Tincin de Gram

INTRODUCCIN
De gran importancia en Microbiologa porque permite diferenciar dos grandes
grupos de bacterias (Gram+ y Gram-), segn se comporten ante esta tincin. El
fundamento radica en la diferente estructura de la pared celular de ambos
grupos: las bacterias Gram+ tienen una gruesa capa de peptidoglicano en su
pared, mientras que las bacterias Gram- tienen una capa de peptidoglicano
ms fina y una capa lipopolisacardica externa. Tras la tincin con el primer
colorante (Cristal violeta) se efecta un lavado conetanol que arrastrar al
colorante slo en las Gram (-), mientras que en las Gram (+) elcolorante queda
retenido y las clulas permanecern azules. Las clulas Gram (-) se teirn
despus con un colorante de contraste (safranina) para que puedan
observarse.

Objetivos
Utilizacin de tcnicas sencillas para la observacin de microorganismos
Conocer o manejo del microscopio ptico para la observacin de bacterias
(importancia del objetivo de inmersin)
Conocer y manejar las unidades de medida de las clulas y establecer
comparaciones entre tamaos de procariotas y de eucariotas
Reconocer los distintos modelos de pared bacteriana.

Materiales
Mechero Bunsen o de Alcohol
Asa de Siembra o aguja enmangada
Pinzas
Portaobjetos
Muestras bacterianas de origen natural: Yogur, Sarro Dental, Suelo, etc.
Palillos
Microscopios
Aceite de inmersin

Soporte de Tinciones
Goteros
Pinzas
Agua destilada
Colorantes para Tincin: Solucin de cristal Violeta Lugol Safranina Etanol
95%
Procedimiento
I. prepara las muestras siguiendo estos pasos:
1. En unas gotas de agua colocadas sobre un portaobjetos, disuelve una
pequea cantidad de yogur con ayuda de un palillo higinico. Haz lo mismo con
la muestra de sarro dental extrado de la boca de alguien.2. Prepara una fina
extensin (frotis), en otros portas, dejndolos secar.3. Fija este frotis dndole
varios pases a los portas sobre la llama del mechero, con la muestra hacia
arriba.

II Tie ahora los frotis fijados mediante los siguientes pasos:

1. Cubre ambos frotis con cristal violeta durante 3 min. Se retirar el colorante
mediante un suave lavado con agua, deslizando el agua sobre el porta, para
non desprender la muestra. Se 2. cubrir ahora con Lugol durante 1 min., y
despus se realizar otro lavado suave. Todas las clulas se teirn de
violeta.2. Se retirar el colorante con etanol, gotendolo por el portaobjetos,
hasta que las gotas que salen no tengan casi color. Las clulas Gram- pierden
el colorante violeta y quedarn incoloras. Las Gram + seguiran violeta.3.
Aade una gota de agua a la preparacin y cubre las preparaciones 2 min. con
safranina (colorante de contraste).Finalmente, lava el colorante con agua. Este
colorante slo entrar en las bacterias Gram , que quedarn rojas. Las Gram
+ seguirn violetas.
Seca las preparaciones sobre papel de filtro y obsrvalas con microscopio
utilizando el objetivo de inmersin. En esta tincin diferencial las bacterias
Gram aparecen rojas y las Gram + violeta. Observar (100). Lugol
Tincin negativa
1. colocar una pequea gota de tinta china en el extremo de un portaobjeto,
colocar una gota de muestra2. realizar frtis, 3. dejar secar.
Preguntas de anlisis

1) Cules son las fuentes de errores ms comunes de error en la Tincin de

gram.
Los peores obstculos de la Tincin, que impiden conseguir el resultado
perseguido, son los errores del tcnico. Para evitarlos hay que elegir bien los
reactivos y ser muy cuidadosos al ejecutar la tcnica. A continuacin
describimos algunas de las fuentes de error: Impurezas en los reactivos
de Tincin.
Concentracin inadecuada de los reactivos de tincin.
pH inadecuado.
El colorante se fija a la clula por mecanismos fsico-qumicos, que se alteran si
el Ph no es el apropiado.
Los colorantes pueden ser cidos, bsicos o neutros.
Tiempo de Tincin incorrecto.
Temperatura suficiente.
2) Explique qu reaccin de Gram darn las levaduras. Estos tendrn la
misma importancia que para las bacterias.
El color depende de la composicin de la pared celular de la levadura y no
tiene tanta importancia como las bacterias ya que en ellas existe toda
una clasificacin por medio del gram lo que no sucede con las levaduras.

3) Explique el fundamento de la Tincin negativa realizada en la prctica. Qu

tipo de informacin se obtiene.
La Tincin negativa es el reverso del procedimiento de tincin usual: las clulas
se dejan sin teir, pero se colorea en cambio el medio que las rodea. Lo que se
ve, por tanto, es el perfil de las clulas. La Tincin negativa es un modo
satisfactorio de aumentar el contraste de las clulas en la microscopia ptica,
pero su mxima utilidad est en revelar la presencia de cpsulas alrededor de
las clulas bacterianas.

4) Investigue otra tcnica de Tincin selectiva que permita observar otras

estructuras bacterianas.
Las Tinciones Selectivas nos permiten observar estructuras de las clulas
gracias a su mayor afinidad por los colorantes utilizados.

5) A qu se debe el distinto comportamiento de las bacterias segn sean

Gram+ o Gram-?
El distinto comportamiento en la Tincin se piensa que es debido a las
diferentes capas superficiales o paredes de las dos bacterias (Tipos
de Clulas).

6) Para que se necesita el aceite de inmersin ?

El aceite de inmersin tiene un indice de refraccin similar al del vidrio (1,5
aprox.) y se utiliza para el objetivo de 100X.

La membrana plasmtica o celular. Es una estructura laminar formada por

fosfolpidos (con cabeza hidroflica y cola hidrofbica) y protenas que engloban a
las clulas, define sus lmites y contribuye a mantener el equilibrio entre el interior
(medio intracelular) y el exterior (medio extracelular) de stas. Adems, se asemeja a
las membranas que delimitan los orgnelos de clulas eucariotas. Tambin delimita la
clula y le da forma.

Funciones de la membrana plasmtica

La funcin bsica de la membrana plasmtica es mantener el medio

intracelular diferenciado del entorno.

Permite a la clula dividir en secciones los distintos organelos y as proteger las

reacciones qumicas que ocurren en cada uno.

Crea una barrera selectivamente permeable en donde solo entran o salen las
sustancias estrictamente necesarias.

Transporta sustancias de un lugar de la membrana a otro, ejemplo,

acumulando sustancias en lugares especificos de la clula que le puedan servir
para su metabolismo.

Percibe y reacciona ante estimulos provocados por sustancias externas

(ligandos).

Media las interacciones que ocurren entre clulas.

FLAGELOS BACTERIANOS
El flagelo bacteriano es una estructura filamentosa que sirve para impulsar la clula
bacteriana. Son finos(20nm) no es posible verlos en el microscopio ptico y
necesita tinciones especificas para que aumenten su dimetro.
Tiene una estructura nica, completamente diferente de los dems sistemas presentes en
otros organismos, como los cilios y flagelos eucariotas, y losflagelos de las arqueas.
Presenta una similitud notable con los sistemas mecnicos artificiales, pues es una
compleja estructura compuesta de varios elementos (piezas) y que rota como una hlice.

MOVIMIENTO FLAGELAR:
Cada flagelo es una estructura semirrgida poco flexible pero es capaz de moverse
por rotacin como una hlice. Estas rotan en su punto de fijacin a revoluciones
similares a las del movimiento flagelar cuando las clulas nadan libremente.
El movimiento del flagelo parte del cuerpo basal que funciona como un motor. La energa
necesaria para la rotacin del flagelo proviene de la fuerza motriz generada por la
gradiente de protones
Este bombeo se produce debido al gradiente de concentracin creado por el metabolismo
de la clula. (En Vibrio hay dos tipos de flagelos, laterales y polares, y algunos son
impulsados por una bomba de iones de sodio en lugar de la bomba de protones). El rotor
puede girar a 6.000-17.000 rpm, pero el filamento por lo general slo alcanza 200-1000
rpm.
Los flagelos no rotan a velocidad constante, sino que la velocidad de rotacin aumenta o
disminuye en funcin de la intensidad de la fuerza motriz de protones.
Las bacterias pueden alcanzar a travs del medio lquido una velocidad de hasta 60
longitudes de clula/segundo. Aunque esto representa slo 0,00017 km/h, al comparar
esta velocidad con la de organismos superiores en trminos de nmero de longitudes del
cuerpo por segundo, es extremadamente rpido. El ms rpido de los animales terrestres,
el guepardo, corre a una velocidad mxima de alrededor de 110 km/h, pero esto
representa slo alrededor de 25 longitudes de cuerpo/segundo. Por tanto, cuando el
tamao se tiene en cuenta, las clulas procariticas que nadan velocidades de 50-60
longitudes de cuerpo/segundo son en realidad mucho ms rpidas que los organismos
ms grandes.
Los movimeintos e los organismos con flagelacin polar y lofotrica son distintos de los que
poseen flagelacin peritrica. Estos ltimos se mueven en lnea recta de manera lenta y
continua. Los que posen flagelos polares se mueven mas rpidamente y dan giros
periodicos.

Un flagelo en biologa es un orgnulo filiforme cuya funcin principal (aunque no nica) suele
ser proveer de movimiento a las clulas. Este orgnulo est presente, aunque con variaciones,
en clulas de arqueas, de procariotas y de eucariotas.

La cpsula bacteriana o glucoclix es una capa que se forma en la parte externa de

la pared de la mayora de las bacterias. Est compuesta por azcares, protege de la
desecacin, del ataque de los anticuerpos del hospedador y de la fagocitosis por los
gbulos blancos, lo que aumenta la virulencia de las bacterias encapsuladas.
funcion Provee, resistencia a la desecacin, resistencia al ataque de clulas fagocticas y
anticuerpos del sistema inmune y contribuye a la fijacin de clulas hospederas
Es la capa o cubierta externa de la bacteria

Fimbrias y Pili | a Contenidos

Los trminos pili y fimbriae usualmente son intercambiables, estos finos
apndices con apariencias de "pelos" estn formados por protenas
llamadas pilinas. En apariencia son mas rgidos que los flagelos y, en algunos
organismos (Escherichia coli y las especies deShigella) estn profusamente
distribuidos en la superficie (hasta 200/clula).
Son considerados factores de colonizacin por su importancia en los
fenmenos de adhesin a la superficie de sus huspedes.
Caractersticas de algunas cepas bacterianas, tales como la Escherichia
coli K12, cepa que posee el factor F (F+, Hrf, del ingles High frecuence
of recombination), son unos pili muy largos (tubos proteicos huecos 0,5 a 10
um de longitud), que intervienen en la "reproduccin sexual" de las bacterias,

(recombinacin).