Iniciamiento del proceso (priming) de respuesta de clulas T CD8+ a los

antgenos del parsito del estadio heptico de malaria

Aunque que el rol de las clulas T CD8+ de memoria especficas para el parsito de malaria en el
control de los estadios extraeritrociticos est bien documentado y generalmente aceptado, el debate
an contina en cuanto a la identidad del sitio anatmico especfico donde se da la activacin de
clulas T patgeno-especficas vrgenes, adems de la contribucin de diferentes clulas presentadoras
de antgenos (APC) en este proceso. Mientras que algunos estudios infieren un rol de APC profesionales
presentes en los ndulos linfoides que drenan los sitios donde el mosquito inyect el parasito, otros
argumentan a favor del hgado como un rgano primario y a los hepatocitos como estimulador de la
respuesta de clulas T patgeno- especficas vrgenes. Esta revisin apunta al anlisis crtico del
conocimiento actual y resalta nuevas lneas de investigacin necesarias para entender la induccin del
sistema inmune protector en contra del parasito de la malaria.
Palabras clave: Plasmodium, malaria, antgenos de estadio heptico, presentacin antignica a clulas
T, clulas detrticas y hepticas como APC
Introduccin:
Es actualmente aceptado que la iniciacin de la
respuesta de linfocitos T CD8+ por clulas
presentadoras de antgeno (APCs) se da en los
rganos linfoides secundarios, como el bazo y los
ndulos linfticos. La microscopa intravital basada
en multi-fotones revela que el primer contacto entre
clulas T patgeno-especficas vrgenes y APC ocurre
en la periferia de los ndulos linfticos drenantes
(DLN) poco tiempo despus de la infeccin y sucede
principalmente en los senos subcapsulares o en las
regiones interfoliculares enriquecidas con antgenos
derivados del patgeno.
Dependiendo de la
naturaleza del patgeno, la rpida relocacin de la
clula T virgen a la periferia del ndulo linftico
drenante puede ser tanto antgeno especfica, como
antgeno independiente, asociado con una
disminucin de los niveles locales de quimiosinas y la
drstica alteracin de la arquitectura del linfonodo
por accin del patgeno. Datos tomados de ratones
infectados con el virus de estomatitis vesicular
demostraron que, aunque los macrfagos CD169+
residentes del seno subcapsular fueron la mayor
poblacin de clulas con antgenos derivados del
virus, fueron las clulas dendriticas (DCs) las
principales APC que inducen las clulas T CD8+
antgeno-especficas. La habilidad de las clulas
dendrticas inmaduras para adquirir antgenos
exgenos seguido del procesamiento proteoltico y la
presentacin en las molculas MHC de clase 1,
comnmente referido como presentacin cruzada,
es considerado como el mayor requerimiento para la
generacin de respuestas primarias de clulas T
CD8+ especficas para patgenos.
Antes del encuentro inicial de clulas T vrgenes con
las APC, son generadas una progenie heterognea de
clulas T CD8+ antgeno-especificas, donde se
incluyen las clulas efectoras de vida corta (SLEC) y
las clulas efectoras precursoras de memoria
(MPEC). Aun no es claro si la diferenciacin en SLEC
o MPEC esta reforzada por la segregacin asimtrica
de factores de transcripcin y protenas de la
maquinaria de degradacin ya desde la primera
divisin celular. O si se refleja la exposicin
diferencial a seales de inflamacin y seales de
ayuda coestimuladoras enviadas desde APC a las
clulas T CD8+ antgeno especificas durante la fase
de expansin.
Mientras que la generacin de
respuestas primarias de clulas T CD8+ a antgenos

no inflamatorios requiere de la ayuda de clulas T

CD4+, la induccin de respuestas primarias de
clulas T CD8+ a Lysteria, LCMV, y virus de la
influenza es independiente de clulas T CD4+ y
resulta de la activacin directa de APC por el
patgeno. Incluso, la ayuda de las clulas T CD4+
puede ser reemplazada por la induccin de CD40 en
las DC, lo que inicia la respuesta de clulas T CD8+
antgeno-especificas vrgenes. Por lo tanto, la
naturaleza exacta y los requerimientos del las seales
de ayuda necesarias para la induccin inicial y
subsecuente expansin de las respuestas primarias
clulas T CD8+ antgenos especficos varia entre los
diferentes patgenos y sitios de infeccin primaria.
En este reporte, nuestro objetivo es el de presentar y
discutir la data publicada referente la activacin de
las clulas T CD8+ en una infeccin de Plasmodium, y
sugiere experimentos para entender mejor el
proceso de presentacin de antgenos.
La infeccin de malaria es iniciada por la mordida del
mosquito hembra Anopheles infectado con
Plasmodium, que busca sangre para suplir el
desarrollo de los huevos. Mientras que el mosquito
explora el ambiente debajo de la piel del hospedero
en busca de algn vaso sanguneo, inyecta protenas
de las glndulas salivales tanto antes como durante
su alimentacin con la sangre para inhibir la
coagulacin sangunea. Los parsitos depositados en
la piel
pueden tambin atravesar clulas
circundantes e ingresar en la circulacin con
subsecuente infeccin de las clulas hepticas.
Estudios realizados con parsitos inyectados por va
intradrmica o intraveosa muestran que la carga
parasitaria en el hgado es similar. Adems, la
transferencia de parsitos desde la piel hacia los DLN
ocurre.
La identificacin del sitio anatmico y el tipo de APC,
que orquesta la induccin de respuestas primarias de
clulas T CD8+ en contra de un antgeno particular,
representa un paso esencial en el diseo de las
estrategias de vacunas basadas en clulas T CD8+.
Mientras que la investigacin de la fase efectora de la
respuesta de clulas T CD8+ contra malaria ha sido
bastante extensa, un numero limitado de los estudios
ha intentado diseccionar el tema de la etapa
especfica del hgado CD8C clulas T cebar el husped
infectado.

Papel De Los rganos Diferentes En Presentacin

De Antgenos
En este respecto, el estudio de Chakravarty et al.
parece ser uno de los ms comprensivos y
sistemticos a la fecha. Los autores concluyeron que
los tejidos linfoides extrahepticos, en particular el
DLN y el bazo son los sitios ms importantes
contribuyendo a la generacin de la piscina efector
de clulas T en el hgado. De acuerdo con estos datos,
Obeid y sus colegas demostraron que la
inmunizacin
estrictamente
subcutnea
con
esporozoitos irradiados condujo a la induccin de
inmunidad estril contra la malaria pre-eritroctica
con la preparacin de clulas T que ocurre en los
ganglios linfticos de drenaje de la piel. Se propuso
que la preparacin de clulas TCD8+ especficas a
parsito depende de la presentacin cruzada de
antgenos de malaria. Esto indica que las APC
profesionales, en lugar de los hepatocitos infectados,
inician la preparacin de clulas T vrgenes CD8+
dirigidas a los antgenos de la etapa heptica.
Varias lneas de evidencia experimental fueron
presentadas en apoyo de estas conclusiones. Por lo
tanto, la produccin de IFN por clulas T
transgnicas vrgenes especficas a protena
circumsporozoite (CSP) adoptivamente transferida
se detect por primera vez en la piel DLN tan
temprano como en el da 2 despus de la
inmunizacin de ratones por microinyeccin o
picaduras de mosquito, mientras no se detect la
activacin de clulas T detectable en otros rganos
incluyendo el bazo. Por lo tanto, Chakravarty y coautores sugieren que estas diferencias temporales en
el inicio de la activacin de las clulas T-parsito
especfico podran reflejar el orden jerrquico de
preparacin de clulas T iniciado en el DLN que
podra ser seguido por la migracin de clulas TCD8+
en preparacin a otros rganos, incluyendo el bazo y
el hgado. Sin embargo, la eliminacin de los ganglios
linfticos que drenan el sitio de inyeccin de
parsitos antes de la transferencia adoptiva de
clulas TCD8+ especficas al parsito, di lugar a una
reduccin del 60% de las clulas TCD8+ activadas en
el hgado, no afect a las frecuencias de clulas
TCD8+ en preparacin en el bazo, donde se
documentaron los primeros signos de activacin de
clulas T slo 24 h ms tarde que en DLN y al mismo
tiempo que el hgado. Esto indican que el uso de las
diferencias temporales en el inicio de la activacin de
las clulas T como un parmetro para identificacin
del sitio de preparacin de clulas T CD8+ debe ser
reconsiderada cuidadosamente en futuros estudios y
fortalecer an ms la importancia del bazo como un
sitio de induccin primaria respuestas de clulas
TCD8+ en modelos animales de la infeccin. Lo
ltimo concuerda con los datos de Sano et al.
demostrando que el bazo de ratones infectados
apoyan la preparacin de las clulas vrgenes TCD8+
especficas al parsito despus de la inyeccin
intravenosa de esporozoitos.
Al mismo tiempo, varias lneas de evidencia
presentadas por Chakravarty y sus colegas no apoyan
firmemente el papel esencial del bazo en la
preparacin de clulas TCD8+ parsito especficas.
En primer lugar, las clulas dendrticas aisladas del
bazo 60 h despus de la inyeccin de esporozoitos

fueron incapaces de provocar la proliferacin de las

clulas T CD8+ especficas al parsito, mientras las
DCs aisladas del DLN inducian la proliferacin de
clulas T y, presumiblemente, presentan el antgeno.
Desde que no se generan datos con DCs residentes
del hgado, un papel directo de APCs intrahepticas
profesionales en la preparacin de clulas TCD8+
especficas al parsito todava debe ser abordado.
Adems, como se detectaron los primeros signos de
la activacin de los linfocitos T especficos del
parsito en DLN en el da 2 despus de la
inmunizacin, no es del todo claro si las DCs de DLN
tenan una mayor capacidad para preparar clulas
TCD8+ en comparacin con el bazo y de hgado de
DCs residente en los puntos de tiempo antes de 60h.
En segundo lugar, los animales sometidos a
linfadenectoma y la esplenectoma simultnea antes
de la transferencia adoptiva de clulas TCD8+
especficas a CSP seguido por la inmunizacin con
esporozoitos y la estimulacin subsiguiente con
parsitos viables 10 das ms tarde tuvo carga
similar de parsitos en el hgado que los ratones no
inmunizados, lo que indica que, el DLN o/y el bazo
son necesarios para la preparacin de las clulas
TCD8+ especficas a CSP. Al mismo tiempo, la
esplenectoma por s sola no afect a la inhibicin de
desarrollo del parsito en el hgado, lo que llev a los
autores a la conclusin, que DLNS son el sitio de
preparacin de las respuestas de clulas T CD8+ de
proteccin.
Curiosamente, como se muestra por Chakravarty y
co-autores, la eliminacin de ambos DLNS y el bazo
antes de la inmunizacin con esporozoitos, aunque
reduce drsticamente la piscina de clulas T
activadas en el hgado, no abroga completamente, lo
que sugiere que al menos una proporcin de clulas
TCD8+ especficas al parsito que se encuentran en el
hgado haban sido preparadas fuera de los DLN y el
bazo. Estos hallazgos podran reflejar el proceso de
activacin de clulas TCD8+ especficas al parsito en
el hgado y definirlo como el rgano esencial para el
desarrollo del parsito. Por otro lado, los animales
tratados con FTY720, un frmaco que inhibe la salida
de linfocitos de los ganglios linfticos, tenan
sustancialmente menos clulas T CD8+ especficas al
parsito productoras de IFN al da 7 despus de la
inyeccin con esporozoitos irradiados. Basndose en
esta observacin, los autores concluyeron que la
distribucin sistmica de las clulas TCD8+, al menos
en parte, contribuye a la piscina intraheptica de las
clulas TCD8+ especficas al parsito. Todava tiene
que ser visto, si el tratamiento con FTY720 inhibe el
desarrollo de clulas TCD8+ tempranamente
preparadas" especficas al parsito en el hgado y el
bazo, sealadas previamente por los autores ya 72h
despus de picadura de mosquito. Adicionalmente, el
efecto de FTY720 en la proteccin de los animales de
la estimulacin subsiguiente con esporozoitos en
vivo tiene que ser abordado en este modelo. Digno de
mencin, el tiempo de activacin de las clulas T
clonales especficas al parasito en los ganglios
linfticos, el hgado y otros rganos se retrasa slo
ligeramente (por 24h), mientras se sabe que las
clulas T activadas salen de los ganglios linfticos 4-5
das despus del encuentro antgeno. Este ltimo
sugiere que o bien la activacin de las clulas T

especficas
al
parsito
puede
suceder
simultneamente en varios rganos, o la salida
inusualmente rpida desde el ndulo linftico
despus de prepararla es una caracterstica
intrnseca de las clulas T en este modelo
experimental especfico.
Rol de los hepatocitos infectados en la
presentacin de antgenos
El rol de los hepatocitos infectados en la preparacin
directa de clulas T CD8+ vrgenes especficas al
parasito es an un tema de controversia. Estudio
temprano por Renia et al. demostr que la inyeccin
intraesplenica de hepatocitos infectados produjo
inmunidad protectora mediada por clulas T contra
infecciones por esporozoitos de Plasmodium yoelii y
P. berghei. Leiriao et al. demostr que hepatocitos
apoptoticos infectados con esporozoitos irradiados
son fagocitados por CDs y solo sirven como fuente de
antgenos de Plasmodium para el inicio de respuestas
inmunes protectoras va preparacin cruzada. En
contraste, Renia y colaboradores argumentaron
contra los hepatocitos infectados apoptoticos como
fuente de antgenos y sugirieron que las clulas
dendrticas del hgado podan ser activadas durante
el ingreso de antgenos de parsitos directamente
desde hepatocitos infectados viables vistos como
anteriormente en otros modelos experimentales. Sin
embargo, los datos de Chakravarty et al. dieron a
entender que, aunque se requiere una preparacin
cruzada, esta tiene lugar en las DLNS y no en el
hgado. De acuerdo con estos datos, Jung et al.
demostraron que en los ratones sometidos a la
deplecin de qumica de CD11c+ las DCs fallaron al
inducir respuestas de clulas T CD8+ a la infeccin
por Plasmodium yoelii. Ninguno de estos estudios
consider los hepatocitos como un subconjunto APC
capaz de iniciar las respuestas tempranas de clulas
T especficos ante parsitos.
Un estudio reciente de Balam et al. se centr en dos
preguntas: pueden los hepatocitos infectados
preparar directamente clulas T vrgenes especficas
a parsitos y si la estimulacin de las clulas T CD8+
ya preparadas pueden proteger a los ratones contra
la propagacin del parsito? La administracin de las
clulas T CD8+ CSP-especficas pero no una clula T
clon irrelevante inyectado en ratones receptores no
coincidentes de MHC de clase I deficientes de TAP,
simultneamente con hepatocitos infectados que
llevan haplotipo relevante de MHC para las clulas T
especficos al parsito, dieron como resultado 100%
de proteccin de los ratones de la estimulacin
subsiguiente con esporozoitos vivos. A medida que la
proteccin observada no era debida a un efecto
espectador o una secrecin de citoquinas continua
por las clulas T CD8 + especficos del parsito, estos
datos demostraron que los hepatocitos infectados
son capaces de presentar el antgeno a las clulas T
CD8 +, reactivar las clulas T + CD8 CSP-especficas
en reposo e inducir la proteccin.
Es importante destacar que ms de 60% de los
ratones BALB/c vrgenes inyectados con hepatocitos
infectados con esporozoitos irradiados tambin
fueron protegidos de la exposicin posterior al
parsito vivo, lo que sugiere que los hepatocitos
infectados podran contribuir a la preparacin de
clulas T vrgenes endgenas. Sin embargo, se

requieren experimentos de reduccin de clulas T

para confirmar que la proteccin es mediada por
clulas T. Por ltimo, para excluir formalmente la
contaminacin con otras APC potencialmente
presentes en las preparaciones de hepatocitos
capaces de presentar CSP y preparar las clulas T
CD8 + vrgenes, el aislamiento de la poblacin de
hepatocitos puros desprovista de clulas que portan
los marcadores de DCs, macrfagos, y clulas
estrelladas debe ser realizado por citometra de flujo
utilizando parsitos transgnicos fluorescentes. Por
otro lado, con el argumento contra el nico papel de
APC profesional en la preparacin de las respuestas
inmunes vrgenes contra parsitos de la malaria, los
ratones sin DCs mediante el tratamiento con
citocromo c todava estaban protegidos de la
propagacin de los esporozoitos vivos a pesar de
frecuencias significativamente ms bajas de clulas T
especficas al parsitos endgenos preparadas por la
inmunizacin con esporozoitos irradiados. Estos
datos no apoyan plenamente el papel discutido
previamente de la funcin de clulas dendrticas en la
induccin temprana de respuestas de clulas T de
etapa especfica en el hgado contra malaria
OTRAS CONSIDERACIONES
La calidad de los hepatocitos como APCs capaces de
desencadenar respuestas de clulas T han sido
diseccionados recientemente por Ma et al. Se ha
demostrado que hepatocitos humanos infectados con
P. berghei y P. falciparum conservan la expresin
inalterada en gran medida de mltiples molculas de
la va de MHC de clase I hasta etapas muy tardas del
desarrollo del parsito. Por otra parte, las clulas
infectadas no mostraron defectos evidentes en la
capacidad de regular positivamente la expresin de
diferentes componentes moleculares de la
maquinaria de MHC de clase I en respuesta a
linfocinas proinflamatorias o desencadenar la
activacin directa de allo-especfica, as como las
clulas TCD8 + especficas de pptido humanas. Al
mismo tiempo, se desconoce si las caractersticas
tpicas en APCs profesionales que se presume son
importantes para el preparamiento de clulas T, por
ejemplo, molculas co-estimulantes B7.1 y B7.2
(seal2) as como la produccin de citoquinas
esenciales para la supervivencia y mantenimiento de
clulas T en preparacin (seal 3) son posedas por
los hepatocitos humanos primarios in-vivo y/o son
inducidos tras la infeccin.
La literatura actual que investiga la habilidad de los
hepatocitos para preparar clulas TCD8+ vrgenes es
escasa. Bertolino et al. demostraron que hepatocitos
murinicos purificados primarios fueron capaces de
inducir la activacin y proliferacin de clulas TCD8+
vrgenes especificas a antgeno in vitro, incluso en
ausencia de citoquinas aadidas de manera exgena
al igual que las molculas co-estimulantes CD80 y
CD86. Ms an, la magnitud de la proliferacin de
clulas T inducidas por hepatocitos primarios fue
comparable a la inducida por CDs. El preparamiento
de clulas T vrgenes por hepatocitos no requiri
ayuda de clulas TCD4+ e indujo la expresin de
marcadores de activacin temprana de clulas T y
actividad efectora transitoria de clulas TCD8+
seguida por la muerte celular rpida de las clulas
activadas. Por ende, los hepatocitos primarios fueron

capaces de preparar clulas T vrgenes pero fueron

incapaces de sostener respuestas productivas
especficas a antgeno de clulas T CD8+. De acuerdo
a esta data, experimentos in vivo usando expresin
endgena de aloantgenos bajo los promotores
especficos a hepatocitos demostraron que la
activacin primaria de clulas T primarias por
hepatocitos como APCs lleva a la apoptosis de la
clula T en vez de a la formacin de clulas T de
memoria. Tambin fue demostrado que las clulas T
activadas por hepatocitos moran por negligencia y
falta de IL-2 y poca expresin de genes prosupervivencia debido a la co-estimulacin
insuficiente en la fase de preparamiento. Por ende,
tomando en cuenta la inhabilidad de los hepatocitos
primarios de proveer co-estimulacin apropiada
durante el preparamiento de clulas T junto con el
microambiente inmunosupresivo creado por
mltiples sublinajes de APCs residentes en el hgado,
puede parecer improbable que los hepatocitos
infectados con malaria jueguen un rol mayor en la
generacin de respuestas efectivas especficas a
parasitos de clulas T de memoria CD8+. Sin
embargo, esto no descarta la posibilidad de que
clulas TCD8+ especficas a antgenos de malaria
puedan ser preparados y activados, al menos a corto
plazo, por hepatocitos contribuyendo al desarrollo de
formas
exo-eritrociticas.
Ciertamente,
con
estimulacin adecuada, tales clulas T pueden ser
rescatadas
hacia
competencia
inmunolgica
completa y supervivencia ms larga. En el caso de
malaria, estmulos de activacin adecuados pueden
ser inducidos por infeccin de Plasmodium
conllevando a la activacin de numerosos genes en
los hepatocitos incluyendo aquellos involucrados en
la inmunidad innata y la presentacin de antgenos.
Dado que no se ha realizado ningn anlisis
transcripcional en clulas de Kupffer travesadas por
esporozoitos, sera importante entender si es que los
macrfagos residentes en el hgado cambian sus
propiedades inmunomoduladoras en el sitio de
infeccin por malaria.
En este punto, una palabra de precaucin debe ser
expresada para el hecho de que todos los estudios
animales discutidos arriba se basaron en una nica
raza de ratones, BALB/c, al igual que una sola epitope
de clula TCD8+derivada del CSP. Futuros estudios
sobre la induccin primaria de respuestas de clulas
T a formas extra eritrociticas de malaria necesitan
ser extendidos a otras epitopes protectivas de clulas
TCD8+ incluyendo respuestas, que aparecen ms
tarde en la etapa heptica usando esporozoitos
atenuados por radiacin (RAS) o genticamente
(GAS) o combinados con cloroquina quimioprofilaxis
(CPS).
Estudios de campo
No es aun claro hasta que punto los modelos
animales que investigan la induccin de respuesta de
clulas T primarias a la malaria, asi como los estudios
humanos que involucran voluntarios vacunados,
reflejan la adquisicin de respuestas naturales de
inmunidad celular en reas endmicas de malaria.
Una adquisicin de proteccin inmune esteril,
seguida de inmunizacin con RAS, GAS o usando
rgimen CPS en animales y humanos contrasta

fuertemente con la situacin en el campo, donde, a

pesar de la frecuente (hasta 30 por mes en algunas
reas) picadura por mosquitos infectados, ninguna
proteccin esteril es obtenida usalmente en tanto
adultos como nios en respuesta a infeccin natural
bajo tratamiento con drogas o tratamiento
preventivo intermitente (IPT). Muchas hiptesis
pueden ser propuestas para explicar esta
discrepancia: (1) La carga de esporozotos (y, como
resultado, el suministro de antigenos del parasito) es
muy baja en el campo comparada con aquella dada
bajo condiciones experimentales ; (2) la regulacin
negativa de respuestas de clulas T CD8+ especificas
para el parasito a travs del contenido de las
glndulas salivarias del mosquito inyectadas junto a
los esporozoitos en el sitio de cebado de clulas T; y
(3) induccin excesiva y/o precedente de respuestas
inmunes a protenas de glndulas salivarias. Con
respecto a lo ltimo, dado el hecho de que solo una
fraccin (0-25% dependiendo de la estacin y
localizacin) de mosquitos esta infectada, un pool de
clulas T memoria especificas para antgenos de la
glndula salivara del mosquito est probablemente
establecida antes de la infeccin parasitaria. Como
resultado, respuestas de clulas T secundarias
dirigidas a los antgenos del mosquito podran ser
preferentemente activadas a expensas de la
activacin de clulas T especificas para el parasito,
va, por ejemplo, competencia por IL-2, nicho
homeosttico, o por secrecin activa de molculas
inhibitorias. Si este es el caso, la eficacia de vacunas
basadas en esporzotos pre eritrocticos podra
resultar baja en reas endmicas debido a la sutil
contaminacin con protenas de las glndulas
salivarias. Tanto la segunda como la tercera hiptesis
pueden explicar la baja frecuencia de clulas T helper
especficas del parasito y T CD8 encontrados en
humanos de regiones endmicas de malarias, asi
como el fracaso general (con excepcin de un solo
donante hasta ahora) para obtener clones estables
de clulas T humanas especficas para antgenos de
malaria en estadio heptico.
Observaciones finales
En conclusin, la data experimental existente
obtenida de modelos animales sugiere que: (1) tanto
DCs como hepatocitos pueden cebar clulas T CD8
vrgenes parasito-especficos para malaria, al menos
aquello dirigidos a eptopos derivados de CSP y (2)
tanto DCs como hepatocitos son suficientes para
inducir respuestas protectoras de clulas T CSPespecficas si la carga parasitaria no es excesiva.
Identificacin del sitio esencial para el cebado de
respuestas de clulas T CD8 dirigidas al estadio
heptico de malaria con especificidad amplia
antignica, as como imitar las condiciones de la
exposicin natural al vector del mosquito no
infectado pavimentara el camino para el diseo
ptimo de vacunas basadas en clulas T. Esperamos
que los acercamientos experimentales sugeridos
anteriormente en el contexto de data original
revisada resulte en estudios futuros en la induccin y
el mantenimiento de respuestas protectoras de
clulas T contra etapas exo eritrocticas de infeccin
por malaria.