IDENTIFICACIN DE ACETAMINOFE + CAFEINA, POR MEDIANTE

CROMOTOGRAFIA HPLC

PRESENTADO POR:
CAROLINA GUZMN
XIMENA PAREDES
ANDRS BARRERA

PRESENTADO A:
SERGIO CUERVO

UNIVERSIDAD DE CIENCIAS AMBIENTALES Y APLICADAS

FACULTADAD DE QUIMICA FARMACEUTICA
AREA DE FISICOQUIMICA
2010

METODOLOGIA

VALORACIN DE ACETAMINOFEN Y CAFENA TABLETAS POR HPL

FASE MVIL:
Prepar una mezcla de agua,
metanol y ac.actico
glacial.(69:28:3)

Hacer ajustes si fuera

necesario.

SOLUCIN ESTANDAR INTERNO:

Prepara una solucin de ac.
Bezoico en metanol que
contenga aproximadamente
6 mg por mL.

MEZCLA DE DISOLVENTES:
Preparar une mezcla de
metanol y ac. Actico glacial
(95:5).

SOLUCIN MADRE DEL ESTANDAR:

Disolver cantidades pesadas

con exactitud de ER
Acetaminofen USP y ER
Cafena USP .en mezcla de
de disolventes. Para obtener
una sln de conc.0,25 de
acetaminofen y 0,25 de
cafena.
PREPARACIN DEL ESTANDAR:
Transferir 20 mLde solucin
madre estndar y 3 mL de
sln de estndar interno a un
matraz volumtrico de 50
mL.

Diluir a volumen con mezcla

de disolventes y mezclar .

PREPARACIN DE VALORACIN :
Pesar y reducir a polvo fino
no menos de 10 tab de
acetamonifen y cafena.

Transferir una cantidad de

polvo bien mezclado pesada
con exactitud. Que
equivalga a 250 mg de
acetaminofen a un matraz
volumtrico.de 50 mL.

Agregar aprox. 35 mL de
mvil y agitar
mecnicamente durante 30
minutos.

Diluir a volumen con mezcla

de disolventes y mezclar.

Transferir 2 mL de esta
solucin y 3 mL de la
solucin de estndar interno
a un matraz volumtrico 50
mL, diluir a volumen con
fase mvil y mezclar.

SISTEMA CROMATOGRAFICO:
Equipar el cromatografo con
un detector 275 nm y una
columna de 4,6 mm x 10 cm
rellena con material L1 de 5
m y mantener a 45 1.

La velocidad de flujo 2 mL
por minuto.

El factor de asimetra para el pico

de cada analito no es mayor de 1,2
; la resolucin entre cualquiera de
los picos y STA interno no es menor
de 1,4 y la desviacin estndar
relativa para inyecciones relativas
para inyecciones repetitivas no
mas de 2,0 %.

PROCEDIMIENTO:
Inyectar por separado en el
cromatografo volmenes
iguales (10 L) de
preparacin estndar y de
preparacin de valoracin.
Registrar.

Los tiempos de retencin

relativos son aprox.0,3 para
acetaminofen, 0,5 para
cafena y 1,0 para
ac.benzoico.

Calcular las cantidades de

en mg en la proporcin de
tabletas tomadas.

Cromatografa Lquida de Alta Eficiencia (HPLC)

Qu es Cromatografa Lquida de Alta Eficiencia?

La cromatografa es un mtodo fsico de separacin basado en la distribucin
de los componentes de una mezcla entre dos fases inmiscibles, una fija o
estacionaria y otra mvil. En la cromatografa lquida, la fase mvil es un
lquido que fluye a travs de una columna que contiene a la fase fija.
La cromatografa lquida clsica se lleva a cabo en una columna
generalmente de vidrio, la cual est rellena con la fase fija. Luego de sembrar
la muestra en la parte superior, se hace fluir la fase mvil a travs de la
columna por efecto de la gravedad.
Con el objeto de aumentar la eficiencia en las separaciones, el tamao de las
partculas de fase fija se fue disminuyendo hasta el tamao de los micrones, lo
cual gener la necesidad de utilizar altas presiones para lograr que fluya la
fase mvil. De esta manera, naci la tcnica de cromatografa lquida de alta
resolucin (HPLC), que requiere de instrumental especial que permita trabajar
con las altas presiones requeridas.
Tipos de Cromatografa Lquida:
Cromatografa de Particin.
Cromatografa de Adsorcin
Cromatografa Inica
Cromatografa de Exclusin
Eleccin del Solvente
Caractersticas: Disponible comercialmente
Precio
Pureza y Estabilidad. En la actualidad contamos con
productos de calidad de
pureza cromatogrfica. Bajo contenido de
impuresas.
Disolver la muestra misible con otros solventes para formar mezclas tiles no
degradar o disolver la fase estacionaria.
Tener baja viscosidad para reducir las cadas de presin
Ser compatible con el detector utilizado. Transparencia ptica (cuando se usan
detectores UV) Filtracin y Desgasificacin de solventes

Filtro a la Entrada del Solvente

Mtodos de Filtracin de Solventes en HPLC
Hay tres (3) mtodos comunes que se utilizan hoy para la filtracin previa de
los Solventes en HPLC
En la actualidad HPLC ha llegado a ser una de las Tcnicas del Laboratorio
Moderno ms importantes como herramienta analtica para separar y detectar
compuestos qumicos. Como en todas las tcnicas analticas, los pequeos
problemas a la larga pueden llegar a tener un mayor impacto en la exactitud y
durabilidad del sistema. Aun con la evolucin de los cromatografos lquidos en
la era de la computadora, hay aun problemas que sta no puede resolver.
Hasta los Solventes para HPLC, todos filtrados cuidadosamente en la fbrica,
pueden acumular partculas en suspensin que pueden ser perjudicial a los
componentes del sistema HPLC. Estas partculas en suspensin pueden venir
de varias fuentes, incluso de la exposicin al polvo en el aire durante el
trasegado de solvente en el depsito para solvente, la exposicin a particulares
del aire durante el almacenamiento del solvente en el depsito del solvente, la
degradacin lenta del recipiente solvente, o de condensacin y polimerizacin
del solvente. Las partculas pueden ocasionar costosos daos a la bomba HPLC,
al guarda columnas, y en general causar desgaste del sistema de HPLC. Los
fabricantes de los instrumentos tienen en cuenta este problema y recomiendan
que se filtre y desgasifique los solventes HPLC antes de usarlos.
En el instante que se abre una nueva botella de solvente para HPLC se expone
el interior del solvente a la atmsfera y empieza a acumular gases disueltos
que se encuentran en la atmsfera. El trasegado del solvente en el depsito
solvente y su almacenamiento en estos depsitos ms este fenmeno. El
Oxgeno Disuelto que constituye el 21% de la atmsfera puede producir mayor
interferencia en los detectores de fluorescencia y electroqumicos. El Nitrgeno
Disuelto es el otro componente de la atmsfera que puede producir burbujas
en la columna de HPLC y cuando el solvente entra al detector produce picos
falsos y desviaciones de la lnea base. El Dixido de Carbono disuelto algunas
veces puede ser la causa de los cambios de pH en el sistema de solvente.
*Filtracin al Vaco
* Filtracin en Lnea
*zonificacin
Mtodos de Desgasificacin de Solventes en HPLC
*Existen cuatro(4) mtodos comunes usados para desgasificar solventes en
HPLC previos a su uso:

*Burbujear Helio
*Desgasificacin Electrnica en la Lnea del Flujo
*Desgasificacin al Vaco en Lnea bombas
Requisitos o aspectos ms importantes que debe reunir una bomba o
sistema de bombeo:
*Debe producir presiones estables hasta 6000 psi.
*Mantener el flujo libre de pulsaciones
*Generar intervalos de caudales de flujo (0,1 a 10 ml/min)
*Control y reproducibilidad del flujo de solvente
*Componentes de la bomba resistentes a la corrosin las bombas que se usan
en HPLC se pueden
Clasificar segn su funcionamiento y diseo en:
*Mecnicas
*Recprocantes
*De desplazamiento contnuo o Neumticas
Programacin del Solvente
Existen dos mtodos de programacin de Solvente en HPLC:
* Isocrtico
*Gradiente de Elucin. Es un trmino que se utiliza para describir el proceso
mendiante el cual se cambia la composicin de la fase mvil. Pueden
efectuarse de dos maneras:
*A baja presin
* A alta presin para obtener la mejor resolucin de los componentes de la
muestra en el menor tiempo posible.
Cuando se desarrolla un anlisis usando el mtodo de gradiente se
debe tener presente dos objetivos:
* Asegurar alta precisin y exactitud.
*Determinar la composicin inicial y final del solvente
Para obtener buenos resultados con el mtodo de gradiente debemos
seguir 5 pasos fundamentales:
*Ajustar el tiempo del gradiente
*Determinar la forma del gradiente (lineal, concava o convexa)
*Ajustar la velocidad del flujo para mejorar la resolucin
* Regresar a las condiciones inciales la columna. Sistemas de Inyeccin de
muestra.
Estos sistemas han variados durante la historia del sistema de HPLC, en un
principio de utilizaba la inyeccin de la muestra con jeringas de alta presin
cuales ya estn de desuso. Hoy se utiliza el sistema de Vlvulas inyectoras.

Columnas y Fases Estacionarias

Tipos de Columna:
Fuentes de dao de una columna de HPLC:
* Obstruccin por partculas pequeas en los solventes o fases mviles
* Obstruccin por materiales no eludos en las muestras
* Variacin de las caractersticas de retencin por incremento de materiales no
eludos
Deteccin
La eficiencia de un detector cromatogrfico depende de la relacin entre la
cantidad fsica medida y la composicin del efluente, as como tambin de las
caractersticas de las seal de transferida.
Los tipos de detectores en HPLC se clasifican en:
*Detectores basados en una propiedad de la fase mvi . Ejemplo: Detector de
Indice de Refraccin
* Detectores basados en una propiedad de la sustancia a separar.Ejemplo:
Detector de Fluorescencia.
* Detector ultravioleta Los detectores ms utilizados en HPLC son:
*Detector UV. Hay bsicamente tres tipos:
*Detector de Longitud de Onda Fija
*Detector de Longitud de Onda Variable
*Detector de Arreglo de Diodos
*Detector de ndice de Refraccin. Existen muchos diseos de estos detectores,
pero solamente existen ahora dos tipos Deflexin, Fresnel
o
*Detector de Fluorescencia. Este detector solamente puede detectar
compuestos que tengan fluorescencia nativa o inducida por derivatizacin .
*Detector de Fluorescencia Inducida por Laser
*Segn la Fuente de Excitacin
*segn el sistema ptico
*Detectores Electroqumicos. Pueden ser clasificados en tres tipos:
*Detector Amperomtrico
*Detector Conductimtrico
*Detector Potenciomtrico
Se deben tener algunas precauciones con los detectores
electroqumicos para asegurarse anlisis reproducicbles:

*Chequear que estn conectados adecuadamente a tierra la bomba, el

detector y registrador (integrador.
*Usar bombas reciprocantes de doble pistn
*Mantener en todo momento el flujo de la fase mvil en el detector.
*Operar con el voltaje adecuado
*Monitorear la altura de los picos para observar cambios en la efiencia que nos
indique la necesidad de reacondicionar los electrodos.
*Tener electrodos de referencias extras en solucin 3M de NaOH y reemplazar
el electrodo de referencia en la celda 1 2 veces a la semana.
*Desconectar el detector electroqumico cuando este limpiando las columnas.
* Utilizar agua, buffers y solventes orgnicos de alta pureza. Derivatizacin
Existen dos tendencia :
Pre-Columna
* Post Columna Anlisis Cualitativo y Cuantitativo
Problemas ms comunes encontrados en HPLC
Esta es una lista de los problemas normalmente encontrados en HPLC, sus
posibles causas posibles, y cmo solucionarlos.
*Presin Alta: Posible causa: Obstruccin de la Columna de HPLC o Guarda
Columna por partculas.
*Solucin: Invierta la Columna y Enjuagar con solvente, teniendo la columna
desconectada del detector. Si esto no funciona reemplace el fritado a la
entrada de la columna. Si la presin sigue alta reemplace la columna.
*Solucin a largo plazo: Asegrese que todas las fases mviles se filtren
apropiamente antes que entren a la bomba de HPLC. Tambin filtre todas las
muestras antes de inyectarlas.
*Prdida de la Resolucin Posible causa: Obstruccin de la Columna de HPLC
del Guarda Columna por partculas.
*Solucin: vea la seccin de Presin Alta
*Solucin a largo plazo: Filtrar todo antes que se introduzcan las fases mviles
en el sistema de HPLC.
*Picos Hendidos
*Posible causa: Obstruccin de la Columna de HPLC o del Guarda Columna por
partculas.
*Solucin: Marcha atrs columna roja con presin baja est al lado de abre. Si
es necesario reemplace el fritado de la entrada o la columna.
*Solucin a largo plazo: Filtrar todo antes que se introduzcan las fases mviles
en el sistema de HPLC.

*Variacin en los Tiempos de Retencin. Posible causa: Aire atrapado en la

bomba debido a gases disueltos en fase mvil.
*Solucin: Bomba primera y est fases seguras tan mviles es propiamente
*Solucin a larga plazo: Asegrese fase tan mvil est propiamente y
adecuadamente desgasificada. Si usa desgasificacin electrnica en lnea
asegura esa cadencia del flujo no es demasiado alto para evita completo.
*Variaciones de la Lnea Base. Posible causa: Burbujas del aire atrapados en la
celda del detector debido a una mala desgasificacin de los solventes de la
fase mvil. Solucin: Asegrese que todas las fases mviles estn debidamente
desgasificadas y considerar el uso de un restricto de la presin a toma de
corriente del detector.
*Lnea Base con mucho Ruido. Posible causa: Aire atrapado en celda del
detector o en la bomba. Solucin: Enjuague el sistema y purgue la bomba de
HPLC . Use Solventes desgasificados adecuadamente para mantener constante
la velocidad de flujo de la fase mvil del sistema.
*Picos Falsos (Detectores Electroqumicos y de Fluorescencia) Posible causa:
Oxgeno Disuelto
Solucin: Desgasificar adecuadamente las fases mviles para reducir la
concentracin de oxgeno disuelto.
*Solucin a largo plazo: Agregar un sistema de filtracin al vaco en lnea.
Peridicamente chequear el nivel de oxgeno disuelto.
*Baja Ninguna Presin. Posible causa: Trabajar con bombas, sellos pistones
expuestos por mucho tiempo a partculas en suspensin en la fase mvil.
* Solucin: Reemplace los sellos o pistones, si es necesario. Recomendaciones
para adquirir un sistema de HPLC
Diagrama Bsico de un sistema de HPLC

RESULTADOS:
CROMATOGRAMAS ESTANDAR

CONDICIONES DE CROMOTOGAFICAS:
* FASE MOVIL: metanol y ac.actico glacial.(69:28:3)
*MEZCLA DE DISOLVENTES: Preparar une mezcla de metanol y ac. Actico
glacial (95:5).
*DETECTOR: 275 nm
*COLUMNA: C8, 4,6 mm x 10 cm rellena con material L1 de 5 m
*TEMPERATURA: 45 1.

CROMOTOGRAMA MUESTRA GRUPO 05