Colorimetria y espectrofotometria COLORIMETRIA Muchos de los experimentos bioquimicos incluyen la medicién de un compuesto 0 un grupo de compuestos que hacen parte de una mezcla. Quizés la técnica mds usada para determinar la concentraci6n de dichos compuestos es la colorimetria. El fundamento de la técnica consiste en que si se pasa luz blanca a través de una solucién coloreada, algunas longitudes de onda se ab- sorben con preferencia sobre las otras (figura 4.1). Muchos compuestos no son coloreados, pero pueden absorber liz en la region visible si se someten a la accién de un reactivo apropiado. Estas reacciones son a menudo especificas y muy sensibles, hasta el punto de poder medir cantidades de material en con- centraciones de milimol por litro. La mayor ventaja consiste en que no es necesario el aislamiento del compuesto y que se pueden determinar los cons- tituyentes de una mezela compleja tal como sangre, sin que se requiera mucho tratamiento previo. Tal como se discute a continuacién, la intensidad del color es proporcional a la concentracién del compuesto que se mide, mien- tras que la cantidad de luz absorbida es proporcional ala intensidad del color y por lo tanto a la concentracién. Ley de Beer-Lambert Cuando se pasa un rayo de luz monocromatica de intensidad inicial Ip a través de una solucion en un recipiente transparente, parte de la luz es absorbida de manera que la intensidad de la luz transmitida I es menor que I. Ocurre alguna disminucién en la intensidad de la luz por dispersién de las particulas oreflexién en las interfases, pero principalmente por absorcién dela solucién (figura 4.2). La relacion entre Ie Ip depende de la longitud del medioColorimetria y espectrofotometria 95. Luz incidente _Luz absorbida por Luz emergente y por (blanca)—_la soluci6n coloreada consiguiente color de ‘roja) Ta solucién (verde) Amarillo Verde + Azul Figura 4.1. Por qué son coloreadas las soluciones absorbente, l, y de la concentraci6n de la solucién absorbente, c. Estos factores se hallan relacionados en la Ley de Lambert y Beer (figura 4.2). Ley de Lambert. Cuando un rayo de luz monocromatica pasa a través de un medio absorbente, su intensidad disminuye exponencialmente a medida que la longitud del medio absorbente aumenta. Ley de Lambert: f= /,e7*1! ) Ley de Beer. Cuando un rayo de luz monocromatica pasa a través de un medio absorbente, su intensidad disminuye exponencialmente a medida que la concentracién del medio absorbente aumenta. Ley de Beer Tete Estas dos leyes se combinan en la ley de Beer-Lambert: IeIpen beet Solucién absorbente, concentracion ¢ Rayo emergente Intensidad Rayo incidente Luz monocromatica Espesor de la golucién <—/—> Figura 4.2 Absorcién de la luz por una solucién96 Bloquimica practica El cociente de las intensidades se conoce como la transmitancia y se expresa como un porcentaje: kyl T= IIo = Sacando logaritmos: loge Jo/I = ks cl, log 0 Zo/f= 2.303 kg cl, log; 9 Io/I = kel. La expresién logy, Io/I se conoce como la extincién E, o absorbancia. La extincién se designa algunas veces como densidad éptica, pero este nombre no se recomienda actualmente. Por lo tanto, E=kel. Sise sigue la Ley de Beer-Lambert y | se mantiene constante, un gréfico de la extincién en funcién de la concentracién da una linea recta que pasa por el origen; en tanto que un grafico del porcentaje de transmitancia en funcién de la concentracién da una curva negativa exponencial (figura 4.3). Algunos colorimetros y espectrofotémetros tienen dos escalas, una lineal de porcentaje de transmitancia y otra logaritmica de extincién. Esta ultima escala es la que esté linealmente relacionada con la concentracién y se usaen .” vo q g 2 50 w 05 5 z a = 5 i coventain coneracn Figura 4.3 Relacién entre la absorcién de la luz y la concentracién de una solucién absorbenteColorimetria y espectrofotometria 97 las curvas patrones de concentracién (figura 4.4). Con la ayuda de tales curvas se puede determinar facilmente la concentracién de una muestra problema conociendo su extincién. Coeficiente molar de extincién. Siles1cmyces 1 mol/l, laabsorbancia sera igual al coeficiente molar de extincién k, el cual es caracteristico para un compuesto dado. El coeficiente molar de extincién k, es, por lo tanto, la extincién producida por 1 mol/l en un recorrido de luz de 1 cm y general- mente se escribe £}™0!/!; y se expresa en 1mol~! cm™!. : Coeficiente de extincién espectfica. No se puede conocer facilmente el peso molecular de algunos compuestos tales como proteinas y dcidos nucleicos presentes en una mezcla y en este caso se usa el coeficiente de extincién especifica. Este se define como la extincién de 10 g/1 (antes conocido como 1% p/v) del compuesto en un recorrido de luz de 1 em, £198, Limitaciones de la Ley de Beer-Lambert. Algunas veces no son lineales los grficos de la extincién en funcién de la concentracién y esto probablemente se debe a que no se cumple alguna de las siguientes condiciones 1. La luz debe ser preferiblemente monocromatica o la longitud de onda debe estar entre limites muy estrechos. 2. La longitud de onda de la luz empleada debe coincidir con el maximo de absorcién de la soluci6n. Esto permite también conseguir la sensibilidad éptima. : 3. No debe haber ionizacién, asociacién, disociacién 0 solvata¢ién del soluto con respecto a la concentracién o al tiempo. 4, La solucién es muy concentrada, originando un color muy intenso. La : ley sélo se cumple hasta cierto limite maximo de concentraci6n, carac- teristico para cada sustancia. Escala lineal del porcentaje de transmitancia 0.2 03 04 06 0810 80% logaritmica de ta extincién Figura 4.4 Relacion entre el porcentaje de transmitancia y la extincién98 — Bloquimica préctica Medicién de la extinclén Los primeros colorimetros se calibraban “a ojo” comparando el color de una solucién con los de una serie de discos coloreados. Los resultados obtenidos eran muy subjetivos y no muy exactos. Los colorimetros visuales s6lo tienen ahora un interés histérico y no se describen en este libro. La célula fotoeléctri- ca tiene la ventaja sobre el ojo humano de poder determinar el grado de absorcién de un color y de ser mucho més objetiva. El colorimetro fotoeléctrico. En la figura 4.5 se presenta un diagrama de las partes bdsicas de un colorimetro tipico. La luz blanca de una lémpara de tungsteno pasa a través de una rendija, luego a través de un lente condensa- dor, hasta obtener un rayo paralelo que incide sobre la solucién que se investiga, la cual se ha colocado en una celda de absorcién o cubeta. Lacubeta es generalmente de vidrio y las paredes a través de las cuales pasa el haz de luz son paralelas. En muchos casos, las cubetas tienen una base de 1 cm cuadrado y pueden contener facilmente 3 ml de liquido. Después de la cubeta se encuentra el filtro, el cual se selecciona para permitir la transmisi6n maxima del color no absorbido. Si se quiere exami- nar una solucién azul, entonces se absorbe el rojo y por lo tanto se selecciona un filtro rojo. El color del filtro es, pues, complementario a la solucion que se estudia (tabla 4.1). En algunos instrumentos el filtro se encuentra antes de la cubeta. El filtro produce bandas angostas de transmisién y, por Jo tanto, da luz aproximadamente monocromitica. Los filtros Ilford son los mas comunes y algunas de sus propiedades se dan en la tabla 4.2. Los filtros se seleccionan en forma tal que cumplan la Ley de Beer. Galvanémetro Célula de absorcién Apertura . de Fotocétula y VY ; Condensador Amplificador Lampara de Fittro ‘tungsteno : Figura 4.5 Diagrama de un fotocolorimetroColorimetria y espectrototometria 99 Tabla 4.1 Relacién entre el color de la solucién estudiada y el filtro escogido parael andlisis colorimétrico Color de la solucién —_Filtro rojo-naranja azul-azul verdoso azul rojo verde rojo purpura verde amarillo violeta A continuacién la luz Hega a una fotocélula que genera una corriente eléctrica en proporcién directa a la intensidad de la luz incidente. Esta sefial eléctrica pequefia se incrementa mediante un amplificador, y la sefial amplificada pasa a un galvanémetro calibrado en una escala logaritmica que da directamente medidas de absorbancia. Las fotocélulas usadas en colorime- tros no muy finos tienen una precision de aproximadamente 0.5%. Lasolucién blanco se coloca primero en el colorimetro y se ajusta el galvanémetro a una absorbancia de cero. Luego se coloca la muestra y se lee directamente la absorbancia. Un método mejor consiste en dividir el haz de luz en dos partes, una de las cuales pasa a través de la mezcla y otra a través del blanco; los circuitos se equilibran hasta que no se mueva la aguja del galvanémetro. La extincién esté dada por la lectura del potenciémetro cuando el circuito queda en equilibrio. Tabla 4.2 Transmisién maxima para filtros Ilford Numero del Transmisién filtro [ford Color maxima (nm) 600 ioleta intenso 420 601 violeta 430 602 azul 470 603 azul verdoso 490 604 verde 520 605 amarillo verdoso 550 606 amarillo 580 607 naranja 600 608 rojo 680 609 rojo fuerte 700 Con permiso de Ilford Ltd.100 Bloduimica practica ESPECTROFOTOMETRIA Analisis por medicién de la absorcién Un espectrofotémetro es un colorimetro més sofisticado en el cual la luz monocromatica se obtiene mediante una rejilla o prisma. La banda de longitudes de onda de la luz que pasa a través de un filtro es bastante ancha y por lo tanto, puede ser dificil distinguir entre dos compuestos que posean absorcién parecida usando un colorimetro. En estos casos se necesita un pectrofotémetro, ya’ que éste permite separar los dos picos de absorcién usando el monocromador. Algunos compuestos absorben fuertemente en la regién ultravioleta y su concentracién se puede determinar lo mismo que en el caso de los colorimetros usando un espectrofotémetro més amplio que pueda funcio- | nar hasta longitudes ‘de onda de 190 nm. Por ejemplo, la concentracién de Acido urico puede ser determinada midiendo la extincién de la solucién a 293 nm antes y después de habérsele tratado con un exceso de la enzima uricasa. El acido trrico es oxidado por la uricasa a pH 9 dando alantoina la cual : no absorbe a esta longitud de onda. La longitud de onda usada mas comunmente en la regién del ultravioleta es quizds 340 nm. A esta longitud de onda las formas reducidas de los nucleétidos de piridina, NADH, y NADPH, absorben fuertemente, mientras que las formas oxidadas de estas coenzimas no lo hacen, (figura 4.6). El NAD tiene la estructura tipica de los dinucleétidos: Reducido —___ Oxidado --- = Coeficiente de extincién molar x 10> Longitud de onda (nm) Figura 4.6 Espectro de absorcién de las formas reducidas y oxidadas de NAD y NADPColorimetria y espectrofotometria 101 HLH HOH eee ee cen. woz econ, 44, . HE“S*G—conn, __. HE~CSe—cONH, | 4, Hos cH HOCH HC\y-CH 1 I A a R Figura 4.7 Reduccién de la nicotinamida-adenina-dinucleétido Nicotinamida—ribosa—fosfato Adenina—ribosa—fosfato El NADP tiene la misma estructura, excepto que posee un fosfato en la posicién 2’ de la ribosa de la adenina. Los dos H reaccionan con la nicotinamida, pero al pH fisiolégico uno de los H se disocia tal como se muestra en la figura 4.7. La forma reducida tiene una estructura quinoide, y es la responsable de la absorcién a 340 nm. El progreso de una reaccién catalizada por enzimas que utilicen estas coenzimas, puede ser medido facilmente siguiendo la velocidad de aparicién o desaparicién del NADH, a partir de su extincién a 340 nm. El método es muy sensible ya que el coeficiente de extincién molar del NADH, a 340 nm es 6.3 x 10? mol-! cm-!, Esto significa que la conversién de un pmol de substrato/ml produce un cambio de 6.3 en la absorbancia. Por lo tanto es posible medir reacciones catalizadas por enzimas que involucran cambios de solo nanomo- les de substrato por minuto. Espectros de absorcién ‘Muchos compuestos tienen espectros caracteristicos de absorcién en laregin visible y ultravioleta y esto hace posible la identificacién de dichos materiales en una mezcla. Este punto se ilustra varias veces a través del texto. Proteinas. Los aminodcidos triptéfano y tirosina absorben a 280 nm, lo cual constituye el fundamento de una técnica muy sensible para determinar protefnas sin que se destruya la muestra. Las proteinas también absorben en el ultravioleta lejano, debido a los enlaces peptidicos. Acidos nucleicos. Los Acidos nucleicos y las bases que los componen presentan una absorcién maxima en la region de 260 nm. La magnitud de absorcién de estos cidos constituye una medida de su integridad, ya que los dcidos nucleicos parcialmente degradados absorben més fuertemente que los materiales nativos. Las bases que componen los Acidos poseen un espectro de absorcién suficientemente diferente, lo cual permite usarlo en su identifica- cién, Hemoglobinas. Cuando se modifican las hemoglobinas por medio de ciertas drogas o de monéxido de carbono, se presenta un cambio caracteristico en la102 Bloquimica préctica absorcién maxima, y por lo tanto la presencia de estos agentes modificantes puede ser detectada y medida. p-Nitrofenilfosfato. Es un substrato usado en la determinacién de fosfatasas Jas cuales catalizan la hidrélisis del compuesto para dar p-nitrofenol y fosfato inorgnico. En solucién alcalina el producto p-nitrofenol da un tipico color amarillo con una absorcién maxima a 405 nm. El substrato no absorbe en esta region permitiendo asi seguir el progreso de la reaccién en solucién alcalina Algunos consejos practicos. Los detalles de la operacién de un instrumento particular deben ser buscados en el manual de instrucciones; sin embargo, a continuacién se dan algunas reglas generales referentes al uso y cuidado de los colorimetros y espectrofotometros. 1. Limpieza de las cubetas. Las cubetas se lavan sumergiéndolas en acido nitrico 50% v/v y luego enjuagdndolas cuidadosamente en agua destilada. 2. Uso de las cubetas. Antes que todo, llene las cubetas con agua destilada y compérelas unas con otras para corregir cualquier pequefia dife- rencia en las propiedades épticas. Seque siempre con papel para limpiar lentes la parte externa de la cubeta antes de colocarla en la celdilla y no toque con la mano las dos paredes de la cubetaa través de las cuales pasa el rayo de luz. Cuando se hayan tomado todas las medidas, ldvelas con agua destilada y déjelas en posicién invertida hasta que se sequen. : 3. Absorcién de radiacién por las cubetas. Las cubetas de vidrio son mucho més baratas que las de silica y se usan cuando quiera que sea posible. Su limitacion principal esté en que el vidrio absorbe radiacién ultravioleta y no puede usarse por debajo de 360 nm; para estos casos se emplean cubetas de silica. Cubetas de vidrio: 360 — 800 nm. Cubetas de silic 200 — 800 nm. 4, Fuente de luz. Las lémparas de tungsteno producen un espectro amplio de energia radiante hasta de 360 nm. Para trabajar en la region ultravio- leta del espectro se usan lamparas de deuterio. Si se usa la lampara de tungsteno en el intervalo 360—400 nm, es necesario colocar un filtro azul en frente del haz de luz. 5, Fotocélulas. Una fotocélula azul recibe luz emitida hasta 625 nm y una fotocélula roja recibe luz por encima de esta longitud de onda. Las fotocélulas se exponen a la luz sdlo por el tiempo que sea necesario para tomar una lectura evitando asf la fatiga de las mismas. 6. Blancos, La extincién de una solucién se mide en contra de un blanco que contiene todas las sustancias usadas en la prueba, excepto el.com- puesto que se quiere medir. El blanco se coloca primero en el instru- mento y se ajusta luego la extincién a cero (100% de transmitancia)Colorimetria y espectrofotometria 103 antes de tomar las lecturas para la muestra. Alternativamente se puede leer la extincién en contra de agua destilada y a la absorbancia de la solucién problema se le resta la del blanco. . Duplicados. Es absolutamente esencial preparar en duplicado todas las soluciones blancos y patrones en forma tal que se pueda construir una curva patron exacta. Ademés, las muestras deben prepararse también en duplicado siempre que sea posible. x EXPERIMENTO 4.1 Curvas de absorbancia de dos colorantes Fundamento Los compuestos coloreados presentan espectros de absorcién caracteristica y la seleccién cuidadosa de las longitudes de onda maxima permite analizar los componentes de una mezcla de estas sustancias coloreadas. Materiales 100 1. Colorimetros con una serie de filtros diferentes. 50 2. Azul de bromofenol (10 mg/l). 11 3. Anaranjado de metilo (10 mg/l). 11 4. Mezcla problema de los dos colorantes. 11 Método Determine la extincién de cada colorante usando los diferentes filtros que vienen con el colorimetro. Recuerde que cada vez que se cambie el filtro es necesario graduar el instrumento en cero con agua destilada en la cubeta. Anote cuidadosamente la longitud de onda de transmisién maxima (absor- bancia minima) para cada filtro y haga un grafico de la absorbancia observada en funcién de la longitud de onda. iCuél es la longitud de onda que produce la absorbancia maxima para cada colorante? : aEn qué forma la mezcla de los dos colorantes afecta el espectro de absorcién? EXPERIMENTO 4.2 Demostracidn de la Ley de Beer Materiales 1. Los mismos del experimento 4.1. Método Prepare varias concentraciones de uno de los colorantes disponiendo una serie de tubos en la siguiente forma: Azul de bromofenol (10 mg/!) (ml) 1 2 3 4 5 Agua destilada (ml) ¢3 2770 Coloque el filtro que dio la m4xima extincién y gradie el colorimetro a cero con agua destilada. En seguida anote la extincién de cada solucion y haga104 Bloquimica préctica un gréfico de ésta en funcién de la concentracién del colorante en cada tubo (mg/l 0 ug/ml). 1. Repita el experimento anterior usando el filtro que dio la maxima absorbancia con anaranjado de metilo, haga lo mismo con otrofiltroy si es posible con luz blanca sin filtro. ;Qué tanto se ajustan ala ley de Beer las curvas de extincién en funcién de la concentracién? 2. Repita todo el éxperimento usando el colorante anaranjado de metilo. 3, Finalmente, use la informacién obtenida en estos experimentos para determinar la concentracién de cada colorante presente en la muestra. EXPERIMENTO 4.3 Determinacién colorimétrica de fosfato inorganico Fundamento A diferencia de los colorantes anteriores, la mayoria de los compuestos bioquimicos no tienen coloracién y pueden ser analizados colorimétrica- mente pero sélo después de someterlos a la accién de un reactivo quimico especifico que origine un producto coloreado. Este aspecto puede ilustrarse midiendo fésforo inorganico, que es, probablemente, una de las determina- ciones més usuales en los laboratorios de bioquimica. La curva patrén obte- nida seré empleada en experimentos posteriores. El fésforo inorganico reacciona con molibdato de amonio en soluci6n acida para formar dcido fosfomol{bdico. La adicién de un agente reductor reduce el molibdeno presente en el fosfomolibdato produciendo un color azul, sin afectar el Acido molibdico libre. En este método el agente reductor es el sulfato de p-metilaminofenol. La presencia de cobre en la solucién amortiguadora aumenta la velocidad de aparicién del color. Materiales 100 1. Molibdato de amonio (50 g/1). 11 2. Amortiguador de acetato de cobre pH 4.0 (Disuelva 21 2.5 g de sulfato de cobre (CuSO, -5H,0),y 46 g de acetato de sodio (CH,;COONa - 3H,0) en 1 litro de Acido acético 2 mol/l. Verifique el pH y ajustelo a 4.0 si es necesario.) . Agente reductor. (Disuelva 20 g de p-metilaminofenol 11 sulfato en una solucién de sulfito de sodio (Na,SO,. 7H,O) 100 g/l y complete hasta 1 ).Guardelo en un frasco oscuro hasta cuando se necesite. . Acido tricloroacético (TCA), (100 g/1). 250 ml . Solucién de fosfato que contenga 100 mg de 100 ml fésforo/100 ml. (Disuelva 438 mg de fosfato de potasio monobisico en agua y complete hasta 100 ml.) Guardela en el refrigerador. » oeColorimetria y espectrofotometria. 105 6. Solucién de trabajo de fosfato que contenga 1 mg 11 fésforo/100 ml. (Diluya la solucién anterior 1 a 100 con TCA 50 g/l). 7. Colorimetros. 50 Método En varios tubos de ensayo pipetee de 0.1 a 1 ml de la solucién patrén de fosfato y complete con agua hasta un volumen de 1 ml en los que sea necesario, ‘Agregue luego 3 ml de amortiguador de acetato de cobre, 0.5ml de molibdato de amonio y 0.5 ml del agente reductor. Mezcle vigorosamente después de cada adicién. Deje reposar por 10 minutos y lea la extincién a 880nm. Prepare un blanco en el cual se reemplaza el fosfato por 1 ml de TCA 50 g/l. Haga un gréfico de la extincién en funcién de la concentracién de fosfato. Cuando se mide la concentracién de fosfato en una solucién que contiene proteina, la muestra se mezcla con un volumen igual de TCA 20 g/l, luego se separa el precipitado por centrifugaci6n y se trata una alicuota del sobrena- dante en la forma como se indicé anteriormente. EXPERIMENTO 4.4 Validez de la Ley de Beer en la determinacién colorimé- trica de creatinina Fundamento La creatinina en presencia de Acido picrico y en soluci6n alcalina forma un tautémero rojo de picrato de creatinina. Materiales 100 1. Acido picrico (solucién acuosa saturada). 21 2. Hidréxido de sodio (1 mol/I). 11 3. Patrén de creatinina (2 g/l). 11 4. Colorimetros. 50 5. Matraces volumétricos (100 ml). 250 Método Prepare diferentes soluciones de creatinina diluyendo adecuadamente el patron y coloque 1 ml de cada solucién en un matraz aforado de 100 ml. ‘Agregue 1 ml de hidréxido de sodio 1 mol/l y 2 ml de solucin saturada de Acido pfcrico, mezcle vigorosamente y déje reposar durante 10 minutos. Complete con agua hasta la marca y mida la extincién a 530 nm. Haga un grafico de la extincién en funcién de la concentracién de creatinina. EXPERIMENTO 4.5 Espectro de absorcién del p-nitrofenol Materiales 10 1. p-nitrofenol (10 mmol/1). 50 ml 2. Acido clorhidrico (10 mmol/1). 1)106 —_Bloquimica préctica OH 9) = + Ht oD JN AN, oo “8 ° Ul i ooo Figura 4.8 Disociacién del p-nitrofenol 3. Hidréxido de sodio (10 mmol/1). a 4. Espectrofotémetros. 5 5. Matraces volumétricos (100 ml). 10 Método Diluya la solucién de p-nitrofenol 0.2—50 ml con (a) HCl 10 mmol/I y (b) NaOH 10 mmol/l. Determine el espectro de absorcién de cada solucién en el intervalo de 250 a 500 nm. Analice las diferencias entre los dos espectros y caleule el coeficiente de extincién molar a la longitud de onda que dé la absorcién maxima. EXPERIMENTO 4.6 Determinacién de los valores pK, del p-nitrofenol Fundamento El p-nitrofenol se disocia como se muestra arriba (figura 4.8). Como se anoté en el experimento anterior, la forma no disociada que esta presente en la solucién 4cida, no absorbe en la regién visible mientras que la estructura quinoide, presente en la solucién alcalina, absorbe fuertemente. El valor de pK es el pH al cual hay 50% de ionizacién, o, en otras palabras, el pH al cual se produce la mitad del valor de la absorbancia obtenida en solucién alcalina suponiendo que en Alcali se produce el 100% de ionizacién. Materiales 10 1. Los mismos del experimento anterior. . 2. Soluciones amortiguadoras 50 mmol/I. 11 de cada (a) Amortiguador de citrato (pH 3.0). solucién (b) Amortiguador de citrato (pH 4.0). amortiguadora (c) Amortiguador de citrato (pH 5.0).Colorimetria y espectrototometria 107 (d) Amortiguador de citrato (pH 6.0). (e) Tris-HCl (pH 7.0). (f) Tris-HCl (pH 7.5). (g) Tris-HCl (pH 8.0). (h) Tris-HCl (pH 9.0). (i) Carbonato-bicarbonato (pH 10.0). (j) Carbonato-bicarbonato (pH 11,0). Método Usando las soluciones amortiguadoras anteriores diluya 0.2 ml de p-nitrofenol hasta 50 ml y determine la extincién de cada solucién a la longitud de onda de 405 nm, en la cual el fenol no disociado no presenta absorcién. Determine los valores de pK ,. Titule 25 ml de p-nitrofenol 10 mmol/I con NaOH a un pH de 10.5. Corrija los valores obtenidos después de titular agua destilada y haga una curva de titulacién. Determine los valores de pk, y comparelos con los obtenidos anteriormente. EXPERIMENTO 4.7. Curva de progreso del p-nitrofenil fosfatasa Si se desea puede hacerse un tercer experimento con el fin de mostrar el uso de las propiedades de absorcién usando p-nitrofenol, para medir la actividad de la enzima fosfatasa alcalina. Detalles completos se dan en el experi- mento 9.2. EXPERIMENTO 48 Determinacién de barbituratos mediante el espectrofoté- metro ultravioleta pH 10.0 —— eH13.4 --—— Extincién 230 240 250 260 270 Longitud de onda (nm) Figura 4.9 Espectro de absorcién caracteristica de algunos barbituratos en solucién alcalina108 Bloquimica practica Fundamento Los barbituratos sustituidos en posiciones 5,5’ dan un espectro de absorcién caracteristico en la region ultravioleta con un maximo a 240 nm a pH 10. A pH 13.4 la absorbancia maxima se desplaza a 253 nm y se obtiene un minimo a 235 nm. Para detectar la presencia de barbituratos se hace el espectro de una solucién en el intervalo 220—270 nm a pH 10.0 y a pH 13.4 (figura 4.9). Las cur- vas presentan maximos y minimos y se cruzan a 227nm y 250 nm. Los puntos de cruce se llaman isosbésticos. Hay también una diferencia maxima en la absorcién a 260 nm la cual se usa para determinar la cantidad de barbiturato presente. La razén para la diferencia en el espectro de absorcién es que estos compuestos son Acidos dibasicos con valores pK de aproximadamente 8 y 12, asi que a pH 10 se encuentra tnicamente una forma ionizada y a pH 13.4 se encuentra la forma doblemente ionizada (figura 4.10). La deteccién y determinacién de barbituratos en sangre y orina es muy importante en aquellos casos en que se sospecha envenenamientoy el método puede usarse con sangre, plasma u orina. Los barbituratos presentes en los fluidos corporales se extraen primero en cloroformo y luego en dlcali. Una solucién ‘desconocida’ de fenobarbitona en plasma puedeser util para demostrar el método. Las concentraciones plasmaticas que sobrepasen los 100 mg/l son usualmente fatales y por tanto es conveniente que la muestra ‘desconocida’ contenga aproximadamente 10 a60 mg/l. Materiales 10 1. Cloroformo (grado analitico). 11 2. Amortiguador de fosfato de sodio o potasio (0.4 mol/l, 200 ml pH 7.4). 3. Hidréxido de sodio (50 mmol/l). 200 ml 4, Solucién de Acido bérico y cloruro potésico. (37.2 g 100 ml de Acido bérico y 45 g de cloruro de potasio en 1 1). 5. Patron de fenobarbitona (20 mg/l en NaOH 0.45 mol/l). 100 ml 6. Papel de filtro Whatman No. 31. 10 7. Embudos de separacién. 20 8, Espectrofotémetros. 5 9. Acido sulfarico (6 mol/1). 10 ml o oO i ul I I ae oS an ee om Yn =r = o7 Sno 07 Sw No 07 Sn No 8 H . No ionizadas lonizado una ver Doblemente ionizada Figura 4.10 Formas ionizadas de barbituratos substituidos en 5,5’Colorimetria y espectrofotometria 109. Método Extraccién. En un embudo de separaci6n coloque 5-10ml de fluidoy extraiga 3 veces con 30 ml de cloroformo. Combine los extractos y filtre a través de papel Whatman No. 31. Lave el filtro con un poco de cloroformo. Vuelva a colocar el extracto en un embudo de separacién limpio, lave dos veces con 5 ml de amortiguador de fosfato y deséchelo. Agregue 10 ml de hidr6xido de sodio 0.45 mol/l y agite fuertemente durante 1—2 minutos. Deje que se separen las fases y centrifugue la capa acuosa. Determinacién del barbiturato 1. A 2 ml de hidréxido de sodio 0.45 mol/1 agregue 2 ml de la capa acuosa y haga un grafico del espectro desde 220 hasta 270 nm, contra un blanco de hidréxido de sodio 0.45 mol/1 (pH 13.4). A2 ml de la solucién de Acido borico, agregue 2 ml de la capa acuosa. Mida esta muestra contra un blanco de 2 ml de hidréxido de sodio 0.45 mol/ly 2 ml de Acido bérico (pH 10.0). Célculos 1. La extincién de la muestra es igual a la de la solucién a pH 13.4 menos la de la solucién a pH 10.0 medidas a 260 nm. La solucién patrén de fenobarbitona se trata lo mismo que la capa acuosa obtenida después de extraer con cloroformoy la eztincién del patrén a 260nm se calcula en forma semejante a la de la muestra. Concentracién de barbiturato en el fluido (mg/1) _extincién de la muestra “~~ extincién del patrén Deteccién del barbiturato 2. Registre el espectro a pH 10.0 tal como se indicé anteriormente y luego afiada 4 gotas de H,SO, 6 mol/l a la muestra y a las cubetas blanco. Registre el espectro de nuevo, pero esta vez a pH 2. Explique las diferencias observadas y sugiera cudles de las formas ionizadas se encuentran probablemente presentes a pH 2. Trate la solucién patron de fenobarbitona en la misma forma y calcule la concentracién de barbiturato usando la diferencia de extincién en las dos soluciones a 240 nm. ;Cudl de los dos métodos es mas sensible? EXPERIMENTO 4.9 Experimentos con hemoglobina Fundamento : Cuando la hemoglobina se combina con oxigeno, hay un desplazamientoen el espectro de absorcién y el color de la sangre varia de oscuro a rojo brillante; un cambio opuesto sucede cuando la sangre se desoxigena y esto explica la diferencia de color entre la sangre venosa y la arterial. Tanto en la hemoglobina como en la oxihemoglobina el hierro se halla presente en la forma ferrosa y no es oxidado cuando se oxigena. Siel hierro ferroso se oxidaa110 Bloquimica préctica férrico por medio de un agente oxidante tal como el ferricianuro, entonces se forma metahemoglobina y la molécula no se puede combinar luego con oxi- geno o monéxido de carbono. Normalmente la sangre humana contiene solo aproximadamente 1% de metahemoglobina, pero esta puede aumentarse después de ingerir ciertas drogas. La hemoglobina se combina con el mon6xido de carbono aproximada- mente 200 veces mas facilmente que con el oxigeno formando carboxihemo- globina; la cantidad de hemoglobina disponible para el transporte de oxigeno se reduce por lo tanto y si hay suficiente CO presente se produce la muerte por falta de oxigeno en lds tejidos. El espectro de absorcién de la carboxihemo- globina es solo ligeramente diferente al de la hemoglobina, pero la diferencia es lo suficientemente grande para permitir la deteccién del compuesto en sangre y esto puede tener implicaciones médico-legales en casos de muerte por envenenamiento producido por el gas de carbén. Si se agita la sangre al aire, se forma la oxihemoglobina, perosi se le agrega el reactivo de Stokes, se remueve el oxigeno completamente y se forma hemoglobina. Derivado de Absorcién hemoglobina maxima (nm) hemoglobina | oxihemoglobina 577 541 413 carboxihemoglobina 570535418 metahemoglobina 630 © 500-406 Materiales - 10 1. Espectrofotémetros ultravioleta. 5 2. Reactivo de Stokes. (Sulfato ferroso 20 g/1 y acido 50 ml tartdrico 30 g/l: inmediatamente antes de usarse agregue amoniaco hasta disolver un ligero precipitado que se forma al comienzo. Esta es una solucién de ferrotartrato de amonio, un agente reductor). 3. Ferricianuro de potasio (100 g/l). 50 ml 4, Hemoglobina preparada a partir de glébulos rojos 50 ml humanos hemolizados. 5. Cloruro de sodio (0.15 mol/1). 200 ml 6. Espectroscopio de visién directa. = 7. Fuente de monéxido de carbono. 1 Método Prepare una solucién de hemoglobina en soluci6n salina a una concentracién de aproximadamente 1 mg/ml y trace el espectro de absorcién en el interval 400-700 nm.Colorimetria y espectrofotometria. 111 Haga elespectro de absorcin después de tratar la solucién de hemoglobina como sigue: 1. A 4 ml de solucién de hemoglobina, agregue dos gotas de reactivo de Stokes preparado recientemente. 2, Pase mondxido de carbono a través de la solucién de hemoglobina (nose haga al descubierto en el laboratorio) y selle la parte superior de la cubeta. 3. Repita (2) después de agreger dos gotas del reactivo de Stokes. 4. A 4 ml de hemoglobina agregue dos gotas de ferricianuro potésico 100 g/l. 5. Repita (4) pero agregue el reactivo de Stokes después del ferricianuro, Ademés, examine el espectro visible de las soluciones mencionadas anteriormente usando un espectroscopio de vision directa. Bibliografia Florkin, M. y Stotz, E., Comprehensive Biochemistry, Vol. 3, Methods for the Study of Molecules, Amsterdam, Elsevier, 1962 James, A. y Prichard, M., Practical Physical Chemistry, 3a ed. Londres, Longmans, 1975 Van Holde, K. E., Physical Biochemistry, Englewood Cliffs, N. J., Prentice- Hall, 1971.