Principios en mapas de ligamiento gentico

Taller: Mapas de ligamiento gentico, QTLs, bases de datos y vas

metablicas en Arabidopsis thaliana: del modelo a la prctica
1. Motivacin
Un mapa de ligamiento gentico es la ubicacin fsica de marcadores
moleculares, locus o genes de inters a lo largo del genoma de un organismo.
Dichos mapas son realizadas por medio del anlisis de la frecuencia de
recombinacin de marcadores morfolgicos y/o moleculares entre una
poblacin segregante. Los mapas de ligamiento son un paso previo para
realizar estudios genticos cuantitativos, como lo es el mapeo de QTLs.

2. Objetivo general
Entender el principio, manejar conceptos y software relacionados con mapas
de ligamiento gentico.

3. Objetivos especficos
a) Entender los principios de mapas genticos de ligamiento.
b) Ser capaz de manipular informacin proveniente de marcadores
moleculares y realizar un mapa de ligamiento.
c) Familiarizarse con software para hacer mapas de ligamiento.

Prctica I: Ligamiento entre dos marcadores moleculares

Por medio de una prueba de Chi-cuadrado (X2) y de la estimacin de la
frecuencia de recombinacin, es posible determinar si dos marcadores
(moleculares o morfolgicos) se encuentran ligados. Griffiths et al. (2008)
presentan el siguiente ejemplo, en el cual se tienen dos loci A y B. Para
determinar si ambos estn ligados deben cuantificarse la cantidad de individuos

con genotipos recombinantes y la cantidad de individuos con genotipos

parentales:

Luego, los anteriores valores deben acomodarse similar a una tabla de punnett,
en donde se deben incluir las sumas de cada fila y columna. Estos van a ser
los valores observados.

Ahora se deben de estimar los valores esperados. El siguiente paso es

determinar los valores esperados entre cada una de las formas parentales y
recombinantes. El siguiente ejemplo es para determinar los valores esperados
entre A y B:

Una vez que se han estimado los valores esperados, se procede a estimar la
prueba de chi-cuadrado la cual est determinada por la siguiente frmula:

De los datos del ejemplo anterior la tabla de X2 sera la siguiente:

La

hiptesis

nula

para

esta

prueba

sera

que

los

loci

segregan

independientemente; la hiptesis alterna, que los marcadores se encuentran

ligados. En este caso el valor de la prueba de X2 es de 4.97, valores arriba de
3.84 (proveniente de tabla de valores crticos de X2) rechazan la hiptesis nula,
indicando que los marcados se encuentran ligados (a una p < 0.05, grados de
libertad = 1).
Adems de realizar la prueba de X2 es relevante tomar en cuenta el valor de
frecuencia de recombinacin (FR), el cual se obtiene de la siguiente manera:
FR = Nmero de individuos recombinantes / Nmero de individuos totales

Tericamente se dice que un valor de FR menor de 50 significa que los

marcadores se encuentran ligados, pero en la prctica, dicho valor tiende a ser
menor. Se puede decir que dos marcadores se encuentran ligados cuando
presentan una frecuencia de recombinacin menor a 40. En el ejemplo anterior,
el valor es de 45 cM, lo cual da ms evidencia del ligamiento entre los loci A y
B.

Ejercicio. Abra el archivo de excel Mapas de ligamiento y dirjase a la hoja de

clculo GAPB. Ah usted va a encontrar el resultado de dos marcadores
moleculares tipo CAPS evaluado en 30 individuos (provenientes de la
poblacin F8 LerCvi): GAPB A y GAPB B. P1. Estn ligados ambos
marcadores? Recuerde que el primer paso es determinar los polimorfismos
entre la poblacin segregante, para esto asigne valores de A B dependiendo
del tipo de alelo parental que presente cada individuo. Una vez realizado esto
P2. cuales son los genotipos parentales y cuales los recombinantes? Una vez
realizado esto, usted puede determinar la distancia entre ambos marcadores,
P3. cual es la frecuencia de recombinacin entre ambos marcadores? Ya
tiene datos para saber si los marcadores estn ligados o no, ahora lo que
puede hacer es una prueba de X2 para tener ms evidencia del ligamiento entre
A y B. P4. Cual es el resultado de su prueba de ligamiento? Para revisar su
prueba de X2 puede abrir lo hoja de cculo Conf.chi.

Prctica II. Ligamiento entre marcadores moleculares y marcadores

morfolgicos
Landsberg erecta (Ler) es un ecotipo de arabidopsis que presenta una
mutacin que ocasiona cambios en la densidad de estomas y longitud de la
inflorescencia (Torii et al., 1996, Masle et al., 2005). Al momento de evaluar la
poblacin segregante Ler/Cvi, se encuentran diferencias en la longitud de la
influorescensia de las plantas, de esta manera es posible catalogarlas con
longitud corta o larga, as como se muestra en la siguiente figura:

Er-

Er+

Las plantas que presentan la mutacin (Er-) tienen una influorescensia ms

pequea as como se muestra en la figura anterior. Sera muy relevante saber
en cual cromosoma se encuentra localizada dicha mutacin. Arabidopsis tiene
5 cromosomas. Los siguientes son marcadores moleculares localizados en
cada uno de los cromosomas.
Marcador
EC480C
EG66L
AD108L
CD730C
FD188C

Cromosoma
1
2
3
4
5

Ejercicio. Determine en cual cromosoma se encuentra dicha mutacin. Para

esto abra la hoja de clculo Longitud inflorescensia. All va a encontrar datos de
los marcadores moleculares y tambin del marcador morfolgico longitud de
inflorescencia. P5. Cual marcador molecular se encuentra ligado al carcter
longitud de inflorescencia? Para esto realice pruebas de chi-cuadrado y estime
las frecuencias de recombinacin. Puede ayudarse con la hoja de clculo
Conf.chi. P6. Cual es la distancia gentica entre los dos marcadores ligados?
En la hoja de clculo conf.ligamiento, usted puede encontrar frmulas ms
complejas para confirmar sus resultados rpidamente.

P7. En cual

cromosoma se encuentra el locus responsable del tamao de la inflorescencia?

Ejercicio. Antes de realizar un mapa de ligamiento con el software joinmap,
realice un mapa de ligamiento por medio de inspeccin. Utilice los valores
presentes en la hoja de clculo mapa.inspeccin. P8. Cual es el orden de los
distintos locus?
Prctica III. Software para realizar mapas de ligamiento: uso introductorio
de JoinMap 4
Ahora que ya conoce el principio de ligamiento entre dos marcadores (uno
morfolgico y otra molecular), realice un mapa de ligamiento con datos de 80
marcadores moleculares. Si se hiciera por medio de excel, P9. Cuantas

posibles combinaciones de los marcadores se esperaran? Para esto utilice la

siguiente frmula:
((n1) (n/2))
Es posible realizar el mapa de ligamiento por medio de excel? Realmente s lo
es pero se tardara mucho tiempo y adems sera muy tedioso, es por esto que
se han desarrollado software para crear el mapa de ligamiento. En este caso se
va a utilizar el programa joinmap 4 . Este documento fue elaborado con base
en el manual de dicho software (Van Ooijen, 2006). El manual est disponible
en el siguiente link: http://www.kyazma.nl/index.php/mc.JoinMap/sc.Manual
En el link se puede descargar un programa de prueba. Para ms informacin o
referencias se recomienda visitar el sitio http://www.kyazma.nl/
Procedimiento:
1. Abra el programa el cual se localiza en el escritorio o siguiendo la
siguiente

direccin de Windows: inicio/programas/kyasma/joinmap 4.

Familiarcese con el entorno del programa (figura 1).

Men y barra de herramientas
Pestaas

Panel de navegacin
rbol de navegacin

Barra de estado

Figura 1. Entorno del programa Joinmap 4.

2. Abra en el men o barra de herramientas: File/New project/. Haga una
carpeta en mis documentos y escriba un nombre para el proyecto.
Presione salvar. En la direccin en donde se cre el proyecto tambin va
a aparecer una carpeta llamada nombredelproyecto.jmd. En esta
carpeta se van a almacenar los resultados del programa.

3. En excel abra la hoja de calculo datos.joinmap en donde se encuentran

los datos para realizar el mapa de ligamiento. P10. Cuantos individuos
tiene la poblacin? P11. Cuntos marcadores tiene la poblacin?
4. Volviendo al programa joinmap, abra en el men: dataset/create new
dataset/. En la parte inferior del panel de navegacin indique el nombre
de la poblacin (pop. Name), el nmero de loci/marcadores (Nr. of loci),
el nmero de individuos en la poblacin (Nr. of indiv.) y el tipo de
poblacin (pop. Type). En el caso de lneas recombinantes se debe
poner Rlx y luego se debe poner el nmero de generaciones en la x.
5. Una vez que haya ingresado la informacin va a darse cuenta que se
crea una hoja para ingresar los datos. Por lo tanto vaya al programa de
Excel, copie la informacin de los genotipos y pguela en la hoja de
datos del programa joinmap.
6. Con el fin de sabe si hay errores (generalmente de escritura) en los
datos suministrados abra la siguiente opcin el men: Dataset/highlight
errors. Si hay errores dichos casillas se van a cambiar de blanco a color
rosado. Se debe revisar si se suministr toda la informacin y si hubo
errores al momento de poner los datos en la hoja. Si desea corregir la
informacin oprima el botn F2 del teclado y proceda a editar la casilla.
Repita el procedimiento otra vez y contine con el siguiente paso hasta
que no aparezcan casillas color rosado otra vez. Cuando no hay ms
errores va a aparecer en la barra de estado el siguiente mensaje: no
coding errors detected.
7. Para empezar con el mapeo gentico oprima las siguientes opciones en
el men: Dataset/create population node. Para este momento el rbol de
navegacin se debe observar como en la figura 2.

Figura

2.

Entorno

del

programa Joinmap 4 (el rbol

de navegacin est dentro del
crculo).

8. Ahora se pueden observar una serie de pestaas. La pestaa info nos

da un resumen de los datos. Data es una copia no editable de los
datos. Loci e individuals presenta los loci e individuos de la poblacin;
a la par se puede marcar determinado loci o individuos con el fin de
excluirlos del anlisis (columna con exclude). Hay que recordar que
cada vez que se excluyen datos, se debe realizar el anlisis
nuevamente. La pestaa locus genot. Freq. se utiliza para evaluar si
hay distorsiones en la segregacin; en este momento no hay datos en
esta pestaa, para obtenerlos sigamos con el siguiente paso.
9. Presione el botn para calcular valores

. En los resultados se

presentan valores de la prueba chi-cuadrado para saber si la

segregacin es acorde a los ndices de Mendel. Cuando el valor es
significativo eso significa que hay una distorsin en la segregacin. En la
barra de herramientas hay un botn azul activado

. Al presionar el

botn vamos a encontrar informacin adicional. Hay que tener cuidado al

eliminar valores que indiquen una distorsin en la segregacin, ya que
este es un fenmeno que puede ocurrir en cruces de padres muy
distantes.
10. Para tener una figura de las frecuencias allicas presione el botn para
hacer grficos

(tambin puede seguir los siguientes pasos desde el

men: calculate/create chart). Una vez que aparece una ventana se

pueden graficar las variables deseadas (en la pestaa chart control).
En data to Plot se marcan las variables a graficar; en el lado derecho
de esta ventana se encuentra la opcin show data labels el cual
graficara los valores con los respectivos nombres de los marcadores lo
cual es muy til. En la pestaa chart se puede observar la figura. P12.
Con base en esta tabla, que marcadores excluira del anlisis?
11. Continuando con el anlisis, haga clic en el arbol de navegacin en el
nudo de la poblacin

. Seleccione la pestaa groupings tree (la

tabla est vaca). Presione el botn calcular

. En este momento va a

parecer un nuevo rbol. Para expandir los nudos haga click en cada
ramificacin

. Bsicamente lo que presenta el rbol son grupos de loci

8

que estn ligados unos de otros en un rango de significancia

determinado (por medio de una prueba estadstica). El primer valor se
refiere al valor de la prueba estadstica, el siguiente nmero se refiere al
nmero de grupo de ligamiento (nmero de cromosoma, aunque mucho
cuidado con la asignacin de los mismos ya que no necesariamente es
el cromosoma que el nmero diga), y el ltimo nmero se refiere al
nmero de loci en el grupo. Cuando se hace clic en un determinado
nudo, se puede observar los loci del grupo en la derecha de la pantalla.
12. Hay distintas pruebas estadsticas. Para cambiar la prueba estadstica
haga clic en el men en: options/calculation options. En la pestaa
population se puede observar que la prueba estadstica que se utiliz
es el valor de LOD. Las pruebas son realizadas en distintos rangos
(Threshold ranges). Cambie el start value del LOD score de 2.0 a
0.05 y calcule nuevamente los valores al presionar el botn de calcular
. Como puede observar aparecen ms nudos y de hecho ahora todos
los loci se encuentran en el mismo mapa de ligamiento.
13. Para volver a los valores anteriores presione en el men lo siguiente:
options/calculation options/preset default/ok. Presione el botn de
calcular nuevamente

14. Una vez que se han seleccionado los grupos con los que requiere
trabajar para hacer los mapas de ligamiento, haga clic derecho sobre los
nudos deseados; dichos nudos deben de cambiar a color rojo o rosado
como se muestra en la figura 3.

Figura 3. Entorno del programa Joinmap 4 (las flechas indican el cambio de

color en los nudos).
15. Presione los siguientes botones en el men: population/create groups
using the groupings tree. Ahora en el rbol de navegacin va a aparecer
un nuevo nudo llamado grouping. Este nudo presenta los grupos de
ligamiento creados. Adems se presenta una serie de nuevas pestaas.
Haga clic en la pestaa maximum linkages y presione el botn calcular
. Aqu se puede observar las frecuencias de recombinacin entre los
distintos pares de marcadores. Tambin se muestra el valor LOD. Esto
permite inspeccionar si en los grupos de ligamiento asignados hay
marcadores podran incluirse en un grupo u otro. P13. Eliminara algn
marcador en este paso?
16. Para realizar un mapa de los grupos de ligamiento, seleccione un grupo
al hacer clic una vez con el botn del Mouse izquierdo y oprima el botn
para calcular el mapa

(tambin vaya en men: Group/calculate map).

Una vez realizado esto va a observar en el rbol de navegacin un

nuevo nudo llamado map. En dicho nudo va a aparecer el mapa de
ligamiento realizado. En el nudo mapping puede observar los detalles
de todo el procedimiento realizado para llegar al mapa. P14. Entre
cuales marcadores moleculares se encuentra nuestro locus de inters
longitud de inflorescencia? P15. Podran utilizarse estos marcadores
para seleccionar plantas con influorescencias largas o cortas?
17. Aqu se terminara lo que se denomina first round. Dependiendo de los
datos, as van a necesitarse una o ms rondas hasta llegar a un mapa
de ligamiento gentico. Para construir el mapa los loci son agregados
uno por uno; empezando por los loci ms informativos. Para cada locus
se busca la mejor posicin y adems se determina mediciones para su
bondad de ajuste (ver en las pestaas la opcin mean chisquare
contribs.. Cuando la medicin se reduce mucho o produce valores
negativos, entonces el locus es removido y se empieza a buscar otra
ubicacin.

10

En este punto la prctica ha terminado. Hay muchas ms funciones que el

programa puede hacer. Incluso al instalar la versin de prueba del programa
hay datos demostrativos que permiten realizar otras prcticas. Tambin
recuerde que todos los resultados estn guardados en una carpeta que se
realiz al momento de guardar el proyecto. En dicha carpeta se encuentra el
mapa de los locus y el mapa gentico realizado. Ambos archivos son
necesarios para otros anlisis como el mapeo de QTLs.
JoinMap 4 no es el nico software para realizar mapas genticos. Otros
software son MAPMAKER (Lander et al., 1987) y GMENDEL (Liu y Knapp,
1990). Tambin hay software para editar los mapas de ligamiento o para crear
figuras de los mismos. Uno de estos software es Mapchart; para ms
informacin

consulte

el

siguiente

link:

www.biometris.wur.nl/uk/Software/MapChart.
Gracias al entrecruzamiento es posible determinar la posicin de loci en el
genoma de un individuo. En est prctica aprendi a ligar un carcter, tamao
de la inflorescencia, con un marcador molecular, adems logr realizar un
mapa de ligamiento en el que se encuentra dicho carcter. Dado que tena ms
marcadores moleculares, tambin pudo determinar cual marcador estaba
prximamente ligado al carcter estudiado. Los mapas de ligamiento, entre
varios de sus usos, son el paso previo para realizar mapeo de caracteres
cuantitativos (QTLs), tema que ser abarcado en la prxima prctica.
Literatura
Masle J, Gilmore SR, Farquhar GD (2005) The ERECTA gene regulates plant
transpiration efficiency in Arabidopsis. Nature 436: 866-870
Lander, E. S., Green, P., Abrahamson, J., Barlow, A., Daly, M. J., Lincoln, S. E.,
and Newberg, L. 1987. MAPMAKER: An interactive computer package
for constructing primary genetic linkage maps of experimental and
natural populations. Genomics 1, 174181.
Liu, B. H. and Knapp, S. J. (1990) GMENDEL: a program for Mendelian
segregation and linkage analysis of individual or multiple progeny
populations using log-likelihood ratios. J. Heredity 81, 407.
Torii KU, Mitsukawa N, Oosumi T, Matsuura Y, Yokoyama R, Whittier RF,
Komeda Y (1996) The Arabidopsis ERECTA gene encodes a putative

11

receptor protein kinase with extracellular leucine-rich repeats. Plant Cell

8: 735-746
Van Ooijen, J.W., 2006. JoinMap 4, Software for the calculation of genetic
linkage maps experimental populations. Kyazma B.V., Wageningen,
Netherlands.

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