activada con CNBr

Este comportamiento es el reflejo de dos fenmenos: la carga del a-amino y la

estabilidad del complejo activado. El extremo ascendente que se muestra en la figura
esta determinado por la forma reactiva desprotonada del ligando, el pH de
acoplamiento debe escogerse por arriba del pKa del ligando pero no debe rebasar el
valor de 10. De hecho se calcula que debe ser: 7-8 para aminas aromticas (pKa
cercano a 5); 9.5-10 para aminocidos (pKa del a-amino cercano a 8) y; 10 para
aminas alifticas (pKa entre 9 y 10).
Se debe evitar el uso de buffers que contengan grupos amino, como el tris, ya
que estos grupos competirn con las funciones amino del ligando por los grupos
activados. Los buffers ms comunmente utilizados son el borato y el bicarbonato.
El decremento en el acoplamiento que se muestra en la figura anterior muestra
una fuerte caida en la estabilidad del complejo activado. La sefarosa actvada con CNBr
tambin es inestable a temperatura elevadas, es por eso que las reacciones deben
llevarse a 4o C.
Como se mencion anteriormente, la matriz recin activada se pone
inmediatamente en contacto con el ligando, la reaccin de acoplamiento se lleva a cabo
de 2-3 hrs usualmente. Sin embargo, es conveniente que se permita que la reaccin se
lleve a cabo durante toda la noche a 4 o C para asegurar la completa prdida de grupos

32

Cromatografa de afinidad

reactivos en la matriz. An bajo estas condiciones algunos grupos reactivos

permanecen en la matriz (especialmente con ligandos muy grandes). Estos grupos
residuales pueden bloquearse reaccionandolos con 1-amino-2,3-propanodiol, Dglucosamina o etanolamina
La cantidad de lligando unido a una matriz activada con CNBr est en funcin de
la cantidad adicionada durante el acoplamiento

moles de glicina unida/ml de agarosa

La grfica de la Fig. 6 es reflejo del comportamiento de la adicin de ligando a la

matriz y se ha demostrado que las matrices de polisacridos tienen una marcada
tendencia a unir protenas (covalentemente) bajo condiciones ligeramente alcalinas, es
decir, siguen un comportamiento muy parecido al que se muestra en la grfica y
pueden ser utilizadas como ligandos especficos. Por ejemplo, la quimotripsina y la
papaina pueden unirse a matrices de dextrano, agarosa o celulosa para dar lugar a
conjugados que contienen hasta 30% de protena. Sin embargo, la exposicin de estas
enzimas a polmeros activados bajo un pH donde la amyora de los grupos amino de la
protena esten desprotonados puede provocar uniones en ms de un punto del ligando
provocando un descenso de actividad. Este problema puede resolverse acoplando en
valores por debajo del pH ptimoa fin de que slo algunos residuos estn
desprotonados.

80

60

40

20

20

40

60

80

100

120

moles de glicina adicionada/ml de agarosa

33

A. Carbajal-Saucedo

Figura 6. Efecto de la concentracin de glicina en la unin de glicina e una matriz de agarosa activada con CNBr.

Activacin y acoplamiento con metaperiodato de sodio

Activacin

El gel se mezcla con un volumen igual de NaIO4 0.2 M suavemente por 2 hrs a
temperatura ambiente
Acoplamiento con hidroborato de sodio

La matriz oxidada se filtra y se lava exhaustivamente con agua destilada

Se introduce el ligando. El pH se lleva a 9 adicionando Na2CO3 slido. Una vez
alcanzado este valor se adicionan 10 ml de NaBH4 5 M y se mezcla por agitacin
durante 12 hrs.
El gel se lava exhaustivamente con NaCl 1M hasta que se eliminen por completo las
diaminas libres
Acoplamiento con ciano hidroborato de sodio

Lavar el gel con buffer fosfato 0.5 M pH 6

Adicionar buffer fosfatos 0.5 M pH 6 + 1-50 mM ligando + 0.5 mM NaBH3CN y
mezclar suavemente por volteo durante 3 das a temperatura ambiente
Lavar exhaustivamente. Adicionar 1 ml/ml de gel de NaBH4 1 M para reducir los
grupos aldehdo que no reaccionaron. Se dejan reaccionar durante 15 hrs a 4o C
Lavar exhaustivamente

EJEMPLOS PRCTICOS
En este apartado se encontrarn algunos ejemplos de la utilizacin de las metodologas
antes revisadas y las fromas en las que se recuperaron algunas macromolculas
importantes.
Ejemplo 1. Expressing an purifying membrane transport proteins in high yields
Hale C. C., Hill. C. K., Price E. y Bossuyt J. 2002. J. Biochem. Biophys Methods.
Los autores proponen una metodologa que resulta en mayor cantidad de
protena nativa purificada expresando el gen recombinante en clulas de insecto
utilizando baculovirus como vector de expresin. ste vector le adiciona 6 residuos de
histidina en el extremo carboxilo terminal del gen permitiendo su posterior recuperacin
en una columna Nquel. Esta metodologa explota la gran afinidad que presentan el
niquel por los residuos de histidinas (y de cistena). Para recuperar la muestra se utiliz
un buffer que contena imidazol 500 mM

34

Cromatografa de afinidad

His-tagged recombinant NCX protein from Trichoplusia ni larvae vesicles was subjected to Ni2+ affinity
column chromatography. Eluted NCX protein was reconstituted into proteoliposomes. Column protein
recovery (n=3) and affinity purified NCX activity (n=4) are compared. Activity of reconstituted affinity
purified NCX is compared to activity of NCX reconstituted directly from larvae vesicles. Conclusion: 5% of
larvae vesicle protein was recovered with a 13.4-fold increase in NCX specific activity.

Ejemplo 2. Overexpression and reconstitution of a Rieske iron-sulphur protein from the

higher plant. Gubernator B., Seidler A., Rogner M. y Szczepaniak A.2003. Prot.
Expression. Pur. 29 (1): 8-14.
El objetivo principal de este artculo es conocer la estructura de una protena que
participa activamente en la cadena de transporte de electrones en clulas de plantas.
Una de la herramientas que los autores utilizan para lograrlo es clonar el gen en un
vector de expresin que le aade la protena de unin a maltosa (MBP) a su protena
de inters. La columna que utilizaron fue de amilosa y eluyeron la protena de inters
con maltosa que compite con la amilosa por la unin con la MBP.

35

A. Carbajal-Saucedo

Fig. 3. Para conocer la estructura de una protena que participa activamente en la cadena de transporte
de electrones en clulas de plantas. Una de la herramientas que los autores utilizan para lograrlo es
clonar el gen en un vector de expresin para purificar por afinidad la protena de fusin.

Ejemplo 3. Purification and physicochemical characterization of a cotyledonary lectin

from Luetzelburgia auriculata. Oliveira A. T., Melo V. M., Camara M., Vasconcelos I.,
Beltramini L., Machado O., Gomes V., Pereira S., Fernandes C., Nunes E., Capistrano
G. y Montero-Moreira A. 2002. Phytochemistry 61 (3):301-310
En este caso lo que buscan los autores es no slo purificar sino tambin
caracterizar lo mejor posible una lectina de plantas. La cromatografa de afinidad sirve
slo como uno de muchos pasos que siguen para lograrlo. Una vez que los cotiledones
de la planta haban crecido lo suficiente hicieron un homogenado seguido de un
centrifucacin para eliminar la mayor parte de los restos celulares. Luego de sto
fraccionaron el sobrenadante con diferentes concentraciones de sulfato de amonio y los
precipitados resultantes los dializaron contra agua. Las fracciones dializadas se
pasaron a travs de una columna de agarosa-N-acetyl D galactosamina. Las lectinas
son protenas que unen diversos tipos de azucares. Para eluir la muestra utilizaron un
buffer que contenia 200 mM galactosa.

36

Cromatografa de afinidad

Fig. 1. Agarose-N-acetyl--galactosamine affinity chromatography. The 4060% ammonium sulfate fraction

was applied to the agarose-N-acetyl-D-galactosamine column (2.5 X 5.0 cm) equilibrated with 0.05 M
sodium acetate buffer (pH 6.0) containing 0.15 M NaCl. The lectin was eluted with 0.2 M D-galactose
included in the above buffer at a flow rate of 30 ml h-1. Fractions (2.5 ml) were collected and monitored
for protein content at 280 nm.

Ejemplo 4. Novel ligands for the affinity chromatographic purification of antibodies.

Fassina G., Ruvo M., Palombo G., Verdoliva A. y Marino M.
J. Biochem. Biophys. Methods. 2001. 49 (1-3): 481-490
Si bien el uso de la cromatografa de afinidad en la purificacin de anticuerpos ha sido
ampliamente requerido, en muchas occasiones se ve un poco frenado por la poca
disponibilidad de ligandos. En este artculo los autores hacen una revisin de distintos
ligandos sintticos que podran utilizarse a fin de purificar distintos tipos de
inmunoglobulinas

a Depending on the type of support.

b No binding or very weak binding.
c Depending on IgG isotype (in mg Ig/g wet gel: IgG1 12.3, IgG2 10, IgG3 4.8, IgG4 8.7).
d Only for rat and mouse IgG.
e Selective for IgM with buffers at high ionic strength.

37

A. Carbajal-Saucedo

f Not determined.
g For monoclonal antibodies.

Table 1. Capacities (mg Ig/ml support) of different ligands for various immunoglobulin classes

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Cromatografa de afinidad

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