Electroforesis en gel

Separacin de
protenas

Punto isoelctrico
Peso molecular
Carga elctrica

Protenas:
tratamiento por
agentes reductores
(perdida de
estructuras 2 y 3)

SDS-PAGE: gel de
poliacrilamida
Gel de tampn con
dodecilsulfato
SDS

Condici
n

Paso 1

Paso 2

La membrana escogida se une de forma especifica a

protenas, de lo contrario dificultara la distincin del
complejo antgeno -antgeno que se forma con la
protena que se busca
Se bloquea lugares de unin libres tras la
transferencia
Se incuba la membrana con una solucin de protena
( ASB, leche en polvo, fraccin pequea de
detergente)
Las protenas en solucin se unen a los lugares de la
membrana que no estn ocupados por la
transferencias desde el gel.
El anticuerpo se une al antgeno especfico.

Mtodo en dos pasos

Unin
del

Anticuer
po
primario
Unin del anticuerpo
primario con la protena
buscada (inoculacin
de la protena)

Anticuerpo
secundario
Proceden de animales o
cultivos de hibridomas
(O: animal)
Protenas no
anticuerpos (A y G)

Se elimina el
anticuerpo primario
(lavando la membrana)

expone el anticuerpo
secundario
Reconoce una regin
especfica del A. primario
(detectables, unidos a
biotina, enzimas reporter)

Deteccin
colorimtrica

Deteccin
quimioluminice
nte

Depende de la
incubacin del W.B.
con un sustrato que
reacciona a las E.
Reporter (peroxidasa)

Requiere la incubacin
de la membrana con
un sustrato que emite
luminiscencia al ser
expuesto al reporter
que trae unido el A.
Secundario

Tie la membrana
cerca de la enzima
- Cuantificacin:
1. Densitometra
2. Espectrometra

Pelcula fotogrfica:
capta su luz
Cmaras CCD: dan
una imagen digital del
W.B.
- Densitometra