Desde hace mao iempa, lr humans cm secon lx herrameenasmecesriaspara bard ene mur un par mgr. Abt dende el amor, bt campsite y Lisa reco, bt rmanpulictin pnd no rar. ‘Gen Manwera, a woequa ox ta rmvzertte caste Hr De sie: be Sena sicas” remiiaré-un tema que ha ganado nta prominencia que seguramente en poco tiempo ser objeto de un Premio Nobel; por lo promo, acaba de ganar el Premio Principe de Asturias 2015 que cxorga Espatia (hutplllpaixcomnfelpais/2015/05/28 ciencia/1432807151_067613hirn)). Eterna al que ‘me efiero tiene un eriptico nombre derivado de sus corigenes bacterianos clustered regularly interpaced short palindromic repeat (repeticiones palindromicas ccortas agrupadas a intervalas regulares) o, simple- mente, CRISDR. Exe nombre se refiere a un locus del cromecoma bacteriano en donde residen unos (genes que extda ala altura del fuego de Prometea, pues con ellos se ha creado una poderosa herra~ imienta que permite manipular el Scido desoxirei- bomucleiza (ADN 0 DNA. por sussiglas en inglés) dle cualquier organiamo vivierte sobre nuestro plat eta. Fl nombre GRISPR identifica abora a una ‘técnica o herramienta con la que se logran cambios ‘pecifices en los genomas y que ha fancionado titomamente en diversos arganismas, incluyendo recientemente cigotas humano:”, El CRISPReuvo sus origenes en investigaciones de ciencia bdsics que tal ver a algunos lex hubjesen parecido ocio- ‘5s, occurate ireelevamtes. Al escudia ciertos genex CRISPR alojs lox engranajes de un sistema de de= fensa que, funcionalmente hablando, equivale ala “inmunidad adquirida” en animales Es decir, que Jes “sencillos” orgenismes procariontes tambien Se nen manera deinmunizarse” contra reinfecciones por bacterisfagas con los que ya habian estado en cantare. Esa defensa ex mediada par las genes del locus CRISPR, el cual extd compuesto par el precursor de un écide riborucleico (ARN o RNA, [por nus siglas en inglés) largo que es procemdo en sus componentes maduror funcionales, los ARN corto: llamados ceARN y tracrARN y por genex ssociados “Cas” (CRISPR-aszociated). ots ne tt gosta 2018‘Figura 1. squemadeun complejo ataral dal stoma Cusrs-casasobreunblanceda ADM marge se ‘motcee quo 3 poser dau solourahetra dal ADN a aparaacon a crn alco dolblancoocureonkas 2 babes fl areki, quero: rquariée para donbfcaral blanca, srwa pars nama albedo ARRON ‘exalatse act doe Caen comadade Hwang WY ata Nature Botach, 2012-77-01 Ellocus CRISPR funciona como un “archivo” de segmentos de ADN tomadas del genoma de los Fagor que previamente habian infectado la bacte- tig, Los genes aociadon (Cas) son fandarnentales cea 21 operacién pues genesan las proteins ine ceradas en Ia creacién del archivo. Sin embargo, Ia estrella del eeneo es la Cas9 (CRISPR-aociated 9), bs endomucleasa que destruye al ADN del bac- terigfaga reinfecrante, sunque ells por of sola sex incapar de actuar. La especificidad del sistema la proporcionan les crARN que reconocen, por ape reamiento de bases, a las secuencias mucleotidicas del ADN de un bacteridfago reinfecrante. Junto con el tracc ARN, cad erARN apareadossu ADN ‘Banco, forma un complejs oon la Cao) que corte alADN blanco, ‘La forma activa de la enclonucleasa Cas9, solo ‘existe cuando estén un complejo con el ADN, su GrARN yun tractARN, de ahi que no corts cera [ADDN de manera alestoria. El exquema de a figura 1, enfatica que los dides mucleicosde este commplejon FE wee enters sc hibeiden por complementariedad debases, lo cual ‘explice la especificidad del sitio decom. Este come ‘ccurre precizamenve dentro de las bases pareadac end hibride ADN-ARN yen la hebea complemen {aria al ADN apareado. De ahi que en cl complejo: activo, la endorucleses Car) (convomno zal en lax figuras 1 y2)-corta arabashebras del ADN blanco inbabilitando al fago reinfectante. Esta stuacién, aque ocurre en la naturalcza, ha sida simplificada y ‘adapeada para su wo en pricticamente cualquier ‘sdlula vivienic gracias al tabajo-de Jenaifer Doudna yy Emmanuelle Charpentier‘, ganadoras del premio Princess de Asruris. Ellar diseiaron y conjunta- ron ew un sale ARN, llamado agARN (angle guide RNA, o ARN guia), lr funciones delos cARN y tact ARN. EL gARN dirige ala Cas hacia su blanco, con lb misma precisa que lo harian lorerARN y tra~ cAARN de [a bacteris"®, Para obtener un agARN con expecificidadl contra un blanco genérnico (ADN) de clecciéa, simplemente hay que disefiatos con,Figura 2. Esquemas que fatran como un eam jo dal sate cru R-cae tmbion punde ox. mae sobre wn Bones de ABN faze te usando tun alo ARN, sl2gAeNn ARN gu, cus enum solo ARN combina las 2fncones al ry da ERAN Etedoscubrimientesimolficbelisa SS da CREPR,pueshece peable anuntar aun blanco, \genomico inroducende 158M complemarea- Hoyle Ca:9 eas mAAN,[Tomadas Huang WY, ‘ata Nature Bintach 2013-71227 9y Boudin A, chargontor£ Scance. 2014346077. complementariedad (vegi las reglas de Watson y (Crick) de bases (Figura 2). Al introdacirel gARN, y la Cas) al ndclea de un eucarionte donde resida SL ADN Blanco, este serd corado en ambas he- bras, generando un double xiranded break (DSB). Unislmente exte tipo de corter son reparadas, de jimprecist, por un sizema denaminado non omolognr eu-jomng (NEED) La tnberene flea de precision del NHEJ ocasiona que, durante la sepazacién, cf ADN sufra inserciones @ debeciones sdebases finde) alrededor del DBS. Deesta manera LDN blanco nufre musacianes que, dependiendo dde au naturalezs, ocasionaa ba pérdida de funcién del AD blanco, por ejemplo, por la pérdida del marco de traducciéin en tin exést codificante (ver ‘sjemplo en figura 3). (Generar sutaciones tipa indel sobre un gene (ADN blancs) expecifics puede msarse pars ma- dificar alguns exrructera 0 funcsén celular en par Matehing uk Une aurslanto animaston ds como CRISPE Cas ‘furcnns pusda encontrarse onl susonts enlace: hetpsrrwveyoutubs.com/watchey-25637E9E 08 ‘Seular, es decir para modificar el fenotipo de un organism. CRISPR-Cas ha demostrado funcionar de esta manera en todos los erganismas en qur hz sido probada, Un ejemplo "viejo", publicads en agne- to de 2013, dernuestraa simple vist la inactivacsén df gene de lz tirosinac en ef per cebra. Este gene codifies a una enzima de la via de sintesis de la smelanina, el pigmento quele da al embrién de estos peces su patrén de manchas earscteristico (Figura 4a), de abi queun pez carente de exe gene deberia ser albino. Ese experimento x hiso co-ingectando embrio- ses del pez cobra con un sgARLN complermensario al gene de tirosinas jamie con un mARN que se traduce en Ia proteina Gas Muchos de los em- (beiones inyectados resultaron con algiin grado de albinismo, en algunos de ellos casi completo, indi cando que ambosalelas del gene fueron inaetivados muy temprano durante la embeiogénesis (Figura Wess Nee nt agpe 2005Reference _ACTSGACAGCAGC GTTTEGACTEGASGACTECIGSGGASGIGCAGACTSGSGGAACTGCTS Reference ‘ACTGGACAGCAGCGTTTGGAGzagtotoctggagagacgagetgaagagctggaggaagaag +64 (-17, +81) 438 C4 +30) 33:3, 48) = 3 2 vel 25 (20, +2) 23 31 636, +) 7 pal Figura 2.38 secuenets mucins: lacey ce eo blanco de SgARN par tosis ured en el expet- ‘mento dela igua 4, muesran los astines bps de Inge serciones oelecones) obteniars La nea superior (reference) asi secuencis vesteyen sombresdo gs yor siesta a sacuenca Ge spareamianto con ‘GAR. Notes a orn vrledad de mutaclones afecian al gene saves, bases oas minoscula son las InseTSo- nes ylas deleconesse nan como gulones.{Tomacio de 0, eta PNAS. OT3:11BT3804-5. 48), Secuenciando genomas de diversos embriones sometidosa este tratamiento se obtuvo la confirma- séén de que este fenotipe se debid a la generacién de mutaciones alrededor del ADN blanco del ARN guia Figura 3). Este trabajo demostré la factibilidad de identi- ficar y de modificar un sitio preciso de un genoma mediante dl sistema CRISPR-Cas9. Considerando al gran tamaiio que los genomas suelen tener la fax cilidad con que se hizo, eto es un logro formidable. Si pensamos en que asi como se Ilew6 a.cabo con el pex.cebra, se puede hacer con cualquier organismo Viviente, empezamos a comprender el gran poder de CRISPR-Cas. Sin embargo, esto es solo es una de la muchas aplicaciones que los cientificos ya han encontrado para CRISPR. En la figura 5s iustran varias mo- dificaciones que se han hecho a la Cas9 para que, sin perder su capacidad de reconocer (junto con tun sgARN) una secuencia blanco de ADN, hagan ‘otras cosas sobre él. Porejemplo, introduciendo mu taciones de un solo aminodcido, se han inactivado sada uno de los 2 sitios actives endonuckeliticas de la enzima silvestre, dejando versiones de Cas9 que solo cortan una hebra del ADN (Figura Sa), ya sea In apareada al sgARN 0 Ia que queda libre. Estas (Cas9 que solo cortan una cadena se denominan, nickaseses decir que no rompen la doblehelice, solo leintroducen un nick (rompen un enlace fosfoids- tes) en una hebea. Su utilidad reside en que, usadas ‘en combinacién, pueden creat das ickren rlativa ccercania, pero en cadenas distintas (figura 5b). Esto redunda en mayor precision y especificidad dd sitio de corte, disminuyendo ls posibilidad de cortar regiones del ADN errinea.o aleatoriameete (comes fuera del blanco foff target). Ademas de esta gran venta. al usa dos nickasas se gencra un tipo de dafio enel ADN que puede ser reparado por recombinaciin homéloga, un sistema {que ex mucho més preciso que el NHEJ que repara los DSB, pcs usacl alelointacto como molde para lareparacién. Esto seha aprovechado pars inserear fragmentos de ADN exégenos en dl sitio reparado, ‘reando con elo versiones transpénicas del ADN blanco. Esta nueva manera de hacer organismos ‘transgénicos es macho mas Filly eficiente que las que se han utilizsdo durare afios y con téznieas anteriores. ‘Ahora imaginemos una Cas9 que tenga muta dos sus 2 sitios mucleoliticos, eta versidm estarla Smuerta® respecto a su capacidad para romper al [ADN, pero si se preserva su capacidad de nirse alFigura. Enbriones sl vesres dpe obra rec friars estado embvionaioda ura coils yectaon con \srmARN quecediia a Inendonucieaa Cs8y con un sgASA\expocicn paral esinaea bj ocon unegAf cor tl negav (al. La fotos uestonelaspecia qu eran alas AM horas de daarmllo. Notes, falta pigmonta- ‘Sen enlesambriones en quose mantel gana dol tasinasa (Tomada defo, et a PNAS 200371013500-9. sitio blanco (junto con el sgARN adecuads}, en- tonces se puede usar para “marcar* o ubicar may cespecificamenteun sitio del genoma, Siesta "Cas ‘muerta’ se fusiona con una proieina reguladora de la transeripesin ("efector” on la figura 5¢) 0 con ‘una protefna fluorescente (Figura 5d), entonces se cconvierte, espectivamente, en un inédito factor ‘ranscripcional para actvaro reprimirla expresién, dle genes especificos, 0 en un “fara” para ubicar [por microscopia al locus blanco en el interior del nico celular. Al logar a este punt espero haber comvencido, alllectar de que, peacia ala precisién del CRISPR- ‘Cas es postble implementarestratepias no solo para ‘mutar ADN, sino tambign para loprar otras mo- dificaciones tales como insertar © remawer frag- ‘mentos completos de ADIN en alelos especificos del genoma. Esto abre la puerta para que, en un. futuro muy cercano, sea posible singetizar genomas ‘con secuencias especifica, dstintas alas silvestes. Siestoselogra tendromos la posbilidad de reparar genes murantes casantes de enfermedades heredi- {arias que hoy son incurables. En ese caso, CRISPR representaria una verdadera “medicina molecular” ‘que haris posibles todas la promesas, husta ahora incumplidas, dela terapia pénica ‘Sin embargo, como cualquier oto fuego de Pra- rmeteo que la Cencia haya entregadoal ser humano, ‘no hay dudade que el poder cas “divino® del CRIS- [PR podria usarse con fines postivos 0 negatives ‘Existed riesgo fundado deque el CRISPR sea usa- cdo para hacer modificaciones que wayan mas alkicde la rerapia génica, en wn intento de hacer ingenieria genética con fines eugenésicos, Esto ha causada que ‘muchos ciontificos hayan alertadaal pablico sabre ‘este uso éticamente reprobable y hayan propues- to una moestonn dels splcarn del CRISPR en bumanas (http: hw. nytimes.com/2015/03/20/DNA leveling Figara 5. Graco dinictrs modificaores dels Cer3, es posbla war al stra CISPR pare aplicaciones fiitadas solopr i imaginacion, Larmitacion de aincidosaspocficar en Cars puodon inactive 02delosstios do ndonudeasce, sande Pickssa gus crt una ets Rehradel ADN ble (3) Una eon ambos as ‘nactdorsereuna encima que sinambargaze pusde us paredrgir elon genamican expecicerequladores ‘Narscipconalaco marca corscons ey ver txts) (omado de Hsu otal Col 235712078) ‘La decisiin de céimo usar esto portentoso des- cubrirmento es responsabilidad de Is humanidad. idealmente toda ella de una manera informaday éi- ‘2 Solo ecordembs, parafraseando a Maranto, que iso trata de constrair un mando y wna sociedad ‘major, los hurmanns desde hace anos tenemos yalos rmextios necesarios. “en donde el amcr, la compasién, BS ey kneteeeieahar sn genética tampoco tendrd éxito”, @ REFERENCIAS BIBLIOGRAFICAS Hex PD, Lander ES, Zhang F. Developement and Appl. cations of CRISPRLCH foe Genome Enginceing, Cll aoisise 1262-78 2. 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