1 COLIFORME TOTAL. DETERMINACION DEL NUMERO MAS PROBABLE DE COLIFORME TOTAL POR LA TECNICA DE LOS TUBOS MULTIPLES AL INTRODUCCION El rApido aumento de 1a densidad poblacional y el crecimiento industrial hace necesario e indispensable tratar las aguas residuales para que, de esta ma~ nera puedan servir para diversos usos, considerandolas como un recurso adicional. Asi mismo, las aguas residuales, especialmente las de origen doméstico, albergan bacterias, virus y otros organisms microscépicos, convirtiéndose en un vehfculo de trasmisién de enfermedades. El aislamiento de patégenos de muestras de aguas residuales, aunque posi- ble, no es accesible a todos los laboratorios por su alto costo y necesidad de personal especializado. Se hace necesario el examen rutinario de estas aguas y determinar su gra~ do de seguridad desde el punto de vista microbiolégico. Para evaluar las condiciones sanitarias del agua se utilizan bacterias del grupo Coliforme, que actfian como indicadores de contaminacién fecal, y se encuentran en gran nGmero en la flora intestinal del hombre y de animales de sangre caliente. 2. DEFINICION DEL GRUPO COLIFORME El grupo coliforme incluye todos los bacilos Gran-negativos aerobios o anaerobios facultativos no esporulados, que fermentan la lactosa con produccién de gas, dentro de 24-48 horas a 35° Cl, Si consideramos este grupo en relacién con la familia Enterobacteriaceae se vera que incluye los géneros: Escherichia, Citrobacter, Enterobacter y Klebsiella.3. METODO DEL NUMERO MAS PROBABLE (NMP) La determinacién del NMP de bacterias coliformes en una muestra se hace a partir de la técnica de los tubos miltiples, en 1a cual voliimenes decrecientes de la muestra (diluciones decimales consecutivas) son inoculadas en un medio de cultivo adecuado. La combinacién de los resultados positivos y negativos es usada en la determinacién del NMP. 3.1 Resumen del método EL método consta de tres etapas: prueba presuntiva, prueba confirmativa Yy prueba complementaria (ver Figura 2). La prueba presuntiva consiste en colo- car voliimenes determinados de muestra en una serie de tubos conteniendo caldo lauril triptosa y son incubados a 35° C + 0.5° C durante 24-48 horas. En esta prueba presuntiva 1a actividad metabélica de las bacterias es estimulada vigoro- samente y ocurre una seleccién inicial de organismos que fermentan 1a lactosa con produccién de gas. La formacién de gas a 35° C + 0.5° C dentro de las 24- 48 horas, constituye una prueba presuntiva positiva pata la presencia de bacte— vias del Grupo Coliforme. La prueba presuntiva no debe usarse rutinariamente sin confirmacién para andlisis de agua y aguas residuales®. De acuerdo al objetivo del estudio, en algunos casos se puede usar la prueba presuntiva sin confirmacién, o en los casos en que exdmenes anteriores indican que los resultados de 1a prueba presuntiva son comparables a 1a prueba confirmativa?. La prueba confirmativa consiste en transferir todos los tubos positives de 1a prueba presuntiva a tubos conteniendo caldo lactogado verde brillante bilis 2% y son incubados durante 24-48 horas a 35° C + 0.5° C. Esta prueba reduce 1a posibilidad de resultados falsos gas-positivos que pueden ocurrir por la actividad metab6lica de los organismos formadores de esporas o por la produc— cin sinergistica de gas debido a que algunas cepas bacterianas no pueden, indi- vidualmente, producirlo a partir de la fermentacién de la lactosa. El caldo lactosado verde brillante bilis contiene agentes selectivos e inhibidores quesuprimen el desarrollo de todos los organismos no coliformes. La produccién de gas a 35° C después, de las 24~48 horas constituye una prueba confirmativa positiva, La prueba complementaria consiste en transferir por inoculacién en es- trias, las bacterias a partir de los tubos de caldo lactosado verde brillente bilis positivos, a placas de Agar Endo o Agar Eosina Azul de Metileno (B.A.M.), luego son incubadas a 35° ¢ + 0.5° C durante 24 + 2 horas. Se consideran posi- tivas las colonias tipicas que son nucleadas con o sin brillo metAlico y las colonies atipicas que son opacas, anucleadas, mucoides y de color rosado. Colo- nias tipicas y atfpicas son transferidas a tubos con caldo lauril triptosa y tubos con agar inclinado. Sera prueba complementaria positiva cuando haya pro- duccién de gas a partir de la fermentacién de 1a lactosa y por el examen micros- cSpico, sea demostrada la presencia dé bacilos gram-negativos no esporulados, en las bacterias desarrolladas en el agar inclinado. Esta prueba se aplica en el examen de muestras de agua, si los resulta~ dos son aplicados en el control de 1a calidad del agua potable. También se reco- mienda cuando existe alguna duda sobre 1a validez de 1a prueba confirmativa. 3.2 Aplicacién EL procedimiento del NMP para la determinacién de Coliforme Total puede ser usada para evaluar 1a potabilidad de aguas tratadas y como indicador de la calidad bacteriolégica de aguas naturales y contaminadas. 3.2.1 Ventajas La prueba presuntiva y confirmativa consiste en observar la presencia o ausencia de gas, para lo cual se requiere minima experiencia. Muestras de agua con alta turbiedad y gran niimero de algas no producen aparentemente efectos nocivos en la reaccién de los tubos®. 3.2.2 Limitaciones El tiempo requerido para 1a prueba puede ser de 96 horas con 1a prueba confirmativa.EL requerimiento horas-hombre para 1a preparacién del material de vidrio y medios de cultivo para la prueba es significative. 3.3 Equipos, materiales, medios de cultivo y reactivos 3.3.1 Equipos y material Estufa para esterilizacién en calor seco Con capacidad suficiente para la circulacién del aire caliente en su inte~ tior. Debe estar provista de termémetro calibrado para mantener una temperatura de 170 # 10° ¢ durante un perfodo de dos horas. El tiempo de esterilizacién para el material de vidrio Pyrex es de dos horas a 170° C ~ 180° Cc. Autoclave De tamafio suficiente para permitir la circulacién de vapor. La cémara del autoclave debe tener un termémetro calibrado y colocado de forma tal que se pueda registrar la temperatura minima del interior de 1a cdmara, un manémetro © medidor de presién y una vélvula de seguridad. La temperatura de esterilizaci6n debe ser alcanzada ndximo en 30 minutos porque algunos componentes de los medios de cultivo no deben ser sometidos al calor durante mas de 60 minutos, desde el momento que se cierra la tapa del auto- clave hasta que el medio es retirado. . Para que la eaterilizacién sea eficiente, debe ser eliminado todo el aire del interior del autoclave antes de iniciar el periodo de esterilizacién. Incubadora de aire caliente Equipada con termostato de tal manera que la temperatura de 35° C sea uni- forme en todas partes. Los termémetros, calibrados con-una divisién de escala 0.5° C, manteniendo 1a humedad relativa entre 75 y 85%. La incubadora no debe estar sometida a variaciones excesivas de temperatura causadas por fluctuacio- nes de la temperatura ambiental, cambios de corriente eléctrica o apertura innecesaria.Balanzas Deben tener una capacidad de 200 - 300 gramos com minimo y una sensibi- lidad de por lo menos 2 gramos para 150 gramos de pesada. Destilador de agua Debe producir agua no téxica que pueda impedir el desarrollo de bacterias. Es recomendable efectuar un pretratamiento si es que el agua que alimenta al destilador es de baja calidad (por ejemplo que contenga dureza, compuestos orgé- nicos 0 turbiedad). Una columa de intercambio idnico, utilizando el ciclo de cloruro de sodio, puede ser colocada antes del destilador para ablandar las aguas duras. Medidor de pH Dotado de un sistema electrénico, capaz de dar lecturas directas con una exactitud de + 0.1 unidades de pH. Gontador de colonias Se debe utilizar un contador de colonias de Quebec, con campo oscuro o similar, que tenga visibilidad satiefactoria. Mechero de Bunsen Microscopio Frascos para la toma de muestras De vidrio neutro 0 plastico autoclavable, no téxico, con capacidad minima de 125 mi de boca ancha y tapa esmerilada. Frascos para agua de dilucién Estas botellas o tubos deben ser de borosilicato u otro vidrio no corro- sible, con tapa de rosca, de preferencia con una graduacién de 90 + 2 mt, dejando un espacio suficiente para permitir una buena homogenizacién.Piper: De tamafio conveniente para tomar el volumen requerido répidanente, per- mitiendo un error mximo de 2.5%. En caso de que no se emplee perilla de gona se debe colocar un pequeiio tapén de algodén en la parte superior de cada pipeta, antes de ser esterilizada, como una medida de seguridad. Tubos de ensayo Tubos de ensayo de borosilicato (pyrex) o vidrio neutro, de 18 mm x 180 mm; 16 mm x 150 mm; y de 75 mm x 100 mm, Material para 1a preparacién de medios de cultivo Recipiente de vidrio o acero inoxidable. as Pets Deben ser de borosilicate (pyrex) o vidrio neutro de buena calidad, con fondo preferentemente plano, sin ranuras, con medidas de 15 mm de altura x 100 mm de didmetro. Asas de inoculaci6n De platinoo nfquel~cromo, con un aro de 3mm de didmetro. Laminas porta objeto : Estuches para pipetas y placas Petri De acero inoxidable o aluminio; para proteger el material en la esterili- zacién y durante su almacenamiento. 3.3.2 Medios de cultivo y reactivos aldo Lauril Triptosa Para 1a prueba presuntiva:Formula Triptosa : 20.0 g Lactosa 5.08 Fosfato dipotasico KzHPO, 2.75 g Fosfato monopotasico KH2PO, 2.75 8 Cloruro de sodio NaC; 5.08 Lauril sulfato de sodio O.1g Agua destilada le pH aproximado 6.8 + 0.1 después de 1a esterilizacién. Preparacién Para cada litro de agua destila agregar 35.6 g de caldo lauril triptosa (caldo simple). Distribuir en cantidades de 10 me en tubos de ensayo de 16 am x 150 mm provisto con un tubo de fermentaci6n invertido (tubo de Durham), taponar y esterilizar a 121° C durante 15 minutos. Para caldo doble: agregar 71.2 g de caldo lauril triptosa a 1 litro de agua destilada. Distribuir en cantidades de 10 ma en tubos de ensayo de 20 x 175 mm provisto con un tubo de fermentacién invertido (tubo Durham), taponar y esterilizar a 121° C durante 15 minutos. Guadro No. 1 GONCENTRACION ADECUADA DE CALDO LAURIL TRIPTOSA EN COMPENSACION AL VOLUMEN DE MUESTRA EMPLEADA * Tubos con Volumen de Concentracién Grams de CLT CLT en me. muestra en mi del medio por litro 10 0.1 a 1.0 lox 35.6 10 10 2 x 71.2 20 10 1.5 x 53.4Galdo Lactosado Verde Brillante Bilis 2% Para la prueba confirmativa: FSrmula Peptona Lactosa Bilis de buey deshidratada Verde brillante Agua destilada pH final luego de esterilizacién Preparaci6n 10.0 g 10.0 g 20.0 6 0.0133 g La 7,240.2 Para cada litro de agua destilada agregar 40 g de verde brillante bilis 2k, distribuir en cantidades de 10 mt en tubos de ensayo de 16 mm x 150 um, provisto con un tubo de Durham invertido. Taponar y autoclavar a 121° ¢ durante 15 minutos. Agar eosina azul de metileno EAM Para aislamiento de colonias coliformes; prueba complementariat Formula Peptona 10.0 g Lactosa 10.0 g . Fosfato dipotasico KzHPOy 2.08 Agar 15.0 8 Fosina 0.4 8 Azul de metileno 0.065 & Agua destilada le pl final luego de esterilizacién 71£0.1Breparac: Para cada litro de agua destilada agregar 37.5 g de agar cosina azul de netileno. Disolver el medio calenténdolo y agitandolo. Esterilizar durante 15 minutos a 121° G. Distribuir en voliimenes de aproximadanente 15 mé en pla- cas de petri. Agar nutritivo FSrmula Peptona 5.08 Extracto de carne 3.08 Agar 15.0 g Agua destilada le PH final luego de esterilizacién 6.8 Preparacién Pesar 23 g de agar nutritivo y disolver en I £ de agua destilada frfa; dejar en reposo durante unos 15 minutos. Disolver por calentamiento y agitando frecuentemente hasta disolver completamente teniendo cuidado de no llegar a temperatura de ebullicién. Distribuir el medio aGn estando caliente en voliine- nes de 6 2 7 mi en tubos de ensayo de 12 mm x 120 mm, Esterilizar a 121° ¢ durante 15 minutos. Retirar del autoclave y atin estando taliente colocar los tubes en posicién inclinada hasta que el medio se solidifique. Agua de dilucién Solucién Stock A Fosfato monopotésico (KHzP0,) 34.0 g Agua destilada 500 me= 10 - Preparacién Disolver el fosfato monopotésico en 500 mi de agua destilada, ajustar el pH para 7.2 con NaOH 1 N y completar el volumen a un litro con agua destilada. Soluciéa Stock B Sulfato de magnesio (Mg $01,7K20) 50.0 Agua destilada 1000 me Preparacién Disolver el sulfato de magnesio en un litro de agua destilada. Preparacién del agua de dilucién Agregar 1.25 mi de la solucién Stock (A) de fosfato monopotésico y 5 mt de 1a solucién Stock (B) de sulfato de magnesio a un litro de agua destilada. Distribuir en cantidades que aseguren luego de autoclavear durante 15 minutos a 121° C volumen de 90 + 2 me. Reactivos para la coloracién de Gram Solucién de cristal violeta Preparacién Disolver 2 g de cristal violeta en 20 ms de alcohol etflico a 95% y filtrar en papel grueso o algodén. Disolver 0.2 g de oxalato de amonio en 20 mi de agua destilada. Mezclar estas soluciones en partes iguales. Solucién de Lugol Preparacién Disolver 2 g de yoduro de potasio (KL) en 5 mé de agua destilada. Agre~ gar 1 g de cristales de yodo a 1a soluci6n de yoduro de potasio y agitar hasta que el yodo se disuelva. Agregar 295 mt de agua destilada y agitar.-u- SoluciSn de Safranina Preparacién Disolver 2.5 g de safranina en 100 mf de alcohol etflico 95%. Diluir 10 mt de solucién stock de franina en 90 mt de agua destilada. Alcohol ~ acetona Preparaciéa Mezclar alcohol etilico 95% y acetona en partes iguales. 3.4 Muestreo Para la toma de muestras bacteriolégicas se deben usar frascos estériles con capacidad de 125 mf. El método de coleccién se determina por el objetivo del estudio. En lagos, reservorios, rios, la abundancia de bacterias varia con la profundidad y con la hora. Para recolectar la muestra se sumerge rapidamente el frasco debajo de ja superficie del agua unos 15 6 20 cms para de esta manera evitar recolectar material flotante y dirigiendo 1a boca de la botella ensentido contrario al de 1a corriente, para prevenir el contacto del agua con las manos. EL tiempo de transporte al laboratorio no debe exceder las seis horas. Debido a la gran influencia que 1a temperatura ejerce en la poblacién bacteriana, €5 importante que se mantengan refrigeradas a 4° C, manteniéndose la muestra tefrigerada alin después de su llegada al Laboratorio y el andlisis comenzarse de inmediato © maximo a las dos horas siguientes a su llegada.126 3.5 Procedimiento Cuadro 2 RANGO DE VOLUMEN DE MUESTRAS PARA COLIFORME TOTAL Y FECAL METODO DE TUBOS MULTIPLES Volumen necesario Tipo de muestra ; xix A, Agua residual cruda T | x B. Agua residual efluente pri- mario ©. Agua residual efluente se- cundario | 7 T | | | { | Lie. D. Agua residual i | | efluente ter- ' i j ciario {ox x] | | | 1 * E. Agua residual efluente cua- | ternario x 3.5.1 Procedimiento pare coliforme Prueba presunt: ~ Preparar serie de tres tubos con caldo lauril triptosa y ponerlos en gradillas. : - Codificar los tubos anotando e1 némero asignado, volumen inoculado y fecha. = Identificar el frasco del agua de dilucién. ~ Homogenizar 1a muestra. ~ Con una pipeta estéril transferir 10 mt de 1a muestra original a un frasco con 90 * 2 mt de agua de diluci6n amortiguado con fosfato, De esta manera-13- tenemos la primera dilucién llamada dilucién (A) (107!) correspondiente a 0.1 mt de la muestra original (Ver Figura 1). El cdlculo es el siguiente: Volumen de muestra Volumen del agua de dilucién + volunen de muestra ~ ‘tlucién correspondiente jemplo Diluciéa (A) __10 lo, 30+ 10 * Too” 01m ~ Homogenizar el frasco que contiene la diluci6n 107! de 1a muestra y con una nueva pipeta esterilizada transferir 10 mt a un nuevo frasco de dilucién, te- niendo asf la segunda dilucién decimal (102), llamada dilucién (B), correspon~ diente a 0.01 mt de la muestra, El cdleulo es el siguiente: Ax B = Dilucién final correspondiente 1 Tot iS 10, _100 * Too “ Too0d S| - Proceder de esa forma en las secuencias de dilucién deseada: (om? , 107% , 10S , etc.) - Ordenar los frascos conteniendo las diluciones, manteniendo secuencia creciente con relacién a los volimenes de 1a muestra inoculada. ~ Agitar fuertemente por + 25 veces el frasco con la Gltima dilucién efec~ tuada y con una pipeta estéril de 5 mf sembrar 1 mz de 1a dilucién en cada uno de los tubos de Caldo Lauril Triptosa (CLT) concentracién simple, correspondiente a esa dilucién. (Ver Figura 2),Tubos con 10m de medio de cultivo —> Volumen de muestra original en los > tubos Diluc{én 10 —-10mt—> |[°024}---- 10a Dilucién Ditueién 10? 1073 “ Dilucién 10° ah fmt, Hy ith i itt \ | l | ft j i U U YUU J WU 1o7'ne 103g lone, Figura No. 1 PREPARACION DE DILUCIONES DECIMALES 10m —> -at--15- aS - / 48 brs Prueba Negativa 8 ee as - 7 48 hee Prueba Negetiva io TAURI, TRIPTOSA Tnewbar a 35 £0,5°C : ce A Ne i Teincaber 7 oe ee i ws + 7 48 Ww Procba Footeiva coti forse Fresente Caibo VERE BRILLANTE BLES rc a5 t05¢¢ ens 2atnes 7 Teincabar i aan g : CSS 7 a8 hee 2 Prusha Positiva 3 oti forge Presence Tadae FosTan ADU DE YETTINNG Be horas 35.4 003° ciontas Tipicas ints Golonias Coldforme wnentes 4 Tp Wareitive] [Galay tavehi Teiprosa q Me inoras 24 NB horas q at ose Ss tose 7S 3| [orm _] [orem = 8] |Bactios tof |sactios no 8] [porutndos’| |Eeporata é eetitoree Tota presente DIAGRAMA PARA COLTFORME TOTAL 1-16- - Se procede de esta forma sembrando de atras para adelante, siempre con Ja mioma pipeta de 1a mayor para 1a menor dilucién. = Incubar los tubos por 24+ 2 horas a 35°C, después de las 24 horas de incubacién examinar y retirar los tubos de C.L.S.T. positives, o sea aquellos que presentan formacién de gas en el tubo de Durham y anotar los resultados. Re~ incubar los tubos negatives por 24 horas mas. ~ Se procede a realizar 1a segunda lectura de 1a misma forma anterior, los tubos positives serén separados y anotados y los tubos negativos seran despre~ cdados. - A partir de la suma de los resultados obtenidos en la primera lectura (24 horas) y segunda lectura (48 horas) se calcula el NMP de Coliformes, por medio del Cuadro 3. ~ Si el objetivo del estudio exige la prueba confirmativa, todos los tubos positivos de le lectura (24 horas) y (48 horas) de 1a Prueba Presuntiva pasan @ la prueba confirmativa, inmediatamente después de las lecturas respectivas. Prueba confirmativa para coliforme total = Se utiliza como medio de cultivo caldo lactosado verde brillante bilis 2%. ~Marcar los tubos de caldo lactosado verde brillante bilis correspondien- tes respectivamente, a cada tubo positivo de caldo lauril triptosa de la prueba presuntiva. - Agitar bien cada tubo de C,L.T presuntivo positivo y con un asa de ni quel-cromo, previamente quenada y enfriada, extraer una azada del material e inocular en el tubo de caldo lactosado verde brillante bilis (C.L.V.B.B.) evitan— do tocar 1a pelfcula superficial que puede formarse en el caldo lauril triptosa. = Incubar todos los tubos de C.L.V.B, inoculados durante 24-48 horas a 35+ 0.5°C. ~ Proceder a 1a lectura luego de las 48 * 3 hs, considerando prueba posi- tiva confirmativa para coliforme total a todos los tubos que presentan formacién de gas en el tubo de Durham invertido. ~ Anotar los resultados y calcular el NMP a partir de los datos obtenidos, en la prueba confirmativa.eye Prueba _complementaria = Se utiliza si la finalidad del estudio es el exanen completo, proce~ diendo de 1a siguiente forma: - Se marca las placas de E.A.M., correspondiendo cada una a un tubo de caldo lactosado verde brillante bilis (C.L.V.B.B.). ~ Quenar y enfriar una asa de nfquel-cromo, cuya parte final esta forma~ da de un aro de 5 mm de didmetro. = Agitar e inclinar el tubo de C.L.B.B., sumergir el asa en el 1fquido del tubo y extraer una azada del material. ~ Senbrar el inéculo, esparciendo en 1a superficie del primer cuadrante de 1a placa petri conteniendo Agar E.A.M., y cuidando de no romper el agar, gi- rar la placa y continuar el esparcimiento en el segundo cuadrante a partir del (® @ PRINER CUADRANTE SEGUNDO CUADRANTE TERCER CUADRANTE inéculo del primer cuadrante. - Continuar de esta forma hasta completar el esparcimiento en toda la su- perficie del agar. ~ Cerrar e incubar 1a placa en posicién invertida durante 24+ 2 horas a 35 + 0.5°C, ~ Observar el desarrollo de colonias y realizar 1a lectura.luego de las 24 42 horas a 35 £0.5°C. ~ Las colonias positivas son as colonias tfpicas (son colonias rosado- oscuro, con nficleo central, con o sin brillo verde metflico), 0 las coloniasies at{picas (son colonias rosadas, mucoides, opacas, sin nidcleo). - Las colonias negativas son las transparentes. ~ Seleccionar tres colonias, escogiendo dos t{picas y una at{pica y sem brar cada una de ellas en un tubo de caldo lauril triptosa y un tubo de agar inclinado. ~ Incubar e1 caldo lauril triptosa durante 24-48 horas y el agar incli- nado durante 24 horas, ambos a 35 + 0.5°C. - Preparar una suspensién de cada cultivo de agar inclinado, correspon- diente a cada tubo de C.L.T. que haya revelado presencia de gas a partir de las colonias en E.A.M. Preparacién de la coloracién de Gram ~ Limpiar bien una lamina de vidrio, para librarla de cualquier traza de pelfcula oleosa. = Colocar una gota de agua destilada sobre 1a Lamina. = Con un asa de inoculacién colectar una pequefia cantidad del crecimiento bacteriano en la superficie del agar inclinado y suspenderla en la gota de agua. = Con la punta del asa de inoculacién esparcir sobre 1a 1émina de manera que forme una pelfcula bien delgada. ~ Fijar 1a suspensién pasando 1a 1émina tres veces sobre 1a llama. ~ Cubrir 1a suspensién fijada, con solucién de cristal violeta, durante un minuto. ~ Remover el exceso de cristal violeta de 1a lamina, lavéndola brevemente con agua corriente. = Cubrir con solucién de lugol durante un minuto. = Decolorar utilizando una solucién de alcohol-acetona (1:1). = Cubrir durante 15 segundos con solucién de safranina diluida. = Lavar la 1émina en agua corriente y secarla levemente, ~ Examinar las 1éminas con el microscopic usando objetivo de inmersién. Las bacterias coliformes son bacilos Gram-negativos, coloreados de rojo y pueden aparecer en pares o raramente en pequefias cadenas. = La formacién de gas en el tubo de caldo lauril triptosa provenientes de colonias de E.A.M. y la presencia de bacilos Gram-negativos no esporulados en-19- el cultivo de agar inclinado que le corresponde, es considerado ensayo completo, positive, para la presencia de bacterias del grupo Coliforme. (El esquema se encuentra en la Figura 2). 3.6 Resultado = El c&lculo de 1a densidad probable de bacterias colifornes totales en una muestra est basado en la combinacién de los resultados positives y nega~ tivos obtenidos en cada dilucién. = La densidad de coliforme total s¢ expresa como NMP de coliformes por ‘100 me. ~ E1 NYP se obtiene a través de tablas en las que se presentan el limite de confianza de 95% para cada valor de NMP determinado. (Cuadro 3). ~ Tres diluciones son necesarias para 1a obtencién del c6digo del NMP. Por ejemplo en la Tabla 3: si tenemos sembradas 3 porciones de 10 mt, 3 de 1 mi y 3 de 0.1 mg, resultando positives, 3 de 10 mt, 2 de 1 mt y ninguno de 0.1 mt. El cédigo resultante para 1a obtencién del NMP serf: 3-2 = Se localiza ene! cuadro 3 y el NMP seré 93 por 100 mt. = Aunque los eédigos presentados en el Cuadro 3 se refieren especifica- nente a la combinacién de resultados positivos obtenidos, cuando son inoculados yolfimenes de 10 mt, 1 mt y 0.1 mi de muestra, ésta puede ser usada para yolimenes mayores 0 menores de siembra. Ejemplo ‘Tres porciones de 0.01 més resultaron positivos; dos dé 0.001 mty ninguno de 0.0001 mz. El cédigo resultante ser 3-2-0 se localiza el valor en el Cuadro 3 y se obtiene en NMP ajustando las diluciones de acuerdo a la siguiente férmula (5): Valor en la Tabla de NMP _____10____ = nwp/100 me volunen de 1a dilucién inicial Reemplazando tendremos: 93 x 10_ = 93,000/100 me 0.01= 20 - Cuadro NMP Y LIMITES DE CONFIANZA DEL 95% ENTRE LOS CUALES PUEDE VARTAR PARA DIVERSAS COMBINACIONES DE RESULTADOS POSITIVOS OBTENIDOS GON TRES PORCIONES DE (Lom, Imt y 0. 1m2) COMBINACION Limite de confianza del 95% DE NP TUBOS POSITIVOS Tae aaedee Inferior Superior 0-0-0 <3 0-0-1 3 < 0.5 9 0-1-0 3 <0.5 3 0-2-0 eI 1-0-0 4 £0.5 20 1-0-1 7 1 21 1-1-0 7 1 23 leL-L u 3 36 1-2-0 aL 3 36 2-0-0 9 1 36 2-0-1 14 3 37 2-1-0 15, 3 4h 2-1-1 20 7 89 2-2-0 21 4 47 2-2-1 28 10 150 2-3-0 - 3-0-0 23 4 . 120 3-0-1 39 7 130 3-0-2 64 15, 380 3-1-0 43 7 210 31-1 75 iv 230 3-1-2 120 30 380 3-2-0 93 4s 380 32-1 150 30 440 3-2-2 210 35 470 3-3-0 240 36 1,300 3-3-1 460 7 2,400 3-3-2 1,100 150 4,800 3-3-3 3 2,400eae ~ Cuando més de tres diluciones decimales son inoculadas, se debe deter- ninar las tres diluciones significativas. Estas tres diluciones se pueden de~ terminar de acuerdo a las siguientes reglas (5): Ver Cuadro 4. ~ Como primer nimero del cédigo se seleccionara 1a mayor dilucién en la que todos los tubos resultaran positivos y las dos diluciones subsiguientes para completar el cédigo (Pruebas 1 y 2). (Cuadro 4). - Si menos de tres diluciones tienen resultados positivos, se seleccionaré Jas tres mayores diluciones que incluyen los tubos positivos para conpletar el. cOdigo. (Prueba 3). Cuadro No. 4 TABLA PARA SELECCION DEL CODIGO, SERIE DE TRES TUBOS — pruebas ‘Tubos positives /mé y volumen de muestra 10 10 | oa 0.01 0.001 0.0001 | #8 eo 1 Svadieeee o ° ° 0 3-2-0 2 3 | 2 L ° ° 3e2-1 3 L | o oO 0 aio | 4 3 2 1 L ° 3-2-2 ls 2 2 2 0 ° 3-2-0 is | 3 2 a 3343 leo 0 L 0 0 ‘0-1 9 | ee es 0 0 0-1-0 eae L-22- = Si resultaran tubos positivos en diluciones mayores que en aquellas se~ leccionadas para el cédigo, los resultados positives se desplezan hacia las di- luciones seleccionadas a fin de incrementar los tubos positivos en 1a altima dilucién seleccionada (Prueba 4). = Si resultaran tubos negativos en voliimenes mayores de muestra que los escogidos para el cédigo (2/3, 3/3, 2/3, 0/3) el primer ndmero del cédigo sera la de mayor dilucién en 1a cual todos los tubos resultaran positivos, con las guientes diluciones ms altas para completar el Cédigo (Prueba 5). ~ Si todos los tubos resultarun positives, seleccionar para el cddigo aquellas tres diluciones mayores (Prueba 6). ~ Si todos los tubos resultaran negatives, seleccionar para el cédigo aquellas tres diluciones menores (Prueba 7). ~ Si no reaultaran tubos positives en una dilucién intermedia, seleccionar para el cédigo 1a serie de menor dilucién con tubos positivos y otra de mayor di- lucién con tubos positives (Prueba 8). ~ Si solamente 1a dilucién intermedia resultara positiva, escoger para el cSdigo la serie de menor dilucién y otra de mayor dilucién para el cédigo (Prueba ». 3.7 Registro de datos En el registro de datos se deben considerar los siguientes aspectos: = Némero de muestra, punto de muestreo, fecha y hora de muestreo, fecha y hora de anélicis, temperatura del ania y aire. 7 - El Cuadro No, 5 es una hoja de registro de datos para 1a prueba de coli- forme total, prueba presuntiva y confirmativa. - Para cada muestra se va reportando los resultados de las pruebas presun- tiva 24 y 48 horas y prueba confirns!iva 24 y 48 horas. - Es conveniente indicar los medios de cultivo utilizades para cada prueba. - Los rangos de diluci6n a emplearse son de acuerdo al tipo de muestra ana- Lizada.REGISTRO DE DATOS PARA COLIYORME TOTAL N.¥.P. DETERMINACION DE COLIFORE METODO TUBOS MULTIPLES HOSA Ne DE PROYECTO ey ANALISTA Prueba Presuntiva: Caldo Lauril Triptosa (C.L.T-) Prucba confirmativa: Caldo lactosado verde brillante bilis 22 (CLVBB) Se oesecos asus gas IGssa eaniCa Goze am oraa RIE TCC ‘Mues-| Fechay [Fecha y| Punto fenperacur Prucha Presuntiva y Confirmativa 24-48 horas [vera] nore [hora | de To gp 2 [ow | ee ae | mves- |r L rus das NMP coli/100 at uesececfandtisi treo | *7*0]40 Fig x i BOT Ti0 i0 wna ba ob presun presunt. 7 confirm. ~_confire. preaune. ~ presunt. confiza. confirm. presuat. Db. presunt. fh. confire. confira. hy presunt. presunt. hy confice. ‘b. confire. ~ presunt. bh. presunt. confirm. - confirm.ae REFERENCIAS BIBLIOGRAFICAS AMERICAN PUBLIC HEALTH ASSOCIATION et al. Methods for the examination of water and wastewater. 15 ed. New York, APHA, 1981 CEPIS. Guia para 1a evaluacién de laboratorios bacteriolégicos de andlisis de aguas. Serie de Documentos Técnicos, N° 3. Edicién revisada. Lima, CEPIS, 1978 CETESB. Andlisis microbiolégicos de aguas. Normalizagdo tecnica saneamento ambiental, NT-08. Sao Paulo, 1978 CANADA CENTRE FOR INLAND WATERS. Methods for microbiology analysis of water, wastewater and sediments, Burlington, Ontario, 1976 ENVIRONMENTAL PROTECTION AGENCY, Cincinnati, Estados Unidos. Microbiolog- ical methods for monitoring the environment: Water and wastewater. Cincinnati, EPA, 1978 GELDREICH, Edwin E. Handbook for evaluating water bacteriological labora~ tories. Cincinnati, Municipal Environmental Research Laboratory, 1975. EPA~670/9-75-606 MARA, P.D, Bacteriology for sanitary engineers. London, Churchill Livingston, 1974