10/3/2008

T.P.
T
P N 5
Pruebas Bioqumicas
q

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l i de
d cepas que comparten
t propiedades
i d d estables
t bl y difieren
difi
Especie bacteriana: coleccin
significativamente de otros grupos de cepas.

Asociacin DNA-DNA (>70%)

Porcentaje de similitud rRNA 16S (>97%)

IDENTIFICACION DE UN MICROORGANISMO

Pruebas bioqumicas:

Ensayos que ponen de manifiesto caractersticas metablicas

de los microorganismos.

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Catalasa
Oxidasa
Hidrlisis de almidn
Motilidad
Sensibilidad a antibiticos
IMViC
Agar Hierro-Dos azcares de Kligler
API 20E

Pruebas bioqumicas para la

identificacin de
enterobacterias

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Prueba de la Oxidasa
(citocromo C oxidasa)

Vibrio
Aeromonas
Pseudomonas

Escherichia coli

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Prueba de la Oxidasa
(citocromo C oxidasa)

Se utiliza un donor de
electrones artificial (tetrametil(tetrametil
p-fenilenediamina).

Reaccin +

Reaccin -

Vibrio
Aeromonas
Pseudomonas

Enterobacterias

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Prueba de la Catalasa
Perxido
i de hidrgeno
i

Radical hidroxilo

Compuesto producido en pequeas cantidades

durante la respiracin aerbica. Su produccin
est mediada por flavoprotenas.

Radical libre altamente reactivo. Agente

oxidante capaz de atacar cualquier molcula
orgnica presente en la clula.

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Prueba de la Catalasa
Enzimas que actan sobre
los derivados txicos del
oxgeno:

Catalasa

Peroxidasa

Enzimas que destruyen el perxido de

hidrgeno.

Superxido dismutasa

Enzima que destruye el anin

superxido
p
(
)).

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Prueba de la Catalasa

Reaccin +
Ensayo:
Se toman bacterias de un cultivo
slido y se esparcen con ansa sobre
una gota de perxido de hidrgeno
30%.

Aerobios estrictos o
facultativos

Bacillus
Staphylococcus
Enterobacterias

Reaccin - Clostridium

S
Streptococcus

Anaerobios estrictos o
Lactobacillus
microaerfilos

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Hidrlisis de almidn
( )
-amilasa:

amilasa: Enzima qque hidroliza los enlaces (1-4)

de polmeros de glucosa.

+
Reaccin +
(Halo transparente)

Agregado de
Lugol

B ill
Bacillus

Agar - almidn

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Motilidad
Se detecta la presencia de flagelo bacteriano.

Se cultivan las bacterias por puncin en

placas de agar blando.
Se observa migracin como un halo desde
el punto de siembra.

Bacterias mviles

Bacterias no mviles

Pseudomonas
Bacillus
Enterobacter
Vibrio

Staphylococcus

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Sensibilidad a antibiticos
Mecanismos de accin
Inhibicin de la sntesis de la pared (Penicilina, Ampicilina, Carbenicilina,
Cefalosporinas, Vancomicina, etc.)
Inhibicin de la sntesis de protenas (Streptomicina, Gentamicina,
Cloranfenicol, Tetraciclina, etc.)
Inhibicin de la snteis de cidos nuclicos (Ciprofloxacina, Rifampicina, etc.)
Disrupcin de la membrana (Polimixina B)
Antagonistas metablicos (Sulfonamida, Trimetoprima)

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Sensibilidad a antibiticos

MIC (concentracin inhibitoria mnima)

Anlisis de
sensibilidad a
antibiticos

MLC (concentracin letal mnima)

Anlisis de difusin en agar
(sistema de discos)

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Sensibilidad a antibiticos
Metodologa de trabajo:
Se crecen cultivos en medio lquido.
Se mezcla el cultivo con agar blando (0,7%) y se vuelca sobre una placa de agar nutritivo.
Se depositan discos con diferentes antibiticos.
Se mide el diametro del halo de inhibicin.

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Pruebas bioquimicas para la

identificacin de Enterobacterias
Cocobacilos Gram negativos
Aerobios facultativos (Catalasa positivos)
Fermentadores de Glucosa
Oxidasa negativos

1) IMViC
a)) Prueba del Indol
b) Rojo Metilo
c) Voges Proskauer
d) Prueba del citrato

2) Agar Hierro Dos Azcares de Kligler

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1)) IMViC
a) Prueba del Indol
Indol: Subproducto de la degradacin del aminocido Triptofano
por la enzima triptofanasa.

Cultivar la bacteria en caldo de peptonas

(alto contenido de Triptofano ) por 48 h.

Reaccin

Reaccin +

Formacin de una fase Formacin de una fase

orgnica amarilla
orgnica roja

Agregar al cultivo cinco gotas de reactivo

de Kovacs (dimetilaminobenzaldehdo).
El reactivo de Kovacs reacciona con el
indol dando un producto de color rojo.

Salmonella

E. coli

Enterobacter

Proteus

Klebsiella

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Fermentacion:

Tipos de Fermentacin
1) Lctica
2) Alcohlica
3) Propinica
4) Butilengliclica
5) cido Mixta
6) Aceto-Butrica

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F
Fermentacin
t i Butilengliclica
B til
li li
Enterobacter
Serratia
Erwinia
Bacillus

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Fermentacin cido

Mixta
Escherichia, Salmonella,
Proteus, etc.

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1)) IMViC
b) Rojo de Metilo
Este ensayo pone en evidencia la capacidad del microorganismo de realizar
f
fermentacin
i cido-mixta.
id
i

Rojo de Metilo:

Indicador de pH que vira al rojo por debajo de 4,3

Se inocula medio RM
RM-VP
VP
Incubacin 48h a 37C

Reaccin

Reaccin +

(Amarillo)

(Rojo)

Se agregan 3 gotas de Rojo de

Metilo 0,1%.

Enterobacter

E. coli

Klebsiella

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1)) IMViC
c) Voges Proskauer
Este ensayo pone en evidencia la capacidad del microorganismo de producir
acetilmetilcarbinol
il
il bi l (acetona)
(
) a partir
i de
d la
l frementacin
f
i butilengliclica
b il li li de
d la
l
glucosa.

Se inocula medio RM-VP

Reaccin

Reaccin +

E. coli

Enterobacter

Incubacin 48h a 37C

Se agregan 0,6 ml de reactivo de Barrit
(
(-naftol,
f l vira
i all rojo
j all reaccionar
i
con la
l
acetona) y 0,2 ml de KOH 40%.

Klebsiella

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1)) IMViC
d) Prueba del Citrato
Este ensayo pone en evidencia la capacidad del microorganismo de utilizar
citrato como nica fuente de carbono.
carbono

Estriar agar citrato de Simmons (contiene Azul de

b
bromotimol
ti l como indicador
i di d de
d pH).
H)
Incubacin 48h a 37C

Reaccin
Sin cambio (medio de
color verde).

Reaccin +
Crecimiento y viraje al
azul (la eliminacin del
citrato alcaliniza el
medio).

E. coli

Salmonella

Shigella
g

Enterobacter
Klebsiella

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1)) IMViC
I M V C
Escherichia coli
Proteus mirabilis
Salmonella
Enterobacter
Kl b i ll
Klebsiella

_
+ +
_
+ +
_
_
+
_ _
+
_ _
+

_
_
+
+
+

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2)) Agar
g Hierro-Dos azcares de Kligler
g
Medio de cultivo para la diferenciacin de enterobacterias en base a su capacidad para
fermentar glucosa y lactosa, y para producir cido sulfhdrico.

Peptona de
d carne

A partir del consumo de peptonas se libera NH3 produciendo

una alcalinizacin del medio.

Lactosa y Glucosa
(10:1)

La fermentacin de estos sustratos produce compuestos

cidos.

Tiosulfato de sodio.
Citrato de hierro y amonio.

Rojo fenol

El tiosulfato de sodio se reduce a sulfuro de

hidrgeno, el cual reacciona con la sal de hierro
produciendo sulfuro de hierro (precipitado negro) .

Vira al amarillo en medio cido.

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2)) Agar
g Hierro-Dos azcares de Kligler
g
Medio de cultivo para la diferenciacin de enterobacterias en base a su capacidad para
fermentar glucosa y lactosa, y para producir cido sulfhdrico.

Se inocula el medio por

puncin y estra en
superficie.
superficie
Incubacin 24h a 37C

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2)) Agar
g Hierro-Dos azcares de Kligler
g
Medio de cultivo para la diferenciacin de enterobacterias en base a su capacidad para
fermentar glucosa y lactosa, y para producir cido sulfhdrico.

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API 20E

Sistema ppara la identificacin rpida

p de enterobacterias.
Dispositivo plstico con tubos que contienen medios deshidratados.
Se inocula cada minitubo con una suspensin del microorganismo a analizar y se
incuba 24 hs a 37C en una atmsfera hmeda.
Al cada resultado se le asigna un cdigo que da como resultado un nmero de 7
cifras q
que se compara
p con tablas o bases de datos para
p la identificacin de la
especie..

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API 20E

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