ESPECTROSCOPA 2D DE CORRELACIN

HETERONUCLEAR
Jos Adrian Gavn Sazatornil
Instituto Universitario de Bio-Orgnica IUBO Antonio Gonzlez
Departamento Qumica Orgnica, Universidad de La Laguna
Avda. Astrofsico F. Sanchez 2, 38296 La Laguna (Tenerife),
jgavin@ull.es

1. INTRODUCCION
Debido a la mayor dispersin en sus desplazamientos qumicos, los espectros de 13C y
N presentan en general una mejor dispersin que los correspondientes espectros de 1H. Este
hecho puede ser explotado a travs de la realizacin de experimentos 2D de correlacin
heteronuclear. Aunque en este captulo estudiaremos fundamentalmente la espectroscopia 2D
heteronuclear 1H-13C, podramos hacerla extensiva a correlaciones 1H-15N, 31P-13C y otros.
15

Existe una amplia variedad de mtodos, como los basados en eco de espn o en
transferencia de polarizacin, que permiten editar un espectro 1D del espn heteronuclear X, y
que suministran informacin sobre el nmero de H unidos al heterotomo (INEPT, DEPT).
Sin embargo estos mtodos no aportan evidencias directas, por ejemplo, de qu protones estn
unidos a cada carbono en una molcula.
El problema de la asignacin ha sido simplificado de manera importante gracias a la
espectroscopia de correlacin heteronuclear 2D, en la cual las dos coordenadas de cada
resonancia son los desplazamientos qumicos de un protn y del carbono enlazado
directamente a l (o a 2,3 enlaces).
Histricamente los primeros experimentos de correlacin heteronuclear que se
desarrollaron fueron los llamados de deteccin directa del heterotomo [1-4] y fue slo a
principios de los 80 cuando se empezaron a realizar los llamados de deteccin inversa [5-8]
que van a constituir el objeto de esta leccin.

156

Jos A. Gavin

2. SENSIBILIDAD
Como indicamos ms arriba, los mtodos originales para determinar las correlaciones
heteronucleares, estaban basados en la observacin del ncleo X ( ms pequea), mientras el
1
H era detectado indirectamente y apareca en la dimensin f1 del experimento 2D. Esta
aproximacin fue adoptada porque, las secuencias originales 2D eran derivadas de
experimentos anteriores, del tipo de transferencia de polarizacin, como el INEPT, que haban
sido diseados a su vez para aumentar la sensibilidad en la observacin de los ncleos de
ms baja. Adems, los primeros instrumentos de RMN de pulsos fueron diseados con este
modelo. Durante los ltimos aos, la aproximacin a la recogida de datos ha cambiado en el
sentido de que el ncleo de mayor valor de , frecuentemente 1H, es el observado, mientras X
es detectado indirectamente. Es lo que se conoce con el nombre de experimentos de
deteccin inversa. La motivacin de este cambio ha sido el aumento de sensibilidad
asociado a l.
La dependencia de la fuerza de una seal con su relacin giromagntica, , es bien
conocida y el concepto de transferencia de polarizacin fue introducido como un medio de
aumentar la sensibilidad. La expresin formal siguiente, para la relacin S/N de un
experimento 1D que implica ncleos con espn =1/2, cuantifica este hecho.
S/N N A T-1 B 0 3/2 exc obs 3/2 T*2 (ns)1/2
N es el nmero de molculas en el volumen de muestra analizada, A es un trmino que
representa la abundancia de los espines activos en RMN presentes en el experimento, T es la
temperatura, B0 es el campo magntico esttico, exc y obs representan las relaciones
giromagnticas de los espines inicialmente excitados y observados, respectivamente, T*2 es el
tiempo de relajacin transversal efectivo y ns el nmero total de escanes acumulados. De una
manera aproximada y para un experimento concreto: S/N exc obs 3/2
Cuando elegimos cmo llevar a cabo un experimento de correlacin heteronuclear,
podemos contemplar las siguientes opciones, ver figura 1, teniendo en cuenta cul sea el
ncleo excitado y cul el observado.
1

Sensibilidad relativa

t1
t2

H-31P

H-13C

H-15N

a)

b)

2.5

10

t1

t2

t2

c)

30

d)

10

32

300

t1
t2

H
X

Tradicional

t1

Inverso

Figura 1. Esquemas generales para la obtencin de espectros 2D de correlacin heteronuclear

P= preparacin E= evolucin M= mezcla D= deteccin

Espectroscopa 2D de correlacin heteronuclear

157

El esquema 1b representa la aproximacin adoptada en los experimentos tradicionales

de correlacin (deteccin directa), en los cuales la magnetizacin inicial de protn es
marcada con su frecuencia durante t1 y luego es transferida a X para su deteccin. El
esquema 1d representa la aproximacin moderna (deteccin inversa) en la cual el ncleo de
protn es usado como origen y como detectado. Claramente se observa que la
sensibilidad predicha es bastante ms grande que la del mtodo tradicional, y la dependencia
con la relacin giromagntica del ncleo de menor , ha sido completamente eliminada,
aunque la abundancia natural de dicho ncleo sigue siendo un factor importante en dicha
opcin (trmino A de la ecuacin anterior). Cuanto ms bajo es el valor de de X, mayor es la
ganancia obtenida con la deteccin de 1H. Ganancias adicionales con un factor de 2 3
pueden ser anticipadas para grupos CH2 o CH3 respectivamente.
Los aumentos de sensibilidad mostrados para los mtodos inversos frente a los
directos, pueden no ser alcanzados en la prctica cuando se consideran los detalles de cada
secuencia en particular. Sin embargo, y teniendo en cuenta que una ganancia por un factor de
4 en un experimento de correlacin 1H-13C corresponde a una ganancia en tiempo por un
factor de 16, experimentos que necesitaban 1 noche con deteccin directa de X, pueden
realizarse en alrededor de 1 hora con deteccin de 1H . Tales consideraciones han conducido a
la adopcin casi generalizada de experimentos de deteccin inversa de protn siempre que sea
posible.
La eleccin de esta aproximacin ha tenido consecuencias en el diseo de los equipos
de RMN. Las sondas convencionales eran construidas para optimizar la sensibilidad en la
observacin del ncleo de ms baja, lo que implicaba colocar la bobina de dicho ncleo ms
cerca de la muestra y colocar la bobina de protn ms alejada. Las sondas de deteccin
inversa presentan la disposicin opuesta proporcionando un mayor factor de llenado. Sin
embargo, incluso con sondas convencionales, podemos realizar experimentos con deteccin
de 1H, aunque no con una sensibilidad ptima, pero siempre mayor que la que corresponde a
los experimentos de deteccin de X.
3. ESPECTROSCOPIA DE DETECCION INVERSA. CORRELACIONES A UN
ENLACE
Hay dos tcnicas de amplio uso que proporcionan correlaciones heteronucleares a un
enlace y que son conocidas coloquialmente como HMQC y HSQC. Los datos de correlacin
proporcionados por los dos mtodos son esencialmente equivalentes y para la espectroscopia
de rutina son poco relevantes. Debido a esto, los dos aparecen con una frecuencia parecida en
la literatura qumica. A nivel prctico, el experimento HMQC tiende a ser ms robusto con
respecto a imperfecciones experimentales o a fallos de calibracin, mientras que el HSQC
tiene caractersticas ms favorables para trabajos en los que se requiere una alta resolucin y
es ms flexible con respecto a modificaciones de la secuencia, lo que ha extendido su uso en
los laboratorios qumicos. Las dos tcnicas emplean la aproximacin de establecer las
correlaciones va deteccin de 1H como se indica en la figura 1d. Sin embargo, esta
aproximacin plantea una serie de dificultades tcnicas relacionadas con la supresin de las
seales principales correspondientes a los protones unidos a heterotomos de I 1/2 como 12C
y 14N. Estas seales son las dominantes en un espectro de protn 1D pero constituyen una
fuente de interferencias en las correlaciones heteronucleares, ya que slo los satlites de baja
intensidad pueden dar origen a dichas correlaciones, esto es, 1H-13C y 1H-15N en nuestro caso.
La necesaria supresin es actualmente realizada con gran efectividad mediante la aplicacin

158

Jos A. Gavin

de gradientes de campo magntico (PFG), que tienen un impacto enorme en particular en la

espectroscopia de correlacin heteronuclear.
3.1. Correlacin heteronuclear mltiple cuntica (HMQC)
El experimento HMQC en uno de los ms utilizados en los experimentos de correlacin
heteronuclear a un enlace con deteccin de protn. Aunque fue sugerido hace muchos aos
[6,8], su uso no se hizo extensivo hasta que se present un esquema [9] que resolva las
dificultades tcnicas asociadas a la observacin de protn. Desde entonces, y en particular
desde la llegada de los gradientes [10], la tcnica de la deteccin inversa ha pasado a dominar
la espectroscopia RMN orgnica.
3.1.1. La secuencia HMQC
La secuencia bsica HMQC es bastante sencilla y slo consta de 4 pulsos de
radiofrecuencia, rf, que aparecen representados en la figura 2. La secuencia comienza con la
excitacin del protn seguida de la evolucin de su magnetizacin bajo la influencia del
acoplamiento 1JCH. Durante un perodo , de aproximadamente 3.3 ms, se desarrolla una
magnetizacin en antifase de 1H con respecto a 1JCH. Como en el caso del INEPT, esta
magnetizacin en antifase puede ser transferida al carbono unido a l gracias a la accin de un
pulso de 13C cuyo objetivo es adems el de generar coherencia mltiple-cuntica protncarbono (de aqu el nombre del experimento).
X

H
X

t1

X
+1
1

H p=

0
-1

+1

p= 0

Desacoplar

Esta coherencia es una

mezcla de magnetizacin
transversal de los espines
acoplados, en este caso un
protn y el carbono
directamente unido a l,
que
evoluciona
coherentemente pero que
no puede ser observada
directamente.
Si
uno
quisiera
comenzar
a
recoger datos en ese
instante no aparecera
seal, siempre que fuera
igual a 1/2 JCH.

-1

Figura 2. Secuencia HMQC y camino de transferencia de coherencia (CTC) asociado. El perodo =1/2JCH
provoca el desfase y reenfoque posterior del acoplamiento heteronuclear.

Esta coherencia es, de hecho, una combinacin de coherencias de orden cero y orden
dos, como aparece representado en la ruta de transferencia de coherencia de la figura 2. As,
por ejemplo, 1Hp = +1 y 13Cp = +1 corresponde a una coherencia de orden dos (p=2),
mientras que 1Hp = +1 y 13Cp = -1 es una coherencia de orden cero (p=0). El punto
importante en este estadio es cmo evoluciona la coherencia durante el perodo t1. Ya que
contiene trminos de magnetizacin transversal de los dos ncleos, evolucionar bajo la
influencia de los desplazamientos qumicos de ambos (aunque un rasgo importante de la

Espectroscopa 2D de correlacin heteronuclear

159

coherencia mltiple cuntica es que no evoluciona bajo el acoplamiento activo, de tal forma
que no lo consideraremos en este punto). Lo que se requiere es que la frecuencia est
marcada solamente con el desplazamiento de 13C, ya que esto es lo que se quiere
caracterizar en la dimensin indirecta f1. Para eliminar el efecto del desplazamiento de protn
durante t1, se incorpora un eco de espn colocando una impulsin de 180 de 1H en el centro
de t1. De esta forma al final del perodo de evolucin los desplazamientos de 1H son
reenfocados y por tanto no tienen influencia en f1. La evolucin de los del 13C no se ve
afectada por dicha impulsin de 1H con lo que se mantiene el marcaje reseado. La
impulsin final de 13C convierte la coherencia mltiple-cuntica en magnetizacin observable
simple cuanto de protn que aparece de nuevo en antifase respecto a 1JCH. Cuando detectamos
la FID del protn es aconsejable aplicar un desacoplamiento de los espines de 13C para
eliminar la estructura fina del doblete de 1JCH, aumentando de esa forma la relacin
seal/ruido. Para evitar la cancelacin de los satlites de protn en antifase, se inserta un 2
perodo para reenfocar el acoplamiento 1H-13C, despus de lo cual se detecta la seal de 1H.
La deteccin convencional en cuadratura en f1 es implementada incrementando la fase de la
impulsin de 13C anterior a t1, de acuerdo con los mtodos States o TPPI para obtener un
espectro sensible a la fase. El resultado es un espectro bidimensional con los de protn
representado en f2, los de 13C en f1 y los picos cruzados indicando las conectividades a un
enlace. Aunque la secuencia HMQC (y HSQC) detecta nominalmente las correlaciones a un
enlace, en circunstancias excepcionales algunas de estas puede desaparecer y aparecer las
correlaciones a mayor distancia. Esto ocurre cuando la J implicada en ese caso est lejos del
valor asumido cuando se calcula , una situacin probable en alquinos donde las J a uno y dos
enlaces son inusualmente grandes. Un acoplamiento a dos enlaces (>50Hz) puede ser
suficiente para producir un pico de correlacin, y hay que tener cuidado para no confundirlo
con una correlacin a un enlace.
3.1.2. Influencia del acoplamiento homonuclear de protn
Como se indica ms arriba, evolucionar con su desplazamiento qumico durante el
perodo que sigue al primer pulso. Sin embargo, se produce el reenfoque durante el segundo
perodo debido a la presencia de un eco de espn, lo que evita la aparicin de errores de fase
en la dimensin f2. Ms importante es la evolucin de la magnetizacin de protn en los dos
perodos sealados y de la coherencia mltiple cuntica heteronuclear durante t1, bajo la
influencia del acoplamiento H, H. Ya que dichos acoplamientos no son reenfocados por el eco
de espn, evolucionarn durante ambos perodos y potencialmente contribuirn a la presencia
de errores de fase no deseados en la dimensin protn. Sin embargo, es fijado de acuerdo
con 1JCH que es al menos un orden de magnitud mayor que JHH, de tal forma que en la prctica
el grado de evolucin debido al acoplamiento H, H es muy pequeo. En otras palabras es
demasiado pequea para que pueda producirse una evolucin significativa y los errores de
fase que puedan originarse son de poca importancia (como veremos ms adelante, no ocurre
lo mismo en los experimentos de correlacin heteronuclear a larga distancia, HMBC, donde
los valores de las constantes de acoplamiento 3JCH y 3JHH son parecidas). Por el contrario, la
coherencia mltiple cuntica evoluciona durante t1 bajo el acoplamiento pasivo JHH que no
es reenfocado lo que hace que la resonancia final de carbono se ve ensanchada por el
acoplamiento protn-protn a lo largo de f1. Esto puede parecer raro, pero es una
consecuencia del hecho que durante t1 evolucionan las coherencias de 1H y 13C; el eco de
espn elimina la evolucin con el desplazamiento qumico pero no con J. De hecho, debido a
la baja resolucin digital utilizada en la dimensin 13C, estos acoplamientos de protn
raramente se resuelven, pero contribuyen a un ensanchamiento no deseado de la resonancia a

160

Jos A. Gavin

lo largo de f1. Estos acoplamientos homonucleares no aparecen en la dimensin f1 del HSQC

siendo este rasgo la principal diferencia entre ambos experimentos.
3.1.3. Utilizacin del formalismo del operador producto
El primer pulso de 1H crea magnetizacin transversal de 1H, -Iy, como en la ecuacin
(1). Durante el perodo se crea magnetizacin en antifase 2IxSz. Ya que = 1/2JCH el
trmino coseno se anula y el seno se hace igual a 1. El trmino 2 hace referencia a la
existencia de un sistema acoplado (1) y puede ser suprimido para simplificar la
representacin. El primer pulso de 90 de 13C transforma la magnetizacin en antifase en
magnetizacin de orden dos, IxSy, como en la ecuacin (2). Durante el perodo t1 este
trmino evoluciona con el desplazamiento qumico de 13C como en (3). El de protn y la JHH
tambin evolucionan durante t1. El primero es eliminado por el pulso de 180. Adems dicho
pulso intercambia los trminos doble cuanta y cero cuanta.
El ltimo pulso de 13C transforma la magnetizacin de orden dos en magnetizacin de
orden uno en antifase. El perodo siguiente =1/21JCH es insertado para reenfocar el
acoplamiento 1H-13C (4). Durante la adquisicin, y puesto que el desacoplador est
encendido, dicha magnetizacin evoluciona con el del protn, dando lugar a una seal
modulada por s durante t1 y por I durante t2.
Ix
JIzSz
Iz 90

-Iy
2IxSz (1)
90 Sx
IxSz
-IxSy
(2)
st1Sz
-IxSy -IxSy cos s t1 + IxSx sen s t1 (3)
Sx
-IxSy cos s t1 + IxSx sen s t1 90

-IxSz cos s t1 + IxSx sen s t1

JIzSz
-Iy cos s t1 (4)

3.1.4. Eliminacin de las seales de 1H-12C y 1H-14N

Cuando se registra la FID del HMQC, todos los protones inducirn seal en el receptor
en cada escan y las seales no deseadas, que son las mayoritarias, deben ser eliminadas con
un ciclado de fase adecuado si queremos observar los picos de correlacin (con excepcin del
caso en el que se usan los gradientes para realizar tal seleccin). Invirtiendo el primer pulso de
13
C en escanes alternos, la fase de los satlites de 13C es tambin invertida, mientras que la de
los protones enlazados a 12C no vara. La inversin simultnea de la fase del receptor
conducir a la cancelacin de las seales no deseadas con la correspondiente suma de los
satlites deseados. Este proceso en dos etapas es el ciclado de fase fundamental del HMQC.
Secuencia BIRD-HMQC
En el caso de los espectrmetros de RMN que carecen de unidad de gradientes, es
posible tambin eliminar las seales antes citadas. En dichos casos se utiliza un esquema
alternativo para conseguir dichos fines. La secuencia BIRD (bilinear rotation decoupling)
permite la eliminacin de las seales 1H-12C antes de la aplicacin de la secuencia HMQC,
mediante un ingenioso esquema de presaturacin [11]. Adems, el desacoplamiento durante la
adquisicin de los ncleos de 13C con la tcnica GARP mejora la relacin S/N (figura 3).

Espectroscopa 2D de correlacin heteronuclear

161

H
X

t1

X
Figura 3. Secuencia HMQC precedida del bloque BIRD

Desacoplar

El perodo del
bloque BIRD tiene
que ser optimizado
(minimizando
la
FID obtenida) y
suele
ser
de
alrededor de 1s.

= 1/2JCH

Seleccin mediante la utilizacin de gradientes

La aproximacin ms reciente y adems la ms efectiva consiste en la incorporacin
de gradientes de campo magntico (PFG) en las secuencias correspondientes [10,12]. Con un
slo escan es posible obtener fcilmente relaciones de atenuacin de 1000:1. Esto implica la
supresin de las seales 1H-12C 1H-14N.
X
X
El ciclado de fases no es esencial ya

que la seleccin de la seal se

1
H
obtiene gracias al reenfoque de sta
X
X
mediante el uso de gradientes. La
t
secuencia con gradientes opera
Desacoplar
X
empleando
una
combinacin
G
G
G
adecuada de gradientes que reenfoca
Gz
slo aquellas respuestas que han
seguido el camino de transferencia
+1
de coherencia (CTC) deseado. El
1
H p= 0
esquema de la figura 4 es deseable
-1
para la obtencin de un espectro en
modo absoluto ya que selecciona
+1
nicamente un CTC de 13C durante t1
X p= 0
(preferentemente el eco o tipo-N), y
-1
por tanto proporciona deteccin en
Figura 4. Secuencia del experimento HMQC, con
cuadratura en f1 directamente.
gradientes, en modo absoluto
1

Para seleccionar esta ruta, la fase total inducida por los gradientes debe ser igual a
cero:
G1 (H + C) + G2 (- H + C) + G3 (-H) = 0
Teniendo en cuenta que la relacin (H / C) = 4 la ecuacin anterior queda
simplificada a: G1 x (5) + G2 x (-3) + G3 x (-4) = 0
Existen toda una serie de relaciones de gradientes que satisfacen esta expresin y
conducen a la seleccin de la seal deseada 2:2:1, 5:3:4, 3:5:0.

162

Jos A. Gavin

La eleccin ptima, en presencia de varias imperfecciones experimentales, ha sido

considerada en detalle [13] y los autores recomiendan el uso de gradientes en la proporcin
3:5:0 (slo dos gradientes). Esta aproximacin en valor absoluto, requiere un procesado en
magnitud lo que lo convierte en experimento estndar para la obtencin de espectros de rutina
cuando la resolucin y la sensibilidad no son crticas.
Para obtener un espectro sensible a la fase, es necesario conservar los dos caminos N y
P de X durante t1. Esto es imposible con un slo escan si se aplican gradientes durante t1, ya
que no hay ninguna combinacin de gradientes que pueda reenfocar simultneamente seales
de los dos caminos +1 y 1. Hay dos aproximaciones bsicas para superar esta limitacin que
consiste en evitar el uso de gradientes durante t1 [14,15] permitiendo usar los mtodos
convencionales de deteccin en cuadratura SHR o TPPI, o recoger las seales de tipo-P y N
en escanes alternativos, combinando esto con el mtodo de procesado eco-antieco [16-18].
X
X
Para obtener espectros en fase

pura es necesario reenfocar la

1
H
evolucin con el desplazamiento
X
X
X
X
qumico de X durante la
t

aplicacin de los gradientes. Para

Desacoplar
X
ello se adicionan dos ecos de
G
G
G
espn enmarcando el perodo t1.
P
La
seleccin de los dos caminos
Gz
N
se realiza invirtiendo el signo del
+1
ltimo gradiente y por ejemplo,
1
H p= 0
la seal de tipo-N es reenfocada
-1
con 2:2:-1 y la de tipo-P con
2:2:1.
1

+1

p= 0

P
Figura 5. Secuencia HMQC, con gradientes, sensible a la
fase, va el mtodo eco-antieco
-1

3.2. Correlacin heteronuclear simple cuanto HSQC

El experimento de correlacin heteronuclear HSQC [7] sigue el esquema general del
HMQC pero se diferencia de ste en que durante t1 slo hay evolucin de magnetizacin
trasversal de orden uno de X, en lugar de la coherencia mltiple-cuntica 1H-X. Esta
magnetizacin heteronuclear trasversal es generada por transferencia de polarizacin desde el
protn unido al carbono va INEPT, como sucede en la secuencia 1D. La magnetizacin del
ncleo X evoluciona durante t1, mientras que el pulso de 180 de protn reenfoca la evolucin
con el acoplamiento 1H-X lo que hace que slo haya evolucin del desplazamiento qumico
de X durante t1. Despus del perodo de evolucin variable t1 la magnetizacin transversal de
13
C es transferida de nuevo al protn va un bloque retroINEPT, lo que produce
magnetizacin de protn en fase que puede ser detectada en presencia de un desacoplamiento
de carbono.

Espectroscopa 2D de correlacin heteronuclear

X
1

/2

/2

/2

163

/2

H
X

t1

X
Desacoplar

+1
1

H p=

0
-1

+1

p= 0
-1

Figura 6. Experimento HSQC y CTC asociado. El perodo

/2 =1/41JCH

El ciclado de fase bsico en dos

etapas es anlogo al del HMQC
que requiere inversin del
primer pulso de 90 de X con
inversin
simultnea
del
receptor. El resultado final es la
aparicin
de
correlaciones
protn-carbono como las del
HMQC.
Los
picos
de
correlacin no contienen sin
embargo la evolucin del
acoplamiento homonuclear H-H
a lo largo de t1. Estos resultados
aumentan la resolucin en la
dimensin f1 que es la principal
ventaja del HSQC sobre el
HMQC en molculas pequeas.

En general y en este tipo de molculas no suele haber problemas de poca dispersin en

las seales de 13C y cualquiera de las dos aproximaciones es buena. La principal desventaja
del HSQC frente al HMQC es el mayor nmero de pulsos que utiliza, especialmente pulsos de
180 del heterotomo, lo que provoca prdidas de intensidad debido a inhomogeneidades en
rf, mala calibracin de los pulsos o excitacin off-resonance. Esto tiene mayor importancia
para 13C que para 15N debido a la mayor frecuencia de trabajo, as como cuando se trabaja con
equipos de alto campo (500 MHz ms), en cuyo caso es aconsejable el uso de pulsos
compuestos o adiabticos del heterotomo.
3.2.1. Utilizacin del formalismo del operador producto
La secuencia consiste en una transferencia de polarizacin INEPT desde el protn al
heterotomo, un perodo t1 con un pulso de 180 de protn en el centro y una transferencia
tipo retroINEPT desde X al protn. El primer bloque INEPT genera magnetizacin en antifase
de X con respecto a 1H, IzSy, como se indica en (1). Durante t1 hay una evolucin con el
desplazamiento qumico de X. El pulso de 180 de protn en el centro de t1 reenfoca la
evolucin con el acoplamiento 1JCH y por simplicidad no aparece en la ecuacin (2). El ltimo
pulso de 90 de X junto al de protn transfiere la magnetizacin al protn en antifase, IySz,
como en (3). Durante el perodo posterior de reenfoque dicha magnetizacin se convierte en
magnetizacin en fase detectable (4)
Es esencial que el primer y segundo pulso de 1H estn desfasados 90. El espectro
puede ser obtenido en modo sensible a la fase usando SHR o TPPI; las rutas de transferencia
de coherencia no deseadas son eliminadas aplicando un ciclado de fase adecuado, gradientes
PFG como veremos ms adelante o una combinacin de ambos.
Ix
JIzSz
Iz 90

-Iy
-Iy cos J + IxSz sen J
= 1/2J cos = 0 sen = 1
90 Iy
90 Sx
IxSz

IzSy (1)
st1Sz
IzSy IzSy cos s t1 IzSx sen s t1 (2)
Ix
Sx
90

90

-IySz cos s t1 + IySx sen s t1 (3)

JIzSz
-IySz cos s t1

-IySz cos s t1 cos J + Ix cos s t1 sen J (4)

164

Jos A. Gavin

para = 1/2J cos = 0 y sen = 1, por lo que se obtiene Ix cos s t1

3.2.2. Eliminacin de las seales 1H-12C Y 1H-14N
Una lgica similar a la empleada en el HMQC hay que aplicar a la secuencia HSQC de
la cual existe una variedad de aproximaciones [12]. En la figura 7 se muestra la secuencia que
emplea el mtodo eco-antieco y que requiere slo dos gradientes en proporcin de las
relaciones giromagnticas de H y X ya que acta sobre una magnetizacin simple cuanto.
X
1

/2

/2

/2

/2

H
X

t1

Desacoplar

G1

G2
N
P

Gz
+1
1

H p=

0
-1

+1

p= 0

-1

Figura 7. Secuencia HSQC sensible a la fase, usando el

mtodo eco-antieco

Para
un
experimento
de
correlacin 1H-13C se utilizan
relaciones 4:1 y 4:-1 que
seleccionarn las coherencias
tipo N y P en escanes alternos.
De nuevo el primer gradiente se
aplica dentro de un eco de espn
para reenfocar la evolucin con
el desplazamiento qumico de X
durante la duracin del gradiente,
mientras que el segundo puede
ser aplicado durante el perodo de
reenfoque del retroINEPT. La
capacidad
para
suprimir
completamente las seales 1H12
C o 1H-14N produce espectros
con supresin casi total del ruido
t1

3.3. Variantes de la secuencia HSQC: PEP-HSQC (SE-HSQC), CT-HSQC

Secuencia PEP-HSQC Ciertos experimentos pueden ser realizados usando la
metodologa conocida como de conservacin de los caminos equivalentes (preservation of
equivalent pathways, PEP, o sensitivity enhancement, SE) que conduce a espectros con
aumento de sensibilidad PEP-HSQC [19-21]. La seal originada est modulada en fase y con
un aumento de sensibilidad de 2 en la relacin S/N con respecto al caso de la modulacin de
amplitud. La figura 8 muestra dicha secuencia.
X

H
X

t1

Figura 8. Secuencia PEP-HSQC

1 = JCH

X
Desacoplar

2 = JCH (1/8 JCH)

Comienza con un experimento HSQC convencional, con una etapa INEPT que crea
coherencia en antifase y que est marcada con la frecuencia de X durante t1 (1). Si registramos

Espectroscopa 2D de correlacin heteronuclear

165

un HSQC con el modo SHR o TPPI, se adquiere alternativamente una seal modulada por un
seno o coseno en la dimensin t1. La finalidad de la secuencia es asegurar que ambos tipos de
modulacin sean observados simultneamente. Requerimos por tanto una ruta de
transferencia de coherencia que convierta IzSy e IzSx en los observables Ix y/o Iy. El primer
retroINEPT aplicado despus de t1 produce lo siguiente (2). La finalidad de la alternancia en
la fase del primer pulso de X del retroINEPT es clara. Normalmente detectaramos la seal de
Ix (2). Sin embargo, en el experimento PEP-HSQC aparcamos esta seal como Iz, y
convertimos el trmino IySx en coherencia en antifase, que es reenfocada posteriormente.
Finalmente colocamos la seal Iz en el plano transversal mediante el pulso de 90 de protn
del 2 retroINEPT (3).
Ix
JIzSz
Iy
Sx
st1Sz
Iz
90

90

90

IzSy
IzSy cos s t1 +
IzSx sen s t1 (1)
Ix
mx
JIzSz
IzSy
90

90
S
m IySz
Ix
(2)
90 Ix
90 S m x
JIzSz
IySx IySz
IzSx
90 Iy
Sy
JIzSz
Ix
Ix
90

Iz
m Iz 90

m Iy
(3)
90 Iy
90 Sy
JIzSz
90 Ix
IySx

-IySz Ix
Ix

La coherencia presente al comienzo de la deteccin es: m Iy cos s t1 + Ix sen s t1

Las dos seales obtenidas + Iy cos s t1 + Ix sen s t1 y -Iy cos s t1 + Ix sen s t1
estn moduladas en fase. Sin embargo la adicin y sustraccin de ambas: 2 Ix sen s t1 y
2 Iy cos s t1 respectivamente, estn moduladas en amplitud, lo que permite obtener espectros
sensibles a la fase. Con el ciclado de la fase del pulso X despus de t1, controlamos la
adquisicin de datos tipo-N o P. Hay que recordar que necesitamos ambos para tener un
espectro sensible a la fase. La ganancia de sensibilidad terica 2 no es, en general, alcanzada
en la prctica. Hay ms pulsos de radiofrecuencia que en un experimento convencional
HSQC, lo que provoca prdida de seal debido a la inhomogeneidad de dichos pulsos, y
adems los perodos extras que aparecen en la secuencia generan prdidas por relajacin
transversal de la seal. A pesar de esto, el efecto neto es un aumento de sensibilidad
importante.
Para un sistema de dos espines IS, los perodos 1 y 2 son fijados a 1/4 JCH. Para un
sistema I2S, si colocamos esos mismos valores, perdemos la coherencia IySx, ya que es
convertida cuantitativamente en coherencia en antifase debido al acoplamiento del otro espn
I:
JIzSz
IySx
IySx
JSzI ' z
IySx
IyIzSy
Podemos acortar 2 para retener algo de IySx, pero entonces hay que tener en cuenta
que las dos ramas, que conducen a Iy e Ix, deben ser compensadas lo que significa que
debemos hacer sen 2 J 2 = cos 2 J 2 y por tanto 2=1/8 J. Sin embargo, la sensibilidad
obtenida en este caso no se ve aumentada por un factor de 2, sino de 2 , que corresponde a
un aumento mximo de 19%.
La secuencia PEP-HSQC puede ser combinada con la utilizacin de gradientes [22],
que realizan la seleccin de las seales tipo P o N, y que se sitan al final de t1 y justo antes

166

Jos A. Gavin

de la adquisicin. Este experimento presenta un incremento de sensibilidad de 2 en el caso

de grupos CH [23,24] y algo menor para los CH2 y CH3 [25,26].
Experimento
Eco-antieco
Ciclado de fase
PEP

IS
0.707
1
1.414
1.20
1.06
Tabla 1. Incrementos tericos obtenidos en
multiplicidad de los carbonos

I2S
I3S
1
1.414
2.12
2
3
1.414
2.12
1/2J
2
2.54
1/4J
1.92
2.65
1/6J
una serie de experimentos HSQC con gradientes, en funcin de la

Secuencia HSQC a tiempo constante (CT-HSQC)

Eco de espn X

No evolucin X
Evolucin JXX
No evolucin JHX
Evolucin JHH

Eco de espn H

Evolucin X
Evolucin JXX
No evolucin JXH
Evolucin JHH

Figura 9. Secuencia CT-HSQC

Evolucin X durante t1 Evolucin JXX 2T=cte no modulacin f1

La realizacin de experimentos HSQC con molculas marcadas, por ejemplo 13C, hace
aparecer el acoplamiento C, C en la dimensin f1 lo que va en detrimento de la sensibilidad
del experimento. La modificacin conocida como CT-HSQC [27,29], introduce el perodo
variable t1 dentro de otro fijo, 2T. Este hecho elimina la evolucin con el acoplamiento C, C
mientras que mantiene la evolucin con el desplazamiento qumico de 13C.
3.4. Experimentos hbridos
Los espectros de correlacin HMQC o HSQC pueden ser mejorados si los
combinamos con otras secuencias que alteran sus caractersticas o mejoran la informacin
obtenida. Los ejemplos citados a continuacin son slo una muestra de dichas posibilidades.
3.4.1. Experimentos con editado de la multiplicidad
Si exceptuamos la habilidad para identificar grupos de CH2 diasterotpicos, los
experimentos de correlacin heteronuclear descritos hasta aqu no aportan evidencias directas
sobre la multiplicidad de los grupos CHn que dan origen a cada correlacin. Existen en la
actualidad varios mtodos que permiten dicho editado dentro del propio experimento de
correlacin. Esto proporciona una informacin aadida en el espectro y requiere menos
tiempo que los experimentos 1D de editado convencional (por ejemplo DEPT). Este hecho es
particularmente importante en el caso de muestras con pequea cantidad, donde la realizacin
de los DEPT y 13C requiere la mayor parte del tiempo de mquina. La incorporacin de la
secuencia DEPT en un HMQC ofrece un mtodo para realizar dicho editado en el espectro de
correlacin [30].

Espectroscopa 2D de correlacin heteronuclear

167

El editado puede ser fcilmente introducido en la secuencia HSQC [14, 31, 32],
mediante la simple adicin de un eco de espn (- 180 (1H,X) -) despus de t1. Durante
dicho perodo slo evoluciona el acoplamiento heteronuclear, de la misma manera que en la
secuencia 1D J-modulado. Por tanto, fijando = 1/2J obtenemos un espectro de correlacin
donde las respuestas de CH2 aparecen invertidas respecto a las de CH y CH3. En una reciente
aproximacin [33] de Parella, el eco de espn aparece concatenado con el t1 variable. Un
problema potencial en este tipo de aproximacin es la cancelacin de seales de correlacin
superpuestas y que presentan fases opuestas en regiones del espectro muy apiadas. Existen
tambin secuencias alternativas basadas en el editado mediante filtracin mltiple-cuntica
produciendo espectros que contienen slo correlaciones de CH, CH2 CH3 eliminando el
problema de la cancelacin [34,35].
3.4.2. HSQC-TOCSY, HSQC-NOESY
Cuando se analizan molculas que presentan espectros de protn muy solapados, los
experimentos de correlacin homonuclear pueden mostrar espectros que siguen presentando
mucho solapamiento para una buena interpretacin. En tales casos, se puede aprovechar la
dispersin, potencialmente mayor, de los desplazamientos qumicos del heterotomo como un
medio para separar las correlaciones protn-protn. Adems, en los casos donde es completo
el solapamiento de las seales de 1H, las correlaciones a un enlace 1H-X no permiten
identificar sin ambigedad el heterotomo y una aproximacin para resolver este problema
consiste en transferir la informacin sobre la correlacin heteronuclear, a los protones
vecinos. As, si adicionamos un perodo de mezcla de un spin-lock del TOCSY despus de la
secuencia HMQC/HSQC e inmediatamente antes de la deteccin, la transferencia de
magnetizacin que haba vuelto al protn se reparte con otros protones va TOCSY [36,37].
Modificaciones posteriores de la secuencia HSQC-TOCSY que incorporan la metodologa
PEP as como la utilizacin de gradientes han sido descritas [38,39].
Las
correlaciones
directas
pueden ser diferenciadas de las
indirectas (generadas por el
TOCSY) incluyendo un bloque
de editado justo antes de la
adquisicin;
adems
la
multiplicidad de los picos
directos puede ser codificada
[33] (ver figura 10).
Otro experimento interesante es
el HSQC-NOESY [40] a partir
del cual pueden observarse
NOEs
entre
protones
qumicamente equivalentes o
Figura 10. Espectros 2D HSQC-TOCSY con PEP de estricnina en accidentalmente solapados, lo
CDCl3 : A) espectro convencional B) con editado de respuestas directas que lo convierte en una
C) con editado de multiplicidad D) doble editado; picos herramienta til para el estudio
positivos(negro) negativos(vaco)
de molculas simtricas.

168

Jos A. Gavin

3.4.3. Experimentos INEPT-INADEQUATE, ADEQUATE

Existe todo un nmero de modificaciones a partir de la secuencia bsica del
INADEQUATE [41-44] cuya finalidad es mejorar la sensibilidad de dicha tcnica. Un
experimento reciente, llamado INEPT-INADEQUATE [45] resuelve el problema de la
sensibilidad utilizando la transferencia inicial de polarizacin protn-carbono y con deteccin
final de protn. Adems la supresin de las seales de los protones unidos a un slo 13C y de
los 1H-12C se consigue mediante la utilizacin de PFG para la seleccin de la seal. En
principio, esto conduce a un aumento en la sensibilidad por un factor de 32, ((H/C)5/2),
aunque un factor entre 8 y 16 parece ms realista si se tienen en cuenta las prdidas
experimentales. El espectro resultante presenta una correlacin paso a paso de los protones
con sus carbonos vecinos lo que permite reconstruir el esqueleto molecular.
La secuencia original es la de la figura 11 y puede ser formalmente diseccionada en
sus partes principales.

Figura 11. Secuencia INEPT-INADEQUATE con gradientes =1/4JH,C 3=1/4JC,C

La secuencia conocida como ADEQUATE presenta mejoras en la sensibilidad por la

inclusin de la metodologa PEP. El experimento 1,1-ADEQUATE [46] es un HSQC-PEP en
el cual el perodo de evolucin usual es sustituido por otro en el que se crea y evoluciona
coherencia de orden dos, DQ 13C-13C, como en el experimento INADEQUATE. Una versin
reenfocada de este experimento permitira discriminar entre picos cruzados provenientes de
2
JCH y 3JCH en un HMBC [47].

Figura 12. Secuencia 1,1-ADEQUATE con PEP y seleccin mediante eco-antieco

Espectroscopa 2D de correlacin heteronuclear

169

Por otra parte, si el perodo de evolucin se optimiza para nJCC, obtendramos el

experimento 1,n-ADEQUATE que muestra correlaciones a 3 y 4 enlaces [48]. Resultados
similares pueden ser obtenidos a partir de un experimento n,1-ADEQUATE ( nJCH + 1JCC ).
Finalmente, a partir de un experimento n,n-ADEQUATE ( nJCH + nJCC ) podemos obtener
correlaciones a 6 enlaces en un nico experimento. Tambin como en ejemplos anteriores
puede incluirse la multiplicidad de los carbonos en dichos experimentos.
4.

ESPECTROSCOPIA DE DETECCIN INVERSA. CORRELACIONES A

LARGA DISTANCIA

Los mtodos de correlacin heteronuclear 1H-X presentados hasta ahora (HMQC,

HSQC) dependen de la presencia de un protn, al menos, unido al heterotomo y no son
capaces de asignar los carbonos no protonados. Un mtodo alternativo en dichos casos
consiste en establecer correlaciones entre carbonos y protones vecinos a ms de un enlace,
llamadas correlaciones a larga distancia o a varios enlaces, y es conocido comnmente como
HMBC.
4.1. La secuencia HMBC
El experimento HMBC [49,50] establece correlaciones a larga distancia haciendo uso
de la mayor sensibilidad asociada a la deteccin de protn y es en esencia un HMQC
optimizado para detectar correlaciones va acoplamientos pequeos. Debido a su gran
similitud, slo presentaremos las diferencias existentes entre ambos.
La optimizacin del HMQC se obtiene fijando el perodo de preparacin lo
suficientemente largo para permitir que los pequeos acoplamientos 1H-13C a larga distancia,
evolucionen para producir magnetizacin en antifase que generar luego coherencia
heteronuclear mltiple-cuntica. Ya que dichos acoplamientos son al menos un orden de
magnitud ms pequeo que los acoplamientos a un enlace (generalmente <5 Hz.), sera en
principio al menos de 100ms. (1/2 nJCH), aunque se suelen usar valores ms pequeos para
evitar prdidas por relajacin. Durante este largo perodo, los acoplamientos homonucleares
1
H-1H, que son de una magnitud similar, tambin evolucionan e introducen distorsiones en la
fase de los picos de correlacin observados (estas distorsiones son mucho ms pequeas en el
HMQC debido al valor de mucho menor). Esto hace que las presentaciones ms frecuentes
usadas para los espectros HMBC sean en valor absoluto para enmascarar tales distorsiones.
Por razones de sensibilidad, el perodo de reenfoque final del HMQC es omitido, de tal forma
que la magnetizacin aparece en antifase al principio de t2, lo que explica el no
desacoplamiento durante la adquisicin. Aunque es elegido de acuerdo a los valores de los
acoplamientos a larga distancia, puede ocurrir que sea mltiplo de los valores apropiados para
la correlacin a un enlace, lo que originara su aparicin. Ya que la FID es adquirida sin
desacoplamiento de 13C, estos poseen distintas estructuras dobletes en f2 lo que facilita su
identificacin.
La supresin de dichas seales es conseguida al menos parcialmente mediante la
adicin de un filtro de tipo low-pass J filter [50,51] ( llamado as porque retiene o deja pasar
slo los picos que se originan a partir de acoplamientos ms pequeos que un valor
determinado, en este caso la constante de acoplamiento a 1 enlace). Aqu, el perodo 1 es
fijado de acuerdo a 1JCH, mientras que 2 lo es de acuerdo al acoplamiento a larga distancia.
Alternando la fase del primer pulso de 13C sin cambiar la fase del receptor, se consigue
cancelar la seal proveniente de la correlacin a 1 enlace en escanes sucesivos. En la prctica,
la supresin es a menudo incompleta, en particular cuando hay un rango amplio de valores de

170

Jos A. Gavin

JCH. En estos casos la adicin de un esquema de purga mejora dicha supresin [52]. En
estudios de rutina se pueden suprimir dichos filtros y aceptar la presencia de restos de
acoplamiento a 1 enlace.
Sin lugar a dudas, el problema principal asociado con la secuencia HMBC consiste en
la eliminacin de las seales padre 1H-12C, que pueden llegar a enmascarar los satlites de los
acoplamientos a larga distancia. La introduccin de PFG [15,53] ha revolucionado la
aplicabilidad del HMBC, ya que se consigue una perfecta supresin de las seales padre, con
una reduccin muy grande del ruido t1 asociado a ellas.
X

1
1

H
X

t1
G1

G2

G3

Gz
Figura 13. Secuencia HMBC con low pass filter en modo magnitud

.La utilizacin de la secuencia HSQC, adaptada para la obtencin de correlaciones a

larga distancia, no es aconsejable. Adems de los problemas de relajacin asociados a la
utilizacin de 2 grandes (60-70 ms), aparece una evolucin significativa de los
acoplamientos 1H-1H durante dichos perodos lo que conduce a transferencias tipo COSY no
deseadas que son producidas por el 2 pulso de protn del INEPT. Este problema no aparece
en la secuencia HMBC.
4.2. Aspectos experimentales
Los acoplamientos a dos o tres enlaces protn-carbono raramente sobrepasan 25 Hz, y
en ausencia de insaturaciones son generalmente inferiores a 5 Hz [54,55]. Hay que tener
presente que los acoplamientos a tres enlaces pueden ser, y frecuentemente lo son, de
magnitud mayor que los correspondientes a dos enlaces, y adems presentan una relacin tipo
Karplus con el ngulo diedro [56]. Realmente, una de las limitaciones en el uso de los datos
HMBC es la falta de diferenciacin entre las conectividades a dos y tres enlaces. Debido al
rango relativamente grande en que se mueven los acoplamientos a larga distancia existen
distintas alternativas para obtener el mayor nmero de correlaciones posibles. La ms sencilla
consiste en la realizacin de 2 3 experimentos con distintos valores de (por ejemplo 60,
90, 120ms). Otra alternativa ms reciente lleva el nombre de ACCORD-HMBC (ver ms
adelante).
4.3. Variantes de los experimentos HMBC: ACCORD-HMBC, CIGAR-HMBC,
IMPEACH-MBC, HSQMBC
Un hito en el desarrollo de nuevos experimentos de correlacin heteronuclear a larga
distancia fue la introduccin del experimento HMBC propuesto por Bax y Summers en 1986
[9]. Recientemente se ha producido un resurgimiento en el inters por este tipo de
experimento, que ha llevado a la aparicin de una serie de secuencias relacionadas.

Espectroscopa 2D de correlacin heteronuclear

171

Quizs la modificacin ms creativa del HMBC ha sido el experimento ACCORDHMBC desarrollado por Berger [57] que utiliza el principio del acorden [58] para
muestrear un amplio rango de constantes de acoplamiento heteronucleares a larga distancia en
un nico experimento. Este experimento usa el principio del acorden reemplazando el
perodo esttico 2 durante el cual evolucionaba el acoplamiento nJCH, por un perodo que va
disminuyendo sistemticamente. Este perodo acorden permite muestrear un rango de
potenciales acoplamientos a larga distancia, ya que su duracin vara entre max y min,
mientras que la duracin del correspondiente tiempo de evolucin t1 es aumentada. En
principio, el experimento ACCORD-HMBC resuelve el problema de la optimizacin del
perodo 2. Sin embargo, un inconveniente que aparece usando este principio es la
modulacin del acoplamiento homonuclear en f1 (ver figura 17c).
3

t1

Desacoplar

X
Filtro
Delay
Low Pass variable

G1

G3

Delay
Filtro
variable Low Pass

G5

G4

G6

G8

Gz
G7

G2
Figura 15. Secuencia ACCORD-HMBC

El experimento IMPEACH-MBC (IMproved PErfomance ACcordion Heteronuclear

Multiple Bond Correlation) descrito por Martin [59] elimina este problema. La diferencia
consiste en la utilizacin de un perodo variable a tiempo constante en lugar del perodo
variable simple del ACCORD. Esto suprime la modulacin debido al acoplamiento
homonuclear en f1. (ver figuras 15 y 16)
X

H
X

D/2

D/2

2
t1

dv

Desacoplar

X
Filtro J Tiempo constante
Low Pass Delay variable

G1

G4

G6

G7

Gz
G2

G3

G5

Figura 16. Secuencia IMPEACH-MBC

Delay
simtrico

G8

172

Jos A. Gavin

Recientemente ha aparecido una

nueva
variante
denominada
CIGAR-HMBC (Constant time
Inverse-detected
Gradient
Accordion Rescaled long-range
Heteronuclear Multiple Bond
Correlation) [60]. Este nuevo
experimento modifica el perodo
variable a tiempo constante
constant time variable delay del
IMPEACH lo que permite escalar
la modulacin en f1.

Figura17. Comparacin de la regin aliftica de la estricnina. A) CIGAR-HMBC B) IMPEACH y C)

ACCORD-HMBC

Tambin han aparecido una serie de experimentos como el GSQMBC (Gradientenhanced-Single-Quantum-Multiple-Bond-Correlation) [61] y una modificacin de ste
conocida como HSQMBC (Heteronuclear-Single-Quantum-Multiple-Bond-Correlation) [62]
que no slo tienen la misma sensibilidad que el HMBC, sino que adems permiten una
medida fcil de las J heteronucleares a larga distancia. Estos experimentos reducen el efecto
no deseado del acoplamiento homonuclear mediante el uso de la secuencia HSQC como
bloque fundamental. La transferencia inicial INEPT permite crear magnetizacin simple
cuanto en X, lo que elimina la evolucin del acoplamiento homonuclear durante t1.

Figura 18. Secuencia HSQMBC sensible a la fase. 2=1/4 nJCH

El experimento puede incorporar un trim pulse antes del 2 pulso de 1H y adems un filtro
zz en el retroINEPT con lo que se elimina la magnetizacin no deseada (que genera
contribuciones dispersivas en la forma de lnea) antes de transferir la magnetizacin al protn
para su deteccin despus de la aplicacin del correspondiente gradiente de descodificacin.

Espectroscopa 2D de correlacin heteronuclear

5.

173

ESPECTROSCOPIA 15N

La baja abundancia natural del 15N (0.37%) unida a su tambin baja relacin
magnetogrica (N), aproximadamente el 10% de H, lo convierten en un ncleo difcil para
trabajar en espectroscopia de rutina. El desarrollo de los mtodos de deteccin inversa ha
aumentado grandemente sus posibilidades como se pone de manifiesto en el creciente nmero
de trabajos aparecidos en los ltimos aos [63-66].
BIBLIOGRAFIA
General
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John Wiley & Sons, New York, (1995)
- J. Cavanagh, W.J. Fairbrother, A.G. Palmer III, N.J. Skelton, Protein NMR spectroscopy. Principles and
practice Ed. Academic Press, San Diego, (1996)
- T.D.W. Claridge, High resolution NMR techniques in Organic Chemistry Ed. Elsevier, Oxford (1999)
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Wiley & Sons and Verlag Chemie, Weinheim, (1998)
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Sons, Chichester (1997)
Especfica
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2. A.A. Maudsley, L. Mller, R.R. Ernst, J. Magn. Reson. 28, 463 (1977)
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7. G. Bodenhausen, D.J. Ruben, Chem. Phys. Lett. 69, 185 (1980)
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Griesinger, J. Biomol. NMR 4, 301 (1994)
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31. S.I. Tate, Y. Masui, F. Inagaki, J. Magn. Reson. 94, 625 (1991)

174

32.
33.
34.
35.
36.
37.
38.
39.
40.
41.
42.
43.
44.
45.
46.
47.
48.
49.
50.
51.
52.
53.
54.
55.
56.
57.
58.
59.
60.
61.
62.
63.
64.
65.
66.

Jos A. Gavin

T. Parella, F. Sanchez-Ferrando, A. Virgili, J. Magn. Reson. 126, 274 (1997)

T. Parella, J. Belloc, F. Sanchez-Ferrando, A. Virgili, Magn. Reson. Chem. 36, 715 (1998)
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D.G. Davix, J. Magn. Reson. 84, 417 (1989)
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Agradecimientos: Quiero agradecer la inestimable ayuda prestada por el Dr. Antonio

Hernndez-Daranas en la preparacin de este texto, as como de los Dres Teo Parella y
Francesc Snchez-Ferrando por las sugerencias realizadas y la revisin del manuscrito.