Anticuerpos

Los anticuerpos son molculas de peso molecular

aproximado de 150 kDa, pertenecientes al grupo de las
inmunoglobulinas (Ig). Son molculas capaces de
reconocer otras molculas, los antgenos. La capacidad
de reconocimiento de un anticuerpo radica en las
secuencias variables de sus cadenas proteicas,
generadas por recombinacin de una serie de 'gene
cassettes" en el proceso de produccin de los linfocitos B
durante el desarrollo embrionario. La combinatoria de
estas secuencias puede producir ms de un billn de
secuencias diferentes. Esta informacin es almacenada
en el 'pool' de linfocitos B presentes en nuestro tejido
linftico.

La estructura bsica de un anticuerpo se esquematiza en la figura: formado por

dos cadenas proteicas pesadas y dos ligeras, unidas por puentes disulfuro. Se
dividen en varias clases que se identifican segn el tipo de cadena pesada en:
IgG, IgM, IgA, IgD e IgE.
La accin de enzimas proteolticas sobre los anticuerpos permite obtener
fragmentos que presentan actividades biolgicas diferenciales. Los fragmentos
obtenidos son:

Fc. Corresponde al extremo C-terminal de las dos cadenas pesadas. Este

fragmento est constituido por la regin constante de la cadena pesada y
es caracterstica de cada clase de inmunoglobulinas. Es en esta regin

donde radican las funciones efectoras de la molcula como son la fijacin

del complemento, la interaccin con los receptores celulares de monocitos y
macrfagos, la interaccin con la protena A de S. aureus y G de
Streptococcus sp. etc... La regin Fc es caracterstica de especie.
F(ab')2. Corresponde al extremo N-terminal de las dos cadenas pesadas y
a las dos cadenas ligeras. Se obtiene por digestin con pepsina. Tiene
reconocimiento divalente del eptope.
F(ab). Corresponde al extremo N-terminal de una cadena pesada y a una
cadena ligera, unidas por puentes disulfuro. Se obtiene por digestin con
papaina. Tiene reconocimiento monovalente del eptope.

De las distintas clases de inmunoglobulinas las que se encuentran

predominantemente en el suero de animales inmunizados son las IgM y las IgG.
Las IgM se sintetizan durante la respuesta primaria y se asocian en una estructura
pentamrica. Su capacidad de reconocimiento de eptopes es por ello de 10. Las
IgG se sintetizan tanto durante la respuesta primaria como secundaria, siendo en
esta ltima donde se consiguen los mayores niveles de produccin. Su accin
bivalente les permite interactuar con ms de una molcula de antgeno.

Antgenos, Antigenicidad e inmunogenicidad.

Virtualmente toda molcula ajena a un determinado organismo se comporta frente
a ste como un antgeno, Se pueden diferenciar dos caractersticas primordiales
en un antgeno. Por una parte la inmunogenicidad o capacidad que presenta una
molcula para generar una respuesta inmune en un organismo dado y la
antigenicidad o particularidad del antgeno que hace que ste sea reconocido por
un determinado anticuerpo. Ambas propiedades pueden o no estar presentes en
un determinado antgeno. Molculas de pequeo tamao (haptenos o pptidos)
son poco inmunognicas y por ello se asocian a protenas transportadoras de alto
peso molecular o 'carriers' para inducir una respuesta inmune adecuada.
Macromolculas ubcuas (albminas, citocromos, etc...) o de especies
filogenticamente relacionadas, son poco inmunognicas. En estos casos, para
obtener una respuesta adecuada es aconsejable utilizar como animal husped una
especie filogenticamente alejada a la del antgeno a inocular.
Habitualmente se emplean como antgenos puros o previamente enriquecidos
mediante tcnicas de concentracin o de separacin electrofortica. Uno de los
criterios de mayor importancia en la obtencin de un suero monoespecfico es la
inmunizacin con antgenos puros.
A la regin del antgeno reconocida por un anticuerpo se le denomina eptope o
determinante antignico. Un antgeno puede presentar un nmero variable de
eptopes de estructura nica o repetitiva. La complejidad estructural de las
protenas favorece que stas presenten por lo general un nmero elevado de

eptopes distintos, mientras que los cidos nucleicos y los polisacridos, dada su
repetitividad estructural, poseen un nmero escaso de eptopes diferentes.

Inmunizacin y preparacin del antgeno

El proceso de inmunizacin es aquel en el que se inyecta al animal el antgeno en
condiciones adecuadas de cantidad, sustancias acompaantes, y nmero de
veces, que sean necesarias para conseguir una buena respuesta inmune. En
general se divide en dos fases: inmunizacin primaria, en la cual se administra una
determinada cantidad de antgeno en presencia de adyuvante, e inmunizacin de
recuerdo ('booster'), en la que el antgeno es administrado en forma soluble o bien
con adyuvante. Existen numerosos protocolos de inmunizacin, con una duracin
variable.
Cuando se inmuniza un animal con un antgeno y se provoca una respuesta
inmune aumenta notablemente en el suero del animal la cantidad de Ig especficas
del antgeno empleado. Esto es la consecuencia de la seleccin clonal de los
limfocitos B que producen anticuerpos contra el antgeno. Como hemos visto un
antgeno puede presentar diferentes eptopes, y cada uno de ellos ser reconocido
por un clon de linfocitos B que producir molculas Ig con una secuencia
caracterstica. Por ello en el suero de un animal inmunizado se acumulan un
nmero desconocido, posiblemente elevado, de diferentes molculas de Ig
especficas en mayor o menor medida de nuestro antgeno. Se trata de un suero
producido por la accin de sntesis de numerosos clones de linfocitos B y por ello
se ha denominado policlonal.

Interaccin primaria antgeno-anticuerpo.

Afinidad y avidez
La interaccin entre antgeno y anticuerpo se estabiliza mediante enlaces dbiles,
como puentes de hidrgeno, fuerzas de Van der Waals e interacciones
electrostticas e hidrofbicas. La suma de todos estos enlaces genera una
interaccin estable entre el lugar de unin del anticuerpo (paratope) y el lugar de
unin del antgeno (eptope). Estas fuerzas son inversamente proporcionales a
una potencia de la distancia entre los grupos interactuantes, lo que implica que
eptope y paratope deben presentar estructuras complementarias para obtener
una energa de unin suficiente como para resistir la disrupcin termodinmica. La
suma de estas fuerzas de atraccin y de repulsin se conoce como afinidad del
anticuerpo.
Los anticuerpos son molculas multivalentes en su interaccin con el antgeno.
Las molculas de inmunoglobulina presentan un mximo de 10 (IgM) y un mnimo

de 2 brazos de unin con el antgeno. En el caso de que este ltimo tambin sea
multivalente, presentar un mnimo de dos puntos de anclaje para el anticuerpo
correspondiente. Esta interaccin multivalente entre antgeno y anticuerpo permite
introducir el concepto de avidez o afinidad funcional.

Especificidad y reaccin cruzada

La complementariedad existente entre eptope y paratope condiciona la relacin
especfica entre antgeno y anticuerpo. Dicha complementariedad afecta tanto a
una relacin espacial entre los grupos qumicos reaccionantes, a la relacin
complementaria de cargas netas como a la relacin estrica entre las estructuras
reaccionantes.
En general los anticuerpos son altamente especficos, siendo capaces de discernir
entre pequeas variaciones del antgeno, tanto a nivel de estructura primaria como
de conformacin estrica o configuracin ptica del mismo.

Interaccin secundaria antgeno-anticuerpo.

En la interaccin in vitro de un antgeno con su correspondiente anticuerpo se
distinguen dos etapas, la reaccin primaria no visualizable y la reaccin
secundaria, que sigue a la anterior y se caracteriza por la aparicin de un
fenmeno visible como la aglutinacin, la precipitacin, etc.
Los complejos iniciales que se forman rpidamente, sobre los que dentro de
ciertos limites las variaciones de temperatura y concentracin salina tienen poca
influencia, se agregan luego para dar diferentes fenmenos visibles cuyas
caractersticas dependen en gran parte del estado fsico del antgeno. Esta etapa
se acelera con la temperatura, la agitacin y es electrolitodependiente.
Es importante separar las etapas de la reaccin antgeno-anticuerpo. Puede
ocurrir que se demuestre la presencia de anticuerpo por interaccin primaria, pero
que este no sea detectable por interaccin secundaria o terciaria. Esto puede ser
consecuencia de variaciones cuantitativas, ya que para conseguir fenmenos
visibles son indispensables determinadas concentraciones de anticuerpo, y
cualitativas inherentes a las propiedades de la clase de inmunoglobulina
comprometida en la respuesta inmune, as como de las caractersticas del ligando.
Si bien es posible detectar un anticuerpo mediante estudios de interaccin
primaria, ello no significa que siempre deban ocurrir reacciones secundarias o
terciarias.
Precipitacin

Cuando una anticuerpo, excepcin hecha de los bloqueantes y no precipitantes,

es puesto en contacto con una solucin de macromolculas que lo origino, se
forman complejos Ac/Ag que se insolubilizan luego en su mayor parte dando una
reaccin de precipitacin, que puede ser total o zonal.
Es una propiedad de la mayor parte de los anticuerpos y no una caracterstica
particular de un determinado tipo al que originalmente se lo llamo anticuerpo
precipitante.
Precipitacin en medios lquidos
Esta reaccin se produce en dos etapas. En la inicial, que se desarrolla
rpidamente y es influida muy poco por la temperatura y los electrolitos, se forman
los complejos Ac/Ag primarios. A medida que el tiempo transcurre, esos complejos
iniciales se agregan, originando micelas de diferentes tamaos, las que finalmente
precipitan. Algunos complejos no alcanzan a hacerlo y quedan en solucin.
La temperatura acelera esta segunda etapa, siendo adems
electrolitodependiente.
Es mucho ms lenta que la inicial, puede durar minutos, e incluso horas, para que
se complete.
La formacin de agregados es una consecuencia de la bivalencia de los
anticuerpos y la multivalencia de los antgenos. Con haptenos monovalentes o
antgenos que poseen un solo determinante antignico por molcula, la
precipitacin no se produce.
Un hecho muy particular lo constituyen los anticuerpos monoclonales, que en su
mayor parte no muestran actividad precipitante. Ello se debe a que en muchos
casos, especialmente cuando estn dirigidos contra macromolculas en solucin,
reconocen a un nico epitope no repetido, lo que les impide formar agregados.
La formacin de estos diferentes complejos ha sido explicada mediante la llamada
teora del enrejado, que considera que la composicin del precipitado formado es
una consecuencia del modo en que anticuerpo y antigeno se han unido. Dada la
bivalencia del anticuerpo y multivalencia del antigeno, las posibilidades de
combinacin varan segn que en la mezcla exista exceso de antigeno, exceso de
anticuerpos o equivalencia de ambos.
En la zona de exceso de antigeno, los complejos son solubles.
Si bien la precipitacin en medios lquidos es muy til para la identificacin de
antgenos y anticuerpos, teniendo en cuenta lo anteriormente expuesto en lo
relativo a la formacin de los precipitados, la misma puede usarse con fines
cuantitativos y constituye un buen mtodo para la medida de la concentracin de
los anticuerpos presentes en un suero. Puede usarse tambin para medir niveles
de antgeno.
Precipitacin en medios gelificados
Las macromolculas pueden difundir libremente a travs de geles; dicha difusin
esta limitada por la concentracin del gel. Empleando soportes adecuados, en

especial aquellos que como base tienen agar disuelto en electrolitos, es posible
hacer migrar antgenos y anticuerpos de modo que al encontrarse interaccionen.
Pueden utilizarse tambin geles con base de pectina, alginatos, pliacrilamida y aun
tiras de acetato de celulosa gelatinizado.
Los precipitados que se originan se visualizan como ntidas bandas de
precipitacin, que permanecern estables mientras un mayor aflujo de molculas
de los reactivos no provoquen su redisolucin.
Se han descripto numerosas tcnicas cualitativas y cuantitativas basadas en este
principio, entre las que pueden citarse la difusin simple monodimensional,
difusin doble monodimensional, difusin doble bidimensional, difusin radial, etc..
Difusin simple monodimensional
Se coloca en un tubo de ensayo pequeo agar fundido, solucin al 1% en cloruro
de sodio 0,15 M, mezclado con un volumen igual del antisuero para analizar.
Producida la solidificacin, se aade la solucin de antigeno. Por difusin a travs
del gel el antigeno va penetrando, creando un gradiente de concentracin. En la
interfase gel-liquido no se forman precipitados, dada la alta concentracin
antignica, y aparecen con la forma de bandas cuando la concentracin del
antigeno que ha difundido es la optima.
Si en el suero haba mas de un anticuerpo y en la solucin aadida mas de un
antigeno que se correspondan, se formara tantas bandas de precipitacin como
sistemas hayan interaccionado.
Esto no es exacto, pues si se tiene en cuenta que dichas separaciones dependen
de las velocidades de difusin de las diferentes molculas antignicas, solo ser
cierto si aquellas son distintas. El numero de bandas de precipitacin nos indica la
cantidad mnima de sistemas reaccionantes presentes. Esto tambin es relativo,
ya que es indispensable que los reactivos no estn en concentraciones inferiores a
las necesarias para que la reaccin ocurra.
Difusin doble monodimensional
En este caso la reaccin se efecta colocando en la parte inferior del tubo un
volumen de agar al 1 % fundido, mezclado con partes iguales del antisuero.
Producida la gelificacin, se agrega agar al 0,5 % en solucin salina, en un
volumen igual a la mitad del anterior. Despus de la solidificacin se cubre todo
con un volumen de agar al 1 % fundido, mezclado con igual volumen de la
solucin antignica.
Antgenos y anticuerpos migrarn hacia la zona media e interaccionarn
desencadenndose la precipitacin cuando las concentraciones sean las ptimas.
Estando la difusin en relacin directa con la concentracin de la sustancia que
difunde, la banda de precipitacin estar ms prxima a la zona del antgeno
cuando hay exceso de anticuerpo, y ocurrir lo inverso en caso contrario.

Este es un buen mtodo cualitativo que permite demostrar varios sistemas

reactivos simultneos, cosa que no ocurre en la precipitacin en medios lquidos.
Pueden detectarse hasta 10 g/ml de anticuerpo.

Difusin doble bidimensional

Un interesante mtodo de doble difusin en placas fue descripto por Ochterlony.
Consiste en enfrentar en pequeas perforaciones efectuadas en el agar, y a

distancias convenientes, las soluciones de antgeno y de anticuerpo. Al difundir

ambos y ponerse en contacto, producirn una banda de precipitacin cuando
estn en la relacin ptima.
Con esta tcnica puede tenerse una idea de las relaciones entre los pesos
moleculares de los antgenos y anticuerpos reaccionantes. Trabajando con
concentraciones ptimas de Ag y de Ac, si la banda de pecipitacin formada es
recta, indica que los pesos moleculares de ambos son muy prximos. Si la banda
es cncava con especto al reservorio del antgeno, seala que el peso molecular
de ste es superior al del anticuerpo, siendo menor en el caso en que la banda
presente convexidad.
Todo esto es una consecuencia de las leyes generales de la difusin, que
establecen que la distancia a la que una sustancia difunde est en relacin directa
con su concentracin y en relacin inversa con su peso molecular. Mediante esta
metodologa, es posible identificar varios sistemas reaccionantes
simultneamente, pues cada uno de ellos dar una banda de precipitacin
especfica y, adems, investigar reacciones cruzadas, pues en estos casos habr
fusin de bandas. Originariamente Ochterlony describi, de acuerdo a este
hecho, tres tipos de reacciones. Fueron denominadas como reacciones de
identidad, no identidad e identidad parcial.
En el primer caso, los dos sistemas reactivos se funden en una nica banda de
precipitacin. Si los sistemas no son iguales (reacciones de no identidad), cada
uno reacciona independientemente originando bandas de precipitacin que se
cruzan. Cuando uno de los antgenos analizados tiene algn componente capaz
de dar una reaccin cruzada con el anticuerpo elaborado por el otro (identidad
parcial), las bandas de precipitacin de ambos sistemas se unen y funden
parcialmente en una banda, apareciendo una prolongacin o espoln en la
correspondiente al antgeno que se emple para la obtencin del antisuero. Esto
indica que en este antgeno hay componentes antignicos no compartidos con el
restante.

Difusin radial (Tcnica de Mancini)

Cuando un antgeno es colocado en un orificio circular practicado en una placa de
agar, al cual se adicion anticuerpo monoespecfico, difunde en forma radial y, de
acuerdo con los principios bsicos de la difusin, el dimetro del halo de
precipitacin est en relacin directa con su concentracin. Si a esta operacin se
la efecta colocando en varios orificios de la placa cantidades variables conocidas
del antgeno especfico para el antisuero mezclado con el agar y se lo deja a
temperatura ambiente hasta que el halo de precipitacin no se modifique, con los
resultados obtenidos se puede confeccionar una curva relacionando el dimetro
de los halos de precipitacin con las correspondientes concentraciones
antignicas. Esta curva permite calcular la concentracin de ese mismo antgeno
en cualquier muestra desconocida.
La difusin radial se utiliza en la cuantificacin de protenas que se encuentran
presentes en mezclas complejas como lo son los componentes del suero humano.
Es indispensable disponer para ello de antisueros monoespecficos destinados a
los antgenos que se quieren valorar.

Bibliografa
http://www.ub.es/biocel/wbc/tecnicas/anticuerpos.htm#arriba
Inmunologa e Inmunoqumica. Margni, R. A., 5 edicin Editorial Mdica
Panamericana 1996.