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NDICE
Pgina
Las prcticas de Bioqumica. Modo de trabajo en el laboratorio
P.1
P.2
13
P.3
18
P.4.
25
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31
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P.6
Ley de Lambert-Beer
La fraccin de luz incidente absorbida por una solucin a una longitud de onda
determinada es proporcional al espesor de la capa absorbente (paso ptico) y a la concentracin
de sustancia absorbente. Estos dos parmetros estn combinados en la ley de Lambert-Beer:
log Io/I = cl
Io: intensidad de la luz incidente.
I: intensidad de la luz transmitida.
El espectrofotmetro
El espectrofotmetro es un aparato que mide la cantidad de luz que pasa a travs de una
solucin. Est compuesto por las siguientes partes:
FUENTE DE ENERGIA: lmpara que emite un haz luminoso que contiene un rango de longitudes
de onda.
MONOCROMADOR: se llama tambin selector de longitud de onda. Consiste en una red de
difraccin que separa las diferentes radiaciones procedentes de la fuente y selecciona la longitud
de onda requerida.
RENDIJA: es un dispositivo que sirve para seleccionar un haz fino de radiacin que ser el que
incida sobre la muestra, evitando que la atraviese la luz difusa.
COMPARTIMENTO DE MUESTRA: en l se coloca la solucin problema, que va a absorber un
haz fino de luz monocromtica.
DETECTOR: es un sistema que transforma la energa luminosa que atraviesa la muestra en
energa elctrica. Posee adems un amplificador de la seal elctrica recibida que posibilita su
medicin posterior.
MEDIDOR: traslada la energa elctrica producida en el paso anterior hasta un galvanmetro de
aguja dnde figuran dos escalas graduadas; una mide la absorbancia y la otra el tanto por ciento
de transmitancia. Cuando se mide la concentracin de una solucin se usa la escala de
absorbancia. Los espectrofotmetros ms modernos dan una lectura digital y algunos incluso
pueden transformarla en concentracin.
En la figura 1 se representa un esquema de un espectrofotmetro bsico.
Fuente
Monocromador Rendija
Cubeta
Detector
Medidor
Prctica 1.
Medida del pH. Titulacin de un aminocido. Preparacin de tampones.
Modelizacin molecular.
Objetivos
-
Lavar la bureta con agua destilada. Llenarla con HCl 1 M hasta el cero de la bureta.
Llevar a cabo la titulacin aadiendo HCl desde la bureta en fracciones de 0.5 ml. Agitar con
una varilla de vidrio despus de cada adicin de HCl.
Anotar en una tabla el pH y el volumen de cido correspondiente. Aadir cido hasta llegar a
pH 1.5 aproximadamente.
ml HCl
Resultados
1.- Representar los valores de pH (eje de ordenadas) frente al volumen de cido aadido (eje de
abscisas) en la titulacin del aminocido.
2.- A partir de la representacin grfica, obtener los valores aproximados de pKa del aminocido y
el punto isoelctrico (pI).
3.- Indicar cual pKa corresponde al grupo amino y cual al carboxlico.
4.- Escribir las formas de disociacin de la glicina (las estructuras) e indicar qu carga presentar
el aminocido al pH inicial de la titulacin, al pH igual al pI y al pH final.
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Enlaces
Los elementos constituyentes de los aminocidos estn unidos por enlaces covalentes.
Para representar estos enlaces se usarn varillas de color verde.
Elementos
Color
Hidrgeno
Carbono
Nitrgeno
Oxgeno
Azufre
H
C
N
O
S
BLANCO
NEGRO
AZUL
ROJO
AMARILLO
Longitudes de enlace
La escala que se utiliza es 100 picometros =3 cm.
C - H, O - H , N - H
2.0 cm
C=O
2.5 cm
C=C
3.0 cm
C - C, C - N , C - O
3.5 cm
Formas D o L
Busca el C asimtrico, con el H hacia ti
Mira el orden de los sustituyentes en el
sentido de las agujas del reloj:
Aminocidos estndar
COO--R-NH3+.........forma L
COO--NH3+-R..........forma D
Frmulas de perspectiva
COOforma L
H3N
R
COOforma D
H
NH3
11
Resultados
1. Identificacin de aminocidos:
Nombre, forma D o L, dibujar la estructura (con el estado de ionizacin), indicar a que pH
se encuentra (al del pI, por encima o por debajo)
2. Construir un aminocido. Cada pareja har el mismo aminocido, uno el D y otro el L,
y comparar los enantimeros.
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Prctica 2. Determinacin
espectrofotomtricos.
cuantitativa
de
protenas
por
mtodos
Objetivos
-
Introduccin
La sangre est formada por una solucin acuosa que contiene molculas de tamao
variable y diversos tipos de elementos celulares. Los elementos formes de la sangre se
encuentran en suspensin en una solucin acuosa denominada plasma. Aunque el plasma es el
medio natural de las clulas sanguneas, la mayora de las determinaciones qumicas se hacen en
suero. Las protenas del plasma pueden clasificarse en dos grupos: las que son sintetizadas por
el hgado (albmina) y las inmunoglobulinas (producidas por las clulas plasmticas de la mdula
sea). El plasma humano tiene una concentracin en protenas de 60-80 g/L (frecuentemente se
expresa en g/dL; 6-8 g/dl). Casi la mitad de esta protena plasmtica es albmina, cuyo rango de
concentracin es 35-45 g/L. Es una protena de 62.000 D que acta como protena de reserva,
adems de importante transportador (cidos grasos, bilirrubina y frmacos) y regulador osmtico.
Es producida por el hgado. Su concentracin aumenta en casos de deshidratacin y disminuye
en casos de ascitis/edema, y dao heptico severo.
La determinacin de la concentracin de protenas en sangre puede ser llevada a cabo
por diferentes mtodos. En esta prctica vamos a utilizar dos de los mtodos que se utilizan con
mas frecuencia: Biuret y Bradford. Los dos mtodos tienen en comn que la disolucin de
protena se mezcla con algn reactivo que determina que aparezca o se intensifique un color
(azul) que se cuantifica midiendo la absorbancia a una determinada longitud de onda frente a un
blanco de reactivo. El color generado es poco estable y depende de las condiciones de reaccin,
por lo que hay que realizar una curva patrn con soluciones de una protena de concentracin
conocida (albmina bovina).
La base terica de la aplicacin de la espectrofotometria para medir la concentracin de
una sustancia en solucin y las instrucciones para el uso del Espectrofotmetro Spectronic se
encuentra en la Introduccin de este Manual de Practicas (pginas 5-7)
Materiales
-Soluciones de suero sanguneo A y B de concentracin desconocida.
-Soluciones de protena patrn (albmina de suero bovina) de concentraciones conocidas
-Reactivo de Bradford
-Reactivo de Biuret
-Pipetas
-Tubos
-Agitadores
-Rotulador
-Espectrofotmetros (Colormetros)
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Mtodo
1)
Numerar 7 tubos
2)
Aadir al tubo
"
"
"
"
"
2
3
4
5
6
7
100
"
"
"
"
"
"
"
"
"
"
l de solucin de protena
l "
"
"
"
l "
"
"
"
l "
"
"
"
l "
"
"
"
l "
"
"
"
3)
4)
4)
20 g/L
40 g/L
60 g/L
80 g/L
problema A
problema B
Esperar 5 min. para que se desarrolle el color. Medir la absorbancia a 550 nm ajustando a
cero con el tubo 1 ( blanco).
Resultados
- En una hoja de papel milimetrado construir una grfica de A550 (eje y) frente a concentracin de
protena (eje x) de las soluciones patrn (tubos 2-5). Marcar el eje de las x en g/l de protena.
USAR LA MITAD SUPERIOR DE LA HOJA, DEJANDO LA OTRA MITAD PARA LA PARTE DE
BRADFORD
- Determinar la concentracin de las soluciones problema A y B interpolando en la grfica patrn
los valores de las soluciones problema A y B. Expresarlo en g/L
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Mtodo
Diluir las soluciones patrn y problema 200 veces. Para ello:
1) Aadir 4 ml de agua destilada a seis tubos
2) Tomar 20 l de cada solucin patrn (20-80 g/L) y problema (A y B) y pasarlos a los tubos
con 4 ml de agua. Mezclar bien. As quedan diluidos 200 veces. Marcar los nuevos tubos as:
20 g/l (1:200), 40 g/l (1:200) etc.
Reaccin de Bradford:
3) Numerar 7 tubos limpios
4) Aadir al tubo
"
"
"
"
"
"
1
2
3
4
5
6
7
15
16
17
Prctica 3.
Actividad enzimtica: Fosfatasa alcalina.
Introduccin
Los enzimas son los catalizadores de las reacciones bioqumicas. La medida de la
actividad de un enzima y la comprensin de las variables que la afectan es importante no slo
para entender la biologa de la clula sino tambin para el diagnstico clnico. Cuando se
producen lesiones celulares como inflamacin o necrosis de los tejidos, ciertas enzimas pasan al
plasma y sus niveles en l aumentan. Estos niveles enzimticos en plasma se analizan para
detectar la enfermedad y llegar al diagnstico diferencial. Una concentracin anormalmente alta
de una enzima en sangre (reflejada en una alta actividad enzimtica) puede ser debida a la
destruccin de clulas de un tejido rico en dicho enzima o al aumento de clulas como ocurre en
tumores. Por el contrario una baja actividad enzimtica puede indicar un trastorno del tejido en
cuestin. Los niveles enzimticos tambin son tiles para vigilar el curso del tratamiento. Por
tanto, la enzimologa clnica es un aspecto fundamental del laboratorio clnico.
En esta prctica, emplearemos el enzima fosfatasa alcalina como modelo. Las fosfatasas
alcalinas son un grupo de enzimas que presentan su mxima actividad a pH 9-10,5 y catalizan la
hidrlisis de steres monofosfatos. La reaccin enzimtica general de la fosfatasa alcalina es:
H2O
+ R-PO4H2-
R-OH
+ PO4H2
Las fosfatasas alcalinas son isoenzimas que catalizan la misma reaccin aunque poseen
propiedades diferentes. Se encuentran ampliamente distribuidas en los tejidos humanos tales
cono hueso, placenta, intestino, bazo y rin y se desconoce su funcin biolgica precisa. Los
niveles de fosfatasa alcalina en plasma son la suma de los isoenzimas procedentes de los
distintos rganos. Los valores normales de actividad fosfatasa alcalina en plasma son de 30 a
100U/L (moles/min/L de suero). El aumento de actividad fosfatasa alcalina en plasma se observa
en diversas afecciones y su significado clnico se relaciona principalmente con la deteccin de
enfermedades seas (tumores seos, osteomalacias) y hepticas (obstruccin biliar, cncer)
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Descripcin de la prctica
En la presente prctica se usar suero humano como fuente de fosfatasa alcalina. La
actividad enzimtica se medir utilizando el p-nitrofenil-fosfato (p-NFF) como sustrato. Por accin
del enzima ste se hidroliza a fosfato y p-nitrofenol (pNF) segn la siguiente reaccin:
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Recta patrn
20
2
1
200
0
2
1
150
50
2
1
100
100
2
1
50
150
2
1
0
200
(ml)
(ml)
(l)
(l)
- Al aadir el suero (que contiene la enzima), poner los tubos en un bao de hielo.
- Mezclar bien e incubar 5 min a 37 C.
- Aadir 0,3 ml NaOH 0,2N para parar la reaccin.
- Volver a mezclar para homogeneizar. Secar los tubos por fuera.
- Ajustar el "cero" del spectronic con el tubo 1 y medir la A400 en todos los tubos, anotando los
valores obtenidos.
100
A400nm
nmoles pNF
(V) nmoles/min
nmoles/min./ml=
= U/L
21
150
200 l
22
T Tris pH 9,6
Agua destilada
PNFP (conc. mM)
Suero
2,1
1
--0,1
2,1
--1(1)
0,1
2,1
--1(2,5)
0,1
2,1
--1(5,0)
0,1
2,1
--1(7,0)
0,1
2,1
--1(10)
0,1
(ml)
Resultados.
9.- Calcular la velocidad inicial (V) en cada tubo en nmoles p-N-fenol/min.
10.- Representar velocidad (ordenadas) frente a concentracin de sustrato (abscisas).
11.- Representar 1/V frente a 1/S (representacin de Lineweaver-Burk).
12.- Calcular la Km y Vmax. Cules son sus unidades?
[S]
2,5
A400nm
nmoles pNF
V (nmoles/min.)
1/S
1/V
23
10 mM
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Prctica 4.
Extraccin de DNA plasmdico y digestin con enonucleasas de restriccin.
Introduccin
Los plsmidos son elementos genticos extracromosmicos que se encuentran en
muchas bacterias. En general son capaces de replicar por s mismos, sin precisar de las funciones
de replicacin cromosmicas. Muchos de ellos contienen genes que confieren a la bacteria
propiedades que aumentan sus posibilidades de supervivencia (resistencia a antibiticos,
degradacin de sustancias orgnicas, toxinas, etc.)
Los plsmidos naturales han sido adaptados para ser utilizados como vectores de clonaje
en Ingenieria Gentica. Hoy en da se conocen varios mtodos para la obtencin de DNA
plasmdico de gran pureza. Un mtodo estndar rpido comprende cuatro etapas:
(a) Cultivo bacteriano. Este se lleva a cabo a partir de una estirpe bacteriana que contiene un
plsmido de resistencia a antibiticos cultivndolo en un medio rico suplementado con los
antibiticos frente a los que el plsmido confiere resistencia.
(b) Lisis celular. Tras recoger las bacterias por centrifugacin estas se tratan con lisozima que
digiere la pared celular formando protoplastos. Los protoplastos se lisan con un detergente inico,
como el SDS, que libera principalmente el DNA plasmdico y tambin parte del DNA cromosmico,
quedando la mayor parte de este unido a la membrana celular. Durante este proceso el DNA
cromosmico es fragmentado mientras que el DNA plasmdico permanece intacto debido a su
pequeo tamao. El detergente SDS forma tambin complejos con las protenas presentes en el
extracto.
(c) Desnaturalizacin del DNA. Generalmente la etapa del SDS se lleva a cabo en presencia de
concentraciones de NaOH suficientemente altas para llevar el pH a 12,0-12,5.En estas
condiciones las largas molculas lineales de DNA se desnaturalizan de modo irreversible, debido
a los pKs de los grupos cargados implicados en la formacin de enlaces de hidrgeno de la doble
hlice, dando lugar a DNA de cadena sencilla. Por otra parte, el DNA plasmdico se desnaturaliza
solo parcialmente debido a su forma circular, mantenindose las dos cadenas juntas.
(d) Renaturalizacin del DNA. Si el pH desciende a pH 5,0 con alta concentracin de acetato
sdico, el DNA cromosmico se renaturaliza al azar dando lugar a un precipitado insoluble. El
plsmido se renaturaliza tambin, pero en este caso ambas cadenas se complementan
adecuadamente mantenindose el plsmido soluble. Al mismo tiempo, la elevada concentracin
de acetato sdico precipita el DNA cromosmico unido a la membrana celular, los complejos SDSprotena y el RNA de elevado peso molecular. Tras la centrifugacin, solo el DNA plasmdico y el
RNA de bajo peso molecular permanecen en el sobrenadante (hay que precisar que una pequea
cantidad de DNA cromosmico permanecer siempre en el sobrenadante). El RNA contaminante
se elimina fcilmente por digestin con RNAsa.
Finalmente el plsmido se analiza por electroforesis en agarosa, en paralelo con un
standard de marcadores de peso molecular. Esta etapa permite determinar la pureza y la cantidad
de plsmido obtenido en base a la relacin de intensidades de fluorescencia debidas al bromuro
de etidio, entre el DNA plasmdico obtenido y el standard de peso molecular. El bromuro de etidio
es un colorante especfico de los cidos nucleicos que se intercala entre sus bases apareadas.
25
Materiales
Plsmidos y bacterias. Los plsmidos utilizados en esta prctica se denominan pUC19 y pUC19choB.Los dos contienen un gen de resistencia a ampicilina y sitios de restriccin nicos para las
endonucleasas EcoR1 y HindIII. Los dos plsmidos se propagan en la estirpe de E.coli DH5.
Medio de cultivo Se utiliza el medio L-broth (triptona 1%,extracto de levadura 0.5%;ClNa 1%
ajustado a pH 7,0 con NaOH). Este medio se suplementa con ampicilina (50g/ml) tras ser
autoclavado
Reactivos
- Solucin de Lisis I: glucosa 50 mM, Tris-ClH pH 8.0 25 mM EDTA,10 mM, lisozima 2 mg/ml.
- Solucin de Lisis II: NaOH 0.2 M,SDS 1%.
- Solucin de lisis III: acetato potsico 3 M pH=5.5.
- TE buffer:10 mM Tris-ClH pH 8.0 conteniendo 1 mM EDTA.
- Tampn de electroforesis (TBE):89 mM Tris, pH 8.3, 89 mM cido brico, 2 mM EDTA.
- Tampn de carga: 0.25% azul de bromofenol,0.25% cyanol xileno,30% glicerol en 6X TBE.
- Tampones de restriccin : Tampn M (10X): 500 mM NaCl, 100 mM Cl2Mg, 100mM Tris-ClH, pH
8.0,10 mM ditiothreitol. Tampn H (10X): 1M NaCl,100 mM MgCl2,500 mM Tris-ClH pH 8.0,10 mM
ditiothreitol.
Todas estas soluciones deben ser autoclavadas durante 20 min. a 120C.
-RNAsa: RNAsaA a concentracin 10 mg/ml en Tris-ClH 10 mM pH 8.0 conteniendo 100 mM
NaCl. Hervir 10 min. a 100C y enfriar a temperatura ambiente para destruir la actividad DNAsa
contaminante.
26
Mtodo
(a) Lisis celular
- Resuspender el precipitado de bacterias del tubo Eppendorff en 200 l de solucin de lsis I y
ponerlo en hielo 5 minutos.
(b) Desnaturalizacin del DNA
- Aadir 400 l de solucin de lisis II, mezclar bien y dejar en hielo 5 min.
- Aadir 300 l de solucin de lisis III, mezclar bien y dejar en hielo 5 min.
- Centrifugar 5 min. a 14.000 rpm. Recoger el sobrenadante en un tubo nuevo. En este
sobrenadante se encuentra el DNA plasmdico y parte del tRNA.
(c) Precipitacin del DNA
- Recoger en un tubo limpio 800 l del lquido sobrenadante.
- Aadir 0.5 ml de isopropanol, mezclar y dejar precipitar 2 min. a temperatura ambiente.
- Centrifugar 5 min. a 14.000 rpm. Tirar el sobrenadante.
- Dejar secar el precipitado
- Resuspender en 50 l de TE ( o TE con RNAsa).
- Pipetear en un tubo: 10 l agua + 5 l DNA + 5 l tampn de carga. (Muestra A)
(d) Digestin de DNA con endonucleasas de restriccin
- Pipetear en un tubo: 15 l de agua + 2l de tampn de reaccin + 3 l de DNA + l l de EcoRI.
Condiciones de reaccin: 1 h a 37C.
Cuando termine la reaccin aadir 5 l de tampn de carga. (Muestra B).
27
Resultados
1.- Obtener una fotografa del gel mostrando los patrones de Pm, el DNA plasmdico sin digerir y
digerido con EcoRI.
2.- A partir de la fotografa anterior calcular y sealar el tamao molecular de los fragmentos de
restriccin.
28
29
30
Prctica 5.
VALORACIN DE LA DIABETES: DETERMINACIN DE LA GLUCEMIA Y HEMOGLOBINAS
GLUCOSILADAS
Introduccin general
El mantenimiento de la glucemia, o concentracin plasmtica de glucosa, en los
organismos superiores es fundamental para el funcionamiento de todos los rganos, al ser la
glucosa un metabolito energtico principal. La coordinacin de los procesos metablicos
implicados en este cometido se lleva a cabo por la relacin insulina/glucagn. La ingestin de
glucosa va seguida, en las personas sanas, por un aumento de la glucosa en sangre. Este
aumento origina la puesta en marcha del mecanismo regulador: aumento de la utilizacin de
glucosa, aceleracin de la glucogenognesis y disminucin de la glucogenlisis; todo ello ocurre
principalmente mediante la secrecin de insulina, hormona pancretica de tipo polipeptdico. En el
caso de que la produccin de insulina est disminuida, la glucosa no puede ser utilizada por las
clulas, lo cual ocasiona niveles elevados de glucosa en sangre (hiperglucemia); as ocurre en las
personas que sufren diabetes del tipo denominado "dependiente de insulina" o "tipo 1".
El diagnstico de la diabetes dependiente de insulina se basa en antecedentes, sntomas
clnicos y comprobacin de una hiperglucemia significativa. Los valores de referencia en humanos
son de 60-110 mg/dl de glucosa en plasma en individuos sanos. Las determinaciones de glucemia
basal permiten el diagnstico de la diabetes, pero constituyen valores puntuales y aislados en el
tiempo que no reflejan los niveles medios de glucemia ni la duracin de la misma. Por lo tanto, es
necesario disponer de pruebas que indiquen el grado del control metablico de la enfermedad a
corto y medio plazo. Estas pruebas estn basadas en el fenmeno de unin de la glucosa a
diversas protenas albmina, colgeno, hemoglobina, etc. Esta glucosilacin tiene lugar por una
reaccin no enzimtica. La intensidad de la glucosilacin depende de varios factores, siendo los
ms importantes los niveles medios de glucemia, la duracin de la hiperglucemia, la vida media de
las protenas y la concentracin de stas. Como consecuencia, la medida de la glucosilacin
proteica constituye un buen marcador bioqumico del grado de compensacin del enfermo
diabtico.
El objetivo de esta prctica es la valoracin de la diabetes mediante la determinacin de
los niveles de glucosa en plasma y de hemoglobinas glucosiladas. Como modelo se emplearn
ratas diabticas, en comparacin con ratas control. La diabetes en la rata se provoca mediante
una nica inyeccin intraperitoneal de estreptozotocina (45 mg/Kg de peso). La estreptozotocina
acta provocando la destruccin de los islotes del pncreas, por lo que ocasiona una diabetes
de tipo 1 o dependiente de insulina.
Parte A
DETERMINACIN DE LA CONCENTRACIN DE GLUCOSA EN PLASMA
Descripcin de la prctica
En esta prctica se utilizar el mtodo de la glucosa oxidasa y peroxidasa (GOD-POD)
para medir los niveles de glucosa sangunea de ratas diabticas y controles. En el mtodo GODPOD, en un primer paso la glucosa oxidasa cataliza la oxidacin de la D-glucosa a cido
D-glucnico con formacin de perxido de hidrgeno. ste es utilizado por la peroxidasa para
oxidar a la 4-aminofenazona y al fenol, dando lugar a una quinonaimina coloreada. La intensidad
de color ser proporcional a la concentracin de glucosa presente inicialmente.
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cido glucnico
HO
-gluconolactona
O
OH
HO
OH
OH
H2C
OH
O2, H2O
OH
HO
OH
HO
OH
OH
OH
glucosa oxidasa
H2O2
H2C
4-aminofenazona
(4-aminoantipirina)
NH2
OH
CH3
peroxidasa
N
O
Materiales
4 H2O
CH3
OH
quinonaimina
2 H2O2
CH2
fenol
H3C
N
OH
6 tubos de ensayo
Pipetas automticas
Colormetro
Disolucin patrn de glucosa 0,4 g/l
Disolucin de coloracin que contiene:
Glucosa oxidasa
Peroxidasa
4-Aminofenazona
Fenol
Tampn Tris pH 7,4
Plasma de ratas normales y/o diabticas
32
Procedimiento experimental
1.- Preparar la recta patrn con la disolucin patrn de glucosa y el correspondiente volumen de
agua hasta un total de 200 l, como se indica en la tabla.
2.- En otro tubo mezclar 10l de plasma + 190l de agua (tabla).
Tubo
n
Patrn Glucosa
(0,4 g/l)
Agua
destilada
Solucin
GOD-POD
1
2
3
4
5
0 l
25 l
50 l
100 l
200 l
200 l
175 l
150 l
100 l
0 l
2 ml
2 ml
2 ml
2 ml
2 ml
Tubo
Plasma
n
6
10 l
Agua
Solucin
GOD-POD
190l
2ml
Absorb.
505nm
g de
Glucosa
Absorbancia
505nm
g de
Glucosa
Conc.Glucosa Conc.Glucosa
g/l plasma mg/dl plasma
33
34
Parte B
DETERMINACIN DE HEMOGLOBINAS GLUCOSILADAS
Descripcin de la prctica
El control de la diabetes no se valora solamente por el control glucmico, sino que hay
otra serie de parmetros, como la Hemoglobina Glucosilada (Hb A1c), que indican el grado de
control que, a largo plazo, ha mantenido el paciente diabtico.
La hemoglobina (Hb) de los seres humanos adultos est constituida principalmente por:
Hb A (97% del total), Hb A2 (2,5%) y Hb F (0,5%). La Hb A est constituida por 4 cadenas
polipeptdicas: 2 globinas y 2 globinas . La hemoglobina glucosilada es una fraccin de la
hemoglobina A normal del adulto, que tiene la propiedad de unir, de forma irreversible, cantidades
de glucosa proporcionales a la concentracin glucmica. Al conjunto de todas ellas se les
denomina hemoglobina A1 o hemoglobina glucosilada. Dentro de la hemoglobina A1 se pueden
separar varias fracciones, HbA1a, HbA1b y Hb A1c, siendo la de mayor inters y la que se
encuentra en un porcentaje ms elevado la Hb A1c, que es la que se encuentra unida a la glucosa
de manera ms especfica.
La Hb A1c es el resultado de la glucosilacin de la hemoglobina normal (Hb A), como
consecuencia de la reaccin no enzimtica entre la glucosa presente en el plasma y los grupos
amino de la hemoglobina, como se muestra en la figura. La unin de glucosa a la valina N-terminal
de las cadenas de la HbA da lugar a la Hb A1c, que es la ms abundante de las HbA1
(aproximadamente el 80%).
HN-Val-HbA
H3N-Val-HbA
HbA+
Hemoglobina NO
glucosilada
HbA1c
Glucosa
Hemoglobina
glucosilada
35
base a las diferencia en sus cargas elctricas. Al tener su grupo amino sustituido con glucosa (NH-R), la hemoglobina Hb A1c posee menos carga positiva que la Hb A no glucosilada, cuyo
grupo -NH2 intacto se puede protonar a -NH3+; como consecuencia, la HbA1c es menos retenida
que la Hb A y eluye con la disolucin de lavado (Tampn fosfato). Empleando despus un medio
de mayor fuerza inica (NaCl) se consigue liberar la interaccin de la resina con la Hb A y as se
recupera sta.
Materiales
-
3 tubos de ensayo largos de vidrio (para soportar las columnas y recoger los eluatos)
Pipetas automticas
Columna con resina de intercambio catinico (polmero acrlico con grupos carboxilato)
Colormetro
Disolucin hemolizante
o Biftalato potsico 50mmol/L y detergente, pH 5.0
Disolucin de lavado
o Tampn fosfato 72 mmol/L pH 6.4
Disolucin de elucin
o Cloruro sdico 1 M
Sangre completa de ratas normales o diabticas (con heparina o EDTA)
Procedimiento experimental
1. Preparacin del hemolizado (nota: este hemolizado se proporciona ya preparado al alumno)
Se prepara un hemolizado (ruptura de los hemates) mezclando la sangre total con la disolucin
hemolizante:
SANGRE
DISOLUCIN HEMOLIZANTE
50 l sangre normal
200 l
50 l sangre de diabtico
200 l
Agitar y dejar a temperatura ambiente durante 10-15 minutos para que se produzca la lisis.
Este hemolizado se pasar por una microcolumna en donde las hemoglobinas son retenidas
por una resina de intercambio catinico.
2. Preparacin de las columnas:
Dar vuelta a las columnas y mantenerlas con el tapn hacia abajo durante 10 minutos
Colocar la columna sobre un tubo largo de vidrio
Retirar los tapones superior e inferior de la columna. Bajar el disco superior hasta el nivel
de la resina, evitando comprimirla, con ayuda del extremo plano de una pipeta. Dejar
gotear justo hasta que veamos desaparecer el lquido en la parte superior de la columna
(alcanza la superficie de la resina) desechando el eluido.
No dejar que se seque la columna
3. Fraccionamiento de las hemoglobinas
Aplicar cuidadosamente sobre la columna 50 L del hemolizado y dejar que el lquido sea
absorbido completamente (desaparece por la parte superior).
Aadir a la columna 200 l de la solucin de lavado para arrastrar los posibles restos del
hemolizado y dejar que penetren en la columna (desaparece, por la parte superior).
Desechar el eludo.
Se necesitan 2 tubos de vidrio para recoger la hemoglobina glucosilada (HbA1c) y la
normal (HbA). Rotular convenientemente los tubos para no confundirlos como tubo1 y
tubo 2.
3.1. Separacin de la hemoglobina glucosilada HbA1c
Colocar bajo la columna el tubo de vidrio rotulado como tubo 1 para recoger la fraccin de
HbA1c
Aadir a la columna 2 ml de solucin de lavado (tampn fosfato) y dejar que todo el
lquido salga de la columna. Una vez que desaparezca el lquido por la parte superior,
retirar el tubo 1.
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X 100 = % HbA1c
A415 Hb total
Comparar los resultados de hemoglobinas glucosiladas con los de los otros compaeros.
Identificar los valores de hemoglobinas glucosiladas de muestras normales y de diabticos.
6. Completar:
Se ha realizado un cromatografa de .utilizando una resina con grupos con
carga
En el tubo 1 se ha recogido la hemoglobina (Hb), que al tener carga ..
no ha quedado retenida en la columna. Esta carga se debe a la unin de la
.al grupo N-terminal de la .
En el tubo 2 se ha recogido la hemoglobina ..(Hb..), que al tener carga . qued
retenida en la columna.
Con la solucin de elucin (.) hemos desplazado a la hemoglobina..de la resina.
La absorbancia a 415 nm es debida a .
37
38
Prctica 6.
Estudio de una ruta metablica. El ciclo de la urea.
Objetivos
El alumno debe familiarizarse con los procesos experimentales utilizados para la elucidacin de
las rutas metablicas. Estos procesos se aplicarn al estudio del ciclo de la urea.
Introduccin
La urea, CO(NH2)2, es el compuesto mediante el cual los mamferos excretan la mayora del in
amonio producido por el catabolismo de los aminocidos. En la sntesis de urea, que tiene lugar
en el hgado, las fuentes inmediatas de los tomos de nitrgeno son el carbamil fosfato y el cido
asprtico. El carbamil fosfato se sintetiza en la matriz mitocondrial a partir de anhdrido carbnico
y amonaco en una reaccin que requiere ATP. El cido asprtico se forma por una
transaminacin en la que el oxalacetato es el receptor de un grupo amino.
Como puede verse en el esquema de abajo, la formacin de urea es un proceso cclico en el que
que la ornitina tiene un papel anlogo al oxalacetato en el ciclo de los cidos tricarboxlicos, pero a
diferencia del mismo, no se decaboxila en cada ciclo, de modo que la molcula de la ornitina cicla
una y otra vez. El hgado de una persona con dieta normal produce en promedio 25-30 g de urea
al dia, aunque puede variar dependiendo de la abundacia en protean de la dieta. La uremia es
alrededor de 30 mg/dl.
HEPATOCITO
Carbamil-fosfato
HCO3-Sintetasa I
+
NH4+
Urea
Arginasa
Fumarato
Arg-succinato
liasa
2ATP
Ornitina
Ornitina
Arginina
Carbamil-P
Ornitina
transcarbamilasa
Arginin-Succinato
Argsuccinato
sintetasa
ATP
Citrulina
Citrulina
Aspartato
Mitocondria
Citosol
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En esta prctica el alumno llevar a cabo varios ensayos para tratar de comprobar determinados
aspectos del ciclo de la urea.
Determinacin de urea
Para cuantificar el efecto de los cambios experimentales sobre la actividad del ciclo, se utilizar un
mtodo de medida de la cantidad de urea basado en la reaccin coloreada de la urea en
presencia de ortoftalaldehido (Reactivo 1) en medio cido (cido brico, Reactivo 2). La mezcla
incubada durante 15 minutos a 37 C da una coloracin roja con un mximo de absorcin a una
longitud de onda de 510 nm. Se determinar tambin la concentracin de urea en orina humana.
A 510 nm
Blanco
Patrn 1
Patrn 2
Patrn 3
Patrn 4
Orina diluida 1:10
en agua
moles urea
40
Agua:
0,7, 0,2 o 0,4 ml
Tris 0,1M pH 7,4:
0,6 ml
Ornitina 0,05 M:
0,1 ml
Carbamil fosfato 0,05M: 0,2 ml
Aspartato 0,2 M:
0,2 ml
ATP 0,1 M:
0,2 ml
Arginina 0,05 M:
0,3 ml
Homogenado de hgado: 0,2 ml
TUBO
TUBO
TUBO
TUBO
PROBLEMA 1 PROBLEMA 2 PROBLEMA 3 PROBLEMA 4
Tris pH 7.4
Ornitina 0.05 M
CarbamilP 0.05M
Aspartato 0.2 M
ATP 0.05 M
Arginina 0.05 M
Homogenado
higado.
Agua destilada
A510 nm
moles de urea
1. Incubar los tubos durante 5 minutos a 37C para que tenga lugar las reacciones enzimticas de
sntesis de urea en los tubos problema.2. Aadir los Reactivos 1 y 2 (1 ml de cada uno).
3. Incubar 5 min a 37C para que tenga lugar la reaccin coloreada en presencia de urea.
4. Enfriar los tubos para parar la reaccin (1 min en hielo) y medir la Absorbancia a 510 nm (Secar
los tubos antes de meterlos en el espectrofotmetro). SI es necesario usar el Tubo 1 (blanco) de la
primera parte para hacer el blanco del colormetro
5. Interpolar en la recta patrn y expresar la cantidad de moles de urea producidos en cada tubo
Preguntas
1. Cul es la concentracin de urea en la muestra de orina analizada? (tener en cuenta que se
ha usado 0.1 ml de orina diluda 1/10)
2. Cul es la cantidad de urea presente en el tubo que tiene todos los componentes necesarios
para que se lleve a cabo el ciclo? Qu metabolitos del ciclo NO has aadido?
3. Hay urea en el homogenado de hgado?
4. La generacin de urea es un proceso enzimtico?
5. Es la arginina precursora directa de la urea?
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ESTRUCTURAS
O
H3N+
H2 N
HN
CH2
H2N
CH
CH2
COO-
H2N
Ornitina
+
COO-
CH
H2N
COO-
NH2
CH2
HC
NH2
CH2
COO-
Aspartato
COO-
NH2
C
HN
CH
CH
Citrulina
COOCH2
(Escribir y nombrar
la molcula que falta)
CH2
CH2
Carbamil-fosfato
NH2
CH2
CH2
O-P
Fumarato
CH2
H2N
CH
COO-
Arginina
42
NH2
UREA
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