3.

- TECNOLOGIA EN EL DIAGNOSTICO MOLECULAR

3.1.- INTRODUCCIN
Pocas reas de la Biologa Molecular han permanecido inalteradas con la
aparicin de una serie de tcnicas englobadas dentro del trmino genrico de
tcnicas moleculares. El objetivo de este captulo consiste en realizar un
repaso por una seleccin de las distintas tcnicas empleadas en el diagnstico
molecular, incidiendo en su fundamento.
3.2.- EXTRACCIN DE LOS ACIDOS NUCLEICOS
Los cidos nucleicos son las dianas que vamos a emplear para realizar todos
nuestros ensayos y un primer paso en la mayoria de las tcnicas moleculares
es la obtencin de stos.
Los cidos nucleicos se pueden extraer de cualquier tipo de muestra, de hecho
se han empleado muestras tan insignificantes como clulas epiteliales de
saliva, pelos e incluso fsiles incluidos en ambar para buscar genes de
antiguos animales prehistricos u otros organismos ya extinguidos.
Aunque existen muchos mtodos de extraccin de cidos nucleicos y el
proceso se encuentra automatizado en muchos laboratorios, creemos
conveniente explicar el fundamento de la extraccin.
3.2.1.- Extraccin de ADN
Primeramente hablaremos de la extraccin de ADN. El mtodo clsico ms
conocido es la extraccin con fenol-cloroformo y consta de tres etapas
1. Lisis celular
2. Eliminacin de protenas
3. Precipitacin y limpieza del ADN
La etapa de lisis consiste en desestabilizar las estructuras que confinan el
citoplasma y liberar al medio su contenido. Para ello se emplean unos
tampones de extraccin que contienen los siguientes compuestos: detergentes
como el SDS o el Triton X100, que eliminaran membranas y lpidos; agentes
quelantes como el EDTA que elimina los cationes de la solucin,
desestabilizando las membranas celulares e inhibiendo las ADNasas (enzimas
que podran degradar el ADN libre lisndolo en pequeos fragmentos); sales
como el cloruro de sodio (NaCl) que forma una capa inica alrededor del ADN
protegindolo; un tampn como el Tris HCl que mantiene un pH de la solucin
estable y proteinasa K que degradar protenas y enzimas. La lisis se suele
realizar a temperaturas elevadas alrededor de 50C (nunca mayor de 80C, ya
que a esta temperatura comienza a degradarse el ADN) facilitando la ruptura
de lpidos de la membrana y por ende la liberacin de ADN de la estructura
celular.

Posteriormente se procede a la eliminacin de protenas que se realiza

mediante la adicin de una mezcla de fenol:cloroformo: alcohol isoamlico
(proporcin 50:49:1) y posterior centrifugacin, lo que provoca que el ADN
permanezca en el sobrenadante y en la interfase queden las protenas. El
fundamento es el siguiente: el fenol y el agua (solucin acuosa donde se
encuentra el ADN) no se pueden mezclar, por lo que el ADN que es muy polar
debido a su carga negativa, permanecer en la fase acuosa de la solucin,
mientras que las protenas (formadas por grandes cadenas cuyos componentes
elementales son aminocidos algunos polares y otros no) quedarn tras la
centrifugacin en la interfase y en la fase orgnica debido a su polaridad. Hay
que extraer el sobrenadante con cuidado para no arrastrar las protenas.
La precipitacin y limpieza del ADN se realiza aadiendo al sobrenadante
recuperado en el paso anterior una sal a alta concentracin (p.ej. acetato de
sodio, cloruro de sodio o acetato de amonio). Con la adicin de la sal, el ADN
que est cargado negativamente va a obtener una capa inica positiva que
facilitar su precipitacin. Posteriormente aadiremos alcohol en la solucin de
precipitacin para eliminar la concentracin residual de sales y promover la
precipitacin del cido nucleico, ya que el alcohol va a sustraerle las molculas
de agua al ADN y por tanto deshidratarlo Cuando se trata de muestras con baja
concentracin de cidos nucleicos, comnmente se utiliza isopropanol
(volumen a volumen). La precipitacin del ADN es casi inmediata en presencia
de la sal y el alcohol, sin embargo se recomienda incubar la muestra durante
varios minutos a -20C o -80C para acelerar el proceso de precipitacin.
Posteriormente, se centrifuga la muestra unos minutos para recuperar el
precipitado de ADN, lavndose el pellet obtenido varias veces con etanol al
70% para eliminar todas las sales que permanezcan en la solucin.
Posteriormente se vuelve a centrifugar, se elimina cuidadosamente el
sobrenadante con una pipeta y se deja secar para eliminar las trazas de
alcohol. El ADN as obtenido es rehidratado con agua bidestilada o tamponada
con tampn Tris.

Esquema de extraccin de ADN con el mtodo de fenol cloroformo

Actualmente existen muchos kits comerciales de extraccin de ADN donde el

proceso es simplificado fundamentalmente en el segundo y tercer paso de
eliminacin de protenas y precipitacin y limpieza. Con la ayuda de columnas
equipadas con una membrana de slice, es posible retener el ADN que se une
al slice, permitiendo el paso de molculas como protenas, lpidos y sales que
acompaan a la reaccin de lisis. Finalmente se lava con alcohol y posterior
elucin del contenido.

Esquema de extraccin de ADN con kit comercial que emplea columnas rellenas de slice

3.2.2.- Extraccin de ARN:

Existen muchos mtodos para la extraccin del ARN. Los protocolos ms
empleados son aquellos que incluyen agentes caotrpicos como isotiocianato
de guanidinio o fenol para el lisado celular. Estos compuestos inactivan
ARNasas (enzimas que degradan rpidamente el ARN), lo que resulta muy
favorable cuando se trabaja con muestras que poseen altos niveles de

ARNasas endgenas. Posteriormente se realiza una desproteinizacin con

cloroformo y una precipitacin diferencial con una sal (Cloruro de Ltio).
Actualmente ya existen diferentes empresas que ofrecen equipos automticos
para la extraccin de cidos nucleicos con un excelente rendimiento, evitando
errores de manipulacin; toxicidad de los reactivos empleados y permitiendo la
estandarizacin de la tcnica.

3.2.3.- Concentracin y calidad del cido nucleico obtenido

Tras la extraccin del cido nucleico de inters es conveniente evaluar la

concentracin y calidad del mismo. Una forma de evaluar si los cidos

nuclecos han sufrido roturas, consiste en realizar una electroforesis en gel de
agarosa (su fundamento lo veremos en un apartado posterior). Con una
electroforesis en gel de agarosa podemos conocer la calidad de la muestra. Si
el ADN no ha sufrido roturas veremos una nica banda de alto peso molecular.
Para el caso de muestras de ARN de buena calidad, la electroforesis mostrar
claramente los diferentes tipos ARNs.

Extraccin de ARN de distintas muestras donde podemos ver los distintos ARN que se
encuentran en la clula tras su electroforesis en gel de agarosa.

Otra medida de la calidad de los cidos nucleicos consiste en valorar la

absorbancia de la disolucin del cido nucleico obtenido tras la extraccin, en
un espectrofotmetro (instrumento que mide la densidad ptica de una
disolucin) a 260nm y 280nm. Un ADN puro tendr una relacin de
A260/A280 (Absorbancia a 260nm/Absorbancia a 280nm) entre 1,8 y 2.
Valores menores indican contaminacin con protenas mientras que valores
mayores se deben a contaminacin con sales.
Para calcular la concentracin del ADN se mide en un espectofotmetro su
absorbancia a 260nm. Se sabe empricamente que para el ADN una
absorbancia de 1 corresponde a una concentracin de 50ug/ml. Con esta
relacin puede calcularse la concentracin de ADN de nuestra muestra. Para el
caso del ARN una absorbancia de 1 corresponde una concentracin de
40ug/ml.

3.3.- LAS ENZIMAS

Existen muchas enzimas que intervienen decisivamente en distintos
procesos de la Biologa Molecular. Entre ellas podemos destacar:
Endonucleasas de restriccin: Son enzimas que hidrolizan los cidos
nucleicos rompiendo enlaces internucleotdicos del interior de la cadena. Las
endonucleasas de restriccin son enzimas producidas principalmente por
bacterias que hidrolizan enlaces fosfodiester del esqueleto de ADN de doble
hebra en secuencias especficas. Las endonucleasas de restriccin de tipo II
son las ms tiles en los mtodos de manipulacin del ADN debido a su
especificidad de secuencia absoluta (reconocen una secuencia concreta del
cido nucleico), tanto para la reaccin de unin como para la de ruptura.
Algunas, tras la rotura de la cadena pueden producir extremos cohesivos (esto
permitir al fragmento generado unirse a otro fragmento de distinta procedencia
que haya sido generado por la misma endonucleasa de restriccin) o extremos
romos.

Secuencias de reconocimiento y zona de corte de dos enzimas de restriccin

Las enzimas de restriccin se denominan con tres o cuatro letras que

corresponden a la primera letra del gnero del microorganismo de procedencia,
y a las dos o tres primeras letras de la especie del organismo de procedencia
(ejemplo: Sma: Serratia marcescens) . El nmero seala el orden cronolgico
de descubrimiento de esa enzima en esa estirpe.
Casi todas las secuencias nucleotdicas reconocidas por las
endonucleasas de restriccin poseen un eje de simetra impropio binario, esto
es, la lectura de la secuencia en ambas direcciones es la misma, lo que recibe
el nombre de palndromos. La rotura se produce en ambas hebras de ADN
siendo esta simtrica respecto al eje binario.

Polimerasas: Son enzimas capaces de sintetizar ADN o ARN in vitro. La

mayora de estas enzimas requieren un molde y sintetizan una molcula
complementaria al molde. Las polimerasas utilizadas con mayor frecuencia
son: ADN polimerasa I de E. coli, el fragmento de Klenow, transcriptasa inversa
(utiliza como molde ARN para convertirlo en ADN), la ADN polimerasa del
bacteriofago T7, ARN polimerasa de los bacteriofagos SP6, T7 y T3 y la Taq

polimerasa (enzima empleada en la reaccin en cadena de la polimerasa o

PCR). La mayora de las polimerasas necesitan un pequeo cebador o primer
complementario al ADN molde para iniciar la polimerizacin a partir de ese
punto. La transferasa terminal es una polimerasa que no requiere molde y que
aade nucletidos exclusivamente a los extremos de las cadenas
preexistentes. Todas ellas requieren Mg2+.
Hay una polimerasa especialmente interesante y de la que vamos estudiar sus
caractersticas en profundidad en el apartado correspondiente a la importante
reaccin en cadena de la polimerasa (PCR). Esta polimerasa se llama Taq
polimerasa y su mecanismo de actuacin es trascendental en la P.C.R.,
siendo clave en el impulso para el diagnstico en los ltimos aos.
Otras enzimas: Ligasas (une extremos de ADN protuberantes o romos),
Fosfatasas (eliminan el fosfato de la regin 5 de los cidos nucleicos,
Quinasas (incorporan fosfatos en el extremo 5 que han dejado las fosfatasas)
etc...

3.4.- LA CLONACION
Consiste en la obtencin de un gran nmero de fragmentos idnticos de
cido nucleico a partir de uno original. Para ello se asla primero el fragmento
de ADN que se quiere clonar (para este aislamiento podemos emplear las
endonucleasas de restriccin antes citadas que son capaces de reconocer y
cortar al ADN en zonas concretas que nos puedan interesar ), se liga a un
transportador o vector (plsmidos, fagos , csmidos etc..) mediante el empleo
de varias enzimas entre ellas las ligasas, posteriormente es introducido en el
interior normalmente de una bacteria (para ello se emplean mtodos qumicos
o impulsos elctricos que permiten la permeabilizacin de la membrana), y
finalmente se replica mediante cultivo. Una vez replicado considerablemente
se recupera junto con el vector correspondiente.

Introduccin en una bacteria para su cultivo

Cultivo

Esquema del proceso de clonacin

Posteriormente se le separa del vector generalmente con la misma enzima de

restriccin que hemos empleado para obtenerlo, obteniendo como resultado un
gran nmero de copias del fragmento de inters.

3.5.- LA ELECTROFORESIS
Es un mtodo que permite la separacin de molculas en base a su tamao.
Esta separacin se realiza en un gel, que es una malla compleja de molculas
polimricas. Los geles pueden ser de agarosa o poliacrilamida. La agarosa es
conveniente para separar fragmentos de cidos nucleicos en el rango desde
unos pocos cientos, hasta aproximadamente 20000 pb (pares de bases). La
poliacrilamida es preferible para la separacin de fragmentos ms pequeos de
cidos nucleicos y para separacin de protenas.
El peso molecular de los cidos nucleicos se mide con las siguientes unidades:

- ADN: en pares de bases o bp.

- ARN : en nucletidos o nt.
- Protenas: en Daltons o Da.
Existen muchos tipos de electroforesis:
-

SDS-PAGE: electroforesis en gel de poliacrilamida para identificar

protenas.
Electroforesis 2D o electroforesis bidimensional para separacin de
protenas con arreglo a su carga/masa.
Electroforesis en Geles de poliacrilamida para ADN desnaturalizado:
para analizar fragmentos de ADN < 100 pb.
Electroforesis en Geles de Agarosa: Separacin de ADN en base a su
tamao para fragmentos > 100 pb.
Electroforesis de campo pulsante para analizar grandes fragmentos
de ADN (mayores de 10 megabases).
Electroforesis capilar: Para separar mezclas complejas de pequeas
molculas de ADN (50-100 pb). Actualmente se ha ampliado este rango
y automatizado el proceso.

3.5.1.- ELECTROFORESIS EN GEL DE AGAROSA

El fundamento de esta separacin est basado en que las molculas de
cidos nucleicos estn cargadas negativamente (al pH y condiciones del
tampn en el que se encuentran), y al someterlas a un campo elctrico migran
hacia el polo positivo de este a travs del gel, a velocidades que dependen de
sus tamaos (una molcula pequea puede seguir su camino a travs del gel
ms fcilmente que una molcula grande). Las velocidades de migracin de las
molculas de cidos nucleicos, son inversamente proporcionales a los
logaritmos de sus pesos moleculares. La deteccin tras la migracin se realiza
fcilmente gracias al empleo de un colorante intercalante como el bromuro de
etidio (se intercala entre las bases de los cidos nucleicos) que contiene el
propio gel y el cido nucleico es visualizado al emitir luz visible cuando el gel
se ilumina con luz ultravioleta. Un factor a tener en cuenta para valorar la
migracin de los cidos nucleicos en un gel adems de su tamao es la
configuracin espacial que adopte la molcula.

REPRESENTACION DE UN GEL DE AGAROSA TRAS LA ELECTROFORESIS DE

MUESTRAS DE PCR.

En las carreras primera y ltima corren los marcadores de peso molecular, en la posicin 2 se
encuentra el control positivo, en la posicin 3 el control negativo, la posicin 4 y 5 son dos
muestras positivas y en las posiciones 6 y 7 son muestras negativas. El peso molecular de los
casos positivos oscilar alrededor de 2,5KB (KILOBASES) al compararlo con los marcadores
de peso molecular laterales.

FOTOGRAFIAS REALES DE GELES DE AGAROSA

PCR de Hepatitis C donde vemos marcador de pesos moleculares, en el pocillo 2 control negativo, en el
pocillo 3 control positivo y en el pocillo 4 PCR+ de muestra real de Hepatitis C

3.5.2.- ELECTROFORESIS EN GELES DE POLIACRILAMIDA

Son geles normalmente realizados en un soporte vertical constituyendo un
excelente medio para separaciones electroforticas. Los geles de
poliacrilamida se forman por copolimerizacin de la acrilamida y bis acrilamida.
La reaccin de polimerizacin es iniciada/catalizada por el compuesto qumico
TEMED (tetrametiletilendiamida) y por persulfato sdico. El radical persulfato
activa al TEMED, el cual a su vez activa al monmero de acrilamida para que
polimerice. Las cadenas de poliacrilamida son entrecruzadas al azar por la
bisacrilamida, formndose as una red de porosidad bastante uniforme, que
puede ser regulada variando las condiciones de la reaccin y las
concentraciones de los monmeros.
Existen distintas aplicaciones para la electroforesis en este tipo de soporte.
Generalmente se emplean para la separacin de protenas (SDS PAGE: de las
siglas polyacrylamide gel electroforesis en condiciones desnaturalizantes
causadas por el detergente SDS). Tambin son empleadas para la separacin
de pequeos fragmentos de ADN, generalmente fragmentos que han sido
generados tras corte con enzimas de restriccin.
Una aplicacin importante en la que se emplea el soporte de gel de acrilamida
es la tcnica de RFLP (Restriction Fragment Length Polymorphism). Su
fundamento est basado en el corte especfico del ADN de la muestra
problema con endonucleasas de restriccin y la separacin del producto
resultante mediante electroforesis en gel de poliacrilamida. Una aplicacin de
esta tcnica consistira en la deteccin de una mutacin puntual, por ejemplo
una base G que se convierte en T justo en un punto de corte de una enzima de
restriccin, lo que provoca que la enzima que antes reconoca la secuencia
diana especfica y proceda a su corte, ahora tras la mutacin, no la reconozca
y por tanto no la corte. Este cambio sera visualizado despus de su separacin
en una electroforesis. La tcnica RFLP se emplea como marcador para
identificar grupos particulares de personas con riesgo a contraer ciertas
enfermedades genticas, en medicina forense, en pruebas de paternidad y en
otros campos, ya que puede mostrar la relacin gentica entre individuos.

3.6.- LA HIBRIDACION
Es un proceso de unin de dos hebras complementarias de cidos
nucleicos pero cuyo origen es distinto. Una de ellas ser el cido nucleico diana
y la otra ser la sonda empleada para localizar ese cido nucleico diana a la
que se le ha unido una molcula reporter.

Esquema de hibridacin

El ADN est formado por una doble hlice de dos cadenas complementarias
unidas por puentes de hidrgeno. La unin entre ambas cadenas puede ser
rota (desnaturalizacin del ADN) por calor o por un incremento del pH,
constituyendo as cadenas de ADN monocatenario. A este fenmeno es
reversible, denominndose renaturalizacin, al proceso en el que las cadenas
anteriormente separadas se unen de nuevo al bajar la temperatura o al
restablecer el pH, segn sea el caso, volviendo a formarse los puentes de
hidrgeno entre ellas. Ahora bien, si tras la desnaturalizacin aadimos a la
muestra una sonda de ADN marcada, es decir, un fragmento de cadena simple
de ADN de secuencia complementaria a la de nuestro ADN diana y de origen
distinto, cuando se restablecen las condiciones de temperatura o de pH, la
sonda puede unirse a la cadena simple de ADN diana; siendo la seal del
marcador suficiente para su deteccin. Este proceso se define como
hibridacin.
Existe un captulo completo en este mdulo en el que se va a tratar en profundidad la
hibridacin y en particular la hibridacin in situ para muestras parafinadas. Ahora tan solo
vamos a desarrollar algunos conceptos generales de esta tcnica

3.6.1.- Las sondas

Una sonda es un fragmento monocatenario de ADN o ARN marcado con
una molcula reporter, y que se emplea para el reconocimiento especfico de
una molcula determinada de cido nucleico diana de cadena sencilla, en un
proceso de hibridacin.
Existen tres tipos de sonda de cidos nucleicos:
- Fragmentos de ADN
- Fragmentos de ARN

- Oligonucletidos sintticos u oligosondas (sintetizados artificialmente en

equipos automticos).

3.6.2.- Las molculas reporter

Son molculas qumicas unidas a la sonda y que van a permitir la deteccin de
esta tras un proceso de hibridacin. Existen molculas reporter de muchos
tipos: radiactivas (32P, 35S), de afinidad (Biotina, Digoxigenina...), enzimticas
(Fosfatasa, Peroxidasa ...) , quimioluminiscentes (steres de acridina), Plata
etc.

3.6.3.- Factores que afectan a la sensibilidad y especificidad de la

hibridacin
- Concentracin del cido nucleico diana
- Complementariedad sonda-cido nucleico diana
- Concentracin de la sonda.
- Longitud de la sonda
- Actividad especfica de la molcula reporter.
- Condiciones de hibridacin (pH, fuerza inica, temperatura de hibridacin, ...)
- Tm (temperatura de fusin, temperatura a la que el 50% de las hebras de
ADN estn desnaturalizadas )
- Capacidad de acceder al cido nucleico diana.
- Formato de hibridacin

3.6.4.- Formatos de hibridacin

- Hibridacin en solucin: La sonda y el cido nucleico diana se encuentran
en una solucin lquida. Las condiciones de hibridacin deben ser rigurosas. La
velocidad de formacin del duplex en estas condiciones es alta. El problema de
este tipo de hibridacin es la eliminacin de la sonda que no ha reaccionado,
emplendose entre otros mtodos la nucleasa S1-precipitacin con
tricloroactico o la hibridacin protection assay.
- Hibridacin en fase slida: El cido nucleico diana o bien la sonda se
encuentran inmovilizados en filtros. Estos pueden ser de nitrocelulosa (fijacin

por calor) o de nylon (fijacin por luz ultravioleta). Una vez realizada la fijacin
se aade la sonda marcada que buscar su secuencia complementaria en el
cido nucleico diana que queremos identificar. La sonda que no reacciona,
hbridos inestables o uniones inespecficas son eliminados mediante lavados.
Su sensibilidad es menor que la hibridacin en solucin. Tambin se ha
conseguido fijar los cidos nucleicos al plstico de las placas de microtitulacin.

Existe un tipo de hibridaciones en fase slida que son muy empleadas en

Biologa Molecular: los Southern blot : ADN cortado con enzimas de
restriccin, separado mediante electroforesis, transferido a un soporte slido
(nitrocelulosa o nylon) e hibridado con una sonda de ADN marcada con una
molcula reporter y Northern Blot : ARN separado e hibridado con sondas de
ADN o ARN marcadas con molculas reporter. Estas tcnicas consisten en
lneas generales en una separacin inicial de las molculas en base a su peso
molecular mediante electroforesis , trasferencia capilar de estas molculas a un
filtro de papel o de nylon, fijacin, hibridacin con la sonda de inters y
deteccin.

Resultado de un Southern Blot

Hibridacin in situ
Aunque este apartado ser tratado en extensin en un prximo captulo
diremos a modo de resumen que permite la deteccin de genes o expresin de
genes dentro del contexto morfolgico de la clula o tejido. Para conseguirlo se
requiere que el cido nucleico sea liberado de su entorno celular para tener

acceso la sonda, pero preservando la morfologa para la consiguiente

interpretacin y anlisis.. El empleo de proteasas, que facilitan el acceso de la
sonda al cido nucleico diana debe ser realizado cuidadosamente para no
provocar el desmantelamiento de la morfologa celular. Se recomienda el
empleo de oligosondas por su tamao que permite un mejor acceso al interior
de la clula.
Entre las tcnicas de hibridacin in situ encontramos el FISH (hibridacin in situ
fluorescente) entre cuyas molculas reporter podemos encontrar la
fluorescena o el rojo Texas, CISH (hibridacin in situ cromognica) y su
variante DUO-CISH (realizacin de dos hibridaciones simultneas y deteccin
con dos cromgenos de distinto color), SISH (emplea plata como cromgeno).