Manual de Las Pruebas Diagnostico y de Las Vacunas para Animales Terrestres.

ORGANIZACIN MUNDIAL DE SANIDAD ANIMAL
MANUAL DE LAS PRUEBAS DE DIAGNSTICO

Y DE LAS VACUNAS
PARA LOS ANIMALES TERRESTRES
(mamferos, aves y abejas)
Volumen I
2004
Este Manual de animales terrestres ha sido editado por

la Comisin de Estndares Biolgicos de la OIE y
adoptado por el Comit Internacional de la OIE
Manual de las Pruebas de Diagnstico y de las Vacunas para los Animales Terrestres
Quinta Edicin, 2004 (Primera edicin en espaol)
Manual of Recommended Diagnostic Techniques and Requirements for Biological Products:

Volumen I, 1989; Volumen II, 1990; Volumen III, 1991.
Manual of Standards for Diagnostic Tests and Vaccines:
Segunda Edicin, 1992
Tercera Edicin, 1996
Cuarta Edicin, 2000
ISBN 92-9044-632-3
Copyright
OFFICE INTERNATIONAL DES EPIZOOTIES, 2004
12, rue de Prony, 75017 Paris, FRANCE
Telephone: 33-(0)1 44 15 18 88
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Todas las publicaciones de la OIE (Organizacin mundial de sanidad animal) estn protegidas por un Copyright
internacional. Extractos pueden copiarse, reproducirse, adaptarse o publicarse en publicaciones peridicas,
documentos, libros o medios electrnicos, y en cualquier otro medio destinado al pblico, con intencin
informativa, didctica o comercial, siempre y cuando se obtenga previamente una autorizacin escrita por parte
de la OIE.
Las designaciones y nombres utilizados y la presentacin de los datos que figuran en esta publicacin no
constituyen de ningn modo el reflejo de cualquier opinin por parte de la OIE sobre el estatuto legal de los
pases, territorios, ciudades o zonas ni de sus autoridades, fronteras o limitaciones territoriales.
PRLOGO
El propsito de este Manual de animales terrestres es facilitar el comercio internacional de

animales y productos animales, as como contribuir a la mejora de los servicios de salud animal en
todo el mundo. Mediante la descripcin de los mtodos de laboratorio para el diagnstico de
enfermedades y los requisitos para la produccin y control de productos biolgicos (principalmente
vacunas), ambos consensuados internacionalmente, se pone de manifiesto lo que constituye el
objetivo del Manual: la armonizacin de los elementos fundamentales de la prevencin, vigilancia
y control de las enfermedades animales.
Este ambicioso objetivo ha requerido la cooperacin de especialistas en salud animal de muchos
pases. La OIE, Organizacin Mundial de Sanidad Animal, es, a todas luces, una de las
organizaciones ms indicadas para acometer la mencionada tarea a nivel global. Las principales
actividades de la organizacin, que fue fundada en 1924 y en 2004 cuenta con 166 estados
miembros, son las siguientes:
1.
Asegurar la transparencia de la situacin global relativa a la zoonosis y las enfermedades

animales.
2.
Recabar, analizar y difundir informacin cientfico-veterinaria.
3.
Ofrecer conocimiento experto y promover la solidaridad internacional para el control de las

enfermedades animales.
4.
Dentro de su mandato, sujeto al Acuerdo SPS con la OMC, salvaguardar el comercio

internacional mediante la publicacin de estndares sanitarios para el comercio
internacional de animales y productos animales.
5.
Mejorar el marco legal y los recursos de los Servicios Nacionales de Veterinaria.
6.
Garantizar mejor la seguridad de los alimentos de origen animal y mejorar el bienestar

animal mediante procedimientos cientficos.
El Manual de animales terrestres, que trata de las enfermedades infecciosas y parasitarias de los
mamferos, aves y abejas, se public por primera vez en 1989. En cada nueva edicin del Manual
se han ampliado y actualizado los contenidos del mismo. Esta quinta edicin incluye captulos
adicionales sobre infecciones zoonsicas, reflejando as la implicacin creciente de la OIE en los
temas de salud pblica. Como complemento al Cdigo de sanidad animal, el Manual de animales
terrestres fija los estndares del laboratorio para todas las enfermedades de las listas A y B de la
OIE as como para otras varias enfermedades de importancia global. El Manual se ha venido
adoptando ampliamente como un texto de referencia de importancia crucial para los laboratorios
de veterinaria de todo el mundo. Las enfermedades de animales acuticos se tratan por separado
en el Manual de animales acuticos.
El Comit Internacional de la OIE asign a la Comisin de Estndares Biolgicos de la
Organizacin la tarea de encargar los captulos y compilar el Manual de animales terrestres. Los
originales se solicitaron a expertos en cada una de las enfermedades o en otros temas incluidos
en el Manual. Despus de su examen inicial por el Editor Tcnico Consultor, los captulos se
enviaron a los revisores cientficos y a expertos de los laboratorios de referencia de la OIE.
Tambin se enviaron a los pases miembros, recabando su revisin y comentarios. Los
comentarios recibidos fueron examinados por la Comisin de Estndares Biolgicos y el Editor
Tcnico Consultor, quienes, en muchos casos, se los hicieron llegar a los autores para las
aclaraciones pertinentes, antes de dar forma definitiva a los captulos. El texto final fue aprobado
por el Comit Internacional de la OIE.
Ante el incremento del volumen de contenidos del Manual de animales terrestres, ha sido
necesario publicar esta quinta edicin en dos volmenes. Es nuestro sincero deseo que este
Manual resulte de la mayor utilidad para los responsables de diagnstico veterinario y para los
fabricantes de vacunas de todos los Pases Miembros de la OIE.
Doctor Bernard Vallat
Director General de la OIE
Profesor Steven Edwards

Presidente de la Comisin de Estndares
Biolgicos de la OIE
Enero 2004
Manual de la OIE sobre animales terrestres 2004
iii
AGRADECIMIENTOS
Estoy sumamente agradecido a las muchas personas que han contribuido con su esfuerzo a la
preparacin del presente Manual de animales terrestres. De forma especial, me gustara expresar
mi agradecimiento a:
El Dr. B. Vallat, Director General de la OIE desde 2001 hasta el presente, por propiciar y
apoyar el proyecto de preparacin de la nueva edicin del Manual de animales terrestres,
Los Miembros de la Comisin de Estndares de la OIE, Prof. M. Truszczynski, Prof. S.
Edwards, Dr. B. Schmitt y Dr. A. Golovko, y los observadores en la reunin de la Comisin
de Estndares Biolgicos, Dr. A. Diallo y Dr. P. Wright, quienes se responsabilizaron de
encargar los captulos y, junto con el Editor Tcnico Consultor, editar las contribuciones
hasta completar esta edicin del Manual,
Los colaboradores relacionados en las pginas xxiv-xxxv, que aportaron su inestimable
tiempo y conocimiento experto en la redaccin de los captulos,
Los revisores y expertos de los laboratorios de referencia de la OIE, quienes dedicaron su
tiempo y conocimiento experto al examen de los captulos,
Los pases miembros de la OIE que aportaron comentarios sobre los borradores de los
captulos que previamente se les haba enviado. Esos comentarios resultaron esenciales
para hacer del Manual un texto internacionalmente aceptable,
Ms Sara Linnane, quien, como Editor Cientfico, organiz este complejo proyecto y
contribuy de forma importante a mejorar la calidad del texto,
Los Doctores G.A. Cullen y J.E. Pearson, Editores Tcnicos Consultores del Manual de
animales terrestres, que contribuyeron en gran medida a la edicin y armonizacin de los
contenidos aportando la informacin requerida para subsanar cualquier laguna informativa,
Los miembros del Departamento Cientfico y Tcnico de la OIE y del Departamento de
Publicaciones por su apoyo.
Dr. Abdoulaye Bouna Niang

Presidente del Comit Internacional de la OIE
Enero 2004
AGRADECIMIENTOS POR LA EDICIN ESPAOLA
Deseo expresar mi ms sincero agradecimiento a todos los que han posibilitado la primera edicin en espaol
del Manual de las pruebas de diagnstico y de las vacunas para los animales terrestres y a todos los que con su
trabajo han colaborado en la traduccin al espaol, muy especialmente a:
El Dr. Vallat, por impulsar este Proyecto tan necesario para los veterinarios y tcnicos y especialistas de
pases de habla espaola.
Los gobiernos del Reino de Espaa y de la Repblica de Argentina, y en concreto al Ministerio de
Agricultura, Pesca y Alimentacin (Espaa) y al Servicio Nacional de Sanidad y Calidad Agroalimentaria
(SENASA, Argentina), por sus contribucin econmica a este Proyecto.
Los miembros del Comit Director para los proyectos de lOIE (Organizacin Mundial de Sanidad Animal)
de traduccin del Manual of Standards for Diagnostics Tests and Vaccines al idioma espaol y Base
terminolgica multilnge para el mbito de la Sanidad Animal y ciencias afines, los Doctores Angot
(Francia), Cabello Navarro (Espaa), Acerbi (Argentina), Cruz de Urbina (Colombia), Serrano (Cuba), por
su colaboracin y apoyo.
Los miembros del Grupo ad Hoc correspondiente, Profesores Doctores Rodrguez Ferri, Zepeda Sen,
Gimeno, Len Vizcano, Cuello Gijn y Snchez Vizcano por su participacin activa en las correcciones
cientficas y tcnicas de los textos en espaol, as como por sus aportaciones, comentarios y crticas, que
han resultado fundamentales para la calidad de la traduccin.
El Profesor Dr. Schudel, Jefe del Servicio Cientfico y Tcnico de la OIE, que ha coordinado de forma
impecable las relaciones entre nuestra organizacin y el Comit Director y el Grupo ad Hoc.
El Profesor Dr. Gutirrez Dez, miembro del Grupo ad Hoc, que ha llevado a cabo la coordinacin
lingstica y traductolgica de la versin espaola de este Manual y a su equipo de traductores.
El Profesor Dr. Crespo Len, Secretario del Comit Director y del Grupo ad Hoc, que fue el coordinador
cientfico y tcnico de este Proyecto.
Dr. Abdoulaye Bouna Niang

Presidente del Comit Internacional de la OIE
vii
CONTENIDOS
VOLUMEN I
Introduccin: cmo usar el Manual de animales terrestres......................................

Lista de pruebas para el comercio internacional......................................................
Abreviaturas ms comunes usadas en el Manual de animales terrestres
Glosario terminolgico..............................................................................................
Colaboradores..........................................................................................................
xi
xiii
xvii
xix
xxiv
PARTE I
INFORMACIN GENERAL
SECCCIN I.1.
CAPTULOS INTRODUCTORIOS
Captulo I.1.1.
Captulo I.1.2.
Captulo I.1.3.
Mtodos de muestreo...............................................................................................
Gestin de calidad en los laboratorios de pruebas veterinarias...............................
Principios de validacin para las pruebas de diagnstico de enfermedades
infecciosas.
21
Captulo I.1.4.
Validacin y control de calidad de los mtodos de la reaccin en cadena de la

polimerasa utilizados para el diagnstico de enfermedades infecciosas......
32
Captulo I.1.5.
Pruebas para esterilidad y ausencia de contaminacin en materiales

biolgico.
Captulo I.1.6.
Captulo I.1.7.
Captulo I.1.8.
Seguridad humana en los laboratorios veterinarios de microbiologa...

Principios de produccin de vacunas veterinarias....................................................
La Biotecnologa en el diagnstico de las enfermedades infecciosas y el
desarrollo de vacunas..
3
14
40
49
62
75
Captulo I.1.9.
El papel de los organismos oficiales en la regulacin internacional de los

productos biolgicos de uso veterinario...
99
Captulo I.1.10.
Mtodos de laboratorio para ensayos de sensibilidad de bacterias frente a

antimicrobianos....
112
PARTE 2
LISTADO DE ENFERMEDADES DE LA OIE
SECCCIN 2.1.
ENFERMEDADES DE LA LISTA A
Captulo 2.1.1.
Captulo 2.1.2.
Captulo 2.1.3.
Captulo 2.1.4.
Captulo 2.1.5.
Captulo 2.1.6.
Captulo 2.1.7.
Captulo 2.1.8.
Captulo 2.1.9.
Captulo 2.1.10.
Captulo 2.1.11.
Captulo 2.1.12.
Captulo 2.1.13.
Captulo 2.1.14.
Captulo 2.1.15.
Fiebre aftosa.............................................................................................................
Estomatitis vesicular.................................................................................................
Enfermedad vesicular porcina..................................................................................
Peste bovina.............................................................................................................
Peste de los pequeos rumiantes............................................................................
Pleuroneumona bovina contagiosa..........................................................................
Dermatosis nodular contagiosa ........
Fiebre del Valle del Rift...
Lengua azl..............................................................................................................
Viruela ovina y viruela caprina..................................................................................
Peste equina africana...............................................................................................
Peste porcina africana..............................................................................................
Peste porcina clsica (clera del cerdo)...................................................................
Gripe aviar muy virulenta..........................................................................................
Enfermedad de Newcastle........................................................................................
123
142
150
156
167
178
191
202
213
230
241
254
266
281
293
ix
Contenido
SECCIN 2.2.
ENFERMEDADES DE ESPECIES MLTIPLES- LISTA B
Captulo 2.2.1.
Captulo 2.2.2.
Captulo 2.2.3.
Captulo 2.2.4.
Captulo 2.2.5.
Captulo 2.2.6.
Captulo 2.2.7.
Captulo 2.2.8.
Carbunco..................................................................................................................
Enfermedad de Aujeszky..........................................................................................
Equinococosis/Hidatidosis........................................................................................
Leptospirosis.............................................................................................................
Rabia.........................................................................................................................
Paratuberculosis (enfermedad de Johne) ................................................................
Cowdriosis................................................................................................................
Larva perforada del Nuevo Mundo (Cochliomyia hominivorax) y del Viejo Mundo
(Chrysomya bezziana).....
Captulo 2.2.9.
Captulo 2.2.10.
Captulo 2.2.11.
Triquinelosis..............................................................................................................
Fiebre Q ...................................................................................................................
Leishmaniosis...........................................................................................................
SECCIN 2.3.
ENFERMEDADES BOVINAS- LISTA B
Captulo 2.3.1.
Captulo 2.3.2.
Captulo 2.3.3.
Captulo 2.3.4.
Captulo 2.3.5.
Captulo 2.3.6.
Captulo 2.3.7.
Captulo 2.3.8.
Captulo 2.3.9.
Captulo 2.3.10.
Captulo 2.3.11.
Captulo 2.3.12.
Captulo 2.3.13.
Captulo 2.3.14.
Captulo 2.3.15.
Brucelosis bovina......................................................................................................
Campilobacteriosis genital bovina............................................................................
Tuberculosis bovina..................................................................................................
Leucosis bovina enzotica........................................................................................
Rinotraqueitis bovina infecciosa /vulvovaginitis pustular infecciosa.........................
Tricomonosis.............................................................................................................
Anaplasmosis bovina................................................................................................
Babesiosis bovina.....................................................................................................
Cisticercosis bovina* (ver captulo 2.10.1)................................................................
Dermatofilosis...........................................................................................................
Teileriosis..................................................................................................................
Septicemia hemorrgica...........................................................................................
Encefalopata espongiforme bovina..........................................................................
Fiebre catarral maligna.............................................................................................
Tripanosomosis (transmitida por la mosca ts.ts)......
307
320
334
343
356
377
391
402
413
421
433
445
477
489
503
514
526
534
548
560
561
564
580
593
615
626
INTRODUCCIN
(Sobre la utilizacin del
Manual de animales terrestres)
Estructura del Manual de animales terrestres y sistema de numeracin
La Parte I, al comienzo del Manual, contiene diez captulos introductorios sobre diversos temas
generales de inters para los responsables de diagnstico de los laboratorios de veterinaria. Cada
uno de los captulos es una introduccin al tema enunciado, y todos ellos contienen informacin
bsica no estandarizada.
El cuerpo principal del Manual de animales terrestres (Parte 2) contiene los estndares para las
pruebas de diagnstico y las vacunas para las enfermedades listadas en el Cdigo sanitario de
animales terrestres de la OIE. Estas aparecen en el mismo orden y con el mismo sistema de
numeracin que se utiliza en el Cdigo Sanitario a fin de facilitar las referencias cruzadas entre los
dos libros. La Lista A contiene las enfermedades transmisibles que pueden propagarse
rpidamente, y con graves consecuencias, a travs de las fronteras entre pases. Son
enfermedades de consecuencias especialmente graves por su incidencia en la salud pblica y sus
repercusiones socio-econmicas. En la Lista B aparecen las enfermedades transmisibles de
consecuencias igualmente graves para la salud pblica y el mbito socio-econmico, aunque
restringidas a ciertos pases; tienen un impacto en el comercio internacional de animales y de
productos animales. La lista B se subdivide segn la especie animal hospedadora.
Las cuatro primeras enfermedades de la Seccin 2.10 se incluyen en algunas secciones de la
Lista B, que se refieren a especies individuales; pero en estos captulos se tratan varias especies,
ofreciendo as una visin ms amplia. En la Seccin 2.10 se incluyen algunas otras enfermedades
que tambin son importantes para el comercio, y a las que no se les asigna un captulo especfico
en el Cdigo sanitario de animales terrestres.
Los colaboradores de los distintos captulos aparecen relacionados en las pginas xxivxxxviii,
pero la responsabilidad ltima en relacin con los contenidos del Manual de animales terrestres
recae en el Comit Internacional de la OIE.
Al final del Volumen II se ofrece un ndice alfabtico de enfermedades.
Formato de los captulos

Cada captulo se inicia con un resumen del contenido, a fin de proporcionar a los oficiales
veterinarios y a otros lectores una informacin sucinta sobre las pruebas y las vacunas disponibles
para el tratamiento de la enfermedad. A continuacin del resumen, se ofrece el texto completo,
con informacin detallada para los operarios del laboratorio. En la Parte A de cada captulo, se
ofrece una introduccin general sobre la enfermedad; en la Parte B, se incluye el diagnstico de la
enfermedad en el laboratorio; y en la Parte C (en los casos en que sea pertinente), se tratan los
requisitos para las vacunas y los productos biolgicos para el diagnstico in vivo. La informacin
sobre la produccin y control de las vacunas o los materiales de diagnstico se ofrecen a modo de
ejemplo: no siempre es necesario ajustarse a esa informacin, sobre todo en los casos en que
existan razones cientficamente fundamentadas para la utilizacin de enfoques alternativos. Al
final de cada captulo, se incluyen las referencias bibliogrficas como fuente de informacin
adicional.
Explicacin de las pruebas descritas y del cuadro de las pginas xiiixvi

En el cuadro de las pginas xiiixvi aparece un listado de las pruebas de diagnstico clasificadas
en dos categoras: pruebas prescritas y pruebas alternativas. Las prescritas son las pruebas
que se exigen en el Cdigo sanitario de animales terrestres para ser aplicadas a los animales
antes de su transporte internacional. En el Manual de animales terrestres, tales pruebas aparecen
en tipo azul. En la actualidad no se dispone de pruebas prescritas para todas las enfermedades
xi
Introduccin
de las listas A y B. Las pruebas alternativas son aquellas que conviene aplicar para el diagnstico
de la enfermedad en un mbito geogrfico local, y que tambin se pueden utilizar de cara a la
importacin/exportacin de animales previo acuerdo bilateral. Dentro de los captulos, a menudo
se describen otras pruebas que pueden ser de utilidad prctica en situaciones de mbito local o
que estn todava en proceso de desarrollo.
Lista de laboratorios de referencia de la OIE

En la Parte 3 del presente Manual de animales terrestres se ofrece una lista de laboratorios de
referencia de la OIE. Dichos laboratorios han sido designados por la OIE como centros de
excelencia por su conocimiento experto en campos especficos. Tienen capacidad para asesorar a
otros laboratorios sobre cuestiones de metodologa. En ocasiones pueden obtenerse de estos
laboratorios de excelencia cepas estndar de microorganismos o reactivos de referencia (por
ejemplo, antisueros o antgenos).
La lista de laboratorios de referencia ser actualizada cada ao por el Comit Internacional de la
OIE. Existe una lista actualizada en la pgina Web de la propia OIE.
*
* *
xii
LISTA DE PRUEBAS PARA EL COMERCIO

INTERNACIONAL
En el cuadro inferior aparece un listado de las pruebas de diagnstico clasificadas segn dos
categoras: pruebas prescritas y pruebas alternativas. Las prescritas se exigen en el Cdigo
sanitario de animales terrestres de la OIE para el transporte internacional de animales y de
productos animales, y se consideran como las ms adecuadas para determinar el estado de salud
de los animales. Tales pruebas aparecen impresas en letra azul en el Manual de animales
terrestres. En la actualidad no se dispone de pruebas prescritas para todas las enfermedades de
las listas A y B. Las pruebas alternativas son las adecuadas para el diagnstico de la enfermedad
en un mbito geogrfico local, y tambin se pueden utilizar de cara a la importacin/exportacin
de animales, previo acuerdo bilateral. Dentro de los captulos, se describen a menudo otras
pruebas que pueden ser de utilidad prctica en situaciones de mbito local o que estn todava en
proceso de desarrollo.
Captulo N
Nombre de la enfermedad
2.1.1.
Fiebre aftosa
2.1.2.
Estomatitis vesicular
2.1.3.
Enfermedad vesicular porcina
2.1.4.
Peste bovina
2.1.5.
Peste de los pequeos rumiantes
2.1.6.
Pleuroneumona bovina contagiosa
2.1.7.
Pruebas prescritas
Pruebas alternativas
ELISA*, NV
FC
FC, ELISA, NV
NV
ELISA
ELISA
NV
NV
ELISA
FC, ELISA
Dermatosis nodular contagiosa
VN
2.1.8.
Fiebre del Valle del Rift
HI, ELISA, PRN
2.1.9.
Lengua azul
Id. agente, IGDA,

ELISA, PCR
NV
2.1.10.
Viruela ovina y viruela caprina
NV
2.1.11.
Peste equina africana
FC, ELISA
NV
2.1.12.
Peste porcina africana
ELISA
IFI
2.1.13.
Peste porcina clsica (clera del cerdo)
NPLA, FAVN, ELISA
2.1.14.
Gripe aviar muy virulenta
IGDA, HI
2.1.15.
Enfermedad de Newcastle
HI
2.2.1.
Carbunco
2.2.2.
Enfermedad de Aujeszky
ELISA, NV
2.2.3.
Equinococosis/Hidatidosis
2.2.4.
Leptospirosis
MAT
2.2.5.
Rabia
NV
ELISA
2.2.6.
Paratuberculosis (enfermedad de Johne
DTH, ELISA
2.2.7.
Cowdriosis
ELISA, IFI
2.2.8.
Larva perforada del Nuevo Mundo

(Cochliomyia hominivorax y del Viejo
Mundo (Chrysomya bezziana)
Id. agente
xiii
Lista de pruebas para el comercio internacional
Hay que consultar los captulos del Manual de animales terrestres para comprobar el mtodo prescrito
Captulo N
2.2.9.
Triquinelosis
2.2.10.
Pruebas prescritas
Id. agente
ELISA
Fiebre Q
CF
2.2.11.
Leishmaniosis
Id. agente
2.3.1.
Brucelosis bovina
2.3.2.
Campilobacteriosis genital bovina
BBAT, FC,
ELISA, FPA
Id. agente
2.3.3.
Tuberculosis bovina
2.3.4.
Leucosis bovina enzotica
2.3.5.
2.3.6.
Rinotraqueitis bovina infecciosa

/vulvovaginitis pustular infecciosa
Tricomonosis
2.3.7.
Prueba de la
tuberculina
IGDA, ELISA
PCR
NV, ELISA, Id. agente

(slo semen)
Id. agente
Agg. moco
Anaplasmosis bovina
FC, Agg. card
2.3.8.
Babesiosis bovina
ELISA, IFI
2.3.9.
Cisticercosis bovina
Id. agente
2.3.10.
Dermatofilosis
2.3.11.
Teileriosis
Id. agente, IFI
2.3.12.
Septicemia hemorrgica
Id. agente
2.3.13.
Encefalopata espongiforme bovina
2.3.14.
Fiebre catarral maligna
NV, IFI, PCR
2.3.15.
Tripanosomosis (transmitida por la

mosca ts-ts)
Epididimitis ovina (Brucella ovis)
IFI
FC
ELISA
BBAT, FC
Prueba de la brucelina
IGDA, ELISA
FC
2.4.1.
2.4.2.
2.4.3.
2.4.4/5.
xiv
Brucelosis caprina y ovina

(no debida Brucella ovis)
Agalaxia contagiosa
Artritis/encefalitis caprina y Maedi-visna
2.4.6.
Pleuroneumona caprina contagiosa
2.4.7.
FC
2.4.8.
Aborto enzotico de las ovejas

(Clamidiosis ovina)
Prurigo lumbar
2.4.9.
Adenomatosis pulmonar ovina
2.4.10.
Enfermedad de Nairobi
2.4.11.
Salmonelosis (S. Abortus ovis)
Id. agente
2.5.1.
Metritis equina contagiosa
Id. agente
2.5.2.
Durina
FC
IFI, ELISA
2.5.3.
HI, FC, PRN
2.5.4.
Encefalomielitis equina (del Este y del

Oeste)
Anemia infecciosa equina
IGDA
ELISA
2.5.5.
Gripe equina
HI
2.5.6.
Piroplasmosis equina
ELISA, IFI
FC
2.5.7.
Rinoneumonitis equina
NV
2.5.8.
Muermo
Prueba de la malena,
FC
Captulo N
Pruebas prescritas
2.5.10.
Arteritis vrica equina
NV, Id. agente (en

muestras de semen)
2.5.11.
Sarna equina
Id. agente
2.5.12.
Encefalomielitis equina venezolana
HI, FC, PRN
2.5.13.
Linfangitis epizotica
2.5.14.
Encefalitis japonesa
2.5.15.
Tripamosomosis (Trypansoma evansi)
2.6.1.
Rinitis atrfica porcina
2.6.2.
Brucelosis porcina
ELISA
BBAT, FPA
2.6.3.
Encefalomielitis por enterovirus

(anteriormente enfermedades de
Teschen/Talfan)
Gastroenteriris transmisible
NV
NV, ELISA
Sndrome reproductivo y respiratorio

porcino
Cisticercosis porcina
ELISA, IFI, IPMA
Id. agente
Bursitis infecciosa (Enfermedad de

Gumboro )
Enfermedad de Marek
IGDA, ELISA
IGDA
Agg., HI
2.7.4.
Micoplasmosis aviar
(Mycoplasma gallisepticum)
Clamidiosis aviar
2.7.5.
Pulorosis y taifosis aviar
Agg., Id. agente
2.7.6.
Bronquitis infecciosa aviar
NV, HI, ELISA
2.7.7.
Laringotraqueitis infecciosa aviar
IGDA, NV, ELISA
2.7.8.
Tuberculosis aviar
Prueba de la
tuberculina,
Id. agente
2.7.9.
Hepatitis vrica del pato
2.7.10.
Enteritis vrica del pato
2.7.11.
Clera aviar (pasteulerosis aviar)
2.7.12.
Viruela aviar
2.8.1.
Mixomatosis
IGDA, FC, IFI
2.8.2.
Tularemia
Id. agente
2.8.3.
Enfermedad hemorrgica del conejo
HI
2.9.1.
Acariosis de las abejas
2.9.2.
Loque americana
2.9.3.
Loque europea
2.9.4.
Nosemosis de las abejas
2.9.5.
Varroosis
2.9.6.
Infestacin de las abejas melferas por

Tropilaelaps (Tropilaelaps clareae, T.
koenigerum)
2.10.1.
Cisticercosis
2.6.4.
2.6.5.
2.6.6.
2.7.1.
2.7.2.
2.7.3.
Id. agente
xv
Captulo N
Pruebas prescritas
2.10.2.
Enfermedades bunyavirales de
animales (excluyendo la Fiebre del
Valle del Rift)
2.10.3.
Salmonelosis
Id. agente
2.10.4.
Sarna
Id. agente
2.10.5.
Enfermedad de la frontera
Id. agente
2.10.6.
Diarrea vrica bovina
Id. agente
2.10.7.
Encefalitis del Oeste del Nilo
2.10.8.
Campylobacter jejuni and C. Coli
2.10.9.
Criptosporidiosis
2.10.10.
Enfermedades vricas de Hendra y de

Nipah
2.10.11.
Gripe porcina
2.10.12.
Toxoplasmosis
2.10.13.
Escherichia coli Verocitotoxignica
2.10.14.
Listeria monocytogenes
Nota: Las pruebas prescritas por el Cdigo sanitario de animales terrestres a efectos de comercializacin
internacional se han impreso en letra azul en el Manual de animales terrestres.
Abreviaturas
Id. agente
Identificacin del agente
HI
Inhibicin de la hemaglutinacin
Agg.
Prueba de aglutinacin
IFI
Inmunofluorescencia indirecta
IGDA
Inmunodifusin en gel de agar
IPMA
Prueba de inmunoperoxidasa en
monocapa
BBAT
Prueba con antgeno tamponado de Brucella
MAT
Prueba de aglutinacin microscpica
FC
(Prueba de) fijacin del complemento
NPLA
Prueba de neutralizacin acoplada a la

peroxidasa
DTH
Hipersensibilidad retardada
PCR
Reaccin en cadena de la polimerasa
ELISA
Prueba de enzimoinmunoensayo
PRN
Neutralizacin por reduccin de calvas
FAVN
Neutralizacin vrica con anticuerpo

fluorescente
NV
Neutralizacin vrica
FPA
Prueba de polarizacin de la fluorescencia
Prueba por designar
xvi
ABREVIATURAS UTILIZADAS EN EL MANUAL DE

ANIMALES TERRESTRES
ABTS
ATCC1
BBAT
BFK
BGPS
BHK
BLP
BPAT
BSA
BSF
CAM
CEF
CFU
CIEP
CK
CPLM
CSY
DEAE
DEPC
DICT50
DMEM
DMSO
DTH
ECP
EGTA
EID
ELISA
EMTM
EYL
FAT
FAVN
FBS
FC
FITC
FLK
FPA
g
GIT
HA
cido 2,2-azino-di-(3-etil-benzotiazolina)6-sulfnico
Coleccin americana de cultivos tipo
Prueba con antgeno tamponado de
Brucella
(Clulas de ) rin fetal bovino
Medio con extracto de carne-glucosapeptona y suero
Lnea celular de rin de hamster
neonato
Lactosa y peptona tamponada
Prueba con antgeno tamponado en
placa
Albmina de suero bovino
Factores del suero bovino
Membrana corioalantoidea
Fibroblasto de embrin de pollo
Unidad formadora de colonia
Contrainmunoelectroforesis
Clulas de rin de ternero
Medio con cistena-peptona-infusin de
hgado y maltosa
Medio con casena-sacarosa y levadura
(con agar)
Dietilaminoetil
Dietil pirocarbonato
Dosis infectiva del 50% en cultivo celular
Medio de Eagle modificado por Dulbecco
Dimetil sulfxido
Hipersensibilidad retardada
Efecto citoptico
cido etiln glicol tetra-actico
Dosis infecciosa en huevo
Prueba de enzimoinmunoensayo
Medio de Tobie modificado por Evans
Solucin salina equilibrada de Earle con
lactalbmina y levadura
Prueba de anticuerpo fluorescente
Neutralizacin vrica con anticuerpo
fluorescente
Suero bovino fetal
(Prueba de) fijacin del complemento
Isotiocianato de fluorescena
(Clulas de) rin de cordero fetal
Prueba de polarizacin de la
fluorescencia
Fuerza centrfuga relativa
Prueba de inhibicin del crecimiento
Hemaglutinacin
HAD
HBSS
HEP
HEPES
HI
HRPO
IB
ICFTU
ICPI
ID50
IFI
IGDA
IHA
IPMA
IVPI
LA
LD
LEP
MAb
MAT
MCS
MDT
MEM
MHC
MSV
NI
NV
OGP
OPD
OPG
PAGE
PAP
PAS
PBS
PCR
PD
PFU
PHA
PPD
PPLO
PRN
Hemadsorcin
Solucin salina equilibrada de Hanks
Alto nmero de pases en huevo (virus)
cido N-2-hidroxietilpiperazina, N-2etanosulfnico (tampn)
Inhibicin de la hemaglutinacin
Peroxidasa de rbano
Prueba de inmunodeteccin
Unidad internacional de la prueba de
fijacin de complemento
ndice de patogenicidad intracerebral
Dosis infecciosa media
Prueba de inmunofluorescencia indirecta
Hemaglutinacin indirecta
Prueba de inmunoperoxidasa en
monocapa
ndice de patogenicidad intravenosa
Aglutinacin con ltex
Dosis letal
Bajo nmero de pases en huevo (virus)
Anticuerpo monoclonal
Stock de clulas iniciales
Tiempo letal medio
Medio mnimo esencial
Complejo mayor de histocompatibilidad
Virus inicial de siembra
ndice de neutralizacin
Neutralizacin viral
1-octil-beta-D-glucopiransido (tampn)
Ortofenildiamina (tampn)
Solucin conservante con oxalasa-fenol
y glicerina
Electroforesis en gel de poliacrilamida
Peroxidasaantiperoxidasa
(procedimiento de tincin)
Reaccin de Schiff con cido peridico
Solucin salina tamponada con fosfato
Dosis protectora
Unidad formadora de calvas o halos
Prueba de hemaglutinacin pasiva
Derivado de protena purificada
Organismos semejantes a los causantes
de pleuroneumona
Neutralizacin por reduccin de calvas
xvii
Abreviaturas utilizadas en el Manual de animales terrestres
PSG
Solucin salina tamponada con fosfato

ms glucosa
RBC
Eritrocito
RFLP
Polimorfismo de fragmentos de
restriccin
RK
Rin de conejo
RPM
Revoluciones por minuto
RSA
Aglutinacin srica rpida
RT-PCR Reaccin en cadena de la polimerasa
con transcripcin inversa
SAT
Prueba de aglutinacin srica
SDS
Dodecil sulfato sdico
SNC
SPF
SPG
SRBC
TMB
TSI
UI
VB
VBS
Vero
Sistema nervioso central

Libre de patgeno especfico
Sacarosa, fosfato y cido glutmico
Eritrocito de oveja
Tetrametil benzidina
Medio de hierro y triple azcar
Unidades internacionales
Tampn veronal
Solucin salina tamponada con veronal
Clulas de rin de mono verde african
ABREVIATURAS DE LOS NOMBRES DE ENFERMEDADES

AEC
AIE
APO
AVE
BI
BIA
CA
DNC
DVB
EA
EEB
EEE
EEO
EEV
EHC
EM
EV
EVP
EVP
FA
FCM
FVR
GAMV
Artritis/encefalitis caprina
Anemia infecciosa equina
Adenomatosis pulmonar ovina
Arteritis vrica equina
Bursitis infecciosa
Bronquitis infecciosa aviar
Clamidiosis aviar
Dermatosis nodular contagiosa
Diarrea vrica bovina
Enfermedad de la frontera
Encefalopata espongiforme bovina
Encefalomielitis equina del este
Encelalomielitis equina del oeste
Encefalomielitis equina venezolana
Enfermedad hemorrgica del conejo
Enfermedad de Marek
Estomatitis vescular
Enfermedad vesicular porcina
Enteritis vrica del pato
Fiebre aftosa
Fiebre catarral maligna
Fiebre del Valle del Rift
Gripe aviar muy virulenta
GET
HVP
LA
LBE
LPNM
LPVM
LTI
MV
NPO
PBC
PEA
PNCC
PPA
PPC
PPR
RBI/VPI
RE
SH
SRRP
Gastroenteritis transmisible
Hepatitis vrica del pato
Lengua azul
Leucosis bovina enzotica
Larva perforada del nuevo mundo
Larva perforada del viejo mundo
Laringotraqueitis infecciosa aviar
Maedi-visna
Neumona progresiva ovina de las
Ovejas
Pleuroneumona bovina contagiosa
Peste equina africana
Pleuroneumona caprina contagiosa
porcino
Peste porcina africana
Peste porcina clsica
Peste de los pequeos rumiantes
Rinotraqueitis bovina infecciosa/
Vulvovaginitis pustular infecciosa
Rinoneumonitis equina
Septicemia hemorrgica
Sndrome reproductivo y respiratorio
Coleccin americana de cultivos tipo, 10801 University Boulevard, Manassas, Virginia 20110-2209, Estados Unidos de
Amrica.
xviii
GLOSARIO DE TRMINOS
Las definiciones dadas a continuacin se han seleccionado con el criterio restrictivo de incluir
solamente las que pueden ser de utilidad para los usuarios del Manual de animales terrestres.
Absorbancia/densidad ptica
Absorbancia y densidad ptica son trminos utilizados para indicar la fuerza de la reaccin. Se utiliza un
espectrofotmetro para medir la cantidad de luz de la longitud de onda especfica absorbida por una muestra, y
la absorbancia es proporcional a la cantidad de material analizado que est presente.
Animal de referencia
Cualquier animal cuyo estatus infeccioso pueda definirse de forma inequvoca; puede incluir animales enfermos,
infectados, vacunados, inmunizados o animales sin ninguno de los rasgos anteriores.
Armonizacin
Calibracin de mtodos de prueba idnticos o similares frente a reactivos internacionales estndar y expresin
de los resultados cuantitativos o semi-cuantitativos de la prueba, que han sido normalizados frente a estndares
de trabajo incorporados en cada realizacin de la prueba.
Caracterstica de la realizacin
Propiedad del mtodo de prueba; puede incluir la sensibilidad y especificidad analticas, la exactitud, la
precisin, y/o la sensibilidad y especificidad diagnsticas.
Clula maestra (lnea, stock, inculo)
Conjunto de alcuotas de clulas de un determinado nmero de pases, que se utilizan en la preparacin o

prueba de un producto biolgico, se distribuye dentro de recipientes en una operacin individual, se procesa
conjuntamente y se almacena de forma que queda garantizada la uniformidad y la estabilidad, y se evita la
contaminacin.
Clulas primarias
Grupo de clulas originales derivadas de tejido normal incluyendo el dcimo subcultivo.
Centrifugacin
En todo el texto del Manual, el promedio de centrifugacin se expresa como la fuerza centrfuga relativa,
simbolizada por g. La frmula es:
(rpm 0,10472)2
radio (cm) = g
980
donde rpm es la velocidad del rotor en revoluciones por minuto, y donde radio (cm) es el radio del brazo del rotor
hasta la parte baja del tubo, en centmetros.
Puede ser necesario calcular el rpm necesario para alcanzar un valor dado de g, con un rotor especfico. La
frmula es:
rpm =
g 980 /radio (cm)

0,10472
xix
Glosario de trminos
Comparacin entre laboratorios (Ensayo en anillo)
Cualquier evaluacin de la realizacin de una prueba y/o de la competencia de un laboratorio para ensayar
muestras determinadas, llevada a cabo por dos o ms laboratorios; un laboratorio puede actuar como referencia
en la definicin de los atributos de las muestras a ensayar.
Control del proceso
Los procedimientos de prueba llevados a cabo durante la fabricacin de un producto biolgico para garantizar
que el producto cumple con las normas de calidad acordados.
Controles internos
Todas las actividades tendentes a garantizar la calidad dentro de un laboratorio y que estn directamente
relacionadas con el control, la validacin, y el mantenimiento de las condiciones de realizacin y suficiencia
tcnica de la prueba.
Diluciones
Cuando se dan diluciones para preparar reactivos lquidos, stas se expresan como, por ejemplo, 1 en 4 partes
o una cuarta parte (1/4), lo que significa que una parte se aade a cuatro partes, es decir, un 20% de la solucin
A en B.
v/v = volumen a volumen (dos lquidos)
w/v = peso a volumen (slido aadido a lquido).
Diluciones utilizadas en las pruebas de neutralizacin vrica
Hay dos formas convencionales de expresar la dilucin utilizada en las pruebas de neutralizacin vrica (NV). En
Europa es costumbre expresar la dilucin antes de la adicin del antgeno, pero en Estados Unidos y en otros
lugares, es comn expresar las diluciones despus de la adicin del antgeno.
Estas convenciones alternativas se expresan en el presente Manual como dilucin inicial o dilucin final,
respectivamente.
Eficacia
Capacidad especfica que tiene un producto biolgico para producir el resultado esperado, cuando aqul se
utiliza bajo las condiciones recomendadas por el fabricante.
Ensayo
Sinnimo de prueba o mtodo de prueba, como enzimoinmunoensayo o prueba de fijacin de complemento.
Especificidad (analtica)
Grado en el que los materiales analizados distintos al material problema reaccionan en una prueba; cuanto ms
alto sea el nivel de reacciones cruzadas, ms baja ser la especificidad analtica.
Especificidad (diagnstica)
Proporcin de animales de referencia no infectados que se sabe que presentan un resultado negativo en la
prueba; se considera que los animales infectados que presentan un resultado positivo tienen resultados
positivos falsos.
Especificidad (relativa)
Proporcin de animales de referencia, definidos como negativos mediante un mtodo de prueba o una
combinacin de mtodos, que tambin dan resultado negativo en el ensayo que se compara.
Espcimen
Material sometido a prueba.
Esterilidad
Ausencia de microorganismos contaminantes viables, que se establecer mediante pruebas autorizadas y

adecuadas.
xx
Glosario de trminos
Exactitud
Nivel de concordancia entre el valor obtenido en la prueba y el valor esperado para un estndar de referencia
de actividad o ttulo conocido.
Incidencia
Estimacin del nmero de nuevas infecciones en una poblacin susceptible durante un perodo de tiempo
determinado; no debe confundirse con la prevalencia.
Inculo de produccin
Un organismo en un determinado nmero de pases, que se utiliza, sin propagacin adicional, para iniciar la
preparacin de un lote de produccin.
Inculo de trabajo
Organismo con un nmero de pases comprendido entre el inculo original y el inculo de produccin.
Inculo original (agente, cepa)
Conjunto de alcuotas de un organismo de un determinado nmero de pases, del que se derivan todos los otros
pases del inculo, que se obtienen de un lote individual, se distribuyen en recipientes en una operacin
individual, se procesan conjuntamente y se almacenan de forma que queden aseguradas la uniformidad y la
estabilidad y se eviten la contaminacin.
Laboratorio de referencia
Laboratorio de reconocido nivel de capacitacin cientfica y diagnstica en que concierne a una determinada
enfermedad animal y/o a la metodologa de pruebas; incluye la capacidad para describir y evaluar los reactivos y
muestras de referencia.
Libre de patgenos especficos (SPF)
Animales de los que se ha demostrado, mediante el uso de pruebas adecuadas, que estn libres de
microorganismos patgenos especficos; tambin se refiere a los huevos provenientes de aves SPF.
Lnea celular
Lnea de clulas transformada y estable que tiene una alta capacidad de multiplicacin in vitro.
Lote
Todas las vacunas u otros reactivos, tales como antgeno o antisueros, derivados del mismo lote homogneo e
identificados mediante un solo nmero de cdigo.
Mtodo de la prueba
Procedimiento tcnico especfico para la deteccin del material a analizar (sinnimo de ensayo).
Muestra
Material obtenido de un espcimen y utilizado en las pruebas.
Potencia
La potencia relativa de un producto biolgico puesta de manifiesto por los mtodos de prueba apropiados.
(Inicialmente, la potencia se mide utilizando una prueba de eficacia en animales. Ms tarde aquella puede
correlacionarse con pruebas de contenido antignico, o respuesta a anticuerpos, para pruebas rutinarias de
potencia de lotes.
Precisin
Grado de dispersin de los resultados para una muestra ensayada repetidamente.
Prevalencia
Estimacin de la proporcin de animales infectados dentro de una poblacin en un momento dado. No debe
confundirse con la incidencia.
xxi
Glosario de trminos
Producto final(lote)
Todos los recipientes finales sellados, que se han llenado a partir de un mismo lote homogneo de vacunas en
una sesin de trabajo, liofilizados conjuntamente en una operacin continua (si es pertinente), sellados en una
sesin de trabajo e identificados con un nmero de cdigo nico.
Prueba de suficiencia
Medicin de la competencia del laboratorio mediante la comparacin entre laboratorios; esta definicin implica
que los laboratorios participantes utilizan los mismos mtodos de prueba, los mismos reactivos y controles y que
los resultados se expresan cualitativamente.
Pruebas
Mtodos de prueba que aparecen en el Manual de Animales Terrestres, que se consideran adecuados
para el diagnstico de las enfermedades en un mbito local y que tambin pueden utilizarse para la
importacin y exportacin reguladas por convenios bilaterales.
Pruebas confirmativas
Mtodos de prueba de alta especificidad diagnstica que se utilizan para confirmar resultados,
generalmente resultados positivos, derivados de otros mtodos de prueba.
Pruebas de criba
Pruebas de alta sensibilidad diagnstica adecuadas para aplicacin a gran escala.
Pruebas prescritas
Los mtodos de prueba exigidos por el Cdigo de Sanidad Animal de la OIE para el transporte
internacional de animales y productos animales, y que se consideran ptimos para determinar el estado
sanitario de los animales.
Pruebas de equivalencia
Determinacin de ciertas caractersticas de realizacin de la prueba, propias de mtodos de prueba nuevos y/o
diferentes, mediante la comparacin con un mtodo de prueba estndar llevada a cabo por varios laboratorios.
En esta definicin est implcito que los laboratorios participantes utilizan sus propios mtodos de prueba, sus
reactivos y controles, y que los resultados se expresan de forma cualitativa.
Punto de corte/umbral
Valor resultante de una prueba seleccionado para distinguir entre resultados positivos y negativos, y que puede
incluir zonas indeterminadas o sospechosas.
Pureza
Calidad de un producto biolgico preparado hasta su forma final y:

a)
Relativamente libre de microorganismos y material (orgnico e inorgnico) extraos, lo que vendr avalado
por mtodos de prueba adecuados al producto; y
b)
Libre de microorganismos y material extraos que podran afectar de forma adversa a la inocuidad, la
potencia o la eficacia del producto.
Reaccin cruzada
Actividad detectable en un mtodo de prueba, atribuible a un material a analizar procedente de, o producido por
otro organismo que da como resultado una reaccin positiva falsa; los ensayos de este tipo tienen una
especificidad analtica baja.
Reactivos estndar
Reactivos estndar internacionales

Reactivos estndar por medio de los cuales se contrastan los dems reactivos y pruebas; preparados y
distribuidos por un Laboratorio Internacional de Referencia, para ser remitidos a los Laboratorios
Nacionales.
xxii
Glosario de trminos
Reactivos estndar nacionales

Los reactivos estndar contrastados mediante comparacin con los reactivos estndar internacionales; son
preparados y distribuidos por los laboratorios de referencia nacionales para ser remitidos a las redes de
laboratorios nacionales.
Estndares de trabajo (reactivos)

Reactivos estndar contrastados mediante comparacin con los reactivos estndar nacionales; se
incluyen en las pruebas de diagnstico rutinarias como control y/o para normalizacin de los resultados de
la prueba.
Repetibilidad
Nivel de acuerdo entre las rplicas de una muestra, tanto dentro una aplicacin como entre varias aplicaciones
del mismo mtodo de prueba en un mismo laboratorio.
Reproducibilidad
La capacidad que una prueba tiene de proporcionar resultados consistentes cuando se aplica a las alcuotas de
la misma muestra en diferentes laboratorios.
Seguridad
Ausencia de propiedades causantes de reacciones locales indebidas o sistmicas, cuando se utilizan como
recomendadas o sugeridas por el fabricante, y sin riesgo conocido para los animales prximos, los humanos o el
medio ambiente.
Sensibilidad (analtica)
La cantidad ms pequea del material de prueba que se puede detectar; el material de prueba puede consistir
en anticuerpos, antgenos, cidos nucleicos u organismos vivos.
Sensibilidad (diagnstica)
Proporcin de animales de referencia infectados que se sabe que dan resultado positivo en la prueba; se
considera que los animales infectados que presentan un resultado negativo tienen resultados negativos falsos.
Sensibilidad (relativa)
Proporcin de animales de referencia, definida como positiva por un mtodo o por una combinacin de mtodos
de prueba, que tambin presentan un resultado positivo en el ensayo que se compara.
Temperatura ambiente
El trmino temperatura ambiente se refiere a la temperatura de un entorno de trabajo confortable. No se

pueden fijar lmites precisos para este trmino, pero las cifras de referencia son 1825C. Cuando en una
prueba se especifica la temperatura ambiente, sta debera lograrse con aire acondicionado, si es preciso; de lo
contrario, los parmetros de la prueba pueden verse afectados.
Valor predictivo (negativo)
Proporcin de animales con resultado negativo en una prueba sin estar realmente infectados; el valor predictivo
est influido por la sensibilidad y especificidad diagnstica, as como por la prevalencia de la infeccin.
Valor predictivo (positivo)
Proporcin de animales que estn realmente infectados y presentan un resultado positivo en una prueba; el
valor de prediccin est influenciado por la sensibilidad y especificidad diagnstica, as como por la prevalencia
de la infeccin
*
* *
xxiii
COLABORADORES
L IS T A DE C O L A BO RA DO RE S Y DIRE C C IO NE S P RO F E S IO NA L E S
Los captulos del Manual de animales terrestres han sido confeccionados mediante invitacin
expresa de la OIE a sus respectivos autores. Siguiendo el procedimiento estndar de esta
organizacin, los captulos se distribuyen entre sus pases miembros y entre expertos en la
enfermedad correspondiente a fin de recabar sus comentarios. A continuacin, la Comisin de
Estndares Biolgicos y el Editor Consultor de la OIE proceden a incorporar al texto las
modificaciones propuestas. Una vez completado el proceso de revisin del texto y finalizada su
redaccin, el Manual de animales terrestres se present al Comit Internacional de la OIE durante
su Sesin General Anual para su aprobacin antes de publicarse. De esta forma, el Manual se ha
convertido en un texto estndar de la OIE como fruto del consenso internacional. Por esta razn,
los nombres de los colaboradores no aparecen en la cabecera del correspondiente captulo sino
que se ofrecen en un listado global. La Comisin de Estndares Biolgicos valora enormemente el
trabajo de los siguientes colaboradores:
I.1.1. Mtodos de muestreo
Dr J.E. Pearson
4016 Phoenix St., Ames, Iowa 50014, USA.
I.1.2. Gestin de calidad en los laboratorios de

pruebas veterinarias
Dr A. Wiegers
USDA, APHIS, VS, Center for Veterinary
Biologics, Policy, Evaluation, and Licensing,
Biotechnology, Immunology, and Diagnostics, 510
South 17th Street, Suite 104, Ames, Iowa 50010,
USA.
I.1.3. Principios de validacin para las pruebas de

diagnstico de enfermedades infecciosas
Dr R. Jacobson (retired)
Formerly Diagnostic Laboratory, College of
Veterinary Medicine, Cornell University, Ithaca,
New York 14850-5786, USA.
I.1.4. Validacin y control de calidad de los mtodos

de la reaccin en cadena de la polimerasa
utilizados para el diagnstico de enfermedades
infecciosas
Dr S. Belak & Dr P. Thorn

Department of Virology, National Veterinary
Institute, Ulls vg 2B, SE-751 89 Uppsala,
Sweden
I.1.5. Pruebas para esterilidad y ausencia de

contaminacin en materiales biolgicos
Dr L. Elsken
USDA, APHIS, Center for Veterinary Biologics,
Suite 104, 510 South 17th Street, Ames, Iowa
50010, USA.
I.1.6. Seguridad humana en los laboratorios

veterinarios de microbiologa
Dr M. Best
Office of Laboratory Security, Centre for
Emergency Preparedness and Response, Health
Canada, Ottawa, Ontario K1A 0K9, Canada.
I.1.7. Principios de produccin de vacunas

veterinarias
Dr D.A. Espeseth
Espeseth Consulting, 404 Long Leaf Drive,
Perkasie, Pennsylvania 18944, USA.
xxiv
Colaboradores
I.1.8. La Biotecnologa en el diagnstico de las

enfermedades infecciosas y el desarrollo de
vacunas
Dr J. Gorham
College of Veterinary Medicine, Department of
Veterinary Microbiology and Pathology,
Washington State University, Pullman,
Washington 99164-7030, USA.
Dr D. Knowles & Dr H. Li
Animal Disease Research Unit, ARS, USDA,
Prof. P.-P. Pastoret
Institute for Animal Health, Compton Laboratory,
Compton, Newbury, Berkshire RG20 7NN, UK.
I.1.9. El papel de los organismos oficiales en la

regulacin internacional de los productos
biolgicos de uso veterinario
Dr Ph. Vannier
AFSSA Ploufragan, Laboratoire dtudes et de
recherches avicoles et porcines, Zoople des
Ctes dArmor-Les Croix, BP 53, 22440
Ploufragan, France.
Prof. P.-P. Pastoret
Institute for Animal Health, Compton Laboratory,
Compton, Newbury, Berkshire RG20 7NN, UK.
Dr D.A. Espeseth
Espeseth Consulting, 404 Long Leaf Drive,
Perkasie, Pennsylvania 18944, USA.
Dr O. Itoh
National Veterinary Assay Laboratory, JMAFF,
1-15-1 Tokura, Kokubunji, Tokyo 185-8511,
Japan.
I.1.10. Mtodos de laboratorio para ensayos de

sensibilidad de bacterias frente a antimicrobianos
Dr D. White
Centre for Veterinary Medicine, Food and Drug
Administration, Office of Research, HFV-530,
8401 Muirkirk Road, Laurel, Maryland 20708,
USA.
2.1.1. Fiebre aftosa
Dr R.P. Kitching
National Centre for Foreign Animal Disease,
1015 Arlington Street, Winnipeg, Manitoba
R3E 3M4, Canada.
Dr P.V. Barnett & Dr D.K.J. Mackay
Institute for Animal Health, Pirbright Laboratory,
Ash Road, Pirbright, Surrey GU24 0NF, UK.
Dr A.I. Donaldson,
290 London Road, Burpham, Guildford, Surrey
GU4 7LB, UK
2.1.2. Estomatitis vesicular
Dr B. Schmitt
USDA, APHIS, National Veterinary Services
Laboratories, P.O. Box 844, Ames, Iowa 50010,
USA.
xxv
Colaboradores
2.1.3. Enfermedad vesicular porcina
Dr R.P. Kitching
R3E 3M4, Canada.
Dr D.K.J. Mackay
Dr A.I. Donaldson,
290 London Road, Burpham, Guildford, Surrey
GU4 7LB, UK
2.1.4. Peste bovina
Dr W.P. Taylor
8 South Terrace, Littlehampton, West Sussex
BN17 5NZ, UK.
Dr P. Roeder
Animal Health Service, Animal Production and
Health Division, FAO, Vialle delle Terme di
Caracalla, 00100 Rome, Italy.
2.1.5. Peste de los pequeos rumiantes
Dr A. Diallo
FAO/IAEA Centre for ELISA and Molecular
Techniques in Animal Disease Diagnosis,
International Atomic Energy Agency
Wagramerstrasse 5, P.O. Box 100, A-1400
Vienna, Austria.
2.1.6. Pleuroneumona bovina contagiosa
Dr F. Thiaucourt
CIRAD-EMVT, Campus international de
Baillarguet, Montferriez-sur-Lez, B.P. 5035, 34032
Montpellier Cedex 1, France.
2.1.7. Dermatosis nodular contagiosa
Dr R.P. Kitching
R3E 3M4, Canada.
Dr V. Carn
Highbury, Thornford, Sherborne, Dorset
DT9 6QD, UK.
2.1.8. Fiebre del Valle del Rift
Dr G.H. Gerdes
Onderstepoort Veterinary Institute, Private Bag
X05, Onderstepoort 0110, South Africa.
2.1.9. Lengua azul
Dr B. Eaton
Australian Animal Health Laboratory, CSIRO,
Livestock Industries, 5 Portarlington Road,
Geelong, Victoria 3220, Australia.
2.1.10. Viruela ovina y viruela caprina
Dr R.P. Kitching
R3E 3M4, Canada.
Dr V. Carn
Highbury, Thornford, Sherborne, Dorset
DT9 6QD, UK.
xxvi
Colaboradores
2.1.11. Peste equina africana
Prof. J.M. Snchez-Vizcano

Catedrtico del rea de Sanidad Animal,
Universidad Complutense, Facultad de
Veterinaria, Avda. Puerta de Hierro s/n, 28040
Madrid, Spain.
2.1.12. Peste porcina africana
Dr P.J. Wilkinson (retired)

Dr D.J. Paton
2.1.13. Peste porcina clsica (clera del cerdo)
Dr D.J. Paton
Dr T. Drew
VLA Weybridge, New Haw, Addlestone, Surrey
KT15 3NB, UK.
2.1.14. Gripe aviar muy virulenta

2.1.15. Enfermedad de Newcastle
Dr D.J. Alexander
VLA Weybridge, New Haw, Addlestone,
Surrey KT15 3NB, UK.
2.2.1. Carbunco
Dr P.R. Coker
Biological Safety Officer, Office of University
Research Compliance, Oklahoma State
University, Stillwater, Oklahoma 74078, USA.
2.2.2. Enfermedad de Aujeszky
Prof. B. Toma & Prof. N. Haddad

Ecole nationale vtrinaire dAlfort, 7 avenue du
Gnral de Gaulle, 94704 Maisons-Alfort Cedex,
France.
Dr Ph. Vannier
AFSSA Ploufragan, Laboratoire dtudes et de
recherches avicoles et porcines, Zoople des
Ctes dArmor-Les Croix, BP 53, 22440
Ploufragan, France.
2.2.3. Equinococosis/Hidatisodis
Prof. P.S. Craig

Division of Biological Sciences, School of
Environment & Life Sciences, University of
Salford, Salford M5 4WT, UK.
2.2.4. Leptospirosis
Prof. C.A. Bolin

Diagnostic Center for Population & Animal Health,
College of Veterinary Medicine, A3 Veterinary
Medical Center, Michigan State University, East
Lansing, Michigan 48824, USA.
2.2.5. Rabia
Dr F. Cliquet & Dr J. Barrat

AFSSA Nancy, Domaine de Pixrcourt, BP 9,
F-54220 Malzeville, France.
2.2.6. Paratuberculosis (enfermedad de Johne)
Dr M.-F. Thorel
AFSSA Alfort, Laboratoire dtudes et de
Recherches en Pathologie Animale et Zoonoses,
22 rue Pierre Curie, BP 67, 94703 Maisons-Alfort
Cedex, France.
xxvii
Colaboradores
Dr E. Camus
CIRAD-EMVT, Campus International de
Baillarguet TA/30B, 34398 Montpellier Cedex 5,
France.
2.2.7. Cowdriosis
Dr D. Martinez
CIRAD-EMVT, Domaine de Duclos, Prise dEau,
97170 Petit-Bourg, Guadeloupe.
Prof. F. Jongejan
Department of Parasitology & Tropical Veterinary
Medicine, Faculty of Veterinary Medicine, Utrecht
University, P.O. Box 80.165, 3508 TD Utrecht,
The Netherlands
AND
Department of Veterinary Tropical Diseases,
Faculty of Veterinary Science, University of
Pretoria, Onderstepoort 0110, South Africa.
2.2.8. Larva perforada del Nuevo Mundo (Cochliomyia
hominivorax) y del Viejo Mundo (Chrysomya
bezziana)
Dr M.J.R. Hall
Department of Entomology, The Natural History
Museum, Cromwell Road, London SW7 5BD, UK.
2.2.9. Triquinelosis
Dr H.R. Gamble
Director, Fellowships Office, National Research
Council, 500 Fifth Street NW, Washington DC
20001, USA.
2.2.10. Fiebre Q
Dr E. Rousset, Dr P. Russo, Dr M. Ppin,

& M.F. Aubert
AFSSA Sophia Antipolis, Laboratoire dtudes et
de Recherches sure les Petits Ruminants et les
Abeilles, Les Templiers, 105 route des Chappes,
BP 111, 06902 Sophia Antipolis Cedex, France.
2.2.11. Leishmaniosis
Dr L. Gradoni & Dr M. Gramiccia

Istituto Superiore di Sanit, Laboratorio
di Parassitologia, Viale Regina Elena 299,
I-00161 Rome, Italy.
2.3.1. Brucelosis bovina
Dr K. Nielsen
Canadian Food Inspection Agency, Animal
Diseases Research Institute, P.O. Box 11300,
Station H, Nepean, Ontario K2H 8P9, Canada.
Dr D.R. Ewalt
Mycobacteria and Brucella Section, Diagnostic
Bacteriology Laboratory, National Veterinary
Services Laboratories, 1800 Dayton Road, Ames,
Iowa 50010, USA.
Y la importante contribucin del Grupo Ad hoc de la
OIE en Brucelosis:
Dr B. Garin-Bastuji
AFSSA Alfort, Unit Zoonoses Bactriennes, Lab.
OIE/FAO de rfrence pour la brucellose, 22 rue
Pierre Curie, BP 67, 94703 Maisons-Alfort Cedex,
France.
Dr A.P. MacMillan
KT15 3NB, UK.
Dr Peter Wright
Canadian Food Inspection Agency, National
Centre for Foreign Animal Disease, 1015
Arlington Street, Winnipeg, Manitoba R3E 3M4,
Canada
2.3.2. Campilobacteriosis genital bovina
xxviii
Dr J.A. Wagenaar & M.A.P. Van Bergen, BSc

Animal Sciences Group, P.O. Box 65, 8200 AB
Lelystad, The Netherlands.
Colaboradores
2.3.3. Tuberculosis bovina
Dr N.M.A. Palmer
KT15 3NB, UK.
2.3.4. Leucosis bovina enzotica
Dr L. Renstrm
National Veterinary Institute, Department of
Virology, SE-751 89 Uppsala, Sweden.
2.3.5. Rinotraqueitis bovina infecciosa /vulvovaginitis

pustular infecciosa
Prof. J.T. van Oirschot

Animal Sciences Group - Wageningen UR, P.O.
Box 65, 8200 AB, Lelystad, The Netherlands.
2.3.6. Tricomonosis
Prof. M. Taylor
Veterinary Surveillance Unit, Central Science
Laboratory, Sand Hutton, York YO41 1LZ, UK.
Dr A.A. Gajadhar & Dr S. Parker
Canadian Food Inspection Agency, Saskatoon
Laboratory, 116 Veterinary Road, Saskatoon,
Saskatchewan S7N 2R3, Canada.
2.3.7. Anaplasmosis bovina
Prof. T.F. McElwain

Washington State University, Animal Disease
Diagnostic Laboratory, 155 Bustad Hall, Pullman,
2.3.8. Babesiosis bovina
Dr R.E. Bock
Queensland Department of Primary Industries,
Animal and Plant Health Service, Tick Fever
Research Centre, 280 Grindle Road, Wacol,
Queensland 4076, Australia.
Dr W.K. Jorgensen & Mr J.B. Molloy
Queensland Department of Primary Industries,
Agency for Food & Fibre Sciences, 665 Fairfield
Rd, Yeerongpilly, Queensland 4105, Australia.
2.3.9. Cisticercosis bovina (ver captulo 2.10.1.)
Dr S. Lloyd
Department of Clinical Veterinary Medicine,
University of Cambridge, Madingley Road,
Cambridge CB3 0ES, UK.
2.3.10. Dermatofilosis
Prof. D.H. Lloyd

Dept of Veterinary Clinical Sciences, Royal
Veterinary College, Hawkshead Lane, North
Mymms, Hatfield, Hertfordshire AL9 7TA, UK.
2.3.11. Teileriosis
Prof. E. Pipano
Koret School of Veterinary Medicine, The Hebrew
University of Jerusalem, P.O. Box 12 Rehovot,
Israel.
Dr S. Morzaria
FAO Regional Office for Asia and the Pacific,
39 Phra Athit Road, Bangkok 10200, Thailand.
Dr P. Spooner
International Livestock Research Institute,
Naivasha Road, Nairobi 00100, Kenya.
Dr V. Shkap
Division of Parasitology, Kimron Veterinary
Institute, P.O. Box 12, Beit Dagan, 50250 Israel.
xxix
Colaboradores
2.3.12 Septicemia hemorrgica
Dr S. Chandrasekaran
Veterinary Research Institute, 59 Jalan Suntan
Azlan Shah, P.O. Box 369, 31400 Ipoh, Perak,
Malaysia.
Dr K. Townsend
Diagnostic Bacteriology Laboratory, Veterinary
Pathology and Anatomy, School of Veterinary
Science, The University of Queensland, Brisbane
QLD 4072, Australia.
2.3.13. Encefalopata espongiforme bovina
Dr D. Matthews, Dr M. Jeffrey, Dr M.M. Simmons,

Mr M. Stack, Mr G.A.H. Wells & Prof. J.W.
Wilesmith
2.3.14. Fiebre catarral maligna
Dr H.W. Reid
Moredun Research Institute, International
Research Centre, Pentlands Science Park, Bush
Loan, Penicuik EH26 0PZ, Scotland, UK.
2.3.15. Tripanosomosis (transmitida por la mosca ts

ts)
Dr J. Schlater
USA.
Dr P. Van Den Bossche
Veterinary Department, Institute of Tropical
Medicine, Nationalestraat 155, 2000 Antwerpen
Belgium
AND
Pretoria, Post Bag X04, Onderstepoort 0110,
South Africa
2.4.1. Epididimitis ovina (Brucella ovis)

2.4.2. Brucelosis caprina y ovina (excluyendo la
infeccin por Brucella ovis)
Dr B. Garin-Bastuji
AFSSA, Unit Zoonoses Bactriennes, OIE
Reference Laboratory/FAO Collaborating Centre
for Brucellosis, BP 67, F-94703 Maisons-Alfort
Cedex, France.
Dr J.M. Blasco
Dpt Sanidad Animal, Servicio de Investigacion
Agraria/DGA, Apartado 727, 50080 Zaragoza,
Spain.
2.4.3. Agalaxia contagiosa
Dr R. Nicholas
2.4.4/5. Artritis/encefalitis caprina y Maedi-visna
Dr D. Knowles & Dr L.M. Herrmann

Animal Disease Research Unit, ARS, USDA,
2.4.6. Pleuroneumona caprina contagiosa
Dr F.R Rurangirwa
Department of Veterinary Microbiology and
Pathology, Washington State University, Pullman,
Dr J.H. Kinyili
Kenya Veterinary Vaccines Production Institute,
P.O. Box 53260, Nairobi, Kenya.
2.4.7. Aborto enzotico de las ovejas (Clamidiosis

ovina)
xxx
Prof. I.D. Aitken & and Dr D. Longbottom

Research Centre, Pentlands Science Park
Bush Loan, Penicuik EH26 0PZ, UK.
Colaboradores
2.4.8. Prurigo lumbar
Dr D. Matthews, Dr M. Jeffrey Dr M.M. Simmons,

Mr M. Stack & Mr G.A.H. Wells
KT15 3NB, UK.
2.4.9. Adenomatosis pulmonar ovina
Dr J.M. Sharp
VLA, Pentlands Science Park, Bush Loan,
Penicuik EH26 0PZ, Scotland, UK.
2.4.10. Enfermedad de Nairobi (ver captulo 2.10.2.)
Dr G.H. Gerdes
2.4.11. Salmonelosis (S. abortus ovis)

(ver captulo 2.10.3.)
Dr R. Davies
KT15 3NB, UK.
Prof. M. Truszczynski
National Veterinary Research Institute,
57 Partyzantow St., 24-100 Pulawy, Poland.
2.5.1. Metritis equina contagiosa
Dr N. Chanter
Intervet UK Ltd, Walton Manor, Walton, Milton
Keynes MK7 7AJ, UK.
2.5.2. Durina
Dr J.B. Katz
USA.
2.5.3. Encefalomielitis equina (del Este y del Oeste)

2.5.4. Anemia infecciosa equina
Dr E.N. Ostlund
USA.
2.5.5. Gripe equina
Dr J. Daly
Animal Health Trust, Lanwades Park, Kentford,
Newmarket, Suffolk CB8 7UU, UK.
2.5.6. Piroplasmosis equina
Dr D.T. de Waal
University College Dublin, Faculty of Veterinary
Medicine, Department of Veterinary Microbiology
& Parasitology, Belfield, Dublin 4, Ireland.
2.5.7. Rinoneumonitis equina
Dr G.P. Allen
Department of Veterinary Science,
College of Agriculture, University of Kentucky, 108
M.H. Gluck Equine Research Center, Lexington,
Kentucky 40546-0099, USA.
2.5.8. Muermo
Dr N.K. Bookova,
All-Russian State Centre for Quality and
Standardisation of Veterinary Drugs and Feeds,
Ministry of Agriculture of the Russian Federation,
5, Zvenigorodskoye shosse, 123022 Moscow,
RUSSIA.
2.5.10. Arteritis vrica equina
Dr P.J. Timoney
University of Kentucky, Department of Veterinary
Science, 108 Gluck Equine Research Center,
Lexington, Kentucky 40546-0099, USA.
2.5.12. Encefalomielitis equina venezolana
Dr E.N. Ostlund
USA.
2.5.13. Linfangitis epizotica
Dr J.A.W. Coetzer
Department of Veterinary Tropical Diseases,
Pretoria, Private Bag X04, Onderstepoort 0110,
South Africa.
xxxi
Colaboradores
2.5.14. Encefalitis japonesa
Dr I. Takashima
Laboratory of Public Health, Department of
Environmental Veterinary Sciences,
Graduate School of Veterinary Medicine,
Hokkaido University, Sapporo 060-0818, Japan.
2.5.15. Tripanosomosis (Trypanosoma evansi)
Dr A.G. Luckins
Centre for Tropical Veterinary Medicine, Easter
Bush Veterinary Centre, Roslin, Midlothian,
Scotland EH25 9RG, UK.
2.6.1. Rinitis atrfica porcina
Dr K. Register
USDA, ARS, National Animal Disease Center,
2300 Dayton Avenue, Ames, Iowa 50010, USA.
2.6.2. Brucelosis porcina
Dr Steve Olsen,
2300 Dayton Avenue, Ames, Iowa 50010, USA.
2.6.3. Encefalomielitis por enterovirus (anteriormente

enfermedades de Teschen/Talfan)
Dr V. Mdr
Hudcova 66, 62100 Brno, Czech Republic.
2.6.4. Gastroenteritis transmisible
Dr D.J. Paton
Dr L.J. Saif
The Ohio State Universtiy, Ohio Agricultural
Research and Development Center, Food Animal
Health Research Program, 1680 Madison
Avenue, Wooster, Ohio 44691-4096, USA.
2.6.5. Sndrome reproductivo y respiratorio porcino
Dr L.R. Ludemann
USDA, APHIS, Center for Veterinary Biologics,
Laboratory, P.O. Box 844, Ames, Iowa 50010,
USA.
Dr R. Magar
Agence canadienne dinspection des aliments,
Laboratoire dhygine vtrinaire et alimentaire,
3400 Casavant ouest, Saint-Hyacinthe, Qubec
J2S 8E3, Canada.
2.6.6. Cisticercosis porcina (ver captulo 2.10.1.)
Dr S. Lloyd
2.7.1. Bursitis infecciosa (Enfermedad de Gumboro)
Dr N. Eterradossi
AFSSA Ploufragan, Unit de virologie,
immunologie et parasitologie aviaires et
cunicoles, BP 53, 22440 Ploufragan, France
2.7.2. Enfermedad de Marek
Dr J.M. Sharma
Veterinary PathoBiology, College of Veterinary
Medicine, University of Minnesota, St Paul,
Minnesota 55127, USA.
2.7.3. Micoplasmosis aviar

(Mycoplasma gallisepticum)
Dr S.H. Kleven
University of Georgia, College of Veterinary
Medicine, Department of Avian Medicine, Athens,
Georgia 30602-4875, USA.
Dr F.T.W. Jordan & Dr J.M. Bradbury
University of Liverpool, Department of Veterinary
Pathology, Veterinary Field Station, Leahurst,
Neston, South Wirral CH64 7TE, UK.
2.7.4. Clamidiosis aviar
xxxii
Dr A.A. Andersen
P.O. Box 70, Ames, Iowa 50010, USA.
Colaboradores
2.7.5. Pulorosis y tifosis aviar
Dr R. Davies
KT15 3NB, UK.
2.7.6. Bronquitis infecciosa aviar
Dr R. Gough (retired) & Dr D.J. Alexander

KT15 3NB, UK.
2.7.7. Laringotraqueitis infecciosa aviar
Dr R.C. Jones
University of Liverpool, Department of Veterinary
Pathology, Jordan Building, Veterinary Field
Station, Leahurst, Neston, South Wirral
CH64 7TE, UK.
2.7.8. Tuberculosis aviar
Dr M.-F. Thorel
AFSSA Alfort, Laboratoire central de recherches
vtrinaires, 22 rue Pierre Curie, BP 67, 94703
Maisons-Alfort Cedex, France.
2.7.9. Hepatitis vrica del pato

2.7.10. Enteritis vrica del pato
Dr P.R. Woolcock
California Animal Health and Food Safety
Laboratory System Fresno Branch, School of
Veterinary Medicine, University of California,
Davis, 2789 South Orange Avenue, Fresno,
California 93725, USA.
2.7.11. Clera aviar (Pasteurelosis aviar)
Dr R. Kunkle,
National Animal Disease Center, P.O. Box 70,
Ames, Iowa 50010, USA.
2.7.12. Viruela aviar
Dr D.N. Tripathy
University of Illinois at Urbana-Champaign,
College of Veterinary Medicine, Department of
Veterinary Pathbiology, 2001 South Lincoln
Avenue, Urbana, Illinois 61802, USA.
2.8.1. Mixomatosis
Prof. J. Chantal (retired) & Prof. S. Bertagnoli

cole Nationale Vtrinaire, 23 Chemin de
Capelles, 31076 Toulouse Cedex 03, France.
2.8.2. Tularemia
Dr T. Mrner
Department of Wildlife, The National Veterinary
Institute, 751 89 Uppsala, Sweden
Dr G. Sandstrm
Department of Clinical Immunology, Infectious
Diseases, Ume University and National Defence
Research Establishment, SE-901 82 Ume,
Sweden.
2.8.3. Enfermedad hemorrgica del conejo
Dr A. Lavazza & Dr L. Capucci

Istituto Zooprofilattico Sperimentale della
Lombardia e dellEmilia Romagna, Via Bianchi
7/9, 25124 Brescia, Italy.
2.9.1. Acariosis de las abejas
Dr W. Ritter
CVUA-Freiberg, Animal Health, Am Moosweiher
2, D79018 Freiberg, Germany.
2.9.2. Loque americana
Prof. D.C. de Graaf

Laboratory of Zoophysiology, University of Gent,
K.L. Ledeganckstraat 35, B-9000 Gent, Belgium.
2.9.3. Loque europea
Dr B.V. Ball
Plant and Invertebrate Ecology Division,
Rothamstead Research, Harpenden,
Hertfordshire AL5 2JQ, UK.
2.9.4. Nosemosis de las abejas
Dr A. de Ruijter
Research Centre for Insect Pollination and
Beekeeping, Ambrosiusweg 1, 5081 NV
Hilvarenbeek, The Netherlands.
xxxiii
Colaboradores
2.9.5. Varroosis
Dr W. Ritter
CVUA-Freiberg, Animal Health, Am Moosweiher
2, D79018 Freiberg, Germany.
2.9.6. Infestacin de las abejas melferas por

Tropilaelaps (Tropilaelaps clareae, T. koenigerum)
Dr D. Sammataro
Carl Hayden Honey Bee Research Center,
2000 East Allen Road, Tucson, Arizona 857191596, USA.
2.10.1. Cisticercosis
Dr S. Lloyd
2.10.2. Enfermedades bunyavirales de animales

excluyendo la Fiebre del Valle del Rift
Dr G.H. Gerdes
2.10.3. Salmonelosis
Dr R. Davies
KT15 3NB, UK.
2.10.4. Sarna
Dr P. Bates
KT15 3NB, UK.
2.10.5. Enfermedad de la frontera
Dr P.F. Nettleton
Research Centre, Pentlands Science Park, Bush
Loan, Penicuik EH26 0PZ, Scotland, UK.
2.10.6. Diarrea vrica bovina
Dr T. Drew
KT15 3NB, UK.
2.10.7. Encefalitis del Oeste del Nilo
Dr E.N. Ostlund
United States of America.
2.10.8. Campylobacterosis
Dr Diane Newell
KT15 3NB, UK.
Dr W.F. Jacobs-Reitsma & Dr J.A. Wagenaar
Animal Sciences Group, Wageningen UR, P.O.
Box 65, 8200 AB Lelystad, The Netherlands.
2.10.9. Criptosporidiosis
Prof. H. Smith
Scottish Parasite Diagnostic Laboratory, Stobhill
General Hospital, Glasgow G21 3UW, UK.
2.10.10. Enfermedades vricas de Hendra y de Nipah
Dr B.T. Eaton & Dr P. Daniels

Australian Animal Health Laboratory, CSIRO,
Livestock Industries, 5 Portarlington Road,
Geelong, Victoria 3220, Australia.
Dr M. Narasiman
Veterinary Research Institute, 59, Jalan Sultan
Azlan Shah, 31400 Ipoh, Perak, Malaysia.
2.10.11. Gripe porcina
Dr S.L. Swenson
National Veterinary Services Laboratories, P.O.
Box 844, Ames, Iowa 50010, USA.
Dr P.L. Foley
Center for Veterinary Biologics, 510 S. 17th St.,
Suite 104, Ames, IA 50010 USA
2.10.12. Toxoplasmosis
xxxiv
Dr D. Buxton & Dr S.W. Maley

Moredun Research Institute, Pentlands Science
Park, Bush Loan, by Edinburgh EH26 0PZ,
Scotland, UK.
Colaboradores
2.10.13. Escherichia coli Verocitotoxignica
Dr F.A. Clifton-Hadley
KT15 3NB, UK.
2.10.14. Listeria monocytogenes
Dr Jose Lopez
Canadian Food Inspection Agency,
R3E 3M4, Canada.
xxxv
C O MIT D IRE C T O R P A RA L O S P RO YE C T O S DE L A OIE DE T RA DUC C I N A L E S P A O L

DE L M A NUA L O F D IA GNO S T IC T E S T S A ND V A C C INE S F O R T E RRE S T RIA L A NIMA L S Y
E L A BO RA C I N DE UNA B A S E T E RMINO L GIC A M UL TIL INGE PA RA E L MBITO DE
L A S A NIDA D A NIMA L .
Presidente
Vicepresidente
Excmo. Sr. D. Bernard Vallat
Ilmo. Sr. D. Jean-Luc Angot
Director General
Organizacin Mundial de Sanidad Animal, OIE
12, rue de Prony 75017 Paris. France.
Tfno: 33 (0) 1 44 15 18 88
Fax: 33 (0) 1 42 67 09 87
Correo electrnico: b.vallat@oie.int
Jefe del Servicio Administrativo y Financiero

12, rue de Prony 75017 Paris. France.
Tfno: 33 (0) 1 44 15 18 88
Fax: 33 (0) 1 42 67 09 87
Correo electrnico: l-l.angot@oie.int
Vocales
Ilmo. Sr. D. Arnaldo Cabello Navarro
Dra. Da. Luz Alba Cruz de Urbina

Subgerente de Prevencin y Control
Instituto Colombiano Agropecuario (ICA)
Ministerio de Agricultura y Desarrollo Rural
Calle 37 n 8-43 PISO 4 Y 5.
Apartado Areo 7984 y 1511123
El Dorado
Santa Fe de Bogot. Colombia.
Tfno: (57-1) 32 o 3654
Fax: (57-1) 232 4695
Correo electrnico: savinal@elsitio.net.co
Subdirector General de Sanidad Animal.

Direccin General de Ganadera.
Ministerio de Agricultura, Pesca y Alimentacin.
Corazn de Mara n 8
28002 Madrid.
Tfno: 34 91 3 47 83 24
Fax: 34 91 3 47 82 99
Correo electrnico: acabello@mapya.es
Dr. D. Rodolfo Csar Acerbi
Dr. D. Emerio F. Serrano Ramrez
Coordinador Relaciones Internacionales e

Institucionales
Servicio Nacional de Sanidad y Calidad
Agroalimentaria SENASA
Avda. Paseo Coln. 367 5 p.cont.
1063 Buenos Aires.
Republica Argentina
Tfno: 00 (54) 11 4331-6041/9 INT. 1323
Fax: 00 (54) 11 4334-4738
Correo electrnico: relint@inea.com.ar
Director General del Instituto de

Medicina Veterinaria.
Ministerio de Agricultura.
Calle 12 n 355, entre 17 y 17
El Vedado.
Zona Postal 10400
Ciudad de la Habana. Cuba.
Tfno: (53-7) 83 06 6 15
Fax: (53-7) 830 35 37
Correo electrnico: dnimv@infoued.sld.cv
Secretario
Coordinador de la OIE
Profesor Dr. D. Fernando Crespo Len
Profesor Dr. D. Alejandro Schudel.
Experto de la OIE
Organizacin Mundial de Sanidad Animal
y de la Unin Europea
Investigador del Departamento de
Ganadera y Acuicultura del Instituto Murciano
de Investigacin y Desarrollo Agrario
y Alimentario. (IMIDA)
Calle mayor s/n. 30150 La Alberca. Murcia.
Espaa.
Tfno: 00 34 968 36 67 99
Fax: 00 34 968 36 67 92
Correo electrnico: fernando.crespo@carm.es
Jefe del Servicio Cientfico y Tcnico

12, rue de Prony 75017 Paris. France
Tfno: 33 (0) 1 44 15 18 88
Fax: 33 (0) 1 42 67 09 87
Correo electrnico: a.schudel@oie.int
xxxvi
Colaboradores
C O O RDINA C I N
C IE NT F IC O - T C NIC A
DE L A TRA DUC C I N
Profesor Dr. D. Fernando Crespo Len

Experto de la OIE
Organizacin Mundial de Sanidad Animal
y de la Unin Europea
Investigador del Departamento de Ganadera y
Acuicultura del Instituto Murciano
de Investigacin y Desarrollo Agrario
y Alimentario.(IMIDA)
Calle mayor s/n. 30150 La Alberca. Murcia.
Espaa.
Tfno: 00 34 968 36 67 99
Fax: 00 34 968 36 67 92
Correo electrnico: fernando.crespo@carm.es
C O O RDINA C I N
L INGS T IC A Y
TRA DUC TO L GIC A
Profesor Dr. D. Francisco Gutirrez Dez

Catedrtico de Filologa Inglesa
Director del Mster de Traduccin
e Interpretacin de la Universidad de Murcia
Dpto. de Filologa Inglesa
C/ Santo Cristo n 1. 30071. Murcia, Espaa
Tfno: 00 34 968 36 31 79
Fax: 00 34 968 36 31 85
Correo electrnico: fgut@um.es
G RUPO A D HO C PA RA L O S P RO YE C T O S DE L A OIE DE T RA DUC C I N A L E S P A O L

DE L M A NUA L O F D IA GNO S T IC T E S T S A ND V A C C INE S Y E L A BO RA C I N DE L A B A S E
T E RMINO L GIC A M UL TIL INGE PA RA E L MBITO DE L A S A NIDA D A NIMA L .
Profesor Dr. D. Elas Fernando Rodrguez Ferri
Catedrtico de Microbiologa e Inmunologa de la
Facultad de Veterinaria
Departamento de Sanidad Animal
Universidad de Len
Campus de Vagazana. 24071 Len. Espaa
Tfno: 00 34 987 29 12 97
Fax: 00 34 987 29 11 94
Correo electrnico: dsaerf@isidoro.unileon.es
Profesor Dr. D. Luis Len Vizcano

Catedrtico de Patologa Infecciosa de la
Universidad de Murcia, Espaa.
Departamento de Sanidad Animal
Campus de Espinardo. 30100 Murcia, Espaa
Tfno: 00 34 968 36 47 32
Fax: 00 34 968 36 41 47
Correo electrnico: lleonvi@um.es
Profesor Dr. D. Emilio J. Gimeno

Coordinator of OIE Representation for the
Americas (RR/AA)
Cervio 3101
1425 Buenos Aires. Repblica de Argentina
Tfno: (54-11) 48 03 48 77
Fax: (54-11) 48 03 36 88
Correo electrnico: rr.americas@oie.int
Profesor Dr. D. Jos Joaqun Cern Madrigal

Profesor Titular del Departamento de Medicina y
Ciruga Animal
Universidad de Murcia
Campus de Espinardo. 30100 Murcia. Espaa
Tfno: 968 36 47 22
Fax: 968 36 41 47
Correo electrnico: jjceron@um.es

Director del Mster de Traduccin e
Interpretacin de la Universidad de Murcia.
Dpto. de Filologa Inglesa. C/ Santo Cristo n 1.
30071. Murcia, Espaa.
Tfno: 00 34 968 36 31 79
Fax: 00 34 968 36 31 85
Profesor Dr. Pascual Cantos Gmez

Profesor Titular de Filologa Inglesa.
Departamento de Filologa Inglesa
Campus La Merced. C/ Santo Cristo n 1.
30071. Murcia Espaa.
Tfno: 00 34 968 36 43 65
Fax: 00 34 968 36 31 85
Correo electrnico: pcantos@um.es
Profesor Dr. D. Alejandro Schudel

Jefe del Servicio Cientfico y Tcnico
12, rue de Prony 75017 Paris. France
Tfno: 33 (0) 1 44 15 18 88
Fax: 33 (0) 1 42 67 09 87
Correo electrnico: a.schudel@oie.int
Director del Mster de Traduccin e
Interpretacin de la Universidad de Murcia.
Dpto. de Filologa Inglesa. C/ Santo Cristo n 1
30071. Murcia, Espaa.
Tfno: 00 34 968 36 31 79
Fax: 00 34 968 36 31 85
xxxvii
Colaboradores
T RA DUC TO RE S
Profesor Dr. D. Mariano Gacto Fernndez
Catedrtico de Microbiologa
Dpto. de Microbiologa y Gentica, Campus de
Espinardo, 30071-Murcia, Espaa
Fax. 00 34 968 36 39 63
Tfno: 00 34 968 36 71 32
Correo electrnico: maga@um.es
Profesora Dra. Da. Purificacin Snchez

Hernndez
Profesora Titular de Filologa Inglesa
Profesora del Mster de Traduccin e
Interpretacin
Dpto. Filologa Inglesa, C/ Santo Cristo, 1.30071-Murcia, Espaa
Tfno: 00 34 968 36 48 67
Fax: 00 34 968 36 31 85
Correo electrnico: purisan@um.es
Profesora Dra. Da. Jernima Vicente Soler

Profesora Titular de Microbiologa
Dpto. de Microbiologa y Gentica,
Campus de Espinardo, 30071-Murcia,
Espaa
Tfno: 00 34 968 43 03 29
Fax: 00 34 968 36 39 63
Correo electrnico: jerovic@um.es
Profesor Dr. D. Jos Cansado Vizoso
Da. Elena Cuadrado Caparrs

Licenciada en Biologa y Mster en
Traduccin e Interpretacin
Tfno: 00 34 968 21 55 24
Correo electrnico: islaplana@telefnica.net
Da. Ruth Elena Prez

Licenciada en Filologa Inglesa y Mster en
Traduccin e Interpretacin
C/ Olor Palme, 1, 7 B.- 30009-Murcia, Espaa
Tfno: 00 34 968 29 45 93
Correo electrnico: rutelena@ono.com
Profesor Titular de Microbiologa

Dpto. de Microbiologa y Gentica, Campus de
Espinardo, 30071-Murcia, Espaa
Fax: 968-363963
Tfno: 00 34 968 36 49 53
Correo electrnico: jcansado@um.es
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PARTE I
INFORMACIN GENERAL
SECCIN I.1.
CAPTULOS INTRODUCTORIOS
CAPTULO I.1.1.
MTODOS DE MUESTREO
INTRODUCCIN
El punto de partida para la investigacin de una enfermedad animal en el laboratorio es la toma de
muestras. Este primer captulo introductorio trata algunos de los principios generales relativos a la
toma, envo y almacenamiento de muestras. Cada uno de los captulos sobre enfermedades de
este Manual proporciona informacin especfica sobre la toma de muestras para esa enfermedad
concreta. Las muestras pueden tomarse de los animales o de su entorno con diferentes fines, tales
como el diagnstico de enfermedades, vigilancia de enfermedades, certificado sanitario o
seguimiento de la respuesta a un tratamiento o a la vacunacin. Para proporcionar resultados
estadsticos vlidos, las muestras recogidas debern ser idneas para el fin que se persigue y
adecuadas en cuanto al nmero y cantidad. Los laboratorios de diagnstico solicitan la entrega de
muestras adecuadas que lleguen al laboratorio en buenas condiciones. Para el diagnstico de una
enfermedad, los tejidos muestreados debern ser representativos de la enfermedad investigada y
de las lesiones observadas. Las muestras deben tomarse cuidadosamente con el fin de evitar
cualquier lesin o estrs excesivo para el animal o cualquier peligro para el operador. Las
muestras deben tomarse de forma asptica y se debe tener cuidado para evitar la contaminacin
cruzada.
Las muestras deben embalarse, etiquetarse y enviarse al laboratorio por el procedimiento ms
rpido posible, controlando convenientemente la temperatura. Se deben seguir los requisitos
especficos para el embalaje y expedicin de especmenes para diagnstico y sustancias
infecciosas. Tambin es necesario que el expedidor reciba instruccin sobre los procedimientos de
expedicin. Cuando se vaya a enviar material a un laboratorio de otro pas, se consultar
previamente con dicho laboratorio para asegurarse de que est dispuesto a recibir el material y a
obtener la correspondiente licencia de importacin. Todas las muestras debern acompaarse de
una carta o formulario de envo en el que se indique el nombre y la direccin del remitente, el
origen del material, el historial pertinente, identificacin del animal y espcimen correspondiente y
las pruebas solicitadas.
A. RECOGIDA DE MUESTRAS
Antes de tomar las muestras, debe tenerse en cuenta el fin para el que se solicitan. Dicho fin determinar el tipo
y nmero de muestras necesarias para obtener resultados vlidos. Cuando las muestras se tomen de animales
vivos, se llevar cuidado para evitar heridas o sufrimiento al animal o cualquier peligro para el operador y sus
ayudantes. Puede ser necesario el uso de sujecin mecnica, de anestsicos o de tranquilizantes. Siempre que
se maneje material biolgico de animales vivos o muertos, debe tenerse en cuenta el riesgo de contraer una
enfermedad zoonsica y, por lo tanto, deben tomarse precauciones para evitar la infeccin humana (vase
tambin el Captulo I.1.6. Seguridad humana en los laboratorios de microbiologa veterinaria). Los exmenes
post-mortem deben realizarse bajo las ms estrictas condiciones de asepsia posibles. Hay que procurar evitar la
contaminacin ambiental o el riesgo de propagar la enfermedad a travs de insectos o fomites. Debe organizarse
la forma apropiada y segura de deshacerse de animales y tejidos.
Captulo I.1.1. Mtodos de muestreo
Se requieren bastante habilidad y cuidado para decidir qu muestras son apropiadas para enviar al laboratorio.
Las muestras recogidas deben ser representativas de la enfermedad que se est investigando y de las lesiones
observadas. Con frecuencia, se requiere un combinado de muestras de sangre para pruebas serolgicas y de
tejidos procedentes de animales muertos o sacrificados selectivamente para cultivos microbiolgicos. Ms
adelante, dentro de este captulo, se describen recomendaciones para el transporte.
Los captulos sobre enfermedades contenidos en este Manual proporcionan una gua sobre las muestras que
deben tomarse, y, por lo tanto, no repetiremos aqu esa informacin. Adems, las autoridades nacionales e
internacionales han elaborado los procedimientos para la recogida de muestras y su envo (2, 4, 8, 11, 12). Estas
publicaciones ofrecen recomendaciones detalladas de muestras concretas que hay que tomar de diferentes
especies, y sobre una amplia variedad de enfermedades de cuya existencia se sospecha. Tambin proporcionan
informacin sobre los procedimientos post-mortem, listados de medios apropiados e instrucciones sobre el envo
de muestras. Se debera contactar con el laboratorio que vaya a realizar las pruebas para dilucidar cualquier
cuestin relacionada con el tipo de muestreo a realizar.
1.
Toma de muestras de animales vivos
a)
Sangre
Las muestras de sangre pueden tomarse para anlisis hematolgico, para cultivos y/o para el examen
directo de bacterias, virus o protozoos, en cuyo caso es normal el uso de anticoagulantes, como el etiln
diamino tetra-actico (EDTA) o heparina. Tambin se pueden tomar para pruebas serolgicas, en cuyo
caso se necesita una muestra coagulada. El plasma sanguneo tambin se usa para algunos
procedimientos. Las muestras de sangre se toman mediante venepuntura, de la forma ms limpia posible.
En la mayora de los grandes mamferos, se utiliza la vena yugular o una vena caudal, pero tambin se
pueden utilizar venas braquiales y mamarias. En las aves, generalmente se utiliza una vena del ala (vena
braquial). En los animales pequeos de laboratorio, las venas auricular o retroorbital pueden ser tiles para
obtener muestras de sangre, pudindose obtener sta tambin por punzamiento del corazn. La sangre se
puede extraer con una jeringa y aguja o con una aguja y un tubo de vaco (no es fcil con venas delicadas,
pero es cmodo con venas gruesas). Se pueden obtener cmodamente pequeas cantidades de sangre
mediante puncin con una aguja triangular de punta slida. Lo ideal sera rasurar (o desplumar) la piel del
lugar de la puncin, frotarla con alcohol etlico al 70% y dejarla secar.
Cuando las muestras se recogen con anticoagulante, es preciso mezclarlas por completo mediante
agitacin suave inmediatamente despus de su recogida. Es preciso mezclar bien las muestras tomadas
con anticoagulantes y/o antibiticos tan pronto como se tomen stas. Tambin puede ser necesario hacer
un frotis sanguneo en un portaobjetos; se pueden preparar semiextensiones y extensiones de sangre. Para
las muestras de suero, la sangre debe dejarse a temperatura ambiente, pero protegida del calor o fro
excesivos, durante 1-2 horas, hasta que el cogulo empiece a retraerse. Entonces, se recoge el cogulo
con una varilla estril, girndola, y se colocan los frascos en el frigorfico a 4 C. La muestra se puede
centrifugar a 1000 g durante 10-15 minutos despus de unas horas o al da siguiente, y el suero se puede
decantar o quitar con una pipeta. Con los sueros que van a utilizarse para pruebas de neutralizacin de
virus, deben evitarse los conservantes qumicos, tales como el cido brico o el tiomersal (mertiolato). A
menudo, ser necesario tomar muestras de suero pareadas para determinar los ttulos de los anticuerpos
con intervalos de 14 das. Un mtodo alternativo para el transporte de sangre, que se va a usar en pruebas
de sensibilidad a anticuerpos, es la colocacin de una gota de sangre sobre papel de filtro; la sangre se
seca a temperatura ambiente y la muestra puede entonces remitirse sin necesidad de refrigeracin.
b)
Heces
Se deben utilizar al menos 10 g de heces recin evacuadas, envindolas con o sin medio de transporte. Las
heces para anlisis parasitolgico deben llenar por completo el recipiente y enviarse con refrigeracin para
impedir la eclosin de los huevos de los parsitos, y deben llegar al laboratorio antes de transcurridas 24
horas. Deben utilizarse botellas con tapn de rosca o bolsas de plstico para el transporte. Debe evitarse el
uso de tubos con tapn de goma, pues el gas que se genera puede expulsar el tapn del tubo destruyendo
as la integridad de la muestra y contaminando otras muestras del mismo paquete. Un mtodo alternativo y
a menudo preferible consiste en tomar muestras del recto (o cloaca), procurando arrastrar la superficie
mucosa. Los hisopos deben estar visiblemente cubiertos de materia fecal; sin embargo las muestras
recogidas con hisopos no suelen ser adecuadas para el anlisis parasitolgico. Se debe tener cuidado al
tomar muestras de animales pequeos y delicados o de aves, para no herirlos; se deberan utilizar los
hisopos pequeos que se encuentran en el mercado. Los hisopos deben colocarse en un medio de
transporte. Las heces se deben almacenar y transportar a 4C.
c)
Piel
Las muestras se tomarn de las lesiones mismas, en el caso de enfermedades que producen erupciones
vesiculares: se tomarn 2 g del tejido epitelial afectado de la forma ms asptica posible, y se depositarn
en 5 ml de medio de transporte de virus con glicerina tamponada con fosfato o caldo de triptosa tamponada
con Tris, a pH 7,6. Adems, las muestras de fluido vesicular deben tomarse por aspiracin con una jeringa,
en donde haya vesculas intactas, y depositarse en un tubo estril independiente. Las muestras de pelo o
lana son tiles en los caso de infeccin por caros de superficie, piojos y hongos. Para la deteccin del
antgeno vrico, cuando se sospecha la presencia de la enfermedad de Marek, pueden obtenerse piojos
excavadores mediante raspado profundo con el borde de un escalpelo, y, en el caso de las aves, pueden
tomarse las puntas de las alas.
d)
Tracto genital y semen

Las muestras pueden tomarse mediante lavado vaginal y prepucial o utilizando hisopos adecuados. El
crvix y la uretra se muestrean por raspado. Las mejores muestras de semen se obtienen mediante una
vagina artificial o por extrusin y estimulacin artificial del pene. La muestra debe contener una fraccin rica
en esperma y debe evitarse la contaminacin, mediante el lavado con una solucin antisptica. A menudo
se requieren medios y condiciones de transporte.
e)
Ojos
La muestra de la conjuntiva puede tomarse separando el prpado y arrastrando suavemente por la
superficie. A continuacin, el hisopo debe colocarse en un medio de transporte. Los raspados tambin se
pueden depositar sobre portaobjetos. En este caso, las asas de los hisopos de mango de metal son tiles
para asegurarse de que se retiran suficientes clulas para el estudio microscpico. Slo en raras ocasiones
son tiles las secreciones mucopurulentas nasales y lacrimales.
f)
Exudados nasales (saliva, lgrimas)

Las muestras tambin se pueden tomar con hisopos de dracn, algodn o gasa, preferiblemente con
mangos de alambre, ya que la madera no es flexible y se puede partir. Puede resultar til humedecer el
hisopo con medio de cultivo antes de tomar la muestra. Es conveniente dejar el hisopo en contacto con las
secreciones durante 1 minuto, colocarlo despus en un medio de transporte, y enviarlo al laboratorio sin
demora, a 4C. Se deberan utilizar hisopos nasofarngeos con proteccin duradera para recoger muestras
en algunos casos sospechosos de infeccin vrica.
g)
Leche
Las muestras de leche deben tomarse despus de limpiar y secar el pezn, evitando el uso de antispticos.
Debe desecharse el primer chorro de leche y llenar un tubo con el chorro o chorros siguientes. Para algunas
pruebas, puede tomarse la muestra de leche de un tanque de almacenamiento. La leche para pruebas
serolgicas no se debe congelar, calentar o agitar de forma enrgica. Puede aadirse conservante a las
muestras de leche recogidas para pruebas serolgicas si se va a tardar en enviarlas al laboratorio. Si es
preciso se puede congelar la leche destinada a anlisis bacteriolgico.
2.
Toma de muestras en los exmenes post-mortem
Al realizar el examen post-mortem, se pueden tomar muestras de tejidos de diferentes rganos. En la mayora de
los libros de texto de patologa, se detallan los procedimientos para la realizacin de exmenes post - mortem y
para la toma de muestras. Se ha publicado una gua sobre los procedimientos de necropsia (10). Las tcnicas
post- mortem se recogen tambin en algunas de las directrices nacionales (2, 4, 8). En este apartado se ofrece
un resumen de estos procedimientos.
Se debe instruir al personal veterinario sobre los procedimientos que deben seguirse en un examen post-mortem
de los animales con los que trabajan. El equipo necesario para realizar este trabajo depender del tamao y de
la especie del animal y se requerirn un cuchillo, una sierra, un hacha y tambin bistur, frceps y tijeras,
incluidas unas con punta curva en una de sus hojas para abrir los intestinos. Debe disponerse de un abundante
nmero de recipientes adecuados a la naturaleza de la muestra, as como de etiquetas y formularios de informe.
Los recipientes deben etiquetarse perfectamente con la fecha y la identificacin del tejido y del animal antes de
comenzar la necropsia. Pueden necesitarse medios especiales para el transporte de las muestras desde el lugar
en el que se toma la muestra. El operador debera llevar vestimenta protectora (traje de proteccin lavable y
guantes y botas de goma). Adems, si se estn investigando posibles enfermedades zoonsicas, el examen
post-mortem debera realizarse en una cabina de seguridad biolgica; si esto no es posible, se debera llevar una
mascarilla y proteccin para los ojos. Es normal separar la cabeza del animal, si se sospecha de la rabia o de
encefalopatas espongiformes transmisibles (EETs).
Los tejidos se recogen para realizar cultivos microbiolgicos, diagnsticos de parsitos, anlisis bioqumicos,
estudios histopatolgicos y/o inmunopatolgicos, y para la deteccin de protenas o cidos nucleicos del
genoma. La persona que realice el examen post-mortem debe poseer conocimientos de anatoma y patologa
suficientes para seleccionar los rganos correctos y las lesiones ms favorables para el muestreo. Cada trozo de
tejido se debe colocar en una bolsa de plstico independiente perfectamente rotulada o en un bote con tapa de
rosca. Se debe utilizar instrumental esterilizado para la recogida de especmenes destinados a cultivo
microbiolgico, y hay que tener un cuidado especial de no contaminar los tejidos con contenido intestinal. No
deben utilizarse desinfectantes sobre o cerca de los tejidos que vayan a servir de muestra para cultivo
bacteriolgico o para aislamientos vricos.
Los tejidos se pueden enviar secos al laboratorio o en medio de transporte de bacterias o de virus, dependiendo
de las pruebas que se soliciten. Tras la recogida, las muestras para examen microbiolgico deben refrigerarse
hasta su envo. Las muestras se deben congelar si aqul no se hace en 48 horas; sin embargo el
almacenamiento prolongado a 20C puede resultar perjudicial para el aislamiento de virus. Para los estudios
histopatolgicos, se cortarn bloques de tejido que no excedan de 0,5 cm de grosor y 12 cm2 y se colocarn en
formalina al 410 % en tampn neutro, que debera ser, al menos, diez veces el volumen de la muestra de tejido.
Cuando se sospeche de ciertas enfermedades, se necesitan trozos ms grandes de cerebro; el cerebro se
secciona haciendo un corte sagital: la mitad se enva fresco, en hielo, y la otra en formalina al 10% tamponada.
En el caso de la tembladera (scrapie), de la encefalopata espongiforme bovina y otras EETs, los detalles sobre
recoleccin de muestras se ofrecen en los captulos correspondientes del presente Manual. Almacene y embale
los tejidos fijados con formalina separados de los tejidos frescos, la sangre y los frotis. Hay que asegurarse de
que los tejidos fijados con formalina no estn congelados. Una vez fijados, se les puede quitar la formalina y
enviarlos al laboratorio, siempre que se mantengan hmedos y estn protegidos (por ejemplo, envolviendo los
tejidos en toallas de papel empapadas con formalina y en botes con tapn a rosca hermticamente cerrados).
3.
Toma de muestras medioambientales y de alimentos
Las muestras se pueden tomar para controlar la higiene o como parte de la investigacin de enfermedades. Las
muestras del medio ambiente se pueden tomar del estircol o de la cama de los animales y de heces excretadas
u orina. Las muestras pueden tomarse de la superficie de los conductos de ventilacin, de comederos y de
desages. Este tipo de muestreo es particularmente importante en criaderos, centros de inseminacin artificial y
mataderos, en los que hay equipamiento especializado. Las muestras tambin se pueden tomar del forraje de los
comederos o de los contenedores de almacenamiento. La toma de muestras de agua se puede hacer de
comederos, de bebederos, de tanques de alimentacin o de alimentos naturales o manufacturados.
4.
Abejas
Las abejas adultas, estn muertas o moribundas, se pueden recoger en las cercanas de las colonias. A las vivas
se las mata por congelacin. Las muestras de cras se toman quitando un trozo de panal de cra que presente
anormalidades. Se envuelve en papel y se coloca en una caja para transportarla al laboratorio.
B. TAMAO DE LA MUESTRA
Cuando se investiga un caso de una enfermedad clnica, las muestras recogidas deben ser representativas de la
enfermedad que se est investigando y de las lesiones observadas. Cuando se desarrolla un programa de
vigilancia y seguimiento de la salud animal, se deben utilizar algunos mtodos estadsticos de muestreo
generales. Estos mtodos de muestreo son necesarios para realizar los estudios cientficos especificados en el
Cdigo Sanitario para los Animales Terrestres de la OIE (9). Es posible calcular el nmero de animales de una
manada de un tamao determinado que se deben muestrear, para que la deteccin de la infeccin, que se
asume que est presente en un determinado porcentaje de animales, alcance una probabilidad del 95% (10). Las
formulas siguientes pueden proporcionar datos numricos aproximados, pero un programa de muestreo
especfico para el programa de vigilancia planificada debera basarse en frmulas completas que estn
disponibles en las referencias (1, 3, 11) o utilizando un programa (FreeCalc) disponible en Internet
(http://www.ausvet.com.au/content.php?page=res_software#freecalc).
La siguiente frmula podra utilizarse para calcular el tamao de la muestra n para detectar al menos un caso de
infeccin, con una prueba que tiene una sensibilidad y especificidad del 100%, donde D es el nivel de
significacin y 1D es el nivel de confianza, y p es la prevalencia en la poblacin. Si una enfermedad se
presentara en el 5% de una manada de 500 animales, sera necesario muestrear 59 animales, para que la
confianza de encontrar al menos un caso positivo sea del 95%, suponiendo que la sensibilidad y la especificidad
de la prueba fueran del 100%. Puesto que la mayora de las pruebas diagnsticas no tienen la especificidad y la
sensibilidad del 100%, el nmero de muestras recogidas debe ajustarse a la sensibilidad y especificidad de la
prueba que se utilice (vase tambin Captulo I.1.3. Principios de validacin para las pruebas de diagnstico de
enfermedades infecciosas).
ln (D)
n=
ln (1p)
En el ejemplo anterior D = 0,5, 1D = 95%, p = 0,05 y n = 59

Si la sensibilidad (Se) es menor del 100%, la frmula anterior se debera modificar de la siguiente forma:
ln (D)
n=
ln (1p.Se)
En el ejemplo anterior con D = 0,05, p = 0,05, especificidad (Sp) = 1 y Se = 0,95, sera necesario muestrear un
mnimo de n = 62 animales en vez de 59 para tener una probabilidad de 0,95 de encontrar al menos un animal
positivo. El aumento en el tamao de la muestra desde 59 a 62 se debe a la disminucin de la sensibilidad de la
prueba desde 1 a 0,95. La grfica de abajo indica el tamao de muestra mnimo que se requiere para encontrar
al menos un positivo para varias combinaciones de sensibilidad y prevalencia para D = 0,05 y Sp = 1.
Si se sabe que la prueba tiene una especificidad menor de 1, los resultados positivos se debern confirmar
mediante una prueba con una especificidad ms alta. Si la prevalencia es muy baja y la prueba utilizada tiene
una especificidad menor de 1, es muy posible que un resultado positivo de la prueba sea un falso positivo.
Figura 1. Tamao de muestra mnimo requerido para la confianza del 95% de encontrar la infeccin para
distintas combinaciones de sensibilidad y prevalencia.
C. INFORMACIN QUE HA DE ENVIARSE CON LAS MUESTRAS

Es fundamental que las muestras individuales se identifiquen perfectamente mediante mtodos adecuados. Los
instrumentos de marcado deben poder resistir las condiciones de uso; por ejemplo, mojarse o congelarse. El
lpiz tiene tendencia a borrarse de los contenedores, y las etiquetas, pegadas al plstico, se desprenden cuando
se almacenan a 70C. La informacin y el historial del caso siempre deberan acompaar a las muestras al
laboratorio y deberan colocarse en un sobre de plstico, por fuera del embalaje de transporte. Se sugiere que se
sigan los siguientes puntos. Es aconsejable contactar con el laboratorio receptor para determinar si tiene un
formulario de envo que quisiera que le remitieran con las muestras o si necesita otra informacin.
i)
Nombre y direccin del propietario/titular donde se dio la enfermedad, con los nmeros de telfono y fax.
ii)
Nombre, direccin postal, correo electrnico, nmeros de telfono y fax del remitente.
iii)
Enfermedades de cuya existencia se sospecha y pruebas solicitadas.
iv)
Especie, raza, sexo, edad e identidad del animal muestreado.
v)
Fecha de toma de las muestras y envo.
vi)
Lista de las muestras remitidas y medios de transporte utilizados.
vii)
Debera incluirse un historial completo para el laboratorio, que contemplara los siguientes elementos:
a)
Una lista y descripcin de los animales examinados y de los hallazgos del examen post-mortem.
b)
El tiempo que han permanecido los animales enfermos en la granja; si son recin llegados y de dnde
procedan.
c)
La fecha de los primeros casos y de los posteriores, o de los animales muertos, con los nmeros de
referencia de los envos anteriores.
d)
Una descripcin de la extensin de la infeccin en la manada o rebao.
e)
El nmero de animales muertos y de los que presenten signos clnicos, y edad, sexo y raza.
f)
Los signos clnicos y su duracin, incluidos el estado de la boca, ojos y patas, y los datos de
produccin de leche y huevos.
g)
Tipo y normas para la cra, incluidos el tipo de alimento disponible, y posible contacto con venenos o
plantas venenosas.
h)
Cualquier medicacin administrada a los animales y cundo se les administr.
i)
Cualquier vacuna administrada y cundo se administr.
j)
Otras observaciones sobre la enfermedad y manejo de los animales.
D. EMBALAJE Y TRANSPORTE DE MUESTRAS

1.
Autorizacin de envo de especmenes
Se debe contactar con el laboratorio que va a recibir las muestras, para asegurarse de que est capacitado para
realizar las pruebas solicitadas y para consultar si hay requisitos especiales de embalaje o expedicin. Cuando el
material se enve a otro pas es imprescindible ponerse en contacto con el laboratorio receptor. Normalmente se
necesitar una licencia de importacin especial para cualquier material biolgico, que debe obtenerse con
anticipacin. La licencia debe colocarse en un sobre en el exterior del paquete.
2.
Transporte de especmenes
Los especmenes deben enviarse al laboratorio por el procedimiento ms rpido disponible. Si las muestras
pueden llegar al laboratorio antes de 48 horas, se deben enviar refrigeradas. Si se utiliza hielo seco, se deben
seguir normas adicionales de empaquetado. Las sustancias infecciosas, que pueden incluir especmenes de
diagnstico, no se pueden enviar como equipaje facturado ni como equipaje de mano, y se deben enviar como
cargamento.
3.
Embalaje
El remitente debe asegurarse de que los especmenes se embalan de tal forma que lleguen al laboratorio en
buenas condiciones y que no hay fugas durante el transporte. El Reglamento sobre Mercancas Peligrosas
(DGR) de la Asociacin Internacional de Transporte Areo (IATA) tiene requisitos explcitos sobre el embalaje y
expedicin de especmenes para diagnstico en todos los medios comerciales de transporte areo. En muchos
pases se exigen requisitos similares para los envos terrestres y por servicio postal. Los requisitos para el
transporte areo se especifican de forma detallada en las publicaciones de la IATA, que son actualizadas cada
ao. Se espera que el remitente conozca y siga los procedimientos esbozados en el Reglamento para
Mercancas Peligrosas (DGR). A continuacin se ofrece un resumen del Reglamento vigente en el momento en
que este Manual se envi a la imprenta, y que deberan seguirse para cualquier envo. Tambin anticipamos que
a partir del 1 de enero de 2005 tendrn efecto algunos cambios importantes en las citadas normas. Si hay
cambios significativos en las DGR, colocaremos una versin revisada de este captulo en la red, en el sitio Web
www.oie.int . Los remitentes debern consultar siempre la ltima versin de las DGR de la IATA antes de
proceder al envo de especmenes de diagnstico. Adems, tres de las directrices nacionales ofrecen
instrucciones explcitas para el embalaje y envo de especmenes de diagnstico, estando tales directrices
basadas en los requisitos de la IATA (2, 4, 8).
Las DGR esboza los procedimientos para el envo de sustancias infecciosas, incluidos los especmenes de
diagnstico. Las DGR define las sustancias sospechosas como sustancias de las que se sabe o se sospecha
que contienen patgenos. Los patgenos se definen como microorganismos (incluidas bacterias, virus,
rickettsias, parsitos y hongos) o microorganismos recombinantes (hbridos o mutantes) de los que se sabe o se
tiene una sospecha razonable de que causan enfermedades en los humanos o los animales.
La IATA (5, 6) menciona como exento del Reglamento sobre Mercancas Peligrosas el siguiente supuesto:
Las sustancias que no contienen sustancias infecciosas o las sustancias que no es probable que causen
enfermedades en humanos o animales no estn sujetas a estas Regulaciones salvo que se ajusten a criterios
por los que se las pueda incluir en otra clase.
Tambin hay excepciones para algunos productos biolgicos, y el remitente debe consultar el Reglamento de la
IATA ya que algunos de esos productos no estn exentos. A continuacin ofrecemos la definicin de productos
biolgicos que aparece en las DGR:
Los productos biolgicos provienen de organismos vivos. Estos se fabrican y distribuyen de acuerdo con los
requisitos exigidos por las correspondientes autoridades gubernativas de mbito nacional; estos productos estn
sometidos a requisitos para obtener licencias y se utilizan para la prevencin, tratamiento o diagnstico de
enfermedades humanas o animales, o para el desarrollo, experimentacin e investigacin relacionados con los
propsitos antes mencionados. Entre esos productos se incluyen productos acabados o no acabados como las
vacunas y los materiales de diagnstico.
Las DGR especifica que las sustancias infecciosas (incluidos los especmenes que puedan contener patgenos
que afectan a los humanos o los animales) se designan como N2814, NU2900 o UN3373.
Las muestras enviadas para fines diagnsticos deberan designarse como UN 2814 o UN 2900 si contienen
material proveniente de humanos o animales afectados por cualquier enfermedad contagiosa para las que
normalmente no existe tratamiento efectivo ni medidas preventivas1. Las sustancias infecciosas que se ajusten a
esta definicin y afecten a los humanos, incluidos los agentes zoonsicos, se designan como UN 2814. Las que
slo afectan a los animales se designan como UN 2900.
Las sustancias infecciosas enviadas con fines diagnsticos, y que no se ajustan a los criterios por los que se las
designara como UN2814, o, UN 2009, son asignadas a la clase UN 3373 y designadas como Especmenes de
Diagnstico.
Las DGR de la IATA contiene una lista indicativa de los patgenos que se deben asignar a UN 2814, o, UN
2900 (Cuadros 1 y 2). Los patgenos incluidos en estas listas no se pueden asignar a UN 3373 (5, 6).
La definicin propuesta para la versin de la DGR en el 2005 es: Sustancia infecciosa que se transporta de tal forma
que, en caso de exposicin a la misma, es capaz de provocar invalidez permanente, peligro para la vida o enfermedad
letal en humanos y animales.
Cuadro 1. Sustancias infecciosas que afectan a los humanos y que deben denominarse UN 2814.
Bacilo del ntrax (slo cultivos)
Virus de la Encefalitis japonesa (slo cultivos)
Brucella abortus (slo cultivos)
Virus de Junin
Brucella melitensis (slo cultivos)
Virus de la Enfermedad de la Selva de Kyasanur
Brucella suis (slo cultivos)
Virus de Lassa
Burkholderia mallei Pseudomonas mallei

Muermo (slo cultivos)
Virus Machupo
Burkholderia pseudomallei
Pseudomonas pseudomallei (slo cultivos)
Virus de Marburg
Chlamydia psittaci cepas aviares (slo cultivos)
Mycobacterium tuberculosis (slo cultivos)
Clostridium botulinum (slo cultivos)
Virus de la Viruela del mono
Coccidioides immitis (slo cultivos)
Virus de Nipah
Coxiella burnetii (slo cultivos)
Virus de la Fiebre hemorrgica de Omsk
Virus de la Fiebre hemorrgica de Crimea-Congo
Virus de la Polio (slo cultivos)
Virus del Dengue (slo cultivos)
Virus de la Rabia
Virus de la Encefalitis equina del Este (slo cultivos)
Rickettsia prowazekii (slo cultivos)
Escherichia coli, verotoxignico (slo cultivos)
Rickettsia rickettsii (slo cultivos)
Virus del bola
Virus de la Fiebre del Valle del Rift
Virus Flexal
Virus de la Encefalitis rusa de primavera-verano (slo

cultivos)
Francisella tularensis (slo cultivos)
Virus de la Sabia
Virus Guanarito
Virus de la Disentera Shigella tipo 1 (slo cultivos)
Virus Hantaan
Virus de la Encefalitis rusa estival (slo cultivos)
Hantavirus causante del Sndrome pulmonar por

Hantavirus
Virus de la Viruela
Virus de Hendra
Virus de la Encefalitis equina venezolana
Virus de la Hepatitis B (slo cultivos)
Virus del Oeste del Nilo (slo cultivos)
Virus del Herpes B (slo cultivos)
Virus de la Fiebre amarilla (slo cultivos)
Virus de la Inmunodeficiencia humana (slo cultivos)
Yersinia pestis (slo cultivos)
Virus de la Gripe aviar muy virulenta (slo cultivos)
Cuadro 2. Ejemplos indicativos de patgenos animales prohibidos que deben enviarse como sustancias
infecciosas que afectan a los animales (UN 2900).
Virus de la Peste equina africana
Mycoplasma mycoides Pleuroneumona contagiosa bovina
Virus de la Peste porcina africana
Virus de la Peste de los pequeos rumiantes
Virus de la Enfermedad de Newcastle
Virus de la Peste bovina
Virus de la Lengua azul
Virus de la Viruela ovina
Virus del Clera porcino
Virus de la Viruela caprina
Virus de la Fiebre aftosa
Virus de la Enfermedad vesicular porcina
Virus de Dermatosis nodular contagiosa
Virus de la Estomatitis vesicular
Cualquier agente infeccioso que pueda producir una enfermedad en humanos o animales que se
haya incrementado en cultivo as como los patgenos nuevos o emergentes deben asignarse a UN2814 o UN
2900, He aqu la definicin de incremento en cultivo ofrecida por la IATA:
Los cultivos (stocks de laboratorio) son el resultado de un proceso por el que los patgenos se multiplican o
propagan para generar grandes concentraciones, de lo que se deriva un gran riesgo de infeccin cuando se da
una exposicin a los mismos. Esta definicin se refiere a los cultivos preparados con la intencin de generar
patgenos y no incluye los cultivos producidos con fines clnicos y de diagnstico.
10
En el siguiente diagrama de produccin se ofrece una clasificacin resumida de muestras de diagnstico.
Puede
Puedela
lasustancia
sustanciacontener
contenermicroorganismos?
microorganismos?
No
No
S
S
Es
Espoco
pocoprobable
probableque
quela
la sustancia
sustancia
cause
cause una
una enfermedad
enfermedadhumana
humana oo
animal?
animal?
No
No
S
S
Est
Est exenta
exentade
delas
las Regulaciones
Regulaciones de
de Mercancas
Mercancas
Peligrosas-.
Envar
en
paquete
a
prueba
Peligrosas-. Envar en paquete a pruebade
deprdidas.
prdidas.
La
Lasustancia
sustanciapuede
puede tener
tenerpatgenos
patgenosque
quepueden
pueden
causar
causarenfermedades
enfermedades graves
gravesde
de tipo
tipohumano
humanooo
animal
muy
contagiosas
que
no
pueden
curarse
animal muy contagiosas que no pueden curarseoo
prevenirse
prevenirse con
con rapidez,
rapidez,oo los
lospatgenos
patgenoslistados
listadosen
en
el
el Cuadro
Cuadro 11ooCuadro
Cuadro 22??
No
No
La
Lasustancia
sustanciaes
esun
uncultivo
cultivo
(exceptuados
(exceptuadoslos
los cultivos
cultivos
producidos
producidospara
parafines
finesclnicos
clnicosoo
de
dediagnstico)?
diagnstico)?
S
S
S
S
No
No
La
Lasustancia
sustanciase
se transporta
transportapara
para
fines
finesde
dediagnstico?
diagnstico?
No
No
S
S
Consgnese
Consgnese como
como espcimen
espcimen
de
de diagnstico
diagnstico (UN
(UN 3373)
3373)
Consgnese
Consgnese como
como sustancia
sustancia
infecciosa
infecciosa (UN
(UN 2814
2814 or
or UN
UN 2900)
2900)
El embalaje de sustancias y especmenes infecciosos procedentes de enfermedades animales graves, Un

2814, o, UN 2900, se trata de forma resumida en la instruccin de embalaje 602; La Declaracin de Mercanca
Peligrosa por parte del remitente debe cumplimentarse y entregarse junto con las muestras. Tambin existe el
requisito de que el remitente reciba entrenamiento sobre procedimientos de embalaje aprobados por la
IATA para los embarques de UN 2814 y UN 2900. Debido a la complejidad de estas directrices, se le recomienda
al remitente que consulte el Reglamento de la IATA par obtener ms informacin sobre los embarques de UN
2814 y UN 2900.
El otro grupo, UN 3373, cubre los Especmenes de Diagnstico. Esta categora entraa un riesgo menor, y los
paquetes que contienen tales especmenes deben llevar la etiqueta Especmenes de Diagnstico; no es
necesario hacer una declaracin de mercancas peligrosas. La instruccin de embalaje 650 de la IATA
proporciona las directrices para embalar sustancias infecciosas clasificadas como NU3373, ofrecindose a
continuacin un resumen de las instrucciones de embalaje mencionadas. No obstante, debe seguirse el
procedimiento completo, tal como se explica en el Reglamento de Mercancas Peligrosas ms recientes de la
IATA (5, 6).
i)
Los especmenes para diagnstico (UN 3373) deben disponerse en embalajes de buena calidad, que deben
ser suficientemente fuertes para resistir los golpes y el peso que tienen que soportar durante el transporte.
Los embalajes se deben hacer y cerrar de forma que se evite cualquier fuga de contenido que pudiera
producirse en condiciones normales de transporte.
ii)
El espcimen deber colocarse en un recipiente o recipientes primarios, ya sean botellas de cristal, tubos o
contenedores de plstico.
iii)
El recipiente o recipientes primarios se envolvern en material absorbente adecuado para absorber todo el
fluido de los mismos.
iv)
Si se utilizan varios recipientes primarios stos debern envolverse individualmente o por separado para
impedir el contacto entre ellos.
v)
El recipiente o recipientes primarios y el material absorbente se colocarn dentro de un recipiente

secundario.
vi)
Los recipientes primario y secundario que se utilizan para los lquidos deben ser a prueba de fugas, y deben
resistir, sin fuga, una presin diferencial interna no inferior a 95 kPa entre 40C y 55C.
vii)
El recipiente o recipientes primarios para los slidos deben ser a prueba de fugas.
11
viii) El recipiente o recipientes primarios no deben contener ms de 500 ml de especmenes lquidos, ni ms de

500 g de slidos. El embalaje exterior no debe exceder los 4 litros o 4 kilos para especmenes lquidos o
slidos, respectivamente.
ix)
Debe incluirse una lista detallada del contenido entre el embalaje secundario y el exterior.
x)
Si el envo se realiza a temperatura ambiente o superior, el recipiente primario tiene que tener un medio que
asegure su estanqueidad, tal como un cierre hermtico, un cierre sellable por calor o un tapn con reborde.
Si se usan tapones a rosca, deben reforzarse con cinta adhesiva.
xi)
Las bolsas refrigerantes o el hielo seco deben colocarse fuera del recipiente secundario. Si se usa hielo
seco debe haber un soporte interno que mantenga el recipiente secundario en la posicin original, una vez
que el hielo seco se haya derretido. El embalaje exterior debe permitir la liberacin de dixido de carbono.
Cuando se utiliza nitrgeno lquido, hay requisitos adicionales que se describen en el DGR.
xii)
Los recipientes primario y secundario se pondrn dentro de un embalaje de transporte con material de
amortiguamiento.
xiii) El embalaje debe resistir una prueba de cada desde 1,2 metros. Existen requisitos adicionales de
resistencia de embalajes usados para los especmenes NU2900 y NU2814.
xiv) El paquete se etiquetar como Especmenes para Diagnstico. En la casilla de Naturaleza y Cantidad de
Mercancas de la gua de carga area constar ESPECMENES PARA DIAGNSTICO EMBALADOS
CONFORME A LA INSTRUCCIN DE EMBALAJE 650 DE LA IATA.
4.
Documentos de embarque
Todos los documentos de embarque, incluidos la licencia de importacin y el formulario de envo deben ponerse
en un sobre pegado en la parte exterior del embalaje de transporte. Los formularios y las etiquetas de mercanca
peligrosas requeridas se cumplimentarn tal como se explica en el DGR y se ponen tambin en la parte exterior
del embalaje.
E. CONSERVACIN DE MUESTRAS EN ALMACENAMIENTOS PROLONGADOS

Puede resultar muy til establecer una coleccin de muestras para futuros estudios. La coleccin puede incluir
cultivos para la comparacin con futuros aislados, muestras de tejido o de suero que pueden utilizarse para
validacin de nuevas pruebas, y una coleccin de tejidos fijados o bloques de parafina para futuros exmenes
histolgicos. Posiblemente la coleccin ms til es el almacenamiento de muestras de suero. Estas muestras
pueden resultar tiles si se lleva a cabo una investigacin retrospectiva para comparar el estado actual de la
enfermedad con el de otras veces anteriores.
Bancos de suero
Las muestras de suero pueden proporcionar informacin sobre los animales de los que se han tomado. Se
pueden analizar diversos constituyentes de stas, tales como inmunoglobulinas, elementos traza, toxinas,
hormonas y enzimas. Si el nmero de muestras de suero recogido al azar de la poblacin es suficiente, se
pueden hacer comparaciones sobre la influencia del sexo, edad, raza y localizacin geogrfica. Los resultados
de esta comparacin permiten identificar grupos de alto riesgo, se pueden establecer prioridades de vacunacin
y establecer patrones e ndices de enfermedades (5).
Un banco de suero es una coleccin catalogada de sueros que se almacenan para conservar sus propiedades
inmunolgicas y otras bioqumicas. Las condiciones de catalogacin y almacenamiento son fundamentales para
que un banco de suero sea eficaz. Cada uno de los sueros se deber documentar e identificar perfectamente.
Las bases de datos deberan contener toda la informacin pertinente sobre el origen de la muestra y los
resultados obtenidos de las pruebas. Tambin se pueden incluir datos adicionales que pueden ser de inters,
tales como las condiciones climticas y la productividad del animal. Es fundamental la exactitud de los datos y
estos deben obtenerse cuando se toman las muestras de sangre. El primer dato fundamental es la identificacin
completa del animal. La cantidad de detalles registrados depender de la pericia del operador, siendo ms
importante la exactitud que la cantidad de informacin. Debera evitarse la mezcla de sueros, pues, aunque
reduce la cantidad de documentacin y el espacio de almacenamiento, tambin reduce enormemente la utilidad
del material. La recogida de muestras de sangre debe hacerse de la forma ms asptica posible, y la esterilidad
debe mantenerse durante la separacin del suero y otras manipulaciones. El catlogo del banco de suero debe
organizarse bien, y mantenerse en una base de datos computarizada, con una adecuada copia de seguridad. Se
ha sugerido y descrito con detalle una metodologa (7).
Los sueros se pueden almacenar para un uso peridico o se pueden mantener almacenados a largo plazo para
objetivos histricos, estas dos funciones debern mantenerse separadas. Las condiciones de almacenamiento
de los sueros debern minimizar la prdida de propiedades inmunolgicas y de otras propiedades bioqumicas.
12
Hay tres mtodos de almacenamiento: ultracongelacin, almacenamiento en seco sobre discos de papel a
temperatura ambiente y liofilizacin (congelacin-desecacin). Deber mantenerse una temperatura central por
debajo de 60C para el almacenamiento de sueros a largo plazo mediante ultracongelacin. Cuanto ms baja
sea la temperatura mejor, pero resulta ms caro de mantener. El nitrgeno en fase lquida se encuentra a
196C, el nitrgeno en fase de gas se encuentra a 100C y un congelador de temperatura ultrabaja se
mantendr a 90C. Algunos bancos de suero se han mantenido a 20C, pero el suero puede deteriorarse y no
ser apropiado para la deteccin de algunas propiedades, especialmente, si se almacena durante largos perodos
de tiempo a esta temperatura. Los ultracongeladores deberan tener un sistema de aviso si la temperatura sube,
debido a avera mecnica o a un fallo de energa. Es imprescindible un generador de emergencia junto con un
espacio alternativo para el almacenamiento en fro por si hay que transferir los contenidos del congelador. El
almacenamiento en disco de papel es un mtodo simple y barato, pero slo permite almacenar una pequea
cantidad de suero, y el suero eludo slo es apropiado para un nmero limitado de pruebas. Los discos debern
mantenerse en un lugar fresco y seco. Puede que proporcionen resultados satisfactorios durante 5 aos. En
general, se considera la liofilizacin como el mejor mtodo para almacenamiento de sueros a largo plazo. Si se
optimizan las condiciones de ultracongelacin, se reducir la prdida de caractersticas sricas. Para la
liofilizacin se precisa un equipo caro y, adems, hay que invertir mucho tiempo. Los viales liofilizados deben
mantenerse a 4C.
REFERENCIAS
1.
CAMERON A.R. & BALDOCK F.C. (1998). A new probability formula for surveys to substantiate freedom from
disease. Prev. Vet. Med., 34, 117.
2.
CANADIAN FOOD INSPECTION AGENCY, LABORATORY DIRECTORATE: ANIMAL HEALTH (2002). Manual of Common
Procedures. Section: Specimen Collection and Submission; Specimen Packaging; Specimen Transportation.
Canadian Food Inspection Agency, Ottawa, Canada, 61 pp.
3.
CANNON R.M. & ROE R.T. (1982). Livestock Disease Surveys A Field Manual for Veterinarians. Department
of Primacy Industry, Water and Environment, Australia, 15 pp.
4.
COOK R., BARTON M., GLEESON L. & MAIN C. (1996). AUSVETPLAN Management Manual: Laboratory
Preparedness. Animal Health Australia, Canberra, 56 pp. http://www.aahc.com.au/ausvetplan/index.htm.
5.
INTERNATIONAL AIR TRANSPORT ASSOCIATION (2004). Dangerous Goods Regulations, 44th Edition.
International Air Transport Association, 800 Place Victoria, P.O. Box 113, Montreal, Quebec H4Z 1M1,
Canada, 801 pp.
6.
INTERNATIONAL AIR TRANSPORT ASSOCIATION (2003). Infectious Agents and Diagnostic Specimens Shipping
th
Guidelines, 4 Edition. IATA, 800 Place Victoria, P.O. Box 113, Montreal, Quebec H4Z 1M1, Canada, 208
pp.
7.
MOORHOUSE P.D. & HUGH-JONES M.E. (1981). Serum banks. Vet. Bull., 51, 277290.
8.
NATIONAL VETERINARY SERVICES LABORATORIES (2003). Procedures for Collection and Submission of
Specimens. National Veterinary Services Laboratories, Ames, Iowa, USA. www.aphis.usda.gov/vs/nvsl.
9.
OFFICE INTERNATIONAL DES EPIZOOTIES (2003). Terrestrial Animal Health Code. Office International des
Epizooties, Paris, France. www.oie.int.
10. STRAFUSS A.C. (1988). Necropsy: Procedures and Basic Diagnostic Methods for Practicing Veterinarians.
Charles C. Thomas, Springfield, IL, USA, 244 pp.
11. VETERINARY LABORATORIES AGENCY (1998). Submission of Samples to VI Centres. Veterinary Laboratories
Agency, New Haw, Addleston, Surrey, United Kingdom, 36 pp.
12. WORLD HEALTH ORGANIZATION/FOOD AND AGRICULTURE ORGANIZATION OF THE UNITED NATIONS (WHO/FAO)
(1994). Basic Procedures for Veterinary Laboratories in Developing Countries, Pini A., Parodi P.,
Demeneghi D., Belemu U., Kabilika H. & Ghirotti M., eds. WHO/FAO Collaborating Centre, Viale Regina
Elena 299, 00161 Rome, Italy, 142 pp.
*
* *
13
CAPTULO I.1.2.
GESTIN DE CALIDAD EN LOS LABORATORIOS

DE PRUEBAS VETERINARIAS
RESUMEN
Es esencial para el diagnstico, la vigilancia y la comercializacin que los resultados del laboratorio
sean vlidos. Dichos resultados deben alcanzarse mediante el uso de buenas prcticas de manejo,
mtodos de prueba y calibracin vlidos, tcnicas apropiadas, control y garanta de calidad, todo
ello dentro de un sistema de calidad. Estos temas comprenden un rea compleja de suma
importancia en la conduccin e interpretacin de las pruebas. Podemos denominar a este asunto
gestin de calidad del laboratorio, e incluye elementos administrativos, operativos y tcnicos. Un
programa de gestin de calidad debe permitir al laboratorio demostrar que opera con un sistema
de calidad viable, que es tcnicamente competente, y es capaz de generar resultados
tcnicamente vlidos. Adems, un laboratorio debe llevar a cabo un programa de gestin de
calidad que sea apropiado para su territorio, sus clientes, sus necesidades y objetivos, y que
pueda demostrar su eficacia en la consecucin de los objetivos de calidad. La necesidad y los
requisitos de los programas de gestin de calidad de los laboratorios, tambin estn determinados
por la necesidad de una aceptacin recproca de los resultados de las pruebas realizadas para el
comercio internacional y por la aceptacin de los estndares internacionales tales como la Norma
1
Internacional 17025 de la ISO/IEC (4) para la acreditacin del laboratorio. La OIE ha publicado
normas detalladas sobre este tema (7). No es nuestro propsito recordar en este captulo los
requisitos de los mencionados documentos de la ISO o de la OIE. Ms bien se presenta un
esquema de los asuntos y consideraciones importantes que un laboratorio debe acometer en el
diseo y el mantenimiento de su programa de gestin de calidad.
CONSIDERACIONES CLAVE PARA EL DISEO Y MANTENIMIENTO DE UN

PROGRAMA DE GESTIN DE CALIDAD DEL LABORATORIO.
Con el fin de asegurar que el programa de gestin de calidad sea apropiado, debe elaborarse cuidadosamente el
diseo. En las siguientes siete secciones de este captulo, se presenta un esquema de las principales categoras
a tener en cuenta, y de los asuntos y actividades clave dentro de cada una de dichas categoras.
1.
El trabajo, las responsabilidades y los objetivos del laboratorio
Son muchos los factores que influyen en los elementos necesarios y los requisitos de un programa de gestin de
calidad. Dichos factores son:
i)
ii)
iii)
iv)
v)
vi)
vii)
14
El tipo de prueba realizada.

El uso de los resultados de la prueba.
La repercusin de un resultado cuestionable o errneo.
El nivel de tolerancia de riesgo y de responsabilidad.
Las necesidades del cliente (por ejemplo, sensibilidad y especificidad de los mtodos de prueba, costes y
tiempo para la devolucin).
El papel del laboratorio en el trabajo legal o en los programas reguladores.
El papel del laboratorio en la asistencia, confirmacin y/o supervisin del trabajo de otros laboratorios, y
Organizacin Internacional para la Estandarizacin/Comisin Internacional Electroqumica.
Captulo I.1.2.
Gestin de calidad en los laboratorios de pruebas veterinarias
viii) Los objetivos comerciales del laboratorio, incluyendo la necesidad de algn reconocimiento y/o acreditacin
por parte de terceros.
2.
Estndares, directrices y referencias
Se recomienda que el laboratorio seleccione estndares y directrices acreditadas y fiables para ayudar en el
diseo del programa de gestin de calidad. El estndar de la OIE sobre este tema, constituye una directriz til
(7). Para los laboratorios que deseen acreditarse, es esencial la utilizacin de la norma 17025 ISO/IEC (4) o del
estndar de la OIE (7). Puede obtenerse informacin adicional sobre los estndares en los organismos de
estndares nacionales de cada pas, en el Laboratorio Internacional para la Cooperacin de la Acreditacin
(ILAC) y en los organismos de acreditacin (por ejemplo, la Asociacin Internacional de Autoridades de Pruebas
[NATA], en Australia; la Asociacin Americana de Acreditacin de Laboratorio [A2LA], en EE.UU; el Servicio de
Acreditacin del Reino Unido [UKAS] y en el Consejo de Estndares de Canad [SCC]). Algunas organizaciones
internacionales y tcnicas, tales como la AOAC Internacional (la antigua Asociacin de Qumicos Analistas
Oficiales) y la ISO, publican referencias, directrices y/o estndares tiles que completan los requisitos generales
de la norma 17025 de la ISO/IEC. La Norma Internacional 9001 de la ISO (5), que es un norma general para los
sistemas de gestin de calidad y una de las muchas normas incluidas en el grupo denominado comnmente Las
series 9000 de la ISO, no se utiliza para la acreditacin, puesto que el cumplimiento de los requisitos, no implica
ni garantiza necesariamente la competencia tcnica. (Vase seccin 3 abajo). Aunque un laboratorio puede
llevar a cabo un sistema de gestin de calidad que cumpla con los requisitos del la norma ISO 9001, el registro o
la certificacin se utilizan para indicar conformidad con la norma. La norma 17025 de la ISO/IEC incluye una
comparacin, mediante cuadros con clusulas numeradas, entre dicha norma, la norma ISO 9001 (de 1994) y la
norma ISO 9002 de 1994. Estos dos ltimos documentos han sido reemplazados por la versin 2000 (de 9001)
(5).
3.
Acreditacin
Si el laboratorio ha determinado que necesita un reconocimiento formal de su programa de gestin de calidad,

entonces ser necesaria la verificacin por parte de terceros de su conformidad con el estndar o estndares
seleccionados. El ILAC ha publicado los requisitos y las directrices especficas, para los laboratorios y los
organismos de acreditacin. Los trminos acreditacin, un procedimiento por medio del cual un organismo
autorizado reconoce formalmente que una persona u organismo es competente para llevar a cabo tareas
especficas (2), y la acreditacin del laboratorio, el reconocimiento formal de la competencia de un laboratorio
para llevar a cabo pruebas especficas o tipos especficos de pruebas (2), son propios de los requisitos del ILAC
y del uso de la Norma 17025 de la ISO/EC y del estndar de la OIE como base para la acreditacin. Por
competencia se entiende algo significativo: quiere decir mucho ms que tener y seguir procedimientos
documentados. Tener competencia tambin significa que el laboratorio:
i)
Tiene validez tcnica, mtodos de prueba validados, procedimientos y especificaciones que estn
documentados de acuerdo con los requisitos de las normas y/o directrices seguidas.
ii)
Tiene personal cualificado y adecuado, capaz de entender el componente cientfico que subyace bajo los
procedimientos.
iii)
Tiene el equipo correcto y adecuado.
iv)
Tiene instalaciones adecuadas y control medioambiental.
v)
Tiene los procedimientos y especificaciones que garantizan unos resultados precisos y fiables.
vi)
Puede prever las necesidades y problemas tcnicos.
vii)
Puede solucionar y prevenir los problemas tcnicos que puedan surgir.
viii) Puede controlar y calcular de forma precisa la incertidumbre en los resultados de las pruebas; y
ix)
Puede demostrar competencia en la aplicacin de los mtodos de prueba utilizados.
4.
Seleccin de un organismo de acreditacin
Para que una acreditacin pueda propiciar la aceptacin de los resultados de una prueba de laboratorio con fines
comerciales, dicha acreditacin debe ser reconocida por la comunidad internacional. Por lo tanto, el organismo
de acreditacin debe ser reconocido como competente para acreditar laboratorios. Los programas para el
reconocimiento de los organismos de acreditacin estn basados, dentro del esquema del ILAC, en los requisitos
del Estndar Internacional 17011 de la ISO/EC (3). Se puede obtener informacin sobre organismos de
acreditacin reconocidos, de las organizaciones que los reconoce, tales como la Cooperacin Nacional para la
Acreditacin de Laboratorios (NACLA), la Cooperacin Asia-Pacfico para la Acreditacin de Laboratorios
(APLAC), la Cooperacin Interamericana para la Acreditacin (IAAC), y la Cooperacin Europea para la
Acreditacin (EA).
15
Captulo I.1.2.
5.
Determinacin del mbito del programa de gestin de calidad y/o de la acreditacin del
laboratorio
El programa de gestin de calidad debera cubrir preferentemente las reas de actividad que afectan a cualquier
prueba realizada en el laboratorio. Sin embargo, y a efectos de acreditacin, el laboratorio debera determinar el
rango de pruebas que se van a incluir en la acreditacin. Los factores que pueden afectar el mbito de
acreditacin elegido por un laboratorio son:
i)
La disponibilidad y coste del personal necesario, de las instalaciones y del equipo.
ii)
El coste del control medioambiental para evitar una contaminacin cruzada.
iii)
La fecha lmite para la acreditacin.
iv)
El impacto de los resultados de las pruebas.
v)
El nmero de pruebas realizadas.
vi)
Si las pruebas efectuadas son rutinarias o no rutinarias.
vii)
Si alguna parte de la prueba se subcontrata para su realizacin en otro lugar.
viii) La garanta de calidad necesaria para los materiales, los reactivos y el medio.
ix)
La disponibilidad de estndares de referencia (por ejemplo, los reactivos estandarizados, muestras de

control de calidad interno, los cultivos de referencia).
x)
La disponibilidad de pruebas de competencia.
xi)
La disponibilidad de estndares y/o mtodos de prueba plenamente validados, procedentes de fuentes

fiables.
xii)
La evaluacin y validacin de los mtodos de prueba que se van a utilizar.
xiii) La complejidad tcnica del (los) mtodo (s).

Los organismos de acreditacin tambin acreditan a los proveedores y operadores de programas de pruebas de
competencia, y pueden exigir el uso de un proveedor acreditado, con el fin de entregar al laboratorio un
certificado de acreditacin.
6.
Mtodos de Prueba
La norma 17025 de la ISO/IEC exige el uso de mtodos apropiados y seala los requisitos para la seleccin,
desarrollo y validacin. El documento de la OIE tambin proporciona los requisitos para la seleccin y la
validacin.
En los captulos sobre enfermedades especficas, el presente Manual ofrece recomendaciones sobre la seleccin
de mtodos de prueba realizados con fines comerciales y de diagnstico. Adems se suministra un listado de
pruebas para el comercio internacional. Tal como se indica en la introduccin de este listado, las pruebas
prescritas que aparecen en la lista son las exigidas por el Cdigo sanitario de animales terrestres de la OIE. Se
considera que estas pruebas tienen la validacin adecuada para proporcionar resultados fiables al decidir qu
animales son aptos para el transporte internacional. Tambin se ofrece una lista de pruebas alternativas
apropiadas para el diagnstico de enfermedades de mbito local, pero que pueden haber tenido una validacin
limitada. Generalmente se trata de pruebas serolgicas.
En la profesin veterinaria, otros mtodos estandarizados (mtodos publicados en los estndares
internacionales, regionales o nacionales) o plenamente validados (mtodos que han sido sometidos a un estudio
colaborativo y han sido publicados o emitidos por un organismo tcnico con autoridad, tal como el Internacional
de la AOAC), pueden no estar disponibles aunque su uso fuera preferible. Muchos laboratorios veterinarios
desarrollan o modifican los mtodos, y muchos de dichos laboratorios tienen programas de prueba que utilizan
mtodos no estndares o una combinacin de mtodos estndar y no estndar. A fin de garantizar resultados
vlidos en los laboratorios veterinarios, incluso cuando se utilizan mtodos estandarizados, por lo general debe
realizarse una evaluacin, una optimizacin y/o una validacin internas.
16
Captulo I.1.2.
Los clientes y el personal del laboratorio deben tener muy claro cul es el resultado que se espera de una
prueba. Muchos laboratorios de pruebas veterinarias, tendrn, por tanto la necesidad de demostrar su
competencia en el desarrollo, adaptacin y validacin de los mtodos de prueba.
En el captulo I.1.3 del presente Manual se proporciona asesoramiento detallado y especfico sobre la seleccin,
optimizacin, estandarizacin y validacin de las pruebas.
En los siguientes apartados se tratan los temas relacionados con la metodologa de la prueba, temas que son de
sumo inters para el personal implicado en una gestin de calidad de un laboratorio.
a)
Seleccin del mtodo de la prueba

Los resultados vlidos comienzan con la seleccin de un mtodo de prueba apropiado para los temas de
diagnstico de que se trate. Las consideraciones para la seleccin del mtodo de prueba son:
i)
Aceptacin internacional.
ii)
Aceptacin cientfica.
iii)
Vigencia del mtodo.
iv)
Caractersticas de ejecucin (por ejemplo, sensibilidad y especificidad analtica y de diagnstico, tasa

de aislamiento, precisin (repetibilidad, reproducibilidad, replicabilidad, precisin e incertidumbre).
v)
Comportamiento en las especies y en la poblacin pertinente.
vi)
Recursos y tiempo disponibles para la realizacin, adaptacin y/o evaluacin.
vii)
Tiempo de realizacin y de devolucin.
viii) Tipo de muestra (por ejemplo, suero, tejido) y la calidad o estado en que se espera que aquella llegue
al laboratorio.
ix)
Sustancia a analizar (por ejemplo, anticuerpo, antgeno).
x)
Recursos y tecnologa del laboratorio.
xi)
Naturaleza del uso que se le pretende dar al mtodo (por ejemplo, exportacin, importacin, vigilancia,
proteccin, confirmacin, utilizacin con un animal solo o con la manada).
xii)
Expectativas del cliente.
xiii) Factores de seguridad.

xiv) Nmero de pruebas a realizar.
xv)
Coste de la prueba por muestra.
xvi) Existencia de estndares de referencia, incluyendo los materiales de referencia; y

xvi) Disponibilidad de planes sobre para pruebas de competencia.
b)
Optimizacin y estandarizacin del mtodo de prueba

Una vez seleccionado el mtodo debe ponerse en marcha en el laboratorio. Tanto si el mtodo se ha
desarrollado localmente como si ha sido importado de una fuente externa, se requiere una optimizacin
adicional. La Optimizacin consiste en una serie de experimentos seguida de un anlisis posterior de los
datos. La optimizacin establece las especificaciones esenciales y los estndares de ejecucin para el
proceso de la prueba y para su utilizacin a la hora de monitorizar la correcta ejecucin de la prueba. La
optimizacin debe garantizar que el mtodo se somete al correspondiente control estadstico. La
optimizacin tambin debe determinar:
i)
Las especificaciones esenciales para el equipamiento y el instrumental.
ii)
Las especificaciones esenciales para los reactivos (por ejemplo, qumicos o biolgicos).
iii)
Las especificaciones esenciales para los estndares de referencia, materiales de referencia y

controles internos.
iv)
La robustez (si es aplicable).
v)
Los puntos crticos de control esenciales y los rangos, caractersticas o comportamiento aceptables en
los puntos de control esenciales, utilizando procedimientos aceptables desde el punto de vista
estadstico.
vi)
Las actividades de control de calidad necesarias para monitorizar los puntos de control esenciales.
17
Captulo I.1.2.
vii)
El tipo, nmero, alcance, frecuencia y/o disposicin de los controles de ejecucin de la prueba que
sean necesarios.
viii) Los requisitos para controlar el comportamiento de la aceptacin o rechazo no subjetivos de los
resultados de la prueba.
c)
ix)
Los elementos de un mtodo de prueba fijado y documentado, para ser usado por el personal del
laboratorio; y
x)
El nivel de competencia tcnica que deben reunir aquellas personas que realizan y/o interpretan la
prueba.
Validacin del mtodo de la prueba

La validacin sirve adems para evaluar la prueba segn su adecuacin a un determinado uso. La
validacin establece las caractersticas aplicables al mtodo de la prueba, tales como el grado de
sensibilidad, especificidad y aislamiento, y los parmetros de diagnstico tales como corte positivo/negativo,
y ttulo de inters o significacin. La validacin debe hacerse utilizando un procedimiento optimizado,
documentado y fijado. Dependiendo de los factores logsticos y de riesgo, la validacin puede incluir
cualquier nmero de actividades y cantidad de datos, con el posterior anlisis de los datos mediante el uso
de estadsticas apropiadas. La validacin de pruebas se trata en el captulo I.1.3., titulado Principios de
validacin para las pruebas de diagnstico de enfermedades infecciosas, y en el captulo I.1.4, titulado
Validacin y control de calidad de los mtodos de reaccin en cadena de la polimerasa utilizados para el
diagnstico de enfermedades infecciosas.
Las actividades de validacin podran incluir:
i)
Estudios de campo y/o epidemiolgicos.
ii)
Comparacin con otros mtodos, preferiblemente con mtodos estndar.
iii)
Comparacin con estndares de referencia (si estn disponibles).
iv)
Estudios en colaboracin con otros laboratorios, utilizando el mismo mtodo documentado e incluido el
intercambio de muestras, con preferencia, aquellas cuya composicin o dosificacin no estn
explicitadas. Es preferible que dichos estudios sean dirigidos por un laboratorio cualificado, que
organice dichos estudios y evale los resultados proporcionados por todos los participantes.
v)
Reproduccin de los datos a partir de un mtodo estndar aceptado o de una publicacin acreditada.
vi)
Estudios experimentales de comprobacin; y
vii)
Anlisis de los datos de control de calidad internos.
La norma 17025 de la ISO/IEC reconoce que La Validacin es siempre un equilibrio entre los costes, los
riesgos y las posibilidades tcnicas. Tambin admite que hay muchos casos en los que aspectos tales
como la exactitud y la precisin, slo pueden darse de forma simplificada.
d)
Incertidumbre
Los laboratorios deben ser capaces de evaluar la incertidumbre suscitada por los mtodos de prueba
aplicados en el laboratorio. Esto incluye los mtodos usados por el laboratorio para calibrar el equipo (3).
Los requisitos de la norma 17025 de la ISO/IEC relacionados con este asunto, se mencionan en las
secciones 5.1.2, 5.4.4k, 5.4.6.2, 5.4.6.3 y 5.10.3.1c de dicho documento.
La determinacin de la incertidumbre de una medicin (MU), no es nueva en metrologa. Sin embargo, la
aplicacin de los principios de la MU en los laboratorios de ciencias biolgicas, es nueva. La mayor parte de
los trabajos realizados hasta la fecha estn relacionados con mbitos de ensayos distintos al de las
ciencias biolgicas, y la mayor parte de las aportaciones son de tipo terico. Sin embargo, a medida que la
acreditacin ha ido cobrando importancia, se han ido desarrollando aplicaciones en otras reas. Es
importante tener en cuenta que la MU no implica duda acerca de la validez del resultado de una prueba o
de una medicin, ni es equivalente a un error, ya que puede aplicarse a todos los resultados de las pruebas
derivados de un procedimiento particular. La MU puede considerarse como una expresin cuantitativa de
fiabilidad y se expresa comnmente con un nmero despus del signo +/- (es decir, el valor real cae dentro
del rango establecido, ya que el MU se expresa como un rango). La desviacin estndar y el intervalo de
confianza son ejemplos de la expresin de la MU. Un ejemplo del uso de la desviacin estndar para
expresar duda, lo constituyen los lmites permitidos en los controles de realizacin de una prueba en un
enzimoinmunoensayo, comnmente expresado como +/- n SD.
18
Captulo I.1.2.
Aunque la determinacin y expresin de la MU no han sido estandarizadas para los laboratorios de pruebas
veterinarias, existen algunas directrices bien fundadas.
En el laboratorio debe estimarse el MU para cada mtodo que haya de ser acreditado. Puede estimarse
mediante una serie de pruebas realizadas sobre muestras control. La MU puede tambin estimarse
utilizando caractersticas manejadas en publicaciones (6), pero antes el laboratorio debe demostrar una
actuacin aceptable al aplicar el mtodo. Las agencias gubernamentales pueden fijar metas para los
valores de la MU para los mtodos oficiales, (por ejemplo: Health Canad). Organizaciones tcnicas de
prestigio (como la AOAC Internacional, ISO, NATA, A2LA, SCC, UKAS, Eurachem y la Cooperacin para la
Trazabilidad Internacional en Qumica Analtica [CTAC]), imparten cursos y ofrecen directrices sobre MU
para los laboratorios que solicitan la acreditacin. Codex Alimentarius, que especifica los estndares para
las pruebas con alimentos, ha asumido el principio de que no es necesario que un laboratorio obtenga una
estimacin adicional de la MU, si dicho laboratorio cumple con los principios de Codex relativos a la calidad:
es decir, que el laboratorio est acreditado por la norma 17025 de ISO/IEC y usa mtodos validados ( por
ejemplo, que conozca parmetros aplicables tales como sensibilidad y especificidad, as como el intervalo
de confianza en torno a dichos parmetros), y que participe en los Programas de Pruebas de Competencia,
y en los estudios en colaboracin, y utilice procedimientos de control de calidad internos que sean
apropiados.
El uso de procedimientos adecuados de control de calidad, de carcter interno, implica que el laboratorio
debe utilizar procedimientos de control de calidad para identificar las principales fuentes de incertidumbre.
No es preciso tratar cada componente por separado. Los componentes pueden estimarse mediante
experimentos de laboratorio (estimaciones de Tipo A) o a partir de otras fuentes (materiales de referencia,
certificaciones de calibracin, etc.) (estimaciones de Tipo B). Un procedimiento tradicional de muestra
control, llevado a cabo muchas veces por todos los analistas, normalmente identifica todas las fuentes
principales de duda, con la posible excepcin de la preparacin de la muestra. Puede utilizarse la variacin
de las muestras control como una estimacin de aquellas fuentes combinadas de duda.
La norma 17025 de ISO/IEC exige que el laboratorio identifique todas las fuentes importantes de
incertidumbre, y que obtenga estimaciones fiables de MU. Puede darse el caso de que los laboratorios
deseen establecer especificaciones aceptables, criterios y/o intervalos en los puntos crticos de control para
cada componente. Donde proceda, los laboratorios pueden implementar el control adecuado de calidad en
los puntos crticos asociados con cada fuente o intentar reducir el tamao de un componente. Entre las
fuentes de incertidumbre, estn el muestreo, las condiciones de almacenamiento, los efectos de la muestra,
la extraccin y recuperacin la calidad del reactivo, la pureza del material de referencia, las manipulaciones
volumtricas, las condiciones ambientales, la contaminacin, los efectos del equipamiento, el sesgo del
operador o analista, y otros defectos desconocidos o debidos al azar. Es de esperar que el laboratorio se
ocupe de cualquier error que se haya producido de forma sistemtica. (Vase tambin la Seccin 6.b.,
puntos i-vii). Los errores sistemticos (por sesgo) deben corregirse con cambios metodolgicos, ajuste
matemtico, anotacin de cualquier sesgo en el documento de informe. Si se produce un ajuste del
procedimiento, puede ser necesaria o no una re-evaluacin de la incertidumbre. Si se produce un ajuste
para corregir el sesgo, se estar introduciendo una nueva fuente de incertidumbre (la incertidumbre de la
correccin). Esta debe aadirse a la MU de la estimacin.
Las tres formas principales de estimacin de la MU son:
1. La aproximacin por componentes (aproximacin de abajo hacia arriba o bottom-up), en la que se
identifican todas las fuentes de incertidumbre, se hacen estimaciones razonables para cada
componente, se desarrolla un modelo matemtico que relaciona entre s a los componentes y se
combinan las variaciones utilizando reglas para la propagacin del error (1).
2. La aproximacin en que se utilizan muestras control (aproximacin de arriba hacia abajo o top-down),
en la que se utilizan mediciones de material control estable para estimar la variacin combinada de
muchos componentes. Debe aadirse la variacin procedente de fuentes adicionales.
3. La aproximacin que tiene en cuenta las caractersticas del mtodo, en la que se utilizan como
incertidumbres combinadas los datos de actuacin de un estudio colectivo vlido (se pueden aadir
otras fuentes de incertidumbre). Los laboratorios deben cumplir con los criterios definidos para el
tratamiento del sesgo y la repetibilidad a fin de que las estimaciones de MU sean vlidas. Estas
deberan ser mayores que las obtenidas por los laboratorios competentes mediante la utilizacin de sus
propias muestras control o mediante le modelo de componentes.
e)
Aplicacin y uso del mtodo de la prueba

Los analistas deben demostrar su competencia en el uso del mtodo de la prueba, segn se va realizando
sta, antes de elaborar el informe con los resultados.
19
Captulo I.1.2.
El laboratorio debe garantizar, mediante la gestin de proyectos adecuados y documentados, el registro de

datos, el manejo de datos y los procedimientos de archivado, que puede recrear de nuevo, si es necesario,
todos los aspectos relacionados con la seleccin, el desarrollo, la optimizacin, la estandarizacin, la
validacin, la realizacin y el uso de la prueba. Ello incluye las actividades de control y garanta de calidad.
7.
Plan Estratgico
Es esencial que haya un perfeccionamiento continuo. Se recomienda que el laboratorio est informado y al da
en torno a cualquier obstculo que se presente relacionado con los estndares y los mtodos utilizados, con el
fin de demostrar la competencia del laboratorio y establecer y mantener la validez tcnica. Los mtodos para
llevar esto a cabo son:
i)
Asistencia a conferencias.
ii)
Participacin en organizaciones locales e internacionales.
iii)
Participacin en la redaccin de estndares nacionales e internacionales (por ejemplo, participacin en las

comisiones del ILAC y de ISO).
iv)
Consulta de publicaciones.
v)
Visitas a otros laboratorios.
vi)
Participacin en programas de colaboracin (por ejemplo, con el Instituto Interamericano de Cooperacin

para la Agricultura).
vii)
Intercambio de procedimientos, mtodos, reactivos, muestras, personal e ideas; y
viii) Siempre que sea posible, acreditacin por medio de terceros de que dicho laboratorio est reconocido
como competente para emitir acreditaciones.
REFERENCIAS
1.
AMERICAN NATIONAL STANDARDS INSTITUTE (1997). ANSI/NCSL Z540-2-1997, US Guide to the Expression of
Uncertainty in Measurement, First Edition. American National Standards Institute, 1819 L Street, NW,
Washington, DC 20036, USA.
2.
ISO/IEC INTERNATIONAL STANDARD 17000 (2005) . Conformity Assessment General Vocabulary.

International Organisation for Standardisation (ISO), ISO Central Secretariat, 1 rue de Varemb, Case
Postale 56, CH - 1211, Geneva 20, Switzerland.
3.
ISO/IEC INTERNATIONAL STANDARD 17011 (2003) . General Requirements for Bodies Providing Assessment
and Accreditation of Conformity Assessment Bodies General Requirements for Operation and Recognition.
International Organisation for Standardisation (ISO), ISO Central Secretariat, 1 rue de Varemb, Case
Postale 56, CH - 1211, Geneva 20, Switzerland.
4.
ISO/IEC INTERNATIONAL STANDARD 17025 (1999). General Requirements for the Competence of Testing and
Calibration Laboratories. International Organisation for Standardisation (ISO), ISO Central Secretariat, 1 rue
de Varemb, Case Postale 56, CH - 1211, Geneva 20, Switzerland.
5.
ISO INTERNATIONAL STANDARD 9001 (2000). Quality management systems Requirements. International
Organization for Standardization (ISO), ISO Central Secretariat, 1 rue de Varemb, Case Postale 56, CH 1211, Geneva 20, Switzerland.
6.
ISO DTS 21748 (draft). Guide to the use of repeatability, reproducibility and trueness estimates in
measurement uncertainty estimation. International Organisation for Standardisation (ISO), ISO Central
Secretariat, 1 rue de Varemb, Case Postale 56, CH - 1211, Geneva 20, Switzerland.
7.
OFFICE INTERNATIONAL DES EPIZOOTIES (2000). Standard for Management and Technical Requirements for
Laboratories Conducting Tests for Infectious Animal Diseases. In: OIE Quality Standard and Guidelines for
Veterinary Laboratories: Infectious Diseases (2002). Office International des Epizooties (OIE), 12 rue de
Prony, 75017 Paris, France, 131.
*
* *
2
20
ISO/IEC International Standard 17000 replaces ISO/IEC GUIDE 2 (1996). Standardisation and Related Activities General
Vocabulary.
ISO/IEC International Standard 17011 replaces ISO/IEC Guide 58 (1993). Calibration and Testing Laboratory
Accreditation Systems General Requirements for Operation and Recognition.
CAPTULO I.1.3.
PRINCIPIOS DE VALIDACIN PARA LAS

PRUEBAS DE DIAGNSTICO
DE ENFERMEDADES INFECCIOSAS
INTRODUCCIN
La validacin consiste en la evaluacin de un proceso a fin de determinar su idoneidad para un
uso particular. Una ensayo validado produce resultados que identifican la presencia de un
compuesto concreto (por ejemplo, un anticuerpo) y permite la posibilidad de formular predicciones
sobre el estado de los sujetos analizados. Las pruebas realizadas sobre individuos o sobre
poblaciones tienen varios propsitos, tales como ayudar a documentar la ausencia de una
determinada enfermedad en un pas o regin, evitar su propagacin a travs del comercio,
erradicar una infeccin de una zona, confirmar el diagnstico de los casos clnicos, estimar la
prevalencia de una infeccin para facilitar anlisis de riesgo, identificar los animales infectados
con vistas a desarrollar medidas de control, y clasificar los animales segn su salud o estado de
inmunizacin ECP la vacunacin. Es posible validar una nica prueba para uno o varios
propsitos mejorando algunas caractersticas de su realizacin en cada caso (por ejemplo,
elevando el nivel de sensibilidad del diagnstico - hasta el 99,99%- y disminuyendo a la vez su
especificidad para un ensayo general, o inversamente, estableciendo una alta especificidad
asociada a un bajo nivel de sensibilidad en una prueba confirmativa).
Si consideramos las variables que pueden afectar a la realizacin de un ensayo, podremos
apreciar ms claramente los criterios que deben tenerse en cuenta para su validacin. Estas
variables pueden agruparse en tres categoras: (a) la muestra - que refleja las interacciones
hospedador/organismo que influye en la composicin y concentracin del componente a analizar
en la muestra de suero; (b) el sistema de ensayo - que incluye factores fsicos, qumicos,
biolgicos y tcnicos que afectan a la capacidad de la prueba para detectar en la muestra un
componente especfico; y (c) el resultado de la prueba - es decir, la capacidad del sistema de
ensayo para predecir de forma precisa el estado del individuo o de la poblacin en relacin con el
componente en cuestin.
Los factores que influyen en la concentracin y en la composicin de un componente de la
muestra de suero dependen en gran medida del hospedador y son factores naturales (como la
edad, sexo, raza, estado nutritivo, embarazo, respuesta inmunolgica), o bien factores adquiridos
(como la adquisicin pasiva de anticuerpos, la inmunidad activa obtenida por vacunacin o
infeccin). Otros factores que no dependen del hospedador, como la contaminacin o el deterioro
de la muestra, tambin pueden afectar al componente a analizar en dicha muestra.
Los principios de validacin que se consideran en este captulo se refieren fundamentalmente a
mtodos para detectar anticuerpos en sueros. No obstante, estos mismos principios se pueden
aplicar a la valoracin de pruebas para otros componentes en sueros o tejidos. El captulo I.1.4.,
que trata de la validacin y el control de calidad de mtodos de la reaccin en cadena de la
polimerasa usados para el diagnstico de enfermedades infecciosas, aplica los principios
generales descritos aqu a un mtodo directo de deteccin de agentes infecciosos, mediante
ensayos de diagnstico molecular.
21
Captulo I.1.3. Principios de validacin para las pruebas diagnsticas de enfermedades infecciosas
Los factores que interfieren en la precisin analtica del sistema de ensayo incluyen la
instrumentacin, el error tcnico, la eleccin de los reactivos (tanto desde el punto de vista
qumico como biolgico), la calibracin, ajuste y lmites de validez de los controles, los recipientes
de las reacciones, la calidad del agua, el pH y la fuerza inica de los tampones y diluyentes, las
temperaturas de incubacin y su duracin, as como los errores que se introducen por deteccin
de compuestos estrechamente relacionados, del tipo de anticuerpos con reaccin cruzada,
factores reumatoides, o anticuerpos heterfilos.
Los factores que influyen en la capacidad del resultado de una prueba para predecir de forma
1
precisa la infeccin o el nivel de un componente analizado en el hospedador son la sensibilidad
del diagnstico, la especificidad del mismo, y la prevalencia de la enfermedad en la poblacin
objeto de la prueba. La sensibilidad y la especificidad diagnstica derivan de resultados de
pruebas con muestras obtenidas de animales de referencia previamente seleccionados. Los
mtodos empleados para seleccionar estos animales son importantes para la precisin de las
estimaciones (5). El grado en que dichos animales representen todas las variables ambientales y
del hospedador en la poblacin examinada tiene una influencia fundamental en la adecuada
interpretacin de los resultados. Por ejemplo, los clnicos experimentados saben que un ensayo
validado para un tipo de ganado del norte de Europa puede que no sea adecuado para suministrar
resultados vlidos cuando se aplica a poblaciones de ganado de frica.
La capacidad del resultado positivo o negativo de una prueba para predecir de forma precisa el
estado de un animal o poblacin con respecto a una infeccin es la consideracin ms importante
para la validacin de un ensayo. Esta capacidad no slo depende de un ensayo preciso y muy
fiable, y de estimaciones cuidadosamente obtenidas acerca de la sensibilidad y la especificidad de
diagnstico, sino que tambin est muy influenciada por la prevalencia de la infeccin en la
poblacin sometida a anlisis o por la probabilidad de que un animal est infectado segn criterios
clnicos. Sin una estimacin real de la prevalencia de la enfermedad en esa poblacin o de la
probabilidad de infeccin en un animal aislado, la interpretacin del resultado positivo o negativo
de una prueba puede resultar dudosa.
Por supuesto, antes de considerar validado un ensayo se deben tener en cuenta muchas
variables (15,13). Sin embargo, no hay consenso sobre si el concepto de validacin de un ensayo
es un proceso temporalmente limitado, en el que solamente se optimizan y estandarizan aquellos
factores inherentes al ensayo, o bien si supone una validacin continuada del ensayo por todo el
tiempo en el que el ensayo puede ser usado. De acuerdo con lo descrito, el trmino "ensayo
validado" puede llevar a varias interpretaciones entre los tcnicos de laboratorio y los veterinarios
clnicos. Por consiguiente, se ofrece una definicin funcional de la validacin de un ensayo como
marco para las directrices esbozadas a continuacin. En teora, todos las pruebas diagnsticas
deberan ser completamente validadas para uno o varios fines, pero en la prctica a veces existen
limitaciones para una completa validacin.
22
A lo largo de este captulo, los trminos positivo y negativo se emplean con relacin a los resultados de pruebas y
nunca para designar el estado de infeccin o el nivel de anticuerpo/antgeno en el hospedador. Cuando se hace
referencia a infeccin o compuesto a analizar se supone la existencia de algun modo de exposicin a un agente
infeccioso que puede ser detectado de modo directo (como antgeno) o indirecto (como anticuerpo) por una prueba de
ensayo.
A. DEFINICIN DE LA VALIDACIN DE UN ENSAYO

Un ensayo validado proporciona de modo repetitivo unos resultados mediante un test que identifican a los
animales como positivos o negativos para un componente o proceso determinado (por ejemplo un anticuerpo,
un antgeno, o la induracin cutnea localizada en el sitio de prueba) y, por deduccin, permite predecir de
2
modo preciso el estado de infeccin de animales con un grado predeterminado de fiabilidad estadstica . Este
captulo se centrar en los principios que fundamentan el desarrollo y el mantenimiento de una prueba validada.
Se incluyen tambin algunas indicaciones acerca de los estadios iniciales del desarrollo del ensayo porque
constituyen parte del proceso mismo de validacin. La capacidad del resultado final del test en cuanto a
proporcionar fiabilidad diagnstica est influenciada de un modo notable por el modo en que se lleva a cabo
este proceso inicial.
Debe hacerse hincapi en que un ensayo, cuando se aplica a poblaciones, minimizar la clasificacin de
animales como falsos positivos o falsos negativos solamente en la medida en que su validez est garantizada
en todas las fases del proceso de validacin del ensayo. Esto supone que un mtodo de prueba bien diseado y
documentado, as como unos reactivos adecuados, en combinacin con tcnicos bien preparados,
proporcionarn un ensayo estable de laboratorio. Tambin implica el empleo minucioso de un riguroso diseo
experimental y de herramientas epidemiolgicas y estadsticas. Estos son elementos requeridos para eliminar
sesgo, errores aleatorios y falsas suposiciones acerca de la poblacin de animales sobre la que se formulan las
estimaciones del ensayo (5). Adems, se supone que el ensayo se adapta bien al propsito que se persigue
(por ejemplo, es probable que un ensayo confirmativo suministre muchos resultados del tipo falsos positivos si
se usa como una prueba general de deteccin). Finalmente, esto tambin supone que, en la prctica, el ensayo
se aplica dentro del contexto de un programa riguroso de control de calidad.
La definicin funcional de validacin de un ensayo que se emplea en este captulo generaliza un proceso que
conlleva diferentes aspectos en funcin de la intencin o el fin para el cual se desarrolla. Dejando a un lado el
tipo concreto de ensayo, sin la existencia de rigor cientfico en el proceso validativo, el ensayo no cumplir las
expectativas. No obstante, existen muchas tcnicas tradicionales con un uso muy extendido que no han sido
sometidas a un proceso de validacin completo.
B. ESTADIOS DE LA VALIDACIN DE UN ENSAYO

El desarrollo y la validacin de un ensayo es un proceso secuencial que consta de al menos de cinco fases: 1)
Determinacin de la viabilidad del mtodo para un uso especfico; 2) Eleccin, optimizacin y estandarizacin de
los reactivos, tcnicas y mtodos; 3) Determinacin de las caractersticas de funcionamiento del ensayo; 4)
Evaluacin continuada del funcionamiento; y 5) Mantenimiento y refuerzo de los criterios de validacin durante
el uso rutinario del ensayo (Figura 1). Aunque algunos cientficos pueden cuestionar la relevancia de la cuarta y
quinta fase, tales estadios se incluyen aqu porque un ensayo solo se considera vlido cuando los resultados de
las pruebas son vlidos, es decir, si estn dentro de lmites estadsticamente definidos y proporcionan
deducciones precisas. En la prctica, hay muchas tcnicas tradicionales de amplio uso que no se han sometido
al proceso de validacin formal expuesto. Se deberan hacer esfuerzos para validar formalmente las
caractersticas de funcionamiento de estos ensayos, mediante el uso de datos histricos o bien a travs de un
estudio prospectivo. Esto dara crdito a la creencia de que tales ensayos son tiles para lo que se pretende. En
dichos casos se puede comenzar el proceso en los estadios 4 y 5, reuniendo un conjunto de datos de validacin
para ensayos que carezcan de la informacin necesaria correspondiente a las fases 1-3.
Es muy importante no detenerse despus de los dos primeros estadios de validacin de un ensayo -ya que eso
no constituye un ensayo validado para uso diagnstico. Aunque la mejora del protocolo y de los reactivos son
factores importantes, el factor ms crtico es probablemente la seleccin de las poblaciones de referencia.
Cuando se revisa la literatura no resulta raro encontrar un amplio espectro de valoraciones sobre la sensibilidad
diagnstica y la especificidad diagnstica para un mismo ensayo bsico. Aunque parte de la variacin se puede
atribuir a los reactivos escogidos, es probable que la variacin en las valoraciones de la sensibilidad y de la
especificidad se deba a una seleccin sesgada de los sueros sobre los que se "valida" la prueba. Este estadio
en la validacin de un ensayo necesita ms atencin de la que ha recibido con anterioridad. Esto es
Segn esta definicin, la sensibilidad y especificidad diagnsticas son caractersticas de la realizacin de una prueba
para una poblacin estudiada. Ambas caractersticas determinan en conjuncin con la prevalencia de la enfermedad en
la poblacin- la probabilidad de que un resultado concreto de una prueba refleje el verdadero estado del animal. Puede
aceptarse como validada una prueba si se dispone de estimaciones fiables de la sensibilidad y la especificidad
diagnsticas para la poblacin estudiada. Esto no implica la exigencia de unos determinados valores-umbral de esos dos
parmetros. En aplicaciones prcticas, unos valores de sensibilidad o especificidad bajos o problemas de diagnstico
debidos a una prevalencia baja de la enfermedad se compensan con el diseo de muestreo o combinando muchas
pruebas de diagnstico ya sea en paralelo, ya sea secuenciadas. La seleccin de las pruebas, el proceso de muestreo,
la combinacin de mltiples pruebas en un determinado rgimen de ensayo y la regla de interpretacin de resultados
hacen posible una definicin del proceso de diagnstico.
23
particularmente cierto ante la atmsfera actual de acuerdos de comercio internacional y todas sus implicaciones
respecto al movimiento de animales y sus productos derivados.
Seleccionar mtodo
FASE 1
Viabilidad
Seleccionar sueros estndar
Seleccionar sueros control

Estudios de
viabilida
FASE 2
Desarrollo
y
estandarizacin
FASE 3
Caracterizacin
operativa del ensayo
Problemas que requieren

reconsideracin
Sueros de animales
infectados y no
infectados
Optimizar y
estandarizar
reactivos y
protocolos
Sensibilidad analtica
Ensayar
muestras de
animales de
referencia
Normalizar
datos
Especificidad analtica
Valoraciones iniciales de repetitividad
Estndares de suero
conocidos
Establecer
cortes
FASE 4
Comprobacin de la
realizacin y validez
del ensayo
Resultados
normalizados de
pruebas de
rutina
Categorizar
los resultados
en Pos/Neg
Controlar precisin y
exactitud
FASE 5
Mantenimiento y
mejora de criterios de
validacin
Cambio de reactivos estandarizados por

comparacin con reactivos en uso
Calcular
precisin y
exactitud
Calcular especificidad
y sensibilidad
diagnstica
Determinar la prevalencia
en la poblacin
Calcular VPr+ y VPr- para una

interpretacin vlida de resultados
Extensin de la validacin a otras

poblaciones probando sueros de
animales de referencia
representativos de dichas
Fig. 1. Fases consecutivas del proceso de validacin de un ensayo
En este captulo usaremos un ensayo indirecto basado en la unin de una enzima a un inmunoadsorbente
(tcnica ELISA) para la deteccin de anticuerpos a fin de ilustrar los principios de validacin de un ensayo. Es
un formato de prueba que puede resultar difcil de validar debido a la amplificacin de la seal tanto de los
componentes especficos como de los inespecficos (2). Esta metodologa sirve para destacar los problemas a
los que hay que enfrentarse en cualquier proceso de validacin. Los mismos principios bsicos se usan en la
validacin de otros formatos de ensayo simples o complejos. El Captulo I.1.4., sobre validacin y control de
calidad de los mtodos de reaccin en cadena de la polimerasa que se usan para el diagnstico de
enfermedades infecciosas, describe los principios para validar tcnicas de amplificacin de genes.
Por limitaciones de espacio, este captulo introductorio proporciona nicamente directrices bsicas en los
principios relacionados con la validacin de un ensayo. Su presentacin deriva de un tratamiento ms detallados
del tema (8).
1 FASE. ESTUDIOS DE VIABILIDAD

En el ejemplo de las tcnicas ELISA, los estudios de viabilidad constituyen la primera fase para validar un nuevo
ensayo. Se llevan a cabo para determinar si los reactivos y el protocolo que han sido seleccionados tienen la
capacidad de distinguir entre un intervalo de concentraciones de anticuerpo frente a un agente infeccioso a la
vez que proporcionan una mnima actividad inespecfica de fondo. Los estudios de viabilidad tambin
suministran estimaciones iniciales de reproducibilidad, y de sensibilidad y especificidad analticas.
24
1.
Muestras control
Resulta til seleccionar cuatro o cinco muestras (suero en nuestro caso) que difieran en cuanto al nivel de
anticuerpos contra el agente infeccioso en cuestin. Adems, se requiere una muestra que no contenga
anticuerpos. Estas muestras se usarn para optimizar los reactivos y el protocolo del ensayo durante los
estudios de viabilidad, y ms tarde como muestras control. En teora, las muestras deberan representar tanto a
animales que se consideran infectados como aquellos no infectados dentro de la poblacin que finalmente va a
ser objeto del ensayo validado. Por otra parte, las muestras deben haber dado los resultados esperados en uno
o ms ensayos serolgicos adems de aqul en el que se est validando. Con preferencia, las muestras deben
proceder de animales individuales, aunque tambin pueden derivar de la acumulacin de muestras de varios
animales. Una prctica que resulta adecuada es preparar un gran volumen de cada muestra (por ejemplo, 10
ml) y dividirlo en alicuotas de 0,1 ml para almacenamiento a -20C o por debajo de esta temperatura. Luego, una
alcuota de cada muestra se descongela, se utiliza para los experimentos y despus se desecha. Si resulta poco
prctico descartar la alcuota, se puede mantener la misma a -4C para experimentos sucesivos hasta alrededor
de 2 semanas, aunque en estas circunstancias existe la posibilidad de que la muestra se deteriore. A
continuacin, se descongela otra alcuota para ulterior investigacin. Este mtodo proporciona una misma
fuente de suero con idntico nmero de ciclos de congelacin-descongelacin para todos los experimentos (la
congelacin y descongelacin repetida del suero puede desnaturalizar los anticuerpos, de modo que debera
evitarse). Tambin, la variacin se reduce cuando el investigador usa la misma fuente de suero para todos los
experimentos en vez de cambiar entre varios sueros. Este enfoque tiene la ventaja aadida de generar una serie
de datos vlidos para muestras que se manejan repetidamente. Despus de que se completan las fases
iniciales de validacin de un ensayo, una o ms muestras se pueden convertir adems en controles de suero
que son la base para la expresin de los datos y la evaluacin de la reproducibilidad tanto dentro de un ensayo
como entre diferentes ensayos. Pueden tambin servir como estndar de referencia si su actividad ha sido
predeterminada; esos estndares normalizados proporcionan la seguridad de que la realizacin de los ensayos
produce datos precisos (13).
Es muy deseable incluir los sueros internacionales estandarizados de la OIE u otros sueros estandarizados, si
puede disponerse de ellos. Su uso proporcionara una adecuada armonizacin entre el ensayo en desarrollo y
cualquier otro mtodo normalizado que use normalmente sueros de tipo estndar internacional (12).
2.
Seleccin del mtodo para lograr resultados normalizados
La normalizacin ajusta los resultados directos del test para todas las muestras con relacin a los valores de los
controles incluidos en cada desarrollo del ensayo (no confundir esto con una transformacin de datos para
lograr una distribucin normal de Gauss). El mtodo de normalizacin y expresin de los datos debera
determinarse, preferiblemente, antes del final de los estudios de viabilidad. Las comparaciones de resultados
da a da y entre laboratorios son ms precisos cuando se usan datos normalizados. Por ejemplo, en los
sistemas ELISA, los valores directos de densidad ptica (absorbancia) son medidas absolutas influenciadas por
las temperaturas ambientales, los parmetros de comprobacin y la instrumentacin fotomtrica. Para tener en
cuenta esta variabilidad, los resultados se expresan en funcin de la reactividad de una o ms muestras control
de los sueros que se incluyen en cada desarrollo del ensayo. En el mtodo indirecto de la tcnica ELISA, la
normalizacin de los datos se logra expresando los valores de absorbancia en una de varias formas posibles
(13). Un mtodo simple y til es expresar todos los valores de absorbancia como porcentaje de un control nico
de suero altamente positivo que se incluye en cada placa. Este mtodo resulta adecuado para la mayora de las
aplicaciones. El procedimiento de normalizacin puede resultar ms riguroso si se calculan los resultados a
partir de una curva estndar generada por varios controles de suero. Esto requiere un algoritmo ms sofisticado,
tal como un ajuste de regresin lineal o un anlisis de tipo log-logit. Este mtodo es ms preciso porque no
descansa solamente en una muestra control altamente positiva para la normalizacin de datos, sino que usa
varios controles de suero, ajustados a valores esperables, para obtener una curva estndar desde la que puede
extrapolarse el valor de la muestra. Este mtodo tambin permite la exclusin de un valor control que puede
caer fuera de los lmites de confianza esperados.
Para ensayos de punto final por titulacin de la muestra, como la neutralizacin vrica por suero, cada ensayo
realizado se acepta o se rechaza en funcin de si los valores control caen dentro de lmites predeterminados. Ya
que los valores de la muestra no se ajustan normalmente a un valor control, los datos no resultan normalizados
en estricta definicin del trmino.
Sea cual sea el mtodo usado para la normalizacin de los datos, es esencial incluir controles adicionales para
cada reactivo que pueda introducir variabilidad y que pueda limitar por tanto los intentos de lograr un ensayo
validado. Los valores normalizados para tales controles tienen que caer dentro de lmites predeterminados
(dentro de un mltiplo apropiado de la desviacin estndar de la media de muchas reacciones de cada control).
Los lmites escogidos deberan reflejar una tasa tolerable de rechazo de ensayo y un riesgo aceptable de que
algunas muestras de test puedan estar mal clasificadas.
25
2 FASE. DESARROLLO Y ESTANDARIZACION DEL ENSAYO

Una vez establecida la viabilidad del mtodo, el paso siguiente es proceder al desarrollo del ensayo y la
estandarizacin de los reactivos y los protocolos seleccionados.
1.
Seleccin de las concentraciones ptimas de reactivo y parmetros de protocolo
Las concentraciones o diluciones ptimas del antgeno fijado a la placa, del suero, del conjugado
enzima/anticuerpo y de la solucin de sustrato se determinan mediante valoraciones de tipo "tablero de ajedrez"
enfrentando cada uno de los reactivos contra todos los dems, confirmndose despus la eleccin mas
apropiada de los recipientes de reaccin (generalmente por evaluacin de dos o tres tipos de microplacas, con
caractersticas de fijacin diferentes, para minimizar la actividad de fondo y conseguir la mxima diferencia en
actividad entre muestras negativas y positivas altas). Experimentos adicionales determinan las variables
temporales, qumicas y fsicas ptimas del protocolo, incluyendo las temperaturas y duracin de la incubacin; el
tipo, pH, y la molaridad del disolvente y de los tampones de lavado y bloqueantes; as como el equipamiento
usado en cada fase del ensayo (como por ejemplo las pipetas y los sistemas de lavado que proporcionan una
mejor reproducibilidad).
La optimizacin de los reactivos y del protocolo conlleva una comprobacin de la exactitud mediante la
inclusin, en cada realizacin de la prueba, de uno o mas estndares de suero con un nivel conocido de
actividad debida a la sustancia a analizar. Un ensayo optimizado que proporcione los mismos resultados de
forma repetitiva para un estndar de suero y para los controles puede ser considerado como una prueba
estandarizada.
2.
Reproducibilidad- estimaciones preliminares
Las evidencias preliminares de reproducibilidad (concordancia entre los duplicados dentro de un mismo ensayo
y entre distintas realizaciones de la prueba) resultan necesarias para garantizar el posterior desarrollo del
ensayo a validar. Esto se lleva a cabo evaluando los resultados de rplicas de todas las muestras en cada placa
(variacin intraplaca), y analizando la variacin interplaca usando las mismas muestras en placas diferentes
dentro de un mismo ensayo o entre diferentes realizaciones del mismo. En las tcnicas ELISA, en esta fase de
validacin se usan normalmente los valores basales de absorbancia porque es dudoso que los resultados del
suero de control altamente positivo, que podran usarse para calcular valores normalizados, sean reproducibles
en las realizaciones iniciales del ensayo. Adems an no se han determinado los correspondientes valores de
los controles. Para obtener estimaciones preliminares de reproducibilidad suele ser suficiente realizar tres o
cuatro rplicas de cada muestra y llevar a cabo el ensayo en al menos cinco placas en cinco ocasiones
diferentes. En esta fase del desarrollo del ensayo, coeficientes de variacin (desviacin estandar de las
rplicas/media de las mismas) inferiores al 20% en los valores de absorbancia indican una reproducibilidad
adecuada. Sin embargo, si se pone de manifiesto una excesiva variacin (mayor del 30%) en la mayor parte de
las muestras en una misma o diferentes realizaciones de la prueba, deberan hacerse ms estudios preliminares
para determinar si es posible estabilizar el ensayo o si se debera abandonar el tipo de test. Esto resulta
particularmente importante ya que un ensayo intrnsecamente variable tiene una alta probabilidad de no resistir
las exigencias de las pruebas diarias con muestras procedentes de la poblacin animal a estudiar.
3.
Determinacin de la sensibilidad y la especificidad analtica
La sensibilidad analtica de un ensayo es la cantidad ms pequea de la sustancia en cuestin que puede

detectar, y la especificidad analtica es el grado en que el ensayo no muestra reaccin cruzada con otras
sustancias. Estos parmetros son diferentes de la sensibilidad y especificidad diagnstica que se definen mas
adelante. La sensibilidad analtica puede ser determinada mediante diluciones a punto final, lo que revela la
dilucin del suero en la que el anticuerpo ya no puede detectarse. La especificidad analtica se determina
usando un conjunto de sueros procedentes de animales que han experimentado infecciones relacionadas y que
pueden estimular la formacin de anticuerpos con reaccin cruzada. Por ejemplo, si el ensayo no detecta
anticuerpo a diluciones lmite de suero con la misma eficacia que otros ensayos, o si se producen reacciones
cruzadas con sueros procedentes de animales con otras infecciones relacionadas, se necesitar recalibrar o
sustituir los reactivos o, alternativamente, debera abandonarse el ensayo. No obstante, una prueba con baja
especificidad puede ser vlida para uso como prueba tamiz en situaciones donde se requiere analizar un gran
nmero de muestras, con tal de que su sensibilidad sea alta, y donde exista una prueba confirmativa que tenga
elevada especificidad.
3 FASE. DETERMINACIN DE LAS CARACTERSTICAS OPERATIVAS DEL ENSAYO

Si los estudios iniciales de desarrollo y estandarizacin indican que el ensayo es factible y potencialmente
aplicable a las condiciones de campo, el paso siguiente es establecer las caractersticas operativas del ensayo.
26
1.
Sensibilidad y especificidad diagnstica
a)
Principios y definiciones
Los valores de sensibilidad y especificidad diagnstica constituyen los parmetros ms importantes que se
establecen durante la validacin de un ensayo. Constituyen la base para el clculo de otros parmetros a
partir de los cuales se realizan deducciones sobre los resultados. Por consiguiente, es muy importante que
las estimaciones sobre la sensibilidad y la especificidad diagnstica sean tan exactas como sea posible.
En teora, estos valores derivan del ensayo de una serie de muestras procedentes de animales de
referencia cuya historia es conocida, as como su estado de infeccin/enfermedad, y que son adems
animales representativos de la regin o pas donde se pretende usar la prueba. La sensibilidad diagnstica
es la proporcin de los animales de referencia infectados que dan respuesta positiva en el ensayo; los
animales infectados que dan respuesta negativa se consideran como resultados falsos negativos. La
especificidad diagnstica es la proporcin de animales de referencia no infectados que dan respuesta
negativa a la prueba; aquellos animales no infectados que dan resultados positivos se consideran como
falsos positivos.
Para establecer la sensibilidad y la especificidad diagnstica, tanto el nmero como el origen de los
animales de referencia son aspectos clave cuando se intenta una validacin adecuada del ensayo para su
uso con la poblacin de animales a la que va dirigida. Resulta posible calcular el nmero de muestras de
referencia derivadas de animales cuyo estado es conocido en cuanto a infeccin, que es necesario para
determinar la sensibilidad y la especificidad diagnstica dentro de ciertos lmites estadsticos definidos. Las
frmulas y cuadros para determinar el nmero de muestras requeridas se presentan en otra parte (5,8). Sin
embargo, el nmero de muestras de referencia obtenidas de estas frmulas y cuadros puede resultar
inadecuado para un ensayo bien validado debido al gran nmero de variables que deben tenerse en
cuenta a nivel poblacional al establecer los sueros de referencia. Tales limitaciones y una exposicin de los
criterios de seleccin para sueros estndar se desarrollan con detalle en otra parte (4, 6). Debido a las
muchas variables a tener en cuenta, es conveniente incluir al menos 300 muestras de referencia de
animales infectados y unas 1000 de animales no infectados para obtener estimaciones iniciales sobre la
sensibilidad y la especificidad, respectivamente. La obtencin de un nmero tan grande de muestras de
animales de referencia puede ser difcil o incluso imposible. A veces, iniciar el proceso con menos
animales, y continuar luego la estimacin de la sensibilidad y la especificidad a medida que es posible
disponer de mas animales de referencia, es el nico modo, en la prctica, de obtener las estimaciones
iniciales (ver ms adelante, Fase 5).
b)
Estndares de comparacin para el nuevo ensayo

En serologa, el estndar de comparacin es el resultado de un mtodo o combinacin de mtodos con el
que se compara el nuevo ensayo. Aunque se usa normalmente el trmino estndar de oro para describir
cualquier standard de comparacin, debera limitarse el trmino a mtodos que clasifiquen los animales
como infectados o no infectados de modo inequvoco. Algunos mtodos de aislamiento tienen problemas
propios de reproducibilidad y sensibilidad. Los mtodos con estndar de oro incluyen el aislamiento del
agente causal o criterios histopatolgicos patognomnicos. Como establecer un estndar de oro es
imposible, a menudo son necesarios estndares relativos de comparacin; stos se basan en resultados
de otros ensayos serolgicos y en animales vacunados o infectados experimentalmente. Los clculos de
sensibilidad y especificidad diagnstica son ms fiables cuando descansan en un estndar de oro para
comparacin. Cuando solo se dispone de estndares relativos de comparacin, las estimaciones de estos
parmetros en el nuevo ensayo pueden verse afectadas debido al error previo de estos valores en el
estndar relativo, que se acumula en el nuevo ensayo. Si no se dispone de un estndar para la
comparacin, se pueden establecer la sensibilidad y la especificidad diagnstica (3, 7).
c)
Precisin, repeticin, reproducibilidad, y exactitud

En un ensayo, la repeticin y reproducibilidad son indicaciones de precisin. La precisin es una medida
de la dispersin de los resultados en una muestra repetidamente ensayada; un ensayo preciso muestra
solo una pequea dispersin. La repeticin en un ensayo diagnstico consta de dos elementos: el nivel de
concordancia entre las rplicas de cada muestra (normalmente dos o tres) dentro del desarrollo de un
ensayo, y el nivel de concordancia para los valores normalizados de cada muestra control entre diferentes
series de ensayos. La reproducibilidad es el grado de coincidencia de resultados para las mismas
muestras ensayadas en laboratorios diferentes. La exactitud es el nivel de concordancia entre el valor del
ensayo y el valor esperado para la sustancia en cuestin en una muestra estndar de actividad conocida
(ttulo o concentracin). Un sistema de ensayo puede ser preciso, pero no exacto, si los resultados de la
prueba no concuerdan con los valores esperados para un estndar.
27
Se pueden obtener estimaciones fiables de repetitividad y exactitud, tanto dentro de una misma ejecucin
del ensayo como entre distintas realizaciones del mismo, mediante el uso de los resultados normalizados
obtenidos de las muchas pruebas del nuevo ensayo que se requiri hacer para evaluar los sueros de los
animales de referencia (se obtienen resultados menos fiables a partir de datos preliminares sobre valores
directos de absorbancia). Al menos 10 ejecuciones del ensayo, y con preferencia 20, permitirn una
estimacin inicial razonable de estos parmetros. Los mtodos para evaluar estos parmetros se han
descrito con detalle (8).
La exactitud se puede determinar incluyendo uno o ms estndares (muestras de ttulo o concentracin
conocida, etc.) en cada ejecucin del ensayo. Los estndares pueden ser sueros control siempre que la
cantidad de la sustancia a analizar (es decir, su titulo o concentracin) se haya determinado previamente
en cada uno de ellos mediante comparacin con estndares primarios o secundarios de referencia (13) y
que los sueros control no se usen en el proceso de normalizacin de datos.
La reproducibilidad de los ensayos se determina en laboratorios distintos utilizando un ensayo idntico (en
cuanto a protocolo, reactivos y controles) sobre un grupo de al menos 10 muestras, preferiblemente por
duplicado hasta un total de 20 muestras. Es preciso que estas muestras representen el intervalo completo
de las concentraciones esperadas de la sustancia analizada en las muestras de la poblacin. El grado en
que se desvan los resultados colectivos de cada muestra respecto a los valores esperados es una medida
de la reproducibilidad del ensayo. El grado de concordancia entre los datos de los laboratorios constituye
una base adicional sobre la que establecer si las caractersticas de realizacin del ensayo son las
adecuadas para que un ensayo pueda considerarse validado.
2.
Seleccin del nivel de corte (umbral de positividad y negatividad)
Para llevar a cabo valoraciones de sensibilidad y especificidad diagnstica, los resultados de las pruebas tienen
primero que reducirse a la categora de positivo o negativo. Esto implica considerar un punto de corte (umbral o
lmite de decisin) en la escala continua de resultados de la prueba. Aunque se han descrito muchos mtodos a
este respecto, los tres ejemplos que siguen a continuacin ilustrarn los diferentes enfoques, junto a sus
ventajas y limitaciones. El primer mtodo establece un corte basado en la distribucin de frecuencias de los
resultados con animales de referencia infectados y no infectados (8). Este corte se puede establecer por
inspeccin visual de la distribucin de frecuencias, por anlisis de las caractersticas de tipo receptor-operador
(6, 14), o por una seleccin que favorezca la sensibilidad o la especificidad, dependiendo del uso que se
pretenda con el ensayo determinado (11). Un segundo enfoque consiste en establecer el corte basados solo en
animales de referencia no infectados; esto permite una estimacin de la especificidad diagnstica pero no de la
sensibilidad diagnstica. El tercer mtodo proporciona un corte intrnseco basado en resultados de sueros
tomados al azar dentro de la poblacin estudiada sin conocerse de antemano el estado de infeccin de los
animales (4). Aunque por este mtodo no se obtienen estimaciones de la sensibilidad y especificidad, stas se
pueden determinar a partir de datos confirmativos acumulados.
Si existe una superposicin considerable en las distribuciones de los valores de las pruebas con animales
infectados y no infectados, resulta difcil seleccionar un punto de corte que permita clasificar adecuadamente
estos animales con relacin a su estado infectivo. Entonces, en lugar de un nico corte, se pueden seleccionar
dos cortes que definan una sensibilidad diagnstica elevada (por ejemplo, con inclusin del 99% de los valores
de animales infectados) y una especificidad elevada (con 99% de los valores de los animales no infectados).
Los valores que se encuentren entre estos percentiles deberan clasificarse como sospechosos o equvocos y
podran requerir otra prueba de ensayo confirmativo o para detectar la existencia de seroconversin.
3.
Clculo de la sensibilidad y la especificidad diagnstica
La seleccin de cortes o umbrales permite clasificar los resultados de una prueba como positivos o negativos.
La determinacin de la sensibilidad y la especificidad se facilita asociando los datos positivos y negativos con el
estado conocido de la infeccin de cada animal mediante un cuadro de dos por dos (Cuadro 1). Una vez
establecido el corte, los resultados de las pruebas de los sueros estndares se pueden clasificar como
verdaderos positivos (VP) o verdaderos negativos (VN) si estn de acuerdo con los estndares de oro (u otros
estndares de comparacin). Alternativamente, se pueden clasificar como falsos positivos (FP) o falsos
negativos (FN) si no concuerdan con el estndar. La sensibilidad diagnstica se calcula como VP/(VP+FN),
mientras que la especificidad diagnstica se expresa como VN/(VN+FP); los resultados de ambas
determinaciones se suelen indicar como porcentajes (Cuadro 1).
28
Cuadro 1. Clculo de la sensibilidad diagnstica y de la especificidad diagnstica con ayuda de cuadro de 2 x 2

que asocia el estado de infeccin con resultados de la prueba en 2000 animales de referencia.
Animales de referencia con estado infectivo conocido

Infectados (n = 600)
Positiva
No infectados (n = 1400)
570
46
Resultado
TP
FP
de la prueba
FN
TN
Negativa
30
1354
Sensibilidad diagnstica
TP
TP + FN
4.
570
= 95.0%
600
Especificidad diagnstica
TN
TN + FP
1354
= 96.7%
1400
Armonizacin de los ensayos
Cuando para la determinacin de un componente existe ya un mtodo estndar internacional (12), es posible
comparar dicho mtodo con el que se est desarrollando. Este proceso requiere el uso de los mismos controles
de suero y de estndares en ambos ensayos. Si se dispone de sueros internacionalmente estandarizados se
deberan incluir al menos tres de ellos (uno negativo, otro con baja positividad, y otro con alta positividad) en el
estudio comparativo de los ensayos. Esto podra conducir a un nuevo ensayo considerado como un mtodo
estndar internacional y a sueros de estndar internacional (12). La armonizacin de los dos ensayos sera
entonces posible.
4 FASE. COMPROBACIN DE LA VALIDEZ DE LA REALIZACIN DEL ENSAYO

1.
Interpretacin de los resultados factores que influyen en la validez del ensayo
Los resultados de una prueba slo son tiles si las deducciones que permiten alcanzar son correctas. Un error
muy comn consiste en suponer que un ensayo con un 99% de sensibilidad y un 99% de especificidad originar
aproximadamente un solo falso positivo y un falso negativo en los resultados de cada 100 ensayos con animales
de una determinada poblacin. Tal ensayo puede ser preciso y exacto pero puede, sin embargo, producir
resultados que no permitan predecir adecuadamente el estado de infeccin. Por ejemplo, si la prevalencia de
una enfermedad en una poblacin analizada por el ensayo es solo de 1 entre 1.000 animales, y la tasa de falsos
positivos en la prueba es de 1 por cada 100 animales (especificidad diagnstica 99%), entonces en cada 1.000
pruebas sobre esa poblacin habr 10 falsos positivos y solo uno ser verdadero positivo. Por tanto, tan solo
aproximadamente el 9% de los resultados positivos de la prueba permitir predecir de manera exacta el estado
del animal en cuanto a infeccin; los resultados de la prueba clasificarn errneamente al animal el 91% de las
veces. Esta situacin ejemplifica que la capacidad de los resultados de una prueba positiva o negativa para
definir el estado de infeccin depende de la prevalencia de la infeccin en la poblacin estudiada (9). Por
supuesto, la prevalencia probablemente se habr determinado a su vez mediante el uso de una prueba
serolgica con el error de clasificacin de resultados que la misma conlleva.
La determinacin de la prevalencia en la poblacin resulta necesaria para calcular los valores predictivos
positivos (VPr+) o negativos (VPr-) del ensayo. Cuando los valores de la prueba se indican sin disponer de datos
acerca de la especificidad o la sensibilidad, no es posible inferir predicciones sobre el estado infectivo a partir de
los resultados (6). Por consiguiente, es muy conveniente disponer de una especie de interpretacin adicional,
acompaando los resultados con un pequeo cuadro que indique VPr+ y VPr- en un intervalo de prevalencias
posibles en la poblacin. Sin dicha informacin, los resultados de los ensayos de la prueba pueden carecer de lo
requerido para clasificar con exactitud el estado de infeccin de los animales y, por tanto, no reflejarn un
ensayo completamente validado.
FASE 5. MANTENIMIENTO Y MEJORA DE LOS CRITERIOS DE VALIDACIN

Un ensayo validado necesita un constante seguimiento y un mantenimiento para conservar tal designacin. Una
vez que el ensayo se ha puesto ya en uso rutinario, hay que realizar un control interno de calidad comprobando
repetidamente el ensayo en cuanto a repetitividad y exactitud (1).
29
La reproducibilidad entre laboratorios debera comprobarse al menos dos veces por ao. Es deseable formar
parte de un consorcio de laboratorios interesados en evaluar los resultados. En un futuro prximo, una buena
prctica de laboratorio que incluya la aplicacin de un programa para asegurar la calidad total ser un requisito
esencial para aquellos que intenten un reconocimiento nacional o internacional (vase Captulo I.1.2).
El examen de aptitud es una forma de control externo de calidad para una determinada prueba. Normalmente,
esto se lleva a cabo por un laboratorio de referencia que distribuye lotes de muestras, recibe resultados de los
laboratorios, analiza los datos, y devuelve los informes a los laboratorios implicados. Si los resultados de un
determinado laboratorio estn dentro de lmites aceptables y muestran evidencias de exactitud y
reproducibilidad, el laboratorio puede disponer de un certificado emitido por agencias gubernamentales o
laboratorios de referencia que lo acreditan como laboratorio oficial para dicha prueba (10). Las muestras de
suero para el examen de aptitud deberan contener una representacin completa de la concentracin de la
sustancia a analizar en los animales de una poblacin bajo estudio. Si las muestras representaran solo sueros
altamente positivos o dbilmente positivos (con ninguna muestra prxima al nivel de corte del ensayo), el
ejercicio solo pondra en evidencia la reproducibilidad en los extremos de concentracin de la sustancia
analizada, pero no aclarara si los resultados de pruebas rutinarias en la poblacin clasifican de modo
conveniente el estado de infeccin de los animales.
Debido al extraordinario nmero de variables que inciden en la realizacin de las pruebas serodiagnsticas, es
conveniente ampliar el nmero de sueros estndar correspondientes a animales con reconocida infeccin
debido a que el error en las estimaciones de sensibilidad y especificidad se reduce cuando aumenta el tamao
de las muestras. Adems, cuando se pretende transferir el ensayo a una regin geogrfica completamente
distinta, es esencial efectuar una nueva validacin del ensayo para el nuevo uso, ajustndolo a sueros de
poblaciones de animales que residan en las condiciones locales. Lo mismo cabe decir a la hora de establecer
la sensibilidad y especificidad diagnsticas para subpoblaciones (ej., grupos de edad, vacunado/no vacunado,
etc.).
Cuando una muestra de suero control est a punto de agotarse, resulta necesario preparar y probar
repetidamente otro suero de repuesto antes de que se acabe. La nueva muestra de control se incluye en 10-20
realizaciones del ensayo antes del agotamiento del control original para establecer su relacin proporcional con
el que se est acabando. Si la muestra en vas de desaparicin era un control positivo en tcnicas ELISA, donde
el valor normalizado se expresa como porcentaje del control positivo, la diferencia proporcional de actividad en
el ensayo ELISA entre el suero original y el de recambio debe ser convertido en un factor de normalizacin para
mantener el mismo nivel de corte, y por tanto la misma sensibilidad y especificidad diagnstica en el ensayo.
Cuando hay que reemplazar otros reactivos, como el antgeno para captura de los anticuerpos, esto debera
llevarse a cabo siguiendo los mismos criterios que con los reactivos originales y deberan probarse en al menos
cinco desarrollos del ensayo utilizando una serie de muestras de suero diseadas para tal propsito. Siempre
que sea posible, es importante cambiar cada vez solamente un reactivo para evitar el problema de tener que
evaluar simultneamente mas de una variable.
REFERENCIAS
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Chemistry, Bishop M.L., Duben-Engelkirk J.L. & Fody E.P., eds. Lippincott, Philadelphia, USA, 63101.
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the sero-epidemiological study of Trypanosoma evansi infections in a canine population in Brazil: a new
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characteristic (ROC) analysis for diagnostic tests. Vet. Prev. Med., 45, 2341.
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30
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9.
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10. OFFICE INTERNATIONAL DES EPIZOOTIES (2002). OIE Guide 3: Laboratory Proficiency Testing. In: OIE Quality
Standard and Guidelines for Veterinary Laboratories: Infectious Diseases. OIE, Paris, France, 5363.
11. SMITH R.D. (1991). Clinical Veterinary Epidemiology. Butterworth-Heinemann, Stoneham, MA, USA, 1223.
12. W RIGHT P.F. (1998). International standards for test methods and reference sera for diagnostic tests for
antibody detection. Rev. sci. tech. Off. int. Epiz., 17, 527533.
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of enzyme-linked immunosorbent assay techniques for the detection of antibody in infectious disease
diagnosis. Rev. sci. tech. Off. int. Epiz., 12, 435450.
14. ZWEIG M.H. & CAMPBELL G. (1993). Receiver-operating characteristic (ROC) plots: a fundamental evaluation
tool in clinical medicine. Clin. Chem., 39, 561577.
*
* *
31
CAPTULO I.1.4.
VALIDACIN Y CONTROL DE CALIDAD

DE LOS MTODOS DE LA
REACCIN EN CADENA DE LA POLIMERASA
UTILIZADOS PARA EL DIAGNSTICO
DE ENFERMEDADES INFECCIOSAS
INTRODUCCIN
El diagnstico de enfermedades infecciosas se realiza mediante la deteccin directa e indirecta de
los agentes infecciosos. Mediante los mtodos directos se detectan las partculas de los agentes
infecciosos y/o sus componentes, tales como los cidos nucleicos, protenas estructurales y no
estructurales, enzimas, etc. Los mtodos indirectos ponen de manifiesto los anticuerpos inducidos
por las infecciones.
Los mtodos ms comunes de deteccin directa son: el aislamiento o el cultivo in vitro, la
microscopa electrnica, la inmunofluorescencia, la inmunohistoqumica, el enzimoinmunoensayo
(ELISA), la hibridacin de cidos nucleicos (NAH) y la amplificacin de cidos nucleicos, tal como
la reaccin en cadena de la polimerasa (PCR). Tambin se denominan mtodos de diagnstico
molecular, puesto que los ensayos de NAH y PCR tienen como objetivo las molculas de cidos
nucleicos.
Los mtodos indirectos ms comunes de deteccin del agente infeccioso son las pruebas
serolgicas tales como: la neutralizacin vrica, la deteccin de anticuerpos mediante ELISA y las
pruebas de inhibicin de la hemoaglutinacin. En general, los laboratorios de diagnstico aplican
simultneamente los dos mtodos para garantizar un diagnstico seguro.
Hasta la fecha, los principios de validacin de la OIE se han desarrollado para los mtodos de
deteccin indirecta, esto es, para la prueba ELISA de anticuerpos. El objetivo de este captulo es
ampliar las normas a un mtodo directo de deteccin de un agente infeccioso, es decir, adaptar los
principios de validacin a los ensayos de PCR.
Las experiencias de la ltima dcada indican que las tcnicas de PCR finalmente sustituirn a
muchos de los mtodos directos clsicos de deteccin de agentes infecciosos. Est claro que la
PCR est reemplazando el aislamiento de virus o cultivo de bacterias para la deteccin de agentes
que son difciles o imposibles de cultivar. Hay varias razones para esta tendencia, teniendo en
cuenta que el aislamiento de los virus requiere: i) la presencia de los virus que se replican; ii) los
cultivos celulares caros y el mantenimiento de las instalaciones; iii) hasta varias semanas para
completar el diagnstico; y iv) una pericia especial, que se est perdiendo o disminuyendo hoy en
muchos laboratorios. Aunque los ensayos de PCR inicialmente eran caros y engorrosos, hoy en
da, son herramientas relativamente baratas, seguras y fciles de utilizar en los laboratorios de
diagnstico (2, 7). Generalmente, la sensibilidad y especificidad de la PCR es mayor que los
procedimientos ELISA de aislamiento y captura.
32
Captulo I.1.4. Validacin y control de calidad de los mtodos de la reaccin en cadena

de la polimerasa utilizados en el diagnstico de enfermedades infecciosas
A. MTODOS DE PCR UTILIZADOS EN DIAGNSTICOS

MOLECULARES RUTINARIOS
1.
Principios de la tcnica de PCR
La reaccin en cadena de la polimerasa (PCR) implica que en el ensayo hay una reaccin de amplificacin
basada en enzimas. El trmino reaccin en cadena se refiere a varios ciclos de copiado de un tramo especfico
de ADN o de cidos nucleicos diana (nucletidos), en este caso a partir del genoma del agente infeccioso. La
regin que hay que amplificar est definida por dos (o ms) secuencias de nucletidos cortos denominados sitios
de los cebadores, que flanquean a la secuencia diana. Los cebadores, oligonucletidos cortos que son
complementarios a los sitios de los cebadores, se unen a las hebras de ADN para ser copiadas. Utilizando una
polimerasa que no se desnaturalice durante el ciclo de calentamiento, es posible copiar la secuencia diana
uniendo los nucletidos libres a los cebadores. Repitiendo el rgimen de ciclos de calentamiento de 20 a 40
veces, la cantidad de ADN diana copiado que se obtiene es suficiente para operaciones posteriores, tales como
deteccin, clonacin y secuenciacin. La sensibilidad de diagnstico de la PCR es muy alta, porque se producen
varios millones de copias de la diana seleccionada. La especificidad de la reaccin puede ser tambin muy alta,
ya que est determinada por las secuencias especficas de nucletidos de la diana seleccionada, as como por el
diseo del cebador. Los cebadores pueden disearse para detectar secuencias especficas de nucletidos en los
genomas de los agentes infecciosos diana seleccionados o pueden disearse para ser complementarios de las
secuencias muy comunes que se dan en la naturaleza. Estos cebadores no especficos, llamados cebadores
universales, son capaces de aglutinar una gama ms amplia de ADN y pueden utilizarse para detectar miembros
dentro de una familia o gnero del agente infeccioso.
a)
Amplificacin del ADN

Si el genoma del agente infeccioso es de ADN, la amplificacin se realiza directamente, con o sin
purificacin previa del ADN diana. En muchos casos el empleo de ADN extrado y purificado del material
que se va a utilizar en la prueba, dar como resultado un aumento en la sensibilidad analtica y diagnstica.
b)
Amplificacin del ARN (PCR de trascripcin inversa)

Los genomas de muchos agentes infecciosos contienen cido ribonucleico (RNA) que no se puede
amplificar directamente mediante la PCR. Para la amplificacin por PCR se necesita un ADN diana
monocatenario, y ste no est disponible en los virus de ARN. El problema puede resolverse por la adicin
de una etapa antes de comenzar la PCR. Utilizando la trascriptasa inversa, el ARN se puede transcribir a
ADN complementario (ADNc), que es ADN de doble cadena y, por tanto, se puede usar en el ensayo de
PCR (el procedimiento se denomina PCR de trascripcin inversa: RT-PCR). Tradicionalmente, la reaccin
de trascripcin inversa se realiza en un tubo aparte y el ADNc producido se transfiere despus a un tubo
nuevo para la reaccin de la PCR. Sin embargo, ya se dispone de polimerasas de ADN termoestables con
actividad trascriptasa inversa y tampones especficos en los cuales las polimerasas RT y ADN estn
activas. Ambas permiten una reaccin RT-PCR que tiene lugar en el mismo tubo en secuencia directa sin
manipulacin adicional y con menos probabilidad de seguir contaminando. En la mayora de los casos ser
necesario extraer y purificar el ARN antes de la trascripcin inversa. Sin embargo, en algunos casos, es
suficiente con hervir la muestra antes de la RT-PCR (p. ej. muestras de materias fecales en PBS).
c)
Deteccin del amplmero por PCR

El producto PCR o amplmero puede detectarse utilizando varios procedimientos. El ms comn incluye la
deteccin no especfica del producto de la PCR, basada en una medida amplmera utilizando electroforesis
en gel de agarosa y tiendo el ADN con un tinte no especfico, como el bromuro de etilo, o el
reconocimiento especfico de la secuencia diana amplificada utilizando una transferencia de ADN por
Southern blot seguido de hibridacin con sondas de oligonucletidos complementarias de la secuencia
diana. Las sondas de hibridacin pueden ser, enzima, marcado como quimiluminiscente o radionucletido
para permitir la deteccin de la secuencia diana especfica.
Ms abajo se dan algunos ejemplos de mtodos de PCR utilizados actualmente.
2.
PCR convencional
En la PCR convencional (o simplemente PCR) se utiliza un par de cebadores oligonucletidos para amplificar
una parte pequea del genoma del agente infeccioso. La sensibilidad analtica es relativamente alta con un
nmero mnimo de 100 a 1000 copias de ADN diana detectable. La especificidad analtica tambin es bastante
alta. La sensibilidad y especificidad analticas se pueden mejorar mediante la aplicacin de la PCR anidada
(vase ms adelante el punto 3). La especificidad se puede mejorar posteriormente utilizando el mtodo
33

Southern blot de transferencia a papel y comprobando los productos de la PCR con una sonda marcada, pero
esto lleva mucho tiempo y no es una prctica comn hoy da en los laboratorios de diagnstico.
3.
PCR anidada
En los ensayos de la PCR anidada se utilizan dos ciclos de amplificacin con cuatro cebadores, denominados
cebadores externos e internos. En general, los ensayos de la PCR anidada proporcionan una sensibilidad y
especificidad analticas superiores si se comparan con las pruebas de PCR convencionales. La sensibilidad
analtica es tpicamente <10 copias de genoma del agente infeccioso, y la especificidad analtica tambin
aumenta porque, en la PCR anidada, cuatro oligonucletidos tienen que unirse especficamente a las dianas
seleccionadas para producir una reaccin positiva (2).
4.
PCR en tiempo real
La PCR en tiempo real es una amplificacin en la que los productos de la PCR son detectados directamente
durante los ciclos de amplificacin utilizando sondas marcadas con fluorescencia. Diversos mtodos en tiempo
real, tales como los ensayos que se realizan con las sondas fluorescentes TaqMan o Molecular Beacon, se han
convertido en herramientas muy populares para la deteccin de agentes infecciosos. La PCR en tiempo real se
ha utilizado para la deteccin de bacterias, virus o parsitos de una amplia variedad de especies animales (2, 6,
8). Estos nuevos ensayos tienen varias ventajas comparados con los mtodos clsicos de la PCR convencional
o anidada. Slo se utiliza un par de cebadores, presentando, a menudo, una sensibilidad prxima o igual a la
PCR anidada tradicional, pero con un riesgo mucho ms bajo de contaminacin. La fluorescencia, que indica la
presencia del producto amplificado, se mide a travs de la tapa o del lado del tubo de reaccin, de forma que no
es necesario el manejo posterior de los productos de la PCR. Estos procedimientos llevan considerablemente
menos tiempo si se compara con la deteccin tradicional de los productos de la PCR en geles de agarosa,
seguidos de la tincin con bromuro de etidio, con lo que, de nuevo, se reduce el riesgo de contaminacin. El
empleo de la modalidad de placa de microtitulacin de 96 pocillos, sin la necesidad de la PCR anidada, permite
que el procedimiento sea automtico y apropiado para pruebas a gran escala (5). El diagnstico se puede
automatizar posteriormente utilizando robots para las extracciones de ADN/ARN y el pipeteo. En comparacin
con los mtodos clsicos, una ventaja adicional de la tcnica de la PCR en tiempo real es que es posible realizar
ensayos cuantitativos (6).
5.
PCR mltiple
Se denominan pruebas de PCR mltiple a las reacciones de PCR que utilizan cebadores mltiples dirigidos a
diferentes dianas en un nico ensayo. En la PCR mltiple se pueden detectar y diferenciar de forma simultnea
varios agentes infecciosos en un nico tubo de reaccin individual. Los diferentes PCR diana amplificados en
una prueba estndar de PCR se identifican basndose en el tamao del producto de la PCR. El empleo de los
mtodos de la PCR anidada clsica para la construccin de un ensayo mltiple resulta complicado debido a la
necesidad de dianas de diferentes tamaos, as como de cebadores que puedan competir entre s en la misma
mezcla reactiva, todo lo cual puede repercutir negativamente en la eficacia de la PCR. Por el contrario, el
concepto de la PCR en tiempo real (pares de cebadores nicos) proporciona excelentes posibilidades para la
construccin de sistemas mltiples muy sensibles (2, 4) basados en un tamao ms uniforme de la diana, en
unas condiciones de amplificacin uniformes y en la deteccin por separado de las dianas utilizando sondas de
hibridacin especficas marcadas con fluorforos diferentes.
B. VALIDACIN DE LOS ENSAYOS DE DIAGNSTICO MOLECULAR

Cuando se realizan anlisis diagnsticos de material clnico es importante producir datos de buena calidad. Para
esto, hay que cumplir algunos criterios clave. Es necesario establecer los sistemas de garanta de calidad (GC) y
de control de calidad (CC), esto es, un juego de protocolos de calidad, incluyendo el empleo de muestras control,
que aseguren que el sistema est funcionando adecuadamente y confirme la calidad de los datos. En muchos
laboratorios de todo el mundo ya se han establecido los sistemas GC y CC y hay personal entrenado y
competente. La validacin de ensayos es otro factor fundamental para garantizar que los resultados de las
pruebas reflejan el estado real de las muestras (3).
Para predecir la eficacia de un ensayo diagnstico, es necesario utilizar una metodologa de validacin con el fin
de documentar los resultados analticos que se esperan del ensayo en cuestin. La validacin es la evaluacin
de un ensayo diagnstico con el fin de determinar su idoneidad para una utilizacin concreta. Los principios
generales de validacin de ensayos se pueden encontrar en el Captulo I.1.3. Principios de validacin para las
pruebas de diagnstico de enfermedades infecciosas. El presente captulo extiende estos principios de validacin
a los ensayos de diagnstico molecular. Consltese el Captulo I.1.3. para la explicacin de los trminos y las
definiciones.
34

C. MEDIDAS DE LA VALIDEZ
Las caractersticas operativas (o parmetros del ensayo) proporcionan informacin sobre la eficacia de un
mtodo bajo condiciones especficas. En el Captulo I.1.3. se presentan algunas caractersticas operativas, y en
este captulo se ofrecen algunas otras que son importantes para los mtodos de la PCR.
D. ETAPAS DE LA VALIDACIN DE ENSAYOS

En el Captulo I.1.3. se describen con detalle las cinco etapas de la validacin de ensayos. En el presente
captulo, se exponen brevemente estas etapas, con especial nfasis en los ensayos de diagnstico molecular.
1 ETAPA. ESTUDIOS DE VIABILIDAD

El estudio de viabilidad constituye la etapa preliminar en la validacin de un nuevo ensayo. El objetivo es
determinar si en un ensayo se puede detectar o no un rango de concentraciones testigo sin actividad de fondo.
Se eligen, al menos, diez muestras (por ejemplo, agentes infecciosos producidos en el laboratorio en cultivo
celular o bacteriano), que comprendan desde niveles bajos hasta niveles altos del agente infeccioso. Tambin
hay que incluir, al menos, diez muestras que no contengan el testigo. Normalmente, es difcil separar esta etapa
de la segunda, ya que es necesaria una optimizacin preliminar antes de que se puedan realizar estudios
posteriores. Los ensayos que parecen prometedores se someten a un desarrollo posterior en la 2 etapa.
Obsrvese que, a veces, se puede mejorar considerablemente un ensayo mediante esquemas de optimizacin
adecuados, y de esta forma la exclusin de ensayos no ptimos se har con cautela.
La seleccin de la diana y el diseo del cebador son crticas, y debera tenerse en cuenta la naturaleza del
agente infeccioso, su estructura genmica y la diversidad de secuencias genticas que existen entre diferentes
cepas o aislados, y la utilizacin que se pretende dar a la prueba (por ejemplo prueba de control, tipificacin de
cepas, etc.).
El resultado obtenido por la PCR puede verse influido por el funcionamiento del equipo del laboratorio y en
particular por el termociclador, que, por tanto, se debera supervisar de forma continua como parte del programa
QA. Es crucial la calibracin de la temperatura correcta y, para los instrumentos de la PCR en tiempo real, deben
calibrarse de forma regular los sistemas pticos, de acuerdo con los protocolos QA de laboratorio. Los ensayos
desarrollados y validados mediante la utilizacin de equipo clave, como la extraccin robtica o un termociclador
fabricado por un fabricante especfico, deben ser revalidados o tener datos de equivalencia generados antes de
su utilizacin en plataformas de equipamiento alternativas.
2 ETAPA. DESARROLLO Y ESTANDARIZACIN DEL ENSAYO

1.
Seleccin de las concentraciones ptimas de los reactivos, los parmetros de los

protocolos y el equipo
La toma, preparacin y transporte de muestras (vase Captulo I.1.1.) y los mtodos de extraccin de cidos
nucleicos (vase Captulo I.1.8.) son todos parmetros esenciales en la realizacin de un ensayo y deberan
optimizarse para el diagnstico de enfermedades. Incluso los mtodos adecuados varan dependiendo del tipo
de muestra y organismo. En general, el suero sanguneo, el tejido del cuerpo y las muestras de frotis son
muestras adecuadas para la extraccin fcil de cidos nucleicos objeto de estudio, mientras que las muestras de
heces y semen son ms difciles de manejar. La extraccin del ARN difiere de la del ADN, y el ARN es ms
proclive a la degradacin. Tanto los mtodos comerciales (robticos, columnas de giro, extracciones por
procedimientos magnticos, etc.) como los mtodos qumicos estndar se utilizan para la extraccin del ADN o
del ARN. Es fundamental establecer el mtodo ms reproducible y eficaz de extraccin antes de llevar a cabo
una validacin posterior del ensayo. Si se cambia el mtodo de extraccin, deben generarse unos datos de
equivalencia o se debe repetir el procedimiento completo de validacin.
Todo el equipo utilizado en el proceso debe mantenerse correctamente. Los aparatos que requieren calibracin
(bloques de calentamiento, refrigeradores, congeladores, termocicladores, pipetas, etc.) deben calibrarse segn
los protocolos de calidad del laboratorio.
Cuando se realicen los ensayos clsicos de PCR o en tiempo real, es necesario optimizar todos los parmetros,
los protocolos y los reactivos. Un ensayo estandarizado es un mtodo que produce constantemente el mismo
resultado para una muestra dada cuando se repite varias veces y cuando se lleva a cabo por diferentes analistas
en diferentes laboratorios.
35

2.
Repetitividad estimaciones preliminares
En esta etapa debe conseguirse una concordancia entre las rplicas en la realizacin del ensayo y entre las
distintas realizaciones del mismo. Esto proporciona informacin importante sobre el ensayo antes de que se lleve
a cabo una validacin posterior. Si se encuentra una excesiva variabilidad, habr que corregirla antes de
continuar con el proceso de validacin.
3.
Determinacin de los parmetros esenciales de control
Durante la optimizacin del ensayo de la PCR, tambin se puede estimar la capacidad del mtodo de no verse
afectado por pequeos cambios en los parmetros principales. Es preciso documentar las variaciones
intencionadas durante la realizacin del ensayo a fin de caracterizar los parmetros esenciales del mismo. Los
ejemplos de tales parmetros son: tiempos de incubacin y temperaturas, concentracin de tampones,
cebadores, MgCl2, etc., pH, cantidades de otros componentes aadidos (por ejemplo dNTP, suero bovino,
albmina, etc.). La caracterizacin de dichos parmetros de control es crucial para la identificacin de los puntos
esenciales que deben controlarse correctamente en el ensayo.
4.
Sensibilidad y especificidad analticas
La sensibilidad analtica (o lmite de deteccin) se define como la cantidad ms pequea de agente detectado por
el ensayo, y puede representarse como el nmero de copias del genoma, de dosis infecciosas, de unidades que
integran la colonia, de unidades que forman la placa, etc. del agente que puede detectarse y distinguirse a partir
de un resultado cero. Para determinar la sensibilidad analtica se utiliza una dilucin de punto final hasta que el
ensayo ya no pueda detectar el blanco en estudio en ms del 5% de las rplicas (2 desviaciones estndar). Los
fragmentos clonados de los productos de la PCR en estudio se pueden usar como muestras estndar, bien como
ADN o para dianas de ARN, siendo ste trascrito in vitro a ADN.
La especificidad analtica se define como la capacidad de un ensayo para distinguir el agente objeto de estudio
de otros agentes infecciosos. La capacidad se determina analizando los patgenos genticamente relacionados
entre s y el material clnico obtenido de los animales portadores de enfermedades que pueden imitar a (o
confundirse con) aquellas para las que se ha diseado la prueba.
5.
Rango
Las tcnicas analticas deben optimizarse en la fase lineal de la curva de respuesta. El rango de un ensayo se
define como el intervalo existente entre la concentracin mxima y mnima de un agente infeccioso en una
muestra en la que el agente puede detectarse de forma fiable.
3 ETAPA. DETERMINACIN DE LAS CARACTERSTICAS

OPERATIVAS DEL ENSAYO
1.
Sensibilidad y especificidad diagnsticas
La sensibilidad diagnstica (proporcin de animales de referencia que se sabe que estn infectados, que dan
respuesta positiva en el ensayo) y la especificidad (proporcin de animales de referencia que se sabe que no
estn infectados, que dan respuesta negativa en el ensayo) son los parmetros ms importantes obtenidos
durante la validacin de un ensayo. Constituyen la base para el clculo de otros parmetros y son, por lo tanto,
cruciales para el conjunto del proceso de validacin. Se puede calcular el nmero de muestras de referencia que
se requiere para determinar las estimaciones y el error admisible de la sensibilidad y de la especificidad
diagnsticas. Para hacer esto, debe utilizarse una prediccin razonable de la sensibilidad y de la especificidad
diagnsticas. Normalmente, la confianza de la estimacin se establece en el 95%. Sin embargo, ninguna frmula
puede tener en cuenta los numerosos factores del hospedador/organismo que pueden afectar al resultado de la
prueba. En el Captulo I.1.3. se explica, a grandes rasgos, el nmero de muestras requeridas para determinar las
estimaciones de la sensibilidad y de la especificidad diagnsticas. En la prctica esto es difcil de conseguir con
los mtodos moleculares especialmente en lo referente a muestras positivas en el caso de una enfermedad que
no es endmica o no est extendida. Generalmente, el ensayo se pone en prctica en la fase final, quizs en
paralelo con la Norma de oro de que se ensaye un nmero suficiente de animales. A medida que se avanza en la
utilizacin de la prueba, los datos adicionales recogidos ayudarn a reducir el error de las estimaciones. El
estado de los animales que se sabe que estn infectados y el de los que no lo estn, debera establecerse
mediante comparaciones con otros ensayos. No es adecuado el empleo de muestras adicionadas en la PCR, ya
que stas podran no ser representativas de muestras infectadas de forma natural, y de esta forma podra
ponerse potencialmente en riesgo todo el proceso de validacin.
36

2.
Repetitividad y reproducibilidad
La repetitividad y reproducibilidad son dos parmetros importantes de la precisin de un ensayo. La repetitividad

se mide como el grado de concordancia entre rplicas ensayadas en diferentes realizaciones. La reproducibilidad
se determina utilizando un ensayo idntico (protocolo, reactivos y controles) en diferentes laboratorios.
Hoy en da, tal como se indica en el Captulo I.1.3, es poco frecuente realizar en su totalidad la 3 etapa
recomendada por la OIE en los laboratorios de diagnstico veterinarios llevando a cabo ensayos de la PCR.
Tradicionalmente, muchos laboratorios han utilizado pruebas de elaboracin propia, probablemente por razones
prcticas. Los mtodos estandarizados y validados deben seguirse all donde se hayan publicado. Tienen que
llevarse a cabo los procesos de validacin entre laboratorios, incluso si son costosos y requieren una labor
intensa. Este trabajo propiciar la realizacin de los ensayos estandarizados, permitiendo la actividad diagnstica
armonizada en diferentes pases.
4 ETAPA. SEGUIMIENTO DE LA VALIDEZ DE LA OPERATIVIDAD DEL ENSAYO

La estimacin de la prevalencia de un virus en la poblacin es necesaria para calcular el valor predictivo de los
resultados positivos (VP+) o negativos (VP) de la prueba. Esto se aplica por igual a los mtodos de ensayos
moleculares y a otros mtodos tales como el enzimoinmunoensayo (ELISA).
Se insta a los Laboratorios de Referencia a determinar los valores de la sensibilidad y especificidad diagnsticas
de la forma ms precisa posible, ya que stas son muy importantes para valorar la eficacia real de un ensayo
cuando se usa en el campo. Tambin es importante estimar los valores predictivos (VP+ o VP) en las
circunstancias locales. Durante la validacin inicial y el empleo de un ensayo nuevo, se recomienda la
investigacin de los resultados negativos y positivos falsos. Por ejemplo, las reacciones positivas falsas basadas
en ensayos moleculares pueden ser evaluadas por anlisis de secuencia del ADN amplificado, para ayudar en la
correccin de errores debidos a la fijacin de dianas o cebadores no especficos, a la falta de rigor del ensayo,
etc.
5 ETAPA. MANTENIMIENTO Y MEJORA DE LOS CRITERIOS DE VALIDACIN

Cuando el ensayo se utiliza como una prueba rutinaria, es importante mantener el CC interno. El ensayo tiene
que ser supervisado continuamente con relacin a la repetitividad y exactitud. La OIE recomienda que la
reproducibilidad entre laboratorios (pruebas del anillo) se compruebe, al menos, dos veces al ao (9).
Si el ensayo se va a aplicar en otra regin geogrfica y/o poblacin, podra ser necesario hacer una revalidacin
o documentar la equivalencia bajo las nuevas condiciones. La revalidacin tambin puede ser necesaria si la
prueba se aplica a una matriz de muestra distinta, por ejemplo, validacin en sangre y utilizacin en otros tejidos
o validacin para tejidos de cabezas de ganado y utilizacin en otras especies. Esto es especialmente cierto para
los ensayos de la PCR ya que es muy comn que las mutaciones puntuales ocurran en muchos agentes
infecciosos (esto es, virus de ARN). Las mutaciones, que se pueden dar dentro de los emplazamientos del
cebador o la sonda pueden afectar a la eficacia de un ensayo y, de ser as, los criterios de actuacin
establecidos ya no son vlidos. Tambin es recomendable confirmar de forma regular la secuencia diana de las
regiones genmicas seleccionadas para los aislados nacionales o regionales de los agentes infecciosos. Esto es
especialmente cierto para los emplazamientos de los cebadores si se quiere garantizar que los mismos
permanezcan estables con el fin de que no se cuestione la validez de la prueba. Puede ser necesaria la
repeticin de la validacin y la solidez cuando la prueba se transfiere de un laboratorio de desarrollo al campo,
dado que las condiciones pueden ser menos ptimas y el personal estar menos preparado.
1.
Precauciones y controles
Teniendo en cuenta la incertidumbre en torno a la seguridad y fiabilidad de la PCR en el diagnstico rutinario, se

deberan tomar precauciones especiales en cualquier laboratorio que utilice la tcnica de PCR para la deteccin
de agentes infecciosos, con el fin de evitar resultados positivos o negativos falsos. Estos, junto con controles
internos (mimticos) garantizan la evaluacin segura de los resultados.
a)
Precauciones para evitar resultados positivos falsos

Los resultados positivos falsos (muestras negativas que presentan una reaccin positiva), pueden surgir de
bien de temas relacionados con el laboratorio, tales como contaminacin cruzada, o factores relacionados
con la prueba, por ejemplo una realizacin del ensayo o de la optimizacin ineficaces. Los restos de
productos de las muestras positivas o, ms comnmente, de la contaminacin cruzada por los productos de
37

la PCR provenientes de experimentos anteriores constituyen una posible fuente de error, y se han aplicado
varias tcnicas y herramientas para evitar los resultados falso positivos de la PCR. Las muestras y los
reactivos se deben manejar en campanas de aire de flujo laminar, que regularmente se descontaminan
regularmente utilizando luz UV y leja. La construccin y utilizacin de soportes de tubos y abridores
especiales ayuda a evitar resultados positivos falsos de la PCR. Adems, se deberan aplicar prcticas de
laboratorio seguras, esto es, realizar las etapas bsicas (extraccin del ADN, preparacin y mezcla del
cebador, preparacin de la muestra, electroforesis por gel agarosa de la ampliacin de productos, etc.). en
reas o habitaciones del laboratorio separadas (1,2). Se deben utilizar diferentes juegos de pipetas en cada
una de las etapas. Se recomienda el empleo de un desplazamiento positivo y de filtros. Tambin se
recomienda que diferentes personas lleven a cabo las distintas etapas, que estn restringidas a las
respectivas reas del laboratorio. Se deben tomar precauciones para evitar la introduccin de material
amplificado de laboratorios potencialmente contaminados dentro de las reas limpias del laboratorio
mediante las restricciones en los movimientos de las muestras, documentos, equipo, personas o cualquier
otra forma de contaminacin potencial. El movimiento en la direccin contraria debera ocurrir slo despus
de la descontaminacin, la ducha y el cambio de ropa. Adems, es preferible diluir las muestras con una
cantidad desconocida pero que se supone grande, de agente o cido nucleico diana antes de la
introduccin del material en las reas limpias del laboratorio.
Tambin es muy importante incluir controles negativos, por ejemplo, muestras que sean tan parecidas a las
muestras de prueba como sea posible, pero sin la diana. A los laboratorios que han tenido problemas con la
contaminacin cruzada, se les recomienda al menos un control negativo por cada cinco muestras de
diagnstico. Ambas muestras control positivas y negativas se deberan intercalar de forma rutinaria con
muestras de diagnstico a fin de evaluar la realizacin de la prueba de PCR.
b)
Controles de los procesos (mimticos) para evitar resultados negativos falsos

Los resultados negativos falsos (muestras que contienen el agente objetivo pero probadas como negativas)
se deben en su mayor parte a los efectos inhibidores y/o a los errores de pipeteo. Por tanto, los controles
internos se utilizan como indicadores de la eficacia de la prueba de PCR. Los controles internos de la PCR
pueden incluir ADN extrao aadido a la muestra o ADN que se da en la muestra de forma natural. El ADN
extrao aadido a la muestra puede incluir mimticos de ADN o de ARN. Los mimticos de ADN,
oligonucletidos manufacturados, tienen las mismas secuencias de unin a los cebadores que las de la
PCR diana, pero flanquean un fragmento de ADN heterlogo de un tamao diferente. Las secuencias de
nucletidos idnticas de unin al cebador permiten la amplificacin simultnea del molde y del mimtico en
el mismo tubo con una competicin mnima. Las diferencias de tamao proporcionan una discriminacin
fcil por medio del anlisis de Southern blot. El ARN blindado, un concepto idntico a los mimticos de
ADN, utiliza un fragmento de ARN control envuelto en protenas protectoras de bacterifago para proteger o
estabilizar el ARN para los ensayos de control o la estandarizacin de las pruebas RT-PCR.
En los ensayos de la PCR en tiempo real, tambin es posible emplear controles internos, un gen vigilante
que se da forma natural, un fragmento seleccionado del genoma del animal hospedador como el actina
beta, GAPDH o el ARN ribosmico. Mediante la inclusin de dicho control intrnseco, con un fluorforo
indicador especficamente coloreado, es posible comprobar la calidad de la muestra y confirmar la eficacia
de la PCR cuando se detectan simultneamente el agente en estudio y los ADN intrnsecos (8).
Los controles internos aumentan la fiabilidad del diagnstico de PCR (1,2) Se debe tener precaucin al
disear y validar los controles internos. Es necesario realizar muchas pruebas para garantizar que la
amplificacin por PCR del control interno aadido no compite con la PCR de diagnstico y por tanto
disminuye la sensibilidad analtica. Los controles internos se emplean en concentraciones ligeramente por
debajo del lmite de deteccin de la PCR de diagnstico para garantizar la realizacin de la prueba.
Tambin debera tenerse en cuenta que los controles internos tienen una desventaja similar a las pruebas
descartadas y no son representativos del cido nucleico diana y pueden proporcionar resultados negativos
falsos.
2.
Preparacin de estndares
Los laboratorios de referencia deben proporcionar muestras estndares representativas de un agente infeccioso
dado. Dichas muestras pueden ser agentes infecciosos cultivados, especimenes clnicos, etc., que se distribuyen
de manera que el agente infeccioso se conserve bien. De esta forma, las muestras se distribuyen congeladas en
disolventes orgnicos (por ejemplo, trizol) o de otras formas adecuadas. Las muestras tambin se pueden enviar
como cidos nucleicos (congelados, secados por congelacin o en etanol). Para los detalles especficos, vanse
los captulos individuales sobre enfermedades. Los laboratorios de referencia deberan proporcionar los
mimticos apropiados.
38

REFERENCIAS
1.
BALLAGI-PORDANY A. & BELAK S. (1996). The use of mimics as internal standards to avoid false negatives in
diagnostic PCR. Mol. Cell. Probes, 10, 159164.
2.
BELAK S. & THOREN P. (2001). Molecular diagnosis of animal diseases. Expert Rev. Mol. Diagn., 1, 434444.
3.
BURKHARDT H.J. (2000). Standardization and quality control of PCR analyses. Clin. Chem. Lab. Med., 38,
8791.
4.
ELNIFRO E.M., ASHSHI A.M., COOPER R.J., & KLAPPER P.E. (2000). Multiplex PCR: optimization and application
in diagnostic virology. Clin. Microbiol. Rev., 13, 559570.
5.
JUNGKIND D. (2001). Automation of laboratory testing for infectious diseases using the polymerase chain
reaction our past, our present, our future. J. Clin. Virol., 20, 16.
6.
HEID C.A., STEVENS J., LIVAK K.J. & W ILLIAMS P.M. (1996). Real-time quantitative PCR. Genome Res., 6, 986
994.
7.
LOUIE M., LOUIE L. & SIMOR A.E. (2000). The role of DNA amplification technology in the diagnosis of
infectious diseases. CMAJ., 163, 301309.
8.
MACKAY I.M., AARDE K.E. & NITSCHE A. (2002). Real-time PCR in virology. Nucleic Acids Res., 30, 1292
1305.
9.
OFFICE INTERNATIONAL DES EPIZOOTIES (2002). OIE Guide 3: Laboratory Proficiency Testing. In: OIE Quality
Standard and Guidelines for Veterinary Laboratories: Infectious Diseases. OIE, Paris, France, 5363.
*
* *
NB: Existen laboratorios de referencia de la OIE para la Validacin y control de calidad de los mtodos de la
reaccin en cadena de la polimerasa utilizados en la medicina veterinaria (ver Cuadro en la parte 3 de este
Manual de animales terrestres o consultar la pgina web de la OIE para una lista actualizada: www.oie.int)
39
CAPTULO I.1.5.
PRUEBAS PARA ESTERILIDAD Y

AUSENCIA DE CONTAMINACIN EN
MATERIALES BIOLGICOS
INTRODUCCIN
La esterilidad se define como la ausencia de organismos vivos. Se logra por calentamiento, por
filtracin, mediante tratamiento con xido de etileno o por radiaciones ionizantes, y realizando
aspticamente cualquier proceso posterior. La ausencia de contaminacin se define como la falta de
seres vivos concretos. Esto se puede obtener seleccionando los materiales a partir de fuentes que
carezcan de los organismos concretos y realizando aspticamente cualquier proceso posterior. Solo
con un control adecuado de los materiales primarios empleados y de los procesos que se siguen, as
como del almacenamiento, se puede conseguir una adecuada seguridad de esterilidad y de
ausencia de contaminacin. Se requiere la realizacin de pruebas sobre el producto para comprobar
que se ha logrado este control.
A. PROCEDIMIENTOS GENERALES
1.
Los materiales originales deben obtenerse de fuentes que estn libres de contaminacin y que sean
manejadas de tal modo que se reduzca la contaminacin y la posibilidad de que cualquier contaminante se
multiplique.
2.
Los materiales que puedan esterilizarse sin que sus propiedades biolgicas resulten excesivamente
afectadas deben esterilizarse mediante un mtodo efectivo para tales materiales concretos. El mtodo debe
reducir el nivel de contaminacin hasta que sta sea indetectable, segn determine una prueba de
esterilidad adecuada (Vase prrafo B.3 ms adelante).
3.
Si se emplea un procedimiento de esterilizacin, deber ser validado para demostrar su conveniencia y ser
controlado de modo adecuado para demostrar que ha funcionado correctamente en cada ocasin.
Los materiales que no se han esterilizado y aquellos sometidos a manipulacin tras la esterilizacin han de
ser manejados aspticamente.
El ambiente en que se realiza cualquier manipulacin asptica ha de mantenerse en un estado de limpieza

protegido de fuentes externas de contaminacin, y debe estar controlado para reducir al mnimo la
contaminacin interna.
B. VACUNAS CON VIRUS VIVOS PARA ADMINISTRACIN POR INYECCIN

1.
Los materiales de origen animal deben ser (a) esterilizados, o (b) obtenidos de animales sanos que, en la
medida de lo posible, deberan de estar libres de patgenos que puedan transmitirse de la especie de
origen a la especie que va a ser vacunada, o a cualquier otra especie en contacto con ellas, o (c) el material
debe estar exento de tales patgenos.
2.
Los virus del inculo inicial y los de cualquier lnea celular continua empleada para el crecimiento de los
virus deben estar libres de bacterias, hongos, micoplasmas, virus no relacionados y otros patgenos que
puedan transmitirse de la especie de origen a la especie que va a ser vacunada, o a cualquier otra especie
en contacto con ellas.
3.
Cada lote de vacuna debe superar una prueba de esterilidad similar a la de mtodos publicados (1-3, 5).
40
Captulo I.1.5. Pruebas para esterilidad y ausencia de contaminacin en materiales biolgicos
4.
Cada lote de vacuna debe superar pruebas adecuadas para demostrar que la vacuna est exenta de virus
contaminados. (Tales pruebas incluyen ensayos en cultivos celulares que sean sensibles a los virus de la
especie a vacunar, pruebas sobre huevos embrionados, y, cuando sea necesario, pruebas en animales).
5.
Algunos pases exigen que cada lote de vacuna supere una prueba de ausencia de micoplasmas. Se han
publicado mtodos adecuados para tal prueba (1-3, 5).
6.
Puede ser necesaria la realizacin de pruebas para determinar la ausencia de algunas bacterias
especficas, por ejemplo Salmonella pullorum, Mycobacterium tuberculosis y M. paratuberculosis, Brucella
spp. y Leptospira spp.
C. VACUNAS CON VIRUS VIVOS PARA ADMINISTRACIN CON AGUA DE

BEBIDA, PULVERIZACIN, O ESCARIFICACIN CUTNEA
1.
Resultan aplicables los prrafos B.1., 2., 4., 5., y 6.
2.
Puede estar permitido un nmero limitado de bacterias no patgenas y hongos contaminantes (ver Seccin
J.2.5. ms adelante).
D. VACUNAS CON VIRUS INACTIVADOS

1.
Resultan aplicables los prrafos B.2. y 3.
E. VACUNAS CON BACTERIAS VIVAS

1.
Resulta aplicable el prrafo B.1.
2.
Los inculos bacterianos iniciales deben estar libres de otras bacterias as como de hongos y micoplasmas.
3.
Cada lote de vacuna debe superar una prueba de pureza mediante el uso de medios slidos e ignorando el
crecimiento de la bacteria de la vacuna.
4.
publicado mtodos adecuados para tal prueba ( ref. 5, y para micoplasmas aviares ref. 2).
F. VACUNAS CON BACTERIAS INACTIVADAS

1.
Resultan aplicables los prrafos B.1., B.3., y E.
Cada lote de vacuna debe superar una prueba para demostrar la inactivacin de la bacteria contenida en la
vacuna. Si resulta apropiado, puede utilizarse a este respecto la prueba de esterilidad.
G. SUEROS PARA ADMINISTRACIN A ANIMALES

1.
Resulta aplicable el prrafo B.1.
2.
Si se usa un virus o una bacteria para la produccin de los sueros, resultan aplicables los prrafos B.2. o
E.2. segn corresponda.
3.
Cada lote de suero debe superar una prueba de esterilidad que cumpla lo descrito en la ref. 5. Se han
publicado mtodos de ensayo adecuados (1-3).
41
4.
Cada lote de suero debe superar pruebas apropiadas que demuestren que el suero est exento de virus
contaminados. (Tales pruebas incluyen ensayos en cultivos celulares que sean sensibles a los virus de la
especie tratada, pruebas sobre huevos embrionados, y, cuando sea necesario, pruebas en animales).
5.
publicado mtodos adecuados para tal prueba ( ref. 5, y para micoplasmas aviares ref. 2).
H. AGENTES DIAGNSTICOS PARA ADMINISTRACIN A ANIMALES

1.
Resultan aplicables los prrafos B.1. y 3.
2.
Si se utiliza un virus en la produccin del agente diagnstico, son aplicables los prrafos B.2. y D.2.; si se
usa una bacteria resultan aplicables los prrafos E.2. y F.2.
I. EMBRIONES, VULOS, Y SEMEN

En relacin con el uso de embriones, vulos y semen, se deben tomar precauciones especiales (4).
J. EJEMPLOS DE PROCEDIMIENTOS
1.
Procedimientos generales
Los materiales utilizados en la produccin de productos biolgicos deben ser esterilizados y/o probados antes de
su uso para asegurar la ausencia de contaminantes. Tambin deben ensayarse muestras del producto biolgico
final para la deteccin de bacterias, hongos o micoplasmas contaminantes.
Los ensayos que aqu se describen para bacterias, hongos, micoplasmas y virus proceden de diversas fuentes y
se indican como ejemplo de mtodos que pueden emplearse con seguridad.
2.
Deteccin de bacterias y hongos
Estos ensayos describen los materiales y mtodos que se usan para detectar bacterias y hongos por la tcnica
de filtracin por membrana o mediante la inoculacin directa en medios de cultivo lquido en el caso de
materiales que no son adecuados para filtracin a travs de membrana.
2.1. Procedimiento general para estimacin de bacterias y hongos viables

Las pruebas normalizadas para la deteccin de bacterias y hongos indeseables en materiales de partida,
lotes de inculo o en el producto final son: la prueba de filtracin por membrana o la prueba de esterilidad
por inoculacin directa.
En la tcnica de filtracin por membrana, se usa un filtro con un tamao de poro nominal no superior a 0,45
m y un dimetro de al menos 47 mm. Si el material es acuoso o dbilmente lipdico se deben usar filtros
de nitrato de celulosa; si el material tiene un elevado contenido alcohlico, lipdico o con adyuvantes
lipdicos se deben usar filtros de acetato de celulosa. El filtro se humedece con 20-25 ml de Diluyente A o B
inmediatamente antes de verter el contenido del recipiente o recipientes que se vayan a ensayar.
Diluyente A - para productos o materiales acuosos: Disolver 1 g de hidrolizado pptico de tejido animal en
agua hasta completar un litro, filtrar o centrifugar para clarificar, ajustar el pH a 7.1+ 0,2, distribuir en
recipientes en alcuotas de 100 ml, y esterilizar por vapor.
Diluyente B - para materiales o productos lipdicos: Aadir 1 ml de polisorbato 80 a 1 litro de Diluyente A,
ajustar el pH a 7.1+ 0,2, distribuir en recipientes en alcuotas de 100 ml, y esterilizar por vapor.
Si la muestra biolgica ensayada tiene propiedades antimicrobianas, la membrana se lava tres veces con
aproximadamente 100 ml del diluyente apropiado (A o B) despus de la aplicacin de la muestra. A
continuacin la membrana se transfiere entera a los medios de cultivo, cortada aspticamente en partes
42
iguales y colocadas en los medios, o bien los medios se transfieren a la membrana en el aparato de
filtracin. Cuando la muestra contenga mertiolato como conservante, se usa medio de tioglicolato lquido
(FTM) y la membrana se incuba tanto a 30-35C como a 20-25C. Si la muestra ensayada contiene un
agente biolgico muerto sin mertiolato como conservante, se usa el medio FTM a 30-35C y medio de soja
y casena hidrolizada (SCDM) a 20-25C. Cuando se trata de una muestra biolgica a ensayar que
contenga virus vivos, se utiliza el medio SCDM para incubacin a ambas temperaturas.
Si se elige la inoculacin directa a los medios de cultivo, se emplea una pipeta estril o una jeringa con
aguja para transferir aspticamente el material biolgico de modo directo a los medios lquidos. En caso de
que la muestra ensayada tenga propiedades antimicrobianas, se debe determinar la proporcin del inculo
respecto al volumen del medio de cultivo antes del comienzo de la prueba. Para determinar el volumen
correcto de medio a fin de invalidar la actividad antimicrobiana, se usan 100 unidades formadoras de
colonias (CFU) de los microorganismos control indicados en el Cuadro 1. Si la muestra analizada contiene
mertiolato como conservante, se emplea medio FTM en recipientes de ensayo que se incuban tanto a 3035C como a 20-25C. Despus de un tiempo de incubacin adecuado (ver Seccin J.2.2.), el crecimiento
debera ser claramente visible. Si la muestra ensayada contiene un agente biolgico muerto sin mertiolato,
o una bacteria viva, se usa medio FTM a 30-35C y medio SCDMa 20-25C. Si se trata de una muestra con
virus vivos, se usa medio SCDM a ambas temperaturas de incubacin. Si la vacuna con bacterias
inactivadas contiene clostridios, o algn componente de los clostridios, es preferible usar medio FTM
suplementado con 0.5% de extracto de carne (FTMB) en lugar de FTM. Tambin puede ser aconsejable la
utilizacin de FTM y SCDM en todas las pruebas.
Cuadro 1. Algunas cepas de la Coleccin Americana de Cultivos Tipo1 con sus medios respectivos y
condiciones de incubacin
Incubacin
Medio
Microorganismo de referencia
Temperatura (C)
Condiciones
FTM
FTM
Bacillus subtilis ATCC # 6633
3035
Aerbicas
Candida krusei ATCC # 6258
2025
Aerbicas
SCDM
Bacillus subtilis ATCC # 6633
3035
Aerbicas
SCDM
Candida kursei ATCC # 6258
2025
Aerbicas
FTMB
Clostridium sporogenes ATCC # 11437
3035
Anaerbicas
FTMB
Staphylococcus aureus ATCC #6538
3035
Aerbicas
Tanto para pruebas de esterilidad mediante filtracin por membrana como por inoculacin directa, todos los
medios se incuban por al menos 14 das. A intervalos durante la incubacin, y tras los 14 das de
incubacin, se examinan los recipientes de ensayo para evidencia de crecimiento microbiano. El
crecimiento microbiano debera confirmarse mediante subcultivo y tincin de Gram.
2.2. Induccin del crecimiento y pruebas de interferencia

La esterilidad de los medios de cultivo debe ser confirmada incubando recipientes representativos a las
temperaturas adecuadas por el tiempo especificado para cada prueba.
Cada vez que se realiza una prueba debe validarse para cada producto objeto de prueba y para cada
partida o lote de medios de cultivo la capacidad de un medio de cultivo para mantener el crecimiento en
presencia y en ausencia del producto, componentes del producto, clulas, inculos, y otros materiales
ensayados.
Para ensayar la capacidad de mantener el crecimiento en ausencia del material a prueba, los medios de
cultivo deberan inocularse con 10-100 organismos control viables de las cepas sugeridas por la Coleccin
Americana de Cultivos Tipo (ATCC) que se indican en el Cuadro 1 e incubados de acuerdo con las
condiciones especificadas.
Para ensayar la capacidad de los medios de cultivo de mantener el crecimiento en presencia del material a
prueba, los recipientes deben ser inoculados simultneamente con el material de prueba (ver Seccin
J.2.3.) y con 10-100 organismos control viables. El nmero de recipientes a usar debera ser al menos la
mitad de los usados para ensayar el producto o los componentes del producto. Los medios son
1
American Type Culture Collection, 10801 University Boulevard, Manassas, Virginia 20110-2209, USA.
43
satisfactorios si en 7 das existe clara evidencia de crecimiento de los organismos control en todos los
recipientes con medio inoculado. En el caso de que se aprecie crecimiento, debera identificarse el
organismo para confirmar que se trata del organismo originalmente aadido al medio. La prueba de
esterilidad no se considera vlida si alguno de los medios muestra una respuesta inadecuada al
crecimiento, o si el organismo detectado no es el organismo usado para inocular el material.
2.3. Nmero de muestras de prueba

El nmero de artculos en cada lote determina el nmero de recipientes que deberan ser sometidos a
prueba de esterilidad. Si el tamao del lote no es superior a 100, debera ensayarse el 10% o cuatro
recipientes, cualquiera que sea mayor. Si el lote contiene entre 100 y 500 recipientes, deberan probarse
diez. Si el lote tiene ms de 500 contenedores, entonces el 2% o 20 contenedores, cualquiera que sea el
menor, deberan ser sometidos a ensayo. La cantidad de inculo para la prueba de esterilidad est en
funcin de la cantidad de muestra biolgica presente en cada recipiente. Si la cantidad es menor de 1 ml,
todo el contenido se divide para cada medio. Si la cantidad es de 1 a 4 ml, se usa entonces la mitad del
contenido para cada medio. Si se encuentra entre 4 y 20 ml, se utiliza un inculo de 2 ml para cada medio.
Cuando la cantidad en cada recipiente es de entre 20 y 100 ml, entonces se usa el 10% del contenido por
medio. Finalmente, si la cantidad por recipiente supera los 100 ml, se usa para inocular cada medio el 10%
o 50 ml, cualquiera que sea mayor.
2.4. Interpretacin de los resultados de la prueba de esterilidad

Si existe crecimiento en cualquier medio pero puede demostrarse por controles que fueron defectuosos los
medios o la tcnica empleada, entonces el primer ensayo se considera no vlido y debe repetirse. Si en una
primer ensayo se detecta crecimiento microbiano en cualquiera de los recipientes del ensayo y no hay
evidencias que lo invaliden, se debe proceder a una segunda prueba. En tal caso, el nmero mnimo de
recipientes con muestra biolgica, recipientes de ensayo y filtros de membrana es el doble del nmero
usado en la primera prueba. Cuando no se detecta crecimiento en el primer ensayo ni en su repeticin, la
muestra satisface los requisitos de la prueba y se considera adecuada en cuanto a esterilidad. Si se detecta
crecimiento microbiano en cualquiera de los recipientes del ensayo repetido, la muestra biolgica se
considera no satisfactoria en cuanto a esterilidad. Sin embargo, cuando se demuestre mediante controles
que los medios o la tcnica fueron incorrectos en la repeticin, debe procederse a una nueva repeticin.
2.5. Procedimiento general para determinar la presencia de bacterias y hongos en vacunas con virus
vivos producidas en huevos y administradas por agua de bebida, pulverizacin o escarificacin
cutnea.
Cada lote de recipientes con muestra biolgica final debe tener una contaminacin media no superior a una
colonia de bacterias u hongos por dosis de vacuna recomendada en aves, o diez colonias por dosis en
otros animales (ver la anterior Seccin J.2.3. para determinar el numero de muestras a ensayar). De cada
muestra de recipiente se inoculan dos placas Petri con vacuna equivalente a diez dosis si la vacuna es
recomendable para aves, o a una dosis si es recomendable para otros animales. A cada placa se aaden
20 ml de medio slido de infusin de cerebro y corazn que contiene 0.007 IU (unidades internacionales) de
penicilinasa por ml. Una placa se debe incubar a 30-35C durante 7 das y la otra a 20-25C durante
14 das. El recuento del nmero de colonias se realiza al final de cada perodo de incubacin. En cada
condicin de incubacin se debe realizar una determinacin promedio de colonias en todas las placas que
representen un lote. Si en la prueba inicial la media del nmero de colonias en cada condicin de
incubacin supera a una colonia por dosis de vacuna recomendada para aves, o a diez colonias por dosis
de vacuna recomendada para otros animales, se debe proceder a repetir la prueba para eliminar la
posibilidad de fallos en la tcnica, usando el doble de recipientes no abiertos de la muestra biolgica final.
Si en la prueba final la media del nmero de colonias por cada lote en cada condicin de incubacin supera
una colonia por dosis en el caso de vacuna aviar, o diez colonias por dosis en caso de vacuna apropiada
para otros animales, el lote de vacuna debe ser considerado como no satisfactorio.
2.6. Procedimiento general para determinar la pureza de inculos de bacterias y de productos

biolgicos con bacterias vivas
Cada inculo de bacterias o cada lote de material con bacterias vivas debe ser ensayado en cuanto a
pureza por inoculacin en medio SCDM, que se incuba a 20-25C por 14 das, y en medio FTM, que se
incuba a 30-35C por 14 das (ver la anterior Seccin J.2.3. para determinar el nmero de muestras a
ensayar y la cantidad de inculo usado). Se utiliza una pipeta estril o una jeringa con aguja para transferir
directamente de modo asptico la cantidad de muestra a los dos tipos de cultivo. La relacin mnima de
inculo a medio de cultivo es de 1/15.
44
Si el inculo o el crecimiento de la vacuna bacteriana vuelve turbio el medio de tal modo que no es posible
determinar la ausencia de crecimiento microbiano atpico, se debe proceder a hacer subcultivos a partir de
los tubos turbios desde el da 3 al da 11. El subcultivo de hace transfiriendo 0,1-1,0 ml a medios
diferenciales lquidos y slidos e incubando durante el resto del perodo de 14 das. Tambin se debera
realizar un examen microscpico mediante la tincin de Gram.
Si no se detecta crecimiento microbiano atpico en ninguno de los recipientes de ensayo cuando se
compara con un control positivo incluido en la prueba, el lote de muestra biolgica puede considerarse
satisfactorio en cuanto a pureza. Si se detecta crecimiento atpico pero se puede demostrar mediante
control que los medios o la tcnica fueron defectuosos, entonces se debe repetir la primera prueba. Si se
detecta crecimiento atpico pero no existe evidencia que permita invalidar la prueba, se puede llevar a cabo
una repeticin. En esta repeticin se usa un nmero doble de recipientes con muestra biolgica y de
recipientes para prueba respecto al primer ensayo. Si en dicha repeticin no se detecta crecimiento atpico,
la muestra se considera satisfactoria en cuanto a pureza. Si en cualquiera de los recipientes de prueba se
encuentra crecimiento atpico, la muestra se considera inadecuada en cuanto a pureza. Sin embargo,
cuando en la repeticin pueda demostrarse mediante controles que los medios o la tcnica fueron
defectuosos, la repeticin debera a su vez repetirse.
3.
Deteccin de contaminacin por Mycoplasma
3.1. Procedimiento general para la deteccin de contaminacin por Mycoplasma

Cada lote de vacuna con virus vivos, cada lote de inculo vrico original (MSV), cada lote de clulas
primarias y originales en stock (MCS), y todos los ingredientes de origen animal que no hayan sido
esterilizados al vapor deben ser sometidos a pruebas para determinar la ausencia de micoplasmas.
Deberan utilizarse medios slidos y lquidos, tales como el medio para micoplasmas de Frey, capaces de
mantener el crecimiento de pequeas cantidades de organismos de referencia, entre los que se incluyen
Acholeplasma laidlawii (ATCC n 23206), Mycoplasma arginini (ATCC n 23838), M. hyorhinis (ATCC n
17981), and M. orale (ATCC n 23714). En el caso de materiales para aves tambin sera conveniente usar
como organismo de referencia M. synoviae (ATCC n 25204). En teora, se debera incluir en los ensayos
de los medios algn aislamiento reciente de micoplasma con bajo nmero de pases en resiembra,
identificado mediante comparacin con las cepas de referencia. Las propiedades nutritivas del medio slido
deberan de ser tales que cuando se inoculan aproximadamente 200 CFUs (unidades formadoras de
colonias) por placa, no aparezcan menos de 100 CFU para cada organismo de referencia. Cuando se
inoculan aproximadamente 20 CFUs de cada organismo en los medios lquidos, debe originarse un
apropiado cambio de color. La capacidad de los medios de cultivo para mantener el crecimiento en
presencia de los productos debe validarse para cada producto objeto de prueba y para cada nuevo grupo o
lote de medios de cultivo.
Debe someterse a prueba una muestra de cada lote de vacuna, MSV, etc. Inocular cuatro placas de medio
slido con 0,25 ml de la muestra a ensayar e inocular, por otra parte, 100 ml de medio lquido con 10 ml de
la muestra. Incubar durante 28 das dos placas a 35-37C en condiciones aerbicas (una atmsfera de aire
conteniendo 5-10% de CO2 y una humedad adecuada) y otras dos en condiciones anaerbicas (una
atmsfera de nitrgeno conteniendo 5-10% de CO2 y una humedad adecuada). En el da 3 o 4 tras la
inoculacin, subcultivar 0.25 ml del medio lquido por resiembra en dos placas de medio slido. Incubar a
35-37C una placa en condiciones aerbicas y otra en condiciones anaerbicas hasta el da 28 de la
prueba. Repetir el proceso de subcultivo por resiembra en los das 6, 7 u 8, y de nuevo en los das 13
14. Observar diariamente el medio lquido, y, si ocurre cualquier cambio de color, se procede a subcultivar
inmediatamente.
3.2. Interpretacin de los resultados de la prueba para Mycoplasma

Al final del perodo de incubacin (da 28), se examinan microscpicamente todos los medios slidos
inoculados para comprobar la presencia de colonias de micoplasmas. La muestra ensayada supera la
prueba si se ha dado un crecimiento de colonias de micoplasmas en los controles positivos, y si no se ha
dado crecimiento en ninguno de los medios slidos inoculados con el material de prueba. Si se rompiera o
contaminara accidentalmente con bacterias u hongos ms de una placa en cualquier fase de la prueba, la
prueba se considerara no vlida y debera repetirse. Si aparecen colonias de micoplasmas en cualquiera
de las placas con medio slido, debera repetirse una vez la prueba para confirmar la contaminacin por
micoplasmas. En esta nueva prueba se puede usar el doble de volumen (0,5 ml) de material biolgico
objeto de la prueba. Si en alguna placa de esta repeticin se detectan colonias de micoplasma, la muestra
de la prueba debe considerarse como no satisfactoria debido a la contaminacin por micoplasmas. Algunos
micoplasmas no pueden cultivarse, en cuyo caso los lotes de MSV y MCS tienen que ensayarse utilizando
una lnea celular indicadora (clulas Vero), o los mtodos de tincin de ADN o basados en la reaccin en
cadena de la polimerasa (PCR).
45
4.
Deteccin de contaminacin por Salmonella
Cada lote de material biolgico con virus vivos producidos en huevos debe de carecer de contaminacin por
Salmonella. Se deben probar cinco muestras de cada lote; 5 ml de muestra o la mitad del contenido de un
recipiente, cualquiera que sea menor, se inoculan en 100 ml de caldo de triptosa y caldo de tetrationato. Estos
medios lquidos inoculados se incuban a 35-37C durante 18-24 horas. A partir de estos caldos se debe
resembrar en los medios slidos MacConkey y Salmonella-Shigella, se incuba por 18-24 horas y se examina. Si
no se advierte el tpico crecimiento de Salmonella, las placas deben incubarse 18-24 horas adicionales y
examinarse de nuevo. Si entonces se observan colonias tpicas de Salmonella, se debe proceder a un subcultivo
en un medio diferencial adecuado para realizar una identificacin positiva. Si se encuentra Salmonella, el lote de
muestra biolgica no es satisfactorio.
5.
Deteccin de virus en muestras biolgicas
Los materiales biolgicos que son susceptibles de contaminacin vrica y que no pueden ser esterilizados antes
de su uso, como el caso de algunos ingredientes de origen animal (por ejemplo, suero), las clulas de cultivo
primario, las lneas celulares, o los stocks de virus para inoculacin, deben ser ensayados antes de su
correspondiente uso. Existen pruebas descritas para detectar virus contaminantes mediante efectos citopticos,
la hemoadsorcin, la hemoaglutinacin, tcnicas con anticuerpos fluorescentes u otros mtodos adecuados,
como por ejemplo, la reaccin en cadena de la polimerasa (PCR) y el enzimoinmunoensayo (tcnicas ELISA).
Las clulas se ensayan de la siguiente manera. El da inicial, las clulas primarias o congeladas que se van a
ensayar se siembran en frascos de 75 cm2 (o en contenedores similares); 7 das despus, se preparan a partir
de l al menos dos frascos de 75 cm2. En el da 14, un frasco se utiliza para pruebas celulares de citopatologa,
hemadsorcin, y tincin con anticuerpos fluorescentes (los procedimientos se describen ms adelante). El otro
frasco se resiembra por segunda vez, y el da 21 se somete a tres ciclos de congelacin y descongelacin.
Despus del tercer ciclo de congelacin y descongelacin, las clulas se centrifugan a 2.000 g por 10 minutos, y
el sobrenadante se usa para inocular clulas adecuadas que sean sensibles a virus, es decir, clulas
susceptibles a virus que puedan estar presentes en la especie animal de la que proceden las clulas, clulas
susceptibles a virus que puedan presentarse en los animales a los que el uso del material est dirigido y clulas
susceptibles a los pestivirus. Estas clulas son luego resembradas dos veces a intervalos de 7 das, y analizadas
en cuanto a citopatologa, hemadsorcin, y tincin con anticuerpos fluorescentes.
Los componentes de origen animal se prueban tanto en clulas de rin de mono verde africano (clulas Vero)
como en lneas celulares o clulas primarias de la misma especie que el componente sometido a prueba. Se
emplean frascos de 72 cm2, y las clulas se inoculan en 25 ml de medio con 3.75 ml del material ensayado o con
15% de dicho material, cualquiera que sea el menor. Las clulas se resiembran dos veces a intervalos de 7 das
y se analizan en cuanto a citopatologa, hemadsorcin y tincin con anticuerpos fluorescentes. Deben observarse
las clulas, para averiguar si hay efecto citoptico, cada 2 o 3 das y antes de cada subcultivo a lo largo del
perodo de incubacin.
Los lotes de inculos vricos originales (MSV) se prueban sobre clulas Vero, lneas celulares o clulas primarias
de la especie para la que est diseado el producto, y sobre lneas celulares o clulas primarias de la especie en
la que se prepara el producto (si es diferente de la especie a la que se dirige el mismo).
Para cada tipo celular utilizado en la prueba, se descongela o reconstituye 1 ml del MSV ensayado y se
neutraliza mediante adicin de 1 ml de anticuerpo monoespecfico. El suero debe carecer de anticuerpos frente a
cualquiera de los contaminantes que se pretende evidenciar en la prueba. Siempre resulta necesario un mnimo
de al menos dos tipos celulares, de modo que se requiere un mnimo de 2 ml de MSV y 2 ml de antisuero. Se
permite que el antisuero neutralice el MSV a temperatura ambiente durante 1 hora. A continuacin, de esta
mezcla de MSV/antisuero, se inoculan 2 ml en frascos de 75 cm2 conteniendo las clulas adecuadas. Si se
conoce que el MSV presenta un ttulo alto o que es un agente difcil de neutralizar, o cuando se sabe que el
suero bloqueante presenta un ttulo bajo, se puede aadir antisuero bloqueante al medio de crecimiento a una
concentracin final de 1-5%. Se deben resembrar las clulas al menos dos veces en un perodo de 14 das, y el
cultivo final se examina para citopatologa, hemadsorcin y tincin con anticuerpos fluorescentes.
Para detectar la citopatologa causada por virus contaminantes, se usa normalmente el procedimiento de tincin
de May-Grnwald-Giemsa. Las monocapas se suelen preparar en portaobjetos para cultivos de tejidos de dos
cmaras y se incuban por 7 das. Se extraen los pocillos de plstico de los portas dejando la junta de goma unida
al porta. Los portaobjetos se enjuagan con la solucin tampn de fosfato salino de Dulbecco (PBS) ligeramente
calentada, se fijan en alcohol y se colocan en un dispositivo de tincin. A continuacin, los portas se tien
durante 15 minutos a temperatura ambiente con colorante May-Grnwald diluido 1/5 con metanol absoluto. El
colorante May-Grnwald se elimina mediante inversin de los portas. Luego los portas se tien durante
20 minutos con colorante Giemsa diluido 1/15 con agua desionizada. El colorante Giemsa se elimina por
inversin de los portas y lavado de los mismos con agua desionizada por 10-20 segundos. Los portas se secan
46
al aire, y se aplica aceite de parafina y un cubreobjetos. La tincin de May-Grnwald-Giemsa tie de modo

diferente las nucleoprotenas con ADN o ARN. Las nucleoprotenas con ADN se colorean de rojo-prpura,
mientras que las nucleoprotenas con ARN se colorean de azul. Las monocapas se examinan con un
microscopio convencional para ver la presencia de cuerpos de inclusin, un nmero anormal de clulas gigantes,
u otra citopatologa atribuible a un virus contaminante. Las monocapas inoculadas se comparan con monocapas
no inoculadas. Si se detecta citopatologa especfica debida a un virus contaminante, el material ensayado
debera considerarse como no satisfactorio.
La prueba para detectar virus contaminantes que producen hemadsorcin en las clulas infectadas se lleva a
cabo normalmente en monocapas de segunda resiembra de cultivos celulares inoculados con el material
probado y en cultivos celulares no inoculados. Las monocapas se disponen, por lo general, en frascos de plstico
de 25 cm2. La sangre de cobaya, de pollo o de cualquier otro origen que se usa en este ensayo se mezcla con
un volumen igual de solucin de Alsever. La sangre puede conservarse hasta 7 das a 4C si se lava varias
veces con solucin de Alsever antes del almacenarse en un volumen igual de dicha solucin. Inmediatamente
antes de su uso, los eritrocitos guardados se lavan de nuevo aadiendo 5 ml de sangre en solucin de Alsever a
45 ml de PBS libre de calcio y magnesio y se centrifuga a 500 g durante 10 minutos en un tubo de centrfuga de
50 ml. Se elimina el sobrenadante resultante mediante succin y los eritrocitos se suspenden en PBS y se
vuelven a centrifugar. Este proceso de lavado se repite al menos dos veces hasta que el sobrenadante resulte
claro. Los eritrocitos de cada especie se combinan aadiendo 0.1 ml de cada tipo de clulas sanguneas
empaquetadas a 100 ml de PBS. Los eritrocitos de las diferentes especies pueden mantenerse separados o
combinados, segn se desee. A cada frasco se aade 5 ml de la suspensin de eritrocitos y se incuban los
frascos a 4C durante 30 minutos. Las monocapas se lavan dos veces con PBS y se examinan para
hemadsorcin. Si no se observa hemadsorcin, se aaden 5 ml de la suspensin de eritrocitos a cada frasco, se
incuban de nuevo a 20-25C por 30 minutos, se lavan como antes, y se vuelven a examinar para hemadsorcin.
Si se desea, se pueden usar frascos distintos para cada temperatura. Las monocapas se examinan para
presencia de hemadsorcin tanto de manera aproximada (usando un transiluminador encendido) como
microscpicamente. Es importante comparar las monocapas no inoculadas con las monocapas de la prueba para
detectar la existencia de hemadsorcin no especfica que puede ocurrir con algunos tipos celulares. El uso de
PBS libre de calcio y magnesio y de eritrocitos frescos debera evitar, en gran medida, la existencia de
hemadsorcin no especfica. Si se detecta hemadsorcin especfica atribuible a un virus contaminante, el
material ensayado debera ser considerado no satisfactorio.
Las pruebas para detectar virus contaminantes con anticuerpos fluorescentes usan por lo general monocapas de
segunda resiembra de cultivos celulares inoculados con el material ensayado y cultivos celulares no inoculados.
Las monocapas se disponen normalmente en portaobjetos de cultivos celulares con ocho cmaras. Para cada
conjugado antivrico se prepara un porta como control positivo (formado por ocho monocapas) inoculando cada
monocapa con aproximadamente 100 DICT50 (dosis infectiva del 50% en cultivo del tejido) del virus apropiado.
Se tien tres grupos de monocapas con cada conjugado antivrico. Estos son, Grupo 1 - la segunda resiembra de
los cultivos celulares inoculados con el material que est siendo ensayado; Grupo 2 - la segunda resiembra de
los cultivos celulares no inoculados; y Grupo 3 - la segunda resiembra de los cultivos celulares no inoculados
(para produccin de cultivos celulares como control positivo). A la hora de teir, se eliminan los pocillos de
plstico de los portas, dejando la junta de goma unida al porta. Los portas se lavan con PBS de Dulbecco, se
fijan a 4C con acetona por al menos 10 minutos, y se secan. Sobre cada pocillo de un porta de los Grupos 1,2, y
sobre el porta correspondiente al control positivo del Grupo 3, se deposita aproximadamente 0.1 ml de cada
conjugado. Los portas se incuban luego a 37C en una cmara con humedad por 30 minutos, se lavan una vez
con PBS de Dulbecco, y se colocan en un contenedor con PBS de Dulbecco durante 10 minutos. Los portas se
lavan cuidadosamente con agua desionizada y se secan. Se examinan todos los portas en cuanto a
fluorescencia atribuible a cada virus especfico. Se comparan los tres portas de cada grupo con el mismo
conjugado. Si el porta que contiene las clulas inoculadas con el material ensayado muestra alguna evidencia de
fluorescencia vrica especfica, el MSV se considerar como no satisfactorio.
Agradecimiento
Algunas partes de este captulo tienen su origen o estn basadas en el captulo sobre Pruebas para esterilidad y
ausencia de contaminacin en materiales biolgicos de la edicin anterior del Manual de animales terrestres.
REFERENCIAS
1.
CODE OF FEDERAL REGULATIONS (2003). Animals and Animal Products, Title 9, Parts 1-199. The Office of the
Federal Register, National Archives and Records Adminsitration. US Government Printing Office,
Washington DC, USA.
2.
COUNCIL OF EUROPE (2002). European Pharmacopoeia, Cuarta Edicin. Editions of the Council of Europe,
Strasbourg, France. ISBN 92-871-4587-3.
47
3.
EUROPEAN UNION (1999). The Rules Governing Medicinal Products in the European Union. Eudralex, Vols 49. Office Publications of the European Communities, Luxembourg.
4.
HARE W.C.D. (1985). Diseases transmissible by semen and embryo transfer techniques. OIE Technical
Seris No. 4. OIE, Paris, France. ISBN 92-9044-164-1.
5.
WORLD HEALTH ORGANIZATION (WHO) (1998). WHO Expert Committee on Biological Standardization. World
Health Organization, Geneva, Switzerland. ISBN 92-4-120878-3.
LECTURAS ADICIONALES
Para ms detalles sobre mtodos y medios de cultivo, pueden consultarse los siguientes libros as como los
catlogos comerciales correspondientes.
A.
BARROW G.I. & FELTHAM R.K.A., eds. (1993). Cowan and Steels Manual for the Identification of Medical
Bacteria, Tercera Edicin. Cambridge University Press, Cambridge, UK.
B.
CODE OF FEDERAL REGULATIONS (2003) Subchapter E. Viruses, serums, toxins, and analogous products;
organisms and vectors. En: Code of Federal Regulation, Animals and Animal Products, Title 9, Parts 101124. The Office of the Federal Register, National Archives and Records Adminsitration. US Government
Printing Office, Washington DC, USA. 501-676.
C.
COLLINS C.H., LYNE P.M. & GRANGE J.M., eds. (1995). Collins and Lynes Microbiological Methods, Sptima
Edicin. Butterworth Heinemann, Oxford, UK.
D.
MURRAY P.R., ed. (2003). Manual od Clinical Microbiology, Octava Edicin. American Society for
Microbiology Press, Washington DC, USA.
*
* *
48
CAPTULO I.1.6.
SEGURIDAD HUMANA EN LOS LABORATORIOS

VETERINARIOS DE MICROBIOLOGA
INTRODUCCIN
El tipo de trabajo de laboratorio que se describe en este Manual debera realizarse en condiciones
de mnimo riesgo para la salud del personal. Esto supone una cuidadosa consideracin de los
riesgos relacionados con cada procedimiento particular y la toma de las medidas adecuadas para
minimizar la posibilidad de enfermedad en humanos. Tal asunto es un tema complejo que solo
puede ser tratado de forma somera en un captulo introductorio. Este captulo se refiere casi
exclusivamente a los riesgos de los agentes infecciosos, pero tambin deben evitarse en el
laboratorio de microbiologa las lesiones fsicas y qumicas. Las probabilidades de infeccin se
reducen mediante buenas tcnicas de laboratorio y equipamientos seguros, que ayudan a
controlar los patgenos. Es importante destacar que el control de los patgenos cumple dos
objetivos. Uno es evitar la enfermedad en humanos, y el otro evitar la enfermedad en los
animales. Con frecuencia, se usan los mismos mtodos de control para evitar la adquisicin de
infecciones en humanos en el laboratorio y para impedir la diseminacin de patgenos que
podran causar un brote de enfermedad en los animales. Pese a que los mtodos, tcnicas e
instalaciones que se necesitan pueden ser las mismas, la lista de patgenos y su ordenacin en
cuanto a niveles de riesgo puede diferir en funcin de si el objetivo fundamental es controlar una
enfermedad en humanos o en animales.
Los laboratorios nacionales e internacionales de referencia existentes tienen una experiencia
considerable en la prctica del trabajo seguro y en el suministro de instalaciones apropiadas.
Cuando se establezcan laboratorios nuevos, resultara prudente pedir consejo a las autoridades
competentes en los institutos ya establecidos. Es importante cumplir con las normas legislativas.
A. DETERMINACIN DE RIESGOS DE LOS PATGENOS

En primer lugar, es necesario determinar el riesgo de un patgeno, de modo que pueda asignarse a un grupo de
riesgo. El trabajo con dicho patgeno puede relacionarse luego con una categora de contencin apropiada.
Para determinar el riesgo que plantea un patgeno particular para el hombre es necesario conocer si la
infeccin con dicho organismo puede provocar la muerte, una enfermedad, o molestias a la gente que lo
manipula, y adems si es susceptible de fcil diseminacin de modo que pueda causar enfermedad a la
poblacin en general. (Existen aspectos adicionales que hay que considerar respecto a la contencin de los
patgenos animales y a la prevencin de la extensin de sus infecciones, lo que constituye un tema separado,
aunque relacionado. Puede encontrarse informacin al respecto en el Cdigo Sanitario de Animales Terrestres
de la OIE, captulo 1.4.6, que por comodidad se reproduce al final de este captulo como Apndice 1). Para
determinar el riesgo hay que saber aspectos epidemiolgicos del organismo y tambin propiedades suyas tales
como infectividad para los humanos, estabilidad en el medio, capacidad de infectar por diferentes rutas, y su
sensibilidad a tratamientos especficos o profilaxis (1, 2, 5, 6). Es relativamente sencillo disponer de esta
informacin cuando se trabaja con un patgeno conocido, pero el problema es mucho mas complicado cuando
un laboratorio de diagnstico recibe material clnico que puede estar infectado con diversos patgenos
desconocidos, algunos de los cuales pueden ser extremadamente peligrosos para la salud humana. Algunos de
los aspectos a tener en cuenta cuando se evala el riesgo son:
1.
Existencia conocida de infeccin humana por el organismo, o por organismos relacionados con
caractersticas similares, cualquier historia que lo relacione con una infeccin adquirida en laboratorio,
dosis infectiva y gravedad de la enfermedad; produccin de toxinas o sustancias alergnicas.
2.
El volumen del cultivo que se maneja y la concentracin del organismo que esta probablemente presente.
(Algunos procedimientos como la produccin de antgenos o vacunas, que requieren grandes cantidades
de organismos, tienen normalmente mas riesgo que las tcnicas que intentan el aislamiento del
organismo).
49
Captulo I.1.6. Seguridad humana en los laboratorios veterinarios de microbiologa
3.
El origen de la muestra, ya que, por ejemplo, muestras procedentes de animales salvajes es probable que
contengan patgenos humanos del tipo de los no encontrados normalmente.
4.
La historia del aislamiento que se est procesando. Los patgenos en aislamiento primario o durante los
pases iniciales en cultivo son a menudo ms peligrosos que los patgenos con un nivel de pases en cultivo
mas elevado. En algunos casos, en cambio, la patogenicidad puede aumentar por pases o subcultivos en
diferentes medios nutritivos.
5.
La posibilidad de formacin de aerosoles debe ser tenida especialmente en cuenta cuando se manejan
muestras lquidas o, por ejemplo, durante fases de trituracin, homogenizacin o centrifugacin.
6.
La amenaza que el organismo pueda representar en animales de consumo o de compaa o para la vida
salvaje, independientemente de la que represente para el personal del laboratorio. Se necesitan
precauciones adicionales para el manejo y el almacenamiento de agentes transmisores de enfermedades
animales que provengan del extranjero.
7.
El estado fsico de los empleados. Por ejemplo, en el caso de embarazo, inmunodeficiencia o alergia,
pueden requerirse precauciones especiales. En ocasiones, se tienen que excluir algunos individuos de
algunos tipos particulares de trabajo que puedan resultar especialmente peligrosos para ellos.
8.
Se puede producir un elevado nivel de riesgo cuando algunos agentes, como Brucella o Mycobacterium, se
inoculan en animales. A fin de evaluar tal inoculacin, debera valorarse el riesgo que entraa y tener en
cuenta los siguientes factores:
a) La especie hospedadora en contraposicin a la especie inoculada.
b) La cepa/tratamiento y la concentracin del inculo.
c) La ruta de la inoculacin.
d) El tipo de alojamiento de los animales.
e) Tipos de recoleccin de muestras.
B. AGRUPACIN DE LOS MICROORGANISMOS

Las consideraciones anteriormente expuestas se han tenido en cuenta por varias autoridades nacionales para
agrupar los microorganismos en cuatro grupos de riesgo (2,3) que representan una clasificacin en funcin del
peligro creciente para la salud humana. Esta clasificacin no considera que haya gente particularmente
susceptible, debido, por ejemplo, a una enfermedad previa, a un sistema inmune deprimido o a un embarazo.
Los cuatro grupos pueden resumirse del siguiente modo:
Grupo 1- Organismos que no es probable que ocasionen enfermedad en humanos.
Grupo 2- Organismos que pueden causar enfermedad pero que son incapaces de dispersarse por la comunidad
y frente a los cuales se dispone de tratamientos eficaces y profilaxis.
Grupo 3- Organismos que originan enfermedad grave en humanos y que pueden extenderse por la comunidad
pero frente a los cuales hay tratamientos eficaces y profilaxis.
Grupo 4- Organismos que causan enfermedad grave en humanos y que pueden suponer un alto riesgo por su
extensin por la comunidad, frente a los cuales no existe ni tratamiento adecuado ni profilaxis.
A los agentes productores de enfermedades animales que estn bajo el control de las autoridades veterinarias
se aplican principios adicionales, siendo necesario evitar su difusin entre los animales domsticos o salvajes.
Estos aspectos se tratan en el Cdigo Sanitario de Animales Terrestres de la OIE; el captulo 1.4.6 del Cdigo
trata de los grupos de contencin y se presenta como apndice del presente captulo. Estas Normas de la OIE
son similares a las publicadas por la Unin Europea para la contencin en laboratorio de los agentes que
afectan a los animales.
Los microorganismos infecciosos que pueden encontrarse en el trabajo de laboratorio se han incluido por las
autoridades de los diversos pases en los Grupos de Riesgo del 1 al 4 (2, 4). Algunos ejemplos de los
patgenos peligrosos que pueden detectarse en los laboratorios veterinarios se indican en la Cuadro 1. La
encefalopata espongiforme bovina ha sido situada por la Unin Europea en el grupo 3. Adems, algunos
agentes muy peligrosos del grupo 4, como Hendra y Nipah, se han aislado de muestras para su utilizacin en
diagnstico en laboratorios veterinarios.
50
Cuadro 1. Ejemplos de algunos microorganismos de los Grupos de Riesgo 2 y 3 capaces de causar enfermedades
humanas y que pueden encontrarse en un laboratorio veterinario
Grupo 2
Virus: Virus de influenza tipos A, B y C; virus de la enfermedad de Newcastle; virus Orf (parapoxvirus).
Bacterias: Alcaligenes spp.; Arizona spp.; Campylobacter spp.; Chlamydia psittaci (no aviar);Clostridium tetani;
Clostridium botulinum; Corynebacterium spp.; Erysipelothrix rhusiopathiae;Eschericihia coli; Haemophilus spp.;
Leptospira spp.; Listeria monocytogenes; Moraxella spp.;Mycobacterium avium; Pasteurella spp.; Proteus spp.;
Pseudomonas spp.; Salmonella spp.;
Hongos: Aspergillus fumigatus; Microsporum spp.; Trichophyton spp.
Grupo 3
Virus: Virus de la rabia; virus de la encefalomielitis equina (tipo Este, tipo Oeste, tipo Venezolano); virus de la
encefalitis japonesa B; virus de la encefalitis ovina.
Bacterias: Bacillus anthracis; Burkholderia mallei (Pseudomonas mallei); Brucella spp.; Chlamydia psittaci (solo
cepas aviares); Coxiella burnetti; Mycobacterium bovis.
C. REQUISITOS PARA TRABAJAR CON AGENTES INFECCIOSOS

A. Patgenos conocidos
Despus de determinar el nivel de riesgo de un trabajo determinado, es posible decidir luego el nivel de
contencin adecuado que se precisa para minimizar el riesgo de enfermedad en humanos. El nivel de
contencin queda definido por la combinacin de las instalaciones fsicas y las prcticas de trabajo utilizadas.
Los organismos de los cuatro grupos de riesgo indicados anteriormente se pueden colocar en niveles de
contencin apropiados para un trabajo seguro (ver ms adelante). Con frecuencia, los laboratorios nombran un
oficial de seguridad responsable de asegurar que los microorganismos se manipulan en el nivel adecuado de
contencin. Deben poseer la suficiente experiencia y edad como para supervisar y aconsejar todo lo relativo a
asuntos de seguridad. En grandes organizaciones que incluyan una red de laboratorios es adecuado nombrar
un oficial de seguridad central para coordinar los asuntos de seguridad de una manera corporativa, lo que es
luego aplicado en los laboratorios de cada sitio por los oficiales de seguridad locales. Los mtodos de trabajo
para un procedimiento o estacin de trabajo particular deben ser escritos y estar fcilmente disponibles. El
personal debe estar bien entrenado y enterado por completo de cualquier riesgo para la salud asociado con su
trabajo, as como de los procedimientos para informar de cualquier incidente o accidente. Tambin se debera
suministrar al personal una tarjeta mdica con indicacin de los patgenos a los que puede estar expuesto. En
algunos casos, el personal puede ser vacunado de modo especial para suministrarle proteccin adicional, por
ejemplo, si trabaja con el virus de la rabia; esto tambin debera indicarse en la tarjeta mdica. Tal informacin
resulta til en la prctica mdica en caso de que se presente una enfermedad. Se recomiendan los exmenes
mdicos peridicos de los empleados y la realizacin de pruebas en aquellos que trabajan con organismos que
causan enfermedades graves en humanos, tales como brucelosis y tuberculosis.
Existe mucha informacin sobre contencin de patgenos y se pueden construir sofisticados aparatos y edificios
enteros para controlar los organismos ms peligrosos segn requieran las directrices, estndares y regulaciones
de cada pas. Las necesidades dependen de la contencin requerida, desde el nivel ms bsico al ms alto.
Requisitos esenciales de todos los trabajos. Las necesidades esenciales de cualquier trabajo con agentes
infecciosos, por muy inocuos que puedan ser, son las siguientes:
1.
El laboratorio debe ser fcil de limpiar, con superficies impermeables al agua y resistentes a agentes
qumicos. Deben tener una pila de lavado de manos y una ducha de emergencia, incluyendo tambin un
lavador de ojos en cada laboratorio para los peligros de tipo qumico y de otro tipo presentes.
2.
El acceso de personal al laboratorio debe ser restringido.
3.
En el laboratorio se debe de llevar puesta ropa adecuada de proteccin, incluyendo guantes, mscaras (o
mejor, respiradores) y gafas protectoras apropiadas, que debe uno quitarse cuando abandona el
laboratorio.
51
4.
La puerta del laboratorio debe cerrarse cuando hay trabajo en curso y debe existir ventilacin por
extraccin del aire de la habitacin. (Cuando se usan cabinas de bioseguridad se debe tener cuidado en
equilibrar los sistemas de ventilacin).
5.
No se pueden guardar ni consumir alimentos o bebidas en el laboratorio.
6.
No se debe fumar o aplicarse cosmticos en el laboratorio.
7.
No se debe pipetear con la boca.
8.
Debe tenerse cuidado en reducir la produccin de aerosoles.
9.
Deberan implementarse planes de respuesta de emergencia para el caso de derramamiento de materiales

de peligro biolgico. Entre los elementos de ese plan deben figurar desinfectantes efectivos para limpiar
los vertidos, descarte y descontaminacin de la ropa de proteccin contaminada, lavado de manos y
limpieza y desinfeccin de las mesas de trabajo.
10. El material de vidrio usado y cualquier otro material de laboratorio debe ser guardado con seguridad antes
de su desinfeccin. Los materiales de desecho deben transportarse sin vertido en contenedores fuertes. La
basura debe ser esterilizada en autoclave, incinerada o convertida en material seguro antes de su
evacuacin. El material reutilizable debe ser descontaminado por medios adecuados.
11. Nunca se eliminar material infeccioso por las pilas de laboratorio ni ningn otro tipo de escape similar.
12. Cualquier incidente o accidente debe ser registrado y comunicado al Oficial de Seguridad.
En el nivel de contencin de patgenos del Grupo 2 (ver Apndice 1), adems de los puntos indicados
anteriormente, se deben de utilizar cabinas microbiolgicas de seguridad que pueden ser usadas con modo de
apertura frontal (cabinas de Clase I). Tambin se pueden usar cabinas de clase II cuando exista la posibilidad
de que se generen aerosoles o cuando se manejen grandes cantidades de cultivo o exista una necesidad real
de proteger el producto biolgico (ver seccin D). Es necesaria la colocacin de seales en las puertas de
entrada para indicar el peligro existente y el nombre y nmero de telfono de las personas responsables.
Deberan colocarse dentro del laboratorio indicaciones de emergencia para advertir al personal sobre los
procedimientos a seguir en caso de vertidos del patgeno o cuando exista la necesidad de evacuar el
laboratorio debido a un fuego o a otra emergencia.
En el nivel de contencin de patgenos del Grupo 3 (ver Apndice 1), es aconsejable que el laboratorio est
situado de modo aislado y restringir la entrada a personal con cualificacin de nivel 3. Se necesita una
adecuada sealizacin en todas las puertas de entrada, indicando los peligros presentes y el nombre y nmero
de telfono de la persona o personas responsables. Dentro del laboratorio deben colocarse indicaciones de
emergencia sealando al personal los procedimientos a seguir en caso de vertidos del patgeno o ante la
necesidad de evacuar el laboratorio por fuego. El nivel 3 de contencin de la OIE rebasa las directrices de
bioseguridad 3 (BSL-3) delineadas por el Departamento de Salud y Servicios Humanos de los Estados Unidos
(DHHS) (15) y del Departamento de Agricultura de los Estados Unidos (USDA) (14).
Adems de las exigencias anteriores, el laboratorio debe estar bajo presin negativa y los diferenciales de
presin deben vigilarse; debe desarrollarse un procedimiento que de la alarma en caso de un problema. Se
necesita un sistema de ventilacin que extraiga el aire del laboratorio mediante un filtro de aire particulado de
alta eficacia (filtros HEPA). Los filtros HEPA deben ser revisados regularmente (usualmente anualmente); esto
incluye los filtros HEPA en los gabinetes de bioseguridad y en los ductos de salida de las habitaciones y equipo.
El laboratorio debe poder ser cerrado por completo para fumigacin y contener una entrada con bloqueo de aire.
Existe la necesidad de tratar los lquidos efluentes en funcin del patgeno. Deben estar disponibles cabinas de
clase I, II o III (13). El laboratorio debera estar bajo presin negativa respecto a zonas circundantes donde se
realiza trabajo menos peligroso. Adems, puede ser necesario que el personal se duche a la salida del
laboratorio y que dicho personal vista ropa especial de laboratorio que se deja en el mismo cuando se abandona
el edificio.
Nota. Debido a la relacin entre la encefalopata espongiforme bovina (BSE) y la nueva variante de la
enfermedad de Creutzfeldt-Jakob en humanos, el agente productor de la BSE y otros agentes relacionados se
clasifican en el Grupo 3 de riesgo. Por tanto, los veterinarios y trabajadores de laboratorio que lleven a cabo
necropsias de animales sospechosos de BSE o que manejen tejidos procedentes de tales animales deben
realizar su trabajo bajo condiciones estrictas de contencin adecuada, a veces con las limitaciones impuestas
por la naturaleza del trabajo y los resultados de la valoracin del riesgo local. Resulta importante que se vista
ropa adecuada y que se siga un cdigo prctico estricto para evitar contacto con el patgeno. Los laboratorios
que realizan trabajos con BSE deben cumplir las normativas nacionales sobre biocontencin y bioseguridad.
52
En el nivel de contencin de patgenos del Grupo 4 (ver Apndice 1), se exigen las precauciones ms
estrictas, incluyendo un sistema de acceso al edificio a travs de compartimentos estancos y el mantenimiento
del edificio bajo presin negativa. El aire que penetra en el laboratorio debe ser filtrado a travs de un filtro
HEPA sencillo, y el aire extrado a travs de un filtro HEPA doble. Todo el trabajo realizado con material infectivo
debe hacerse en cabinas de tipo II o III conjuntamente con el uso de trajes personales de trabajo de presin
positiva. Todas las aguas residuales del laboratorio, los efluentes normales y los de salida del autoclave, deben
tratarse por medios adecuados para asegurar la destruccin de todo material infeccioso antes de que alcance el
sistema pblico de alcantarillado. El personal debe tomar una ducha y cambiarse de ropa antes de salir del
edificio. Tambin son aplicables otras precauciones descritas para el Grupo 3. En la actualidad, el uso de trajes
de una pieza con presin positiva es una norma internacionalmente aceptada para lograr una contencin de
nivel 4.
Las directrices de la OIE para el nivel de contencin de los patgenos del Grupo 4 son, en general, iguales a las
directrices Ag. para el nivel 3 de bioseguridad de USDA (14). La diferencia entre una y otra es que en la
segunda se especifica que el laboratorio debe ser hermtico y debe superar una prueba de diferencial de
presin para asegurarse de que no sobrepasa la cantidad mxima de escape prescrita.
B.
Muestras para diagnstico
Los centros de diagnstico veterinario reciben muestras que son enviadas porque se sospecha la presencia de
una variedad de enfermedades. La naturaleza infecciosa de las muestras es normalmente desconocida, pero
potencialmente presentan agentes biolgicos que pueden ocasionar enfermedad en el hombre y los animales.
Se requiere seguir prcticas y procedimientos que disminuyan al mnimo el riesgo de la exposicin ocupacional
de los trabajadores a tales patgenos. A menos que se sospeche que contienen un patgeno que requiera un
nivel de contencin ms elevado, es recomendable que el procesamiento inicial de todas las muestras
desconocidas se realice como si el material contuviera un patgeno del Grupo 2. Los aspectos ms importantes
son aquellos que evitan la exposicin percutnea y la de las membranas mucosas. Las cabinas de seguridad
biolgica deben usarse en todas las manipulaciones que puedan generar aerosoles. Las de clase I y II son
adecuadas, en funcin de la necesidad de proteccin de las muestras de contaminacin. Adems, no se debe
realizar el pipeteo con la boca, se debe llevar puesta ropa protectora y, en algunos casos, proteccin respiratoria
y para los ojos, dependiendo del nivel previsto de exposicin. Aunque las etapas iniciales del diagnstico se
pueden realizar en el nivel 2, toda vez que se asle un organismo del Grupo 3 (o que se sospeche su presencia),
el trabajo ulterior se debe llevar a cabo en el rgimen superior de contencin.
D. CABINAS DE SEGURIDAD MICROBIOLGICA

Se utilizan para los diferentes niveles de contencin, segn se describe en la anterior seccin C.A. Son de tres
tipos:
Clase I: cabinas de apertura frontal diseadas de modo especial para suministrar proteccin al operador y sin
proteger el producto.
Clase II: cabinas de apertura frontal, a veces llamadas cabinas de flujo laminar recirculante. Estn destinadas
fundamentalmente a dar proteccin al producto, pero tambin protegen al operador.
Clase III: cabinas cerradas, con acceso frontal mediante guantes, que proporcionan el mayor grado de
contencin mediante separacin completa del trabajador y del trabajo realizado. Algunas cabinas tienen
extrable la parte frontal con los guantes y se conocen como cabinas de clase III/I, es decir, se pueden utilizar de
ambos modos.
Se han publicado descripciones de cabinas de seguridad y de prcticas operativas de seguridad (8, 10, 16).
E. ALMACENAMIENTO DE PATGENOS
El almacenamiento de patgenos vivos requiere contencin y seguridad adecuadas para evitar los riesgos
derivados de fugas por el uso no autorizado de material. El equipamiento en que se mantienen debe ser
marcado como corresponde, indicando la naturaleza del patgeno (es decir, su grupo) y la persona o personas
responsables de tal equipamiento. Debe mantenerse un completo inventario, actualizado y disponible, acerca de
los patgenos almacenados. Se debe tener un cuidado particular cuando se abran los viales de vidrio de
patgenos liofilizados, ya que se fragmentan con frecuencia. Igualmente hay que tener cuidado cuando se
trabaja con nitrgeno lquido.
Muchas de las explicaciones dadas arriba no son solo de aplicacin para la seguridad humana sino que tambin
son aplicables para evitar la extensin de la infeccin a los animales. En un laboratorio veterinario, el eliminar
53
riesgos de escape de patgenos hacia animales salvajes o domsticos de la comunidad es una importante
responsabilidad. Debe mantenerse una estrecha comunicacin con las autoridades veterinarias. Para trabajar
con algunos microorganismos, se requiere disponer de licencias especiales.
F. RIESGOS QUMICOS Y FSICOS

El trabajo de laboratorio incluye muchas manipulaciones que son potencialmente peligrosas, como el manejo de
material de vidrio, el uso de agujas y otros instrumentos cortantes. Deben de existir dispositivos especiales para
desechar adecuadamente las agujas y otro instrumental cortante.
El personal de laboratorio corre el riesgo de sufrir quemaduras por slidos o lquidos calientes. Los autoclaves
deben de estar equipados con mecanismos de seguridad para evitar su apertura accidental cuando funcionan a
presin y sometidos a servicios de mantenimiento y pruebas regulares. Deben suministrarse guantes de
proteccin frente al calor. El fro extremo puede suponer tambin un riesgo, por ejemplo cuando se trabaja con
nitrgeno lquido; las salpicaduras sobre la piel no protegida pueden ser muy peligrosas. Se deben de utilizar
guantes que permitan aislamiento del fro y que sean resistentes al agua para evitar la penetracin del nitrgeno
lquido. Se debe tambin llevar mscara para la cara y botas cuando se trabaja con nitrgeno lquido.
La radiacin es un riesgo serio para la salud que puede estar presente debido al uso de aparatos de rayos X, o
al empleo de emisores de rayos gamma u otras fuentes. Tales equipos deben estar sometidos a mantenimiento
y a pruebas peridicas. Todo uso de material radioactivo ha de ser meticulosamente anotado. Todo el personal
debe disponer de un dispositivo de control de radiacin y pasar controles sanitarios anuales. Deben tenerse en
cuenta las regulaciones locales y nacionales al respecto (10).
En los laboratorios veterinarios se emplea una amplia gama de compuestos qumicos, muchos de los cuales
pueden ser txicos o mutagnicos, y algunos incluso carcinognicos. Debera recordarse que es la dosis la que
determina el peligro (por ejemplo, en cantidades suficientes, incluso una sustancia inocua puede llegar a ser
txica). Los vapores son especialmente peligrosos, y algunas sustancias se pueden absorber por penetracin a
travs de la piel intacta. Siempre deben tomarse suficientes precauciones para proteger a trabajadoras
embarazadas. Debe disponerse de una lista de sustancias qumicas peligrosas y de un archivo de sustancias a
las que puede estar expuesto el personal del laboratorio. Esto constituye en la actualidad normativa legal en
muchos pases. Las sustancias qumicas deben guardarse en contenedores apropiados y a la temperatura
debida. Aquellas que sean muy inflamables deben mantenerse en armarios a prueba de fuego. Debe llevarse un
inventario de compras y de uso del material qumico peligroso que indique cunto se ha usado, cundo, por
quin, y con qu fines. La eliminacin de sustancias qumicas est regulada oficialmente.
Se puede obtener ms informacin sobre precauciones de seguridad frente a agentes fsicos y qumicos en la
literatura sobre el tema (10, 11).
G. INFRAESTRUCTURA DEL LABORATORIO DE ANIMALES

El trabajo con patgenos en animales de laboratorio tiene riesgos especiales (ver Apndice 1). Los habitculos
para los animales deben estar construidos teniendo en cuenta los estndares y niveles de contencin
apropiados, como en el caso de los propios laboratorios. La contencin en estos habitculos es muy importante
porque pueden generarse en ellos una gran cantidad de agentes infecciosos. Consideraciones similares son
tambin de aplicacin en cuanto al entrenamiento del personal, ropa de proteccin e inventario de
procedimientos de trabajo. Debe tomarse especial cuidado en evitar daos al personal, por ejemplo a travs de
mordeduras o coces por parte de los animales. Cualquier incidente de ese tipo debe ser documentado y las
heridas curadas adecuadamente. Deben existir equipos de incineracin o eliminacin de cadveres y sistemas
que hagan posible una cuidadosa limpieza y desinfeccin de los habitculos animales. Estos recintos deberan
suministrar al animal no solamente un ambiente adecuado sino que deberan construirse y ventilarse de tal
modo que se asegure una determinada comodidad para el personal que los atiende. Este es un tema muy
amplio que solo puede tratarse aqu de forma breve (4, 7). Recientemente se ha publicado un libro excelente
sobre salud y seguridad en el equipamiento de laboratorios animales (17).
H. DISPOSITIVOS DE EMERGENCIA
En las proximidades de toda estacin de trabajo debe existir un equipo de primeros auxilios; pero debe
guardarse un lugar que no pueda ser contaminado por el trabajo de laboratorio (p. Ej. en una cmara de aire o
en una antesala). Este equipo debe estar en relacin con el tipo de trabajo, y tiene que ser mantenido limpio y
sujeto a un adecuado mantenimiento. Debe estar dispuesto y disponible para usos inmediatos de emergencia y
contener vendas, ropas y medicinas usuales. Parte del personal debera recibir entrenamiento en
54
procedimientos de seguridad y primeros auxilios por parte de autoridades reconocidas y estar en posesin de un
certificado vlido que evidencie su competencia. Sus nombres y localizacin deben ser conocidos por todos y
figurar en los tablones de anuncios. Todo el personal de plantilla debe ser consciente de la importancia de la
seguridad. Deben considerarse procedimientos apropiados y equipos para tratar casos de vertidos y
descontaminaciones. Adems, debe mantenerse un registro de todos los accidentes.
Deben existir por escrito procedimientos a seguir en caso de emergencia debida al fallo de los sistemas de aire,
por ejemplo, en cabinas de bioseguridad o habitaciones de biocontencin que pueden originar una prdida de
contencin.
Muchos laboratorios disponen en plantilla de un comit de seguridad para desarrollar la comprensin del
concepto de seguridad por parte del personal y para comentar temas relacionados con la direccin. Los
directores son responsables de la seguridad en cada una de sus reas de competencia, y no deberan permitir
que asuntos tales como la rapidez o los costes del trabajo primaran sobre la seguridad de los trabajadores.
Por si fuera necesario, debera existir un procedimiento de emergencia para disponer de asistencia mdica as
como de hospitalizacin cuando ello se requiriese. Las alarmas de fuego deben estar en funcionamiento, y
sometidas a pruebas con regularidad. Cada unidad debera nombrar a un bombero para dirigir ejercicios
peridicos con el fin de hacer conocer al personal qu hacer y donde reunirse en caso de un incendio. El
bombero es el responsable de comprobar que todas las personas abandonan el edificio. La existencia de
normas para el caso de existir otros desastres naturales, como huracanes y terremotos, es tambin pertinente
cuando representen un riesgo. Todas estas directrices deben ser indicadas por escrito y revisadas
peridicamente.
I. TRANSPORTE DE MATERIAL INFECCIOSO

Se debe tomar una precaucin especial en la preparacin y embalaje de muestras diagnsticas que se van a
transportar, para asegurarse de que no hay roturas de los recipientes ni derrames de contenido que pudieran
suponer un riesgo para los trabajadores de correos, transportistas o personal del laboratorio que lleva a cabo la
recepcin (ver Captulo I.1.1. Mtodos de muestreo). Deben seguirse las normas locales, nacionales e
internacionales sobre el transporte de materiales peligrosos y sobre la importacin de patgenos.
J. CONCLUSIONES
Una de las prioridades ms importantes del laboratorio es disponer de altas cualificaciones de seguridad que
aseguren unas condiciones sanas de trabajo a toda la plantilla del personal. Esto solo puede lograrse despus
de un cuidadoso estudio de los principios que conlleva y mediante su aplicacin prctica en los edificios,
equipos, procedimientos operativos e higiene. El entrenamiento de todo el personal del laboratorio es una
cuestin clave, y ninguna persona debera estar autorizada a trabajar hasta haberlo completado de forma
documentada. Existe una literatura muy amplia sobre todos y cada uno de los aspectos de este tema, y se
recomienda su ulterior lectura (6, 9, 13, 14, 15).
REFERENCIAS
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ACHA P.N. & SZYFRES B. (1987). Zoonoses and Communicable Diseases Common to Man and Animals,
Second Edition. Pan American Health Organisation, Scientific Publication No. 503. PAHO, Washington DC,
USA.
2.
ADVISORY COMMITTEE ON DANGEROUS PATHOGENS (1995). Categorisation of Biological Agents According to

Hazard and Categories of Containment, Fourth Edition. Health and Safety Executive Books, P.O. Box 1999,
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3.
BARBEITO M.S., ABRAHAM G., BEST M., CAIRNS P., LANGEVIN P., STERRITT W.G., BARR D., MEULEPAS W.,
SANCHEZ-VIZCAINO J.M., SARAZA M., REQUENA E., COLLADO M., MANI P., BREEZE R., BRUNNER H., MEBUS C.A.,
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55
6.
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7.
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8.
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9.
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10. RAYBURN S.R. (1990). The Foundations of Laboratory Safety (a Guide for the Biomedical Laboratory).
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11. SEWELL D.L. (1995). Laboratory associated infections and biosafety. Clin. Microbiol. Rev., 8, 389405.
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Edition. Catalogue number 017-040-00547-4. United States Government Printing Office, Washington DC,
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13. U.S. DEPARTMENT OF HEALTH AND HUMAN SERVICES, PUBLIC HEALTH SERVICE, CENTERS FOR DISEASE CONTROL
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14. W OOD M. & SMITH M.W. (EDS) (1999). Health and Safety in Laboratory Animal Facilities. Royal Society of
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15. US DEPARTMENT OF HEALTH AND HUMAN SERVICES, CENTRES FOR DISEASE CONTROL AND PREVENTION AND
NATIONAL INSTITUTES OF HEALTH (1999). Biosafety in Microbiological and Biomedical Laboratories, Fourth
Edition. Catalogue number 017-040-00547-4. United States Government Printing Office, Washington DC,
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16. U.S. Department of Health and Human Services, Public Health Service, Centers for Disease Control and
Prevention, and National Institutes of Health (2000). Primary Containment for Biohazards: Selection,
Installation and Use of Biological Safety Cabinets, Second Edition. United States Government Printing
Office, Washington DC, USA.
17. W OOD M. & SMITH M.W. (EDS) (1999). Health and Safety in Laboratory Animal Facilities. Royal Society of
Medicine Press, London, UK, pp. 249.
56
APNDICE I.1.6.1
TRANSPORTE INTERNACIONAL Y CONTENCIN

DE AGENTES PATGENOS DE ORIGEN ANIMAL
EN EL LABORATORIO1
A. OBJETIVO
Prevenir la introduccin y propagacin de enfermedades animales causadas por agentes patgenos.
B. INTRODUCCIN
1.
La introduccin de una enfermedad infecciosa, de un agente patgeno de origen animal o de una cepa
nueva de agente patgeno de origen animal en un pas libre de ellos hasta entonces puede tener
consecuencias muy graves, en la medida en que puede perjudicar en mayor o menor grado la salud
animal, la salud pblica, la economa agropecuaria y el comercio. Para evitar que el comercio internacional
de animales vivos y productos de origen animal sea causa de esa introduccin, los pases debern prever
una serie de medidas que impongan, por ejemplo, las pruebas veterinarias y la cuarentena antes de la
importacin.
2.
No obstante, existe tambin el riesgo de que una enfermedad aparezca como consecuencia de la
liberacin accidental de agentes patgenos por laboratorios que los utilizan con distintos fines, como por
ejemplo la investigacin, el establecimiento de diagnsticos o la elaboracin de vacunas. Esos agentes
patgenos pueden existir ya en el pas o haber sido importados voluntaria o involuntariamente. Por
consiguiente, es imprescindible disponer de medidas para evitar su liberacin accidental. Las medidas
pueden aplicarse en las fronteras nacionales, mediante la prohibicin o el control de las importaciones de
determinados agentes patgenos o de sus portadores (vase el Artculo 1.4.6.7.), o en el territorio
nacional, mediante la especificacin de las condiciones que deben respetar los laboratorios para
manipularlos. En la prctica se combinarn probablemente los controles internos y externos, en funcin del
riesgo que suponga para la salud animal el agente patgeno considerado.
C. PROPSITO
1.
Hacer recomendaciones sobre la contencin en laboratorios de agentes patgenos de origen animal en

funcin del riesgo que suponen para la salud animal y la economa agropecuaria de un pas, sobre todo
cuando la enfermedad que causan no es enzotica.
2.
Hacer recomendaciones sobre las condiciones de importacin de agentes patgenos de origen animal.
3.
Si los agentes patgenos de origen animal suponen tambin un riesgo para la salud pblica, las
recomendaciones relativas a su contencin en los laboratorios se hallarn en el Manual Terrestre y en los
dems documentos pertinentes publicados.
D. CLASIFICACIN DE LOS AGENTES PATGENOS DE ORIGEN ANIMAL

1.
Los agentes patgenos de origen animal sern clasificados por categoras, en funcin del riesgo que
suponen para la salud animal, si son introducidos en un pas o liberados accidentalmente por un
laboratorio. Al proceder a la clasificacin de los agentes patgenos en cuatro categoras, segn el grado
de contencin que requieren, se tendrn en cuenta los siguientes factores: patogenicidad del agente
considerado, riesgos biolgicos que representa, capacidad de propagacin, aspectos econmicos y
disponibilidad de tratamientos profilcticos y teraputicos.
Este Apndice est tomado del Captulo 1.4.6 del Cdigo internacional de sanidad animal de la OIE, 2001.
57
Apndice I.1.6.1. Transporte internacional y contencin de agentes patgenos

de origen animal en el laboratorio
2.
Algunos agentes patgenos necesitan ser transmitidos por determinados vectores o terminar sus fases de
desarrollo en huspedes intermediarios antes de infectar a los animales y provocar una enfermedad. En
los pases en que esos vectores o esos huspedes intermediarios no existen o en que las condiciones
climticas o ambientales no propician su supervivencia, esos agentes patgenos suponen menor riesgo
para la salud animal que en los pases en que esos vectores o esos huspedes intermediarios viven
naturalmente o pueden sobrevivir.
3.
Al proceder a la clasificacin de los agentes patgenos de origen animal en grupos particulares se tendrn
en cuenta los siguientes criterios:
a)
Agentes patgenos de origen animal del grupo 1

Organismos que causan enfermedades enzoticas pero no estn sujetos a control oficial.
b)

Organismos que causan enfermedades exticas o enzoticas, sujetos a control oficial y con escasa
posibilidad de propagarse a partir de un laboratorio.
c)
i)
Su transmisin no depende de vectores ni de huspedes intermediarios.
ii)
Su transmisin entre animales de especies distintas es muy limitada, incluso inexistente.
iii)
Su capacidad de propagacin geogrfica en caso de liberacin accidental por un laboratorio es

limitada.
iv)
Su transmisin directa entre animales es relativamente limitada.
v)
La necesidad de aislar los animales enfermos o infectados es mnima.
vi)
Las consecuencias econmicas y/o clnicas de la enfermedad son limitadas.

Organismos que causan enfermedades exticas o enzoticas, sujetos a control oficial y con
moderada posibilidad de propagarse a partir de un laboratorio.
d)
i)
Su transmisin puede depender de vectores o de huspedes intermediarios.
ii)
Su transmisin entre animales de especies distintas puede producirse fcilmente.
iii)

moderada.
iv)
Su transmisin directa entre animales es relativamente fcil.
v)
El aislamiento reglamentario de los animales enfermos, infectados o que han estado en

contacto con animales afectados es imperativo.
vi)
Las consecuencias econmicas y/o clnicas de la enfermedad son graves.
vii)
Los tratamientos profilcticos y/o teraputicos son escasos o tienen efectos limitados.

Organismos que causan enfermedades exticas o enzoticas, sujetos a control oficial y con alta
posibilidad de propagarse a partir de un laboratorio.
58
i)
Su transmisin puede depender de vectores o de huspedes intermediarios.
ii)
Su transmisin entre animales de especies distintas puede producirse muy fcilmente.
iii)

total.
iv)
Su transmisin directa entre animales se produce muy fcilmente.
v)
El aislamiento reglamentario de los animales enfermos, infectados o que han estado en

contacto con animales afectados es imperativo.
vi)
El control reglamentario de los movimientos de animales en un vasto permetro es imperativo.
vii)
Las consecuencias econmicas y/o clnicas de la enfermedad son sumamente graves.
viii)
No existe ningn tratamiento profilctico y/o teraputico satisfactorio.

E. NIVELES DE CONTENCIN
1.
El principal objetivo de la contencin es evitar que un agente patgeno se escape de un laboratorio y se

propague a la poblacin animal del pas. Algunos agentes patgenos de origen animal pueden infectar a
las personas y, en ese caso, la proteccin de la salud pblica puede exigir una contencin superior a la
que se considera suficiente para proteger la salud de los animales.
2.
El nivel de contencin fsica y los procedimientos y prcticas de seguridad biolgica dependern del grupo
en que haya sido clasificado el agente patgeno y los requisitos debern ser los apropiados para el tipo de
organismo considerado (bacteria, virus, hongo o parsito, por ejemplo). Para los agentes patgenos del
grupo 1 se necesitar el nivel de contencin ms bajo y para los del grupo 4 el ms alto. En el Cuadro 1 se
indican los requisitos de contencin para los grupos 2, 3 y 4.
3.
Algunos artrpodos pueden ser agentes patgenos o vectores de agentes patgenos. Si son vectores de
un agente patgeno que se utiliza en el laboratorio se respetar el nivel de contencin que requiere dicho
agente patgeno y se respetarn, adems, las condiciones de contencin que se aplican a los artrpodos.
Cuadro 1.Recomendaciones relativas a las condiciones que deben respetar los laboratorios
para los distintos grupos de contencin
Grupo de contencin
Condiciones aplicables a los laboratorio
1. Alejamiento de cualquier peligro de incendio

notorio
2. Separacin entre el lugar de trabajo y las dems

actividades
3. Acceso limitado del personal
4. Proteccin contra incursiones de roedores e

insectos
S, bajo vigilancia
S, bajo vigilancia
Simple a la salida
Simple a la entrada,
doble a la salida
8. Sistema mecnico de entrada de aire con

dispositivo antiavera
9. Posibilidad de cierre hermtico en caso de

fumigaciones
Accesible
S, en el sitio
11. Campana extractora de seguridad de clase 1/2/3
12. Acceso directo al autoclave
S, con puertas
dobles
S, con puertas
dobles
13. Conservacin de agentes patgenos en el

laboratorio
Preferible
A) Localizacin y organizacin del laboratorio
5. Esterilizacin de los efluentes lquidos

6. Aislamiento por esclusa de aire. Ventilacin
interna continua
7. Filtracin de la entrada y salida de aire con filtros
HEPA o similares
10. Incinerador de cadveres y desechos

B) Instalaciones del laboratorio
14. Depsito con contenedor doble (aguas residuales)

15. Ropa de proteccin prohibida fuera del laboratorio
59

Cuadro 1. Recomendaciones relativas a las condiciones que deben respetar los laboratorios para los distintos
grupos de contencin (cont.)
Grupo de contencin
Condiciones aplicables a los laboratorio
4
S
16. Ducha obligatoria antes de salir del laboratorio

17. Designacin de un responsable de la contencin
18. Formacin del personal en la observancia de las

reglas
19. Fijacin de carteles relativos a la zona de

contencin
20. Posibilidad de cerrar el laboratorio con llave
21. Entrada exclusiva del personal autorizado
22. A la entrada, cambio de toda la ropa de calle por

ropa limpia
23. A la salida, cambio de toda la ropa de laboratorio,

ducha y entrada al sector limpio
C) Reglamento del laboratorio
24. Ducha obligatoria de las personas antes de entrar

en el sector limpio
S
S
26. Notificacin de las condiciones de embalaje de las

muestras antes de su envo al laboratorio
27. Apertura de los paquetes por personal

experimentado
28. Traslado de agentes patgenos de un laboratorio

autorizado a otro previa autorizacin nicamente
29. Manual de procedimientos normalizados de

manejo que cubra todos los aspectos
25. Declaracin de todos los accidentes

D) Manipulacin de muestras
F. POSESIN Y MANIPULACIN DE AGENTES PATGENOS

1.
60
Un laboratorio slo estar autorizado a poseer y a manipular agentes patgenos de origen animal que
pertenezcan a los grupos 3 4 si puede demostrar a la autoridad competente que est dotado de las
instalaciones de contencin apropiadas para dichos grupos. No obstante, segn las circunstancias
particulares de cada pas, la autoridad competente podr decidir que la posesin y la manipulacin de
determinados agentes patgenos del grupo 2 tambin deben ser objeto de control. La autoridad
inspeccionar en primer lugar las instalaciones, para cerciorarse de su conformidad, y otorgar despus
una licencia que especifique todas las condiciones pertinentes. Una de ellas ser que el laboratorio lleve
un registro en debida forma e informe a la autoridad en caso de que sospeche que el material utilizado
contiene un agente patgeno que no est cubierto por la licencia. La autoridad visitar peridicamente el
laboratorio para asegurarse de que respeta las condiciones de la licencia, pero velar por que el personal
que efecte la visita no tenga ningn contacto con animales susceptibles a los agentes patgenos
manipulados por el laboratorio durante un perodo determinado despus de haber visitado el laboratorio,
perodo cuya duracin depender del tipo de agente patgeno.

2.
Las licencias especificarn:

a)
las condiciones de transporte del agente patgeno y de eliminacin de su embalaje;
b)
el nombre de la persona responsable del trabajo;
c)
si se va a utilizar el agente patgeno in vivo (y en ese caso, si en animales de laboratorio o en otros

animales) y/o solamente in vitro;
d)
las condiciones de eliminacin del agente patgeno y de los animales utilizados para la
experimentacin, una vez concluido el trabajo;
e)
las restricciones en materia de contactos del personal del laboratorio con animales susceptibles a los
agentes patgenos utilizados;
f)
las condiciones de traslado de agentes patgenos a otros laboratorios;
g)
las condiciones particulares relativas al nivel de contencin apropiado y a los procedimientos y

prcticas de seguridad biolgica.
G. IMPORTACIN DE AGENTES PATGENOS DE ORIGEN ANIMAL

1.
La importacin de agentes patgenos de origen animal, de material patolgico o de organismos portadores

de agentes patgenos estar supeditada a la concesin de una licencia de importacin por la autoridad
competente. La licencia de importacin especificar las condiciones pertinentes segn el riesgo que
suponga el agente patgeno y, en caso de transporte areo, las normas pertinentes de la Asociacin
Internacional de Transporte Areo en materia de embalaje y de transporte de sustancias peligrosas. La
licencia de importacin de un agente patgeno de los grupos 2, 3 4 se conceder nicamente a un
laboratorio autorizado expresamente a manipular ese agente patgeno, como se indica en el
Artculo 1.4.6.6.
2.
Al examinar las solicitudes de importacin de material patolgico, las autoridades tendrn en cuenta el tipo
de material, el animal del que proviene, la susceptibilidad de dicho animal a distintas enfermedades y la
situacin zoosanitaria del pas de origen. Podr ser til exigir un tratamiento del producto antes de la
importacin para reducir al mnimo el riesgo de introducir inadvertidamente un agente patgeno.
*
* *
61
CAPTULO I.1.7.
PRINCIPIOS DE PRODUCCIN DE
VACUNAS VETERINARIAS
RESUMEN
La administracin fiable de vacunas puras, inocuas, potentes y eficaces es imprescindible para el
mantenimiento de la salud animal y el funcionamiento satisfactorio de los programas de salud
animal. La inmunizacin de animales con vacunas de gran calidad es el principal medio de control
de muchas enfermedades animales. En otros casos, las vacunas se emplean conjuntamente con el
control nacional de enfermedades o los programas de erradicacin.
Se pretende que los requisitos y procedimientos que se describen en este captulo sean de
carcter general y consistentes con los estndares publicados de los que se dispone normalmente
como gua en la produccin de vacunas veterinarias. El planteamiento para garantizar la calidad,
inocuidad, potencia y eficacia de las vacunas veterinarias puede variar de un pas a otro
dependiendo de las necesidades locales. Sin embargo, son imprescindibles estndares y controles
de produccin adecuados para asegurar la disponibilidad de productos uniformes de gran calidad
para el uso en programas de salud animal.
Como la patognesis y la epidemiologa de cada enfermedad vara, el papel y la eficacia de la
vacunacin como medio de control vara tambin de una enfermedad a otra. Algunas vacunas
pueden ser de gran eficacia, induciendo una inmunidad que no slo previene los sntomas de la
enfermedad, sino tambin la infeccin y la replicacin del agente causante de la enfermedad. Otras
vacunas pueden prevenir la enfermedad clnica, pero no la infeccin y/o el estado de desarrollo del
portador. En otros casos, la inmunizacin puede resultar completamente ineficaz o slo reducir la
severidad de la enfermedad. De esta forma, la decisin de recomendar la vacunacin como parte
de la estrategia de control de las enfermedades animales, requiere un conocimiento profundo de
las caractersticas del agente infeccioso y de su epidemiologa, as como de las caractersticas y
posibilidades de las diferentes vacunas disponibles. Adems, hay una preocupacin pblica
creciente por las implicaciones de la produccin y uso de vacunas veterinarias para el bienestar
animal. En cualquier caso, si se utilizan vacunas, un rendimiento satisfactorio requiere que stas
se fabriquen de forma que se garantice un producto uniforme y constante de gran calidad.
NOMENCLATURA
La nomenclatura para los productos biolgicos veterinarios vara de un pas a otro. Por ejemplo, en EE.UU el
trmino vacuna se utiliza para productos que contienen virus vivos o inactivados o protozoos, bacterias vivas o
cidos nucleicos. Dependiendo del tipo de antgeno que contienen, los productos con bacterias muertas y otros
microorganismos se identifican como bacterinas, extractos bacterianos, subunidades, toxoides bacterianos o
toxoides. Por ejemplo, a los productos que contienen componentes antignicos o inmunizantes de
microorganismos se les puede llamar subunidades o extractos bacterianos, y a los obtenidos a partir de la
inactivacin de toxinas se les llama toxoides. En la Unin Europea (UE), los productos mdicos veterinarios se
definen como productos administrados a animales para producir inmunidad activa o pasiva o para diagnosticar
el estado de inmunidad; vase Directiva 90/677/CEE. Sin embargo, en este captulo el trmino vacuna incluir
todos los productos diseados para estimular la inmunizacin activa de animales contra enfermedades, con
independencia del tipo de microorganismo o toxina microbiana que contengan o de los que stos puedan
derivarse. Este uso es ms coherente con la nomenclatura internacional. En esta revisin no se utilizar vacuna
con referencia a productos biolgicos recomendados para la inmunizacin pasiva, inmunoestimulacin,
tratamiento de alergias o diagnstico.
62
Captulo I.1.7. Principios de produccin de vacunas veterinarias
TIPOS O FORMAS DE VACUNAS

Las vacunas se pueden preparar como productos vivos o inactivados (muertos). Algunas vacunas vivas se
preparan a partir de los aislados de campo de baja virulencia, atenuados, de un agente causante de una
enfermedad, que cuando se administran por va no natural o bajo otras condiciones, en las que la exposicin a
los microorganismos inmuniza en vez de causar la enfermedad, se ha descubierto que son inocuos y eficaces.
Otras vacunas vivas se preparan de los aislados de los agentes causantes de enfermedades que han sido
modificados mediante el pase por animales de laboratorio, medios de cultivo, cultivos celulares o embriones
aviares, para seleccionar un aislado de virulencia reducida. El desarrollo de las tcnicas de ADN recombinante
(ADNr ha proporcionado algunas oportunidades nicas para la produccin de vacunas. En la actualidad, las
vacunas vivas modificadas se pueden producir de forma especfica mediante la eliminacin de los genes
relacionados con la virulencia en un microorganismo. Otras vacunas se producen por la introduccin de genes
que codifican antgenos inmunizantes especficos, en un microorganismo vector no virulento, a partir de un
microorganismo causante de una enfermedad. Se estn desarrollando vacunas mediadas por cido nucleico que
contienen ADN plasmdico. Normalmente, el cido nucleico se encuentra en forma de plsmido y codifica
antgenos inmunizantes a partir de microorganismos que causan enfermedades.
Los productos inactivados pueden contener: 1) Cultivos de microorganismos que han sido inactivados por
medios qumicos u otros medios; 2) Toxinas inactivadas; o 3) Subunidades (partes antignicas de
microorganismos) que se han extrado de cultivos o que se han producido mediante procedimientos de ADNr.
Tanto las vacunas vivas como las inactivadas se pueden formular con adyuvantes diseados para aumentar su
eficacia. Los adyuvantes tpicos son emulsiones de aceite en agua (simples o dobles), hechas con aceite mineral
o vegetal y un agente emulsionante. Tambin se utilizan otros adyuvantes como el gel de hidrxido de aluminio.
GARANTA DE CALIDAD
La produccin uniforme de vacunas de gran calidad, inocuas, potentes y eficaces requiere procedimientos de
garanta de calidad para asegurar la uniformidad y consistencia del proceso de produccin. Puesto que los
procesos de produccin de vacunas proporcionan una gran oportunidad para la variabilidad, se debe tener
cuidado en controlar sta en la medida de lo posible, utilizando, preferiblemente, procedimientos validados, y
proteger el producto de la contaminacin a lo largo de todas las etapas de produccin.
Deben garantizarse la calidad, inocuidad, potencia y eficacia de las vacunas mediante la consistencia durante el
proceso de produccin. En cada etapa debe desarrollarse la calidad constante del producto (uniformidad entre
lotes). El anlisis del producto final se utiliza como comprobacin para verificar que los controles en los
procedimientos de produccin se han mantenido intactos, y que el producto fabricado rene la especificacin
previamente acordada con la autoridad otorgante de la licencia.
Las autoridades reguladoras de los diferentes pases han desarrollado planteamientos diferentes para asegurar
la calidad de las vacunas. Aunque parecidos en su objetivo final, estos sistemas pueden variar en la importancia
que se da al control del proceso de produccin (estndares de proceso) en comparacin con el control mediante
el anlisis del producto final (estndares de eficacia). Los procedimientos de control seleccionados deben ser los
que mejor se ajusten a las condiciones bajo las que se estn produciendo las vacunas y deben, en la medida de
lo posible, cumplir con las prcticas correctas de fabricacin.
Los estndares y procedimientos de control establecidos para un producto determinan el riesgo o la posibilidad
de producir y poner en el mercado un producto intil, contaminado, peligroso o nocivo. El grado de riesgo
aceptable puede depender de los beneficios que se obtengan teniendo un producto disponible que evite las
muertes por enfermedad. De esta forma, los estndares pueden variar, de forma justificada, de un pas a otro, o
de un producto a otro, dependiendo de las condiciones de sanidad animal a nivel local. Sin embargo, las
autoridades controladoras deben esforzarse por establecer estndares y procedimientos de control que
garanticen un producto acabado de la mejor calidad, inocuidad, potencia y eficacia posibles.
El sistema de garanta de calidad ptimo deber abordar por igual los procedimientos de produccin y el anlisis
del producto final. Un sistema de seguridad absolutamente eficaz que no tenga el riesgo de elaborar un producto
insatisfactorio, sera, probablemente, demasiado caro con relacin al coste de produccin y al control. Las
autoridades reguladoras y los fabricantes de vacunas deben seleccionar los procedimientos de control que
puedan garantizar un nivel bajo de riesgo aceptable con relacin a ese peligro. Tales procedimientos, sin
embargo, no deben ser tan onerosos que impidan el desarrollo y la disponibilidad de los productos necesarios
para proporcionar un cuidado mdico preventivo a un coste que sea aceptable para el consumidor.
63
INSTALACIONES DE PRODUCCIN
Las instalaciones que se usan para la produccin de vacunas debern estar diseadas para proteger la pureza
del producto durante todo el proceso de produccin y la salud del personal. Se deben construir de forma que:
1) puedan limpiarse fcil y totalmente; 2) proporcionen una separacin adecuada de las cuartos de elaboracin;
3) tengan ventilacin adecuada; 4) tengan abundante agua limpia fra y caliente, y un drenaje y fontanera
eficientes; y 5) vestidores y otras instalaciones para el personal, a las que se acceda sin pasar por las zonas de
elaboracin del producto biolgico. Las instalaciones deben ser adecuadas para facilitar todas las funciones de
produccin, tales como el almacenamiento de los inculos maestros, los ingredientes y otros materiales de
produccin; la preparacin de los medios de cultivo y los cultivos celulares; la preparacin del material de vidrio y
de produccin; la inoculacin; la incubacin; la recoleccin de los cultivos; el almacenamiento de los materiales
en proceso; la inactivacin; la centrifugacin; la adicin del adyuvante y la formulacin del producto; el envasado,
la desecacin, el sellado de recipientes, el etiquetado y el almacenamiento del producto final; la comprobacin
del control de calidad de los materiales en proceso y del producto final; e investigacin y desarrollo.
Por lo general, se requieren zonas separadas para actividades diferentes. Todas las habitaciones y los sistemas
de manipulacin de aire deben construirse de forma que se evite la contaminacin cruzada por otros productos y
por las personas o el equipo. Los microorganismos virulentos o peligrosos se deben preparar y almacenar en
habitaciones separadas del resto del establecimiento. En concreto, los organismos en estudio deben estar
completamente separados de las cepas de las vacunas. Todo el equipo que entre en contacto con el producto
debe esterilizarse mediante procedimientos validados.
Las instalaciones de produccin tienen que disearse de tal forma que se evite la contaminacin del medio
ambiente. Cualquier material utilizado durante la produccin tiene que ser convertido en material seguro antes de
salir de la instalacin. Si se propagan microorganismos muy contagiosos, la salida del aire debe ser tratada para
impedir la fuga de los agentes infecciosos. El personal debe seguir los protocolos de seguridad tales como la
ducha, y evitar ponerse en contacto con animales sensibles despus de abandonar las instalaciones de
produccin.
Aunque la calidad y el diseo de las instalaciones de produccin pueden variar significativamente, deben cumplir
siempre con los estndares que se consideran apropiados para las vacunas que se van a producir. Por ejemplo,
los requisitos con respecto a las instalaciones para la produccin de vacunas de embriones de pollo
administradas por va oral, intranasal o intraocular pueden no ser tan exigentes como aqullos que se estipulan
para la produccin de vacunas de cultivos celulares administradas de forma subcutnea o intramuscular.
PLAN DE LAS INSTALACIONES

Para cada vacuna producida en una instalacin debe haber un plan de produccin detallado que describa donde
tendr lugar cada etapa del proceso de produccin. Este plan debe documentarse en un procedimiento operativo
estndar detallado (POE) o por un plano general (plano de planta) y la leyenda del plano. Cada habitacin del
establecimiento debe identificarse de forma individualizada, y deben especificarse, para cada una, todas las
funciones realizadas y los microorganismos implicados Tambin deben documentarse los procedimientos de
desinfeccin, de comprobacin del equipo y otros procedimientos usados en el funcionamiento de las
instalaciones para evitar la contaminacin o los errores durante la produccin. Este plan debe actualizarse
cuando se aadan nuevos productos a la instalacin, o cuando se realicen cambios o mejoras en los
procedimientos.
DOCUMENTACIN DEL PROCESO DE FABRICACIN

Tambin debe prepararse un perfil de produccin detallado, una serie de procedimientos operativos estndares,
y otros documentos que describan el protocolo para la produccin y el control de cada producto fabricado en un
establecimiento. Los criterios y estndares para los materiales de origen deben estar documentados de forma
clara y precisa. La documentacin debe tambin abordar asuntos tales como el historial del origen, aislamiento y
pases (subcultivos) de cada cepa; los mtodos para la identificacin y determinacin de la virulencia y la pureza;
el medio o el sistema de cultivo celular usado para los cultivos de siembra y de produccin, incluyendo los
mtodos utilizados para demostrar que los medios estn libres de contaminacin; el origen de los ingredientes de
procedencia animal; los mtodos de esterilizacin de medios; las condiciones de almacenamiento de lneas
celulares y de cultivos de siembra; el tamao y los tipos de recipientes utilizados para el crecimiento de los
cultivos; los mtodos para la preparacin de cultivos de siembra e inoculacin de cultivos de produccin; el
tiempo y las condiciones de incubacin; las observaciones durante el crecimiento; los criterios y las
especificaciones para la recoleccin exitosa del material; y las tcnicas de recoleccin. Tambin debe de haber
64
documentacin sobre las medidas tomadas por la empresa con objeto de minimizar el riesgo de contaminacin
de ingredientes de origen animal por encefalopatas espongiformes transmisibles (TSE; prin), y sobre los
procedimientos para garantizar que el suero bovino est libre de pestivirus. Asimismo, la documentacin debe
incluir: una descripcin de todas las pruebas realizadas para evaluar la pureza y la calidad del producto a lo largo
del proceso de proceso de produccin; cada etapa de la formulacin del producto final; las pruebas utilizadas
para la evaluacin de la calidad, inocuidad, potencia, y otros requisitos de cada lote de producto acabado; las
especificaciones para el acabado, incluyendo el empaquetamiento y etiquetado con las indicaciones completas y
las recomendaciones de uso, y la fecha de caducidad establecida para el producto.
Las directrices para la preparacin de dichos documentos con respecto a las vacunas veterinarias son
publicadas por las autoridades controladoras competentes. Esta documentacin tiene por finalidad definir el
producto y establecer sus especificaciones y estndares. Dicha documentacin deber servir, junto con los
planos generales y las leyendas de los planos (plan de produccin y los POE), de mtodo uniforme y constante
de elaboracin del producto que deber seguirse en la preparacin de cada lote.
MANTENIMIENTO DE REGISTROS
El productor debe establecer un sistema de mantenimiento de registros detallado capaz de rastrear la ejecucin
de las sucesivas etapas de la preparacin de cada producto biolgico. Los registros debern indicar la fecha en
la que se han dado cada uno de los pasos cruciales, el nombre de la persona que llev a cabo la tarea, la
identidad y cantidad de los ingredientes aadidos o retirados en cada etapa, y cualquier ganancia o prdida de
cantidad durante el curso de la preparacin. Se deben mantener registros de todas las pruebas realizadas a cada
lote. Todos los registros relacionados con un lote de producto debern guardarse al menos durante dos aos,
despus de la fecha de caducidad de la etiqueta. Adems, deber mantenerse un registro de todas las etiquetas
utilizadas en todos los productos, con cada etiqueta identificada en cuanto al nombre, nmero de producto,
nmero de licencia del producto, tamao del paquete, y nmero de identificacin de la etiqueta. Se debe dar
cuenta de todas las etiquetas impresas. Se deben guardar registros relacionados con los procedimientos de
esterilizacin y pasteurizacin. Normalmente, estos se llevan a cabo por medio de dispositivos automticos de
registro. El fabricante debe tambin conservar registros completos de todos los animales del establecimiento,
incluyendo datos sobre la salud del animal antes de su utilizacin en cualquier prueba, los resultados de las
pruebas realizadas, el tratamiento administrado, mantenimiento, necropsia y eliminacin.
INCULO MAESTRO
Para cada microorganismo utilizado en la fabricacin de un producto, debe establecerse un inculo maestro que
sirva de fuente de siembra para la inoculacin de todos los cultivos de produccin. Los cultivos de trabajo y los
de produccin se pueden preparar a partir del inculo maestro haciendo subcultivos; los cultivos de produccin
finales no deben tener ms de cinco pases (a veces diez) a partir del inculo maestro. En cada caso, se debe
determinar y disear el nmero de pases segn los datos. La utilizacin de un inculo maestro y la limitacin del
nmero de pases del microorganismo que se usa de siembra en la forma indicada, ayuda a mantener la
uniformidad y la consistencia en la produccin. Se debe mantener un registro del inculo maestro. El inculo
maestro debe componerse de un nico lote homogneo de inculo que se ha mezclado y envasado en
recipientes como un solo lote. El inculo maestro se debe congelar o desecar y almacenar a bajas temperaturas
tales como 40C o 70C, o bajo otras condiciones que se consideren ptimas para el mantenimiento de la
viabilidad. Cada inculo maestro se deber analizar para garantizar su identidad, inocuidad y eficacia. Tambin
se debe determinar la pureza mediante el correspondiente anlisis para garantizar que est libre de bacterias,
hongos, micoplasma y virus extraos.
BANCO DE CLULAS MAESTRO

Cuando se utilicen cultivos celulares para preparar un producto, debe establecerse un banco de clulas maestro
(MCS) para cada tipo de clula que se utilice. Debe mantenerse un registro del origen del banco de clulas
maestro. En el Perfil de Produccin o en el POE, se deben determinar y especificar, para cada producto, los
nmeros ms altos y bajos de pases de clulas. Algunas autoridades controladoras no permiten ms de 20 a
40 subcultivos. Cada MCS debe caracterizarse para garantizar su identidad, y su estabilidad gentica debe
demostrarse al hacer subcultivos a partir del pase ms alto y ms bajo utilizado para la produccin. La pureza de
los MCS debe establecerse mediante anlisis para asegurar que est libre de bacterias, hongos, micoplasma y
virus extraos.
65
Clulas primarias
Se definen como un conjunto de clulas originales obtenidas de tejido normal, que incluye hasta el dcimo
subcultivo, utilizadas en la produccin de biolgicos. En el caso de productos para uso avcola, estas clulas se
obtienen, normalmente, a partir de huevos de pollo embrionados libres de patgenos, que tienen su origen en
una parvada sin vacunar, sujeta a control microbiolgico minucioso. Otras clulas primarias se derivan de tejidos
normales de animales sanos y se analizan con relacin a la contaminacin por una variedad de organismos tan
amplia como sea pertinente, incluyendo bacterias, hongos, micoplasmas, y agentes citopticos y/o
hemoadsorbentes y otros virus extraos. Algunas autoridades controladoras slo permiten el uso de clulas
primarias en casos excepcionales.
Huevos embrionados
Los huevos se utilizan con frecuencia en la produccin de biolgicos. En casi todos los casos, deben derivarse
de parvadas de pollos libres de patgenos especficos, que hayan sido controladas de forma exhaustiva con
relacin a agentes infecciosos y que no hayan sido vacunadas. La va de inoculacin del huevo y la eleccin del
material del huevo que se va a recolectar dependen del organismo concreto que est siendo propagado.
INGREDIENTES
Las especificaciones y el origen de todos los ingredientes de los productos deben estar definidos en el perfil de
produccin, en el POE, y en otros documentos apropiados. El perfil de produccin debe ser aprobado por una
agencia nacional expendedora de licencias. Todos los ingredientes de origen animal que no estn sujetos a
esterilizacin se deben analizar para garantizar que estn libres de bacterias, hongos, micoplasma y virus
extraos. Se debe conocer el pas de origen. La empresa adoptar medidas para minimizar el riesgo de
contaminacin de ingredientes de origen animal por TSE (prin). Algunas autoridades controladoras
desaconsejan el uso de conservantes o (ms importante) el uso de antibiticos como medio de controlar la
contaminacin accidental durante la produccin, y prefieren el uso de tcnicas aspticas estrictas para asegurar
la pureza. Sin embargo, a veces, permiten el uso de conservantes en recipientes multidosis para proteger el
producto durante el uso. Normalmente, estas autoridades controladoras limitan cualquier adicin de antibiticos
al lquido del cultivo celular y a otros medios, a los inculos de huevos, y al material recogido de piel o
posiblemente de otros tejidos, durante la elaboracin del producto. Normalmente, permiten el uso de no ms de
tres antibiticos en el mismo producto. Algunas autoridades controladoras tambin prohben el uso de penicilina
o estreptomicina en vacunas administradas mediante aerosol o de forma parenteral. Si los antibiticos utilizados
no estn recomendados para el uso en las especies a las que se destinan, deber demostrarse que aqullos no
tienen efectos dainos en los animales vacunados y que no tienen repercusin en la contaminacin de alimentos
derivados de los animales vacunados.
PRUEBAS DE EFICACIA
La eficacia de las vacunas veterinarias deber demostrarse mediante estudios estadsticos vlidos de la
vacunacin en prueba en el animal hospedador utilizando los animales ms jvenes a los que ha de
recomendarse el producto. En cada especie animal, los datos deben apoyar la eficacia de la vacuna en cada
rgimen de vacunacin que se describe en la etiqueta de recomendacin del producto, incluyendo los estudios
sobre el comienzo de la proteccin cuando en la etiqueta del producto se haga referencia a dicho comienzo y a la
duracin de la inmunidad. Las pruebas se realizarn bajo condiciones controladas, comenzando, siempre que
sea posible, con animales seronegativos. En lugares en los que se disponga de las pruebas de potencia
validadas, pueden ser innecesarios los estudios de la vacunacin que se prueba en las especies a las que va
destinada, si se dispone de los resultados de prediccin de las pruebas serolgicas. En la medida de lo posible,
debe fomentarse la aplicacin de procedimientos para reemplazar, reducir y refinar los ensayos con animales (la
regla de las tres R).
Los estudios de eficacia deben realizarse con el producto final de la vacuna, elaborada a partir del inculo
maestro con el nmero de pases ms alto permitido en el perfil de produccin, o en otra documentacin del
proceso de fabricacin. En dicha documentacin, se habr especificado la cantidad mnima de antgeno por
dosis que debe haber en el producto final durante todo el tiempo de validez autorizado. El nivel de antgeno por
dosis en la vacuna ensayada para averiguar su eficacia, debe estar en esta cantidad mnima o por debajo. El
mtodo de estudio exacto y los criterios para determinar la proteccin varan con el agente inmunizante y deben
estandarizarse siempre que sea posible.
Los estudios de la eficacia de campo se pueden utilizar para determinar la eficacia cuando no sean posibles los
estudios significativos de la vacunacin en prueba. Sin embargo, normalmente, es ms difcil obtener datos
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estadsticos significativos para demostrar la eficacia bajo las condiciones de campo. Los protocolos para los
estudios de campo son ms complejos, y se debe poner cuidado en establecer los controles adecuados con el fin
de garantizar la validez de los datos. Incluso cuando se disean adecuadamente, los estudios de la eficacia de
campo pueden no resultar concluyentes debido a condiciones externas incontrolables. Algunos problemas
implican: niveles de desafo variables una incidencia baja de la enfermedad en controles sin vacunar y la
exposicin a otros microorganismos causantes de una enfermedad similar. Por lo tanto, para establecer la
eficacia de algunos productos, pueden necesitarse los datos de la eficacia de los estudios de campo y de los del
laboratorio.
PRUEBAS DE INTERFERENCIA
Para los productos con ms de dos componentes antignicos, las pruebas deben confirmar que no hay
interferencia entre los componentes individuales, es decir, que un componente no cause una disminucin en la
respuesta inmunolgica protectora de otro componente. La comprobacin de la interferencia debe realizarse para
cada combinacin de productos antes de su aprobacin.
Se puede producir tambin una prdida de potencia cuando el agente residual de la inactivacin de un producto
lquido muerto, utilizado como diluyente para una fraccin viva disecada, reduce la viabilidad de los organismos
vivos debido a la actividad viricida y bactericida. Cada lote de vacuna muerta lquida que vaya a utilizarse como
diluyente para vacunas vivas debe, por lo tanto, comprobarse para su actividad viricida y bactericida antes de su
puesta en el mercado.
Tambin hay que prestar atencin a la posible interferencia entre dos vacunas diferentes del mismo fabricante,
que se recomienda que sean suministradas al mismo animal en un perodo de dos semanas.
PRUEBAS SOBRE EL INCREMENTO DE LA VIRULENCIA

Con las vacunas vivas existe la preocupacin de que el organismo pueda ser excretado por el hospedador y
transmitirse a animales en contacto, causando enfermedades, si aqul conserva una virulencia residual o revierte
a la virulencia. Por lo tanto, todas las vacunas vivas se deben examinar para la reversin a la virulencia mediante
estudios de pases. Los organismos vacunales se propagan in vivo por inoculacin de un grupo de animales
diana con el inculo maestro, utilizando normalmente la va natural de infeccin para ese organismo. El
organismo vacunal se recupera de los tejidos o excreciones y se utiliza directamente para inocular un nuevo
grupo de animales, y as sucesivamente. Despus de no menos de cinco pases (ms si se trata de productos
avcolas), el aislado debe caracterizarse completamente utilizando los mismos procedimientos que para
caracterizar el inculo maestro. El organismo vacunal debe conservar un nivel aceptable de atenuacin tras la
propagacin de esta forma.
EVALUACIN DEL RIESGO PARA EL MEDIO AMBIENTE

Debe estimarse la capacidad de cada vacuna viva para abandonar el hospedador, para propagarse, para entrar
en contacto con animales diana y los que no lo son, y para persistir en el medio ambiente, con el fin de facilitar
informacin para evaluar el riesgo de la vacuna para el medio ambiente.
En algunos casos esto se puede hacer junto con los ensayos de reversin a la virulencia.
CONSISTENCIA EN LA PRODUCCIN
Antes de la aprobacin de comercializacin de cualquier producto nuevo, cada establecimiento deber producir
en sus instalaciones tres lotes de producto completo para evaluar la consistencia en la produccin. Estos lotes
debern prepararse segn los procedimientos descritos en el perfil de produccin y en los planos generales y
leyendas, en los procedimientos operativos estndares y en otra documentacin del proceso de fabricacin. El
tamao de cada uno de los tres lotes debe ser, al menos, un tercio del tamao medio del lote que se producir
una vez que el producto est en produccin.
El fabricante debe comprobar cada uno de estos tres lotes en cuanto a su calidad, inocuidad y potencia, como se
estipula en el perfil de produccin o en otra documentacin del proceso de fabricacin. Se pueden utilizar los
requisitos normalizados aplicables y los procedimientos de ensayo, por ejemplo, los descritos en el CFR (Cdigo
federal de regulaciones) Ttulo 9 parte 113, en la Directiva 92/18/CEE de la Unin Europea, en la Farmacopea
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europea, o como se describe en este Manual. Antes de la aprobacin de la fabricacin del producto en las
instalaciones y de la aprobacin para su comercializacin, los tres lotes deben mostrar resultados satisfactorios
en los ensayos. Todos los lotes sucesivos deben dar resultados satisfactorios al comprobarse de la misma forma
antes de la aprobacin para su comercializacin.
PRUEBAS DE POTENCIA
Las pruebas de potencia, exigidas para cada lote antes de su aprobacin, se disean para que guarden relacin
con los estudios de eficacia de la vacunacin ensayada en el animal hospedador. Para los productos vricos o
bacterianos inactivados, las pruebas de potencia se pueden realizar en el laboratorio o en animales
hospedadores, o por mtodos cuantitativos in vitro. Normalmente, la potencia de las vacunas vivas se estima
mediante recuentos bacterianos o titulacin de virus.
Cuando se ensaya una vacuna bacteriana viva para su aprobacin, el recuento de bacterias debe ser bastante
mayor que el recuento que se demuestra que es realmente protector en la prueba de inmunogenicidad (eficacia)
del inculo maestro, con el fin de garantizar que, en cualquier momento antes de la fecha de caducidad, el
recuento ser, al menos, igual al manejado en la prueba de inmunogenicidad. Cuando se prueba una vacuna
vrica viva para su aprobacin, la titulacin del virus tiene que ser, como norma general, bastante mayor que la
que se demuestra que es protectora en la prueba de inmunogenicidad del inculo maestro para garantizar que,
en cualquier momento antes de la fecha de caducidad, el ttulo ser, al menos, igual al manejado en la prueba de
inmunogenicidad. Algunas autoridades controladoras especifican que se hagan recuentos bacterianos o vricoses
ms altos que los referidos anteriormente. Es evidente que el ttulo adecuado para la aprobacin depende, en
primer lugar, de la potencia requerida y, en segundo lugar, de la velocidad de desaparicin de las bacterias o los
virus en la vacuna, como se indica mediante las pruebas de estabilidad.
Los requisitos estndares han sido desarrollados y publicados por las autoridades competentes con relacin a
las pruebas de potencia de diversas vacunas. Estas pruebas se pueden encontrar en el CFR Ttulo 9 parte 113,
en la Farmacopea europea y en este Manual.
PRUEBAS DE ESTABILIDAD
Para establecer la validez de la fecha de caducidad que aparece en el paquete del producto, son necesarios los
estudios de estabilidad (basados en una prueba aceptable de potencia). Para estimar la estabilidad con el fin de
establecer una fecha provisional de caducidad, un producto nuevo se puede someter a pruebas de estabilidad
aceleradas, por ejemplo, incubndolo a 37C durante 1 semana por cada ao de validez. Dichas estimaciones
deben confirmarse en tres lotes diferentes al menos, mediante pruebas de potencia peridicas en tiempo real,
durante el perodo de tiempo indicado por la fecha de caducidad, y entre 3 y 6 meses despus. Para los
productos que contengan organismos viables, las pruebas debern hacerse en la fecha de aprobacin de
comercializacin y en la fecha de caducidad aproximada, hasta que se fije un valor estadsticamente vlido. Para
los productos con organismos no viables, cada lote que se presente para su autorizacin se probar en la fecha
de aprobacin de comercializacin, y en/despus de la fecha de caducidad exigida. Algunas autoridades tambin
solicitan una prueba intermedia. Si al final del perodo fechado (perodo de validez), se prueba el producto y se
encuentra que an est por encima de la calidad de aprobacin, se puede considerar la ampliacin del perodo
de validez indicado, mediante la solicitud a la autoridad controladora. El anlisis de la estabilidad, tambin
proporciona la oportunidad para probar la humedad residual y otros parmetros importantes, tales como la
estabilidad de las emulsiones adyuvantes.
PRUEBAS DE INOCUIDAD
La inocuidad intrnseca de una vacuna deber demostrarse al comienzo de la etapa de desarrollo. Se deben
evaluar las vacunas vivas mediante pruebas de incremento de la virulencia y mediante la valoracin del riesgo
medioambiental, tal como se ha dicho ms arriba. Deben evaluarse las vacunas obtenidas mediante
biotecnologa, tal como se argument a propsito de la clasificacin de esas vacunas y la puesta en circulacin
de vacunas vivas ADNr, a las que nos referimos ms adelante. Los estudios de seguridad incluirn la inocuidad
de una dosis nica, de una sobredosis, y de dosis nicas repetidas. Las pruebas de inocuidad para la aprobacin
de un lote se describen en el CFR Ttulo 9 parte 113, en la Farmacopea europea, en este Manual y en otros
sitios. Los procedimientos estndares se aplican a las pruebas de inocuidad con ratones, cobayas, gatos, perros,
caballos, cerdos y ovejas. Los productos pueden requerir ms de un tipo de pruebas de inocuidad. La prueba de
inocuidad exigida para un producto avcola se describe en los requisitos estndares o en el perfil de produccin
especfico para dicho producto. Por regla general, se necesitan estudios de sobredosis para todas las vacunas:
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10 para vacunas vivas y 2 para las inactivadas (si esto no es factible, puede obtenerse confirmacin de la
inocuidad a partir de los datos de las pruebas de potencia).
Para los productos vricoses inactivados, en los que se utilizan animales hospedadores para las pruebas de
potencia, la inocuidad se puede determinar mediante la inspeccin diaria de las vacunaciones durante el perodo
previo de estudio de las pruebas de potencia. De los estudios de reversin a la virulencia en productos vivos
modificados (analizados anteriormente) y de las pruebas de inocuidad de campo (analizados ms adelante), se
obtienen pruebas adicionales de la inocuidad de los productos, pero dichas pruebas no son necesarias para cada
lote.
PRUEBAS DE PUREZA
La pureza se determina mediante el anlisis de una variedad de contaminantes. Las pruebas para detectar los
contaminantes se realizan en los inculos maestros, en las clulas primarias, en los bancos de MCS, en los
ingredientes de origen animal si no se someten a esterilizacin (por ejemplo, suero fetal bovino, albmina bovina
o tripsina), y en cada lote del producto final antes de su aprobacin.
En el CFR Ttulo 9 parte 113, en la Directiva 92/18/CEE de la Unin Europea, en la Farmacopea europea o en
este Manual se han publicado los procedimientos de las pruebas de pureza para la deteccin de virus, bacterias,
micoplasma y hongos extraos, incluyendo, por ejemplo, la Salmonella, la Brucella, los agentes clamidiales, los
virus hemoaglutinantes, la leucosis linfoide aviar, los patgenos detectados mediante una prueba de inoculacin
en embriones de pollo, la coriomeningitis linfoctica, los agentes citopticos y hemoadsorbentes, y los patgenos
detectados por el enzimoinmunoensayo, la reaccin en cadena de la polimerasa o la tcnica del anticuerpo
fluorescente. Debera prestarse mucha atencin, acompaando la documentacin pertinente, a los
procedimientos utilizados para asegurarse de que el suero fetal bovino y otros ingredientes de origen bovino
estn libres de pestivirus. Las pruebas que se van a utilizar para asegurar la pureza varan segn la naturaleza
del producto y deben especificarse en el perfil de produccin o en otra documentacin del proceso de
fabricacin. Puesto que no se han desarrollado pruebas para la deteccin de la encefalopata espongiforme
bovina en ingredientes de origen animal, los fabricantes de vacunas deberan documentar en el perfil de
produccin o SOPs las medidas tomadas para minimizar el riesgo de dicha contaminacin en ingredientes de
origen animal, tales como: verificacin de que todos los ingredientes de origen animal del establecimiento de
produccin provienen de pases que estn libres de la encefalopata espongiforme bovina.
OTRAS PRUEBAS
Dependiendo de la forma en la que se fabrique la vacuna, se puede sugerir la realizacin de ciertas pruebas que
debern especificarse como pertinentes en el perfil de produccin o en otra documentacin del proceso de
fabricacin. Estas pruebas pueden relacionarse con el nivel de humedad que hay en los productos desecados, el
nivel residual de inactivacin de los productos muertos, la inactivacin completa de los productos muertos, el pH,
el nivel de conservantes y antibiticos permitido, la estabilidad fsica de los adyuvantes, la retencin del vaco en
los productos desecados y un examen fsico general de la vacuna final. Las pruebas para estos objetivos se
pueden tambin encontrar en el CFR Ttulo 9 parte 113, en la Directiva 92/18/CEE de la Unin Europea, en la
Farmacopea europea o en este Manual.
MUESTREO
Las muestras deben seleccionarse de cada lote del producto. El seleccionador elegir envases finales
representativos de cada lote y los almacenar a la temperatura de almacenamiento recomendada en la etiqueta.
El fabricante guardar estas muestras de reserva a la temperatura de almacenamiento recomendada durante
6 meses despus de la fecha de caducidad que aparece en la etiqueta, de forma que estn disponibles para
facilitar la evaluacin de la causa de cualquier problema de campo que se presente por el uso de la vacuna. Las
muestras deberan guardarse en una zona de almacenaje segura.
ETIQUETADO
Los estndares para el etiquetado de los productos variarn de un pas a otro; sin embargo, las indicaciones de
la etiqueta y todas las afirmaciones que se hacen en sta debern estar respaldadas por datos relevantes que
hayan sido revisados y aprobados por las autoridades competentes. Se recomienda que todas las etiquetas para
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las vacunas veterinarias contengan la siguiente informacin, aunque en el caso de los envases muy pequeos,
sus etiquetas remitan a la etiqueta del envase o a un prospecto adjunto para la informacin menos importante:
1.
Denominacin exacta del producto, con letras visibles y con igual nfasis en cada letra.
2.
Nombre y direccin del fabricante (y tambin del importador en el caso de los productos importados).
3.
Temperatura de almacenamiento recomendada.
4.
Una declaracin de que el producto es para uso exclusivo veterinario (o animal). Instrucciones de uso
completas, incluyendo todas las advertencias requeridas.
5.
En el caso de los animales destinadas a la alimentacin, una declaracin indicando que los animales no
debern ser vacunados dentro de un nmero especfico de das antes del sacrificio. Esto depender de
las vacunas (por ejemplo, el tipo de adyuvante) y no se requiere para todos los productos.
6.
Fecha de caducidad.
7.
Nmero de lote por el que se identifica el producto en el registro de fabricacin del productor.
8.
Nmero de autorizacin del producto. En algunos pases se sustituye por el nmero de licencia del
establecimiento o del fabricante.
9.
Cantidad recuperable y nmero de dosis.
10.
Declaracin de que el contenido total de un vial multidosis se usar cuando se abra ste por primera vez
(o con un tiempo de almacenamiento temporal adecuado para ciertos productos, cuando est respaldado
por los datos) y que las porciones no utilizadas debern eliminarse de forma adecuada.
11.
Una advertencia de seguridad para el operador, si se considera oportuno, en el caso, por ejemplo, de una
autoinyeccin accidental con la emulsin de aceite de las vacunas.
12.
Cuando se aade un antibitico a una vacuna durante el proceso de produccin, en el cartn o embalaje
utilizados debe figurar la expresin Contiene (nombre del antibitico) como conservante u otra similar. Si
no se utiliza cartn, esa informacin debe aparecer en la etiqueta del recipiente final.
Las etiquetas pueden incluir tambin otras declaraciones objetivas que no sean falsas o engaosas. Tambin
deben indicar, siempre que sea procedente, las restricciones especiales con relacin al empleo o manejo del
producto.
Tambin se facilitar informacin similar en una hoja de datos del producto que se proporciona como un
prospecto. sta contendr tambin muchos ms detalles sobre el mtodo de empleo y las posibles reacciones
adversas.
PRUEBAS DE CAMPO (INOCUIDAD Y EFICACIA)

Todos los productos biolgicos veterinarios administrados a animales debern probarse en cuanto a su inocuidad
y a su eficacia en el campo, si es posible, utilizando las buenas prcticas clnicas antes de su autorizacin para
uso general. Los estudios de campo estn diseados para demostrar la eficacia en las condiciones de trabajo, y
para detectar reacciones inesperadas, incluida la mortalidad, que pueden no haberse observado durante el
desarrollo del producto. En las condiciones de campo, hay muchas variables incontroladas que hacen difcil
obtener buenos datos de eficacia, pero la demostracin de inocuidad es ms fiable. Las pruebas se deben hacer
en el organismo hospedador y en diferentes zonas geogrficas, utilizando grandes cantidades de animales
susceptibles. Los animales en estudio deben representar todas las edades y prcticas de cra para los que est
indicado el producto. Deben incluirse controles sin vacunar. Se deben analizar uno o ms lotes de produccin.
Se debe desarrollar un protocolo que indique los mtodos de observacin y de registro.
INSPECCIN DE LAS INSTALACIONES DE PRODUCCIN

Los establecimientos que estn autorizados para producir biolgicos veterinarios deben estar sometidos a
inspecciones minuciosas de todo el local por parte de las autoridades competentes nacionales que garanticen la
conformidad con el perfil de produccin y los planos generales y las leyendas, los POE u otra documentacin del
proceso de fabricacin. Estas inspecciones pueden incluir asuntos como las cualificaciones del personal; el
mantenimiento de un registro; las condiciones de salubridad general y estndares de laboratorio; las actividades
de investigacin sobre los productos que se estn desarrollando; los procedimientos de produccin; el
funcionamiento de los esterilizadores, pasteurizadores, incubadores y refrigeradores; el envasado; la desecacin;
y los procedimientos de acabado; el cuidado y control de los animales; los procedimientos de anlisis; la
distribucin y la comercializacin; y la destruccin del producto. Es deseable que tengan prcticas correctas de
70
fabricacin (para la fabricacin) y prcticas correctas de laboratorio (para el anlisis de la garanta de calidad).
(Vase el Captulo I.1.2 para las directrices).
Los inspectores prepararn un informe detallado documentando los hallazgos de la inspeccin y planteando las
medidas que el establecimiento debe tomar para mejorar los procesos de produccin. El establecimiento debe
recibir una copia del informe. Se deber realizar una inspeccin complementaria cuando sea necesario, con el fin
de determinar si se han tomado las medidas apropiadas para corregir las deficiencias. Se necesita una
evaluacin continuada para garantizar que las instalaciones de produccin continan operativas de una forma
aceptable. Las inspecciones peridicas tambin fomentan las mejoras continuas en los procedimientos de
produccin y las instalaciones son coherentes con los avances de la tecnologa.
CONTROL PREVIO A LA COMERCIALIZACIN

Antes de la aprobacin, el fabricante debe comprobar cada lote en cuanto a su calidad, inocuidad y potencia as
como realizar otra serie de pruebas para ese producto, detalladas en el perfil de produccin de la compaa o en
otra documentacin del proceso de produccin. En los pases que tienen programas nacionales reguladores, que
incluyen comprobar los anlisis del producto final, muestras de cada lote deben remitirse para su anlisis en los
laboratorios gubernamentales por parte de las autoridades competentes. Si se obtienen resultados no
satisfactorios en las pruebas realizadas bien por el fabricante o por las autoridades competentes, el lote no debe
aprobarse. En tales casos, se debe dar prioridad para la comprobacin de los anlisis de los sucesivos lotes del
producto por las autoridades competentes.
ACTUALIZACIN DEL PERFIL DE PRODUCCIN

Antes de cambiar los procedimientos de produccin, debe cambiarse el correspondiente perfil de produccin u
otra documentacin del proceso de produccin. Los establecimientos debern tener procedimientos internos de
revisin para evaluar todos los cambios en la produccin antes de que se inicien tales cambios. Los cambios
debern ser tambin revisados y aprobados por las autoridades competentes antes de su ejecucin. En los
casos en los que se altere una etapa significativa de la produccin, las revisiones pueden requerir datos
adicionales que respalden la pureza, inocuidad, potencia, y/o eficacia del producto. En los pases con programas
reguladores que incluyen la comprobacin de los anlisis del producto final en los laboratorios nacionales, las
revisiones debern implicar el anlisis del nuevo producto por parte de las autoridades competentes.
SEGUIMIENTO DE LA EFICACIA
Debe pedirse a los fabricantes que mantengan un sistema de notificacin de reacciones adversas y un
mecanismo eficaz para la pronta retirada del producto, que se someter a la auditoria. En muchos pases el
fabricante debe notificar inmediatamente todas las reacciones adversas a la autoridad reguladora, junto con la
medida correctiva tomada. Una alternativa utilizada en muchos pases es que si en algn momento surgen
indicaciones o interrogantes sobre la pureza, inocuidad, potencia o eficacia del producto, o parece que puede
haber algn problema relativo a la preparacin, ensayo o distribucin del producto, el fabricante debe comunicar
de inmediato a la autoridad reguladora tales circunstancias y las medidas que se han tomado.
Despus de la aprobacin de comercializacin de un producto, las autoridades competentes deben hacer un
seguimiento de la eficacia bajo las condiciones de campo. Las quejas del consumidor pueden servir como fuente
de informacin; sin embargo, dicha informacin tiene que ser investigada para determinar si las observaciones
de las que se informa se relacionan con el uso del producto. Se debe informar a los usuarios de las vacunas
veterinarias de los procedimientos adecuados para hacer las reclamaciones. Las autoridades competentes
deben informar al fabricante del producto de todas las reclamaciones recibidas. Deben confirmar tambin si han
recibido otras reclamaciones relacionadas con dicho producto y, de ser as, si el fabricante ha tomado las
mediadas oportunas. Si es necesario, los laboratorios de control pueden analizar muestras del lote del producto
implicado.
Cuando la investigacin est completa, debe prepararse un informe final y debe enviarse un resumen de los
hallazgos al reclamante y al fabricante. Cuando se determine que un producto est causando graves problemas,
deben tomarse medidas urgentes para retirar el producto del mercado y notificarlo a las autoridades de sanidad
animal.
71
CUMPLIMIENTO
Los programas nacionales establecidos para garantizar la calidad, la inocuidad, la potencia y la eficacia de las
vacunas veterinarias deben tener la autoridad legal suficiente para garantizar el cumplimiento de las condiciones
de registro del producto y otros requisitos del programa. El objetivo debe ser conseguir un cumplimiento
voluntario de los requisitos reguladores establecidos. Sin embargo, cuando aqullos se incumplen, las
autoridades competentes deben tener la autoridad legal suficiente para proteger la salud animal. Puede resultar
inestimable para este propsito el que haya una autoridad para la retencin, incautacin y expropiacin de los
productos que se consideren intiles, contaminados, peligrosos o dainos. Al amparo de dicha autoridad, el
producto puede ser retenido por un tiempo, y si durante el mismo no se logra el cumplimiento de los requisitos,
las autoridades competentes pueden solicitar un mandato judicial o un auto de incautacin y expropiacin.
Tambin tendr que haber una autoridad que pueda retirar o suspender la licencia del establecimiento y/o la
licencia del producto y que pueda obtener un requerimiento judicial para detener la venta del producto. Tambin
pueden ser necesarias las multas administrativas o el enjuiciamiento penal en caso de incumplimientos graves y
deliberados.
AUTORIZACIN DE PRODUCTOS OBTENIDOS MEDIANTE BIOTECNOLOGA

Los recientes avances en biotecnologa han hecho posible el desarrollo y la comercializacin de nuevos
productos biolgicos con propiedades antignicas y diagnsticas. Muchos de tales productos han sido
autorizados y aprobados, y muchos estn siendo elaborados. Los productos de la tecnologa del ADN
recombinante no se diferencian bsicamente de los productos convencionales. Por lo tanto, las leyes y
regulaciones existentes son aplicables en su totalidad a estos nuevos productos.
CLASIFICACIN DE LAS VACUNAS OBTENIDAS MEDIANTE BIOTECNOLOGA

Cada autoridad competente con capacidad para regular organismos y productos obtenidos por las tcnicas
recombinantes debe garantizar que la salud pblica y el medio ambiente estn protegidos de cualquier efecto
potencialmente perjudicial. Con el propsito de evaluar las solicitudes de licencia, las vacunas veterinarias
obtenidas mediante la tecnologa de ADNr pueden dividirse en tres grandes categoras. La divisin se basa en
las propiedades biolgicas de los productos y en los problemas de seguridad que presentan.
La Categora I est formada por los productos no viables o muertos que no representan un riesgo para el medio
ambiente y no presentan problemas de seguridad nuevos o inusuales. Dichos productos incluyen
microorganismos inactivados, ya sean completos o como subunidades, creados mediante la utilizacin de
tcnicas de ADNr.
Los productos de la Categora II contienen microorganismos vivos modificados mediante la insercin o
eliminacin de uno o ms genes. Los genes aadidos pueden codificar antgenos marcadores, enzimas u otros
subproductos bioqumicos. Los genes eliminados pueden codificar la virulencia, la oncogenicidad, los
marcadores antignicos, las enzimas u otros subproductos bioqumicos. La solicitud de autorizacin debe incluir
una caracterizacin de los segmentos de ADN aadidos o eliminados, as como una caracterizacin fenotpica
del organismo alterado. Las modificaciones genticas no deben repercutir en un aumento de la virulencia,
patogenicidad o supervivencia del organismo alterado en comparacin con la forma de tipo silvestre. Es
importante que la modificacin gentica no produzca el deterioro de las caractersticas de inocuidad del
organismo.
Los productos de la Categora III hacen uso de vectores vivos para transportar genes forneos, obtenidos por
tecnologa recombinante, que codifican antgenos inmunizantes. Los vectores vivos pueden llevar uno o ms
genes forneos que se ha demostrado que son eficaces para la inmunizacin de animales hospedadores diana.
El uso de vacunas de ADN que contienen genes forneos, obtenidos por tcnicas recombinantes, que codifican
agentes inmunizantes (vacunas de ADN plasmdico) constituye un nuevo enfoque para el desarrollo de vacunas.
La clasificacin adecuada de este tipo de producto de ADNr se establecer conforme se determinen las
propiedades biolgicas y sus caractersticas inocuas. Estas nuevas vacunas pueden tener aplicacin en una
variedad de situaciones mucho ms amplia que los productos convencionales. Las directrices para el desarrollo,
produccin, caracterizacin, y control de estos nuevos productos todava son preliminares y estn sujetas a
cambio a medida que se adquieren nuevos datos y conocimientos. La informacin relacionada con las ideas
actuales sobre las directrices reguladoras para las vacunas de ADN plasmdico se pueden encontrar en Internet
en las siguientes direcciones: http://www.fda.gov/cber/points.htm; http://www.cba.unige.it/VL/bio-info.html;
http://www.orcbs.msu.edu/biological/biolsaf.htm; http://www.pestlaw.com/index.html.
72
AUTORIZACIN DE PRODUCTOS DE ADNr VIVOS

La produccin de vacunas de ADNr y de ADN plasmdico vivas (Categoras II y III) para pruebas de campo o
para la distribucin general como un producto aprobado o autorizado puede tener un efecto importante en la
calidad del medio ambiente humano. Antes de que se autorice la produccin, los fabricantes de la vacuna deben
realizar una evaluacin de riesgos para valorar el impacto sobre el medio ambiente humano. En EE.UU., por
ejemplo, se ha adoptado un procedimiento que podra utilizarse como un sistema modelo en otros pases. La
Unin Europea ha adoptado un sistema similar. El procedimiento en cuestin se realiza de la siguiente forma:
La evaluacin de riesgos que se lleve a cabo debe contener la siguiente informacin: el objetivo y la necesidad
de la accin propuesta, las alternativas consideradas, una lista de las agencias gubernamentales, las
organizaciones y personas consultadas, y las consecuencias para el medio ambiente afectado y para el medio
ambiente potencial. Deben incluirse los siguientes temas: las caractersticas del organismo vacunal, los riesgos
para la salud humana, los riesgos para la salud de los animales diana y de los que no lo son, la persistencia en el
medio ambiente y el aumento de la virulencia.
Si la evaluacin de los riesgos por parte de las autoridades competentes demostrase que la referida liberacin al
medio ambiente de la vacuna recombinante destinada a ensayos de campo o a su distribucin general, no tiene
un impacto significativo sobre el medio ambiente, deber publicarse un anuncio y distribuirse al pblico dando a
conocer esto y que la evaluacin de riesgos y los hallazgos estn a disposicin del pblico para su revisin y
comentario. Si no se reciben comentarios de peso que refuten los hallazgos, las autoridades competentes
pueden autorizar las pruebas de campo o conceder la licencia o la aprobacin para su distribucin general.
La preparacin de una evaluacin de riesgos y los hallazgos hechos a partir de la misma pueden incluir tambin
la organizacin de una o ms reuniones pblicas, si una accin propuesta tiene trascendencia ecolgica o
pblica. Tales reuniones deben comunicarse a travs de un anuncio pblico. Se invitar a las personas
interesadas junto con el fabricante del producto y el personal del gobierno para que hagan propuestas. Las
transcripciones de dichas reuniones deben formar parte del archivo pblico.
Si en el desarrollo de una evaluacin de riesgos, las autoridades competentes concluyen que la accin propuesta
puede tener un efecto importante en el medio ambiente humano, debe prepararse una Declaracin de Impacto
Ambiental, DIA (Environmental Impact Statement, EIS). Dicha Declaracin ofrece un debate detallado e imparcial
de los impactos medioambientales significativos e informa a las personas que toman decisiones y al pblico de
las alternativas razonables que evitaran o minimizaran los impactos adversos. (Los documentos
medioambientales se consideran en el CFR Ttulo 40 parte 1508). Vanse tambin las Directivas 90/219/CEE y
90/220/CEE de la Unin Europea.
Los siguientes textos sugeridos contienen directrices sobre distintos aspectos de la produccin de vacunas.
A.
COMMISSION OF THE EUROPEAN COMMUNITIES (1999) The Rules Governing Medicinal Products in the
European Union. Eudralex. Volumes IVIX. Office Publications of the European Communities, 1999,
Luxembourg. See also EU Directives: 90/219/EEC 90/220/EEC and 92/18/EEC.
B.
COUNCIL OF EUROPE (2002). European Pharmacopoeia, Fourth Edition. Editions of the Council of Europe,
Strasbourg, France.
C.
ESPESETH D.A. (1993). Licensing Veterinary Biologics in the United States. The First Steps Towards an
International Harmonization of Veterinary Biologicals; and Free circulation of vaccines within the EEC.
Dev. Biol. Stand., 79, 1725.
D.
ESPESETH D.A. & GOODMAN J.B. (1993). Chapter 13. In: Licensing and Regulation in the USA. Vaccines for
Veterinary Application. Butterworth Heinemann, London, UK, 321342.
E.
GAY C.G. & ROTH H.J. (1994). Confirming the safety characteristics of recombinant vectors used in
veterinary medicine: a regulatory perspective. Recombinant vectors in vaccine development. Dev. Biol.
Stand., 82, 93105.
F.
ROTH H.J. & GAY C.G. (1996). Specific safety requirements for products derived from biotechnology. In:
Veterinary Vaccinology, Pastoret P.-P., Blancou J., Vannier P. & Verschueren C., eds. Elseviers Science
Publishers B.V. Amsterdam, The Netherlands.
73
G.
PASTORET P.P., BLANCOU J., VANNIER P. & VERSCHUEREN C.,

Science, Amsterdam, The Netherlands.
H.
UNITED STATES DEPARTMENT OF AGRICULTURE (USDA) (2000). Code of Federal Regulations, Title 9, Parts 1
199. US Government Printing Office, Washington DC, USA.
I.
USDA-APHIS -VETERINARY SERVICES-CENTER FOR VETERINARY BIOLOGICS (1999). Categories of Inspection

for Licensed Veterinary Biologics Establishments. Veterinary Services Memorandum No. 800.91. Center
th
for Veterinary Biologics, 510 S. 17 Street, Suite 104, Ames, Iowa 50010, USA.
J.
USDA-APHIS-VETERINARY SERVICES-CENTER FOR VETERINARY BIOLOGICS (1999). Veterinary Biological

Product Samples. Veterinary Services Memorandum No. 800.59. Center for Veterinary Biologics, 510 S.
th
17 Street, Suite 104, Ames, Iowa 50010, USA.
K.
USDA-APHIS- VETERINARY SERVICES-CENTER FOR VETERINARY BIOLOGICS (1995). Guidelines for Submission
of Materials in Support of Licensure. Veterinary Biologics Memorandum No. 800.84. Center for Veterinary
th
Biologics, 510 S. 17 Street, Suite 104, Ames, Iowa 50010, USA.
L.
USDA-APHIS-VETERINARY SERVICES-CENTER FOR VETERINARY BIOLOGICS (1995). Veterinary Biologics

General Licensing Considerations No. 800.200, Efficacy Studies. USDA-APHIS-Veterinary Biologics, 4700
River Road, Riverdale, Maryland 20737, USA.
M.

General Licensing Considerations No. 800.201, Back Passage Studies. Center for Veterinary Biologics,
th
510 S. 17 Street, Suite 104, Ames, Iowa 50010, USA.
N.
USDA-APHIS-VETERINARY SERVICES (19641994). Standard Assay Methods, Series 100900. National

Veterinary Services Laboratories, Ames, Iowa 50010, USA.
O.
USDA-APHIS- VETERINARY SERVICES-CENTER FOR VETERINARY BIOLOGICS (1984). Basic License

Requirements for Applicants. Veterinary Biologics Memorandum No. 800.50. Center for Veterinary
th
Biologics, 510 S. 17 Street, Suite 104, Ames, Iowa 50010, USA
P.
USDA-APHIS-VETERINARY SERVICES-CENTER FOR VETERINARY BIOLOGICS (1988). Guidelines for the

Preparation and Review of Labeling Materials. Veterinary Services Memorandum No. 800.54. Center for
th
Veterinary Biologics, 510 S. 17 Street, Suite 104, Ames, Iowa 50010, USA.
EDS
(1997). Veterinary Vaccinology. Elsevier
*
* *
74
United States Department of Agriculture (USDA), Animal and Plant Health Inspection Services (APHIS). USDA-APHISCENTER FOR VETERINARY BIOLOGICS HOME PAGE: http://www.aphis.usda.gov/vs/cvb/index.html
CAPTULO I.1.7.
PRINCIPIOS DE PRODUCCIN DE
VACUNAS VETERINARIAS
RESUMEN
La administracin fiable de vacunas puras, inocuas, potentes y eficaces es imprescindible para el
mantenimiento de la salud animal y el funcionamiento satisfactorio de los programas de salud
animal. La inmunizacin de animales con vacunas de gran calidad es el principal medio de control
de muchas enfermedades animales. En otros casos, las vacunas se emplean conjuntamente con el
control nacional de enfermedades o los programas de erradicacin.
Se pretende que los requisitos y procedimientos que se describen en este captulo sean de
carcter general y consistentes con los estndares publicados de los que se dispone normalmente
como gua en la produccin de vacunas veterinarias. El planteamiento para garantizar la calidad,
inocuidad, potencia y eficacia de las vacunas veterinarias puede variar de un pas a otro
dependiendo de las necesidades locales. Sin embargo, son imprescindibles estndares y controles
de produccin adecuados para asegurar la disponibilidad de productos uniformes de gran calidad
para el uso en programas de salud animal.
Como la patognesis y la epidemiologa de cada enfermedad vara, el papel y la eficacia de la
vacunacin como medio de control vara tambin de una enfermedad a otra. Algunas vacunas
pueden ser de gran eficacia, induciendo una inmunidad que no slo previene los sntomas de la
enfermedad, sino tambin la infeccin y la replicacin del agente causante de la enfermedad. Otras
vacunas pueden prevenir la enfermedad clnica, pero no la infeccin y/o el estado de desarrollo del
portador. En otros casos, la inmunizacin puede resultar completamente ineficaz o slo reducir la
severidad de la enfermedad. De esta forma, la decisin de recomendar la vacunacin como parte
de la estrategia de control de las enfermedades animales, requiere un conocimiento profundo de
las caractersticas del agente infeccioso y de su epidemiologa, as como de las caractersticas y
posibilidades de las diferentes vacunas disponibles. Adems, hay una preocupacin pblica
creciente por las implicaciones de la produccin y uso de vacunas veterinarias para el bienestar
animal. En cualquier caso, si se utilizan vacunas, un rendimiento satisfactorio requiere que stas
se fabriquen de forma que se garantice un producto uniforme y constante de gran calidad.
NOMENCLATURA
La nomenclatura para los productos biolgicos veterinarios vara de un pas a otro. Por ejemplo, en EE.UU el
trmino vacuna se utiliza para productos que contienen virus vivos o inactivados o protozoos, bacterias vivas o
cidos nucleicos. Dependiendo del tipo de antgeno que contienen, los productos con bacterias muertas y otros
microorganismos se identifican como bacterinas, extractos bacterianos, subunidades, toxoides bacterianos o
toxoides. Por ejemplo, a los productos que contienen componentes antignicos o inmunizantes de
microorganismos se les puede llamar subunidades o extractos bacterianos, y a los obtenidos a partir de la
inactivacin de toxinas se les llama toxoides. En la Unin Europea (UE), los productos mdicos veterinarios se
definen como productos administrados a animales para producir inmunidad activa o pasiva o para diagnosticar
el estado de inmunidad; vase Directiva 90/677/CEE. Sin embargo, en este captulo el trmino vacuna incluir
todos los productos diseados para estimular la inmunizacin activa de animales contra enfermedades, con
independencia del tipo de microorganismo o toxina microbiana que contengan o de los que stos puedan
derivarse. Este uso es ms coherente con la nomenclatura internacional. En esta revisin no se utilizar vacuna
con referencia a productos biolgicos recomendados para la inmunizacin pasiva, inmunoestimulacin,
tratamiento de alergias o diagnstico.
62
TIPOS O FORMAS DE VACUNAS

Las vacunas se pueden preparar como productos vivos o inactivados (muertos). Algunas vacunas vivas se
preparan a partir de los aislados de campo de baja virulencia, atenuados, de un agente causante de una
enfermedad, que cuando se administran por va no natural o bajo otras condiciones, en las que la exposicin a
los microorganismos inmuniza en vez de causar la enfermedad, se ha descubierto que son inocuos y eficaces.
Otras vacunas vivas se preparan de los aislados de los agentes causantes de enfermedades que han sido
modificados mediante el pase por animales de laboratorio, medios de cultivo, cultivos celulares o embriones
aviares, para seleccionar un aislado de virulencia reducida. El desarrollo de las tcnicas de ADN recombinante
(ADNr ha proporcionado algunas oportunidades nicas para la produccin de vacunas. En la actualidad, las
vacunas vivas modificadas se pueden producir de forma especfica mediante la eliminacin de los genes
relacionados con la virulencia en un microorganismo. Otras vacunas se producen por la introduccin de genes
que codifican antgenos inmunizantes especficos, en un microorganismo vector no virulento, a partir de un
microorganismo causante de una enfermedad. Se estn desarrollando vacunas mediadas por cido nucleico que
contienen ADN plasmdico. Normalmente, el cido nucleico se encuentra en forma de plsmido y codifica
antgenos inmunizantes a partir de microorganismos que causan enfermedades.
Los productos inactivados pueden contener: 1) Cultivos de microorganismos que han sido inactivados por
medios qumicos u otros medios; 2) Toxinas inactivadas; o 3) Subunidades (partes antignicas de
microorganismos) que se han extrado de cultivos o que se han producido mediante procedimientos de ADNr.
Tanto las vacunas vivas como las inactivadas se pueden formular con adyuvantes diseados para aumentar su
eficacia. Los adyuvantes tpicos son emulsiones de aceite en agua (simples o dobles), hechas con aceite mineral
o vegetal y un agente emulsionante. Tambin se utilizan otros adyuvantes como el gel de hidrxido de aluminio.
GARANTA DE CALIDAD
La produccin uniforme de vacunas de gran calidad, inocuas, potentes y eficaces requiere procedimientos de
garanta de calidad para asegurar la uniformidad y consistencia del proceso de produccin. Puesto que los
procesos de produccin de vacunas proporcionan una gran oportunidad para la variabilidad, se debe tener
cuidado en controlar sta en la medida de lo posible, utilizando, preferiblemente, procedimientos validados, y
proteger el producto de la contaminacin a lo largo de todas las etapas de produccin.
Deben garantizarse la calidad, inocuidad, potencia y eficacia de las vacunas mediante la consistencia durante el
proceso de produccin. En cada etapa debe desarrollarse la calidad constante del producto (uniformidad entre
lotes). El anlisis del producto final se utiliza como comprobacin para verificar que los controles en los
procedimientos de produccin se han mantenido intactos, y que el producto fabricado rene la especificacin
previamente acordada con la autoridad otorgante de la licencia.
Las autoridades reguladoras de los diferentes pases han desarrollado planteamientos diferentes para asegurar
la calidad de las vacunas. Aunque parecidos en su objetivo final, estos sistemas pueden variar en la importancia
que se da al control del proceso de produccin (estndares de proceso) en comparacin con el control mediante
el anlisis del producto final (estndares de eficacia). Los procedimientos de control seleccionados deben ser los
que mejor se ajusten a las condiciones bajo las que se estn produciendo las vacunas y deben, en la medida de
lo posible, cumplir con las prcticas correctas de fabricacin.
Los estndares y procedimientos de control establecidos para un producto determinan el riesgo o la posibilidad
de producir y poner en el mercado un producto intil, contaminado, peligroso o nocivo. El grado de riesgo
aceptable puede depender de los beneficios que se obtengan teniendo un producto disponible que evite las
muertes por enfermedad. De esta forma, los estndares pueden variar, de forma justificada, de un pas a otro, o
de un producto a otro, dependiendo de las condiciones de sanidad animal a nivel local. Sin embargo, las
autoridades controladoras deben esforzarse por establecer estndares y procedimientos de control que
garanticen un producto acabado de la mejor calidad, inocuidad, potencia y eficacia posibles.
El sistema de garanta de calidad ptimo deber abordar por igual los procedimientos de produccin y el anlisis
del producto final. Un sistema de seguridad absolutamente eficaz que no tenga el riesgo de elaborar un producto
insatisfactorio, sera, probablemente, demasiado caro con relacin al coste de produccin y al control. Las
autoridades reguladoras y los fabricantes de vacunas deben seleccionar los procedimientos de control que
puedan garantizar un nivel bajo de riesgo aceptable con relacin a ese peligro. Tales procedimientos, sin
embargo, no deben ser tan onerosos que impidan el desarrollo y la disponibilidad de los productos necesarios
para proporcionar un cuidado mdico preventivo a un coste que sea aceptable para el consumidor.
63
INSTALACIONES DE PRODUCCIN
Las instalaciones que se usan para la produccin de vacunas debern estar diseadas para proteger la pureza
del producto durante todo el proceso de produccin y la salud del personal. Se deben construir de forma que:
1) puedan limpiarse fcil y totalmente; 2) proporcionen una separacin adecuada de las cuartos de elaboracin;
3) tengan ventilacin adecuada; 4) tengan abundante agua limpia fra y caliente, y un drenaje y fontanera
eficientes; y 5) vestidores y otras instalaciones para el personal, a las que se acceda sin pasar por las zonas de
elaboracin del producto biolgico. Las instalaciones deben ser adecuadas para facilitar todas las funciones de
produccin, tales como el almacenamiento de los inculos maestros, los ingredientes y otros materiales de
produccin; la preparacin de los medios de cultivo y los cultivos celulares; la preparacin del material de vidrio y
de produccin; la inoculacin; la incubacin; la recoleccin de los cultivos; el almacenamiento de los materiales
en proceso; la inactivacin; la centrifugacin; la adicin del adyuvante y la formulacin del producto; el envasado,
la desecacin, el sellado de recipientes, el etiquetado y el almacenamiento del producto final; la comprobacin
del control de calidad de los materiales en proceso y del producto final; e investigacin y desarrollo.
Por lo general, se requieren zonas separadas para actividades diferentes. Todas las habitaciones y los sistemas
de manipulacin de aire deben construirse de forma que se evite la contaminacin cruzada por otros productos y
por las personas o el equipo. Los microorganismos virulentos o peligrosos se deben preparar y almacenar en
habitaciones separadas del resto del establecimiento. En concreto, los organismos en estudio deben estar
completamente separados de las cepas de las vacunas. Todo el equipo que entre en contacto con el producto
debe esterilizarse mediante procedimientos validados.
Las instalaciones de produccin tienen que disearse de tal forma que se evite la contaminacin del medio
ambiente. Cualquier material utilizado durante la produccin tiene que ser convertido en material seguro antes de
salir de la instalacin. Si se propagan microorganismos muy contagiosos, la salida del aire debe ser tratada para
impedir la fuga de los agentes infecciosos. El personal debe seguir los protocolos de seguridad tales como la
ducha, y evitar ponerse en contacto con animales sensibles despus de abandonar las instalaciones de
produccin.
Aunque la calidad y el diseo de las instalaciones de produccin pueden variar significativamente, deben cumplir
siempre con los estndares que se consideran apropiados para las vacunas que se van a producir. Por ejemplo,
los requisitos con respecto a las instalaciones para la produccin de vacunas de embriones de pollo
administradas por va oral, intranasal o intraocular pueden no ser tan exigentes como aqullos que se estipulan
para la produccin de vacunas de cultivos celulares administradas de forma subcutnea o intramuscular.
PLAN DE LAS INSTALACIONES

Para cada vacuna producida en una instalacin debe haber un plan de produccin detallado que describa donde
tendr lugar cada etapa del proceso de produccin. Este plan debe documentarse en un procedimiento operativo
estndar detallado (POE) o por un plano general (plano de planta) y la leyenda del plano. Cada habitacin del
establecimiento debe identificarse de forma individualizada, y deben especificarse, para cada una, todas las
funciones realizadas y los microorganismos implicados Tambin deben documentarse los procedimientos de
desinfeccin, de comprobacin del equipo y otros procedimientos usados en el funcionamiento de las
instalaciones para evitar la contaminacin o los errores durante la produccin. Este plan debe actualizarse
cuando se aadan nuevos productos a la instalacin, o cuando se realicen cambios o mejoras en los
procedimientos.
DOCUMENTACIN DEL PROCESO DE FABRICACIN

Tambin debe prepararse un perfil de produccin detallado, una serie de procedimientos operativos estndares,
y otros documentos que describan el protocolo para la produccin y el control de cada producto fabricado en un
establecimiento. Los criterios y estndares para los materiales de origen deben estar documentados de forma
clara y precisa. La documentacin debe tambin abordar asuntos tales como el historial del origen, aislamiento y
pases (subcultivos) de cada cepa; los mtodos para la identificacin y determinacin de la virulencia y la pureza;
el medio o el sistema de cultivo celular usado para los cultivos de siembra y de produccin, incluyendo los
mtodos utilizados para demostrar que los medios estn libres de contaminacin; el origen de los ingredientes de
procedencia animal; los mtodos de esterilizacin de medios; las condiciones de almacenamiento de lneas
celulares y de cultivos de siembra; el tamao y los tipos de recipientes utilizados para el crecimiento de los
cultivos; los mtodos para la preparacin de cultivos de siembra e inoculacin de cultivos de produccin; el
tiempo y las condiciones de incubacin; las observaciones durante el crecimiento; los criterios y las
especificaciones para la recoleccin exitosa del material; y las tcnicas de recoleccin. Tambin debe de haber
64
documentacin sobre las medidas tomadas por la empresa con objeto de minimizar el riesgo de contaminacin
de ingredientes de origen animal por encefalopatas espongiformes transmisibles (TSE; prin), y sobre los
procedimientos para garantizar que el suero bovino est libre de pestivirus. Asimismo, la documentacin debe
incluir: una descripcin de todas las pruebas realizadas para evaluar la pureza y la calidad del producto a lo largo
del proceso de proceso de produccin; cada etapa de la formulacin del producto final; las pruebas utilizadas
para la evaluacin de la calidad, inocuidad, potencia, y otros requisitos de cada lote de producto acabado; las
especificaciones para el acabado, incluyendo el empaquetamiento y etiquetado con las indicaciones completas y
las recomendaciones de uso, y la fecha de caducidad establecida para el producto.
Las directrices para la preparacin de dichos documentos con respecto a las vacunas veterinarias son
publicadas por las autoridades controladoras competentes. Esta documentacin tiene por finalidad definir el
producto y establecer sus especificaciones y estndares. Dicha documentacin deber servir, junto con los
planos generales y las leyendas de los planos (plan de produccin y los POE), de mtodo uniforme y constante
de elaboracin del producto que deber seguirse en la preparacin de cada lote.
MANTENIMIENTO DE REGISTROS
El productor debe establecer un sistema de mantenimiento de registros detallado capaz de rastrear la ejecucin
de las sucesivas etapas de la preparacin de cada producto biolgico. Los registros debern indicar la fecha en
la que se han dado cada uno de los pasos cruciales, el nombre de la persona que llev a cabo la tarea, la
identidad y cantidad de los ingredientes aadidos o retirados en cada etapa, y cualquier ganancia o prdida de
cantidad durante el curso de la preparacin. Se deben mantener registros de todas las pruebas realizadas a cada
lote. Todos los registros relacionados con un lote de producto debern guardarse al menos durante dos aos,
despus de la fecha de caducidad de la etiqueta. Adems, deber mantenerse un registro de todas las etiquetas
utilizadas en todos los productos, con cada etiqueta identificada en cuanto al nombre, nmero de producto,
nmero de licencia del producto, tamao del paquete, y nmero de identificacin de la etiqueta. Se debe dar
cuenta de todas las etiquetas impresas. Se deben guardar registros relacionados con los procedimientos de
esterilizacin y pasteurizacin. Normalmente, estos se llevan a cabo por medio de dispositivos automticos de
registro. El fabricante debe tambin conservar registros completos de todos los animales del establecimiento,
incluyendo datos sobre la salud del animal antes de su utilizacin en cualquier prueba, los resultados de las
pruebas realizadas, el tratamiento administrado, mantenimiento, necropsia y eliminacin.
INCULO MAESTRO
Para cada microorganismo utilizado en la fabricacin de un producto, debe establecerse un inculo maestro que
sirva de fuente de siembra para la inoculacin de todos los cultivos de produccin. Los cultivos de trabajo y los
de produccin se pueden preparar a partir del inculo maestro haciendo subcultivos; los cultivos de produccin
finales no deben tener ms de cinco pases (a veces diez) a partir del inculo maestro. En cada caso, se debe
determinar y disear el nmero de pases segn los datos. La utilizacin de un inculo maestro y la limitacin del
nmero de pases del microorganismo que se usa de siembra en la forma indicada, ayuda a mantener la
uniformidad y la consistencia en la produccin. Se debe mantener un registro del inculo maestro. El inculo
maestro debe componerse de un nico lote homogneo de inculo que se ha mezclado y envasado en
recipientes como un solo lote. El inculo maestro se debe congelar o desecar y almacenar a bajas temperaturas
tales como 40C o 70C, o bajo otras condiciones que se consideren ptimas para el mantenimiento de la
viabilidad. Cada inculo maestro se deber analizar para garantizar su identidad, inocuidad y eficacia. Tambin
se debe determinar la pureza mediante el correspondiente anlisis para garantizar que est libre de bacterias,
hongos, micoplasma y virus extraos.
BANCO DE CLULAS MAESTRO

Cuando se utilicen cultivos celulares para preparar un producto, debe establecerse un banco de clulas maestro
(MCS) para cada tipo de clula que se utilice. Debe mantenerse un registro del origen del banco de clulas
maestro. En el Perfil de Produccin o en el POE, se deben determinar y especificar, para cada producto, los
nmeros ms altos y bajos de pases de clulas. Algunas autoridades controladoras no permiten ms de 20 a
40 subcultivos. Cada MCS debe caracterizarse para garantizar su identidad, y su estabilidad gentica debe
demostrarse al hacer subcultivos a partir del pase ms alto y ms bajo utilizado para la produccin. La pureza de
los MCS debe establecerse mediante anlisis para asegurar que est libre de bacterias, hongos, micoplasma y
virus extraos.
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Clulas primarias
Se definen como un conjunto de clulas originales obtenidas de tejido normal, que incluye hasta el dcimo
subcultivo, utilizadas en la produccin de biolgicos. En el caso de productos para uso avcola, estas clulas se
obtienen, normalmente, a partir de huevos de pollo embrionados libres de patgenos, que tienen su origen en
una parvada sin vacunar, sujeta a control microbiolgico minucioso. Otras clulas primarias se derivan de tejidos
normales de animales sanos y se analizan con relacin a la contaminacin por una variedad de organismos tan
amplia como sea pertinente, incluyendo bacterias, hongos, micoplasmas, y agentes citopticos y/o
hemoadsorbentes y otros virus extraos. Algunas autoridades controladoras slo permiten el uso de clulas
primarias en casos excepcionales.
Huevos embrionados
Los huevos se utilizan con frecuencia en la produccin de biolgicos. En casi todos los casos, deben derivarse
de parvadas de pollos libres de patgenos especficos, que hayan sido controladas de forma exhaustiva con
relacin a agentes infecciosos y que no hayan sido vacunadas. La va de inoculacin del huevo y la eleccin del
material del huevo que se va a recolectar dependen del organismo concreto que est siendo propagado.
INGREDIENTES
Las especificaciones y el origen de todos los ingredientes de los productos deben estar definidos en el perfil de
produccin, en el POE, y en otros documentos apropiados. El perfil de produccin debe ser aprobado por una
agencia nacional expendedora de licencias. Todos los ingredientes de origen animal que no estn sujetos a
esterilizacin se deben analizar para garantizar que estn libres de bacterias, hongos, micoplasma y virus
extraos. Se debe conocer el pas de origen. La empresa adoptar medidas para minimizar el riesgo de
contaminacin de ingredientes de origen animal por TSE (prin). Algunas autoridades controladoras
desaconsejan el uso de conservantes o (ms importante) el uso de antibiticos como medio de controlar la
contaminacin accidental durante la produccin, y prefieren el uso de tcnicas aspticas estrictas para asegurar
la pureza. Sin embargo, a veces, permiten el uso de conservantes en recipientes multidosis para proteger el
producto durante el uso. Normalmente, estas autoridades controladoras limitan cualquier adicin de antibiticos
al lquido del cultivo celular y a otros medios, a los inculos de huevos, y al material recogido de piel o
posiblemente de otros tejidos, durante la elaboracin del producto. Normalmente, permiten el uso de no ms de
tres antibiticos en el mismo producto. Algunas autoridades controladoras tambin prohben el uso de penicilina
o estreptomicina en vacunas administradas mediante aerosol o de forma parenteral. Si los antibiticos utilizados
no estn recomendados para el uso en las especies a las que se destinan, deber demostrarse que aqullos no
tienen efectos dainos en los animales vacunados y que no tienen repercusin en la contaminacin de alimentos
derivados de los animales vacunados.
PRUEBAS DE EFICACIA
La eficacia de las vacunas veterinarias deber demostrarse mediante estudios estadsticos vlidos de la
vacunacin en prueba en el animal hospedador utilizando los animales ms jvenes a los que ha de
recomendarse el producto. En cada especie animal, los datos deben apoyar la eficacia de la vacuna en cada
rgimen de vacunacin que se describe en la etiqueta de recomendacin del producto, incluyendo los estudios
sobre el comienzo de la proteccin cuando en la etiqueta del producto se haga referencia a dicho comienzo y a la
duracin de la inmunidad. Las pruebas se realizarn bajo condiciones controladas, comenzando, siempre que
sea posible, con animales seronegativos. En lugares en los que se disponga de las pruebas de potencia
validadas, pueden ser innecesarios los estudios de la vacunacin que se prueba en las especies a las que va
destinada, si se dispone de los resultados de prediccin de las pruebas serolgicas. En la medida de lo posible,
debe fomentarse la aplicacin de procedimientos para reemplazar, reducir y refinar los ensayos con animales (la
regla de las tres R).
Los estudios de eficacia deben realizarse con el producto final de la vacuna, elaborada a partir del inculo
maestro con el nmero de pases ms alto permitido en el perfil de produccin, o en otra documentacin del
proceso de fabricacin. En dicha documentacin, se habr especificado la cantidad mnima de antgeno por
dosis que debe haber en el producto final durante todo el tiempo de validez autorizado. El nivel de antgeno por
dosis en la vacuna ensayada para averiguar su eficacia, debe estar en esta cantidad mnima o por debajo. El
mtodo de estudio exacto y los criterios para determinar la proteccin varan con el agente inmunizante y deben
estandarizarse siempre que sea posible.
Los estudios de la eficacia de campo se pueden utilizar para determinar la eficacia cuando no sean posibles los
estudios significativos de la vacunacin en prueba. Sin embargo, normalmente, es ms difcil obtener datos
66
estadsticos significativos para demostrar la eficacia bajo las condiciones de campo. Los protocolos para los
estudios de campo son ms complejos, y se debe poner cuidado en establecer los controles adecuados con el fin
de garantizar la validez de los datos. Incluso cuando se disean adecuadamente, los estudios de la eficacia de
campo pueden no resultar concluyentes debido a condiciones externas incontrolables. Algunos problemas
implican: niveles de desafo variables una incidencia baja de la enfermedad en controles sin vacunar y la
exposicin a otros microorganismos causantes de una enfermedad similar. Por lo tanto, para establecer la
eficacia de algunos productos, pueden necesitarse los datos de la eficacia de los estudios de campo y de los del
laboratorio.
PRUEBAS DE INTERFERENCIA
Para los productos con ms de dos componentes antignicos, las pruebas deben confirmar que no hay
interferencia entre los componentes individuales, es decir, que un componente no cause una disminucin en la
respuesta inmunolgica protectora de otro componente. La comprobacin de la interferencia debe realizarse para
cada combinacin de productos antes de su aprobacin.
Se puede producir tambin una prdida de potencia cuando el agente residual de la inactivacin de un producto
lquido muerto, utilizado como diluyente para una fraccin viva disecada, reduce la viabilidad de los organismos
vivos debido a la actividad viricida y bactericida. Cada lote de vacuna muerta lquida que vaya a utilizarse como
diluyente para vacunas vivas debe, por lo tanto, comprobarse para su actividad viricida y bactericida antes de su
puesta en el mercado.
Tambin hay que prestar atencin a la posible interferencia entre dos vacunas diferentes del mismo fabricante,
que se recomienda que sean suministradas al mismo animal en un perodo de dos semanas.
PRUEBAS SOBRE EL INCREMENTO DE LA VIRULENCIA

Con las vacunas vivas existe la preocupacin de que el organismo pueda ser excretado por el hospedador y
transmitirse a animales en contacto, causando enfermedades, si aqul conserva una virulencia residual o revierte
a la virulencia. Por lo tanto, todas las vacunas vivas se deben examinar para la reversin a la virulencia mediante
estudios de pases. Los organismos vacunales se propagan in vivo por inoculacin de un grupo de animales
diana con el inculo maestro, utilizando normalmente la va natural de infeccin para ese organismo. El
organismo vacunal se recupera de los tejidos o excreciones y se utiliza directamente para inocular un nuevo
grupo de animales, y as sucesivamente. Despus de no menos de cinco pases (ms si se trata de productos
avcolas), el aislado debe caracterizarse completamente utilizando los mismos procedimientos que para
caracterizar el inculo maestro. El organismo vacunal debe conservar un nivel aceptable de atenuacin tras la
propagacin de esta forma.
EVALUACIN DEL RIESGO PARA EL MEDIO AMBIENTE

Debe estimarse la capacidad de cada vacuna viva para abandonar el hospedador, para propagarse, para entrar
en contacto con animales diana y los que no lo son, y para persistir en el medio ambiente, con el fin de facilitar
informacin para evaluar el riesgo de la vacuna para el medio ambiente.
En algunos casos esto se puede hacer junto con los ensayos de reversin a la virulencia.
CONSISTENCIA EN LA PRODUCCIN
Antes de la aprobacin de comercializacin de cualquier producto nuevo, cada establecimiento deber producir
en sus instalaciones tres lotes de producto completo para evaluar la consistencia en la produccin. Estos lotes
debern prepararse segn los procedimientos descritos en el perfil de produccin y en los planos generales y
leyendas, en los procedimientos operativos estndares y en otra documentacin del proceso de fabricacin. El
tamao de cada uno de los tres lotes debe ser, al menos, un tercio del tamao medio del lote que se producir
una vez que el producto est en produccin.
El fabricante debe comprobar cada uno de estos tres lotes en cuanto a su calidad, inocuidad y potencia, como se
estipula en el perfil de produccin o en otra documentacin del proceso de fabricacin. Se pueden utilizar los
requisitos normalizados aplicables y los procedimientos de ensayo, por ejemplo, los descritos en el CFR (Cdigo
federal de regulaciones) Ttulo 9 parte 113, en la Directiva 92/18/CEE de la Unin Europea, en la Farmacopea
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europea, o como se describe en este Manual. Antes de la aprobacin de la fabricacin del producto en las
instalaciones y de la aprobacin para su comercializacin, los tres lotes deben mostrar resultados satisfactorios
en los ensayos. Todos los lotes sucesivos deben dar resultados satisfactorios al comprobarse de la misma forma
antes de la aprobacin para su comercializacin.
PRUEBAS DE POTENCIA
Las pruebas de potencia, exigidas para cada lote antes de su aprobacin, se disean para que guarden relacin
con los estudios de eficacia de la vacunacin ensayada en el animal hospedador. Para los productos vricos o
bacterianos inactivados, las pruebas de potencia se pueden realizar en el laboratorio o en animales
hospedadores, o por mtodos cuantitativos in vitro. Normalmente, la potencia de las vacunas vivas se estima
mediante recuentos bacterianos o titulacin de virus.
Cuando se ensaya una vacuna bacteriana viva para su aprobacin, el recuento de bacterias debe ser bastante
mayor que el recuento que se demuestra que es realmente protector en la prueba de inmunogenicidad (eficacia)
del inculo maestro, con el fin de garantizar que, en cualquier momento antes de la fecha de caducidad, el
recuento ser, al menos, igual al manejado en la prueba de inmunogenicidad. Cuando se prueba una vacuna
vrica viva para su aprobacin, la titulacin del virus tiene que ser, como norma general, bastante mayor que la
que se demuestra que es protectora en la prueba de inmunogenicidad del inculo maestro para garantizar que,
en cualquier momento antes de la fecha de caducidad, el ttulo ser, al menos, igual al manejado en la prueba de
inmunogenicidad. Algunas autoridades controladoras especifican que se hagan recuentos bacterianos o vricoses
ms altos que los referidos anteriormente. Es evidente que el ttulo adecuado para la aprobacin depende, en
primer lugar, de la potencia requerida y, en segundo lugar, de la velocidad de desaparicin de las bacterias o los
virus en la vacuna, como se indica mediante las pruebas de estabilidad.
Los requisitos estndares han sido desarrollados y publicados por las autoridades competentes con relacin a
las pruebas de potencia de diversas vacunas. Estas pruebas se pueden encontrar en el CFR Ttulo 9 parte 113,
en la Farmacopea europea y en este Manual.
PRUEBAS DE ESTABILIDAD
Para establecer la validez de la fecha de caducidad que aparece en el paquete del producto, son necesarios los
estudios de estabilidad (basados en una prueba aceptable de potencia). Para estimar la estabilidad con el fin de
establecer una fecha provisional de caducidad, un producto nuevo se puede someter a pruebas de estabilidad
aceleradas, por ejemplo, incubndolo a 37C durante 1 semana por cada ao de validez. Dichas estimaciones
deben confirmarse en tres lotes diferentes al menos, mediante pruebas de potencia peridicas en tiempo real,
durante el perodo de tiempo indicado por la fecha de caducidad, y entre 3 y 6 meses despus. Para los
productos que contengan organismos viables, las pruebas debern hacerse en la fecha de aprobacin de
comercializacin y en la fecha de caducidad aproximada, hasta que se fije un valor estadsticamente vlido. Para
los productos con organismos no viables, cada lote que se presente para su autorizacin se probar en la fecha
de aprobacin de comercializacin, y en/despus de la fecha de caducidad exigida. Algunas autoridades tambin
solicitan una prueba intermedia. Si al final del perodo fechado (perodo de validez), se prueba el producto y se
encuentra que an est por encima de la calidad de aprobacin, se puede considerar la ampliacin del perodo
de validez indicado, mediante la solicitud a la autoridad controladora. El anlisis de la estabilidad, tambin
proporciona la oportunidad para probar la humedad residual y otros parmetros importantes, tales como la
estabilidad de las emulsiones adyuvantes.
PRUEBAS DE INOCUIDAD
La inocuidad intrnseca de una vacuna deber demostrarse al comienzo de la etapa de desarrollo. Se deben
evaluar las vacunas vivas mediante pruebas de incremento de la virulencia y mediante la valoracin del riesgo
medioambiental, tal como se ha dicho ms arriba. Deben evaluarse las vacunas obtenidas mediante
biotecnologa, tal como se argument a propsito de la clasificacin de esas vacunas y la puesta en circulacin
de vacunas vivas ADNr, a las que nos referimos ms adelante. Los estudios de seguridad incluirn la inocuidad
de una dosis nica, de una sobredosis, y de dosis nicas repetidas. Las pruebas de inocuidad para la aprobacin
de un lote se describen en el CFR Ttulo 9 parte 113, en la Farmacopea europea, en este Manual y en otros
sitios. Los procedimientos estndares se aplican a las pruebas de inocuidad con ratones, cobayas, gatos, perros,
caballos, cerdos y ovejas. Los productos pueden requerir ms de un tipo de pruebas de inocuidad. La prueba de
inocuidad exigida para un producto avcola se describe en los requisitos estndares o en el perfil de produccin
especfico para dicho producto. Por regla general, se necesitan estudios de sobredosis para todas las vacunas:
68
10 para vacunas vivas y 2 para las inactivadas (si esto no es factible, puede obtenerse confirmacin de la
inocuidad a partir de los datos de las pruebas de potencia).
Para los productos vricoses inactivados, en los que se utilizan animales hospedadores para las pruebas de
potencia, la inocuidad se puede determinar mediante la inspeccin diaria de las vacunaciones durante el perodo
previo de estudio de las pruebas de potencia. De los estudios de reversin a la virulencia en productos vivos
modificados (analizados anteriormente) y de las pruebas de inocuidad de campo (analizados ms adelante), se
obtienen pruebas adicionales de la inocuidad de los productos, pero dichas pruebas no son necesarias para cada
lote.
PRUEBAS DE PUREZA
La pureza se determina mediante el anlisis de una variedad de contaminantes. Las pruebas para detectar los
contaminantes se realizan en los inculos maestros, en las clulas primarias, en los bancos de MCS, en los
ingredientes de origen animal si no se someten a esterilizacin (por ejemplo, suero fetal bovino, albmina bovina
o tripsina), y en cada lote del producto final antes de su aprobacin.
En el CFR Ttulo 9 parte 113, en la Directiva 92/18/CEE de la Unin Europea, en la Farmacopea europea o en
este Manual se han publicado los procedimientos de las pruebas de pureza para la deteccin de virus, bacterias,
micoplasma y hongos extraos, incluyendo, por ejemplo, la Salmonella, la Brucella, los agentes clamidiales, los
virus hemoaglutinantes, la leucosis linfoide aviar, los patgenos detectados mediante una prueba de inoculacin
en embriones de pollo, la coriomeningitis linfoctica, los agentes citopticos y hemoadsorbentes, y los patgenos
detectados por el enzimoinmunoensayo, la reaccin en cadena de la polimerasa o la tcnica del anticuerpo
fluorescente. Debera prestarse mucha atencin, acompaando la documentacin pertinente, a los
procedimientos utilizados para asegurarse de que el suero fetal bovino y otros ingredientes de origen bovino
estn libres de pestivirus. Las pruebas que se van a utilizar para asegurar la pureza varan segn la naturaleza
del producto y deben especificarse en el perfil de produccin o en otra documentacin del proceso de
fabricacin. Puesto que no se han desarrollado pruebas para la deteccin de la encefalopata espongiforme
bovina en ingredientes de origen animal, los fabricantes de vacunas deberan documentar en el perfil de
produccin o SOPs las medidas tomadas para minimizar el riesgo de dicha contaminacin en ingredientes de
origen animal, tales como: verificacin de que todos los ingredientes de origen animal del establecimiento de
produccin provienen de pases que estn libres de la encefalopata espongiforme bovina.
OTRAS PRUEBAS
Dependiendo de la forma en la que se fabrique la vacuna, se puede sugerir la realizacin de ciertas pruebas que
debern especificarse como pertinentes en el perfil de produccin o en otra documentacin del proceso de
fabricacin. Estas pruebas pueden relacionarse con el nivel de humedad que hay en los productos desecados, el
nivel residual de inactivacin de los productos muertos, la inactivacin completa de los productos muertos, el pH,
el nivel de conservantes y antibiticos permitido, la estabilidad fsica de los adyuvantes, la retencin del vaco en
los productos desecados y un examen fsico general de la vacuna final. Las pruebas para estos objetivos se
pueden tambin encontrar en el CFR Ttulo 9 parte 113, en la Directiva 92/18/CEE de la Unin Europea, en la
Farmacopea europea o en este Manual.
MUESTREO
Las muestras deben seleccionarse de cada lote del producto. El seleccionador elegir envases finales
representativos de cada lote y los almacenar a la temperatura de almacenamiento recomendada en la etiqueta.
El fabricante guardar estas muestras de reserva a la temperatura de almacenamiento recomendada durante
6 meses despus de la fecha de caducidad que aparece en la etiqueta, de forma que estn disponibles para
facilitar la evaluacin de la causa de cualquier problema de campo que se presente por el uso de la vacuna. Las
muestras deberan guardarse en una zona de almacenaje segura.
ETIQUETADO
Los estndares para el etiquetado de los productos variarn de un pas a otro; sin embargo, las indicaciones de
la etiqueta y todas las afirmaciones que se hacen en sta debern estar respaldadas por datos relevantes que
hayan sido revisados y aprobados por las autoridades competentes. Se recomienda que todas las etiquetas para
69
las vacunas veterinarias contengan la siguiente informacin, aunque en el caso de los envases muy pequeos,
sus etiquetas remitan a la etiqueta del envase o a un prospecto adjunto para la informacin menos importante:
1.
Denominacin exacta del producto, con letras visibles y con igual nfasis en cada letra.
2.
Nombre y direccin del fabricante (y tambin del importador en el caso de los productos importados).
3.
Temperatura de almacenamiento recomendada.
4.
Una declaracin de que el producto es para uso exclusivo veterinario (o animal). Instrucciones de uso
completas, incluyendo todas las advertencias requeridas.
5.
En el caso de los animales destinadas a la alimentacin, una declaracin indicando que los animales no
debern ser vacunados dentro de un nmero especfico de das antes del sacrificio. Esto depender de
las vacunas (por ejemplo, el tipo de adyuvante) y no se requiere para todos los productos.
6.
Fecha de caducidad.
7.
Nmero de lote por el que se identifica el producto en el registro de fabricacin del productor.
8.
Nmero de autorizacin del producto. En algunos pases se sustituye por el nmero de licencia del
establecimiento o del fabricante.
9.
Cantidad recuperable y nmero de dosis.
10.
Declaracin de que el contenido total de un vial multidosis se usar cuando se abra ste por primera vez
(o con un tiempo de almacenamiento temporal adecuado para ciertos productos, cuando est respaldado
por los datos) y que las porciones no utilizadas debern eliminarse de forma adecuada.
11.
Una advertencia de seguridad para el operador, si se considera oportuno, en el caso, por ejemplo, de una
autoinyeccin accidental con la emulsin de aceite de las vacunas.
12.
Cuando se aade un antibitico a una vacuna durante el proceso de produccin, en el cartn o embalaje
utilizados debe figurar la expresin Contiene (nombre del antibitico) como conservante u otra similar. Si
no se utiliza cartn, esa informacin debe aparecer en la etiqueta del recipiente final.
Las etiquetas pueden incluir tambin otras declaraciones objetivas que no sean falsas o engaosas. Tambin
deben indicar, siempre que sea procedente, las restricciones especiales con relacin al empleo o manejo del
producto.
Tambin se facilitar informacin similar en una hoja de datos del producto que se proporciona como un
prospecto. sta contendr tambin muchos ms detalles sobre el mtodo de empleo y las posibles reacciones
adversas.
PRUEBAS DE CAMPO (INOCUIDAD Y EFICACIA)

Todos los productos biolgicos veterinarios administrados a animales debern probarse en cuanto a su inocuidad
y a su eficacia en el campo, si es posible, utilizando las buenas prcticas clnicas antes de su autorizacin para
uso general. Los estudios de campo estn diseados para demostrar la eficacia en las condiciones de trabajo, y
para detectar reacciones inesperadas, incluida la mortalidad, que pueden no haberse observado durante el
desarrollo del producto. En las condiciones de campo, hay muchas variables incontroladas que hacen difcil
obtener buenos datos de eficacia, pero la demostracin de inocuidad es ms fiable. Las pruebas se deben hacer
en el organismo hospedador y en diferentes zonas geogrficas, utilizando grandes cantidades de animales
susceptibles. Los animales en estudio deben representar todas las edades y prcticas de cra para los que est
indicado el producto. Deben incluirse controles sin vacunar. Se deben analizar uno o ms lotes de produccin.
Se debe desarrollar un protocolo que indique los mtodos de observacin y de registro.
INSPECCIN DE LAS INSTALACIONES DE PRODUCCIN

Los establecimientos que estn autorizados para producir biolgicos veterinarios deben estar sometidos a
inspecciones minuciosas de todo el local por parte de las autoridades competentes nacionales que garanticen la
conformidad con el perfil de produccin y los planos generales y las leyendas, los POE u otra documentacin del
proceso de fabricacin. Estas inspecciones pueden incluir asuntos como las cualificaciones del personal; el
mantenimiento de un registro; las condiciones de salubridad general y estndares de laboratorio; las actividades
de investigacin sobre los productos que se estn desarrollando; los procedimientos de produccin; el
funcionamiento de los esterilizadores, pasteurizadores, incubadores y refrigeradores; el envasado; la desecacin;
y los procedimientos de acabado; el cuidado y control de los animales; los procedimientos de anlisis; la
distribucin y la comercializacin; y la destruccin del producto. Es deseable que tengan prcticas correctas de
70
fabricacin (para la fabricacin) y prcticas correctas de laboratorio (para el anlisis de la garanta de calidad).
(Vase el Captulo I.1.2 para las directrices).
Los inspectores prepararn un informe detallado documentando los hallazgos de la inspeccin y planteando las
medidas que el establecimiento debe tomar para mejorar los procesos de produccin. El establecimiento debe
recibir una copia del informe. Se deber realizar una inspeccin complementaria cuando sea necesario, con el fin
de determinar si se han tomado las medidas apropiadas para corregir las deficiencias. Se necesita una
evaluacin continuada para garantizar que las instalaciones de produccin continan operativas de una forma
aceptable. Las inspecciones peridicas tambin fomentan las mejoras continuas en los procedimientos de
produccin y las instalaciones son coherentes con los avances de la tecnologa.
CONTROL PREVIO A LA COMERCIALIZACIN

Antes de la aprobacin, el fabricante debe comprobar cada lote en cuanto a su calidad, inocuidad y potencia as
como realizar otra serie de pruebas para ese producto, detalladas en el perfil de produccin de la compaa o en
otra documentacin del proceso de produccin. En los pases que tienen programas nacionales reguladores, que
incluyen comprobar los anlisis del producto final, muestras de cada lote deben remitirse para su anlisis en los
laboratorios gubernamentales por parte de las autoridades competentes. Si se obtienen resultados no
satisfactorios en las pruebas realizadas bien por el fabricante o por las autoridades competentes, el lote no debe
aprobarse. En tales casos, se debe dar prioridad para la comprobacin de los anlisis de los sucesivos lotes del
producto por las autoridades competentes.
ACTUALIZACIN DEL PERFIL DE PRODUCCIN

Antes de cambiar los procedimientos de produccin, debe cambiarse el correspondiente perfil de produccin u
otra documentacin del proceso de produccin. Los establecimientos debern tener procedimientos internos de
revisin para evaluar todos los cambios en la produccin antes de que se inicien tales cambios. Los cambios
debern ser tambin revisados y aprobados por las autoridades competentes antes de su ejecucin. En los
casos en los que se altere una etapa significativa de la produccin, las revisiones pueden requerir datos
adicionales que respalden la pureza, inocuidad, potencia, y/o eficacia del producto. En los pases con programas
reguladores que incluyen la comprobacin de los anlisis del producto final en los laboratorios nacionales, las
revisiones debern implicar el anlisis del nuevo producto por parte de las autoridades competentes.
SEGUIMIENTO DE LA EFICACIA
Debe pedirse a los fabricantes que mantengan un sistema de notificacin de reacciones adversas y un
mecanismo eficaz para la pronta retirada del producto, que se someter a la auditoria. En muchos pases el
fabricante debe notificar inmediatamente todas las reacciones adversas a la autoridad reguladora, junto con la
medida correctiva tomada. Una alternativa utilizada en muchos pases es que si en algn momento surgen
indicaciones o interrogantes sobre la pureza, inocuidad, potencia o eficacia del producto, o parece que puede
haber algn problema relativo a la preparacin, ensayo o distribucin del producto, el fabricante debe comunicar
de inmediato a la autoridad reguladora tales circunstancias y las medidas que se han tomado.
Despus de la aprobacin de comercializacin de un producto, las autoridades competentes deben hacer un
seguimiento de la eficacia bajo las condiciones de campo. Las quejas del consumidor pueden servir como fuente
de informacin; sin embargo, dicha informacin tiene que ser investigada para determinar si las observaciones
de las que se informa se relacionan con el uso del producto. Se debe informar a los usuarios de las vacunas
veterinarias de los procedimientos adecuados para hacer las reclamaciones. Las autoridades competentes
deben informar al fabricante del producto de todas las reclamaciones recibidas. Deben confirmar tambin si han
recibido otras reclamaciones relacionadas con dicho producto y, de ser as, si el fabricante ha tomado las
mediadas oportunas. Si es necesario, los laboratorios de control pueden analizar muestras del lote del producto
implicado.
Cuando la investigacin est completa, debe prepararse un informe final y debe enviarse un resumen de los
hallazgos al reclamante y al fabricante. Cuando se determine que un producto est causando graves problemas,
deben tomarse medidas urgentes para retirar el producto del mercado y notificarlo a las autoridades de sanidad
animal.
71
CUMPLIMIENTO
Los programas nacionales establecidos para garantizar la calidad, la inocuidad, la potencia y la eficacia de las
vacunas veterinarias deben tener la autoridad legal suficiente para garantizar el cumplimiento de las condiciones
de registro del producto y otros requisitos del programa. El objetivo debe ser conseguir un cumplimiento
voluntario de los requisitos reguladores establecidos. Sin embargo, cuando aqullos se incumplen, las
autoridades competentes deben tener la autoridad legal suficiente para proteger la salud animal. Puede resultar
inestimable para este propsito el que haya una autoridad para la retencin, incautacin y expropiacin de los
productos que se consideren intiles, contaminados, peligrosos o dainos. Al amparo de dicha autoridad, el
producto puede ser retenido por un tiempo, y si durante el mismo no se logra el cumplimiento de los requisitos,
las autoridades competentes pueden solicitar un mandato judicial o un auto de incautacin y expropiacin.
Tambin tendr que haber una autoridad que pueda retirar o suspender la licencia del establecimiento y/o la
licencia del producto y que pueda obtener un requerimiento judicial para detener la venta del producto. Tambin
pueden ser necesarias las multas administrativas o el enjuiciamiento penal en caso de incumplimientos graves y
deliberados.
AUTORIZACIN DE PRODUCTOS OBTENIDOS MEDIANTE BIOTECNOLOGA

Los recientes avances en biotecnologa han hecho posible el desarrollo y la comercializacin de nuevos
productos biolgicos con propiedades antignicas y diagnsticas. Muchos de tales productos han sido
autorizados y aprobados, y muchos estn siendo elaborados. Los productos de la tecnologa del ADN
recombinante no se diferencian bsicamente de los productos convencionales. Por lo tanto, las leyes y
regulaciones existentes son aplicables en su totalidad a estos nuevos productos.
CLASIFICACIN DE LAS VACUNAS OBTENIDAS MEDIANTE BIOTECNOLOGA

Cada autoridad competente con capacidad para regular organismos y productos obtenidos por las tcnicas
recombinantes debe garantizar que la salud pblica y el medio ambiente estn protegidos de cualquier efecto
potencialmente perjudicial. Con el propsito de evaluar las solicitudes de licencia, las vacunas veterinarias
obtenidas mediante la tecnologa de ADNr pueden dividirse en tres grandes categoras. La divisin se basa en
las propiedades biolgicas de los productos y en los problemas de seguridad que presentan.
La Categora I est formada por los productos no viables o muertos que no representan un riesgo para el medio
ambiente y no presentan problemas de seguridad nuevos o inusuales. Dichos productos incluyen
microorganismos inactivados, ya sean completos o como subunidades, creados mediante la utilizacin de
tcnicas de ADNr.
Los productos de la Categora II contienen microorganismos vivos modificados mediante la insercin o
eliminacin de uno o ms genes. Los genes aadidos pueden codificar antgenos marcadores, enzimas u otros
subproductos bioqumicos. Los genes eliminados pueden codificar la virulencia, la oncogenicidad, los
marcadores antignicos, las enzimas u otros subproductos bioqumicos. La solicitud de autorizacin debe incluir
una caracterizacin de los segmentos de ADN aadidos o eliminados, as como una caracterizacin fenotpica
del organismo alterado. Las modificaciones genticas no deben repercutir en un aumento de la virulencia,
patogenicidad o supervivencia del organismo alterado en comparacin con la forma de tipo silvestre. Es
importante que la modificacin gentica no produzca el deterioro de las caractersticas de inocuidad del
organismo.
Los productos de la Categora III hacen uso de vectores vivos para transportar genes forneos, obtenidos por
tecnologa recombinante, que codifican antgenos inmunizantes. Los vectores vivos pueden llevar uno o ms
genes forneos que se ha demostrado que son eficaces para la inmunizacin de animales hospedadores diana.
El uso de vacunas de ADN que contienen genes forneos, obtenidos por tcnicas recombinantes, que codifican
agentes inmunizantes (vacunas de ADN plasmdico) constituye un nuevo enfoque para el desarrollo de vacunas.
La clasificacin adecuada de este tipo de producto de ADNr se establecer conforme se determinen las
propiedades biolgicas y sus caractersticas inocuas. Estas nuevas vacunas pueden tener aplicacin en una
variedad de situaciones mucho ms amplia que los productos convencionales. Las directrices para el desarrollo,
produccin, caracterizacin, y control de estos nuevos productos todava son preliminares y estn sujetas a
cambio a medida que se adquieren nuevos datos y conocimientos. La informacin relacionada con las ideas
actuales sobre las directrices reguladoras para las vacunas de ADN plasmdico se pueden encontrar en Internet
en las siguientes direcciones: http://www.fda.gov/cber/points.htm; http://www.cba.unige.it/VL/bio-info.html;
http://www.orcbs.msu.edu/biological/biolsaf.htm; http://www.pestlaw.com/index.html.
72
AUTORIZACIN DE PRODUCTOS DE ADNr VIVOS

La produccin de vacunas de ADNr y de ADN plasmdico vivas (Categoras II y III) para pruebas de campo o
para la distribucin general como un producto aprobado o autorizado puede tener un efecto importante en la
calidad del medio ambiente humano. Antes de que se autorice la produccin, los fabricantes de la vacuna deben
realizar una evaluacin de riesgos para valorar el impacto sobre el medio ambiente humano. En EE.UU., por
ejemplo, se ha adoptado un procedimiento que podra utilizarse como un sistema modelo en otros pases. La
Unin Europea ha adoptado un sistema similar. El procedimiento en cuestin se realiza de la siguiente forma:
La evaluacin de riesgos que se lleve a cabo debe contener la siguiente informacin: el objetivo y la necesidad
de la accin propuesta, las alternativas consideradas, una lista de las agencias gubernamentales, las
organizaciones y personas consultadas, y las consecuencias para el medio ambiente afectado y para el medio
ambiente potencial. Deben incluirse los siguientes temas: las caractersticas del organismo vacunal, los riesgos
para la salud humana, los riesgos para la salud de los animales diana y de los que no lo son, la persistencia en el
medio ambiente y el aumento de la virulencia.
Si la evaluacin de los riesgos por parte de las autoridades competentes demostrase que la referida liberacin al
medio ambiente de la vacuna recombinante destinada a ensayos de campo o a su distribucin general, no tiene
un impacto significativo sobre el medio ambiente, deber publicarse un anuncio y distribuirse al pblico dando a
conocer esto y que la evaluacin de riesgos y los hallazgos estn a disposicin del pblico para su revisin y
comentario. Si no se reciben comentarios de peso que refuten los hallazgos, las autoridades competentes
pueden autorizar las pruebas de campo o conceder la licencia o la aprobacin para su distribucin general.
La preparacin de una evaluacin de riesgos y los hallazgos hechos a partir de la misma pueden incluir tambin
la organizacin de una o ms reuniones pblicas, si una accin propuesta tiene trascendencia ecolgica o
pblica. Tales reuniones deben comunicarse a travs de un anuncio pblico. Se invitar a las personas
interesadas junto con el fabricante del producto y el personal del gobierno para que hagan propuestas. Las
transcripciones de dichas reuniones deben formar parte del archivo pblico.
Si en el desarrollo de una evaluacin de riesgos, las autoridades competentes concluyen que la accin propuesta
puede tener un efecto importante en el medio ambiente humano, debe prepararse una Declaracin de Impacto
Ambiental, DIA (Environmental Impact Statement, EIS). Dicha Declaracin ofrece un debate detallado e imparcial
de los impactos medioambientales significativos e informa a las personas que toman decisiones y al pblico de
las alternativas razonables que evitaran o minimizaran los impactos adversos. (Los documentos
medioambientales se consideran en el CFR Ttulo 40 parte 1508). Vanse tambin las Directivas 90/219/CEE y
90/220/CEE de la Unin Europea.
Los siguientes textos sugeridos contienen directrices sobre distintos aspectos de la produccin de vacunas.
A.
COMMISSION OF THE EUROPEAN COMMUNITIES (1999) The Rules Governing Medicinal Products in the
European Union. Eudralex. Volumes IVIX. Office Publications of the European Communities, 1999,
Luxembourg. See also EU Directives: 90/219/EEC 90/220/EEC and 92/18/EEC.
B.
COUNCIL OF EUROPE (2002). European Pharmacopoeia, Fourth Edition. Editions of the Council of Europe,
Strasbourg, France.
C.
ESPESETH D.A. (1993). Licensing Veterinary Biologics in the United States. The First Steps Towards an
International Harmonization of Veterinary Biologicals; and Free circulation of vaccines within the EEC.
Dev. Biol. Stand., 79, 1725.
D.
ESPESETH D.A. & GOODMAN J.B. (1993). Chapter 13. In: Licensing and Regulation in the USA. Vaccines for
Veterinary Application. Butterworth Heinemann, London, UK, 321342.
E.
GAY C.G. & ROTH H.J. (1994). Confirming the safety characteristics of recombinant vectors used in
veterinary medicine: a regulatory perspective. Recombinant vectors in vaccine development. Dev. Biol.
Stand., 82, 93105.
F.
ROTH H.J. & GAY C.G. (1996). Specific safety requirements for products derived from biotechnology. In:
Veterinary Vaccinology, Pastoret P.-P., Blancou J., Vannier P. & Verschueren C., eds. Elseviers Science
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G.
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Science, Amsterdam, The Netherlands.
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USDA-APHIS-VETERINARY SERVICES-CENTER FOR VETERINARY BIOLOGICS (1999). Veterinary Biological

Product Samples. Veterinary Services Memorandum No. 800.59. Center for Veterinary Biologics, 510 S.
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17 Street, Suite 104, Ames, Iowa 50010, USA.
K.
USDA-APHIS- VETERINARY SERVICES-CENTER FOR VETERINARY BIOLOGICS (1995). Guidelines for Submission
of Materials in Support of Licensure. Veterinary Biologics Memorandum No. 800.84. Center for Veterinary
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Biologics, 510 S. 17 Street, Suite 104, Ames, Iowa 50010, USA.
L.

General Licensing Considerations No. 800.200, Efficacy Studies. USDA-APHIS-Veterinary Biologics, 4700
River Road, Riverdale, Maryland 20737, USA.
M.

General Licensing Considerations No. 800.201, Back Passage Studies. Center for Veterinary Biologics,
th
510 S. 17 Street, Suite 104, Ames, Iowa 50010, USA.
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USDA-APHIS-VETERINARY SERVICES (19641994). Standard Assay Methods, Series 100900. National

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USDA-APHIS- VETERINARY SERVICES-CENTER FOR VETERINARY BIOLOGICS (1984). Basic License

Requirements for Applicants. Veterinary Biologics Memorandum No. 800.50. Center for Veterinary
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Biologics, 510 S. 17 Street, Suite 104, Ames, Iowa 50010, USA
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United States Department of Agriculture (USDA), Animal and Plant Health Inspection Services (APHIS). USDA-APHISCENTER FOR VETERINARY BIOLOGICS HOME PAGE: http://www.aphis.usda.gov/vs/cvb/index.html
CAPTULO I.1.9.
EL PAPEL DE LOS ORGANISMOS OFICIALES

EN LA REGULACIN INTERNACIONAL
DE LOS PRODUCTOS BIOLGICOS
DE USO VETERINARIO
RESUMEN
El control oficial de los productos biolgicos de uso veterinario est encomendado a varios
organismos nacionales y regionales que garantizan, de formas diferentes, la calidad, la inocuidad y
la eficacia de los productos La armonizacin internacional de las normas relativas a los productos
biolgicos no comenz hasta bastante despus de la normativa relativa a los productos qumicos.
Los primeros productos biolgicos de uso veterinario no se fabricaron ni se distribuyeron hasta
finales del siglo XIX. Dichos productos se elaboraban de forma poco sofisticada y se distribuan sin
ms control que el de los propios fabricantes. Mas tarde, cada fabricante desarroll sus propios
estndares. En Europa, ya en 1895, el Estado controlaba los estndares de ciertos productos de
diagnstico (por ejemplo, la malena y la tuberculina) y los de las vacunas. Poco a poco se fueron
desarrollando las condiciones para la armonizacin internacional, comenzando con la pruebas para
la comparacin de productos, proporcionadas por diferentes laboratorios europeos. Hasta la
segunda mitad del siglo XX, no se establecieron leyes de mbito nacional para la regulacin de los
productos biolgicos de uso veterinario. En ellas se exiga la aplicacin de tcnicas muy precisas
antes de la concesin de licencias para los productos biolgicos de uso veterinario. A dichas leyes
les siguieron notables esfuerzos para la armonizacin de esas normas nacionales, primero a nivel
regional, particularmente en Europa y Amrica, y luego a nivel global, especialmente por parte de
la Oficina Internacional de Epizootias (OIE), con la publicacin en 1989 de la primera edicin del
Manual de Normas para las Pruebas de Diagnstico y las Vacunas por parte de la OIE.
La armonizacin a nivel mundial de estndares para los productos biolgicos de uso veterinario
ser de gran ayuda para los veterinarios oficiales jefes, que deben seguir las instrucciones dadas
en el Cdigo Zoosanitario Internacional de la OIE, instrucciones que son aplicables a todos los
productos biolgicos utilizados en el comercio internacional. Tambin ser de ayuda para los
productores de vacunas que han expresado el deseo de una armonizacin de las normas de
registro a nivel mundial, con el fin de simplificar y facilitar la comercializacin de sus productos.
Evidentemente, eso tambin interesa a los agricultores y consumidores, quienes se beneficiarn
del hecho de que la inocuidad y eficacia de los productos por ellos utilizados se garanticen de
forma uniforme al ms alto nivel.
En las diferentes secciones de este captulo se revisarn y compararn las normativas de las
regiones del mundo que han realizado mayores progresos en este campo, y se describirn los
intentos actuales para la armonizacin de estas normativas a escala internacional.
Nota: En este captulo el trmino "productos biolgicos de uso veterinario", incluir las vacunas y
antisueros para uso animal, y las preparaciones in vivo para diagnsticos.
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Captulo I.1.9.
El papel de los organismos oficiales en la regulacin internacional

de los productos biolgicos de uso veterinario
A. NORMATIVA PARA LOS PRODUCTOS BIOLGICOS DE USO VETERINARIO.

SITUACIN ACTUAL
1.
En Japn
1.1. Introduccin
Los productos medicinales de uso exclusivo en animales, incluidos los productos biolgicos de uso veterinario,
estn bajo la jurisdiccin del Ministerio de Agricultura, Bosques y Pesca. La garanta de calidad, eficacia y
inocuidad est estipulada en la Ley de Asuntos Farmacuticos (1). Desde 1972 se han ido desarrollando los
procedimientos para el registro de dichos productos, con el objeto de racionalizar los procedimientos de
supervisin y facilitar la obtencin de su autorizacin. Dichos procedimientos estn estipulados en la Ley de
Asuntos Farmacuticos y otras normativas afines. En consecuencia, se ha conseguido un procedimiento de
supervisin simple y rpida, poniendo nfasis en garantizar la calidad, inocuidad y eficacia de tales productos. La
Comisin para la Seguridad Alimentaria se estableci dentro de la Oficina del Gabinete del Gobierno de Japn
en julio de 2003. Tratndose de inspecciones, reinspecciones y reevaluaciones para la aprobacin, todas las
vacunas de uso veterinario, excepto los productos destinados a perros y gatos, deben cumplir con lo exigido en
la Ley Bsica de Seguridad Alimentaria de la Comisin de Seguridad Alimentaria.
1.2. Normas que regulan la autorizacin y garantizan la calidad de los productos biolgicos de uso
veterinario
a)
Solicitud de autorizacin y licencia

Quienes deseen fabricar o importar productos biolgicos de uso veterinario deben cumplimentar una
solicitud usando el formato indicado para cada producto y obtener la aprobacin del Ministerio de
Agricultura, Bosques y Pesca. La solicitud se deber presentar acompaada de los documentos
relacionados en la misma, tales como los relativos a estudios clnicos. De entre estos ltimos, los estudios
sobre seguridad y los estudios clnicos en los que se usan las especies objeto de estudio, se deben llevar a
cabo de conformidad con la "Buena Prctica de Laboratorio" (Good Laboratory Practice, GLP) y con la
"Buena Prctica Clnica" (Good Clinical Practice, GCP).
La licencia para fabricar, o para importar y vender productos biolgicos de uso veterinario, la expide el
Ministerio de Agricultura, Bosques y Pesca a cada solicitante y debe renovarse cada 5 aos. La
conformidad con la "Buena Prctica de Fabricacin" (Good Manufacturing Practice, GMP) se considera
como una de las condiciones necesarias para obtener la licencia de fabricacin.
b)
Pruebas a nivel nacional

Despus de recibir una licencia, cada lote de productos biolgicos de uso veterinario debe ser examinado
por el Laboratorio Nacional de Pruebas Veterinarias, de acuerdo con los procedimientos del Estndar de
Pruebas para Productos Biolgicos de Uso Veterinario (3, 9). Cada producto destinado a la
comercializacin ha de llevar en el contenedor o embalaje un sello oficial de identificacin en forma de
precinto.
c)
Nuevo examen y nueva evaluacin

A los productos biolgicos de uso veterinario recin autorizados, se les realiza un nuevo control. Por lo
general, despus de la autorizacin inicial de la vacuna, se realiza un estudio de campo del medicamento
por un perodo de 6 aos. Durante ese perodo se evalan de nuevo la eficacia y la seguridad del producto.
La evaluacin se realiza sobre los productos disponibles en el mercado que hayan sido autorizados por
orden del Ministerio de Agricultura, Bosques y Pesca. Debe seguirse ese procedimiento cuando se
sospeche que un producto biolgico de uso veterinario no cumple con los ltimos estndares vigentes.
d)
Requisitos mnimos que deben reunir los productos biolgicos de uso veterinario
Los controles proporcionan informacin sobre la consistencia del proceso de fabricacin y la calidad del
producto: mtodos de fabricacin, propiedades de las cepas utilizadas en la fabricacin, mtodos de control
de calidad, mtodos de almacenamiento y fechas de caducidad, de acuerdo con los estndares
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Captulo I.1.9.
El Papel de los organismos oficiales en la regulacin internacional

establecidos en los "Requisitos Mnimos Exigidos para los Productos Biolgicos de Uso Veterinario" (2). No
se puede fabricar, importar ni comercializar ningn producto que no cumpla con esos estndares.
e)
Casos en los que se deniega la autorizacin

Cuando la calidad del producto que se somete a aprobacin no es satisfactoria o sus efectos negativos
destacan sobre los previstos en las indicaciones, se considera que el producto es de poco valor y, por lo
tanto, no se autoriza.
f)
Cancelacin de autorizaciones
A la hora de conceder la autorizacin para fabricar o importar un producto, se examinan cuidadosamente la
calidad, inocuidad y eficacia del mismo de acuerdo con las ltimas tecnologas disponibles. No obstante, si
los avances cientficos realizados desde la concesin de la autorizacin indicasen que podra existir un
riesgo para la salud asociado a la utilizacin del producto, se realizarn un nuevo examen y evaluacin y
podr emitirse una orden de cancelacin de la autorizacin.
1.3. Procedimiento para autorizar la fabricacin (o importacin)

Los criterios ms importantes a tener en cuenta cuando se quiere fabricar o importar un producto, como, por
ejemplo, una vacuna de uso veterinario, son la calidad, la seguridad y la eficacia del producto. No es necesaria
una licencia para cada una de las instalaciones. Basta con una autorizacin para cada producto, incluso si el
fabricante va a fabricar (o importar) en ms de una instalacin. Tambin es posible solicitar, de forma simultnea,
la aprobacin de la calidad de un producto y la licencia para su fabricacin.
Cuando un fabricante (o importador o distribuidor), fabrica (o importa) productos biolgicos de uso veterinario,
debe presentar en un documento oficial la solicitud de autorizacin para fabricar (o importar) dichos
medicamentos a la persona encargada de medicamento veterinarios en el Departamento de Industria Crnica de
cada Prefectura. Si la documentacin es correcta, la solicitud para fabricar (o importar), junto con los documentos
que la acompaan, se enva para su revisin a la Oficina del Ministerio de Agricultura, Bosques y Pesca. En ese
momento puede realizarse una consulta o audiencia, si se considera necesario. A continuacin se estudia la
solicitud en el Consejo Central de Asuntos Farmacuticos, y si no se encuentra ningn problema, se enva al
solicitante una notificacin de aprobacin para fabricar (o importar) el producto veterinario.
2.
En la Unin Europea
2.1. Introduccin
La legislacin farmacutica de la Unin Europea (UE), que ha ido evolucionando a lo largo de 30 aos, trata de
los medicamentos de uso humano y de uso animal. La armonizacin de los requisitos en el rea de
medicamentos de uso veterinario se inici en 1981 con la adopcin de las Directivas 81/851/EEC y 81/852/EEC,
en las que se fijan requisitos comunes para la autorizacin de fabricacin y comercializacin basada en la
evaluacin de la calidad, la seguridad y la eficacia del producto. Estas directrices, as como la legislacin
posterior sobre productos farmacuticos de uso veterinario y humano, se consolidaron en la Directriz 2001/82/EC
y 2001/83/EC reguladoras, respectivamente, de los productos de uso veterinario y humano. En 1994 se
publicaron una serie de directrices detalladas bajo el ttulo "Normas que regulan los medicamentos en la Unin
Europea" (7). Estas directrices se han actualizado y describen en detalle las bases legales para la obtencin de
autorizaciones de comercializacin, as como la forma de compilacin y evaluacin de los expedientes. Estas
normas sirven como publicaciones de referencia de gran utilidad para cualquier autoridad que vaya a instaurar un
sistema de autorizacin de productos biolgicos de uso veterinario. Las normas fueron formalmente adoptadas y
aplicadas especficamente a los productos biolgicos de uso veterinario a partir de 1993. Se tomaron muchas
medidas adicionales para avanzar en la armonizacin de los procedimientos y criterios de evaluacin de
medicamentos de uso veterinario, tales como los requisitos marco y las pautas interpretativas para su
experimentacin, los principios y las directrices de la "Buena Prctica Mdica" (GMP), y el procedimiento
utilizado por la Comunidad para la evaluacin de productos de alta tecnologa. Sin embargo, la concesin de
autorizaciones segua siendo prerrogativa de los diferentes estados. Como consecuencia, aunque las solicitudes
se evaluaban en base a esos criterios y procedimientos de armonizacin, y, en algunos casos, de forma
simultnea por las autoridades de los estados miembros, haba discrepancias en las decisiones tomadas por
dichos estados en torno a un mismo producto. Debido a lo anterior, en 1990 la Comisin propuso un nuevo
sistema para la comercializacin de medicamentos, que fue adoptada por el Consejo de Ministros en 1993 y
entr en vigor el 1 de enero de 1995.
Una de las primeras consecuencias fue la creacin en Londres (Reino Unido), de la Agencia Europea de
Evaluacin de Medicamentos.
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Captulo I.1.9.

2.2. El papel de la Agencia Europea de Evaluacin de Medicamentos (EMEA)

En 1995 entr en vigor un nuevo sistema para la autorizacin de medicamentos. Despus de 10 aos de
cooperacin entre las autoridades de registro nacionales, a nivel de la Unin Europea, y despus de 4 aos de
negociaciones, el Consejo de la Unin Europea adopt en junio de 1993 tres directrices y una regulacin, que
juntas constituyen la base legal del sistema. (5)
La EMEA fue fundada por Regulacin del Consejo 2309/93/EEC del 22 de julio de 1993. (OJ No. L214,
24.8.1993), y Londres, en el Reino Unido, fue elegida como su sede por decisin de los Jefes de Estado y de
Gobierno el 29 de Octubre de 1993. Esta agencia formula opiniones y adems del personal administrativo y de la
junta directiva, est compuesta por dos comits cientficos, el Comit para la Propiedad de los Productos
Medicinales (CPMP), encargado de los medicamentos para los humanos y el Comit para los Productos
Medicinales de Uso Veterinario (CVMP), que se encarga de los medicamentos y otros productos de uso animal.
El CVPM es el responsable de la evaluacin de las solicitudes para la comercializacin de productos derivados
de la biotecnologa, de los intensificadores de productividad, de las nuevas sustancias qumicas y de otros
productos nuevos de carcter innovador. Adems, el CVPM ofrece recomendaciones relacionadas con los
Lmites Mximos de Residuos (MRLs) para las sustancias utilizadas en la produccin de alimentos para
animales. Para apoyar estas actividades, el CVMP cuenta con un grupo de 400 expertos puestos a disposicin
de la agencia por los estados miembros de la Unin Europea. Estos expertos pueden participar en cualquiera de
los grupos de trabajo del CVMP. Entre los grupos de trabajo, el Grupo de Trabajo para las Sustancias
Inmunolgicas (CVMP/IWP), tiene un doble mandato: asistir al CVMP, si es necesario, examinando, en nombre
del Coordinador de Asesoramiento Cientfico del CVMP, en parte o en todo, cualquier consulta sobre
asesoramiento cientfico hecha por una compaa durante el desarrollo de una nueva vacuna, y asesorando al
CVMP en asuntos de poltica ms general tales como la elaboracin y revisin de las directrices relativas a los
productos inmunolgicos. Las directrices generales para las pruebas de los medicamentos de uso veterinario
estn contenidas en "Las Reglas que Regulan los Medicamentos en la Unin Europea", cuya ltima publicacin
por la Unin Europea data de 1999 (7). Las directrices nuevas y las revisiones de las directrices antiguas ya no
se publican en documento impreso, pudindose acceder a ellas en la pgina Web de EMEA, www.emea.eu.int
y/o la pgina Web de DG Enterprise www.pharmacos.org.
2.3. Procedimientos Europeos actuales para autorizar la comercializacin

A partir de 1995, empezaron a estar disponibles, a travs de la Unin Europea, dos nuevos tipos de
procedimiento de registro de medicamentos de uso humano y de uso animal: el procedimiento centralizado y el
procedimiento descentralizado (12).
a)
El procedimiento centralizado
Este procedimiento se aplica a productos de alta tecnologa definidos en el Anexo a la Regulacin del
Consejo 2309/93. Es obligatorio para algunos productos ("Parte A: ciertos productos biotecnolgicos y
promotores de crecimiento nuevos), y opcional para otros ("Parte B": otros productos innovadores). La
valoracin est coordinada por uno de los miembros del CVMP, conocido como el "Ponente", bajo contrato
con la EMEA. Las exigencias y los criterios relativos a los datos son los mismos que se utilizan en los
procedimientos nacionales. Por consiguiente, la autorizacin la emite la Comisin, y es vlida en todos los
estados miembros de la comunidad. Sin embargo en el caso de vacunas veterinarias, uno o ms de los
estados miembros pueden prohibir el uso de la vacuna, bien sea debido a la ausencia de infeccin en su
territorio, o bien porque se ha implantado un programa de erradicacin en su territorio, tal como lo certifican
las autoridades competentes.
b)
El procedimiento descentralizado
Las solicitudes para la autorizacin de un producto pueden an resolverse en un nico estado miembro (el
"Estado Miembro de Referencia"), por medio de un procedimiento nacional. Se aplican las mismas "Normas
que Regulan los Medicamentos en la Unin Europea). Siguiendo la aprobacin del Estado Miembro de
Referencia, las solicitudes pueden dirigirse, si se desea, a otros estados miembros "Interesados" para que
sean concedidas autorizaciones idnticas en base al reconocimiento recproco. Si otro estado miembro
considera, de manera fundada, que el producto que se va a autorizar constituye un riesgo para los
animales, la salud pblica o el medio ambiente, dicho estado miembro puede remitir el expediente a la
EMEA para un arbitraje. La Comisin emite una decisin vinculante basada en la opinin del CVMP.
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Captulo I.1.9.

2.4. Autorizacin para la fabricacin y control de la salida de productos al mercado

De acuerdo con la Directiva 81/85/EEC, tambin se necesita autorizacin para la fabricacin de medicamentos
de uso veterinario, incluidos los inmunolgicos. Esta directiva determina inspecciones regulares y estipula que la
fabricacin debe ser supervisada por una "persona cualificada", que certifique que cada partida se ajusta a las
especificaciones aprobadas para ese producto. Para la puesta en prctica de estos requisitos, la Comisin
adopt la Directiva 91/412/EEC relacionada con el principio y las directrices de la GMP, y public una gua
detallada sobre la GMP desarrollada por un grupo de inspectores farmacuticos de los estados miembros.
Se exige a los fabricantes tener a su disposicin una persona cualificada que certifique que cada partida de un
producto ha sido fabricada y controlada de acuerdo con las condiciones exigidas para su comercializacin. Este
es un requisito bsico de la legislacin farmacutica. En el caso de partidas importadas desde terceros pases,
cada partida tiene que someterse, en el primer estado miembro que ha realizado la importacin hacia el interior
de la Unin Europea, a un anlisis completo de calidad y cantidad de por lo menos los ingredientes activos, bajo
la supervisin de una persona cualificada. Solo cuando dicho anlisis se ha llevado a cabo, puede una partida
circular dentro de la Unin Europea sin control posterior. En el caso especial de medicamentos inmunolgicos
para uso veterinario, se puede introducir una nueva medida. La Directiva 90/677/E{68} permite a todos aquellos
estados miembros que lo consideren necesario solicitar que muestras de la mayor parte de las partidas
fabricadas y/o de los productos terminados sean sometidos a examen por el laboratorio de control antes de que
dicha partida sea colocada en el mercado. Esta salida oficial de la partida al mercado, no exime de la necesidad
de un control de los lotes por parte de una persona cualificada. Excepto en circunstancias especialmente
justificadas, la comercializacin de un producto llevada a cabo por un laboratorio nacional de control, debe ser
reconocida por los otros estados miembros, sin necesidad de repetir dicho proceso. Se ha acordado un
procedimiento administrativo de intercambio de informacin entre las autoridades competentes, para asegurar
que este procedimiento funcione sin problemas. Aunque no todos los estados miembros exigen la salida al
mercado de una forma oficial de los productos inmunolgicos para uso veterinario, todos aceptan su implicacin
en este plan de intercambio de informacin. Estn actualmente en curso (ao 2000) discusiones para establecer
un sistema armonizado de salida de los productos al mercado en todos los estados miembros de la Unin
Europea. Despus de la revisin de la legislacin europea sobre medicamentos (revisin de 2001), la Comisin
Europea ha realizado propuestas para introducir enmiendas en dicha legislacin y esas propuestas estn siendo
estudiadas por el Consejo y el Parlamento Europeos siguiendo el Procedimiento de Co-decisin.
2.5. El Papel de la Farmacopea Europea

En los ltimos 30 aos se han realizado profundos cambios en la organizacin y regulacin de los medicamentos
en los pases europeos. Hace 30 aos, cada pas tena sus propias regulaciones, y entre ellos los pases
europeos tenan dos tercios de las farmacopeas del mundo. La Convencin de la Farmacopea Europea ha sido
firmada ahora por 24 socios: 23 pases1 a los que acaba de unirse la Comisin de las Comunidades Europeas;
aunado a esto 10 pases europeos y no europeos2 y la Organizacin Mundial de la Salud (OMS) tienen categora
de observadores. Se mantienen estrechas relaciones con las autoridades que regulan las licencias en el rea
Econmica Europea, donde la integracin se desarrolla a travs del contacto con el EMEA y la implementacin
de directrices comunes y pautas sobre los medicamentos para los humanos y los animales. En 1990 la
Farmacopea Europea junto con la de Japn y la de EE.UU., cofundaron el Grupo de Discusin Farmacopeica
(GDF); este grupo est trabajando asiduamente para la armonizacin a nivel mundial y participa en la
Conferencia Internacional sobre Armonizacin de los Requisitos Tcnicos para el Programa de Registro de
Medicamentos de Uso Humano. Recientemente, mediante un programa paralelo de medicamentos veterinarios,
la Cooperacin Internacional para la Armonizacin de los Requisitos Tcnicos para el Registro de Medicamentos
Veterinarios (VICH), ha prestado atencin a la Armonizacin de los requisitos para ciertos tipos de prueba
aplicados a agentes extraos (vase seccin C.4. ms abajo).La Farmacopea Europea define los estndares
mnimos aceptables para los productos que se han de aprobar en la Unin Europea, ya que el cumplimiento de
los monogrficos es un requisito obligatorio segn la Directriz 2001/82/EC. Esto exige que los productos cumplan
con el monogrfico especfico pertinente, en los lugares en que ste exista, o con un monogrfico general all
donde no exista uno especfico.
La Farmacopea Europea tambin incluye un departamento llamado "Departamento Europeo para la Calidad de
los Medicamentos" (EDQM). Este departamento crea, mantiene y distribuye los reactivos estndares
internacionales mencionados en las monografas de la Farmacopea Europea. Hasta la fecha hay pocos
1
Austria, Blgica, Chipre, Croacia, Dinamarca, Finlandia, Francia, Alemania, Grecia, Islandia, Irlanda, Italia, Luxemburgo,
Holanda, Noruega, Portugal, Eslovenia, Espaa, Suiza. Suecia, Turqua, El Reino Unido y la antigua Repblica Yugoslava
de Macedonia; los estados miembros deben aplicar los estndares de la farmacopea europea.
Albania, Australia, Bulgaria, Canad, Hungra, la Repblica Checa, la Repblica Popular China, Lituania, Eslovaquia y
Polonia; los estados observadores no tienen que aplicar los estndares de la farmacopea europea, aunque algunos de
ellos aplican dichos estndares de forma voluntaria.
103
Captulo I.1.9.

estndares para productos biolgicos de uso veterinario, pero hay indicios de que el EDQM pretende ser cada
vez ms activo en esta rea, y puede adelantarse que varios ms estarn disponibles en un futuro prximo.
3.
En los Estados Unidos
3.1. Introduccin
En EE.UU. los productos biolgicos de uso veterinario se definen de forma igual a los virus, sueros, toxinas
(excluyendo las sustancias que son parcialmente txicas para los microorganismos, por ejemplo los antibiticos),
o productos anlogos en cualquier fase de produccin, embarque, distribucin o venta, que se pretenda usar en
el tratamiento (prevencin, diagnstico, gestin o cura) de enfermedades de animales y que actan
fundamentalmente por estimulacin directa, complementacin, mejora o modulacin del sistema inmunolgico o
respuesta inmunolgica. El trmino productos biolgicos incluye, pero no se limita a, vacunas, bacterias,
alrgenos, anticuerpos, antitoxinas, toxoides, inmunoestimulantes, ciertas citoquinas, componentes antignicos o
inmunizantes de organismos vivos, y componentes de diagnstico de origen natural o sinttico o que derivan de
la sntesis o alteracin de varias sustancias o componentes de sustancias tales como microorganismos, genes o
secuencias genticas, carbohidratos, protenas, antgenos, alrgenos o anticuerpos.
3.2. Bases Legales

La ley de 1913 sobre Virus, Sueros y Toxinas (Ley VST), modificada por la 21 U.S.C., Secciones 151 a la 159,
proporciona la autoridad legal para la regulacin de los productos inmunolgicos y biolgicos de uso animal en
EE.UU. El programa regulador que implementa los requisitos de la Ley VST lo administra el Centro para
Productos Biolgicos de Uso Veterinario (CVB), y el Servicio de Inspeccin de Salud Animal y de las Plantas
(APHIS) del Departamento de Agricultura de EE.UU. Las regulaciones administrativas debidamente promulgadas
y con efecto de ley, se publican en el Ttulo 9 del Cdigo de Regulaciones Federales, Partes 101 a 118 (6).
Adems, el APHIS ha ofrecido asesoramiento sobre noticias del CVB, Memoranda sobre Servicios Veterinarios,
Consideraciones Generales Relacionadas con la Autorizacin de Productos Biolgicos de Uso Veterinario y el
Manual de Programas de Productos Biolgicos de Uso Veterinario.
La ley VST exige que los productos por ella regulados y que se incorporen a los canales de comercializacin no
sean de poco valor, contaminantes, dainos o peligrosos. El plan regulador que implementa esos estndares
exigen a los fabricantes de esos productos que soliciten las correspondientes licencias antes de la
comercializacin, y obligan a los solicitantes a asumir responsabilidades indiciarias al exigirles que demuestren,
mediante la entrega de cierta informacin relativa a los datos de la investigacin y los resultados de las pruebas,
que sus productos son "puros, seguros, potentes y eficaces". El programa de APHIS para productos
inmunolgicos y biolgicos de uso animal regula la fabricacin de los productos y de su salida al mercado a
travs de un sistema de autorizacin, inspeccin, verificacin y vigilancia post-comercializacin, que asegura que
los estndares reguladores y legales se cumplen.
3.3. Licencia e Inspeccin Inicial

Cualquier persona o empresa que solicita fabricar en EE.UU. productos inmunolgicos o biolgicos de uso
animal debe obtener del APHIS una licencia para fabricar en una determinada instalacin (Licencia para la
instalacin), y una licencia para cada uno de los productos que va a fabricar (Licencia del producto). Los
requisitos exigidos para esas licencias se aplican tanto si el producto se va a lanzar en el mercado de EE.UU.
como si se va a exportar al extranjero. Normalmente, el solicitante pedir de forma simultnea la licencia para la
instalacin y la licencia para el primer producto. Una vez haya obtenido las licencias para la instalacin el
producto, la empresa que solicita fabricar y comercializar nuevos productos, tendr que solicitar solamente
licencias para productos adicionales. Una persona o empresa ubicada en el extranjero que solicite comercializar
sus productos en EE.UU., tambin debe pedir autorizacin para la comercializacin. No obstante, para la
importacin de un producto, tan solo se necesita un permiso en lugar de una licencia.
Para obtener una licencia de instalacin, el solicitante deber someter a aprobacin el proyecto (o sea, el plano
arquitectnico del arquitecto) y los planos de las instalaciones con los correspondientes rtulos o anotaciones. El
APHIS revisa esos planos y rtulos para asegurar que la instalacin funcionar de acuerdo con la "Buena
Prctica Mdica" (GMP). Si el solicitante realiza posteriormente cambios fsicos u operacionales en la instalacin,
deber someter a revisin, de forma inmediata, los correspondientes planos y rtulos modificados.
Para obtener una licencia del producto, el solicitante debe establecer la pureza e identidad de todas las semillas
madre y de todas las clulas madre que se van a usar en la fabricacin del producto, y debe someter a
aprobacin un esquema detallado de la produccin El esquema de produccin incluye no slo los detalles
relacionados con el mtodo de fabricacin del producto, sino tambin una descripcin de los procedimientos para
la recogida y presentacin de muestras y el lanzamiento de lotes de productos. El solicitante tambin deber
suministrar las referencias profesionales y tcnicas del personal de la compaa, e identificar a una persona
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Captulo I.1.9.

cualificada (denominada "enlace gubernamental" por las regulaciones de EE.UU), quien acta como contacto
oficial con el CVB durante el proceso de obtencin de la licencia, y es el responsable de presentar los informes
de las pruebas de la empresa y de la salida al mercado del producto. Al solicitante se le exige que presente datos
de las pruebas que demuestren que el producto fabricado de acuerdo con el plan pertinente es puro, seguro,
potente y eficaz. El solicitante debe presentar a los Laboratorios del CVB muestras de tres lotes consecutivos del
producto, a fin de que puedan confirmarse los resultados de las pruebas del producto realizadas por el
solicitante.
Finalmente, antes de la concesin de las licencias para la instalacin y el producto, las instalaciones del
solicitante se someten a una inspeccin exhaustiva por parte de los inspectores del APHIS. La inspeccin
asegura que la instalacin funciona de acuerdo con la "Buena Prctica Mdica" (GMP) mediante la confirmacin
de que el establecimiento est construido segn los planos y las leyendas; que la lnea de produccin est
establecida y funciona de acuerdo con el plan de produccin aprobado y que los archivos relativos a cada fase
de la produccin se guardan y actualizan de forma adecuada. La inspeccin tambin confirma que el solicitante
sigue la "Buena Prctica de Laboratorio" (GLP); que el programa relativo a la comprobacin del proceso y del
producto final se desarrolla y documenta de forma apropiada; que el muestreo se realiza de forma conveniente y
que se aplican los procedimientos adecuados para determinar y documentar la salida del producto al mercado.
3.4. Inspeccin despus de la concesin de la licencia

Una vez se le han expedido a la empresa las licencias para la instalacin y para el producto, el APHIS, realizar
inspecciones rigurosas de seguimiento a las instalaciones de forma rutinaria, para verificar que el titular de la
licencia sigue operando de acuerdo con las normas del programa y segn lo estipulado en la licencia. Las
inspecciones que se realizan despus de la obtencin de la licencia se llevan a cabo sin previo aviso, y
normalmente dentro de los 12-18 meses siguientes a la ltima inspeccin. Si el titular de la licencia propone
algn cambio significativo en la instalacin o en el mtodo de produccin de un producto autorizado, el APHIS se
reserva el derecho a realizar una inspeccin especial antes de aprobar los cambios.
3.5. Verificacin
Cada titular de una licencia es responsable de verificar de forma exhaustiva todos sus procesos de produccin y
cada serie (o lote) de cada producto antes de la salida al mercado. El tipo y la cantidad de pruebas requeridas
dependen de cada producto concreto, pero, en cualquier caso, son fijadas y aprobadas por la autoridad
reguladora antes de concederse la licencia del producto. Una persona cualificada empleada por el titular de la
licencia ("enlace gubernamental") se responsabiliza de la seleccin de las muestras que van a ser verificadas, de
la monitorizacin del programa de verificacin del titular de la licencia y de la certificacin de los resultados de la
prueba ante la autoridad reguladora.
Al mismo tiempo que la empresa selecciona sus muestras para la verificacin en la propia empresa, tambin
selecciona las muestras que van a ser presentadas a los laboratorios del CVB. Utilizando un programa para una
seleccin al azar, el CVB, selecciona un porcentaje de las muestras que se han sometido a pruebas de
confirmacin a fin de verificar la adecuacin y suficiencia de las pruebas realizadas por el fabricante. La
verificacin se realiza para cada serie antes de la autorizacin de comercializacin. Por medio de una regulacin,
el CVB est obligado a poner a prueba sus muestras seleccionadas dentro de los 14 das siguientes al recibo de
las mismas; normalmente, las muestras se ponen a prueba antes del lmite de los 14 das, de tal forma que, de
hecho, la comprobacin de la produccin por parte de la empresa y el Programa de Prueba de Competencia del
CVB se llevan a cabo al mismo tiempo.
Cuando la empresa recibe los resultados de sus propias pruebas, el enlace gubernamental presenta esos
resultados a la autoridad reguladora junto con un impreso de lanzamiento de un lote, inicindose el proceso de
lanzamiento. Si la partida no ha sido seleccionada como parte del Programa de la Prueba de Competencia, o si
sta ha sido elegida, pero las pruebas del CVB confirman los resultados de las pruebas de la compaa, el
impreso de lanzamiento es refrendado por la autoridad reguladora completando el proceso de lanzamiento. Si las
pruebas de la empresa o las pruebas de competencia indican que la partida puede ser insatisfactoria, dicha
partida no podr lanzarse.
Si el titular de la licencia hace una propuesta para modificar su instalacin o su funcionamiento en forma tal que
ello pudiese afectar de algn modo la pureza, la inocuidad, la potencia o la eficacia del producto, la autoridad
reguladora requerir al titular de la licencia para que proporcione datos que demuestren la pureza, la inocuidad,
la potencia y la eficacia del producto, y para que entregue a los laboratorios del CVB muestras del producto para
las pruebas confirmatorias.
3.6. Vigilancia despus de la salida al mercado

El CVB mantiene un programa de vigilancia para la post-comercializacin con el que monitoriza el
comportamiento de los productos en el mercado. Con este programa, el CVB normalmente tiene conocimiento de
algunos problemas relativos a la calidad del producto a travs de los informes o quejas de los consumidores,
105
Captulo I.1.9.

aunque las regulaciones del programa tambin obligan al titular de la licencia a informar al CVB de cualquier
problema que llame su atencin relacionado con la pureza, inocuidad, y potencia del producto. El CVB tiene
autoridad legal para intervenir en aquellos puntos del mercado donde se presenten problemas serios en relacin
con la pureza, inocuidad, potencia y eficacia del producto.
B. COMPARACIN DE LAS REGULACIONES DE LA UNIN EUROPEA CON LAS DE

LOS ESTADOS UNIDOS
Aunque la Agencia Reguladora supervisa la produccin de los productos biolgicos de uso veterinario, estos
deben cumplir con ciertos criterios bsicos. Estos criterios son:
Inocuidad: el producto debe ser seguro en las especies-objetivo y, si son vivas, en las especies expuestas a
organismos excretados.
Eficacia: el producto debe ser efectivo de acuerdo con las propiedades declaradas en la etiqueta.
Calidad: incluye la pureza, la potencia y la consistencia.
Pureza: el producto debe estar libre de agentes contaminantes.
Potencia: cada lote de productos debe formularse y testarse para asegurar la eficacia y reproducibilidad de
la actividad tal como se demuestra en los datos del registro.
Aunque, de forma global, las agencias y regulaciones difieren, todas se esfuerzan por garantizar al consumidor
final que los productos ofrecidos cumplen con esos estndares bsicos.
La Unin Europea usa un sistema completo que consiste en una combinacin de la GMP, incluyendo procesos y
especificaciones de los materiales validadas, junto con los mtodos de produccin que garantizan la calidad del
producto final. Los procesos internos y las comprobaciones de los lotes constituyen una garanta adicional de la
calidad de los productos mdicos de uso veterinario. En los procesos y en las pruebas de los lotes. Las pruebas
de inocuidad son realizadas siguiendo la Buena Prctica de Laboratorio, y las pruebas de eficacia se realizan
siguiendo la Buena Prctica de Controles (GCP). Los EE.UU. definen lo que constituye procesos de fabricacin
aceptables en el plan de produccin y en la descripcin detallada de la instalacin (planos y rtulos de los
planos), y se apoyan en la inspeccin y en las pruebas confirmatorias para conseguir el mismo objetivo. Aunque
diferentes, ambos sistemas estn diseados para conseguir que slo los productos biolgicos puros, seguros,
potentes y efectivos sean puestos a la venta.
En la Unin Europea, adems de los datos proporcionados por el solicitante, se deben incluir informes de
expertos en el dossier de solicitud de autorizacin para la comercializacin. Cada seccin importante del
expediente, incluyendo la analtica, y las relativas la seguridad y la eficacia, debe ser revisada por un experto
independiente. La valoracin del experto se incluye en el archivo de autorizacin de comercializacin. El sistema
de revisin por una tercera parte, no existe en el sistema de registro de EE.UU.
Existen diferencias entre los procedimientos utilizados en la Unin Europea y los utilizados en EE.UU. Debera
establecerse, en la medida de lo posible, la armonizacin de esos dos sistemas, para el reconocimiento de la
equivalencia en las pruebas y procedimientos que se llevan a cabo al evaluar una vacuna, y garantizar la calidad,
inocuidad y eficacia del producto. Se han firmado acuerdos bilaterales de reconocimiento recproco (MRAs)
relacionados con los productos biolgicos de uso veterinario entre la Unin Europea y Australia y entre la Unin
Europea y Nueva Zelanda. La puesta en prctica de dichos acuerdos est en perodo transicin. Parece que va a
tardar ms tiempo en lograrse acuerdos de reconocimiento recproco entre la Unin Europea y los EE.UU. en
relacin con los productos biolgicos de uso veterinario.
C. EL PAPEL DE LAS ORGANIZACIONES INTERNACIONALES

La mayora de las naciones tienen un conjunto de leyes oficiales que regulan la venta y el uso de productos
biolgicos de uso veterinario. Casi todas estas leyes estipulan "unos requisitos mnimos" de calidad, inocuidad y
eficacia de los productos biolgicos de uso veterinario (especialmente vacunas), que han de ser probados en
laboratorios independientes, generalmente bajo supervisin estatal. Estas leyes y pruebas pueden variar de un
pas a otro, y ello supone costes y restricciones para los fabricantes, usuarios y comprobadores.
106
Captulo I.1.9.

Muchas de las vacunas descritas en este Manual se producen y/o utilizan en pases donde los regmenes de
autorizacin y comprobacin no son tan estrictos como los descritos en este captulo. No obstante, conviene ser
consciente de las regulaciones que se aplican en las distintas regiones y, por consiguiente, de las pruebas y la
inspeccin de productos biolgicos de uso veterinario que se pueden haber realizado en dichas regiones.
La idea de armonizar estas pruebas para simplificar y reducir costes a nivel regional, e incluso a nivel mundial, no
es nueva, y se ha avanzado mucho en los ltimos 20 aos. El propsito de esta seccin es revisar la situacin
actual mediante la descripcin del papel de las organizaciones internacionales en la regulacin de las vacunas
de uso veterinario.
En esta seccin el trmino "organizacin internacional" se refiere a aquellas organizaciones relacionadas con la
salud animal a escala mundial (OIE, FAO y OMS).
1.
El papel de la Oficina Internacional de Epizootias
La OIE se fund en Pars en 1924 como la organizacin mundial encargada de la sanidad animal y en el ao
2002 contaba con 162 Pases Miembros. Los tres principales objetivos de la OIE son: proporcionar informacin
sobre la sanidad animal a escala mundial, promover la coordinacin internacional de la investigacin y el control
de ciertas enfermedades animales, y armonizar y regular, a nivel internacional, la importacin y exportacin de
animales y productos animales.
Dentro de la OIE hay cuatro Comisiones Especializadas: la Comisin Zoosanitaria Internacional que se ocupa del
Cdigo Internacional de Sanidad Animal , la Comisin de Normas, La Comisin de la Enfermedad de la Fiebre
Aftosa y de Otras Epizootas, y La Comisin para las Enfermedades de los Animales Acuticos (incluidas las
enfermedades de los moluscos y los crustceos). Adems hay un Grupo de Trabajo se ocupa de las
enfermedades de la fauna salvaje.
Entre estas Comisiones Especializadas, la ms estrechamente relacionada con la estandarizacin es la
Comisin de Normas. Esta Comisin establece las normas para los mtodos de diagnstico (incluidas las
preparaciones para diagnstico) y para las vacunas. Sus trminos de referencia reflejan la obligacin que la
Comisin tiene de participar en la estandarizacin de los productos biolgicos, incluidas las vacunas que usan
con fines profilcticos. La Comisin de Normas es responsable de la preparacin del Manual de Normas para las
Pruebas de Diagnstico y las Vacunas de la OIE (11) y la organizacin de los laboratorios de referencia para
muchas de las enfermedades contenidas en las Listas A y B de la OIE.
Sin embargo, slo se lograr la estandarizacin completa de las pruebas con vacunas cuando se hayan
diseado las normas pertinentes. Se espera alcanzar el objetivo de la estandarizacin y la amplia disponibilidad
de estndares a travs de la participacin de los laboratorios de referencia de la OIE. Entre las funciones y
responsabilidades de los expertos de los casi 150 laboratorios de referencia de la OIE, estn la provisin de un
centro de excelencia en una actividad designada, la estandarizacin de mtodos, la preparacin, el
almacenamiento y la distribucin de antisuero estndar, antgenos y otros reactivos
Entre los 10 Centros Colaboradores de la OIE, tres pueden estar involucrados, en un momento dado, en el
control y/o armonizacin del control de las vacunas: tal es el caso del Centro Colaborador para los Productos
Medicinales de Uso Veterinario, de Fougres (Francia), el Centro Colaborador para la prueba de
enzimoinmunoensayo (ELISA, enzime-linked inmunoadsorbent assay) y para las Tcnicas Moleculares en el
Diagnstico de Enfermedades Animales, de Viena (Austria), y el Centro Colaborador para el Diagnstico de
Enfermedades Animales y Evaluacin de Vacunas, de Ames (EE.UU.).
En 1994, despus de los debates de la Consulta Tcnica Internacional sobre el Registro de Drogas para Uso
Veterinario (ITCVDR), la OIE estableci un grupo Ad hoc sobre La Armonizacin de los Medicamentos de Uso
Veterinario, lo que constituy el primer paso hacia la creacin de la Cooperacin Internacional sobre la
Armonizacin de los Requisitos Tcnicos para el Registro de Productos de Uso Veterinario (VICH) (Vase
Seccin C.4 abajo)
2.
El papel de la Organizacin de las Naciones Unidas para la Agricultura y Alimentacin
La FAO establecida en 1945, es responsable del desarrollo de la agricultura y de la produccin de alimentos. La

Divisin de Salud y Produccin Animal ('AGA'), dentro del Departamento de Agricultura, se encarga del
desarrollo del ganado, e incluye el Servicio de Sanidad Animal ('AGAH'), cuya principal funcin es la prestar
asistencia a los Pases Miembros en el control de las enfermedades animales, con el propsito de aumentar la
produccin de ganado como un componente integral del desarrollo general, en las reas social, econmica y
agrcola .La participacin de la FAO en las pruebas de productos biolgicos de uso veterinario se lleva a cabo
principalmente a travs de su sistema de asistencia tcnica a los Pases Miembros con el fin de establecer e
incluso ejecutar de forma independiente, controles de las vacunas y de otros productos biolgicos. Un ejemplo de
107
Captulo I.1.9.

la asistencia de la FAO a la Unin Africana, (UA) es la creacin de un sistema para que el Centro Panafricano de
Vacunas de Uso Veterinario (PANVAC), realice pruebas con vacunas de uso veterinario, a escala continental,
especialmente las utilizadas contra la peste bovina y la pleuroneumona contagiosa bovina; la FAO encarga, a
peticin de los Pases Miembros, iniciativas bien para garantizar la calidad de las vacunas y otros productos
biolgicos o para las consultas a expertos sobre este asunto, o para la publicacin de manuales sobre el control
de la produccin y de la calidad de las vacunas. Es ms, se pueden solicitar a dos servicios auxiliares, como son
el Codex Alimentarius 'y a la Divisin de Tcnicas Nucleares para la Alimentacin y la Agricultura', que
intervengan en los asuntos relacionados con estos productos. El segundo de dichos servicios opera
conjuntamente con la FAO y la Agencia Internacional de Energa Atmica (IAEA) con base en Viena (Austria), y
tiene una Seccin de Sanidad y Produccin Animal que presta asistencia a los servicios veterinarios e institutos
de investigacin de los pases en vas de desarrollo para el establecimiento de las tcnicas RIA (Prueba de
Inmunidad Radiolgica) y ELISA. Relacionado con esta actividad existe un plan de garanta de calidad por el que
a los laboratorios que han recibido equipos ELISA de la FAO o de la IAEA se les exige monitorizar de forma
rutinaria los controles de calidad interna y probar peridicamente (una o dos veces al ao) un lote de muestras
desconocidas, y enviar los resultados a la IAEA. El objetivo global es proporcionar a todos los interesados la
garanta de que los resultados que se generan mediante el uso de los equipos estandarizados y validados
internacionalmente, son fiables y correctos.
3.
El papel de la Organizacin Mundial de la Salud
Actualmente la OMS no est directamente involucrada en la elaboracin de preparados de referencia

internacionales (por ejemplo antgenos o anticuerpos) para uso meramente veterinario, pero ha desarrollado y
conserva an en el Instituto Nacional para el Control de Estndares Biolgicos, en Potter`s Bar (Reino Unido),
algunos materiales relacionados con las enfermedades estrictamente veterinarias (por ejemplo, vacuna activa
para la enfermedad de Newcastle, y suero contra la fiebre porcina). La OMS quiere mantener su papel en esta
rea en los casos en que los preparados veterinarios de referencia documentos gua tienen una relevancia
directa para la salud humana. (8, 10, 15, 16). Esto involucra a los agentes zoonsicos, o potencialmente
zoonsicos y a otros agentes infecciosos de origen animal que son contaminantes potenciales de los productos
biolgicos, bien se trate de vacunas producidas en cultivos de clulas u rganos para xenotransplante. En la
reunin del Comit de Expertos para la Estandarizacin Biolgica que tuvo lugar en octubre de 1998, se llev a
cabo una revisin de los estndares internacionales entonces vigentes y de los preparados de referencia para los
medicamentos de uso veterinario, y se sugiri una lista de candidatos para ser descontinuados, reemplazados o
revisados (8). Sin embargo, el Comit de Expertos decidi postergar la toma de decisin referente a la
preparacin de las referencias veterinarias, al estar pendiente, por parte de la OMS y de sus socios en el campo
de la veterinaria, una evaluacin de la necesidad de estos diversos productos biolgicos. Adems se ha de
evaluar el inters actual por ciertos preparados, especialmente las vacunas veterinarias, contra zoonosis
familiares (por ejemplo, ntrax y brucelosis), adoptadas y/o revisadas en los aos 60 y 70.
El formato de la lista de Requisitos para las Sustancias Biolgicas, publicado como Apndice en cada informe del
Comit de Expertos para la Estandarizacin Biolgica, fue revisado en 1998 y debera facilitar la recuperacin de
informacin y lograr el objetivo de una mayor transparencia.
4.
El papel de la VICH
4.1 Los trminos de referencia

Los objetivos de la Cooperacin Internacional para la Armonizacin de los Requisitos Tcnicos para el Registro
de los Productos de Uso Veterinario (VICH) son:
Propiciar un forum para un dilogo constructivo entre las autoridades reguladoras y la industria de
productos medicinales de uso veterinario, sobre las diferencias reales y las percibidas en relacin a los
requisitos tcnicos para el registro de los productos en la Unin Europea, Japn y EE.UU., con la esperanza
de que este proceso pueda servir como catalizador para una armonizacin internacional ms amplia.
Identificar reas en que las modificaciones en los requisitos tcnicos o la mayor aceptacin recproca de los
procedimientos de investigacin y desarrollo, pueda conducir a una utilizacin ms econmica de las
recursos humanos y materiales sin que peligre la seguridad.
Hacer recomendaciones sobre modos prcticos de alcanzar la armonizacin de los requisitos tcnicos que
afectan el registro de productos veterinarios e implementar dichas recomendaciones en las tres regiones.
Una vez adoptadas, las recomendaciones de la VICH deberan sustituir a los correspondientes requisitos
regionales. Estas recomendaciones deberan centrarse en los requisitos cientficos esenciales necesarios
para tratar un tema, eliminando los requisitos innecesarios o redundantes.
108
Captulo I.1.9.

La VICH debera conducirse de forma transparente y rentable brindando una oportunidad para los
comentarios pblicos que puedan hacerse sobre recomendaciones durante la elaboracin de stas. La
VICH se centra en la armonizacin de los requisitos de registro para los productos medicinales de uso
veterinario, en la Unin Europea, EE.UU. y Japn.
A los pases no involucrados en la VICH, se les mantiene informados de sus progresos a travs de la OIE. Se
toman en consideracin los productos biolgicos, pero sin dar alas, por el momento, a los promotores de una
expansin adicional.
4.2. El Comit Directivo

Para la existencia de la VICH, es fundamental el Comit Directivo, que est autorizado para dirigir el proceso de
armonizacin. El Comit Directivo consta de dos delegados de cada una de las autoridades reguladoras y de las
asociaciones industriales en las tres regiones. Australia y Nueva Zelanda (juntas) y Canad tienen estatus de
observadoras, con un delegado que representa a las autoridades gubernativas y otro que representa a las
asociaciones industriales. Se ha autorizado una categora adicional de partes interesadas, y a los encuentros del
Comit Directivo asisten delegados del Comit de las Amricas para la Armonizacin del Registro y Control de
Medicamentos Veterinarios (CAMEVET) y de la Asociacin de Compaas de Productos Veterinarios (AVBC).
4.3. Los Grupos de Trabajo

Con el fin de conseguir la armonizacin en torno a los temas seleccionados, el Comit Directivo de la VICH
nombra grupos de trabajo para preparar las recomendaciones. Normalmente, cada grupo de trabajo est
integrado por seis expertos -cada uno de ellos representando a un miembro de pleno derecho de la VICH.
Pueden nombrarse por el Comit Directivo, expertos adicionales de los pases observadores - o incluso de otros
pases - si se considera apropiado.
El Comit Directivo nombra un director para cada tema. Dicho director es responsable de iniciar el grupo de
trabajo dirigiendo el trabajo del grupo. Normalmente, el director preside el grupo de trabajo y es responsable de
la entrega del borrador de directrices armonizadas al Comit Directivo.
El Comit Directivo ha creado grupos de trabajo especficos para ocuparse de la armonizacin de pruebas
usadas para el control de las vacunas de uso veterinario. Este es el grupo de trabajo encargado de supervisar la
calidad de los productos biolgicos.
4.4. La VICH y el papel de las federaciones industriales

La IFAH3, la "industria motor" en el proceso de la VICH, es la responsable de la secretaria completa de la VICH.
Esto conlleva la preparacin de los documentos para las reuniones de los miembros de la VICH, la puesta en
venta de las publicaciones, la distribucin de los documentos de los grupos de trabajo y la publicacin de las
recomendaciones adoptadas por el Comit Directivo. El IFAH tambin coordina los emplazamientos de las tres
federaciones industriales de mbito regional. El AHI4 , la FEDESA5 y la JVPA6, tienen la responsabilidad de
garantizar que la opinin de sus respectivas regiones est debidamente representada. Esas organizaciones
envan expertos industriales a cada grupo de trabajo, para que acten como enlace con las autoridades
regionales y se responsabilicen de la organizacin de las conferencias locales para discutir y dar publicidad a las
recomendaciones de la VICH.
CONCLUSIN
En este momento, existe una clara intencin de alcanzar una gran armonizacin internacional para la regulacin
de los requisitos exigidos para los productos biolgicos de uso veterinario (14). Se ha progresado a travs de las
organizaciones internacionales para permitir una competencia justa en el mercado de los productos veterinarios.
Sin embargo los esfuerzos hechos en el pasado por organizaciones internacionales no han dado como resultado
un nivel suficiente de armonizacin que facilite el mercado internacional. Dichos esfuerzos han servido de base
para los gestiones actuales Las autoridades nacionales reconocen la ventaja de una armonizacin y estn ahora
dedicadas a la consecucin de dicho objetivo.
3
4
5
6
Federacin Internacional para la Sanidad Animal (Internacional Federation for Animal Health)
Instituto para la Sanidad Animal (Animal Health Institute, EE.UU.)
Federacin Europea para la Sanidad Animal (Fdration Europenne de la Sant Animale)
Asociacin Japonesa de Farmacologa Veterinaria (Japanese Veterinary Pharmaceutical Association)
109
Captulo I.1.9.

Los esfuerzos de las organizaciones internacionales han hecho posible el objetivo de la armonizacin y como
consecuencia la creacin de una organizacin y de un proceso que caminan hacia ese objetivo. El xito en
alcanzar dicho objetivo depender de la buena voluntad de las autoridades participantes de trabajar juntos y
aceptar los compromisos que sern necesarios para resolver las dificultades de los asuntos cientficos y polticos.
REFERENCIAS
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Pharmaceutical Affairs Law, Enforcement Ordinance and Enforcement Regulations, Yakugyo Jiho, Japan,
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2.
ANON (2002). The Minimum Requirements for Biological Products for Animal Use. Ministry of Agriculture,
Forestry and Fisheries Notice No. 1567 in 2002, as amended ON 3 May 1993. Japan Association of
Veterinary Biologics, Tokyo, Japan, 1680 (in Japanese).
3.
ANON (2002). The Assay Standard for Biological Products for Animal Use. Ministry of agriculture, Forestry
and Fisheries Notice No. 1568 in 2002, as amended at 25 September 1997. Japan Association of Veterinary
Biologics, Tokyo, Japan, 1507 (in Japanese).
4.
ARTIGES A. (1997). The role of the pharmacopoeias. In: Veterinary Vaccinology, Pastoret P.P., Blancou J.,
Vannier P. & Verschueren C., eds. Elsevier Science, Amsterdam, the Netherlands, 674679.
5.
BRUNKO P. (1997). Procedures and technical requirements in the European Union. In: Veterinary
Vaccinology, Pastoret P.P., Blancou J., Vannier P. & Verschueren C., eds. Elsevier Science, Amsterdam,
the Netherlands, 705717.
6.
CODE OF FEDERAL REGULATIONS (1998). Animals and Animal Products, Title 9, Parts 1199. The Office of the
Federal Register, National Archives and Records Administration. US Government Printing Office,
Washington DC, USA.
7.
EUROPEAN UNION (1999). The Rules Governing Medicinal Products in the European Union. Eudralex, Vols 4
9. Office Publications of the European Communities, Luxembourg.
8.
JOINT FOOD AND AGRICULTURE ORGANIZATION OF THE UNITED NATIONS (FAO)/W ORLD HEALTH ORGANIZATION
(WHO) EXPERT COMMITTEE ON BRUCELLOSIS (1986). Sixth Report. WHO Technical Report Series No. 740,
World Health Organization, Geneva, Switzerland, 132 pp.
9.
MAKIE H. (1998). The activities of veterinary vaccine control laboratories. Rev. sci. tech. Off. Int. Epiz., 17,
578584.
10. MESLIN F.-X., KAPLAN M.M. & KOPROWSKI H. (1996). Laboratory Techniques in Rabies. World Health
Organization, Geneva, Switzerland, 476 pp.
11. OFFICE INTERNATIONAL DES EPIZOOTIES (OIE) (2004). Manual of Diagnostic Tests and Vaccines for Terrestrial
Animals (mammals, birds and bees), Fifth Edition. Office International des Epizooties, Paris, France.
12. PASTORET P.P. & FALIZE F. (1998). Licensing procedures for immunological veterinary medicinal products in
the European Union. Adv. Vet. Med., 41, 595607.
13. TRUSZCZYNSKI M. & BLANCOU J (1992). The role of the Office International des Epizooties in the
standardisation of biologicals. In: Symposium on the First Steps Towards an International Harmonization of
Veterinary Biologicals and Free Circulation of Vaccines within the EEC, Ploufragan, 1992. Dev. Biol. Stand.,
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14. VANNIER P., TRUSZCYNSKI M. & ESPESETH D. (1997). Implementing International harmonisation. In: Veterinary
Vaccinology, Pastoret P.P., Blancou J., Vannier P. & Verschueren C., eds. Elsevier Science, Amsterdam,
the Netherlands, 712717.
15. WORLD HEALTH ORGANIZATION (WHO) EXPERT COMMITTEE ON BIOLOGICAL STANDARDISATION (1992). Fortysecond Report. WHO Technical Report Series No. 822, World Health Organization, Geneva, Switzerland, 84
pp.
110
Captulo I.1.9.

16. WORLD HEALTH ORGANIZATION (WHO) EXPERT COMMITTEE ON RABIES (1992). Eighth Report. WHO Technical
Report Series No. 824, World Health Organization, Geneva, Switzerland, 75 pp.
*
* *
111
CAPTULO I.1.10.
MTODOS DE LABORATORIO
PARA ENSAYOS DE SENSIBILIDAD DE BACTERIAS
FRENTE A ANTIMICROBIANOS
INTRODUCCION
La amplia propagacin de bacterias patgenas con resistencia mltiple a los antibiticos ha sido
reconocida como un importante problema global para la sanidad animal y humana por la OIE y la
Organizacin Mundial de la Salud. La aparicin de resistencias a antimicrobianos en diversas
bacterias patgenas ha convertido a las pruebas de sensibilidad frente a estas sustancias en algo
esencial cuando se emplean antimicrobianos con fines terapeticos. La resistencia de un patgeno
frente a un antimicrobiano determinado permite predecir que el tratamiento no resultar eficaz,
mientras que la sensibilidad del patgeno al mismo constituye una excelente base para elegir el
tratamiento antibacteriano adecuado. Por tanto, el ensayo de sensibilidad frente a antimicrobianos
es un importante componente de cualquier programa eficaz de tratamiento. Adems, en el caso de
bacterias patgenas aisladas, las pruebas de sensibilidad inciden en las directrices generales que
deben seguirse a nivel mundial para un uso prudente de los antimicrobianos en la produccin
animal, y los veterinarios deberan tener en cuenta estos datos (1).
Las pruebas de sensibilidad a antimicrobianos son tambin la base del control epidemiolgico de
las bacterias patgenas para el hombre y los animales. Tal control suministra un punto de partida
para elegir adecuadamente un tratamiento emprico (primera lnea de terapia) y para detectar la
aparicin y/o la diseminacin de cepas bacterianas resistentes as como los determinantes de la
resistencia en diferentes especies de bacterias. La estandarizacin y homologacin de las diversas
metodologas de ensayo de sensibilidad frente a antimicrobianos, utilizadas en el control
epidemiolgico de la resistencia a compuestos antimicrobianos, constituyen un factor clave si se
pretende comparar datos entre los diferentes programas nacionales e internacionales de
seguimiento de los paises miembros de la OIE. Resulta esencial que los mtodos de ensayo de
sensibilidad a antimicrobianos generen resultados reproducibles en laboratorios de uso diario y que
los datos puedan ser comparables con los resultados obtenidos por un mtodo patrn de
referencia conocido como la norma de oro. En ausencia de mtodos estandarizados o de
procedimientos de referencia, los resultados de sensibilidad obtenidos en laboratorios diferentes no
pueden compararse con fiabilidad.
Este Captulo contiene directrices metodolgicas para las pruebas de sensibilidad frente a antimicrobianos e
incluye procedimientos para estandarizar y normalizar la interpretacin de los resultados de dichas pruebas.
1.
Requerimientos de las pruebas
Para lograr la estandarizacin de los mtodos de determinacin de la sensibilidad a antimicrobianos y la

comparacin de sus resultados, hay que tener en cuenta los siguientes principios:
i)
Son cuestiones esenciales el uso de mtodos estandarizados y la homologacin de los datos sobre
sensibilidad (incluyendo los criterios de interpretacin).
ii)
Tanto los mtodos estandarizados como unos criterios similares de interpretacin deberan ser aceptados y
usados por todos los laboratorios implicados.
iii)
Todos los mtodos de determinacin de sensibilidad a antimicrobianos deberan dar lugar a resultados
reproducibles.
112
Captulo I.1.10. Mtodos de laboratorio para ensayos de sensibilidad de bacterias

frente a antimicrobianos
iv)
Todos los datos han de poder describirse en trminos cuantitativos
v)
Resulta esencial establecer una red de laboratorios designados a nivel nacional o regional para coordinar
las metodologas, interpretaciones y controles de calidad de las pruebas de sensibilidad a antimicrobianos.
vi)
Los laboratorios de Microbiologa deberan llevar a cabo su trabajo dentro de un sistema interno de
aseguramiento de la calidad.
vii)
Los laboratorios deberan estar acreditados, siempre que sea posible, y participar en programas externos
de mejora.
viii) La existencia de cepas bacterianas especficas para referencia y control de calidad resulta necesaria a fin
de determinar el nivel de control de calidad, la seguridad y la mejora de las pruebas dentro de un mismo
laboratorio, y entre varios laboratorios.
2.
Metodologa de las pruebas de sensibilidad a antimicrobianos
Deben tenerse en cuenta las siguientes exigencias:

i)
Las bacterias sometidas a ensayo deben aislarse en cultivo puro a partir de las muestras enviadas.
ii)
El procedimiento para el aislamiento de cada bacteria en particular debe estar estandarizado, de modo que
las bacterias analizadas puedan ser identificadas de forma correcta y lgica hasta el nivel de gnero y/o
especie.
iii)
Cuando sea posible, las bacterias aisladas deben ser guardadas para ulteriores anlisis (mediante
liofilizacin o conservacin en fro entre -70 y -80C).
A su vez, se requiere la estandarizacin de los siguientes factores que influencian los ensayos de sensibilidad
frente a antimicrobianos:
i)
Una vez que se ha aislado la bacteria en cultivo puro, el inculo debe normalizarse para obtener resultados
precisos de sensibilidad.
ii)
La composicin de los medios slidos y lquidos utilizados (en cuanto a pH, catione timidina o timina, o el
uso de medios de cultivo suplementados).
iii)
El contenido de la sustancia antimicrobiana en la forma utilizada de suministro (en disco, tira o tableta).
iv)
La composicin de los solventes y diluyentes empleados en la preparacin de las soluciones stock de

antimicrobianos.
v)
Las condiciones de crecimiento e incubacin (tiempo, temperatura, tipo de atmsfera, por ejemplo
presencia de CO2).
vi)
Concentracin del agar como agente solidificante.
vii)
Los criterios posteriores de interpretacin.
Por estos motivos, se debe destacar la especial importancia de los procedimientos normalizados y de los
mtodos estandarizados, ya que slo puede lograrse una reproducibilidad adecuada mediante el uso de una
metodologa modelada.
3.
Seleccin de la metodologa para determinar la sensibilidad al antimicrobiano
La seleccin de una metodologa apropiada para determinar la sensibilidad frente a los antimicrobianos debe
estar basada en los siguientes principios:
i)
Facilidad de realizacin
ii)
Flexibilidad
iii)
Adaptacin a sistemas automatizados o semiautomatizados
iv)
Coste
v)
Reproducibilidad
vi)
Fiabilidad
vii)
Exactitud
viii) Preferencias nacionales e internacionales.
113

4.
Mtodos de ensayo
Los tres mtodos que se citan a continuacin son los nicos que suministran resultados significativamente
reproducibles:
i)
Difusin en disco
ii)
Dilucin en medio lquido
iii)
Dilucin en medio slido con agar
a)
Mtodo de difusin en disco

La difusin en disco hace referencia a la difusin que experimenta un agente antimicrobiano a una
determinada concentracin a partir de discos, tiras o tabletas, que se depositan en un medio de cultivo
slido que ha sido sembrado con un inculo bacteriano estandarizado. El mtodo de difusin en disco se
basa en la determinacin de una zona de inhibicin del crecimiento que es proporcional a la sensibilidad de
la bacteria frente al antimicrobiano presente en el disco.
La difusin de un antimicrobiano en un medio de cultivo inoculado crea un gradiente de la sustancia
antimicrobiana. Cuando su concentracin llega a ser tan diluida que no logra inhibir el crecimiento de la
bacteria ensayada, termina la zona de inhibicin. Tericamente, el borde de esta zona de inhibicin se
corresponde con la concentracin mnima inhibitoria (MIC) para esa combinacin concreta de bacteria y
antimicrobiano. En otras palabras, la zona de inhibicin se correlaciona de modo inversamente proporcional
con el valor de la MIC para la bacteria ensayada. En general, cuanto mayor es la zona de inhibicin, menor
es la concentracin de antimicrobiano que se requiere para inhibir el crecimiento de los microorganismos.
No obstante, esto depende tambin de la concentracin del antibitico en el disco y de su capacidad de
difusin.
Hay que advertir que las pruebas de difusin en disco basadas solamente en la presencia o ausencia de
una zona de inhibicin, sin considerar su tamao, no son aceptables como ensayos para la sensibilidad a
antimicrobianos desde el punto de vista metodolgico.
Consideraciones sobre el uso de la tcnica de difusin en disco
La difusin en disco es fcil de realizar, reproducible, y no requiere disponer de una infraestructura cara.
Sus principales ventajas son:
i)
Bajo coste
ii)
Facilidad para modificar los discos con los antimicrobianos de prueba cuando ello se requiere.
La medicin manual de las zonas de inhibicin puede llevar excesivo tiempo. Sin embargo, existen
dispositivos automticos que permiten leer las zonas y que pueden integrarse en sistemas de
procesamiento de datos y de informes de laboratorio. Se puede colocar hasta un mximo de 12 discos por
cada placa de cultivo de 150 mm de dimetro y un mximo de 5 discos por placa de 100 mm.
Independientemente del nmero de discos depositados sobre la superficie del medio solidificado con agar,
stos deben de estar distribuidos de forma uniforme de modo que no estn a una distancia menor de
24 mm, desde el centro de un disco al centro de otro.
b)
Mtodos de dilucin en medio lquido y en medio slido

La finalidad de estos mtodos es determinar la concentracin ms baja del antimicrobiano ensayado que es
capaz de inhibir el crecimiento de la bacteria analizada (MIC, concentracin mnima inhibitoria, que
normalmente se expresa en microgramos/mililitro o miligramos/litro). Sin embargo, la MIC no siempre
representa un valor absoluto. La "verdadera" MIC es un punto que se encuentra entre la concentracin ms
baja del ensayo que inhibe el crecimiento de la bacteria y la siguiente concentracin ms baja del ensayo.
El rango de los antimicrobianos debera:
114
i)
Abarcar tanto los criterios de interpretacin (sensibilidad, valor intermedio y resistencia) como los
organismos de referencia para el control de calidad.
ii)
Tener en consideracin las concentraciones de antimicrobiano que se pueden alcanzar in vivo para
una combinacin especfica de antibitico y bacteria.

Los mtodos para determinar la sensibilidad a antimicrobianos que se basan en diluciones parecen ser mas
reproducibles y fciles de cuantificar que los basados en difusin. Sin embargo, los antibiticos se ensayan
normalmente mediante diluciones en serie reduciendo la concentracin a la mitad, lo que puede originar
datos inexactos en cuanto a la MIC.
Cualquier laboratorio que pretenda usar un mtodo de dilucin y utilizar sus propios reactivos y diluciones
de antibiticos debera tener la capacidad de obtener, preparar y mantener un stock de soluciones de
antimicrobianos de pureza adecuada y generar diluciones de trabajo de modo regular. Por consiguiente, es
importante que tales laboratorios usen organismos de control garantizado (ver ms adelante) para asegurar
la precisin y estandarizacin en sus procedimientos.
Dilucin en caldos de cultivo.
La dilucin en medio lquido es una tcnica en la que se prueba una suspensin normalizada de bacterias
frente a varias concentraciones de un agente antimicrobiano (normalmente mediante diluciones seriadas
que reducen la concentracin a la mitad) en un medio lquido estandarizado. El mtodo se puede realizar
tanto en tubos con un contenido mnimo de 2 ml (macrodilucin) como en volmenes ms pequeos,
utilizando placas de microtitulacin (microdilucin). Existen comercialmente en el mercado varios tipos de
placas de microtitulacin que contienen antibiticos prediluidos dentro de los pocillos de las placas. El uso
de lotes idnticos de estas placas de microtitulacin ayuda a eliminar errores potenciales que pueden surgir
durante la preparacin y dilucin de los antimicrobianos. Dicho uso, junto a un protocolo normalizado,
incluyendo cepas de referencia con control de calidad, puede facilitar la homologacin si se dispone de
suficientes recursos financieros.
Debido a que en la actualidad la mayor parte de las pruebas para antimicrobianos mediante microdilucin
en medio lquido se preparan comercialmente, estas pruebas pueden considerarse menos flexibles que las
basadas en dilucin en medio slido o en difusin en disco en cuanto a su capacidad para admitir cambios
necesarios derivados del programa de control y seguimiento.
Como la compra de la infraestuctura necesaria y el conjunto de antimicrobianos puede resultar costosa,
esta metodologa no se suele elegir en laboratorios con presupuestos limitados.
Dilucin en medio slido
La dilucin en medio slido implica la incorporacin de un agente antimicrobiano a concentraciones

progresivamente crecientes en un medio solidificado con agar y la aplicacin de un inculo bacteriano
definido a la superficie de la placa que contiene el agar. A menudo, los resultados derivados de estos
ensayos se consideran como los estndares de oro en la determinacin del valor MIC para una
determinada combinacin bacteria/antimicrobiano en una prueba concreta.
Las ventajas de los mtodos de dilucin en medio slido son:
i)
Un mayor control en la pureza de la bacteria ensayada.
ii)
La capacidad de ensayar simultneamente varias bacterias en una misma placa de medio con agar.
iii)
La mejora potencial en cuanto a la determinacin de valores MIC por extensin del rango de
concentraciones del antimicrobiano.
iv)
Posibilidad de semi-automatizar el procedimiento mediante la utilizacin de un replicador del inculo.

Existen en el mercado unos replicadores de los inculos que pueden transferir entre 32 y 36 inculos
bacterianos diferentes a cada una de las placas con medio slido.
Los mtodos de dilucin en medio slido tienen algunos inconvenientes, por ejemplo:
i)
Son muy laboriosos y requieren importantes recursos econmicos y tcnicos.
ii)
Una vez que se preparan deben usarse en el trmino de una semana.
iii)
Los puntos finales no son siempre fciles de determinar ni resulta fcil verificar la pureza del inculo.
La dilucin en medio slido se recomienda a menudo como un ensayo estandarizado para medir la
sensibilidad a antimicrobianos de organismos difciles de cultivar, como es el caso de especies de
Helicobacter y Campylobacter. Sin embargo, al menos en la prctica veterinaria, la microdilucin en medio
lquido tambin funciona muy bien con organismos como Haemophilus, Campylobacter y Brachyspira, entre
otros.
115

c)
Otras pruebas para determinar la sensibilidad a bacterias y la resistencia a antimicrobianos

especficos
Las concentraciones mnimas inhibitorias de antimicrobianos para bacterias se pueden obtener, adems,
mediante tiras de gradientes disponibles en el mercado que permiten la difusin de una concentracin
preformada de antibitico. Sin embargo, el uso de tiras de gradientes puede ser muy caro y originar
discrepancias en cuanto a MIC cuando sus resultados se comparan con los obtenidos mediante dilucin en
medio slido (2).
Cualquiera que sea el mtodo usado, los procedimientos deberan estandarizarse para lograr resultados
exactos y reproducibles. Cada vez que se realiza una prueba de sensibilidad a antimicrobianos se necesita
probar tambin los microorganismos de referencia con control de calidad para asegurarse de la exactitud de
los datos.
La eleccin apropiada en cuanto al sistema para determinar la sensibilidad depender, en ltimo trmino de
las propiedades de crecimiento de la bacteria en cuestin. En circunstancias especiales, pueden resultar
adecuados nuevos mtodos para la deteccin de fenotipos de resistencia particulares. Por ejemplo,
pruebas basadas en cefalosporinas cromognicas (como nitrocefin) o pruebas equivalentes, pueden revelar
resultados rpidos y fiables sobre determinacin de beta-lactamasas en algunas bacterias.
De modo similar, puede detectarse un amplio espectro de actividad beta-lactamasa en algunas bacterias
mediante mtodos estndar de sensibilidad por difusin en disco utilizando cefalosporinas especficas
(cefotaxima y ceftazidima) en combinacin con un inhibidor de beta-lactamasas (como el cido clavulnico),
y midiendo las zonas de inhibicin resultantes. Adems, la resistencia al cloranfenicol atribuible a la
produccin de cloranfenicol-acetil transferasa se puede detectar en algunas bacterias mediante pruebas
rpidas en un tubo o en papel de filtro en cuestin de 1-2 horas (4).
5.
Puntos crticos de sensibilidad y criterios de zona de inhibicin
El objetivo de una prueba de sensibilidad in vitro a los antimicrobianos es predecir el modo en que un patgenos
bacteriano va a responder al agente antimicrobiano in vivo. Independientemente de si se usan mtodos de
difusin o de dilucin, los resultados de estas pruebas in vitro clasifican las bacterias respecto a la accin de un
antimicrobiano particular como resistentes, sensibles o con efecto intermedio.
Los puntos crticos de sensibilidad a antimicrobianos los establecen organizaciones nacionales, sociedades
profesionales o agencias reguladoras. Deberan consultarse los documentos pertinentes. No obstante, pueden
existir notables diferencias entre diferentes pases en relacin con un mismo agente antimicrobiano.
Como se ha indicado previamente, los resultados de las pruebas de sensibilidad a antimicrobianos deberan
expresarse cuantitativamente:
i)
como distribucin de concentraciones mnimas inhibitorias en miligramos por litro.
ii)
como dimetros de zonas de inhibicin en milmetros.
Los dos siguientes factores son importantes para interpretar si una bacteria es sensible o resistente a un agente
antimicrobiano:
i)
El desarrollo y establecimiento de intervalos de control de calidad, usando siempre que sea posible pruebas
de difusin y pruebas de dilucin para microorganismos de control de calidad.
Esto resulta esencial para validar el mtodo especfico de sensibilidad a antimicrobianos que se use. Las
series de control de calidad para los microorganismos control deberan establecerse antes de determinar
los puntos crticos de sensibilidad o resistencia.
ii)
La determinacin de criterios de interpretacin apropiados.

Esto implica la generacin de tres distintos tipos de datos:
distribucin poblacional de valores MIC para organismos relevantes
parmetros farmacocinticos del agente antimicrobiano
resultados de ensayos clnicos y experiencia
La interpretacin de los datos incluye la creacin de un diagrama de puntos a partir de la distribucin de la

poblacin bacteriana (aislamientos bacterianos representativos), representando la zona de inhibicin frente al
116

valor MIC para cada bacteria patgena. La seleccin de puntos crticos se basar en mltiples factores,
incluyendo el anlisis de la lnea de regresin que correlaciones los valores MIC y los dimetros zonales de
inhibicin, distribucin de poblaciones bacterianas, lmites de error, farmacocintica y, finalmente, la verificacin
clnica.
El desarrollo del concepto de "puntos crticos microbiolgicos", que se basa en las distribuciones poblacionales
de la especie bacteriana concreta comprobada, puede ser mas adecuado para algunos programas de control. En
este caso los aislamientos de bacterias que se desvan de la poblacin sensible normal se deberan considerar
resistentes, y los cambios de sensibilidad en una combinacion especfica antimicrobiano/bacteria podran ser
objeto de seguimiento (5).
6.
Directrices para las pruebas de sensibilidad a antimicrobianos
Se dispone actualmente de varias directrices a nivel mundial para las pruebas de sensibilidad a antimicrobianos y
para los correspondientes criterios de interpretacin de las pruebas. Entre otras, se incluyen las directrices y
referencias publicadas por:
Comit Nacional para Estndares de Laboratorios Clnicos (NCCLS)
Sociedad Britnica de Quimioterapia Antimicrobiana (BSAC)
Comit de Antibiogramas de la Sociedad Francesa de Microbiologa (CASFM)
Instituto Alemn de Normativas (DIN)
Sociedad Japonesa de Quimioterapia (JSC)
Werkgroep richtlijnen gevoeligheidsbepalingen (Sistema WRG, Pases Bajos)
Hasta ahora, solo el NCCLS ha desarrollado protocolos para ensayos de sensibilidad de bacterias aisladas de
animales y ha determinado criterios interpretativos (4). Sin embargo, existen protocolos y directrices disponibles
de varias organizaciones y sociedades profesionales sobre pruebas de sensibilidad para especies bacterianas
afines que causan infecciones en humanos. Es posible que se puedan adoptar tales directrices para las pruebas
de sensibilidad de bacterias aisladas de animales pero cada pas debe evaluar sus propias directrices y pautas
de estandarizacin. Adems, estn progresando determinados esfuerzos encaminados a homologar a escala
internacional los puntos crticos de sensibilidad. Estos esfuerzos inciden principalmente en la adopcin de los
estndares y directrices del NCCLS, que contempla la existencia de laboratorios con mtodos normalizados y
valores de control de calidad que permiten establecer comparaciones sobre las pruebas de sensibilidad a
antimicrobianos y sobre los datos generados. Para los pases miembros de la OIE que no tienen mtodos de
determinacin de sensibilidad estandarizados, la adopcin de las indicaciones y los estndares del NCCLS
debera ser un paso inicial apropiado.
Como primer paso hacia una comparacin de datos de seguimiento y control, se anima a los pases miembros a
disear un programa homologado y estandarizado (6). Los datos procedentes de pases que usan otros diseos
metodolgicos y de estudio pueden no ser directamente comparables (3,6). A pesar de esto, los datos
acumulados a lo largo del tiempo en un determinado pas pueden servir al menos para permitir la deteccin de
apariciones de resistencia microbiana o tendencias en la prevalencia de resistencias en dicho pas. No obstante,
si se presentan juntos los resultados que se han obtenido con diferentes mtodos, debe demostrarse que es
posible la comparacin de los resultados y que se puede alcanzar un consenso interpretativo.
Ntese que esto podr llevarse a cabo ms fcilmente utilizando mtodos de determinacin de la sensibilidad a
antimicrobianos que sean exactos y fiables, acoplados a un seguimiento operativo de los ensayos, y con el
empleo por los laboratorios participantes de cepas bacterianas con control de calidad definido.
7.
Comparacin de resultados
Para determinar la comparacin de resultados que se originan en diferentes sistemas de vigilancia, los
resultados deben ser cuantitativos y deben incluir informacin sobre los mtodos, organismos de control de
calidad e intervalos de concentracin de antimicrobianos empleados, as como los criterios de interpretacin
usados.
8.
Control de calidad y seguridad de calidad
Los laboratorios que realizan determinaciones de sensibilidad a antimicrobianos deberan establecer sistemas
adecuados para lograr tanto control de calidad como seguridad de calidad.
Deben verificarse los siguientes componentes:
i)
precisin del procedimiento de ensayo
ii)
exactitud del procedimiento de ensayo
117

iii)
personal del laboratorio.
iv)
funcionamiento de los reactivos apropiados
Tambin deberan respetarse las siguientes exigencias:

i)
Estricto cumplimiento de las tcnicas estandarizadas junto a un control de calidad de los medios y reactivos.
ii)
Mantener registro de:
los nmeros de lote de todos los materiales y reactivos adecuados
las fechas de caducidad de todos los materiales y reactivos
iii)
Tambin debera comprobarse que las bacterias de referencia tienen el adecuado control de calidad vi)
para asegurar la estandarizacin, independientemente del mtodo utilizado para determinacin de
sensibilidad.
iv)
Las cepas bacterianas de referencia tendran que ser catalogadas y caracterizadas por fenotipos estables y
definidos en cuanto a sensibilidad a los antimicrobianos.
v)
Los laboratorios implicados en los ensayos deberan utilizar las cepas de referencia apropiadas con control
de calidad.
vi)
Las cepas de referencia deben mantenerse en cultivos stock de los que se puedan derivar subcultivos de
trabajo y deben proceder de colecciones de cultivo nacionales o internacionales. Las cepas bacterianas de
referencia deben mantenerse en laboratorios centrales o regionales designados al efecto.
vii)
El mejor mtodo para analizar en su conjunto las realizaciones de cada laboratorio es ensayar las cepas
bacterianas con control de calidad cada da que se lleven a cabo pruebas de sensibilidad.
Como esto no siempre resulta fcil o econmico, la frecuencia de tales ensayos de control de calidad puede
reducirse si el laboratorio demuestra que los procedimientos seguidos para determinar la sensibilidad son
reproducibles. Si aparecen errores con los controles de calidad, el laboratorio tiene la responsabilidad de
determinar las causas y repetir las pruebas. En caso de que no pueda determinar el origen de los errores,
los ensayos de control de calidad deberan reiniciarse diariamente.
viii) Cada vez que se inicie el empleo de un nuevo lote de medio de cultivo o de placas, y de forma peridica, se
debera probar el comportamiento de las cepas de control de calidad en paralelo con las cepas bacterianas
a estudiar.
ix)
Se debe tener en cuenta la adopcin de medidas adecuadas de bioseguridad cuando se reciban o se

enven las cepas de referencia de control de calidad entre los laboratorios participantes. El empleo de tales
cepas permitir la comparacin de los datos sobre la sensibilidad a antimicrobianos (fase de seguimiento).
9.
Pruebas externas de capacitacin
Para asegurar que los datos de sensibilidad que se describen son de hecho correctos, los pases miembros de la
OIE deberan llevar a cabo pruebas de capacitacin externas (es decir, desarrolladas por una tercera parte).
Estas pruebas de habilitacin pueden desarrollarse a nivel nacional. Se invita a que los laboratorios de pases
miembros participen en comparaciones internacionales entre diferentes laboratorios. A este respecto, deberan
tenerse en cuenta todas las especies bacterianas importantes.
Cada pas debera designar o establecer laboratorios nacionales responsables de:
i)
verificar los programas de seguridad sobre la calidad de los laboratorios que participan en el control y
seguimiento de las resistencias frente a los antimicrobianos
ii)
suministrar a dichos laboratorios un lote de cepas de referencia.
iii)
Crear una base de datos centralizada, disponible en Internet (p. ej. EARSS) que contenga los diferentes
perfiles de resistencia para cada especie bacteriana.
118

REFERENCIAS
1.
ANTHONY F., ACAR J., FRANKLIN A., GUPTA R., NICHOLLS T., TAMURA Y., THOMPSON S., THRELLFALL E.J., VOSE D.,
VAN VUUREN M. & W HITE D.G. (2001). Antimicrobial resistance: responsible and prudent use of antimicrobial
agents in veterinary medicine. Rev. sci. tech. Off. int. Epiz., 20, 829839.
2.
BROWN D.F. & BROWN L. (1991). Evaluation of the E-test, a novel method of quantifying antimicrobial activity.
J. Antimicrob. Chemother., 26, 185190.
3.
LEEGARD T.M., CAUGANT D.A., FROHOLM L.O. & HOIB, E.A. (2000). Apparent differences in antimicrobial
susceptibility as a consequence of national guidelines. Clin. Microbiol. Inf. Dis., 6, 290293.
4.
NATIONAL COMMITTEE FOR CLINICAL LABORATORY STANDARDS (NCCLS) (2002). Document M31-A2.
Performance Standards for Antimicrobial Disk and Dilution Susceptibility Tests for Bacteria Isolated from
Animals, Approved Standard, Second Edition. document M31-A2. NCCLS, 940 West Valley Road, Suite
1400, Wayne, Pennsylvania 19087-1898, USA, 80 pp.
5.
RINGERTZ S., OLSSON-LILJEQUIST B., KAHLMETER G. & KRONVALL G. (1997). Antimicrobial susceptibility testing
in Sweden II. Species-related zone diameter breakpoints to avoid interpretive errors and guard against
unrecognised evolution of resistance. Scand. J. Infect. Dis. (Suppl.), 105, 812.
6.
THRELFALL E.J., FISHER I.S.T., WARD L., TSCHAPE H. & GERNER-SMIDT P. (1999). Harmonization of antibiotic
susceptibility testing for Salmonella: Results of a study by 18 national reference laboratories within the
European Union-funded Enter-Net group. Microb. Drug Resist., 5, 195199.
7.
WHITE D.G., ACAR J., ANTHONY F., FRANKLIN A., GUPTA R., NICHOLLS T., TAMURA Y., THOMPSON S., THRELFALL
J.E., VOSE D., VAN VUUREN M., W EGENER H., & COSTARRICA L. (2001). Standardisation and harmonisation of
laboratory methodologies for the detection and quantification of antimicrobial resistance. Rev. sci. tech. Off.
int. Epiz., 20, 849858.
*
* *
NB: Existen laboratorios de referencia de la OIE para Ensayos de sensibilidad a antimicrobianos (ver Cuadro en
la parte 3 de este Manual de animales terrestres o consultar la pgina web de la OIE para una lista actualizada:
www.oie.int)
119
PARTE 2
121
SECCIN 2.1.
CAPTULO 2.1.1.
FIEBRE AFTOSA
RESUMEN
La fiebre aftosa (FA) o glosopeda es la enfermedad ms contagiosa de los mamferos y posee un
gran potencial para causar graves prdidas econmicas en animales ungulados de pezua
hendida. Existen siete serotipos del virus de la FA, que son O, A, C, SAT1,SAT2, SAT3 y Asia1. La
infeccin con un serotipo no confiere proteccin frente a otro. Clnicamente, la FA no se puede
diferenciar de otras enfermedades vesiculares, como la enfermedad vesicular porcina, estomatitis
vesicular y el exantema vesicular. El diagnstico de laboratorio en los casos de sospecha de FA es
por tanto un asunto de urgencia.
Los casos tpicos de FA se caracterizan por la aparicin de vesculas en las patas, la mucosa bucal
y, en el caso de las hembras, en las mamas. Los sntomas clnicos varan desde ligeros a graves y
pueden ocasionar muerte, en especial en animales jvenes. En algunas especies, la infeccin
puede ser subclnica, como en el bfalo africano (Syncerus caffer). El mejor tejido para el
diagnstico es el epitelio de vesculas intactas o recin rotas o del lquido vesicular. Cuando esto
no es posible, una fuente alternativa de virus son las muestras de sangre y/o de lquido esofgicofarngeo tomadas con sonda en los rumiantes o por frotis de garganta en el caso de los cerdos. En
casos de muerte se puede enviar tejido del miocardio o sangre pero, si estn presentes las
vesculas, stas son preferibles.
Es importante que el transporte de muestras de casos sospechosos sea seguro y adaptado a
normas internacionales. Slo deben enviarse a laboratorios autorizados.
El diagnstico de la FA requiere el aislamiento del virus o la demostracin del antgeno vrico de la
FA o el cido nucleico en las muestras de tejidos o fluidos. Tambin puede utilizarse para
diagnstico la deteccin de anticuerpos humorales especficos. El uso del serodiagnstico est
incrementndose con las nuevas pruebas desarrolladas con protenas no estructurales (NSP) que
permiten la deteccin de infecciones pasadas o presentes, independientemente del estado de
vacunacin.
Identificacin del agente: Para un diagnstico positivo, es suficiente con la demostracin del
antgeno vrico de la FA. Debido a la naturaleza tan contagiosa y a la importancia econmica de la
FA, el diagnstico de laboratorio y la identificacin del serotipo del virus deben realizarse en un
laboratorio con seguridad para el trabajo con virus.
El uso de la fijacin del complemento (FC) se ha reemplazado en muchos laboratorios por el
enzimoinmunoensayo (ELISA), ya que este ltimo es ms especfico y sensible y no se ve
afectado por factores pro- y anti-complementarios. Si la muestra es inadecuada o el resultado de la
prueba no es concluyente, ser necesario cultivar el virus en cultivos celulares o en ratones
lactantes de 2-7 das. Con preferencia, los cultivos deberan de ser cultivos primarios de tiroides
bovino, aunque se pueden utilizar clulas de rin de cerdo, cordero o ternero, o lneas celulares
de sensibilidad comparable. Cuando en los cultivos aparece un efecto citoptico (ECP), se pueden
utilizar los sobrenadantes en pruebas FC o ELISA. Se pueden realizar pruebas similares con
suspensiones homogenizadas de tejido derivado de msculo esqueltico diseccionado de
cualquier ratn que muera. En ausencia de ECP o de ratones muertos, se debe efectuar otro pase
con un intervalo de 48 horas, congelando y descongelando las clulas, antes de considerar que la
muestra es negativa.
123
Captulo 2.1.1. Fiebre aftosa
Las pruebas de reconocimiento de cidos nucleicos, como la reaccin en cadena de la polimerasa,

se estn utilizando mucho como mtodos de diagnstico rpidos y sensibles. A veces el examen
por microscopa electrnica es til para diferenciar la FA de enfermedades causadas por otros
virus.
Pruebas serolgicas: Para un diagnstico positivo, es suficiente la demostracin de anticuerpos
especficos contra protenas estructurales en animales no vacunados que presenten una
manifestacin vesicular. Esto resulta particularmente til en casos benignos o cuando no se puede
tomar tejido epitelial. Las pruebas para anticuerpos contra algunas NSPs del virus de la FA
proporcionan evidencia de infecciones previas o actuales del hospedador, independientemente del
estado de vacunacin. A diferencia de las protenas estructurales, las NSPs no son especficas de
serotipo y, en consecuencia, la deteccin de estos anticuerpos no est restringida a un serotipo
particular.
Las pruebas de neutralizacin del virus (NV) y los ELISAs para anticuerpos contra protenas
estructurales se emplean como pruebas serolgicas especficas de serotipo. Las pruebas NV
dependen de los cultivos de tejidos y por tanto son ms propensas a variabilidad de resultados que
las pruebas ELISA; son tambin ms lentas y ms fciles de contaminar. Las tcnicas ELISA para
anticuerpos, presentan la ventaja de la rapidez y de no ser dependientes de los cultivos celulares.
La prueba ELISA se puede llevar a cabo con antgenos inactivados, lo que requiere, por tanto,
menos servicios restrictivos de biocontencin.
Requisitos para las vacunas y los materiales de diagnstico: Existen varios tipos de vacunas
disponibles comercialmente con virus inactivados de composicin variada. Por lo general, se
infecta con el virus una suspensin o una monocapa de cultivo celular y la preparacin que resulta
se clarifica, se inactiva con etilenimina y se prepara con adyuvante. Muchas vacunas contra la FA
son polivalentes con el fin de proporcionar proteccin contra los diferentes serotipos que es
probable encontrar en determinadas condiciones de campo.
La vacuna terminada debe carecer de virus vivos residuales. Esto se comprueba mediante una
combinacin de pruebas in vitro sobre la preparacin de virus inactivados y de pruebas in vivo
sobre la vacuna final. Tambin se realizan pruebas de desafo en el ganado vacunado para
establecer la PD50 (dosis protectora del 50%), aunque una prueba serolgica se considera
satisfactoria si el productor de la vacuna ha establecido una correlacin estadsticamente
significativa entre la proteccin y la respuesta de anticuerpos especficos.
Los servicios de produccin de la vacuna contra la FA deben cumplir tambin los requisitos de la
OIE para patgenos del Grupo 4 de Contencin.
Los reactivos para diagnstico y de referencia se pueden obtener de los Laboratorios de
Referencia de la OIE para la FA, y del Laboratorio de Referencia Mundial para la FA de la FAO
(Organizacin de las Naciones Unidas para la Alimentacin y la Agricultura)1. El laboratorio de
Pirbright (ver pie de pgina) posee doble condicin, como Laboratorio de Referencia Mundial y
como Laboratorio de Referencia de la OIE para FA.
A. INTRODUCCIN
La fiebre aftosa o glosopeda (FA) est causada por un virus del gnero Aftovirus, de la familia Picornaviridae.
Existen siete serotipos de virus FA, que son el O, A, C, SAT1, SAT2, SAT3 y Asia1, que infectan animales de
pezua hendida. La infeccin con un serotipo determinado no confiere inmunidad contra otro. Dentro de los
serotipos, se pueden identificar muchos subtipos mediante pruebas bioqumicas e inmunolgicas.
Los virus de la FA se mantienen en frica en el ganado vacuno y en el bfalo africano (Syncerus caffer). La
informacin disponible indica que aunque se pueden infectar otras especies domsticas y salvajes, stas son
incapaces de mantener la infeccin ms all de unos cuantos meses en ausencia de ganado vacuno o del bfalo
africano. En otras partes del mundo, el ganado vacuno es el principal reservorio, aunque, a veces, los virus
implicados parecen haberse adaptado especficamente a cerdos domsticos, ovejas y cabras. Es probable que
estos virus adaptados sean capaces de modificar su adaptacin e infectar otras especies bajo condiciones
adecuadas. Sin embargo, la cepa Cathay del virus de la FA adaptada a los cerdos no parece infectar a los
1
124
FAO World Reference Laboratory for FMD, Pirbright Laboratory, Ash Road, Pirbright, Woking, Surrey GU24 0NF, United
Kingdom.
grandes rumiantes, bien natural o experimentalmente. Hasta ahora, fuera de frica, la fauna salvaje no parece
ser capaz de mantener el virus de la FA. La evidencia indica que la infeccin de ciervos en el pasado deriv de
contactos, directos o indirectos, con animales domsticos infectados.
De las especies domesticas, el ganado vacuno, porcino, ovino, caprino y los bfalos resultan susceptibles a la FA
(21). Adems, pueden infectarse muchas especies salvajes de pezua hendida, como los ciervos, antlopes y
cerdos salvajes aunque, con la excepcin del bfalo africano, no est claro su papel en la epidemiologa de la FA
en las especies domsticas. Se han aislado de cerdos salvajes y de ciervos cepas de virus de la FA que infectan
al ganado bovino. Para el diagnstico de la FA en especies salvajes se pueden aplicar procedimientos similares
a los descritos para los animales de granja.
La infeccin de animales susceptibles con el virus de la FA conduce a la aparicin de vesculas en las patas,
dentro y alrededor de la cavidad oral, y en las glndulas mamarias de las hembras. Tambin se pueden
presentar vesculas en otros lugares, como en el interior de los ollares nasales y en los puntos de presin de los
miembros -especialmente en cerdos. La gravedad de los sntomas clnicos vara con la cepa de virus, la dosis de
exposicin, la edad y raza del animal, la especie hospedadora y su grado de inmunidad (32). Los sntomas
pueden variar desde una infeccin benigna y desapercibida hasta una grave. En algunos casos puede originar la
muerte. La mortalidad por miocarditis multifocal es ms comn en animales jvenes: tambin puede presentarse
miositis en otros lugares. Ocasionalmente, tambin pueden producir la muerte de los animales adultos.
Cuando se presenta una historia de muertes repentinas en ganado joven de pezua hendida, un examen de los
animales adultos revela a menudo la presencia de lesiones vesiculares, en caso de que se trate de FA. La
presencia de vesculas en los casos graves es variable.
En animales con enfermedad vesicular, es suficiente para establecer un diagnstico la deteccin del virus de la
FA en muestras de lquido vesicular, tejido epitelial, leche o sangre. Tambin se puede establecer el diagnstico
por aislamiento del virus de la sangre, el corazn u otros rganos en casos fatales. En una alta proporcin de
estos casos macroscpicamente se puede observar la presencia de miocarditis.
El virus de la FA se puede multiplicar y excretar del tracto respiratorio de los animales. La excrecin area del
virus tiene lugar durante la fase aguda de la infeccin. Los virus pueden presentarse en todas las secreciones y
excreciones de los animales con infeccin aguda, incluyendo el aire expirado. Generalmente, la transmisin tiene
lugar por contacto entre animales infectados y susceptibles o, ms raramente, por exposicin de animales
susceptibles a las secreciones y excreciones de animales con infeccin aguda. Despus de la recuperacin del
estado agudo de la infeccin, los virus infecciosos desaparecen de todas las secreciones y excreciones con
excepcin, en el caso de los rumiantes, de las de origen esofgico-farngeo (OP). Los animales en los que el
virus persiste en las OP durante ms de 28 das despus de la infeccin se denominan portadores. Los cerdos
no son portadores. Alguna evidencia circunstancial indica que, en raras ocasiones, los portadores son capaces
de transmitir la infeccin a animales susceptibles con los que estn en contacto estrecho: el mecanismo
implicado resulta desconocido. Normalmente el estado de portador en el ganado bovino no persiste ms all de
6 meses, aunque en una pequea proporcin puede durar hasta 3 aos. En bfalos africanos, a ttulo individual,
se ha visto que el virus persiste durante al menos 5 aos, pero probablemente no es un fenmeno que dure toda
la vida. Dentro de una manada de bfalos, el virus se puede mantener durante 24 aos o ms. No existe
informacin sobre la duracin del estado de portador en otro bfalo domstico, el bfalo de los pantanos del este
de Asia. Por lo general, el bfalo domstico, las ovejas y las cabras no portan el virus de la FA durante ms de
unos pocos meses.
Debido a la naturaleza contagiosa y a la importancia econmica de la FA, el diagnstico de laboratorio y la
identificacin del serotipo del virus deben realizarse en un laboratorio de seguridad biolgica para virus. Este
servicio debe cumplir los requisitos del Grupo 4 de Contencin de patgenos indicado en el Apndice I.1.6.1. del
Captulo I.1.6. de este Manual. Los pases sin acceso a tal laboratorio especializado nacional o regional de estas
caractersticas deben enviar las muestras a un Laboratorio de Referencia de la OIE para FA. Las instalaciones
de produccin de vacunas tambin deben cumplir los requisitos para el Grupo 4 de Contencin de patgenos.
Los reactivos estndar y para el diagnstico se pueden obtener como preparados comerciales o como artculos
individuales proporcionados por el Laboratorio de Referencia Mundial de la FAO para FA. El uso de antgenos
inactivados en el enzimoinmunoensayo (ELISA), como controles en las pruebas de deteccin de antgeno o para
reaccionar con sueros de ensayo en las pruebas ELISA bloqueantes en fase lquida o competitivas en fase
slida, reduce el riesgo de enfermedad existente con el uso de virus vivos. Los reactivos se suministran
liofilizados o en glicerol y son estables a 4C y a 20C, respectivamente, durante muchos aos. La Agencia
2
Internacional de la Energa Atmica ha editado un manual que incluye una prueba recomendada y protocolos
para el control de calidad.
International Atomic Energy Agency, Wagramerstrasse 5, P.O. Box 100, A-1400 Viena, Austria
125
B. TCNICAS DE DIAGNSTICO
Para el diagnstico, las muestras mejores son el tejido epitelial o el lquido vesicular. Idealmente, se debe
recoger por lo menos 1 g de tejido epitelial de vesculas sin romper o recin rotas. Para evitar daos al personal
que recoge las muestras, as como por el cuidado a los animales, se recomienda sedar a los animales antes de
obtener las muestras.
Las muestras de epitelio se deben colocar en un medio para transporte compuesto de cantidades iguales de
glicerol y tampn fosfato 0,04 M, pH 7.2-7.6, preferiblemente con antibiticos (penicilina [1.000 Unidades
Internacionales (UI)], sulfato de neomicina [100 UI], sulfato de polimixina B [50 UI], micostatin [100 UI]). Si no se
dispone de tampn fosfato 0,04 M, se puede utilizar medio de cultivo de tejidos o solucin salina tamponada
(PBS), pero es importante que el pH final de la mezcla glicerol/tampn est en el intervalo de pH 7.2-7.6. Las
muestras deben mantenerse refrigeradas o en hielo hasta su llegada al laboratorio.
Cuando no se puede disponer de tejido epitelial de rumiantes, por ejemplo, en casos avanzados o de
convalecencia, o cuando se sospecha la infeccin en ausencia de sntomas clnicos, se pueden tomar muestras
de lquido OP por medio de una sonda (esputos) (o en cerdos, por frotis de garganta3) para su envo a un
laboratorio para el aislamiento de virus.
Antes de recoger las muestras OP del ganado o de grandes rumiantes (como bfalos), se deben aadir, a un
recipiente de unos 5 ml de capacidad y con capacidad de resistir la congelacin por dixido de carbono (nieve
carbnica) o por nitrgeno lquido, 2 ml de lquido de transporte (formado por tampn fosfato 0,08 M que
contenga 0,01% de seroalbmina bovina, 0,002% de rojo fenol, antibiticos [1.000 unidades/ml de penicilina, 100
unidades/ml de micostatin, 100 unidades/ml de neomicina y 50 unidades/ml de polimixina], ajustado a pH 7,2).
Despus de recoger el lquido OP mediante sonda, el contenido se vierte en una botella transparente de boca
ancha de unos 20 ml de capacidad. Se examina el lquido, que debera contener algn material celular visible. Se
toman 2 ml y se aaden a 2 ml del lquido de transporte, asegurndose que se transfiere material celular; la
mezcla se agita suavemente y debe tener un pH final prximo a pH 7,6. Las muestras contaminadas con material
del rumen pueden ser inadecuadas para cultivo y las que contienen sangre tampoco son por completo
satisfactorias. Se puede repetir el muestreo despus de lavar la boca y la garganta del animal con agua o PBS.
Las muestras OP de pequeos rumiantes se recogen poniendo 2 ml del lquido de transporte en una botella de
boca ancha de unos 20 ml de capacidad y lavando, despus de la toma, la sonda y la copa de recogida con
este lquido de transporte para descargar la muestra OP. Esto se transfiere luego a un recipiente de cerca de 5
ml de capacidad para el transporte. El pequeo recipiente debe tener la capacidad de resistir la congelacin por
dixido de carbono (nieve carbnica) o por nitrgeno lquido (27).
Las muestras de lquido OP se deben refrigerar o congelar inmediatamente despus de tomadas. Si el transporte
no dura ms que unas pocas horas, se deben congelar con nieve carbnica o con nitrgeno lquido. Antes de
congelar, los recipientes se deben cerrar cuidadosamente con tapones hermticos o con silicona. Esto es
particularmente importante cuando se utiliza nieve carbnica, pues la introduccin de CO2 en la muestra OP
hace que descienda el pH, inactivando cualquier virus de la FA que pudiera estar presente en la muestra. No
deberan utilizarse recipientes de cristal por existir el riesgo de que exploten al descongelarse si penetra
nitrgeno lquido. Las muestras deben llegar al laboratorio en estado congelado.
Se deben tomar precauciones especiales cuando se enve material perecedero sospechoso de FA tanto dentro
de un pas como entre diversos pases. Las Regulaciones sobre Materiales Peligrosos (DGR) de la Asociacin
Internacional del Transporte Areo (IATA) especifican los requisitos de embalaje y envo de muestras
diagnsticas por todos los medios comerciales de transporte. stos se resumen en el Captulo I. 1. 1. Mtodos
de muestreo.
1.
a)
Aislamiento de los virus

La muestra de epitelio se extrae de la mezcla PBS/glicerol, se transfiere sobre papel absorbente para
reducir el contenido en glicerol, que es txico para los cultivos celulares, y se pesa. Se debe preparar una
suspensin homogenizando la muestra en arena estril y un mortero con mano estril con un pequeo
volumen de medio de cultivo de tejidos y antibiticos. Se aade luego ms medio hasta un volumen final
cinco veces superior al de la muestra epitelial aadida, obtenindose una suspensin al 20%. sta se
126
El cerdo debe mantenerse de modo adecuado, preferiblemente en posicin decbito supino en una caja de madera y con
el cuello extendido. Manteniendo una torunda de algodn con un instrumento apropiado, por ejemplo con unas pinzas
hemostticas, se empuja la torunda hacia la parte posterior de la boca dentro de la faringe.
clarifica en una centrfuga de sobremesa a 2.000 x g durante 10 minutos. Una vez clarificadas, las
suspensiones de las muestras sospechosas de contener virus de la FA se inoculan en cultivos celulares o
en ratones lactantes. Los sistemas de cultivos celulares sensibles incluyen clulas primarias de tiroides
bovino, y clulas primarias de rin de cerdo, ternero o cordero. Se pueden utilizar lneas celulares
establecidas, como la BHK-21 (de rin de hmster lactante) o la IB-RS-2, pero son menos sensibles que
las clulas primarias para detectar niveles bajos de infectividad (10). Los cultivos celulares deben
examinarse para efecto citoptico (ECP) durante 48 horas. Si no se detecta ECP las clulas se deben
congelar y descongelar, y utilizar para inocular cultivos frescos, que se examinan para ECP durante otras
48 horas. La alternativa a los cultivos celulares son los ratones lactantes, que deben tener 2-7 das de edad
y proceder de cepas de razas seleccionadas. Algunos virus de campo necesitan varios pases antes de
adaptarse a ratones (38).
b)
Mtodos inmunolgicos
Enzimoinmunoensayo
En el Laboratorio de Referencia Mundial para la FA de la FAO (ver pie de pgina 1), el mejor procedimiento
para la deteccin del antgeno vrico de la FA y para la identificacin de los serotipos vricos es el ELISA
(20, 36). Se trata de una prueba indirecta de tipo "sandwich" en la que las diferentes filas de las placas
multipocillo estn recubiertas con antisuero de conejo a cada uno de los siete serotipos del virus de la FA.
Estos son los sueros de "captura". A cada una de las filas se aaden suspensiones de las muestras de
ensayo, incluyendo los controles apropiados. Despus se aade antisuero de cobaya a cada uno de los
serotipos del virus de la FA, y a continuacin suero anti-cobaya de conejo conjugado con un enzima. Entre
cada paso se lava cuidadosamente para eliminar los reactivos no fijados. Una reaccin coloreada despus
de la adicin del substrato del enzima indica una reaccin positiva; tambin se puede identificar el serotipo
del virus de la FA. Los valores prximos a 0,1 deben confirmarse por repeticin o por amplificacin del
antgeno por pases en cultivo celular y prueba del sobrenadante despus de que se haya desarrollado
ECP. Ms adelante se presenta un protocolo adecuado.
Dependiendo de la especie y del origen geogrfico de la muestra puede ser apropiado probar
simultneamente para el virus de la enfermedad vesicular porcina (SVD) y el virus de la estomatitis
vesicular (VS). En teora, en todas las condiciones de manifestaciones vesiculares se debera hacer un
diagnstico diferencial completo.
Como anticuerpo de captura, se utiliza antisuero de conejo contra el antgeno 146S de cada uno de los
siete serotipos del virus de la FA (ms el virus de la SVD, si fuera necesario), a una concentracin ptima
predeterminada y en tampn carbonato/bicarbonato, pH 9,6.
Los antgenos control se preparan de cepas seleccionadas de cada uno de los siete serotipos del virus de
la FA (ms el virus de la SVD si fuera necesario), que se cultivan en monocapas de clulas BHK-21 (clulas
IB-RS-2 para el virus de la SVD). Se utilizan los sobrenadantes sin purificar y se pretitulan en placas ELISA.
La dilucin final que se escoge es la que corresponde a una absorbancia en la parte superior de la regin
lineal de la curva de titulacin (densidad ptica aproximada 0,2), de modo que las diluciones a 1/5 de los
antgenos control que se utilizan en la prueba den dos lecturas adicionales de densidad ptica ms baja de
las que se pueda tener referencia en la curva de titulacin. Como diluyente se usa PBS con 0,05% de
Tween 20 y rojo fenol como indicador (PBST).
Como anticuerpo de deteccin se utilizan antisueros de cobaya preparados por inoculacin de cobayas con
antgeno 146S de uno de los siete serotipos del virus de la FA (ms el virus de la SVD si fuera necesario) y
prebloqueados con suero bovino normal (NBS). Se preparan concentraciones ptimas predeterminadas en
PBS con 0,05% de Tween 20 y 5% de leche en polvo desnatada (PBSTM).
Se utiliza inmunoglobulina de conejo (o de oveja) anti-cobaya conjugada con peroxidasa de rbano y
prebloqueda con NBS, a una concentracin ptima predeterminada en PBSTM. Como alternativa a los
antisueros de cobaya o conejo, se pueden utilizar anticuerpos monoclonales (MAbs) adecuados unidos a
las placas ELISA como anticuerpos de captura o conjugados con peroxidasa como anticuerpos de
deteccin.
Procedimiento de la prueba
i)
Las placas ELISA se recubren con sueros antivricos de conejo (50 l/pocillo) en tampn
carbonato/bicarbonato, pH 9,6. Las filas A hasta H reciben, respectivamente, antisueros contra los
serotipos O, A, C, SAT1, SAT2, SAT3, Asia1 y virus SVD (opcional).
ii)
Se dejan toda la noche a 4C en posicin esttica o en un agitador a 100-120 revoluciones por minuto
en un incubador a 37C durante 1 hora.
127
iii)
Preparar la suspensin de la muestra de ensayo (con la suspensin de la muestra original al 20% o

con los sobrenadantes clarificados y sin diluir de los cultivos celulares).
iv)
Lavar cinco veces las placas ELISA con PBS.
v)
En cada placa, cargar los pocillos de las columnas 4, 8 y 12 con 50 l de PBS. Adems, aadir 50 l
de PBST a los pocillos 2 y 3 de las filas A hasta H de la placa 1. Al pocillo 1 de la fila A de la placa 1
se aaden 50 l de antgeno control de tipo O, y al pocillo 2 de la fila A se aaden 12.5 l de antgeno
control de tipo O. Se mezcla el antgeno y el diluyente en el pocillo 2 y se transfieren 12,5 l del pocillo
2 al pocillo 3 de la fila A. Mezclar y eliminar 12,5 l del pocillo 3 (esto da diluciones seriadas de 1/5 del
antgeno O). Repetir del mismo modo con el antgeno A, aadiendo 50 l de antgeno de tipo A al
pocillo 1 de la fila B, y 12,5 l de antgeno de tipo A al pocillo 2, y luego mezclar y transferir 12.5 l al
pocillo 3 (como antes para el antgeno O), y continuar el mismo proceso para los tipos C, SAT1, SAT2,
SAT3, Asia1 y SVD (si es necesario). Slo se requiere cambiar las puntas de las micropipetas entre
antgenos. El resto de la placa se puede rellenar con muestra(s) de ensayo. Aadir 50 l de la muestra
uno a los pocillos 5, 6 y 7 de las filas A hasta H. La segunda muestra se coloca de modo similar en las
columnas 9, 10 y 11 de las filas A hasta H.
Si se ensayan ms de dos muestras al mismo tiempo, las otras placas ELISA se deben de utilizar
como sigue:
Depositar 50 l de PBST en los pocillos (en las filas A hasta H) de las columnas 4, 8 y 12 (columnas
de control de tampn). Advirtase que en estas placas no se necesitan los antgenos control. Las
muestras de ensayo se pueden aadir en volmenes de 50 l en las columnas A hasta H a las
columnas 1, 2, 3; 5, 6, 7; 9, 10, 11, respectivamente.
vi)
Cubrir con las tapas y colocar en un agitador orbital a 37C durante 1 hora.
vii)
Lavar las placas por inundacin con PBS -lavar tres veces como antes y vaciar el lquido residual.
Secar las placas con papel secante.
viii) Pasar 50 l de cada dilucin de suero de cobaya a cada pocillo de la placa en el orden apropiado, es
decir, las filas A hasta H, reciben respectivamente antisueros contra los serotipos O, A, C, SAT1,
SAT2, SAT3, Asia1 y contra el virus de VSD (opcional).
ix)
Cubrir con las tapas y colocar en un agitador orbital a 37C durante 1 hora.
x)
Lavar de nuevo las placas tres veces y aadir a cada pocillo 50 l de inmunoglobulina de conejo anticobaya conjugada con peroxidasa de rbano. Las placas se incuban a 37C durante 1 hora en un
agitador orbital.
xi)
Lavar de nuevo las placas tres veces y aadir a cada pocillo 50 l de solucin de substrato con 0,05%
de H2O2 ms ortofeniln diamina o un cromgeno alternativo adecuado.
xii)
La reaccin se detiene a los 15 minutos aadiendo 50 l de cido sulfrico 1,25 M. Las placas se leen
a 492 nm en un espectrofotmetro acoplado a un ordenador.
Prueba de fijacin de complemento
La tcnica ELISA es preferible a la prueba de fijacin de complemento (FC) porque es ms sensible y no se

ve afectada por factores pro- y anti-complementarios. No obstante, si se carece de los reactivos para
ELISA, se puede utilizar la prueba FC del siguiente modo:
Se diluyen en tampn veronal (VBD) los antisueros contra cada uno de los siete tipos de virus de FA, en
diluciones de 1.5 veces, desde una dilucin inicial 1/16 para dejar 25 l de las diluciones sucesivas de
antisuero en pocillos con fondo redondeado de una placa de microtitulacin. Se aade a stos 50 l de 3
unidades de complemento y a continuacin 25 l de suspensin de la(s) muestra(s) de ensayo. El sistema
se incuba a 37C durante 1 hora antes de aadir 25 l de eritrocitos de oveja (SRBC) estandarizados al
1.4% en VBD y sensibilizados con 5 unidades de anti-SRBC de conejo. Los reactivos se incuban a 37C
durante otros 30 minutos y despus se centrifugan las placas y se leen. Se incluyen controles adecuados
para las suspensiones de ensayo, antisueros, clulas y complemento. Los ttulos de FC se expresan como
el inverso de la dilucin del suero que produce un 50% de hemolisis. Un ttulo FC >36 se considera una
reaccin positiva. Valores de 24 en el ttulo deben confirmarse volviendo a probar el antgeno amplificado
por pases en cultivo de tejidos.
128
c)
Mtodos de reconocimiento del cido nucleico

Se puede utilizar la reaccin en cadena de la polimerasa (PCR) para amplificar los fragmentos del genoma
del virus de la FA en materiales para diagnstico (2, 8). Se han diseado cebadores especficos para
distinguir cada uno de los siete serotipos. Para investigar la presencia del ARN del virus de la FA en
muestras de tejidos se han desarrollado tcnicas de hibridacin in situ (44). Estas tcnicas solo se utilizan
en laboratorios especializados.
La epidemiologa molecular de la FA se basa en la comparacin de las diferencias genticas entre los virus
aislados. Se han publicado dendogramas que muestran la relacin gentica entre las cepas vacunales y
naturales de los siete serotipos respecto a secuencias derivadas del gen 1D. La amplificacin del ARN del
virus de la FA por PCR con transcripcin inversa (RT-PCR) es la opcin preferida actualmente para generar
los datos de secuencias que permiten realizar estas comparaciones. El Laboratorio Mundial de Referencia
(WRL) y otros laboratorios han desarrollado tcnicas para realizar estos estudios, y actualmente se
mantiene una base de datos con ms de 3000 secuencias.
El mtodo recomendado es el siguiente:
i)
Extraer el ARN del virus directamente de suspensiones epiteliales, o de pases bajos en cultivo celular.
ii)
Realizar una RT-PCR del gen VP1 completo (o, si slo una parte del gen VP1, el extremo 3del gen es
ms til)
iii)
Determinar la secuencia nucleotdica del producto de la PCR (o, por lo menos, 170 nucletidos
[preferiblemente 420 para los tipos SAT] en el extremo 3del gen).
Se puede disponer de un protocolo completo con secuencias cebadoras, previa solicitud del WRL, o se
puede bajar de la siguiente direccin en la World Wide Web:
http://www.iah.bbsrc.ac.uk/virus/picornaviridae/aphtovitus/fmd.htm
2.
Pruebas serolgicas
La infeccin por el virus de la FA se puede diagnosticar por la deteccin de una respuesta de anticuerpos
especficos. Las pruebas generalmente utilizadas son la neutralizacin del virus (NV) y el ELISA (24, 25,
41). stas son tambin las pruebas ordenadas para el comercio de ganado. La prueba NV es especfica de
serotipo, requiere disponer de servicios de cultivos celulares y tarda 2-3 das en proporcionar resultados. La
prueba ELISA es un ensayo de tipo bloqueante o competitivo que utiliza anticuerpos poli o monoclonales
especficos de serotipo. Por consiguiente, es especfica de serotipo, sensible y cuantitativa, y tiene la
ventaja de que es ms rpida de realizar, es menos variable y no depende del uso de sistemas de cultivos
celulares. Por cualquiera de las dos pruebas se puede esperar una proporcin baja de sueros de ttulo bajo
con reacciones positivas falsas. Una combinacin de anlisis por ELISA y la confirmacin de los positivos
por la prueba de NV reduce los resultados falsos positivos. La OIE ha coordinado la produccin de sueros
de referencia para estandarizar las pruebas serolgicas de la FA; estn disponibles en el WRL.
La deteccin de anticuerpos contra las protenas no estructurales (NSPs) del virus de la FA se ha utilizado
para identificar infecciones pasadas o actuales con algunos de los siete serotipos del virus,
independientemente de que el animal haya sido tambin vacunado. Esto se ha realizado de modo
convencional, midiendo el anticuerpo contra el antgeno vrico asociado a la infeccin (VIAA; la protena de
la ARN polimerasa vrica 3D) por medio de inmunodifusin en gel de agar (IGDA) (31). Aunque es
relativamente insensible, la prueba es barata, fcil de llevar a cabo y utilizada ampliamente en Sudamrica
para detectar la actividad vrica en una poblacin durante las campaas de erradicacin de la FA. La
prueba VIAA est actualmente superada por pruebas que miden anticuerpos frente a NSPs del virus de la
FA producidas por tcnicas recombinantes en una variedad de sistemas de expresin in vitro. En general,
se considera que los indicadores ms fiables de infeccin son los anticuerpos contra las poliprotenas 3AB
o 3ABC (11, 30, 39). En animales seropositivos para anticuerpos contra 3AB o 3ABC, los anticuerpos contra
una o ms de las otras NSPs, incluyendo la protena L, 2C, 3A, 3B o 3D, sirven de confirmacin adicional
de la infeccin (9, 30, 39). La prueba se puede utilizar para detectar la infeccin por el virus de la FA en
poblaciones vacunadas y no vacunadas. Sin embargo, la pureza de la vacuna es una consideracin
importante ya que la presencia de trazas de NSPs en algunas preparaciones de vacunas puede originar
reacciones positivas falsas en animales que han sido vacunados repetidamente. A la inversa, hay evidencia
experimental de que unos pocos animales, vacunados y despus probados en desafo con virus vivos y con
infeccin persistente, pueden pasar sin ser detectados en algunas pruebas anti-NSP, originando resultados
negativos falsos (28). Por tanto, las pruebas NSP pueden utilizarse a nivel poblacional, pero no a nivel de
animal individual, para detectar la circulacin del virus de la FA en poblaciones vacunadas.
129
a)
Neutralizacin de virus (una prueba prescrita para el comercio internacional)

La microprueba cuantitativa NV para anticuerpo contra la FA se realiza con clulas IB-RS-2, BHK-21 o con
clulas de rin de cordero o cerdo, en placas de microtitulacin para cultivo de tejidos con pocillos de
fondo plano.
Los virus se cultivan en monocapas celulares y se guardan a -20C despus de aadir glicerol al 50%. (El
virus es estable en estas condiciones por lo menos durante 1 ao). Antes de la prueba, los sueros de
ensayo se inactivan a 56C durante 30 minutos. El suero control estndar es suero de convaleciente de 21
das (normalmente de cerdo). Un medio adecuado es el medio completo de Earle/LYH (solucin salina
equilibrada de Hank con hidrolizado de levadura y lactoalbmina) ms antibiticos.
La prueba utiliza volmenes idnticos de 50 l.
Procedimiento de la prueba:
i)
Comenzando con la dilucin 1/4, se diluyen los sueros en soluciones dobles seriadas por la placa,
utilizando al menos dos filas de pocillos por suero, preferiblemente cuatro filas, y un volumen de 50 l.
ii)
Se aade virus previamente titulado; cada 50 l de suspensin vrica debe contener aproximadamente
100 DICT50 (dosis infectiva 50% cultivo de tejidos) dentro de un margen aceptable (por ejemplo, 35350 DICT50).
iii)
Los controles incluyen un antisuero estndar de ttulo conocido, un suero negativo, un control de
clulas, un control de medio y una titulacin vrica empleada para calcular el ttulo real del virus
utilizado en la prueba.
iv)
Incubar a 37C durante 1 hora con las placas cubiertas.
v)
Se prepara una suspensin celular de 106 clulas/ml en medio que contenga 10% de suero bovino
(negativo para el anticuerpo especfico) para el crecimiento celular. A cada pocillo se aaden 50 l de
la suspensin celular.
vi)
Las placas se cierran a presin con las tapas y se incuban a 37C durante 2-3 das. Alternativamente,
se cubren con las tapas flojas y se incuban a 37C durante 2-3 das en una atmsfera de 3-5% de
dixido de carbono.
vii)
Despus de 48 horas se pueden realizar lecturas microscpicas. Finalmente las placas se fijan y se
tien, por lo general, al tercer da. La fijacin se hace con 10% formol en solucin salina durante
30 minutos. Para la tincin las placas se sumergen en 0,05% de azul de metileno con 10% de
formalina durante 30 minutos. Una alternativa de fijacin y tincin consiste en utilizar una solucin de
azul negro de naftaleno (0,4% [p/v] de azul negro de naftaleno, 8% [p/v] de cido ctrico en solucin
salina) (23). Las placas se lavan con agua del grifo.
viii) Los pocillos positivos (all donde el virus se ha neutralizado y las clulas permanecen intactas)
contienen capas celulares teidas de azul; los pocillos negativos (donde el virus no ha sido
neutralizado) estn vacas. Los ttulos se expresan como la dilucin final del suero presente en la
mezcla suero/virus al punto final del 50%, como en el mtodo de Krber. La prueba se
considera vlida cuando la cantidad de virus utilizada por pocillo est comprendida en el intervalo
log10 1.5-2.5 DICT50, y el suero positivo estndar est dentro de un margen equivalente a dos veces
su ttulo esperado.
ix)
b)
La interpretacin de las pruebas puede variar entre laboratorios respecto al punto final tomado. Los
laboratorios deben establecer sus propios criterios con referencia a reactivos estndar que pueden
obtenerse del WRL de la FAO para FA (ver nota a pie de pgina 1). En el WRL, un ttulo de 1/45 o
ms de la dilucin final del suero en la mezcla suero/virus se considera positivo. Ttulos de 1/16 a 1/32
se consideran dudosos, y se necesitan ms muestras de suero para prueba. El animal se considera
positivo, si la segunda muestra presenta un ttulo de 1/16 o superior. Un ttulo de 1/8 o inferior se
considera negativo.
Enzimoinmunoensayo competitivo en fase slida (prueba prescrita para el comercio internacional)

Como anticuerpo de captacin, se utiliza antisuero de conejo contra el antgeno 146S de uno de los
4
siete tipos de virus de la FA a una concentracin ptima predeterminada en tampn carbonato/bicarbonato,
pH 9.6.
130
Se realiza una titulacin del tipo en tablero de ajedrez del antisuero captador de conejo, del antisuero de cobaya y del
antisuero anti-cobaya. Antes de utilizar el ELISA de captacin de antgeno o el ELISA de bloqueo en fase lquida, se titula
cada uno de estos reactivos, uno frente al otro, manteniendo el tercero a una concentracin constante. De este modo, se
pueden determinar las diluciones ptimas (para color positivo y para bajo color de fondo). Estas dilucione
predeterminadas" se pueden utilizar despus para todas las pruebas que en el futuro utilicen estos lotes particulares de
reactivos.
Los antgenos se preparan inactivando virus procedentes de cultivos celulares con etilenimina, utilizando los
procedimientos descritos para la produccin de vacunas. La dilucin final escogida es la que, despus de
aadir un volumen idntico de diluyente, proporciona una absorbancia en la parte superior de la regin
lineal de la curva de titulacin (densidad ptica aproximada de 1,5). Como diluyente se utiliza PBS que
contiene 0,05% de Tween 20 y rojo de fenol como indicador (PBST).
Como anticuerpos de deteccin, se utilizan antisueros de cobaya, preparados mediante inoculacin de
cobayas con el antgeno 146S de uno de los siete serotipos y prebloqueado con suero normal de bovino.
Las concentraciones ptimas predeterminadas se preparan en PBS que contiene 0,05% de Tween 20 y 5%
de leche desnatada en polvo (PBSTM).
La inmunoglobulina anti-cobaya de conejo (o de oveja) se emplea a una concentracin ptima
predeterminada en PBSTM conjugada con peroxidasa de rbano y prebloqueada con NBS.
Los sueros de ensayo se diluyen en PBST.
Los estudios realizados en colaboracin han indicado que el ELISA competitivo en fase slida es ms
especfico que el ELISA de bloqueo en fase lquida, pero de sensibilidad similar (29).
i)
Las placas ELISA se recubren con 50 l/pocillo de anticuerpo de conejo contra el antgeno vrico de la
FA diluido en tampn carbonato/bicarbonato, pH 9.6, y se deja toda la noche a 4C en una cmara
hmeda.
ii)
Las placas ELISA se lavan cinco veces con PBS.
iii)
A continuacin se aaden, a cada pocillo de la placa de ELISA, 50 l del antgeno del virus de la FA
diluido en tampn de bloqueo. (Tampn de bloqueo: 0,05% [p/v] de Tween 20, 10% [v/v] de suero
bovino normal, 5% [v/v] de suero de conejo normal). Las placas se tapan y se colocan en un agitador
orbital a 37C durante 1 hora, con agitacin continua.
iv)
Despus de lavar cinco veces con PBS, se aaden a cada pocillo 40 l de tampn de bloqueo y 10 l
de suero de ensayo (o de suero control), lo que proporciona una dilucin inicial de suero de 1/5.
v)
Inmediatamente se aaden 50 l de antisuero de cobaya contra el virus de la FA diluido en tampn de

bloqueo, obteniendo una dilucin final del suero de 1/10.
vi)
Las placas se tapan y se colocan en un agitador orbital a 37C durante 1 hora.
vii)
Despus de lavar cinco veces con PBS, se aaden 50 l de Ig anti-cobaya conjugada, diluida en
tampn de bloqueo. Las placas se tapan y se colocan en un agitador orbital a 37C durante 1 hora.
viii) Despus de lavar cinco veces con PBS, se aaden a cada pocillo 50 l de solucin de substrato que
contiene 0,05% de H2O2 ms ortofeniln diamina o un cromgeno alternativo adecuado.
c)
ix)
La reaccin se para a los 10 minutos aadiendo 50 l de cido sulfrico 2 M. Las placas se leen en un
espectrofotmetro acoplado a un ordenador.
x)
Controles: Se utilizan dos pocillos por cada placa para los controles de conjugado (sin suero de
cobaya), cuatro pocillos para sueros positivos fuertes y dbiles, dos pocillos para sueros negativos y
cuatro pocillos para competicin nula (sin suero de ensayo).
xi)
Interpretacin de los resultados: Para cada pocillo se calcula un porcentaje de inhibicin, visualmente
o mediante un programa adecuado de ordenador (100 [densidad ptica de cada valor de ensayo o
control/densidad ptica media del resultado de competicin nula] x 100) que represente la competicin
entre el suero de ensayo y el antisuero de cobaya contra el virus de la FA en la placa de ELISA.
Inhibiciones superiores al 60% son positivas (35).
Enzimoinmunoensayo de bloqueo en fase lquida

Los antgenos se preparan a partir de cepas seleccionadas de virus de la FA cultivados en monocapas de
clulas BHK-21. Se utilizan los sobrenadantes sin purificar y se pretitulan con diluciones seriadas dobles,
pero sin suero. La dilucin final elegida es la que, despus de aadir el mismo volumen de diluyente (ver a
continuacin), proporciona una absorbancia en la parte superior de la regin lineal de la curva de titulacin
(Densidad ptica aproximada de 1,5). Como diluyente se emplea PBS con 0,05% de Tween 20 y rojo de
fenol como indicador (PBST). Los otros reactivos utilizados en la prueba son los mismos que para ELISA de
bloqueo en fase slida.
131
i)
Las placas ELISA se recubren con 50 l/pocillo de antisuero de conejo contra el antgeno 146S que se
va a ensayar y se dejan toda la noche en una cmara hmeda a temperatura ambiente.
ii)
Las placas ELISA se lavan cinco veces con PBS.
iii)
En placas multipocillo con fondo en U (placas portadoras) se preparan por duplicado 50 l de

diluciones seriadas dobles de cada suero de ensayo, comenzando con . A cada pocillo, se aaden
50 l de una dosis constante de antgeno vrico homlogo al antisuero de conejo utilizado para recubrir
las placas, y las mezclas se dejan toda la noche a 4C, o se incuban a 37C durante 1 hora. La adicin
del antgeno aumenta la dilucin inicial del suero a 1/8.
iv)
A continuacin se transfieren 50 l de las mezclas suero/antgeno de las placas portadoras a las

placas ELISA recubiertas con suero de conejo y se incuban las placas a 37C durante 1 hora en un
agitador orbital.
v)
Despus de lavar, se aaden a cada pocillo 50 l de antisuero de cobaya homlogo al antgeno

utilizado en el paso previo (iv). A continuacin, las placas se incuban a 37C durante 1 hora en un
agitador orbital.
vi)
Se lavan las placas y se aaden a cada pocillo 50 l de inmunoglobulina de conejo anti-cobaya,

conjugada con peroxidasa de rbano. Se incuban las placas a 37C durante 1 hora en un agitador
orbital.
vii)
Las placas se lavan de nuevo tres veces y se aaden a cada pocillo 50 l de la solucin de substrato
que contiene 0,5% de H2O2 ms ortofeniln diamina o un cromgeno alternativo adecuado.
viii) La reaccin se para a los 15 minutos mediante la adicin de 50 l de cido sulfrico 1 M. Las placas
se leen en un espectrofotmetro acoplado a un ordenador.
d)
ix)
Controles: En cada placa se incluye un mnimo de cuatro pocillos para cada uno de los sueros bovinos
de referencia (muy positivo, dbilmente positivo y negativo) a una dilucin final de 1/32 junto con un
nmero equivalente de pocillos para control de antgeno, que contengan slo antgeno en diluyente sin
suero. Para pruebas de titulacin a punto final, en cada prueba se debe incluir por duplicado, por lo
menos en una placa, una serie de diluciones dobles de sueros bovinos de referencia positivos y
negativos.
x)
Interpretacin de los resultados: Los ttulos de anticuerpo se expresan como el 50% del ttulo a punto
final, es decir, la dilucin a la que la reaccin de los sueros ensayados origina una densidad ptica
igual al 50% de inhibicin de la densidad ptica media de la reaccin en los pocillos control (antgeno)
(Krber). La mediana se calcula como la media de dos valores medios de la reaccin en los pocillos
control, eliminando del clculo los valores ms altos y los ms bajos (alternativamente, se puede
utilizar el valor medio despus de ajustar unos lmites adecuados de tolerancia al control para
variaciones entre los pocillos). Los ttulos superiores a 1/40 se consideran positivos. Los ttulos
prximos a 1/40 se deben volver a probar utilizando la prueba NV.
Pruebas de anticuerpo contra protenas no estructurales

Los anticuerpos contra las NSPs expresadas en virus recombinantes de la FA se pueden medir por ELISA o
inmunotransferencia. En varios laboratorios se ha comprobado que varios mtodos ELISA indirectos son
sensibles, especficos y fiables. Estos enzimoinmunoensayos utilizan antgenos purificados que se
adsorben directamente en microplacas o emplean anticuerpos policlonales o monoclonales para capturar
antgenos especficos de preparaciones semi-purificadas (9, 11, 30). Tambin se ha desarrollado un ELISA
competitivo (39). Ms adelante se describen con detalle ejemplos de una tcnica de ELISA y de una
inmunotransferencia.
Como se ha indicado con anterioridad, la prueba IGDA para detectar anticuerpos contra la VIAA (protena
de la ARN polimerasa vrica 3D) se ha utilizado mucho en Sudamrica (31). Actualmente se ha substituido
en gran medida por pruebas de tipo ELISA o de inmunotransferencia.
132
Enzimoinmunoensayo indirecto
Preparacin de antgenos recombinantes (ver Seccin B.2.d. Prueba de enzimoinmunotransferencia,

ms adelante)
i)
Las microplacas se recubren durante toda la noche a 4C con 1 g/ml del antgeno de fusin 3ABC en
tampn carbonato/bicarbonato, pH 9.6 (100 l por pocillo). El antgeno 3ABC se expresa y purifica
como se indica para las pruebas EITB (33).
ii)
Se lavan las placas seis veces con PBS, pH 7,2, que contiene 0,05% de Tween 20 (PBST).
iii)
Se aaden los sueros de ensayo (100 l por pocillo) a una dilucin 1/20 en tampn de bloqueo que
consiste en PBS, 0,05% de Tween 20, 5% de leche en polvo desnatada, 10% de suero de caballo y
0,1% de lisado de Escherichia coli. Cada placa incluye un juego de controles positivos, fuertes y
dbiles, y de controles negativos, calibrados frente a los Sueros Internacionales Estndar descritos
ms abajo.
iv)
Se incuban las placas durante 30 minutos a 37C y se lavan seis veces con PBST.
v)
Se aaden 100 l por pocillo de IgG de conejo contra la especie, conjugada con peroxidasa de rbano
y diluida de modo ptimo en tampn de bloqueo. Se incuban las placas durante 30 minutos a 37C.
vi)
Despus de seis lavados, cada pocillo recibe 100 l de 33, 55-tetrametilbenzidina ms 0,004% (p/v)
de H2O2 en tampn fosfato/citrato, pH 5.5.
vii)
La reaccin se para a los 15 minutos de incubacin a temperatura ambiente aadiendo 100 l de

cido sulfrico 0,5 M. La absorbancia se lee a 450 nm y a 620 nm para correccin de fondo.
viii) Interpretacin de los resultados: Los resultados se expresan como porcentaje relativo de positividad
respecto al control positivo fuerte [(densidad ptica del pocillo de ensayo o control/densidad ptica del
control positivo fuerte) x 100]. Los valores de corte, con y sin zonas de sospecha, se determinan por
los laboratorios individuales en funcin de la finalidad de la prueba y de la poblacin objeto del
anlisis.
Sueros Internacionales Estndares
Se estn desarrollando en la actualidad sueros internacionales estndares sobre la base del mtodo
descrito arriba. Se trata de tres estndares: un positivo fuerte, un positivo dbil y otro negativo, obtenidos de
acuerdo con las Normas de la OIE (34). Estos sueros sern los materiales de referencia para calibrar otros
mtodos de prueba y otros reactivos y como prototipos para la produccin de estndares nacionales y de
trabajo. El estndar positivo fuerte representar el nivel superior de deteccin de anticuerpo. El estndar
positivo dbil representar el nivel inferior de deteccin o la sensibilidad analtica del mtodo de la prueba.
Es importante advertir que la dilucin de estndar positivo dbil debe elegirse de tal modo que sea
inequvocamente positiva en todos los ensayos. El estndar negativo, utilizado para preparar diluciones de
los estndares positivos, actuar como control de la lnea basal o de fondo para los estndares positivos.
Prueba de enzimoinmunotransferencia (EITB)
La prueba EITB se ha empleado mucho en Sudamrica para el control y determinacin de riesgos

asociados con el desplazamiento de animales. Actualmente, el procedimiento consiste en un anlisis inicial
utilizando un ELISA indirecto para anticuerpos contra 3ABC, seguido por una prueba confirmativa EITB, si
las muestras dan resultados positivos o sospechosos. En particular, se recomienda esta combinacin de
pruebas cuando el control implica un gran nmero de muestras. Se dispone de ms informacin en el
Laboratorio de Referencia de la OIE de Brasil (ver Cuadro en la Parte 3 de este Manual).
Preparacin de las tiras de ensayo con los antgenos recombinantes
i)
Las cinco NSPs del virus de la FA sometidas a ingeniera gentica, 3A, 3B, 2C, 3D, y 3ABC, se
expresan en E. coli C600 por termo-induccin. El polipptido 3D se expresa en su forma completa
(33), mientras que el resto de las protenas se obtiene como productos de fusin con la porcin Nterminal del gen de la polimerasa del MS-2 (40).
133
ii)
La polimerasa expresada se purifica en fosfocelulosa, y despus por columnas de Sefarosa poli-U.

Las protenas de fusin 3A, 3B, 2C y 3ABC se purifican por extraccin secuencial de los extractos
bacterianos con concentraciones crecientes de urea. La fraccin 7M, que contiene las protenas de
fusin, se purifica por una SDS-PAGE preparativa al 10% (dodecil sulfato sdico-electroforesis en gel
de poliacrilamida). La banda de protenas de fusin se separa del gel y se electroeluye (33).
iii)
Mediante SDS-PAGE al 12.5%, se separa una mezcla que contenga 20 ng/ml de cada uno de los
polipptidos recombinantes purificados y se transfieren electroforticamente a nitrocelulosa (33).
i)
Debe determinarse la cantidad necesaria de tiras de muestra considerando que, por cada lmina de
nitrocelulosa que define un gel de transferencia, se debe probar un suero positivo, otro positivo dbil,
otro de corte, y un control de suero negativo. En general, de un gel deben derivar 24 tiras de
nitrocelulosa, cada una de 3 mm de ancho.
ii)
A cada pocillo se aaden 0,8 ml de tampn de saturacin (50 mM de Tris-HCl, pH 7,5; 150 mM NaCl;
0,2% Tween 20; 5% de leche desnatada en polvo y 0,05% de lisado bacteriano de E.coli). Las tiras
con antgeno se bloquean colocando las placas en un agitador durante 30 minutos a temperatura
ambiente (20-22C).
iii)
Se aade a los sitios adecuados una dilucin 1/200 de los sueros de ensayo y de cada uno de los
controles. Las tiras deben estar sumergidas por completo, mirando hacia arriba y mantenidas en esa
posicin durante todo el proceso.
iv)
Se incuban las tiras durante 60 minutos en un agitador a temperatura ambiente.
v)
Se elimina el lquido de las bandejas y cada tira de ensayo se lava tres veces con solucin de lavado
(50 mM Tris-HCl, pH 7,5; 150 mM NaCl y 0,2% Tween 20) con agitacin durante 5 minutos.
vi)
Se aade a cada pocillo de la prueba la solucin de suero de conejo anti-bovino conjugado con
fosfatasa alcalina, y las tiras se incuban con agitacin durante 60 minutos a temperatura ambiente.
vii)
Se elimina el lquido de las bandejas y cada tira se lava tres veces con solucin de lavado como
anteriormente.
viii) En tampn de substrato (100 mM NaCl; 5 mM MgCl2; y 100 mM Tris-HCl, pH 9.3) se prepara la
solucin de substrato (0,015% fosfato de bromocloroindol/0,03% de nitroazul tetrazolio) y se aade a
cada pocillo de ensayo.
ix)
Las tiras se incuban colocando la bandeja de la prueba en un agitador orbital hasta que el control de
corte muestre claramente cinco bandas distintas. Las tiras se lavan abundantemente con agua
desionizada y se dejan secar al aire.
x)
Interpretacin de los resultados: La prueba EITB se puede escanear con un densitmetro pero se
considera que la lectura visual, aunque es ms subjetiva, tambin resulta adecuada. Se presentan
controles individuales de los sueros que exhiben un color mnimo pero repetitivo para cada uno de los
cuatro antgenos. Una muestra de ensayo se considera positiva si los antgenos 3ABC, 3A, 3B y 3D
(+2C) muestran densidades de color iguales o mayores que las de sus controles adecuados. Una
muestra se considera negativa si dos o ms antgenos muestran densidades inferiores a las de sus
sueros control. Las muestras que no encajan con estos modelos se consideran indeterminadas.
C. REQUISITOS PARA LAS VACUNAS Y LOS MATERIALES DE DIAGNSTICO

Normalmente, el control de la FA es una responsabilidad nacional y, en muchos pases, la vacuna solo puede
utilizarse con autorizacin.
Las normas para la produccin de vacunas veterinarias se presentan en el Captulo I.1.7. Principios de
produccin de vacunas veterinarias. Las directrices que se indican aqu y en el Captulo I.1.7 son de carcter
general y pueden suplementarse con requisitos nacionales y regionales.
Para producir vacunas contra la FA se deben emplear virus virulentos de la FA; por tanto, las instalaciones de
produccin de la vacuna contra la FA deben funcionar bajo normas y prcticas apropiadas de bioseguridad. Las
instalaciones deben cumplir los requisitos para patgenos del Grupo de Contencin 4 como se indica en el
Apndice I.1.6.1 del Captulo I.1.6 de este Manual.
134
La vacunacin contra la FA se utiliza de forma rutinaria en muchos pases donde la enfermedad es endmica. En
contraste, varios pases que estn libres de la enfermedad no han vacunado nunca su ganado y cuando se han
presentado brotes prefieren utilizar controles estrictos del desplazamiento y el sacrificio de los animales
infectados y los que han estado en contacto con ellos. No obstante, muchos pases libres de la enfermedad
mantienen la opcin de vacunar y disponen de sus propias reservas estratgicas de preparaciones concentradas
de virus inactivados. Tales reservas de antgeno suponen la posibilidad de suministrar vacunas a corto plazo en
el caso de una "emergencia" (17).
Las vacunas contra la FA son preparaciones del virus qumicamente inactivado derivado de cultivos celulares,
que han sido mezcladas con un adyuvante adecuado. En el caso de vacunas destinadas a utilizacin en cerdos,
se prefieren los adyuvantes oleosos.
Debido a la existencia de varios serotipos del virus, muchas vacunas contra la FA son multivalentes, y es comn
la prctica de preparar vacunas con dos o ms cepas diferentes de virus. En las reas donde la enfermedad se
mantiene en bfalos de vida libre, se necesita incluir ms de un virus por serotipo para asegurar una cobertura
antignica amplia contra los virus predominantes.
1.
Control del inculo
a)
Caractersticas del inculo

En teora, la seleccin de los virus del inculo debera basarse en su facilidad de crecimiento en cultivo
celular, en la tasa de virus, en la estabilidad y en un amplio espectro antignico (37). Las cepas de
produccin se deben caracterizar y distribuir por laboratorios oficiales de control y deben seleccionarse de
acuerdo con la importancia epidemiolgica de cada variante.
b)
Mtodo de cultivo
Muchos productores de vacunas contra la FA utilizan cepas vacunales que proceden de aislamientos
locales naturales y, para las procedentes de cultivo celular, de su adaptacin a crecer en clulas en
suspensin o en monocapas, por pases seriados. Para eliminar el riesgo de cualquier virus contaminante
que contenga lpidos en estos aislamientos naturales, se recomienda un tratamiento con un solvente
orgnico antes de la adaptacin, o durante ella. Es aconsejable mantener bajo el nmero de pases en
cultivo celular, pues existen pruebas de que, durante estos procesos, el virus puede presentar una "deriva"
antignica.
c)
Validacin como una vacuna

Los virus del inculo deben estar caracterizados antignicamente y se debe demostrar que estn libres de
todos los agentes extraos declarados por la autoridad competente para establecer la homologa con el
virus original aislado, as como su pureza y eficacia contra las cepas circulantes frente a las que se dirigen.
A menudo, esto supone varios mtodos, pero, para establecer su adecuacin a las cepas naturales, se
suele utilizar la prueba NV. Los virus de siembra se pueden guardar a -20C con glicerina o a temperatura
inferior sin glicerina (por ejemplo, a -70C). Los virus del inculo de trabajo se pueden amplificar por uno o
varios pases del inculo original y utilizarlos para infectar el cultivo celular final a una proporcin aproximada
de 1 PFU (unidades formadoras de placas o calvas) por cada 100 clulas.
2.
Mtodo de produccin
En general, el virus de la FA se produce a gran escala en sistemas celulares en suspensin bajo condiciones
aspticas. Es esencial que todas las tuberas y contenedores estn cuidadosamente esterilizados para asegurar
que en el sistema no existen reas que contengan microorganismos. Adems de las condiciones generales de
esterilidad, es importante destacar que el virus es vulnerable al ataque por enzimas proteolticas, como las
producidas por microorganismos (13). Tambin resulta crtico el control del pH y de la temperatura debido a la
labilidad del virus a estos factores (12). La temperatura ptima para el crecimiento celular y vrico, y para la
desnaturalizacin, que suele ser de alrededor de 37C y 26C, respectivamente, debe controlarse con precisin.
Durante otras fases de la produccin, la temperatura debe reducirse a 4-6C. Los virus deben mantenerse a un
pH cercano a 7,6 y nunca por debajo de 7,0.
Se utiliza una cepa adecuada de virus para infectar una suspensin de una lnea celular transformada, como la
BHK. Tales cultivos deben estar libres de microorganismos contaminantes. Resulta comn mantener los stocks
de clulas BHK en nitrgeno lquido y darles un pase cuando sea necesario. Despus de el pase, se extienden
en medio nutritivo en un volumen y a una densidad celular apropiados para sembrar el cultivo principal. Como
6
una aproximacin indicativa, se siembra el cultivo principal para dar una densidad inicial de 0,2-0,5 x 10
6
clulas/ml, y se deja multiplicar hasta 2-3 x 10 clulas/ml antes de infectarlo con el virus.
135
Cuando el virus alcanza su ttulo mximo, lo cual se determina por infectividad, FC y otras pruebas, el cultivo se
clarifica y se filtra, a menudo con centrifugacin. A continuacin, el virus se inactiva aadiendo etilenimina (EI),
normalmente en forma de etilenimina binaria (BEI). Esto se prepara disolviendo, a una concentracin de 0,1 M,
hidrobromuro de 2-bromoetilamina en una solucin de hidrxido sdico 0,2 N, e incubando a 37C durante 1 hora
(4, 5). El BEI formado se aade luego a una suspensin de virus mantenida a 26C, a una concentracin final de
3 mM. Normalmente, la inactivacin se prolonga durante 24 horas, seguida de una segunda dosis de BEI durante
otras 24 horas. Despus de la inactivacin, cualquier BRI residual en el producto se puede neutralizar aadiendo
una suspensin de tiosulfato a una concentracin final de 2%. Para disminuir la probabilidad de que en la
segunda aplicacin no entren en contacto virus vivos con la BEI, es importante transferir inmediatamente el
contenido de los recipientes a un segundo recipiente estril, donde se deja que la inactivacin contine hasta 48
horas.
El virus inactivado se puede concentrar por ultrafiltracin, precipitacin con polietilenglicol o adsorcin con xido
de polietileno (1, 43). Si es necesario, estos antgenos concentrados se pueden mantener a -70C o a
temperaturas ms bajas durante muchos aos, y, cuando se requiera, convertirlos en vacunas mediante dilucin
en un tampn adecuado y adicin de adyuvantes (15).
Normalmente, las vacunas convencionales contra la FA se presentan en una de dos formas. La utilizada ms
corrientemente en el ganado vacuno se prepara adsorbiendo el virus en gel de hidrxido de aluminio, que es uno
de los adyuvantes de la preparacin final de la vacuna. Otros componentes del producto final incluyen
antiespumante, rojo de fenol (si est permitido en el pas que necesita la vacuna), hidrolizado de lactalbmina,
caldo de triptosa con fosfato, antibiticos, aminocidos, vitaminas y sales tamponadas. Tambin se incorpora un
segundo adyuvante, la saponina, derivada del rbol sudamericano Quillaja saponaria mollina, y tambin
mertiolato/cloroformo como conservante.
Una frmula alternativa utiliza como adyuvantes aceites minerales, como Marcol y Drakeol. Estas preparaciones
tienen varias ventajas sobre la vacuna estndar con hidrxido de aluminio/saponina, sobre todo su eficacia en los
cerdos. Se utilizan mucho en Sudamrica para vacunar ganado bovino debido a una mayor duracin de la
inmunidad obtenida. El aceite mineral se pre-mezcla, por lo general, con un agente emulsionante, como el
monooleato de manosa, antes de aadir un volumen igual de fase acuosa de la vacuna, y emulsionar mediante
un dispersador coloidal, o un emulsificador mecnico continuo o de flujo ultrasnico. Se pueden producir
emulsiones dobles ms complejas (agua/aceite/agua) emulsionando de nuevo en una fase acuosa que contenga
una pequea cantidad de Tween 80 (26).
La introduccin de adyuvantes con aceites alternativos "listos para usar" ha supuesto un avance significativo en
los ltimos aos. Los aceites con steres del cido octadecenoico y 2,5 anhidro-d-manitol, por ejemplo, forman
fcilmente emulsiones dobles o mezcladas (agua/aceite/agua) que son estables y de baja viscosidad sin que se
necesite un equipo emulsionantes sofisticado (6, 17).
3.
Control interno
En general, los ttulos de virus alcanzan niveles ptimos a las 24 horas de la infeccin de los cultivos celulares. El
tiempo escogido para recoger el cultivo se puede basar en ciertas pruebas; por ejemplo, la muerte celular. La
concentracin de virus se puede determinar por pruebas de infectividad, gradiente de densidad de sacarosa (14)
o tcnicas serolgicas. Es preferible utilizar un mtodo que mida masa antignica, como el anlisis en gradiente
de densidad de sacarosa, junto con uno que mida infectividad, ya que las dos propiedades no coinciden
necesariamente y los diferentes mtodos pueden complementarse.
Durante la inactivacin del virus se deben tomar muestras a intervalos de tiempo regulares para controlar la
velocidad y linealidad del proceso de inactivacin. Los ttulos de virus en las muestras se determinan por
inoculacin de cultivos celulares que sean muy susceptibles al virus de la FA, por ejemplo, clulas BHK o de
tiroides bovino. Dichos cultivos permiten la prueba de muestras estadsticamente significativas en condiciones
reproducibles. Los valores lg10 de la infectividad de las muestras se representan en funcin del tiempo, y el
proceso de inactivacin no se considera correcto a menos que la ltima parte de la pendiente de la lnea sea
4
recta y que la extrapolacin indique que hay menos de una partcula infecciosa por cada 10 litros de preparacin
al final del perodo de inactivacin.
4.
Control de lotes
a)
Esterilidad
Tanto la masa total de antgeno inactivado, como los adyuvantes, los tampones de dilucin, y el producto
final deben someterse a pruebas de esterilidad. Esto se puede realizar directamente con los componentes
de la vacuna y con el producto final, pero el mtodo preferido es recoger cualquier microorganismo
contaminante por filtracin en membrana del material a examinar y detectarlo por incubacin de la
136
membrana en medios de cultivo. Este procedimiento permite la eliminacin de conservantes y otras

substancias que puedan inhibir la deteccin de los microorganismos. En la Farmacopea Europea 1997 se
describen normas sobre tcnicas y medios de cultivo que permiten la deteccin de una amplio espectro de
microorganismos (ref. 19; consultar tambin el Captulo I.1.5).
b)
Inocuidad
A efectos de demostrar la ausencia de virus infecciosos, despus de la inactivacin se debera probar una
muestra de cada lote de antgeno inactivado, que represente por lo menos 200 dosis, por inoculacin de
monocapas celulares que sean sensibles, si es posible del mismo origen que las utilizadas para la
produccin del antgeno. Para hacer esto puede preferirse concentrar el antgeno, en cuyo caso se debe
demostrar que el concentrado no interfiere con la sensibilidad o la estimacin de la prueba. Las monocapas
celulares se examinan diariamente durante tres das, despus de lo cual el medio gastado se transfiere a
monocapas frescas y las originales se rellenan con medio nuevo. Empleando este mtodo, se pueden
amplificar trazas de virus vivo mediante pases y deteccin del ECP observado. Normalmente, se emplean
dos o tres pases de la preparacin original del virus. Una variante de este mtodo es congelar y
descongelar la monocapa para liberar el virus intracelular, que puede detectarse por pases sucesivos.
c)
Potencia
La potencia se examina solamente en el producto final (ver Seccin C.5.b.). Se puede utilizar la carga de
antgeno como indicador de la potencia, si se ha establecido previamente una correlacin al respecto.
d)
Duracin de la inmunidad
Para establecer un nivel satisfactorio de inmunidad, lo normal es proceder a una primera fase de dos
inoculaciones, separadas 2-4 semanas entre s, seguida por una revacunacin cada 4-12 meses. La
frecuencia de revacunacin depender de la situacin epidemiolgica y del tipo y calidad de la vacuna
utilizada. Cuando el acceso a los animales resulta difcil, es preferible emplear vacunas con adyuvantes con
aceite a los 4 meses y al ao de edad, y despus revacunar cada ao.
En terneros nacidos de vacas vacunadas, se debe retrasar la primera vacunacin lo mximo posible para
permitir que descienda el nivel de anticuerpos maternos, pero no ms all de los 4 meses, tiempo al que se
espera que una elevada proporcin responda eficazmente a la vacunacin. En terneros nacidos de vacas
no vacunadas, la primera vacuna puede administrarse a la primera semana de edad (3).
e)
Estabilidad
La caducidad de las vacunas convencionales contra la FA suele ser de 1-2 aos a 4C pero son sensibles a
la temperatura y no deberan congelarse ni mantenerse por encima de 4C.
f)
Conservantes
Los conservantes ms utilizados son cloroformo y mertiolato. Este ltimo se utiliza a una concentracin final
de 1/30.000 (p/v).
g)
Precauciones (riesgos)
Las vacunas actuales contra la FA son inocuas y no presentan riesgo txico para el usuario. Se debe tener
cuidado para evitar la autoinyeccin de vacunas con adyuvantes que contienen emulsiones de aceite.
5.
Pruebas sobre el producto final
a)
Inocuidad
Es necesario probar las vacunas contra la FA para asegurarse de que el producto final no es infeccioso ni
txico. Algunos laboratorios determinan la falta de infectividad eluyendo el virus de la vacuna, pero esto no
es aplicable a todas las preparaciones. Por ejemplo, la saponina influye mucho en la elucin del virus de las
vacunas con hidrxido de aluminio/saponina (16). Si el procedimiento de elucin es apropiado a una
preparacin particular, debe ser validado sembrando muestras paralelas de vacuna con pequeas
cantidades de virus vivo (7).
La toxicidad y la falta de infectividad se pueden determinar simultneamente en el ganado bovino mediante
una prueba in vivo (18). En la superficie dorsal de la lengua de cada una de tres cabezas de ganado sanas
y seronegativas, se inocula intradrmicamente 0,1 ml de vacuna en 20 sitios (cuatro filas de cinco puntos de
inoculacin). Los animales se observan por lo menos durante 4 das, al cabo de los cuales se administra a
cada animal tres dosis completas de vacuna por la ruta recomendada por el fabricante. Los animales se
observan otros 6 das. Si alguno de los animales desarrollara sntomas de FA, la vacuna no supera la
prueba de inocuidad. Del mismo modo, se debe determinar cualquier toxicidad anormal atribuible a la
vacuna que pueda invalidar su aceptacin. En teora, las vacunas para otras especies deben probarse en
137
cuanto a inocuidad en las especies a las que van dirigidas, administrando una dosis doble de vacuna de
acuerdo con las instrucciones recomendadas por el fabricante en cuanto a ruta y volumen de la dosis. Los
animales deberan examinarse diariamente durante un mnimo de 7 das para poner de manifiesto signos
de toxicidad o de FA.
b)
Potencia
Se debe utilizar ganado de ms de 6 meses de edad, obtenido de reas sin FA, que no se hayan vacunado
previamente contra la FA y que carezcan de anticuerpos frente a los diferentes tipos de virus de la FA. Se
deben vacunar, por la ruta indicada por el fabricante, tres grupos de por lo menos cinco animales. La
vacuna se debe administrar a diferentes dosis por cada grupo, inoculando diferentes volmenes de la
vacuna. Por ejemplo, si el prospecto seala que una inyeccin de 2 ml corresponde a la administracin de
una dosis de vacuna, 1/4 de dosis corresponder a inyectar 0,5 ml y 1/10 de dosis a 0,2 ml. Estos animales,
y un grupo control de otros dos no vacunados, se inoculan para desafo 3 semanas despus de la
inoculacin con una suspensin de virus bovino completamente virulento y apropiado a los tipos de virus
presentes en el vacuna ensayada, inoculando intradrmicamente 10.000 ID50 (dosis infectiva al 50%) en
dos sitios de la superficie superior de la lengua (0,1 ml por sitio). Los animales se observan durante 810 das. Los animales control no protegidos mostrarn lesiones en otros sitios adems de la lengua y
desarrollarn lesiones en al menos tres patas. Del nmero de animales protegidos en cada grupo, se
calcula la PD50 (dosis protectora media) que contiene la vacuna. Existen varios mtodos para calcular la
PD50 (22), pero se prefieren los procedimientos basados en el mtodo de Krber. La vacuna debe contener
al menos 3 PD50 por dosis para el ganado bovino cuando se emplea con fines profilcticos, aunque es
preferible emplear 6 PD50 por dosis. En ocasiones una vacuna de potencia elevada evita el desarrollo de
lesiones locales en la lengua. En algunos pases de Sudamrica se realiza una variacin de la prueba de
potencia, la prueba PGP (porcentaje de proteccin contra la infeccin generalizada de la pata). Se vacuna
con una dosis completa por la ruta recomendada por el fabricante a un grupo de 16 animales de 1824 meses de edad, con las mismas caractersticas que las descritas para la PD50. Estos animales, y un
grupo control de dos animales no vacunados, se inoculan en desafo 4 semanas despus de la vacunacin
con una suspensin de virus bovino completamente virulento y apropiado a los tipos de virus presentes en
la vacuna ensayada, inoculando intradrmicamente 10.000 BID50 (dosis infectiva bovina al 50%) en dos
sitios de la superficie superior de la lengua. Los animales control no protegidos mostrarn lesiones en otros
sitios, adems de la lengua, y desarrollarn lesiones en al menos tres patas; para uso profilctico rutinario,
la vacuna debe proteger al menos a 12 de los 16 animales vacunados.
No son corrientes las pruebas de potencia en otras especies, como ovejas, cabras o bfalos, y se considera
que es suficiente una prueba correcta en ganado bovino para garantizar su uso en otras especies. Cuando
se produzca una vacuna para uso principal en una especie particular, puede ser ms apropiado realizar las
pruebas de potencia de la vacuna en esa misma especie. Sin embargo, teniendo en cuenta los datos
limitados que se poseen sobre el bfalo africano o el asitico (Bubalus bubalis) y las ovejas, y la frecuente
naturaleza subclnica de la enfermedad en estas especies, los resultados de la prueba de potencia en el
ganado bovino suelen ser un buen indicador de la aplicabilidad de la vacuna a otras especies.
Para la prueba de potencia de las vacunas contra la FA en cerdos, se puede adoptar un protocolo similar a
la prueba en ganado bovino. Utilizando tres grupos de cinco cerdos, se vacuna un grupo con la dosis
completa recomendada por el fabricante, otro grupo con 1/4 de la dosis y el tercer grupo con 1/16 de la
dosis. Tradicionalmente, la respuesta a las vacunas con aceite se deja desarrollar durante ms tiempo, y el
da 28 despus de la vacunacin se inyectan los tres grupos, ms dos cerdos control no vacunados, en una
prueba de desafo. El desafo consiste en la inyeccin intradrmica en los bulbos del taln de una pata, de
10.000 DICCT50 (0,2 ml), calculado por crecimiento en un cultivo celular porcino adecuado, de un virus
virulento homlogo a una cepa utilizada en la vacuna. Los animales se observan diariamente durante
10 das para vigilar la aparicin de sntomas de FA, y se van eliminando tan pronto desarrollan una FA
generalizada para evitar una excesiva dosis de desafo a los restantes. Los animales control deben
desarrollar sntomas en ms de una pata. Del nmero de animales protegidos en cada grupo, se calcula el
contenido en PD50 de la vacuna. Existen varios mtodos para calcular la PD50 (22), pero se prefieren los
procedimientos basados en el mtodo de Krber. La vacuna debe contener al menos 3 PD50 por dosis para
cerdos. Tambin se puede adoptar para cerdos un protocolo similar a la prueba PGP en el ganado
bovino, utilizando un grupo de 16 animales vacunados con una dosis completa de vacuna y dos animales
control no vacunados. El desafo se hace por inyeccin intradrmica en los bulbos del taln de una pata con
10.000 BID50 (0,2 ml) de un virus virulento homlogo a la cepa utilizada en la vacuna.
Para establecer la potencia de una vacuna, se pueden utilizar otras pruebas, como la medida en cultivo
celular de los anticuerpos neutralizantes del virus despus de la vacunacin, o de los anticuerpos por
ELISA, o de los anticuerpos de proteccin en ratones lactantes, con tal de que se haya establecido
estadsticamente una correlacin satisfactoria entre los resultados obtenidos por la prueba con el serotipo
particular de la vacuna y la prueba de potencia en el ganado (42). Por ejemplo, se utiliza el porcentaje
esperado de proteccin para analizar los sueros de un grupo de al menos 16 animales y para expresar la
probabilidad de que un animal resulte protegido midiendo los anticuerpos neutralizantes, los anticuerpos por
138
ELISA o los anticuerpos de proteccin. En un grupo nico al que se suministra una dosis completa de
vacuna, el porcentaje medio de proteccin individual esperado sera igual o mayor que el 75% si se
emplean 16 animales o igual o mayor que el 70% cuando se utilizan 30 animales en el grupo experimental.
La presencia en la vacuna de ms de un serotipo no interfiere con la induccin de anticuerpos frente a otro
serotipo o con la correlacin del ttulo de anticuerpos y la proteccin.
c)
Pureza
El Cdigo de Salud de la OIE para animales terrestres estipula que un criterio para volver a establecer un
estado de ausencia de FA despus de un brote, si se utilizan vacunas, es probar a los animales vacunados
para la presencia de anticuerpos contra NSP. Por consiguiente, la vacuna o el antgeno que se utilice en
estas circunstancias debe estar purificado para reducir el contenido en NSP. Si la vacuna se produce para
un mercado donde no se utilizar la prueba NSP, no ser necesaria esta pureza respecto a NSP. Un
mtodo de prueba que se puede utilizar para determinar la pureza de la vacuna es vacunar tres veces a
tres terneros de 3-6 meses y despus probarlos para la presencia de anticuerpos contra NSP utilizando las
pruebas descritas en la Seccin B.2.d. de este captulo. Si se detecta anticuerpo contra NSP, la vacuna se
debe purificar ms, antes de su distribucin. Un mtodo alternativo consiste en vacunar los terneros
empleados en la prueba de inocuidad dos veces ms en 3-6 meses y luego probarlos para presencia de
anticuerpos contra NSP.
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*
* *
NB: Existen laboratorios de referencia de la OIE para la Fiebre aftosa (ver Cuadro en la parte 3 de este
141
CAPTULO 2.1.2.
ESTOMATITIS VESICULAR
RESUMEN
La estomatitis vesicular (EV) es una enfermedad vesicular de los caballos y el ganado bovino y
porcino causada por un vesiculovirus de la familia Rhabdoviridae. Cuando no afecta a los caballos,
es indistinguible clnicamente de la fiebre aftosa o glosopeda (FA), el exantema vesicular (EV) o la
enfermedad vesicular de los cerdos (EVC). Las ovejas, cabras y muchas otras especies salvajes
pueden resultar infectadas. El hombre tambin es susceptible. La enfermedad est limitada a
Amrica; sin embargo, se describi previamente en Francia y en Sudfrica.
Aunque la EV se transmite directamente por la ruta transcutnea o a travs de la mucosa, el virus
de la EV se ha aislado de la mosca de la arena (Phlebotomus) y de mosquitos, lo que sugiere que
puede ser transmitida por insectos. En consecuencia, existe una variacin estacional en los casos
de EV: desaparece al final de la estacin lluviosa en reas tropicales, y con las primeras heladas
en zonas templadas. Tambin hay evidencias de que el virus de la EV podra ser un virus vegetal y
que los animales son el final de la cadena epidemiolgica. La patognesis de la enfermedad est
poco aclarada, y se ha observado que los anticuerpos humorales especficos no siempre evitan la
infeccin por el virus de la EV.
Aunque se puede sospechar que se trata de EV cuando hay caballos afectados adems de cerdos
y vacas, es esencial un diagnstico diferencial temprano porque los sntomas clnicos de la EV son
indistinguibles de los de la FA cuando afecta a ganado bovino y porcino, y de los de la EVC o la EV
cuando solo afecta a cerdos.
Identificacin del agente: El virus de la EV se puede aislar fcilmente por inoculacin de varios
sistemas de cultivo de tejidos, ratones lactantes o huevos embrionados de pollo. El antgeno vrico
se puede identificar por un enzimoinmunoensayo indirecto de tipo "sandwich" (IS-ELISA) -sta es
la prueba ms rpida y barata. La prueba de fijacin de complemento (FC) es tambin una buena
alternativa. Puede utilizarse la prueba de neutralizacin del virus (NV), pero es elaborada y lleva
tiempo.
Pruebas serolgicas: Los animales convalecientes desarrollan anticuerpos con especificidad de
serotipo a los 4-8 das de la infeccin que se demuestran por un ELISA de bloqueo en fase lquida,
por un ELISA competitivo (C-ELISA) y por NV. Otras pruebas que se han descrito son FC,
inmunodifusin en medio slido y contra-inmunoelectroforesis.
Requisitos para las vacunas y los materiales de diagnstico: En EE.UU. y en Colombia se han
usado vacunas con virus inactivados y con hidrxido de aluminio o aceite como adyuvantes,
respectivamente. Ambas vacunas inducen niveles altos de anticuerpos especficos en los sueros
del ganado vacunado. Sin embargo, no est todava claro que los anticuerpos sricos eviten la
enfermedad. Se ha utilizado en condiciones de campo una vacuna con virus atenuados de eficacia
desconocida.
A. INTRODUCCIN
La estomatitis vesicular (EV) se describi en EE.UU. en 1926 (18) y 1927 (7) como una enfermedad vesicular de
los caballos, y, posteriormente, de ganado bovino y porcino. Las vesculas las causa el virus de la EV en la
lengua, labios, mucosa bucal, pezones, y en el epitelio de la banda coronaria de las patas del ganado vacuno,
caballos, cerdos, y muchas otras especies de animales domsticos y salvajes. Tambin son susceptibles muchas
especies de animales de laboratorio. La enfermedad se limita a Amrica; no obstante, se describi en Francia
(1915 y 1917) y en Sudfrica (1886 y 1897) (11).
142
Captulo 2.1.2. Estomatitis vesicular
En humanos que estn en contacto con animales afectados de EV o que manejan el virus infeccioso de la EV, se
han observado sntomas semejantes a los de la gripe, normalmente sin vesculas. Todas las manipulaciones que
impliquen el virus de la EV, incluyendo el material infeccioso de los animales, deben llevarse a cabo con las
adecuadas medidas de bioseguridad.
Hay dos tipos inmunolgicos principales del virus de la EV, el de New Jersey (NJ) y el de Indiana (IND). Ambos
virus pertenecen al gnero Vesiculovirus, de la familia Rhabdoviridae, y se han estudiado con detalle a nivel
molecular. En las ltimas dcadas se han aislado de animales enfermos otros rhabdovirus estrechamente
relacionados. Estos virus de la EV estn representados por las cepas Salto-Argentina/63 y Alagoas-Brasil/64,
que se consideran como los subtipos 2 y 3, respectivamente, del serotipo IND (8). Se han identificado las cepas
del serotipo NJ y del subtipo IND-1 en reas endmicas de la enfermedad: Sudeste de EE.UU., Mxico, Amrica
central, Panam, Venezuela, Colombia, Ecuador y Per. La cepa IND-2 Salto-Argentina/63 se aisl de caballos
en Argentina en 1963. 18Esta cepa, junto con la IND-2 Maip-Argentina/86 y otras dos cepas aisladas en 1966 y
1979 en Brasil, y clasificadas en el mismo subtipo, slo afectan a caballos (2, 3). El ganado que vive junto a
caballos afectados no presenta conversin de anticuerpos (2). El subtipo IND-3, representado por la cepa
Alagoas-Brasil/64, slo se ha identificado espordicamente en Brasil. Hasta 1977, las cepas del subtipo IND-3
solo se aislaban de caballos. Sin embargo, la cepa IND-3 Espinosa-Brasil/77 fue la primera aislada de ganado
bovino. Las cepas IND-3 conocidas afectan al ganado bovino en menor grado que a los caballos (2,3). Este
hecho confirma las primeras descripciones de 1926 y 1927 (7,18) de los serotipos NJ e IND en caballos, y
posteriormente en ganado bovino y en cerdos.
El mecanismo de transmisin del virus de la EV no est claro. El hecho de que el virus se asle de la mosca de la
arena (Phlebotomus), mosquitos y otros insectos, apoya la hiptesis de que puede ser transmitido por insectos
(6, 10, 17). Tambin hay hiptesis que sostienen que el virus de la EV es un virus vegetal presente en el pasto
(17) y que los animales estn al final de la cadena epidemiolgica. Bajo circunstancias especiales, el virus podra
sufrir un proceso de adaptacin para infectar a los animales, seguido de una transmisin directa entre animales
susceptibles. Durante el brote epizotico de 1982 en el este de EE.UU., hubo varios casos de transmisin directa
de animal a animal (20). Aunque no todos los aos se diagnostica EV en el ganado en EE.UU., se considera que
es endmica entre los cerdos salvajes en Ossabaw Island, Georgia (5).
La incidencia de la enfermedad vara mucho entre el ganado afectado. Normalmente el 10-15% de los animales
muestra signos clnicos, que se observan sobre todo en los animales adultos. Los bvidos y caballos de menos
de 1 ao de edad son raramente afectados. La mortalidad en ambas especies est cercana a cero. Sin embargo,
se ha observado una elevada mortalidad en cerdos afectados por el virus NJ. Los animales enfermos se
recuperan aproximadamente a las 2 semanas. Las complicaciones de importancia econmica ms corrientes son
mastitis, y prdida de produccin lctea (16). Tanto los serotipos NJ e IND-1 en los brotes de 1995, 1997 y 1998
en EE.UU. causaron fundamentalmente sntomas clnicos en caballos, aunque se observ seroconversin en
bvidos.
La EV no se puede diferenciar clnicamente con certeza de otras enfermedades vesiculares, como la fiebre
aftosa o glosopeda (FA), el exantema vesicular (EV), y la enfermedad vesicular de los cerdos (EVC) cuando no
hay caballos implicados. En cualquier caso sospechoso de EV, es urgente un diagnstico de laboratorio
temprano.
La toma de muestras y la tecnologa utilizada para el diagnstico de la EV debe estar en concordancia con la
metodologa empleada para el diagnstico de FA, EV y EVC, a fin de facilitar el diagnstico diferencial de estas
enfermedades vesiculares. Nota: el virus de la EV es un patgeno para humanos y se deben de tomar
precauciones adecuadas cuando se trabaja con tejidos potencialmente infectados o con el virus (ver Captulo
I.1.6. Seguridad humana en los laboratorios veterinarios de microbiologa).
Las mejores muestras para el diagnstico son el fluido vesicular, el epitelio que cubre las vesculas sin romper,
los trozos de epitelio de vesculas recin rotas, o frotis de las vesculas abiertas. Estas muestras se toman de las
lesiones de la boca, as como de las patas y de otros sitios que muestren desarrollo de vesculas. Se recomienda
sedar a los animales antes de tomar las muestras para evitar daos a los trabajadores y por razones de cuidado
animal. Las muestras epiteliares se colocan en botellas con caldo de triptosa y rojo de fenol tamponado con Tris,
pH 7,6. Si se va a realizar una fijacin de complemento (FC) para la deteccin del antgeno, la muestra se puede
recoger en tampn glicerol/fosfato, pH 7,2-7,6. (Nota: el glicerol resulta txico para el virus de la EV y disminuye
la sensibilidad del aislamiento del virus; por consiguiente slo se recomienda para toma de muestras para la
prueba FC). Las muestras deben mantenerse refrigeradas, y si pueden llegar al laboratorio en 48 horas despus
de recogidas, deben enviarse refrigeradas. En caso de que las muestras se enven congeladas en hielo seco,
deben tomarse precauciones especiales para asegurarse de que el CO2 no entre en la muestra y destruya el
143
virus. Hay requisitos especiales de embalaje para enviar muestras con hielo seco (ver Captulo I.1.1. Mtodos de
muestreo, para informacin adicional sobre el envo de muestras para diagnstico).
Cuando en el ganado bovino no hay tejido epitelial disponible, se pueden recoger muestras de lquido esofgicofarngeo (OP) por medio de una copa de esputo. En los cerdos, se puede tomar un frotis de garganta y enviarlo
al laboratorio para aislamiento de virus. Este material debe enviarse al laboratorio refrigerado y en caldo de
triptosa tamponado con Tris. Si las muestras van a estar embaladas ms de 48 horas despus de la recogida,
deben mandarse congeladas en hielo seco, como se indic previamente. Las muestras de esputos para el
aislamiento del virus de la EV no deben tratarse con solventes tales como el cloroformo. Los virus se pueden
aislar de tejidos orales y nasales a los 7 das post-infeccin.
Cuando no es posible tomar muestras para la identificacin del agente, se pueden utilizar muestras de suero de
los animales recuperados para detectar y cuantificar anticuerpos especficos. Se prefiere la toma de pares de
sueros del mismo animal, recogidos por separado entre 1-2 semanas, para comprobar el cambio en el ttulo de
anticuerpo.
Los reactivos para un diagnstico especfico del virus de la EV no estn comercialmente disponibles y cada
laboratorio debe producir los suyos u obtenerlos de un laboratorio de referencia. Los dos laboratorios de
referencia de la OIE para la estomatitis vesicular (ver Cuadro en la Parte 3 de este Manual) y el Instituto de Salud
Animal1, producen y distribuyen reactivos para diagnstico, previa peticin.
1.
Para la identificacin del virus de la EV y el diagnstico diferencial de las enfermedades vesiculares, se deben
someter a pruebas inmunolgicas las suspensiones clarificadas de las muestras que sean sospechosas de
contener el virus. Para el aislamiento del virus, se inoculan las mismas muestras en cultivos celulares
apropiados. La inoculacin de la muestra misma en cultivos celulares de rin de mono verde africano (Vero),
rin de hmster neonato (BHK-21) o IB-RS-2 permite la diferenciacin de las enfermedades vesiculares: el virus
de la EV causa efecto citoptico (ECP) en las tres lneas celulares; el virus de la FA origina ECP en BHK-21 y en
IB-RS-2, mientras que el virus de la EVC slo causa ECP en IB-RS-2. Muchas otras lneas celulares, as como la
mayora de los cultivos primarios de clulas de origen animal, son susceptibles al virus de la EV.
El virus de la EV se multiplica y puede ser aislado de embriones de pollo de 8-10 das de edad por inoculacin en
el saco alantoideo, de ratones lactantes de 2-7 das por inoculacin a travs de cualquier ruta, o de ratones de 3
semanas por inoculacin intracerebral. En los tres casos, el virus de la EV causa la muerte entre los 2 y 5 das
despus de la inoculacin.
La ruta ms susceptible para los caballos y el ganado bovino es la administracin lingual intradrmica. Los
cerdos se inoculan en la banda coronaria de las patas o en el morro. Las lesiones vesiculares se pueden
observar a los 2-4 das de la inoculacin en el tejido epiteliar de la boca, pezones y patas. La presencia de
vesculas secundarias por inoculacin de ganado bovino y equino depende fundamentalmente de la cepa de
virus de la EV utilizada. Normalmente, el morro resulta afectado en los cerdos.
Si se desarrolla un ECP en los cultivos, la suspensin se puede identificar para la identificacin del agente
mediante diversas pruebas inmunolgicas y el cultivo celular se puede teir con un anticuerpo fluorescente
especfico para la EV. Se pueden realizar pruebas similares en suspensiones homogenizadas de tejidos del
msculo esqueltico diseccionado de ratones muertos y de embriones de pollo y con suspensiones de muestras
epiteliales. El tejido cerebral de los ratones es una fuente excelente de virus.
Debido a las diferentes caractersticas morfolgicas de los rhabdovirus (virus de la EV), picornavirus (virus de la
FMD y de la SDV) y calicivirus (VE), y al gran nmero de partculas vricas en los lquidos vesiculares y en los
tejidos epiteliales, la microscopa electrnica puede ser un instrumento diagnstico til para diferenciar la familia
de virus implicada.
Los mtodos inmunolgicos preferidos para identificar en el laboratorio los antgenos vricos son el
enzimoinmunoensayo (ELISA) (2, 9), la prueba FC (2, 13) y la tincin con anticuerpo fluorescente. La prueba de
neutralizacin del virus (NV), con antisueros positivos conocidos contra el virus de la EV de serotipos NJ e IND,
se puede utilizar en cultivo de tejidos, ratones lactantes o huevos embrionados, pero lleva ms tiempo.
a)
Aislamiento del virus

i)
Inocular el cultivo celular en tubos Leighton y en botellas de 25 cm2 con la suspensin clarificada,
tejidos o con el lquido de las vesculas.
Institute for Animal Health, Pirbright Laboratory, Ash Road, Pirbright, Woking, Surrey GU24 0NF, United Kingdom.
144
ii)
Incubar los cultivos celulares inoculados a 37C durante 1 hora.
iii)
Retirar el inculo y lavar tres veces los cultivos celulares con medio de cultivo y aadir medio de
cultivo que contenga 2,5% se suero fetal bovino (FBS).
iv)
Incubar los cultivos de tejidos en tubos Leighton a 33-35C y observar el ECP.
v)
Despus de 18-24 horas de incubacin, el cubre de un cultivo en tubo Leighton por cada muestra
inoculada se tie con anticuerpo fluorescente (AF) especfico de las cepas New Jersey e Indiana del
virus de la EV.
vi)
El resto de los tubos Leighton y de las botellas de cultivo de 25 cm2 se incuban a 35-37C otros 6 das
y se observa diariamente el EPC.
vii)
A los 7 das de la inoculacin, el resto de los cubres de los tubos Leighton se tien con AF. Si no se
observa fluorescencia ni en los recipientes de cultivo se evidencia ECP, las muestras se consideran
negativas en cuanto a aislamiento del virus de la EV.
viii) Si se observa ECP y la tincin con AF es negativa, se realiza un segundo pase, como se indic
anteriormente, usando las clulas de una botella de 25 cm2.
b)
Enzimoinmunoensayo
La tcnica indirecta de ELISA tipo "sndwich" (IS-ELISA) (2, 9) es en la actualidad el mtodo diagnstico
elegido para la identificacin de los serotipos vricos en la EV y otras enfermedades vesiculares.
Especficamente, el procedimiento ELISA identifica todas las cepas del virus de la EV de serotipo IND, con
un juego de antisueros polivalentes de conejo/cobaya preparados contra viriones de las cepas
representativas de los tres subtipos del serotipo IND (2). Para la deteccin de las cepas New Jersey del
virus de la EV, es adecuado un juego de antisueros monovalentes de conejo/cobaya (2, 9).
i)
Fase slida: Las placas ELISA se recubren, durante 1 hora a 37C o durante la noche a 4C, con
antisuero de conejo y con suero normal de conejo (como se describe en las refs. 2 y 4) que se han
diluido de manera adecuada en tampn carbonato/bicarbonato, pH 9.6. Despus, las placas se lavan
una vez con solucin salina tamponada con fosfato (PBS) y se bloquean durante 1 hora a temperatura
ambiente con 1% de ovoalbmina en PBS. Las placas se utilizan de inmediato o se lavan tres veces y
se guardan a -20C para uso futuro.
ii)
Muestras de ensayo: Se depositan en los correspondientes pocillos las suspensiones de antgeno de

las muestras de ensayo (suspensiones al 10-20% de tejido epitelial, tejido muscular esqueltico de
embrin de pollo o de ratones en PBS, o sobrenadantes clarificados de cultivos celulares sin diluir) y
se incuban las placas 30 minutos a 37C en un agitador orbital.
iii)
Detector: A los pocillos correspondientes se aaden antisueros monovalentes o polivalentes de

cobaya contra los serotipos NJ e IND, respectivamente, del virus de la EV, que sean homlogos al
suero de conejo de recubrimiento y que se han diluido convenientemente en PBS que contiene 0,05%
de Tween 20, 1% de ovoalbmina, 2% de suero normal de conejo y 2% de suero bovino normal
(PBSTB). Se deja reaccionar durante 30 minutos a 37C en un agitador orbital.
iv)
Conjugado: Se aade un conjugado de peroxidasa/ IgG de conejo o cabra anti-cobaya, diluido en

PBSTB, y se deja reaccionar durante 30 minutos a 37C en un agitador orbital.
v)
Substrato: Se aade H2O2 como substrato y se deja reaccionar a temperatura ambiente durante 15
minutos, aadiendo despus cido sulfrico para detener la reaccin. Los valores de absorbancia se
miden en un lector de ELISA.
A lo largo de la prueba, se utilizan volmenes de 50 l para los reactivos. Las placas se lavan cinco
veces en cada paso con PBS que contiene 0,05% de Tween 20. Se incluyen controles de los reactivos
utilizados.
vi)
Interpretacin de los resultados: Un antisuero que d una absorbancia superior al 20% de la de otro
antisuero, del suero negativo y de los controles, se considera positivo para el correspondiente subtipo
vrico.
145
c)

El mtodo ELISA es preferible a la prueba FC, porque es ms sensible y no est afectado por factores proo anti-complemento. Sin embargo, cuando no se dispone de reactivos para ELISA, se puede realizar la
prueba FC. Se describe la prueba FC para placas de microtitulacin con pocillos de fondo en forma de U,
utilizando los reactivos titulados por la prueba CF50%.
i)
Antisuero: Se deposita en los pocillos de la placa antisuero monovalente anti-NJ de cobaya y antisuero
polivalente anti-IND de cobaya contra el virus de la EV, diluidos en tampn veronal (VB) a una dilucin
que contenga 2,5 CFU50 (unidades de 50% de fijacin de complemento), contra el virus homlogo.
Los antisueros son los detectores utilizados en la prueba ELISA.
ii)
Muestras de ensayo: Se aaden a los pocillos con suero las suspensiones de antgeno de las
muestras de ensayo, preparadas como se describe para la prueba IS-ELISA.
iii)
Complemento: Se aaden al suero y al antgeno 4 CHU50 (unidades hemolticas de complemento del

50%). (Una alternativa es utilizar 7,5, 10 y 20 CHU50 con objeto de alcanzar 4 CHU50 en la prueba).
La mezcla de antisueros, muestras de ensayo y complemento se incuba a 37C durante 30 minutos.
iv)
Sistema hemoltico: Se aade a los pocillos una suspensin de eritrocitos de oveja (RBCs) en VB,
sensibilizados con 10 HU50 (unidades hemolticas del 50%) de suero de conejo anti-RBC de oveja. El
sistema hemoltico tiene un valor de absorbancia de 0,66 a 545 nm, en la proporcin de dos
volmenes de sistema hemoltico + tres volmenes de agua destilada. La mezcla se incuba durante 30
minutos a 37C. A continuacin, las placas se centrifugan y la reaccin se observa visualmente.
Se necesitan volmenes de 25 l para los antisueros, muestras de ensayo y complemento, y 50 l para el

sistema hemoltico. Se incluyen controles apropiados de los antisueros, antgenos, complemento, y sistema
hemoltico.
Es posible realizar la prueba CF50% en tubos (2) utilizando volmenes de reactivos ocho veces mayor que
los indicados para la FC en placas de microtitulacin. Con la prueba CF50%, la reaccin se puede expresar
como lectura espectrofotomtrica de la absorbancia a 545 nm.
v)
Interpretacin de los resultados: Cuando los controles son los esperados, las muestras con hemolisis
<20% para un antisuero en comparacin con el otro y con los controles se considera positiva para el
tipo correspondiente
Las muestras negativas en las pruebas ELISA o FC deberan inocularse en cultivo celular o en ratones
lactantes. Si no hay evidencia de infeccin vrica despus de tres pases, la muestra se considera negativa
para el virus de la EV.
d)
Mtodos de reconocimiento del cido nucleico

Se puede usar la reaccin en cadena de la polimerasa (PCR) para amplificar pequeas reas genmicas
del virus de la EV (12, 19). Esta tcnica detectar la presencia del ARN del virus de la EV en muestras de
tejidos y lquidos vesiculares y en cultivo celular, pero no puede determinar si el virus es infeccioso. En
general, las tcnicas con PCR no son de uso rutinario en el anlisis diagnstico de casos del virus de la EV.
2.
Pruebas serolgicas
Para la identificacin y la cuantificacin de anticuerpos especficos en el suero, las pruebas preferibles son
ELISA y NV. La prueba FC se puede usar para la cuantificacin de anticuerpos tempranos. Generalmente los
anticuerpos se pueden detectar entre 5 y 8 das despus de la infeccin; el tiempo de persistencia de los
anticuerpos no se ha determinado con exactitud en las tres pruebas pero se piensa que es relativamente corto
por FC y por perodos largos mediante NV y ELISA (14).
a)
Enzimoinmunoensayo (una prueba prescrita para el comercio internacional)

El mtodo ELISA de bloqueo en fase lquida (LP-ELISA) es el mejor mtodo para la deteccin y
cuantificacin de anticuerpos contra el virus de la EV. Se recomienda el uso de las glicoprotenas vricas
como antgeno, porque no son infecciosas, detectan los anticuerpos neutralizantes y proporcionan menos
resultados positivos falsos que la NV (4).
146
i)
Fase slida: Como se describe arriba en la Seccin B.1.a. para la prueba IS-ELISA.
ii)
Fase lquida: En placas de microtitulacin con pocillos de fondo en U, se preparan por duplicado series
de diluciones dobles de cada suero de ensayo, comenzando con 1/4. Se aade a cada pocillo un
volumen igual de glicoprotena NJ o IND del virus de la EV, en una dilucin que proporcione una
reaccin al 70%, y las placas se incuban 1 hora a 37C. A continuacin se transfieren 50 l de esta
mezcla a las placas ELISA con la fase slida y se deja reaccionar durante 30 minutos a 37C en un
agitador orbital.
iii)
Detector, conjugado y substrato: Se utilizan los mismos reactivos y mtodos que los indicados para ISELISA.
iv)
Interpretacin de los resultados: Los ttulos de punto final al 50% se expresan como log10 con
referencia al 50% de la reduccin del control de suero negativo, de acuerdo con el mtodo de
Spearmann-Krber. Los ttulos >1.3 (1/20) se consideran positivos.
Enzimoinmunoensayo competitivo (una prueba prescrita para el mercado internacional)
Tambin se ha desarrollado un mtodo ELISA competitivo para la deteccin de anticuerpos. El

procedimiento que se describe aqu se basa en el descrito por Afshar et al. (1). Utiliza antgenos
recombinantes NJ e IND-1 de la estomatitis vesicular segn lo descrito por Katz et al. (15).
b)
i)
Fase slida: Los antgenos se diluyen en tampn carbonato/bicarbonato, pH 9,6, y se aaden 50 l a

cada pocillo de una placa ELISA de 96 pocillos. Se incuban las placas durante toda la noche a 4C; las
placas recubiertas se pueden guardar hasta 60 das a -70C. Se descongelan las placas, se decanta
el antgeno y se aaden 100 l de solucin bloqueante. A continuacin se incuban las placas durante
30 minutos a 25C y se decanta la solucin bloqueante. Las placas se lavan tres veces con una
solucin de PBS/0.05% de Tween 20.
ii)
Fase lquida: A cada uno de los pocillos duplicados de cada muestra se aaden 50 l de suero diluido
1/8 con PBS y 1% de leche en polvo desnatada. En cada placa ELISA se debe incluir un control de
suero positivo y de suero negativo para cada serotipo. Se incuban las placas a 37C durante
30 minutos. Sin lavar, se aaden 50 l de lquido asctico policlonal a cada pocillo y las placas se
incuban a 37C durante 30 minutos.
iii)
Detector: Se lavan las placas tres veces y se aade a cada pocillo 50 l de suero anti-ratn obtenido
en cabra conjugado con peroxidasa de rbano y diluido en 1% de leche en polvo desnatada. Se
incuban las placas a 37C durante 30 minutos, se lavan tres veces, y se aade a cada pocillo 50 l de
solucin de tetrametil-benzidina (TMB) como substrato. Se incuban las placas a 25C durante 510 minutos y despus se aade a cada pocillo 50 l de cido sulfrico 0,05 M. Se leen las placas a
450 nm y la densidad ptica de los pocillos del control del diluyente debe ser < 1.0.
iv)
Interpretacin de los resultados: Una muestra es positiva si la absorbancia es <50% de la absorbancia

del control del diluyente.
Neutralizacin del virus (una prueba prescrita para el mercado internacional)

La prueba NV se realiza en placas de microtitulacin de cultivo de tejidos con pocillos de fondo plano
utilizando suero inactivado como muestra de ensayo, 1.000 DICT50 (dosis infectiva del 50% en cultivo de
tejidos) de virus NJ o IND de la EV, y clulas Vero M, y una monocapa preformada (4) o una suspensin de
clulas IB-RS-2 para probar la presencia de virus no neutralizado.
i)
Virus: El virus NJ o IND de la EV se crece en monocapas de clulas Vero y se guarda en nitrgeno

lquido o se congela a -70C.
ii)
Muestras de ensayo: Se inactivan los sueros a 56C durante 30 minutos antes del ensayo. En la
prueba se incluyen sueros estandarizados como control positivo y negativo.
iii)
Neutralizacin del virus: Se diluyen los sueros en las placas en series de diluciones dobles,
comenzando con una dilucin 1/4. Se utilizan dos filas de pocillos por suero. Se aade el mismo
147
volumen de la suspensin de virus NJ o IND de la EV que contenga aproximadamente

1.000 DICT50/25 l y se incuba a 37C durante 60 minutos para permitir que tenga lugar la
neutralizacin. A continuacin, se depositan 50 l de las mezclas en las monocapas celulares
preformadas en placas de microtitulacin o se aaden 150 l de suspensiones celulares de IB-RS-2 o
Vero con 300.000 clulas/ml a cada pocillo con la mezcla suero/virus. Se cubren las placas con tapas
no hermticas y se incuban 48-72 horas a 37C en una atmsfera con 5% de CO2 o bien se sellan con
tapas de presin y se incuban en atmsfera normal. (Se ha determinado que una titulacin de virus de
1.000 DICT50 disminuye las reacciones inespecficas y mantiene una elevada sensibilidad de la
prueba).
iv)
c)
Interpretacin de los resultados: Los pocillos sin ECP se consideran protegidos. Las titulaciones a
punto final de los ttulos de los sueros de ensayo se determinan por el mtodo de Spearman-Krber
cuando los ttulos vricos estn entre 750 y 1330 DICT50 y cuando los ttulos de los sueros estndar
negativos y positivos estn dentro del doble de sus valores medios estimados en una titulacin previa.
Los ttulos de cada suero para una neutralizacin del 100% se expresan como log10. Los sueros con
valores de 1/32 o superiores se consideran positivos para la EV.
Fijacin de complemento (una prueba prescrita para el mercado internacional)

En la Seccin B.1.b. se presenta una descripcin detallada de esta prueba, que se modifica del siguiente
modo. La prueba FC se puede utilizar para la cuantificacin de anticuerpos tempranos. Con este fin, se
mezclan diluciones dobles del suero con 2 CFU50 de antgeno conocido y con 5% de suero bovino normal o
de ternero incluido en 4 CHU50 de complemento. La mezcla se incuba durante 3 horas a 37C o durante
toda la noche a 4C. A continuacin se aade el sistema hemoltico y se incuba durante 30 minutos a 37C.
El ttulo del suero es la dilucin ms alta a la que no se observa hemolisis. Los ttulos de 1/5 o superiores se
consideran positivos. Esta prueba FC tiene sensibilidad baja y, frecuentemente, se ve afectada por factores
anticomplementarios o inespecficos.

En EE.UU., Panam, Guatemala, Per y Venezuela se han probado vacunas con virus atenuados (16, 17) con
eficacia desconocida. En la actualidad, todava no se dispone de vacunas comerciales con virus vivos o
inactivados.
AGRADECIMIENTOS
Algunas partes de este captulo se tomaron o estn basadas en el captulo sobre la estomatitis
vesicular de ediciones anteriores de este Manual.
REFERENCIAS
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*
* *
NB: Existen laboratorios de referencia de la OIE para la Estomatitis vesicular (ver Cuadro en la parte 3 de
este Manual de animales terrestres o consultar la pgina web de la OIE para una lista actualizada:
www.oie.int)
149
CAPTULO 2.1.3.
ENFERMEDAD VESICULAR PORCINA
RESUMEN
La enfermedad vesicular porcina (EVP) es una enfermedad contagiosa de los cerdos causada por
un enterovirus que se caracteriza por la aparicin de vesculas en las bandas coronarias en los
talones de las pezuas y, ocasionalmente, en los labios, la lengua, el hocico y las ubres. Las cepas
de la EVP muestran una virulencia variable, y la enfermedad puede ser subclnica, leve o grave,
pudindose observar esta ltima slo cuando los cerdos estn alojados en locales con suelos
abrasivos, en condiciones de humedad. La importancia crucial de la EVP es la imposibilidad de
distinguirla clnicamente de la fiebre aftosa (FA), y debe asumirse que los brotes de la enfermedad
vesicular en cerdos corresponden a FA hasta que se investiguen mediante pruebas de laboratorio
y se demuestre lo contrario.
Identificacin del agente: En los cerdos en los que se aprecie la enfermedad vesicular, la
demostracin del antgeno vrico de la EVP mediante enzimoinmunoensayo (ELISA) en una
muestra de material de una lesin o de fluido vesicular es suficiente para un diagnstico positivo.
Si la cantidad de material de una lesin enviada para el diagnstico no es suficiente (menos de 0,5
gramos) o si los resultados de las pruebas son negativos o no concluyentes, el aislamiento del
virus se puede llevar a cabo mediante la inoculacin de cultivos celulares porcinos. Si finalmente
se produce un efecto citoptico en los cultivos, la demostracin del antgeno vrico de la EVP
mediante la tcnica ELISA, ser suficiente para un diagnstico positivo.
Pruebas serolgicas: El anticuerpo especfico frente al virus de la EVP puede identificarse
mediante la prueba de microneutralizacin o por ELISA. Aunque se requieren de 2 a 3 das para
completar la prueba de microneutralizacin, sta constituye la prueba definitiva para la deteccin
de anticuerpos frente al virus de la EVP. Una pequea proporcin (hasta el 0,1%) de los cerdos
normales, no infectados, reaccionarn positivamente en las pruebas serolgicas para la EVP.
Estos animales positivos aislados slo pueden diferenciarse de los cerdos infectados mediante
un nuevo muestreo de los animales positivos y de sus cohortes.
Requisitos para las vacunas y los materiales de diagnstico: Actualmente no se dispone de
vacunas comerciales contra la EVP. Los reactivos estndares y de diagnstico estn disponibles
en los laboratorios de referencia regionales.
A. INTRODUCCIN
La enfermedad vesicular porcina (EVP) es una enfermedad subclnica, leve o severa, dependiendo de la cepa de
virus implicada, de la va y la dosis de infeccin y de las condiciones de cra en las que se mantiene a los cerdos.
Clnicamente, la EVP no es distinguible de la fiebre aftosa (FA), y esto tiene una importancia crucial. Por lo tanto,
es urgente diferenciar los casos de la EVP de los de la FA, mediante la investigacin en el laboratorio.
El perodo de incubacin de la EVP est entre 2 y 7 das, despus de los que puede aparecer una fiebre
pasajera hasta de 41C. A continuacin, se desarrollan las vesculas en la banda coronaria, de forma tpica en la
unin con el taln. Estas vesculas pueden afectar a la banda coronaria completa, dando lugar a la prdida de la
pezua. Con menos frecuencia, las vesculas pueden aparecer en el hocico, particularmente en la superficie
dorsal, en los labios, la lengua y las ubres y pueden observarse erosiones superficiales en las rodillas. Los
cerdos afectados pueden renquear y estar sin apetito durante unos cuantos das. El aborto no es una
caracterstica tpica de la EVP. La recuperacin completa se produce normalmente en 2-3 semanas, y como
nica seal de la infeccin queda una lnea horizontal y oscura en la pezua, donde se ha interrumpido
150
Captulo 2.1.3. Enfermedad vesicular porcina
temporalmente el crecimiento. Los signos clnicos varan segn la edad de los cerdos afectados, las condiciones
en las que se les mantiene y la cepa de virus de la EVP implicada (8). La enfermedad causada por cepas
atenuadas puede pasar desapercibida, particularmente en los cerdos a los que se mantiene sobre hierba o en
locales con mucha paja. Los animales ms jvenes resultan ms gravemente afectados, aunque la mortalidad
debida a la EVP es muy rara, a diferencia de lo que ocurre con la fiebre aftosa en los cerdos jvenes. Se han
descrito sntomas nerviosos, pero no son frecuentes. Los cerdos afectados pueden excretar el virus por la nariz,
la boca y en las heces, hasta 48 horas antes de la aparicin de los signos clnicos. La mayor parte de los virus se
produce en los primeros 7 das despus de la infeccin, y la excrecin de virus por la boca y la nariz se detiene
normalmente en menos de 2 semanas. El virus se puede seguir eliminando en las heces durante un periodo de
hasta 3 meses. El virus de la EVP es extraordinariamente resistente a la inactivacin en el hbitat natural, y es
estable en el rango de pH 2,512,0 (9), a diferencia del virus de la fiebre aftosa, que resulta muy lbil fuera del
rango de pH 6,08,0.
Debido a que la EVP puede ser leve o subclnica, es imprescindible que se incluyan muestras de suero de los
cerdos sospechosos y de otros animales aparentemente no afectados del grupo, cuando se enven muestras
procedentes de casos clnicamente sospechosos. El virus de la EVP puede circular desapercibido hasta que
afecta a un grupo particularmente susceptible y, por lo tanto, con el fin de establecer cunto tiempo est presente
la enfermedad, es necesario comprobar la seroconversin frente al virus de la EVP en animales aparentemente
sanos.
La enfermedad vesicular porcina es clnicamente muy similar a la fiebre aftosa. Las muestras para el aislamiento
del virus o la deteccin antignica deben manejarse y enviarse como si contuvieran el virus de la fiebre aftosa, y
deben transportarse en solucin salina tamponada con fosfato (PBS) mezclada con glicerol (1/1), pH 7, 27, 6,
con antibiticos (concentracin final por mililitro) como penicilina (1.000 Unidades Internacionales [UI]), sulfato de
neomicina (100 UI), sulfato de polimixina B (50 UI) y micostatina (100 UI) (6).
El virus de la EVP ha sido clasificado como un enterovirus, perteneciente a la familia Picornaviridae.
Antignicamente se relaciona con el virus humano coxsackievirus B5. Hay informes de la seroconversin frente
al virus de la EVP en personal de laboratorio que est en contacto con el agente. Se inform de que la
enfermedad clnica era leve, con excepcin de un nico caso de meningitis asociada a la infeccin por el virus de
la EVP. Sin embargo, no se han descrito casos de seroconversin o de la enfermedad en granjeros o veterinarios
en contacto con cerdos infectados. No se ha podido demostrar la transmisin de coxsackievirus B5 entre cerdos
en condiciones experimentales.
1.
Cualquier afeccin vesicular en los cerdos puede ser fiebre aftosa. En el caso de que se haya eliminado la fiebre
aftosa, se requiere la utilizacin de las instalaciones de un laboratorio especializado para el diagnstico de la
EVP. Los pases que carecen de dichas instalaciones habrn de enviar las muestras para ser investigadas al
1
Laboratorio de Referencia Mundial (WRL) para la Fiebre Aftosa de la FAO. En Amrica se debern realizar
tambin pruebas paralelas para el antgeno vrico de la estomatitis vesicular.
La investigacin comenzar con el examen con una suspensin al 10% de material de lesin en PBS, mediante
un enzimoinmunoensayo (ELISA), utilizando antisueros especficos para los virus de la EVP y de la FA. Esta
suspensin se inocular tambin en monocapas de clulas porcinas IB-RS-2 (u otras clulas porcinas
susceptibles), en clulas primarias tiroideas de bovino y en clulas primarias (o secundarias) renales de bovino.
El virus de la FA crecer en los tres sistemas de cultivo celular. Normalmente, el virus de la EVP slo crecer en
clulas de origen porcino; sin embargo, se tiene informacin de que el virus puede aislarse en clulas
secundarias de rin de cordero. El virus de la EVP puede aislarse tambin a partir de muestras fecales.
a)
Cultivo
Una porcin de la suspensin epitelial clarificada se inocula en monocapas de clulas IB-RS-2 u otras
clulas porcinas susceptibles. Para el diagnstico diferencial (por ejemplo, la fiebre aftosa) se emplearn
tambin sistemas de cultivos celulares bovinos. Se ha comprobado que el medio completo de
Eagle/hidrolizado de lactalbmina con extracto de levadura (LYH) en proporcin 50/50, es un medio de
cultivo apropiado. Para el crecimiento celular, aadir suero bovino al 10%; para mantenimiento, aadir
suero bovino al 3% y para el aislamiento del virus, aadir slo los antibiticos; en este caso se prefiere no
aadir suero.
Laboratorio de Referencia Mundial para la Fiebre Aftosa de la FAO (Organizacin de las Naciones Unidas para la
Alimentacin y la Agricultura), Institute for Animal Health, Pirbright, Woking, Surrey GU24 0NF, United Kingdom (tambin
es un Laboratorio de Referencia para la Fiebre Aftosa de la OIE).
151
Captulo 2.1.3. Swine vesicular disease
Los cultivos se examinan dos veces al da. Si se observa efecto citoptico (ECP), se recoge el
sobrenadante y se utiliza de antgeno en el ELISA para la identificacin del virus. En los cultivos negativos
no se aprecia ningn efecto despus de 48 o 72 horas, aunque se mantienen en observacin durante 3
das ms. Cuando se asla el virus de heces en las que la cantidad de virus presente puede ser baja, puede
ser necesario un tercer pase del cultivo celular.
b)
Mtodos inmunolgicos
Enzimoinmunoensayo
Para la deteccin del antgeno vrico de la EVP se ha preferido utilizar un ELISA indirecto tipo sndwich en
lugar de la prueba de fijacin del complemento. La prueba es la misma que se utiliza para el diagnstico de
la FA. Se recubren dos hileras de pocillos de las placas ELISA con antisuero de conejo contra el virus de la
EVP. Este es el suero de captura. Se aaden las suspensiones de los sueros problema a cada una de las
hileras. Se incluyen tambin los controles apropiados. En la siguiente fase se aade el suero detector de
cobaya, seguido de la adicin del suero anticobaya de conejo conjugado con peroxidasa de rbano. Se
hace un lavado exhaustivo entre cada etapa para eliminar los reactivos que no se hayan unido. La reaccin
positiva se pone de manifiesto si se produce una reaccin de color al aadir un cromgeno
(ortofenilendiamina) y un substrato (H2O2). En el caso de las reacciones fuertemente positivas el resultado
ser evidente a simple vista, pero los resultados se pueden leer tambin por espectrofotometra a 492 nm,
en cuyo caso una lectura de absorbancia de 0,1 por encima del nivel de fondo indica una reaccin positiva.
Como alternativa a los antisueros de cobaya y de ratn, se pueden emplear tambin anticuerpos
monoclonales apropiados (MAb), adheridos a la placa ELISA y utilizados como anticuerpo de captura o
conjugados con peroxidasa como anticuerpo de rastreo.
Para estudiar la variacin antignica entre las cepas del virus EVP, se puede utilizar tambin un ELISA
basado en los MAb. Los antgenos virales obtenidos en cultivos celulares son capturados por un antisuero
de conejo hiperinmune frente al virus de la EVP adherido a la fase slida. Despus se hacen reaccionar con
un grupo de MAb apropiados, y la unin de los MAb a las cepas de campo se compara con la unin a las
cepas originales. Una unin fuerte indica la presencia de eptopos compartidos por la cepa original y las
cepas de campo (1).
c)
Muestras fecales
i)
Se resuspende el material fecal (aproximadamente 20 g) en una cantidad mnima de tampn fosfato

(0,04 M de tampn fosfato o PBS).
ii)
Se deja en agitacin o en un homogenizador rotatorio a 4C durante toda la noche.
iii)
Se clarifica por centrifugacin a 10.000 rpm durante 30 minutos, en una centrfuga de alta velocidad.
iv)
Se recoge el sobrenadante y se inoculan cinco tubos de clulas IB-RS 2 con 0,2 ml por tubo. Se
permite la adsorcin a 37C durante 1 hora, sin agitacin. Se lavan los tubos con PBS tres veces. Se
aade medio de mantenimiento sin suero (2 ml/tubo), y se incuban a 37C colocados en una gradilla
giratoria o en un aparato alternativo apropiado que permita la agitacin de los medios de cultivo.
v)
El sobrenadante restante se centrifuga a 28.000 rpm durante tres horas. Esto concentrar cualquier
virus que haya en el sobrenadante en bajas cantidades.
vi)
Se desecha el sobrenadante, y el precipitado se resuspende en 2 ml de PBS, sonicndolo

brevemente. Se aade un volumen igual de Fren y se agitan 23 ml. Se centrifugan a 4.000 rpm
durante 10 minutos en una centrfuga de mesa. Se elimina el sobrenadante.
vii)
Se inoculan cinco tubos de cultivo de tejidos como en el paso (iv).
viii) Los tubos se incuban a 37C durante 3 das, observndolos diariamente en busca de la aparicin de
ECP.
d)
ix)
Si no hay pruebas de ECP transcurridos tres das, los cultivos celulares se congelan y descongelan, y
se realiza un pase ciego en tubos de clulas IB-RS-2 frescas. Se incuban durante tres das ms,
examinando los tubos diariamente como antes.
x)
Se recoge el sobrenadante de los tubos que muestren ECP y se confirma la presencia del virus de la
EVP mediante la tcnica ELISA (u otra prueba apropiada).
xi)
Si no hay ECP despus del segundo pase, la muestra se declarar como NVD (ningn virus
detectado).
Mtodos de reconocimiento de cidos nucleicos

Los mtodos de reconocimiento de cidos nucleicos pueden utilizarse para la deteccin del genoma vrico
de la EVP en material clnico utilizando la trascripcin inversa, seguida de la reaccin en cadena de la
152
polimerasa (PCR), y para establecer las relaciones entre los aislados del virus de la EVP, mediante la
determinacin de las secuencias de nucletidos de parte del genoma. La secuenciacin de
aproximadamente 200 nucletidos dentro del gen 1D, que codifica la principal protena estructural VP1, ha
permitido agrupar las cepas del virus de la EVP en funcin de la homologa de sus secuencias, y relacionar
epidemiolgicamente las cepas causantes de la enfermedad en distintas regiones o en pocas diferentes
(2). Con el fin de mejorar la sensibilidad del diagnstico, se han desarrollado las tcnicas que utilizan la
PCR. Se ha descrito una PCR que combina la extraccin de RNA, mediante el uso de columnas de gel de
slice, comercialmente disponibles, con una trascripcin inversa acoplada a la PCR (RT-PCR), utilizando
para esto cebadores que corresponden a regiones muy conservadas de los genes 1C y 1D (7). La tcnica
es rpida, detecta todos los genotipos del virus de la EVP y es suficientemente sensible para su uso en
muestras obtenidas de casos de sospecha de enfermedad clnica. Cuando se sospeche de infeccin
subclnica o cuando las muestras se recojan despus de determinarse clnicamente la enfermedad, una RTPCR anidada, ms sensible, puede combinarse con un mtodo de extraccin de RNA ms elaborado, para
conformar un sistema de deteccin tan sensible, al menos, y considerablemente ms rpido, como el pase
mltiple en cultivo de tejidos. Varios laboratorios han desarrollado ensayos alternativos de PCR utilizando
diferentes protocolos (3, 10, 11).
2.
Pruebas serolgicas
Normalmente la enfermedad vesicular porcina se diagnostica slo con los datos aportados por las pruebas
serolgicas. Debido a la naturaleza subclnica o leve de la enfermedad, la primera sospecha de la enfermedad se
tiene con frecuencia despus de las pruebas serolgicas rutinarias que se realizan para la vigilancia de la
enfermedad o para el certificado de exportacin. Para la deteccin de anticuerpos contra el virus de la EVP se
han utilizado la prueba de neutralizacin vrica (NV), la de inmunodifusin doble, la de inmunodifusin radial, la
de contra-inmunoelectroforesis y el ELISA (1, 4, 5). Las pruebas de NV y ELISA se han utilizado ms
frecuentemente. La prueba de NV es la prueba estndar aceptada, pero tiene la desventaja de que lleva 23 das
completarla, y requiere instalaciones para cultivo celular. El ELISA es ms rpido, y puede estandarizarse con
mayor facilidad. Una pequea proporcin de los sueros procedentes de animales que no han estado previamente
expuestos al virus de la EVP reaccionarn positivamente en pruebas serolgicas de deteccin de anticuerpos
contra el virus de la EVP. El ELISA de competicin que emplea el MAb 5B7 (MAC-ELISA) ha sido una tcnica
fiable para la deteccin de anticuerpos de la EVP (1). Hasta el 1%, aproximadamente, de los resultados de los
sueros de cerdos normales son dudosos o positivos mediante el MAC-ELISA, y deben probarse de nuevo
mediante la prueba de NV. De estos sueros, tambin resultarn positivos en la prueba de NV hasta el 10%,
aproximadamente (es decir, el 0,1% de la poblacin original). Se pueden considerar como no infectados los
animales que den positivo mediante ELISA pero negativo en la prueba de NV. Deben recogerse muestras
repetidas de animales que den positivo en ambas pruebas y tambin de sus cohortes. Una titulacin constante o
decreciente del ttulo en el animal positivo y la ausencia de anticuerpos contra el virus de la EVP en las cohortes
confirma el estado del animal positivo como un positivo aislado. Se desconocen los factores responsables de la
aparicin de los animales positivos aislados. La reactividad serolgica cruzada con el virus de la EVP podra
darse debido a la infeccin por otro picornavirus, aunque an sin identificar, o puede deberse a factores
inespecficos presentes en el suero. Puede resultar til la identificacin del isotipo del anticuerpo que se halla en
los sueros positivos (1), puesto que los sueros de los cerdos infectados contienen normalmente IgG especfica
sola o IgG e IgM, mientras que los sueros de los animales positivos aislados contienen, exclusivamente, IgM.
a)
Neutralizacin vrica (prueba prescrita para el comercio internacional)

La microprueba cuantitativa de NV de deteccin de anticuerpos frente al virus de la EVP se lleva a cabo
utilizando clulas IB-RS-2 (o clulas de cerdo susceptibles apropiadas) en placas de microtitulacin de
fondo plano para cultivos de tejidos.
Se hace crecer el virus en monocapas de clulas IB-RS-2 y, despus de aadir un volumen igual de
glicerol, se guarda a 20C. Se ha observado que el virus de la EVP es estable en estas condiciones
durante al menos 1 ao. Antes de probar los sueros, se inactivan a 56C durante 30 minutos. Un medio
apropiado para el cultivo es el medio completo de Eagle/LYH con antibiticos.
Esta es una prueba de volmenes iguales en la que se utilizan volmenes de 50 l.
i)
A partir de una dilucin 1/4, se hacen diluciones seriadas con un factor de dilucin 2 de los sueros en
las placas, empleando dos hileras de pocillos para cada uno de los sueros problema.
ii)
Se aade el virus previamente titulado. Cada volumen de 50 l de suspensin vrica contiene

alrededor de 100 DICC50 (dosis infectiva 50% en cultivo celular).
iii)
Se incluyen los siguientes controles: un suero fuertemente positivo, un suero dbilmente positivo y un
suero negativo, un control celular, un control de medio de cultivo y una titulacin del virus utilizada
para calcular el ttulo vrico real empleado en la prueba.
iv)
Se cubren las placas y se incuban a 37C durante 1 hora.
153
Captulo 2.1.3. Swine vesicular disease
v)
Se prepara una suspensin celular de 106 clulas/ml en medio con suero bovino al 10% a fin de
favorecer el crecimiento celular. Se aaden 50 l de esta suspensin celular a cada pocillo.
vi)
Se sellan las placas con cinta sensible a la presin y se incuban a 37C durante 23 das.
Alternativamente, las placas pueden taparse con cubiertas no hermticas e incubarse a 37C en una
atmsfera con dixido de carbono al 5% durante 2-3 das.
vii)
Al cabo de 48 horas, se pueden realizar las lecturas al microscopio. Finalmente se fijan las placas y,
normalmente, se tien al tercer da. La fijacin se realiza con formalina/solucin salina al 10% durante
30 minutos. La tincin se realiza sumergiendo las placas durante 30 minutos en azul de metileno al
0,05% preparado en formalina al 10%. Las placas se enjuagan con agua corriente.
viii) Los tapices celulares teidos de azul constituyen los resultados positivos; los pocillos negativos estn
vacos. Los ttulos se expresan por la dilucin final del suero presente en las mezclas de suero/virus
que corresponden al 50% a punto final. La prueba se considerar vlida cuando la cantidad de virus
por pocillo realmente utilizada se encuentre entre 101,5 y 102,5 DICC50, y el ttulo del suero estndar
positivo se encuentre dentro de los lmites del doble de su ttulo esperado.
ix)
b)
Interpretacin de los resultados: En el Laboratorio de Referencia Mundial para la Fiebre Aftosa de la

OIE/FAO (vase nota a pie de pgina 1), se considera negativo un ttulo de NV inferior o igual a 1/11.
Un ttulo comprendido entre 1/16 y 1/32 es dudoso, y se considera positivo un ttulo igual o superior a
1/45. Sin embargo, dado que los ttulos dependen del sistema celular empleado, los laboratorios
habrn de establecer sus propios criterios tomando como referencia los reactivos estndares que se
encuentran disponibles en el Laboratorio de Referencia Mundial para la Fiebre Aftosa de la OIE/FAO.
Enzimoinmunoensayo
En el ELISA desarrollado por Brocchi et al. (1), el antgeno vrico de la EVP es capturado en la fase slida
utilizando el MAb 5B7. A continuacin se evala la capacidad de los sueros problema para inhibir la unin
del anticuerpo MAb 5B7 conjugado con peroxidasa al antgeno capturado. Finalmente se detecta la
cantidad del MAb conjugado unido, mediante la adicin de substrato y cromgeno.
i)
Se revisten las placas ELISA con 50 l/pocillo de MAb 5B7 a una dilucin de 10 g/ml, en tampn
carbonato/bicarbonato, pH 9,6, y se incuban a 4C durante toda la noche.
ii)
Se lavan las placas tres veces con PBS ms Tween 20 al 0,05%, y se aaden 50 l de antgeno de la
EVP (el virus de la EVP se ha hecho crecer en clulas IB-RS-2, se ha clarificado, filtrado e inactivado)
a una dilucin ptima predeterminada. La dilucin ptima del antgeno se determina mediante las
titulaciones de doble entrada del antgeno y del MAb conjugado que definen la dilucin de trabajo,
presentando un valor de absorbancia situado en la parte superior de la regin lineal de la curva de
titulacin del antgeno (entre 1,5 y 2,0 unidades de densidad ptica). A continuacin se incuban las
placas a 37C durante 1 hora.
iii)
Despus de tres lavados adicionales, se incuban 50 l de los sueros problema diluidos (no
inactivados) y de los sueros control con el antgeno capturado a 37C durante 1 hora. Los sueros se
someten a diluciones seriadas con un factor de dilucin 3 directamente en los pocillos de las placas
ELISA, aadiendo 10 l de suero a 65 l de tampn (dilucin 1/7,5) transfiriendo a continuacin 25 l a
los pocillos consecutivos, que contienen 50 l de tampn mezclando y desechando finalmente 25 l.
iv)
Despus de 1 hora de incubacin, se aaden 25 l de una dilucin ptima de MAb 5B7 conjugado con
peroxidasa (vase la etapa (ii)) a cada pocillo, y se incuban las placas a 37C, durante 1 hora ms.
v)
Despus de una serie final de lavados, se inicia la reaccin colorimtrica mediante la distribucin de
50 l por pocillo de la solucin substrato (0,5 mg/ml ortofenilendiamina en tampn fosfato/citrato, pH 5,
ms H2O2 al 0,02%).
vi)
Transcurridos 10 minutos, se detiene la reaccin aadiendo 50 l de cido sulfrico 2 N. Se lee la

absorbancia a 492 nm utilizando un lector de microplacas.
El antgeno, los sueros y el conjugado se diluyen en PBS (pH 7,4) que contenga Tween 20 al 0,05% y
extracto de levadura al 1%; el tampn de dilucin para los sueros contiene, adems, suero de ratn al 1,0%,
bien recubriendo la placa o conjugado con peroxidasa, para impedir la unin inespecfica del suero de cerdo
al MAb 5B7.
vii)
Controles: Cuatro pocillos de cada placa con todos los reactivos, excepto el suero problema, para
confirmar la lectura de mxima absorbancia para el antgeno; el suero procedente de un cerdo
convaleciente a cuatro diluciones seleccionadas; el suero de un cerdo negativo y un suero estndar de
cerdo dbilmente positivo.
viii) Interpretacin de los resultados: Las reacciones se expresan por el porcentaje de inhibicin de la
reaccin del MAb con el antgeno de la EVP, causado por cada suero problema. Si el porcentaje de
inhibicin medio en las diluciones 1/7,5 y 1/22,5 es ms del 70%, los sueros se consideran
154
fuertemente positivos. Los sueros que registren una media de ms del 70% de inhibicin en la dilucin
1/7,5, pero menos del 70% de inhibicin en la dilucin 1/22,5 se consideran dbilmente positivos o
dudosos. Se consideran negativos los sueros que muestren menos del 70% de inhibicin en ambas
diluciones. Debern confirmarse todos los resultados positivos y los dudosos utilizando la prueba de
NV.
SUEROS DE REFERENCIA ESTNDAR PARA LAS PRUEBAS SEROLGICAS DE LA EVP

El Laboratorio de Referencia Mundial para la Fiebre Aftosa de la FAO/OIE mantiene una serie de sueros de
referencia que han sido exhaustivamente validados por los Laboratorios de Referencia Nacionales de la EVP de
los Estados Miembros de la Unin Europea.

Actualmente no existen vacunas disponibles comercialmente de EVP. Los sueros estndar pueden obtenerse del
Laboratorio de Referencia Mundial para la Fiebre Aftosa de la OIE/FAO (vase nota a pie de pgina 1). El
anticuerpo MAb 5B7 puede conseguirse en el Laboratorio de Referencia de la OIE para la enfermedad vesicular
porcina, que se encuentra en Italia (vase el cuadro mostrado en la Parte 3 de este Manual).
REFERENCIAS
1.
BROCCHI E., BERLINZANI A., GAMBA D. & DE SIMONE F. (1995). Development of two novel monoclonal antibodybased ELISAs for the detection of antibodies and the identification of swine isotypes against swine vesicular
disease virus. J. Virol. Methods, 52, 155167.
2.
BROCCHI E., ZHANG G., KNOWLES N.J., W ILSDEN G., MCCAWLEY J.W., MARQUARDT O., OHLINGER V.F. & DE
SIMONE F. (1997). Molecular epidemiology of recent outbreaks of swine vesicular disease: two genetically
and antigenically distinct variants in Europe, 19871994. Epidemiol. Infect., 118, 5161.
3.
CALLENS M. & DE CLERCQ K. (1999). Highly sensitive detection of swine vesicular disease virus based on a
single tube RT-PCR system and DIG-ELISA detection. J. Virol. Methods, 77, 8799.
4.
DONALDSON A.I., FERRIS N.P., KNOWLES N.J. & BARNETT I.T.R. (1983). Comparative studies of United Kingdom
isolates of swine vesicular disease virus. Res. Vet. Sci., 35, 295300.
5.
GOLDING S.M., HEDGER R.S., TALBOT P. & W ATSON J. (1976). Radial immunodiffusion and serum
neutralisation techniques for the assay of antibodies to swine vesicular disease. Res. Vet. Sci., 20, 142147.
6.
KITCHING R.P. & DONALDSON A.I. (1987). Collection and transportation of specimens for vesicular virus
investigation. Rev. sci. tech. Off. int. Epiz., 6, 263272.
7.
LIN F., MACKAY D.K.J. & KNOWLES N.J. (1997). Detection of swine vesicular disease virus RNA by reverse
transcription-polymerase chain reaction. J. Virol. Methods, 65, 111121.
8.
LOXAM J.R. & HEDGER R.S. (1983). Swine vesicular disease: clinical signs, diagnosis, epidemiology and
control. Rec. sci. tech. Off. int. Epiz., 2, 1124.
9.
MANN J.A. (1981). Swine vesicular disease. In: Virus Diseases of Farm Animals, Vol. 2, Gibbs E.P.J., ed.
Academic Press, London, UK, 365381.
10. NUNEZ J.I., BLANCO E., HERNANDEZ T., GOMEX-TEJEDOR C., MARTIN M.I., DOPAZO J. & SOBRINO F. (1998). A RTPCR assay for the differential diagnosis of vesicular viral diseases of swine. J. Virol. Methods, 72, 227235.
11. VANGRYSPERRE W. & DE CLERCQ K. (1996). Rapid and sensitive polymerase chain reaction based on
detection and typing of foot-and-mouth disease virus in clinical samples and cell culture isolates, combined
with a simultaneous differentiation with other genomically and/or symptomatically related viruses. Arch.
Virol., 141, 331344.
*
* *
NB: Existen laboratorios de referencia de la OIE para la Enfermedad vesicular porcina (ver Cuadro en la
parte 3 de este Manual de animales terrestres o consultar la pgina web de la OIE para una lista
actualizada: www.oie.int)
155
CAPTULO 2.1.4.
PESTE BOVINA
RESUMEN
La peste bovina es una enfermedad vrica aguda del ganado bovino domstico, de los bfalos y de
los yaks, que se caracteriza por altas tasas de morbilidad y mortalidad. Tambin puede afectar a
ovejas, cabras, cerdos y ungulados salvajes. Clnicamente, esta forma de enfermedad se
caracteriza por fiebre, un desarrollo progresivo de erosiones superficiales en las encas, lengua,
carrillos y paladar, junto con descargas oculares y nasales serosas o mucopurulentas. Las
complicaciones en el tracto alimentario estn marcadas por la aparicin de diarrea o disentera que
provoca una deshidratacin grave y depresin. Este cuadro clnico se observa en la actualidad
muy raramente, pero en el este africano todava se presenta una forma ms leve de la
enfermedad, con el potencial de readquirir las caractersticas clsicas.
En la ltima dcada se han reconocido tres linajes de virus de la peste bovina, genticamente
diferentes, como agentes de la enfermedad en frica y Asia. El linaje 1 se limit a Etiopa y Sudn,
el linaje 2 al este de frica y el 3 a Asia. Recientemente, tanto el sur de Sudn como el oeste
asitico estaban infectados, pero ambas zonas se consideran libres de peste bovina en la
actualidad. La Organizacin de las Naciones Unidas para la Alimentacin y la Agricultura (FAO)
inici en 1992 un Programa Global de Erradicacin de la Peste Bovina orientado a erradicar el
virus en el ao 2010. El xito de dicho programa puede juzgarse por el hecho de que dos de las
tres lneas independientes de peste bovina se han erradicado a nivel global.
Identificacin del agente: La confirmacin clnica de la peste bovina se basa en el hallazgo de
animales individuales o en pequeos grupos que muestran fiebre, inapetencia, depresin,
erosiones superficiales en el labio superior e inferior y en las encas, erosiones o escamaciones de
las papilas de los carrillos, descargas oculares serosas o mucopurulentas y/o descargas nasales,
diarrea, postracin y posiblemente muerte. La confirmacin en el laboratorio se basa en la
demostracin de la presencia del virus, de ARN especfico del virus o de antgenos precipitantes
en muestras del bazo, ndulos linfticos o secreciones nasales u oculares de animales con
infeccin aguda. Es muy importante aislar el virus si ha tenido lugar un importante deterioro de la
salud animal en una extensin geogrfica. Despus de el xito de la erradicacin global, los pases
libres de peste bovina pueden confirmar ahora la presencia de la peste de los pequeos rumiantes
(PPR) en las ovejas o cabras basndose en la apariencia clnica de los animales infectados y en la
presencia de antgenos precipitantes, aunque los sntomas clnicos y los antgenos inducidos son
comunes a ambos virus.
En los exmenes post-mortem de casos sospechosos de peste bovina se debe dedicar una
atencin especial a la cuarta cavidad del rumen que puede estar muy engrosada o mostrar una
decoloracin griscea; a las placas de Peyer, que pueden mostrar necrosis linfoide; y al desarrollo
de un engrosamiento linear y un ennegrecimiento de las crestas de los repliegues del ciego, del
colon y del recto. Los diagnsticos diferenciales principales han de realizarse con la PPR en
ovejas y cabras, y la diarrea bovina vrica/enfermedad de las mucosas junto con la fiebre maligna
catarral en el ganado bovino; la diferenciacin de estas enfermedades requiere utilizar mtodos de
laboratorio apropiados.
Pruebas serolgicas: La OIE ha desarrollado una serie de Estndares Recomendados para la
Vigilancia Epidemiolgica de la Peste Bovina (la "va de la OIE") que orienta las acciones de los
pases miembros que desean demostrar que han logrado verse libres de la infeccin. Con este fin
se dispone de enzimoinmunoensayos de competicin e indirecto que determinan la presencia de
anticuerpos en animales que se han infectado con el virus natural o con la vacuna de la peste
bovina. La prueba seleccionada debe ser sensible respecto al linaje de virus que puede
156
Captulo 2.1.4. Peste bovina
presentarse. Con la misma finalidad puede utilizarse la estimacin de anticuerpos neutralizantes.

Los pases miembros pueden buscar consejo en un Laboratorio de Referencia de la OIE respecto
a la seleccin de la prueba ms apropiada a sus propsitos.
Requisitos para las vacunas y los materiales de diagnstico: Se dispone de una vacuna viva
atenuada en cultivo celular. En los ltimos aos se ha restringido su empleo a campaas
intensivas de vacunacin en los focos de enfermedad porque la inmunidad duradera que induce,
antes considerada de enorme importancia, interfiere ahora con las valoraciones serolgicas postcampaa. Debido a que el uso de esta vacuna ha originado resultados confusos en la
serovigilancia, y a que todava hay disponible una gran cantidad de ella, los pases miembros
deben catalogar y asegurar todos los stocks restantes. Para combatir los ltimos focos residuales
de virus y conservar a la vez la capacidad de desarrollar campaas de serovaloracin y vigilancia,
existe una urgente necesidad de disponer de una vacuna marcada junto con pruebas apropiadas
que permitan discriminar entre los anticuerpos inducidos por la vacuna y los debidos a una
infeccin natural. Se han desarrollado experimentalmente vacunas marcadoras pero por desgracia
ninguna est comercializada. Por otra parte, hasta que se autoricen alternativas o hasta que un
pas se libere de la peste bovina y necesite hacer declaracin de que est libre de la enfermedad
provisionalmente, es posible que la vacunacin con una vacuna heterloga contra PPR pueda
representar una solucin transitoria si resulta aprobada por las autoridades competentes.
A. INTRODUCCIN
En los ltimos aos, el Programa de Erradicacin Global de la Peste Bovina, dependiente de la Organizacin
para la Alimentacin y la Agricultura (FAO) de las Naciones Unidas, ha realizado un enorme avance organizando
y documentando el descenso de la peste bovina (15). Histricamente, el virus estaba distribuido ampliamente por
toda Europa, frica y Asia: Sin embargo, recientemente solo se ha detectado en frica y Asia. El anlisis de
secuencias genticas ha mostrado que todos los aislamientos de peste bovina encajan en uno de tres linajes
filogenticos no superpuestos, y ahora es posible describir la distribucin del virus en trminos de linajes
especficos. As, el llamado linaje asitico (linaje 3) siempre se ha descrito solamente en Afganistn, India, Irn,
Irak, Kuwait, Omn, Pakistn, Rusia, Arabia Saudita, Turqua, Sri Lanka y Yemen. Como consecuencia de una
vacunacin concertada y coordinada, y de campaas de vigilancia, este linaje de virus no ha vuelto a aparecer
desde septiembre de 2000 (en Pakistn). Aunque las estimaciones no son todava completas, es casi seguro que
este virus ha sido erradicado con xito.
Los virus de la peste bovina de los linajes 1 y 2 solo se han descrito en frica. El linaje 1 parece haberse
distribuido desde Egipto hasta al sur de Sudn, por el este a Etiopa, y hacia el norte y el oeste de Kenia. Por otra
parte, el linaje 2 se ha descrito tanto en el este como en el oeste de frica y en tiempos pudo estar distribuido por
el cinturn sub-sahariano a lo ancho de todo el continente (16). Ahora, no obstante, como resultado de otro
programa de vacunacin coordinada y de vigilancia (en particular la Campaa Panafricana de Peste Bovina), en
los ltimos 15 aos, ni el oeste de frica ni frica central han descrito casos de peste bovina. Hasta hace poco
ambos linajes se describan en el este de frica (el linaje 1 al sur de Sudn en 1998, y el linaje 2 en Kenia en
2001). La falta de evidencia actual de que el linaje 1 est an transmitindose apoya la idea de que este linaje
tambin ha sido erradicado.
El linaje 2, que reapareci en 1994, 1996 y 2001 en la fauna salvaje, est an transmitindose en el ecosistema
relacionado con el pastoreo de Somalia (12), donde su continua presencia causa una considerable preocupacin
(13). En 1994 este virus reapareci en el sudeste de Kenia, con efectos dramticos sobre los bfalos del Parque
Nacional de Tsavo (3), ilustrando de este modo su capacidad para llevar a cabo una persistencia crptica durante
un perodo de al menos 30 aos. En este perodo es probable que se transmitiera con bajo nivel de virulencia
entre el ganado susceptible. Aunque ahora parece que este virus ha evolucionado hasta el punto de escapar a la
atencin veterinaria en reas remotas, su presencia no pas desapercibida por los pastores nmadas a cuyo
ganado infectaba. Ms recientemente, en 2003 se describi una peste bovina suave en ganado de Kenia
prximo a la frontera con Somalia. Este virus no se ha aislado, pero estudios genticos han relacionado el ARN
vrico con la cepa ancestral RBOK. Este enigma requiere una urgente resolucin. El peligro que se cierne sobre
el ganado de otras partes de frica, debido a la circulacin de virus en lo que, casi con certeza, es el ltimo
reservorio de la peste bovina, queda demostrado por su capacidad de extenderse a Kenia y a la vecina Tanzania
en los aos 80 y de nuevo a mediados de la dcada de los 90 (18), adquiriendo virulencia en el proceso.
La peste bovina est causada por un virus con ARN de polaridad de antimensajero, que pertenece al gnero
Morbillivirus dentro de la familia Paramyxoviridae. Las descripciones clsicas de la peste bovina la describen
como una enfermedad muy grave del ganado bovino domstico, de bfalos y de yaks. El virus tambin afecta a
157
ovejas, cabras, algunas razas de cerdos, y a una amplia variedad de especies salvajes dentro del orden de los
artiodctilos, aunque no siempre con una forma clnica aparente.
Al describir la peste bovina en trminos contemporneos hay que considerar que en la mayor parte de los casos
es una enfermedad infecciosa leve del ganado, no fatal, pero con dos atributos muy peligrosos. El primero es una
casi segura capacidad para experimentar modulaciones de la virulencia. El segundo es su capacidad para
infectar especies animales de caza y causar una infeccin aguda asociada con altos niveles de mortalidad en
bfalos, antlopes elands (Taurotragus oryx), jirafas, kudus y cerdos verrugosos.
El perodo de incubacin de la forma suave de la peste bovina asociada con el linaje 2 es de 1-2 semanas, y la
enfermedad clnica subsiguiente se puede considerar como poco ms que un ataque febril subagudo. La fiebre
es variable, dura poco (3-4 das) y no es muy alta (38-40C). La depresin que caracteriza a las formas ms
agudas de peste bovina est ausente en los animales con afeccin suave que, sin perder el apetito, continan
con sus actividades normales. Normalmente estos animales no presentan diarreas. En un examen detallado
puede haber una ligera congestin de las mucosas visibles y en la enca inferior se pueden observar pequeas
reas focales de necrosis epitelial blanquecina -a veces no mayores que la cabeza de un alfiler- junto a unas
cuantas papilas erosionadas en los carrillos. Algunos animales no muestra tales erosiones, cuya apariencia es
efmera. Otros animales pueden tener una ligera secrecin ocular o nasal de tipo seroso pero, en contraste con
las formas ms graves de la enfermedad, no llegan a ser mucopurulentas.
De vez en cuando puede aumentar la virulencia suave del linaje 2, en cuyo caso es aplicable la descripcin
clsica de la peste bovina que sigue a continuacin. Despus de un perodo de incubacin de 1-2 semanas, la
enfermedad clnica se caracteriza por un ataque febril agudo en el que se pueden distinguir fases prodrmicas y
erosivas. El perodo prodrmico dura aproximadamente 3 das, en los que los animales afectados desarrollan
fiebre de 40-41,5C junto con anorexia parcial, estreimiento, congestin de las mucosas visibles, descargas
nasales y oculares serosas, depresin y sequedad del morro. Sin embargo, no puede hacerse un diagnstico
clnico preliminar de la peste bovina hasta el comienzo de la fase erosiva y el desarrollo de lesiones bucales
necrticas. En el pico febril aparecen, en el labio inferior y en la enca, manchas de epitelio necrtico y, en una
sucesin rpida, pueden extenderse a la enca superior y a la almohadilla dental, a la parte inferior de la lengua,
a los carrillos y a las papilas de los carrillos y al paladar. Mediante el aumento de las lesiones existentes y el
desarrollo de nuevos focos, la extensin de la necrosis oral puede incrementar notablemente en los 2-3 das
siguientes. Parte del material necrtico se desprende originando erosiones no hemorrgicas y superficiales de
las mucosas.
La diarrea es otra propiedad caracterstica de la peste bovina y se desarrolla 1-2 das despus de la aparicin de
las lesiones bucales. Al principio es copiosa y acuosa, pero despus puede contener mucosidades, sangre y
restos de epitelio, y en los casos graves puede estar acompaada por espasmos. Durante la fase erosiva, se
puede ver necrosis en los agujeros nasales, en la vulva, en la vagina y en el prepucio. Aparece anorexia, el
morro se seca por completo, el animal muestra depresin, el aliento es ftido y se desarrollan descargas
oculares y nasales mucopurulentas.
Aunque ocurren muertes, la mortalidad es variable y aumenta a medida que el virus tiene acceso a ms animales
susceptibles. Las tasas de mortalidad inicial son probablemente del 10-20% y en las fases terminales de la
enfermedad los animales muestran postracin 24-48 horas antes de la muerte. Algunos animales mueren con
lesiones necrticas graves, fiebre alta y diarrea, pero otros lo hacen despus de una cada sbita de temperatura
corporal a valores inferiores a los normales. Alternativamente, puede remitir la fiebre hacia la mitad del perodo
erosivo y, 2-3 das ms tarde, alcanzar la temperatura normal con una rpida resolucin de las lesiones bucales,
detencin de la diarrea e inicio de una convalecencia sin complicaciones.
Tpicamente, las canales de los animales muertos estn deshidratadas, macilentas y sucias. Las fosas nasales y
los carrillos muestran evidencias de descargas mucopurulentas, los ojos estn hundidos y la conjuntiva
congestionada. En la cavidad oral hay una extensa descamacin del epitelio necrtico, que siempre aparece
separado de las reas adyacentes de mucosa sana. Las lesiones se extienden a menudo al paladar y pueden
implicar a la faringe y a la porcin superior del esfago; normalmente, las distintas cavidades del rumen no estn
afectadas, aunque ocasionalmente se encuentran placas necrticas en los pilares del rumen. La regin pilrica
est especialmente afectada y muestra congestin, petequias y edema de la submucosa. La necrosis epitelial da
un color grisceo a la membrana mucosa. Por lo general, el intestino delgado no est implicado, excepto por
cambios notables en las placas de Peyer donde la necrosis linfoide y la descamacin dejan la estructura orgnica
engrosada o ennegrecida. En el intestino grueso los cambios afectan a la vlvula ileocecal, el ganglio cecal y las
crestas de los repliegues longitudinales de las mucosas del ciego, colon y recto. Los repliegues aparecen muy
marcados en casos de muerte aguda y con color oscuro en casos duraderos; en ambos casos las lesiones se
conocen como "bandas de cebra".
Aunque las infecciones con el linaje 2 pueden pasar inadvertidas en el ganado, el virus es muy infeccioso para
especies de vida salvaje, y entre las especies susceptibles (bfalo, eland y kudu) se origina fiebre, descarga
nasal, estomatitis erosiva tpica, gastroenteritis y muerte. Kock (10) observ adems que los bfalos infectados
158
por el linaje 2 tenan los ganglios linfticos perifricos inflamados, lesiones de la piel con placas queratinizadas y
queratoconjuntivitis. Los kudus se infectaron de modo similar, pero aunque la ceguera fue comn -causada por
una queratoconjuntivitis aguda- la diarrea no fue un sntoma usual. Los elands tambin mostraron necrosis y
erosiones en la mucosa bucal junto con deshidratacin y extenuacin. Por tanto, en las presentes circunstancias,
el diagnstico de peste en cualquiera de estas especies indica probablemente la transmisin simultnea del virus
al ganado circundante, aunque a un nivel subclnico.
1.
En vista de los esfuerzos orientados a la erradicacin del linaje 2, cualquier brote de peste bovina tiene una
elevada significacin epidemiolgica. Por ello, las muestras de todos los brotes diagnosticados como peste
bovina sobre bases clnicas o patolgicas deben ser enviadas para confirmacin en el laboratorio. Se dispone de
una adecuada variedad de pruebas de laboratorio, pero es de capital importancia aislar el virus, identificar su
linaje y establecer su virulencia en ganado experimental (1). Aunque no es una prueba diagnstica definitiva, una
prueba rpida en tira cromatogrfica (Prueba Penside; ref. 6) resulta ser un instrumento til para ayudar al
personal de campo a investigar brotes de peste bovina en las fases finales de erradicacin. En Pakistn (9) y
Yemen, ha sido particularmente eficaz. La muestra preferida, siempre que sea posible, es sangre con
anticoagulante. La aparicin de la viremia suele preceder ligeramente a la aparicin de la fiebre y continuar
durante 1-2 das despus de que la pirexia empieza a desaparecer. En consecuencia, los animales con fiebre
son probablemente virmicos y constituyen por tanto la mejor fuente de sangre con la que intentar el aislamiento
del virus. No obstante, como algunos animales febriles pueden ocasionalmente no ser virmicos, se deben tomar
muestras de diferentes animales con fiebre. Es importante asegurar que haya suficiente muestra disponible para
intentar al menos dos aislamientos del virus en el envo inicial cuando aparece un brote sospechoso. Los otros
procedimientos descritos deben intentarse solo si hay muestra disponible en exceso.
a)

El virus de la peste bovina puede cultivarse de la fraccin de leucocitos de la sangre completa recogida con
heparina o EDTA (cido etiln diamino tetra-actico) a una concentracin final de 10 unidades
internacionales (UI)/ml y 0,5 mg/ml, respectivamente. Las muestras deben mezclarse cuidadosamente y
llevarse al laboratorio con hielo, pero no congeladas. El virus tambin puede aislarse de muestras de
ganglios linfticos del bazo, preescapulares o mesentricos de animales muertos; estas muestras pueden
congelarse para el transporte.
Para aislar el virus de la sangre, se centrifuga la sangre no coagulada a 2.500 g durante 15 minutos hasta
producir una capa leucocitaria en la interfase entre el plasma y los eritrocitos. Esta capa se extrae tan
limpiamente como sea posible, se mezcla con 20 ml de solucin salina fisiolgica y se recentrifuga en un
proceso de lavado diseado para eliminar cualquier anticuerpo neutralizante presente en el plasma. El
precipitado celular resultante se suspende en medio de mantenimiento para cultivo celular y se distribuye en
alcuotas de 2 ml sobre monocapas establecidas en tubos rodantes con clulas primarias de rin de
cordero, clulas linfoblastoides B95a de mono tit o clulas de rin de mono verde africano (Vero). El
medio de cultivo se decanta y se reemplaza cada 2-3 das y se observa la monocapa microscpicamente
para el desarrollo de efectos citopticos (ECP). stos se caracterizan por refractibilidad, redondeamiento
celular, retraccin de las clulas con formacin de puentes citoplsmicos alargados (clulas estrelladas) y/o
formacin sincitial. La velocidad a la que se desarrolla el ECP vara en funcin del substrato y de la cepa del
virus. En clulas primarias se puede esperar hasta 12 das, en clulas Vero una semana y en clulas B95a
2-4 das. Antes de declarar negativa una muestra importante se pueden intentar pases, pero una tcnica
preferible sera inocular intravenosamente la suspensin celular, y cualquier residuo de la muestra original,
en un buey susceptible e intentar reaislar el virus de su sangre. Los aislamientos de virus se pueden
identificar parcialmente demostrando la presencia de precipitgenos especficos de morbilivirus en los
restos de clulas infectadas, o bien identificar por completo mediante inmunofluorescencia especfica
utilizando un anticuerpo monoclonal (MAb) conjugado.
Alternativamente, se pueden emplear suspensiones al 20% (p/v) de ganglios linfticos o de bazo. stas se
deben hacer homogenizando los tejidos slidos con medio de mantenimiento de los cultivos sin suero y
1
utilizando tcnicas normalizadas de homogenizacin o de corte e inoculando las monocapas como antes.
La liberacin de virus de tejidos slidos se puede lograr de diversos modos. El ms sencillo es con un mortero, pero esta
tcnica requiere el uso de arena estril como abrasivo. Alternativamente, el tejido se puede moler sin abrasivo utilizando
un molinillo de vidrio, como por ejemplo el Ten Broeck. Las tcnicas de corte son igualmente aplicables utilizando, por
ejemplo, batidoras Silverson o Waring. Las suspensiones que contienen los virus se clarifican por centrifugacin a baja
velocidad. El volumen de inculo no es importante; un volumen normal de trabajo es 1-2 ml. Los antibiticos ms
utilizados son penicilina y estreptomicina, utilizados en combinacin, cada uno a una concentracin de 100 UI/ml. Se
159
b)
Deteccin de antgeno por inmunodifusin en gel de agar

Las pruebas de inmunodifusin en gel (IGDA) pueden hacerse en placas Petri o en portas de vidrio para
microscopio (7). En cualquier caso, la superficie se cubre con agar hasta una profundidad de unos 4 mm
utilizando una solucin acuosa de agar o agarosa al 1% de alta calidad. Se cortan pocillos en disposicin
hexagonal, con seis pocillos perifricos alrededor de un nico pocillo central. En los portas, los pocillos
deben tener 3 mm de dimetro y estar separados 2 mm. En las placas Petri, los pocillos pueden
aumentarse a 4 mm y la distancia entre los pocillos a 3 mm. Cuanto ms juntos se coloquen los pocillos
entre s, menor es el tiempo de reaccin.
Con una pipeta de pequeo volumen, se coloca en el pocillo central un suero de conejo hiperinmune contra
la peste bovina. De modo similar, se coloca en pocillos perifricos alternativos (es decir, en el pocillo uno,
tres y cinco) un control positivo de antgeno preparado de ganglios linfticos homogenizados de conejos
infectados con la cepa de peste lapinizada Nakamura III. El control de antgeno negativo se coloca en el
pocillo cuatro. Los antgenos problema se obtienen de exudados de un corte del bazo o de ndulos
linfticos enviados como muestra para la prueba; alternativamente, se homogeniza un pequeo trozo de la
muestra en solucin salina. Los exudados oculares se pueden tomar directamente de los frotis o por
compresin de una micropipeta (debe quitarse el algodn del hisopo de toma de muestra, y colocarlo en el
extremo ancho de una punta desechable de plstico de una micropipeta de 50-250 l; luego, con la varilla
del hisopo, se comprime el algodn y se fuerza hasta que salga un pequeo volumen del exudado por el
extremo delgado de la punta de la micropipeta). Las muestras se aaden a los pocillos dos y seis. Las
pruebas se desarrollan mejor a 4C o a temperatura ambiente baja. El rea de reaccin debe
inspeccionarse a partir de las 2 horas para la aparicin de lneas de precipitacin limpias y netas entre los
pocillos, formando una lnea de identidad con los controles. Si no se obtiene resultado en 24 horas, las
pruebas se desechan. Los resultados no son vlidos si no se obtiene tambin reacciones de precipitacin
que den una lnea de identidad con la preparacin de control positivo de antgeno.
Aunque la prueba no es muy sensible ni muy especfica, es resistente y adaptable a condiciones de campo.
Una reaccin positiva en un rumiante domstico grande debe considerarse peste bovina. En un rumiante
pequeo, un resultado positivo debe considerarse como derivado de un caso de peste de los pequeos
rumiantes (PPR) y requiere una diferenciacin posterior.
c)
Histopatologa
En examen post-mortem, se recogen los tejidos y se colocan en 10% de formalina neutra tamponada para
histopatologa e inmunohistoqumica; los tejidos adecuados son la base de la lengua, el ganglio linftico
retrofarngeo y el tercer prpado. Se deben examinar cortes teidos con hematoxilina y eosina para ver
formacin de sincitios celulares y de clulas con cuerpos de inclusin vricos intranucleares. La presencia
de antgenos de la peste bovina puede demostrarse en los mismos tejidos fijados con formalina por tincin
con inmunoperoxidasa despus de determinar la actividad de la peroxidasa basal endgena. Si se utiliza un
anticuerpo policlonal, esta prueba no diferencia entre peste bovina y PPR. Sin embargo, este problema
puede superarse utilizando una sonda de ARN antisentido contra el gen de la protena N de la peste bovina
(5).
d)
Identificacin del linaje por medio de la reaccin en cadena de la polimerasa con trascripcin
inversa
La reaccin en cadena de la polimerasa con transcripcin inversa (RT-PCR) (8) genera ADN adecuado para
anlisis de las secuencias de los genes. El ARN vrico puede purificarse del bazo (no lo ideal debido a su
elevado contenido en sangre), de ganglios linfticos y amgdalas (lo ideal), de linfocitos de la sangre
perifrica (PBLs) o de frotis oculares o de lesiones bucales. Los tejidos slidos (0,5-1,0 g) se trocean y se
2
homogenizan con 4,0 ml de solucin desnaturalizante , los frotis oculares y bucales se tratan con 1,0 ml y
los PBLs purificados (de 5-10 ml de sangre completa) con 0,4 ml, segn el procedimiento publicado. El ARN
obtenido se precipita con 2,5 volmenes de etanol, se lava con etanol al 70%, se disuelve en agua estril o
en tampn TE (Tris/EDTA, 10 mM, pH 7,5, con EDTA 1 mM), y se guarda a -70C o -20C hasta su empleo.
La sntesis de ADN complementario (ADNc) se realiza con cebadores hexanucleotdicos aleatorios para
utilizar ms tarde diferentes lotes especficos de cebadores en el paso de amplificacin por PCR. Despus
160
puede obtener una mezcla similar de amplio espectro utilizando neomicina a 50 g/ml. Debera incluirse fungizona a 2,5
g/ml.
Solucin D (solucin desnaturalizante de rotura): el procedimiento es el recomendado para reducir el riesgo de manejar
tiocianato de guanidina venenoso. Debe realizarse en una cabina qumica de seguridad. Se indican las cantidades de
tiocianto de guanidina para una botella de 250 g, pero los volmenes se pueden ajustar para otras cantidades. No
intentar pesar el tiocianato de guadina, sino disolverlo en la botella del fabricante aadiendo 293 ml de agua destilada
estril, 17,6 ml de citrato sdico 0,75 M, pH 7,0, y 26,4 ml de sarcosil al 10%; luego se calienta en un bao de agua a
65C hasta completa disolucin. Esta solucin se mantiene varios meses en la oscuridad a temperatura ambiente en una
cabina qumica de seguridad. La solucin D final se hace aadiendo 0,36 ml de 2-mercaptoetanol a 50 ml de la solucin
stock. Esta solucin no debe mantenerse ms de 1 mes.
se amplifican alcuotas del ADNc resultante, usando al menos tres lotes de cebadores que puedan detectar
y diferenciar entre los dos morbilivirus. Estos juegos incluyen dos lotes "universales" basados en regiones
muy conservadas en los genes de la fosfoprotena y nucleoprotena que se detectan en todos los
morbilivirus, y un lote especfico del virus de la peste bovina basado en las secuencias de los genes de las
protenas de fusin del virus. Los productos de la PCR se analizan en un gel de agarosa al 1,5% (p/v) junto
con marcadores adecuados de ADN para identificar el producto especfico de ADN. En cada RT-PCR se
debe incluir un control positivo, como el ARN del virus del sarampin o del moquillo canino, y un control
negativo con agua destilada estril en vez de ARN. Las reacciones positivas deben confirmarse usando
lotes de cebadores "anidados" sobre secuencias del gen F o por anlisis de las secuencias del ADN
producido. Es importante utilizar ms de un juego de cebadores en el paso de la PCR cuando se prueba la
presencia de virus con ARN, pues su secuencia nucleotdica puede variar considerablemente y un cambio
en el extremo 3 de la secuencia del cebador ocasiona la imposibilidad de amplificar el ADN. El Laboratorio
de Referencia Mundial en Inglaterra, que es tambin un laboratorio de referencia de la OIE para Peste
Bovina, y el laboratorio de referencia de la OIE en Francia (ver Cuadro en la Parte 3 de este Manual)
pueden aconsejar sobre el uso de la tcnica para anlisis de muestras de campo.
Inmunocaptura diferencial
Ni las observaciones clnicas ni las pruebas IGDA pueden diferenciar entre peste bovina y PPR. Por ello, en
pases en que ocurren ambas enfermedades, se deben emplear otras pruebas si se sospecha cualquiera de
estas enfermedades en ovejas o cabras. Se puede conseguir una diferenciacin rpida utilizando una prueba
ELISA de inmunocaptura diferencial (11). Esta prueba emplea MAbs dirigidos contra la protena N de los dos
virus. Se utiliza como anticuerpo de captura un MAb que reacciona contra los dos virus, mientras que un
segundo MAb, que est biotinilado y es especfico para un sitio antignico no superpuesto de la protena N, y que
puede ser especfico de peste bovina, o bien de PPR, se utiliza para determinar la protena N que ha sido
capturada.
Las placas (o tiras) para ELISA con alta capacidad de unin de protenas se recubren con 100 l de antgeno de
captura por pocillo. Despus de tres lavados, se aade a los pocillos 50 l de la muestra problema diluida 1/10
en un tampn e lisis, 25 l de la dilucin recomendada por el fabricante del MAb especfico para el virus y 25 l
de estreptavidina-peroxidasa a una dilucin final de 1/3.000. Los pocillos se llevan a continuacin a un agitador
orbital durante 1 hora a 37C y despus se lavan de nuevo. Despus de la adicin de 100 l de ortofenilndiamina (OPD), los pocillos se reincuban durante 10 minutos a temperatura ambiente. Las reacciones se
detienen aadiendo 100 l de cido sulfrico 1 N y los resultados se miden a 492 nm en un lector ELISA
automtico y se expresan como valores de absorbancia.
2.
Pruebas serolgicas
a)
El enzimoinmunoensayo competitivo (prueba prescrita para el comercio internacional)

Se dispone de un ELISA competitivo para la deteccin de anticuerpos contra la peste bovina en el suero de
animales de cualquier especie que se haya expuesto previamente al virus. La prueba se basa en la
capacidad que presentan los sueros problema positivos para competir en la unin al antgeno de la peste
bovina con un MAb anti-protena H de la peste bovina. La presencia de tales anticuerpos en la muestra
problema bloquear la unin del MAb, produciendo una reduccin en el color esperado de la reaccin
despus de aadir IgG anti-ratn conjugada con una enzima y una solucin de substrato/cromgeno. Como
es un ensayo en fase slida, se necesitan pasos de lavados para asegurar la eliminacin de los reactivos
que no se unen.
El antgeno de la peste bovina se prepara a partir de cultivos celulares Madin-Darby de rin bovino
infectados con la cepa atenuada Kabete "O" del virus de la peste bovina. El antgeno se concentra del
sobrenadante del cultivo celular infectado, por precipitacin con sulfato amnico. El MAb se obtuvo
fusionando esplenocitos de ratones hiperinmunizados con la lnea celular de mieloma NSO, y comprobando
que era especfico para peste bovina (2); este MAb se designa en la actualidad como C1. Tanto el C1 como
el antgeno estandarizado de la peste bovina estn disponibles en el laboratorio de referencia de la OIE
para Peste Bovina en Inglaterra (ver Cuadro en la Parte 3 de este Manual). Existen kits comercializados.
i)
Reconstituir el antgeno liofilizado de peste bovina con 1 ml de agua estril y, posteriormente, diluir
con solucin salina tamponada con 0,01 M de fosfato (PBS), pH 7,4, hasta la dilucin de trabajo
recomendada por el fabricante
ii)
Distribuir de inmediato volmenes de 50 l del antgeno diluido en un nmero apropiado de pocillos de

una microplaca para ELISA con alta capacidad de unin de protenas y con fondo plano, utilizando dos
pocillos por suero problema. Golpear lateralmente la microplaca para asegurar que el antgeno se
161
distribuye uniformemente por el fondo de cada pocillo, tapar la microplaca e incubar en un agitador
orbital durante 1 hora a 37C. Lavar despus los pocillos tres veces con 0,002 M de PBS, pH 7,4.
iii)
Aadir a cada pocillo de la prueba 40 l de tampn de bloqueo (0,01 M de PBS, 0,1% [v/v] de Tween
20 y 0,3% [v/v] de suero bovino normal) seguido por volmenes de 10 l a todos los sueros problema.
iv)
Seguir las recomendaciones del fabricante para preparar una dilucin de trabajo del MAb en tampn
de bloqueo y aadir 50 l del mismo a cada pocillo de la prueba. Tapar la placa y re-incubar en un
agitador orbital durante 1 hora a 37C.
v)
Seguir las recomendaciones del fabricante para preparar una dilucin de trabajo de inmunoglobulina
de conejo anti-ratn conjugada con peroxidasa de rbano en tampn de bloqueo y aadir 50 l a cada
pocillo de la prueba. Tapar la placa y re-incubar en un agitador orbital durante 1 hora a 37C.
vi)
Lavar las placas como antes e inmediatamente despus aadir volmenes de 50 l de mezcla de
substrato/cromgeno (1 parte de H2O2 al 3% y 250 partes de OPD) e incubar a temperatura ambiente
durante 10 minutos sin agitacin. A continuacin, aadir 50 l de una solucin de parada, que consiste
en cido sulfrico 1 M.
vii)
El sistema de prueba debe incluir muestras de suero positivas y negativas para la peste bovina, un
control de MAb y un control de conjugado.
viii) Los valores de absorbancia se miden en un lector de ELISA con un filtro de interferencia a 492 nm y
los resultados de la prueba se expresan como valores de porcentaje de inhibicin respecto al valor
obtenido en el control de MAb. Valores de inhibicin de 50% o ms se consideran positivos, y valores
inferiores al 50% se consideran negativos.
ix)
Actualmente se est analizando el ELISA competitivo "H" a dos valores de corte (50% y 35%) para
intentar aumentar la sensibilidad.
Se ha desarrollado un mtodo ELISA indirecto que podra ser til para programas de vigilancia de peste
bovina, especialmente en reas en las que el virus del linaje II puede estar presente (20). Sin embargo, las
caractersticas de rendimiento de la prueba indican un problema de especificidad y por tanto su utilizacin
requerir pruebas confirmativas.
b)
Neutralizacin del virus

La "norma de oro" en la prueba de neutralizacin vrica (NV) se lleva a cabo en cultivos de tubos rodantes
con clulas primarias de rin de ternero siguiendo el mtodo de Plowright & Ferris (14), dado que los
resultados obtenidos con esta prueba se validaron con ganado bovino. En el procedimiento de los tubos
rodantes, se diluye un suero no inactivado a intervalos decimales y despus, comenzando con el suero sin
3,0
diluir, se mezcla con un volumen igual de virus que contenga aproximadamente 10 DICT50 (dosis infectiva
del 50% en cultivo de tejido) de la cepa vacunal atenuada Kabete "O" por ml. La mezcla se mantiene
durante toda la noche a 4C y despus se inoculan volmenes de 0,2 ml en cada uno de cinco tubos
rodantes, y a continuacin 1 ml de clulas indicadoras dispersadas y suspendidas en medio de crecimiento
5
a razn de 2 x 10 clulas por ml. Los tubos se incuban a 37C, se vierten a los 3 das, se rellenan con
medio de mantenimiento y se colocan en el aparato de rotacin; el examen final se hace a los 10 das.
1,8
Para calcular los puntos finales, la dosis vrica se considera satisfactoria si est entre los lmites de 10 a
2,8
10 DICT50/tubo; hay que considerar que las diluciones del suero se doblan despus de mezclarlas con la
dosis de virus. Esta prueba debe emplearse para examinar los sueros de animales que reaccionan con el
ELISA durante programas de vigilancia diseados para demostrar la ausencia de infeccin o para cualificar
el ganado susceptible para pruebas de vacunacin. En estas circunstancias, la presencia de cualquier
anticuerpo detectable en la dilucin srica final (1/2) se interpreta que indica una infeccin previa con peste
bovina. La prueba NV es la prueba de eleccin para examinar muestras de suero de animales salvajes.
Como prueba de anlisis se puede utilizar un mtodo en microplaca. En este procedimiento, se diluye una
dilucin inicial de 1/5 a intervalos dobles. Despus se incuban volmenes de 50 l de suero con volmenes
1,8
2,8
de 50 l de virus que contenga entre 10 y 10 DICT50 (17). Despus de una incubacin de 45 minutos o
5
de toda la noche, se aaden como indicadores 1-2 x 10 clulas de rin de ternero, de rin de cordero o
clulas Vero. Las pruebas terminan a los 6-7 das y pueden indicar neutralizacin inespecfica a elevadas
concentraciones de suero. En algunos sueros normales (respecto a una exposicin previa de peste bovina)
parece haber factores que impiden la penetracin y replicacin del virus en las clulas indicadoras. En la
prueba en tubo estos factores probablemente se eliminan durante los cambios del medio de mantenimiento,
mientras que en el mtodo de la microplaca permanecen presentes todo el tiempo. Si la dilucin final ms
concentrada de suero se limita a 1/10, este efecto desaparece.
162

Muchos pases han utilizado vacunas contra la peste bovina hasta reducir su incidencia a cero y luego han
seguido las recomendaciones de la OIE para que su estado de libres de peste bovina fuera reconocido
internacionalmente. Para obtener esta situacin, el proceso de la vacunacin anual contra la peste bovina ha
sido reemplazado en muchos casos por vigilancia activa y pasiva, clnica y serolgica. La vacunacin intensiva
en los focos de enfermedad (inmunoesterilizacin) se ha reservado para tratar de controlar campaas de
emergencia (18).
La vacuna viva atenuada en cultivo de tejidos contra la peste bovina (TCRV) descrita en ediciones previas de
este Manual fue desarrollada por Plowright mediante pases seriados de la cepa virulenta Kabete "O" (RBKO) en
clulas primarias de rin de ternero. En vista del xito del Programa de erradicacin global de la peste bovina,
parece que la mayora de los fabricantes de vacunas ya no elaboran este producto, aunque algunos conservan
considerables stocks. La vacuna con TRCV induce una inmunidad persistente que, desafortunadamente, no
puede distinguirse con facilidad de la respuesta de formacin de anticuerpos inducida por el virus natural,
igualmente duradera. Debido al conflicto entre mantener la vigilancia como el mejor instrumento para determinar
la distribucin natural del linaje 2 del virus y la posible necesidad de inmunizar simultneamente animales con
vistas a interrumpir la transmisin vrica, existe una necesidad urgente para reemplazar la TCRV con una vacuna
marcadora. Se han descrito vacunas candidatas (4, 19) pero an deben ser registradas por un fabricante con las
autoridades nacionales.
Las directrices para la produccin de vacunas veterinarias se exponen en el Captulo I.1.7. Principios de
produccin de vacunas veterinarias. Las normas dadas aqu y en el Captulo I.1.7 son de carcter general y
pueden suplementarse con requisitos nacionales y regionales.
Como se ha indicado antes, la produccin de TCRV se ha detenido virtualmente, y parece improbable su uso en
el futuro. Sin embargo, la descripcin publicada en la edicin previa de este Manual se repite aqu para que est
disponible si las condiciones cambian.
1.
Control del inculo
a)

Los lotes de inculo empleados en la fabricacin de TCRV deben producir una vacuna en cultivo celular
que sea segura, confiera una inmunidad en el ganado que dure al menos 5 aos, retenga sus
caractersticas atenuadas durante al menos cinco pases en el ganado y que carezca de capacidad para
extenderse por contacto. Las subcepas de RBOK que se empleen en la produccin de TCRV deben ser
identificables por registros histricos escritos que incluyan informacin sobre el origen de la cepa y sus
subsiguientes manipulaciones.
b)
Mtodo de cultivo
La siembra de la vacuna debe mantenerse por un sistema de lotes de inculo entre los pases 90 y 120. Los
lotes de virus de siembra deben conservarse en estado liofilizado a -20C o a temperatura inferior. El virus
debe cultivarse en clulas Vero o en clulas primarias o cultivadas serialmente de rin derivadas de un
feto bovino normal o de un ternero muy joven. Las clulas de cultivos seriados no pueden tener ms de diez
pases del cultivo primario.
c)

Los lotes de inculo deben ser:
2.
i)
Puros: Libres de contaminacin con virus, bacterias, hongos o micoplasmas.
ii)
Inocuos: Que no induzcan una reaccin clnica anormal inoculados en ganado susceptible a la peste
bovina.
iii)
Eficaces: Que induzcan inmunidad a la peste bovina en ganado susceptible.
Mtodo de produccin
Los lotes individuales de vacunas se preparan infectando cultivos celulares y, despus de un tiempo de
incubacin apropiado, se recoge el medio en el que se han liberado gran nmero de virus vivos. Para facilitar la
conservacin a largo plazo y la distribucin en la cadena de fro, este lquido se liofiliza en presencia de un
crioprotector que consiste en 5% de hidrolizado de lactalbmina y 10% de sacarosa. El virus puede obtenerse en
clulas primarias de rin de embriones bovinos o de terneros, o en clulas derivadas de estas fuentes hasta los
163
diez pases seriados. Adems, la vacuna se puede producir en lneas celulares continuas aprobadas, con tal de
que se sepa que no estn infectadas con el virus de la diarrea bovina vrica (BVDV) y que se mantengan por un
sistema de lotes de siembra; a este respecto se han utilizado clulas Vero. Para constituir un lote, los cultivos
infectados deben haber sido inoculados con el mismo virus de siembra e incubados y recogidos juntos. Se
permiten dos recogidas de la misma serie de cultivos, las cuales pueden juntarse para formar una suspensin
completa. Todas las fases de la produccin de vacunas deben ir acompaadas de registros escritos.
3.
Control del proceso
Clulas: Las clulas primarias, las clulas cultivadas en serie o las lneas celulares continuas deben proceder de
animales o embriones normales y mantener una morfologa normal durante el cultivo. Deben estar libres de
contaminacin por otros virus, particularmente del BVDV. Cualquiera que sea el tipo de clula empleada en la
produccin de vacunas, se deben mantener cultivos control no infectados utilizando los mismos medios y
condiciones de incubacin que con las clulas infectadas y deben someterse a frecuentes observaciones
microscpicas. Despus de recoger la vacuna, los cultivos control se lavan para eliminar el suero bovino y se reincuban durante 10 das en un medio que contenga sustitutos del suero bovino. Se vuelven a observar
microscpicamente para efectos citopticos. Simultneamente, se debe examinar una muestra de los cultivos
para la presencia del BVDV no citoptico mediante una prueba de inmunofluorescencia o de inmunoperoxidasa,
o por RT-PCR. El suero utilizado en los medios de cultivo debe proceder de animales susceptibles a la peste
bovina.
Virus: Se debe realizar una titulacin vrica del lote de siembra con diluciones del virus 1/20 en una microplaca o
en un sistema de tubos rodantes y utilizar diez rplicas por dilucin. Debe realizarse una titulacin similar en el
producto final. El virus debe proceder de cultivos mantenidos en botellas rodantes y no debe recogerse de
cultivos con ms de 10 das de incubacin desde la inoculacin. El material recogido se clarifica por
centrifugacin a baja velocidad antes de mezclarlo con un crioprotector. Se puede mantener sin liofilizar como
mucho durante 5 das a 4C, pero por mucho ms tiempo si se congela desde -20C a -60C. Como pueden
aparecer virus contaminantes durante las manipulaciones de fabricacin o como consecuencia del uso de
medios contaminados, se utiliza suero de conejo hiperinmune para neutralizar el contenido de peste bovina de la
suspensin completa, despus de lo cual la muestra debe utilizarse para infectar clulas Vero o de rin de
ternero como se ha descrito antes. El producto final debe probarse para verificar la ausencia de bacterias,
hongos y micoplasmas.
4.
Control de lotes
a)
Identidad
El contenido de un recipiente de cada lote de produccin debe exponerse a la neutralizacin con un
antisuero de conejo contra la peste bovina, utilizando un mtodo con virus variable/suero constante, e
inocularse en clulas de rin bovino. Se verifica la identidad del producto si no aparece ECP especfico de
la peste bovina.
b)
Esterilidad
Las pruebas para esterilidad y ausencia de contaminacin de materiales biolgicos pueden encontrarse en
el Captulo I.1.5.
c)
Inocuidad y eficacia
Disponiendo de ganado susceptible a la peste bovina, se junta el contenido de cinco viales seleccionados al
azar y se emplea para inocular un buey con un volumen equivalente a 100 veces la dosis de campo para
ganado y otro buey con un volumen equivalente a una dcima parte de una dosis de campo para ganado.
Estos animales se mantienen durante 3 semanas en estrecho contacto con un buey no inoculado. Durante
este perodo se controla diariamente la temperatura de los animales y se realizan frecuentes inspecciones
clnicas. Al final de las 3 semanas, el ganado se examina para anticuerpos neutralizantes contra la peste
bovina y se inocula en desafo con una cepa de peste bovina capaz de producir fiebre. La vacuna se
considera inocua y eficaz si no induce ninguna reaccin clnica anormal, si los dos animales que recibieron
la vacuna resultan protegidos y si no existe evidencia de transmisin del virus vacunal. Esta prueba no es
una prueba de potencia. Cada lote de vacuna debe probarse tambin para inocuidad en pequeos
animales.
d)
Potencia
La estrecha relacin entre la potencia inmunizante y la infectividad permite usar sta ltima como base para
estimaciones de potencia. Se realizan tres titulaciones de infectividad utilizando clulas de una lnea celular
aprobada o clulas de tres riones diferentes de ternero o embrin bovino. En la primera titulacin se puede
164
utilizar el conjunto de viales empleados en la prueba de inocuidad. La segunda y tercera determinacin se

hace con otros contenidos, en cada caso con el procedente de tres recipientes finales. La sensibilidad de
las clulas usadas en cada sesin de trabajo debe medirse utilizando una preparacin estndar de virus de
la peste bovina. El ttulo final es la media geomtrica de las tres determinaciones, realizando cada una con
diluciones decimales y diez observaciones por cada dilucin.
e)
Es necesario establecer rutinariamente la duracin de la inmunidad al TCRV. Los resultados descritos
indican que puede esperarse una inmunidad para toda la vida despus de la vacunacin satisfactoria del
ganado libre de todo vestigio de inmunidad maternal.
f)
Estabilidad
El TCRV es muy estable cuando se liofiliza correctamente, y se mantiene por mucho tiempo tanto a +4C
como a -20C con tal de que el producto se conserve al vaco. Una reciente evidencia seala que la
velocidad de degradacin del TCRV puede alterarse dependiendo del estabilizador y de variaciones del
ciclo de secado. Los resultados ms ventajosos se asociaron al empleo como estabilizador de hidrolizado
de lactalbmina al 5% y sacarosa al 10%, un ciclo de secado de 72-74 horas bajo un vaco reducido (100
miliTorr), un secado inicial de 16 horas a -30C, y una temperatura final de conservacin de 35C. Con
ttulos elevados, la vacuna se puede utilizar en el campo durante 30 das sin refrigeracin. Despus de la
reconstitucin en solucin salina normal o en sulfato magnsico 1 M, el virus es mucho ms termolbil. El
perodo para distribucin de la vacuna reconstituida en el campo no debera superar su vida media, pero
como este parmetro es dependiente de la temperatura y vara de 8 a 24 horas en un margen de 4C a
37C, se debe aplicar un lmite de acuerdo con el sentido comn; el lmite pueden determinarlo las
autoridades nacionales de control, pero puede recomendarse un perodo universal de 4 horas.
g)
Conservantes
El TCRV contiene hidrolizado de lactalbmina y sacarosa que se aaden como crioprotectores; por otra
parte, no contiene conservante qumico especfico.
h)
No se conocen riesgos asociados con la produccin o el uso del TCRV.
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18. TAYLOR W.P., ROEDER P.L., RWEYEMAMU M.M., MELEWAS J.N., MAJUVA P., KIMARO R.T., MOLLEL J.N., MTEI B.J.,
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19. YILMA T., AZIZ F., AHMAD S., JONES L., NGOTHO R., W AMWAYI H., BEYENE B., YESUS M., EGZIABHER B., DIOP M.,
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20. YILMA T., AZIZ F., AHMAD S., JONES L., NGOTHO R., W AMWAYI H., BEYENE B., YESUS M., EGZIABHER B., DIOP M.,
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eradication of rinderpest, and technology transfer to Africa and Asia. Dev. Biol. (Basel), 114, 99111.
*
* *
NB: Existen laboratorios de referencia de la OIE para la Peste Bovina (ver Cuadro en la parte 3 de este
166
CAPTULO 2.1.5.
PESTE DE LOS PEQUEOS RUMIANTES
RESUMEN
La peste de los pequeos rumiantes (PPR) es una enfermedad contagiosa aguda causada por un
morbilivirus de la familia Paramyxoviridae. Afecta a los pequeos rumiantes, especialmente, a las
cabras, que son muy susceptibles y, ocasionalmente, a los animales salvajes. La PPR existe en los
pases de frica situados entre el ecuador y el Sahara, en la pennsula arbiga, en la mayora de
los pases de Oriente Medio y en el sudoeste de Asia.
La enfermedad clnica es parecida a la peste bovina en el ganado vacuno. Normalmente es aguda
y se caracteriza por secreciones nasales y oculares serosas. La PPR se caracteriza por pirexia
extrema, que puede durar 35 das, lesiones erosivas en la boca, diarrea y neumona. En la
necropsia pueden aparecer las rayas de cebra caractersticas en el intestino grueso, pero stas
no constituyen un hallazgo significativo. Cuando se combina con una infeccin bacteriana, pueden
aparecer tambin lesiones en los pulmones, congestin o bronconeumona.
La enfermedad debe distinguirse de la peste bovina, lengua azul, fiebre aftosa y otras
enfermedades exantmicas.
Identificacin del agente: Para hacer el diagnstico mediante el aislamiento del virus es
importante tomar las muestras en el momento adecuado, y debern obtenerse en la fase aguda
de la enfermedad cuando an son evidentes los signos clnicos. Las muestras pueden proceder de
frotis de secreciones nasales, de las mucosas bucales y rectales y de sangre no coagulada.
El diagnstico rpido se realiza mediante el enzimoinmunoensayo de captura (ELISA), la
contrainmunoelectroforesis e inmunodifusin en gel de agar. Tambin puede emplearse la reaccin
en cadena de la polimerasa.
Pruebas serolgicas: En las pruebas serolgicas empleadas rutinariamente se incluyen la
neutralizacin vrica y la tcnica ELISA de competicin. Tambin pueden utilizarse otras como la
contrainmunoelectroforesis, la prueba de inmunofluorescencia indirecta para anticuerpos y una
prueba de inhibicin de precipitacin
Requisitos para las vacunas y los materiales de diagnstico: La vacunacin se ha llevado a
cabo utilizando la vacuna de histocultivos frente a la peste bovina, dado que existe una relacin
antignica entre la PPR y los virus de la peste bovina. Se ha elaborado una vacuna homloga,
probada en ensayos de campo, que se encuentra disponible comercialmente. El uso de esta
vacuna frente a la PPR est plenamente recomendada para evitar las confusiones con la peste
bovina cuando se realizan estudios serolgicos.
A. INTRODUCCIN
La peste de los pequeos rumiantes (PPR) es una enfermedad vrica aguda de los pequeos rumiantes
caracterizada por fiebre, secreciones oculonasales, estomatitis, diarrea y neumona. Los animales infectados
presentan sntomas clnicos similares a los de la peste bovina del ganado vacuno, de la que debe distinguirse. El
virus de la PPR (PPRV) causa enfermedad clnica en las ovejas y las cabras, pero no produce signos clnicos
cuando afecta al ganado vacuno. Se transmite mediante aerosoles entre los animales que viven en contacto
ntimo (17).
El virus de la PPR se ha clasificado dentro del gnero Morbillivirus de la familia Paramyxoviridae (14) en base a
su similitud con los virus de la peste bovina, el moquillo canino y el sarampin. Los virus de este grupo tienen
seis protenas estructurales: la protena de la nucleocpside (Np), que encapsula el RNA genmico viral, la
167
Captulo 2.1.5. Peste de los pequeos rumiantes
fosfoprotena (P), que se asocia con la polimerasa (L) de protena de gran tamao), la protena de la matriz (M),
la protena de fusin (F) y la de hemaglutinacin (H). La protena de la matriz, ntimamente asociada con la cara
interna de la envoltura viral, hace de enlace entre la nucleocpside y las glucoprotenas externas H y F, que son
responsables de la unin y de la penetracin del virus en el interior de la clula a la que infecta. La PPR fue
descrita por primera vez en Costa de Marfil (13), pero existe en la mayora de los pases de frica, al sur del
Sahara y al norte del ecuador (17) y en casi todos los pases de Oriente Medio hasta Turqua (12, 18, 23, 31). La
PPR est tambin muy extendida en India y en el sudoeste de Asia (27).
La enfermedad natural afecta principalmente a las cabras y a las ovejas, pero, normalmente, es ms grave en las
cabras, donde causa enormes prdidas, y slo es grave en las ovejas de forma ocasional. Por lo general, se
admite que el ganado vacuno slo puede ser infectado subclnicamente. Sin embargo, en condiciones de
pobreza puede ocurrir que el ganado vacuno desarrolle lesiones despus de la infeccin por el virus de la PPR,
cuyos signos clnicos se adscribiran a la peste bovina. De hecho, en los aos 50 se describi la enfermedad y la
muerte de terneras infectadas experimentalmente con tejido infectado por PPRV (27). Adems, el PPRV se aisl
en India (1995) de un brote de la enfermedad similar a la peste bovina en los bfalos (15). Se sospecha que el
PPRV estuvo tambin implicado en la enfermedad epizotica que afect a los camellos de una joroba en Etiopa
en 19951996 (24, 25). En algunas muestras patolgicas tomadas durante dicho brote se detectaron el antgeno
del virus de la PPR y el cido nucleico del virus, pero no se aisl el virus vivo. Se ha descrito un caso de la
enfermedad clnica en la fauna salvaje con resultado de muerte de gacelas (Gazella dorcas), cabra monts
(Capra ibex nubiana), rices (Oryx gazella) y ovejas de Laristn (Ovis orientalis laristanica) (12). El venado de
cola blanca americano puede ser infectado experimentalmente (16).
El perodo de incubacin es de 46 das, pero puede variar entre 3 y 10 das. La enfermedad clnica es aguda,
con fiebre alta (hasta 41C) que puede durar de 35 das; los animales muestran decaimiento, anorexia y se les
seca el hocico. Las secreciones oculonasales serosas se vuelven progresivamente mucopurulentas y, si no se
produce la muerte, persisten durante 14 das. En los cuatro das siguientes despus de la aparicin de la fiebre,
las encas se vuelven hipermicas y se desarrollan lesiones erosivas en la cavidad oral, producindose
abundante salivacin. Estas lesiones pueden volverse necrticas. En la ltima etapa es frecuente una diarrea
sanguinolenta acuosa. Tambin se produce neumona, tos, crepitaciones pleurales y respiracin abdominal. La
tasa de morbilidad puede ser hasta del 100% y, en brotes graves, la mortalidad puede alcanzar el 100%. La tasa
de mortalidad no sobrepasa el 50% en brotes ms benignos. El diagnstico presuntivo de la PPR se hace
basndose en estos datos clnicos, pero se requiere la confirmacin del laboratorio donde existe la peste bovina
en el ganado vacuno.
En la necropsia, las lesiones son similares a las observadas en el ganado vacuno afectado por la peste bovina.
Las lesiones erosivas pueden extenderse desde la boca hasta la unin del rumen con el retculo. En el intestino
grueso, en la unin cecoclica, normalmente, aparecen hemorragias lineales o rayas de cebra caractersticas,
pero estas no constituyen un hallazgo significativo o comn; habitualmente se presenta enteritis necrtica o
hemorrgica. Los ndulos linfticos se agrandan, el bazo puede mostrar lesiones necrticas y se produce una
neumona apical.
No se conocen los riesgos para la salud de los trabajadores que estn en contacto con el virus de la PPR, ya que
no se tiene constancia de la infeccin por el virus en humanos.
1.
a)
Toma de muestras
En los animales vivos, se toman frotis de las secreciones de la conjuntiva y de las mucosas nasal y bucal.
Para el aislamiento del virus, la reaccin en cadena de la polimerasa (PCR) y para las pruebas
hematolgicas se toma tambin sangre entera en anticoagulante, durante la fase temprana de la
enfermedad. En el examen post-mortem tambin deben tomarse aspticamente muestras (de dos o tres
animales) de los ganglios linfticos, en particular de los ganglios mesentricos y bronquiales, de los
pulmones, del bazo y de la mucosa intestinal; deben enfriarse en hielo y transportarse refrigeradas. Los
fragmentos de rganos obtenidos para el estudio histopatolgico se colocan en formalina al 10%. Se puede
recoger sangre para realizar el diagnstico serolgico al final del brote.
b)
Inmuodifusin en gel de agar

La inmunodifusin en gel de agar (IGDA) es una prueba sencilla y barata que puede realizarse en cualquier
laboratorio e incluso sobre el terreno. El antgeno viral estndar de la PPR se prepara a partir de ganglios
linfticos mesentricos o bronquiales, de material del bazo o de los pulmones que se tritura y se hace una
168
suspensin al 1/3 en solucin salina tamponada. Se centrifugan a 500 g durante 1020 minutos y los
sobrenadantes se guardan en alcuotas a 20C. El algodn del bastoncillo empleado para tomar los frotis
nasales u oculares, se quita utilizando un escalpelo y se introduce en una jeringa de 1 ml. La muestra se
extrae con 0,2 ml de solucin salina tamponada con fosfato (PBS) expulsando y llenando repetidamente los
0,2 ml de PBS en un tubo Eppendorf, utilizando el mbolo de la jeringa. La muestra resultante extrada del
hisopo ocular/nasal, as como el material de tejido triturado preparado con anterioridad pueden guardarse a
20C hasta su utilizacin. Pueden conservarse 13 aos. El antgeno de control negativo se prepara de
forma similar a partir de tejidos normales. El antisuero estndar se obtiene hiperinmunizando ovejas con 1
ml de PPRV con un ttulo de 104 DICC50 (dosis infectiva 50% en cultivo celular) por mililitro suministrado a
intervalos semanales durante 4 semanas. Se sangra a los animales entre 5 y 7 das despus de la ltima
inyeccin (7). El antisuero hiperinmune estndar frente a la peste bovina tambin es eficaz para la
deteccin del antgeno de la PPR.
i)
Se dispensa agar al 1% en solucin salina normal, conteniendo tiomersal (0,4 g/litro) o azida sdica
(1,25 g/litro) como agente bacteriosttico, en placas de Petri (6 ml/placa de 5 cm).
ii)
Se excavan pocillos en el agar siguiendo un patrn hexagonal, con un pocillo central. Los pocillos
miden 5 mm de dimetro y estn separados 5 mm.
iii)
El pocillo central se llena con el antisuero positivo; tres de los pocillos perifricos se llenan con el
antgeno positivo y uno con el antgeno negativo. Los dos pocillos perifricos restantes se llenan con el
antgeno problema, de forma que los antgenos problema y control negativo se alternen con los
antgenos de control positivo.
iv)
Normalmente, a las 1824 horas aparecern de 1 a 3 lneas de precipitado entre el suero y los
antgenos (9, 29). Estas lneas se intensifican lavando el agar con cido actico glacial al 5% durante
5 minutos (este procedimiento se llevar a cabo con todas las pruebas aparentemente negativas antes
de registrar el resultado como negativo). Las reacciones positivas mostrarn lneas de identidad con el
antgeno control positivo.
Los resultados se obtienen en 1 da, pero la prueba no es suficientemente sensible para detectar formas
leves de la PPR, debido a la baja cantidad de antgeno viral que se excreta.
c)
Enzimoinmunoensayo de captura
El enzimoinmunoensayo (ELISA) de captura (19) en el que se utilizan diferentes anticuerpos monoclonales
(MAb) anti-protena N permite una rpida identificacin diferencial de los virus de la PPR o de la peste
bovina, y esto es de gran importancia, ya que las dos enfermedades tenan hasta hace poco una
distribucin geogrfica similar y pueden afectar a las mismas especies animales.
i)
Las placas de microtitulacin ELISA (por ejemplo, placas Nunc Maxisorb de capacidad de adsorcin
alta) se recubren con 100 l de una solucin de MAb de captura (diluido segn las indicaciones del
Laboratorio de Referencia que proporciona el kit). Este MAb reacciona con el virus de la peste bovina
y con el PPRV.
ii)
Despus del lavado, se aaden 50 l de la suspensin de la muestra a cuatro pocillos, y los pocillos
de control se llenan con tampn.
iii)
Inmediatamente, se aaden a dos pocillos 25 l de un MAb de deteccin biotinilado en el caso de la

PPR y 25 l de estreptavidina/peroxidasa, y a los otros dos pocillos 25 l de un MAb para la deteccin
de la peste bovina y 25 l de estreptavidina/peroxidasa.
iv)
Las placas se incuban a 37C durante 1 hora con agitacin constante.
v)
Despus de tres lavados enrgicos, se aaden 100 l de ortofenilendiamina (OPD) en perxido de

hidrgeno y se incuban las placas durante 10 minutos ms a temperatura ambiente.
vi)
La reaccin se detiene aadiendo 100 l de cido sulfrico 1 N, y se mide la absorbancia a 492 nm en

un espectrofotmetro/lector de placas ELISA.
El valor de corte por encima del cual las muestras se consideran positivas se calcula a partir de cada blanco
(el blanco de la PPR y el blanco de la peste porcina) como el triple de los valores medios de absorbancia.
Tambin puede realizarse un ELISA indirecto tipo sandwich permitiendo primero que la muestra reaccione
con el MAb de deteccin, y el inmunocomplejo formado es capturado despus por el segundo MAb,
adsorbido a la placa ELISA.
La prueba es muy especfica y sensible (puede detectar 100,6 DICC50/pocillo en el caso de la PPRV y
102,2 DICC50 en el del virus de la peste bovina). Los resultados se obtienen en 2 horas.
169
d)

Para distinguir la PPR de la peste bovina (5), se han empleado clones de cADN marcados con 32P, pero no
se recomienda su uso en diagnsticos rutinarios debido a la corta vida media del 32P y al requerimiento de
un equipo especial para la proteccin de los usuarios.
Se ha desarrollado una tcnica de PCR basada en la amplificacin de los genes de las protenas Np y F
para el diagnstico especfico de la PPR (4, 11). Esta tcnica es muy sensible comparada con otras
pruebas y los resultados se obtienen en 5 horas, incluyendo la extraccin de RNA. El Laboratorio de
Referencia para la PPR de la OIE y de la FAO1 en Francia (vase el cuadro mostrado en la Parte 3 de este
Manual sobre animales terrestres) puede aconsejar sobre la utilizacin de esta tcnica.
e)
Contrainmunoelectroforesis
La contrainmunoelectroforesis (CIE) es la prueba ms rpida para la deteccin de antgeno viral (9, 21). Se
lleva a cabo sobre una superficie horizontal empleando una cubeta de electroforesis apropiada que consta
de dos compartimientos conectados a travs de un puente. El aparato se conecta a una fuente de alto
voltaje. Sobre portaobjetos se dispensan volmenes de 3 ml de agarosa o de agar (12%, [p/v]) disuelto en
tampn barbital acetato 0,025 M. Se excavan de seis a nueve pares de pocillos en el agar solidificado. Los
reactivos utilizados son los mismos que se emplean para la prueba IGDA. El bao de electroforesis se llena
con tampn barbital acetato 0,1 M. Los pares de pocillos del agar se llenan con los reactivos, disponiendo
los sueros en los pocillos del nodo y el antgeno en los pocillos del ctodo. Se coloca el portaobjetos en el
puente de conexin y los extremos se conectan al tampn de las cubetas mediante papel poroso hmedo.
Se cubre el aparato y se aplica una corriente de 1012 miliamperios por portaobjeto durante 3060 minutos.
Se desconecta la corriente y se observan los portaobjetos con luz intensa. La presencia de 13 lneas de
precipitacin entre pares de pocillos se considera una reaccin positiva. No deber haber reacciones entre
los pocillos que contengan los controles negativos.
f)
Mtodos de cultivo y aislamiento

Incluso cuando el diagnstico se haya realizado empleando tcnicas rpidas, el virus deber siempre
aislarse en cultivos tisulares a partir de muestras de campo para estudios posteriores (9, 17).
El PPRV puede aislarse en cultivos tisulares de clulas primarias renales de cordero o de clulas de rin
de mono verde africano (clulas Vero). Los cultivos en monocapa se inoculan con el material del que se
sospecha (material de frotis, de la capa leucocitaria o de suspensiones de tejido al 10%) y se examinan
diariamente para detectar la aparicin de efecto citoptico (ECP). El ECP producido por el PPRV puede
producirse en 5 das y consiste en el redondeamiento celular y agregacin que culmina en la formacin de
sincitios en las clulas de rin de cordero. En las clulas Vero a veces resulta difcil ver los sincitios. En el
caso de que existan, son muy pequeos. Sin embargo, en clulas Vero infectadas y teidas siempre se
observan pequeos sincitios. Los sincitios se reconocen por una disposicin circular de los ncleos dando
la impresin de una esfera de reloj. Los cultivos en cubreobjetos pueden producir un ECP antes de 5 das.
Tambin hay inclusiones intracitoplasmticas e intranucleares. Algunas clulas estn vacuolizadas. En
secciones histopatolgicas de tejidos infectados teidas pueden verse cambios celulares similares.
Despus de 56 das, se realizarn siempre pases ciegos ya que el ECP puede tardar tiempo en aparecer.
g)
Otras tcnicas de deteccin viral

Otras tcnicas de deteccin de virus tienen ventajas potenciales, pero an no se utilizan ampliamente.
Mientras que para el aislamiento de virus se requiere que las muestras patolgicas se conserven en
condiciones de fro hasta el comienzo de su procesamiento, stas se pueden mantener a temperatura
ambiente fijadas en una solucin de formalina, y despus analizarlas directamente por inmunofluorescencia
(IF) o mediante una prueba inmunoqumica (2, 3, 28). Esto se ha empleado con xito en extensiones
conjuntivales y en tejidos recogidos en la necropsia; las extensiones se fijan en acetona fra. Ahora se ha
demostrado que el PPRV al igual que el virus del sarampin tienen capacidad de hemaglutinacin, a
diferencia de lo que ocurre con el virus de la peste bovina. Esta caracterstica se ha aprovechado para el
diagnstico especfico, rpido y barato de la infeccin de la PPR (15, 33).
2.
Pruebas serolgicas
Las cabras y las ovejas infectadas por el PPRV desarrollan anticuerpos que pueden ponerse de manifiesto para
confirmar un diagnstico mediante las pruebas de deteccin de antgeno. Las pruebas que se utilizan
rutinariamente son la neutralizacin viral (NV) y la tcnica ELISA de competicin. Se han descrito otras pruebas
170
Organizacin de las Naciones Unidas para la Alimentacin y la Agricultura.
como la CIE (10), la IGDA (31), la prueba de inhibicin de la precipitacin y la de inmunofluorescencia indirecta
para anticuerpos (8), pero tienen escaso inters comparadas con la NV y la tcnica ELISA.
a)
Neutralizacin viral (prueba prescrita para el comercio internacional)

Aunque esta prueba es sensible y especfica, su ejecucin lleva mucho tiempo. La prueba estndar de
neutralizacin se lleva a cabo en cultivos de clulas primarias renales de cordero en tubos rotatorios.
Cuando no se disponga de clulas primarias, pueden utilizarse clulas Vero.
i)
Comenzando con 1 ml de suero inactivado, se hacen diluciones seriadas de razn dos. Las diluciones
se mezclan con una suspensin stock de virus que contenga aproximadamente 103 DICC50/ml.
ii)
Se incuban las mezclas virus/suero a 37C durante 1 hora o a 4C durante toda la noche.
iii)
Se inoculan 0,2 ml de la mezcla en cinco tubos rotatorios e inmediatamente despus se aade 1 ml

de la suspensin de clulas Vero en medio de crecimiento, a una concentracin de 2 105 clulas/ml.
iv)
Se incuban los tubos en posicin inclinada a 37C durante 3 das.
v)
Se desechan los tubos que presenten ECP especfico del virus. En los tubos restantes se substituye el
medio de crecimiento por medio de mantenimiento y se dejan en rotacin durante 7 das ms. La dosis
de virus de desafo es aceptable si desciende entre 101,8 y 102,8 DICC50/tubo. Se consideran positivos
los anticuerpos que sean detectables a una dilucin de 1/8.
Normalmente, se lleva a cabo una prueba de neutralizacin cruzada con el virus de la peste bovina. Un
suero se considera positivo para la PPR cuando su ttulo de neutralizacin es por lo menos el doble que
para la peste bovina.
b)
Enzimoinmunoensayo competitivo
Se ha descrito un ELISA de competicin basado en el uso de una antinucleoprotena monoclonal y de una
nucleoprotena recombinante obtenida en baculovirus (20).
i)
Las placas de microtitulacin (por ejemplo, placas Nunc Maxisorb de alta capacidad de adsorcin) se
recubren con 50 l de una dilucin predeterminada de protena N-PPR (producida por un baculovirus
recombinante) a 37C durante 1 hora con agitacin constante.
ii)
Se lavan las placas tres veces y se secan con papel absorbente.
iii)
Se distribuyen 45 l de tampn de bloqueo (PBS Tween 20 al 0,5% 0,5 suero fetal bovino) a todos
los pocillos. Despus se aaden 5 l de los sueros problema a los pocillos de prueba (a una dilucin
final 1/20) y 5 l de diferentes sueros control (suero fuertemente positivo, positivo dbil y negativo) a
los pocillos control.
iv)
Se aaden 50 l de MAb diluido 1/100 en tampn de bloqueo, y se incuban a 37C durante 1 hora.
v)
Se lavan las placas tres veces, y se secan con papel absorbente.
vi)
Se aaden 50 l del conjugado anti-ratn diluido 1/1.000, y se incuban a 37C durante 1 hora.
vii)
Se lavan las placas tres veces.
viii) Se prepara OPD en solucin de perxido de hidrgeno. Se aaden 50 l de mezcla de

substrato/conjugado a cada pocillo. Se detiene la reaccin despus de 10 minutos con 50 l de cido
sulfrico 1 M.
ix)
Se leen las placas en un lector ELISA a 492 nm.

La absorbancia se convierte a porcentaje de inhibicin (PI) mediante la frmula:
PI = 100 (absorbancia de los pocillos problema/absorbancia de los pocillos de control del MAb)
100
Se consideran positivos los sueros que muestren un PI superior a 50%.
Tambin se han descrito otras dos tcnicas de ELISA de competicin basadas en el uso de la antihemaglutinina monoclonal (H) (1, 26).
171

Las ovejas y las cabras que se recuperan de la PPR desarrollan una inmunidad activa contra la enfermedad. Se
ha demostrado la presencia de anticuerpos 4 aos despus de la infeccin (8), pero probablemente la inmunidad
es para toda la vida. Se dispone de una vacuna homloga contra la PPR. En 1998, el Comit Internacional de la
OIE aprob el uso de esta vacuna en los pases que han decidido seguir las directrices de la OIE para la
vigilancia epidemiolgica en relacin con la peste bovina, con el fin de evitar la confusin cuando se realicen los
estudios serolgicos.
1.
Control del inculo
a)

La vacuna homloga contra la PPR es una vacuna viva obtenida en clulas Vero. La cepa original de virus
para la vacuna homloga contra la PPR es la cepa PPR 75/1, aislada en Nigeria en 1975 (30). La cepa est
atenuada mediante pases en cultivos de clulas Vero (6). La cepa proporcionada para la produccin de
vacuna corresponde al pase 70 en clulas Vero (PPRV 75/1 I.K6 BK2 Vero 70). Esta se conserva en forma
liofilizada a 20C y puede obtenerse de los Laboratorios de Referencia (vase el Cuadro mostrado en la
Parte 3 de este Manual sobre animales terrestres). Los ensayos de actividad de la vacuna demuestran que
retena la capacidad protectora (a una dosis de 103 DICC50) hasta el pase 120 en clulas Vero, que es el
nmero de pase ms elevado hasta ahora probado.
b)
Mtodo de cultivo
Clulas
La vacuna contra la PPR se produce en clulas Vero, que deben estar libres de contaminacin por
bacterias, hongos y virus.
Medio de cultivo
El medio de cultivo se compone de un medio mnimo esencial (MEM) suplementado con antibiticos (por
ejemplo, penicilina estreptomicina a concentraciones finales de 100 UI [Unidades Internacionales]/ml y
100 g/ml, respectivamente) y un agente antifngico (nistatina [Mycostatin] a una concentracin final de
50 g/ml). El medio se enriquece con suero fetal bovino (medio completo) para el crecimiento celular. Esta
proporcin de suero se reduce al 2% para el medio de mantenimiento cuando la monocapa celular est
completa.
Lote de inculo primario del virus vacunal
Este lote est formado por el pase nmero 70 del virus en clulas Vero (PPRV 75/1 LK6 BK2 Vero 70). El
contenido liofilizado de un frasco de un banco de inculo se reconstituye en 2 ml de agua estril (o en
medio de cultivo celular sin suero). Este lquido se mezcla con clulas Vero resuspendidas en medio de
cultivo completo para proporcionar como mnimo 0,001 DICC50 por clula. Las placas de cultivo celular se
llenan con esta mezcla de virus/clula (alrededor de 2 107 clulas Vero en una placa de 175 cm2), y se
incuban a 37C. Las clulas cultivadas se observan regularmente para detectar el ECP. El medio se
renueva cada dos das, reduciendo la proporcin de suero al 2% una vez que la monocapa de clulas est
completa. El virus se recoge por primera vez cuando el ECP es del 4050%. Esta suspensin viral se
guarda a 70C. Se realizan recogidas sucesivas cada dos das hasta que el ECP alcanza el 7080%,
momento en el que se procede a la congelacin de las placas de cultivo (por lo general, pueden hacerse al
menos dos recogidas ms antes de la congelacin final de las placas de cultivo). Todas las suspensiones
de virus recogidas se someten a dos ciclos de congelacin-descongelacin. A continuacin se unen para
formar un solo lote, que sirve de lote de inculo primario. A su vez, este se divide en pequeos volmenes
en botellas y se guardan a 70C. El contenido de cinco frascos se descongela y se titula (el ttulo mnimo
que se requiere es 105 DICC50/ml). Es mejor liofilizar este inculo con el fin de guardarlo a 20C. En este
caso ser necesario titular el virus liofilizado (cinco botellas). Un lote preparado de esta forma debe pasar
todos las pruebas con relacin a la esterilidad.
Cuando se preparan lotes de inculo, es importante no emplear dosis demasiado elevadas de virus para
infectar las clulas (alta multiplicidad de infeccin), ya que esto llevar a la acumulacin de partculas
defectuosas en la suspensin viral producida, lo que disminuir el ttulo de los productos posteriores. Por
otra parte, una multiplicidad de infeccin baja (por ejemplo, 0,0001) prolongar el tiempo de cultivo.
172
Preparacin del lote de inculo de trabajo
Este lote se prepara en las mismas condiciones que el lote de inculo primario. Se obtiene as un gran stock
de virus, a partir del que se preparar la vacuna final. Este lote se distribuye en recipientes que se guardan
a 70C. Adems, debe satisfacer las pruebas de esterilidad. Se titulan cinco muestras (el ttulo mnimo
requerido es 106 DICC50/ml).
c)
Validacin como vacuna

Es necesario confirmar o descartar la presencia del PPRV en el producto que se ensaya. Con este fin, se
utiliza un suero anti-PPR para neutralizar el virus en cultivo celular.
Procedimiento del ensayo
i)
Se mezcla el contenido de dos botellas de la vacuna con agua bidestilada estril para obtener un
volumen igual al volumen que tenan antes de la liofilizacin.
ii)
Se hacen diluciones seriadas de la vacuna de razn diez, reconstituida en medio de cultivo libre de
suero (0,5 ml de suspensin viral 4,5 ml de medio).
iii)
A partir de cada botella, se realizan dos series de mezclas para las diluciones de virus, en placas de
96 pocillos, de la siguiente forma:
Serie 1:
Diluciones de la suspensin viral: 1

Suspensin viral (en l)
50
Medio de cultivo (en l)
50
2
50
50
3
50
50
4
50
50
Serie 2:
Diluciones de la suspensin viral: 1

Suspensin viral (en l)
50
antisuero PPR (en l)
50
2
50
50
3
50
50
4
50
50
(Nota: El antisuero PPR utilizado para este fin se prepara en cabras y se liofiliza. Se reconstituye con 1
ml de agua bidestilada estril a una dilucin 1/10.)
iv)
Se incuban las mezclas a 37C durante 1 hora.
v)
A cada pocillo se aaden 100 l de clulas resuspendidas en medio de cultivo completo (30.000
clulas/pocillo).
vi)
La microplaca se incuba a 37C en presencia de CO2.
vii)
La placa se lee despus de 1015 horas de incubacin.
Por lo general, el ECP se presenta slo en los pocillos que contienen clulas infectadas con la mezcla de
virus y medio de cultivo. Si ste se detecta en los pocillos de la Serie 2, ser necesario identificar el PPRV
mediante inmunofluorescencia, empleando un MAb frente a la PPR o mediante inmunocaptura (el MAb
frente a la PPR y el kit para la prueba de inmunocaptura pueden conseguirse en el Laboratorio de
Referencia para la PPR de la OIE en Francia (vase el Cuadro mostrado en la Parte 3 de este Manual
sobre animales terrestres). Si esta identificacin confirma la presencia del PPRV, el antisuero frente a la
PPR empleado debe de haber sido demasiado dbil o debe cambiarse el lote. Si la inmunofluorescencia o
la inmunocaptura es negativa, debe haber un contaminante viral, y el material en estudio debe destruirse.
2.
Mtodo de elaboracin
a)
Produccin de la vacuna
Esta operacin se realiza a mayor escala. Las clulas pueden infectarse con virus a una multiplicidad de
infeccin como antes o con dosis ms elevadas, por ejemplo, hasta 0,01. Los productos recogidos en
diferentes veces se juntan (para formar el producto final) tras dos ciclos de congelacin-descongelacin, y
se guardan a 70C, pendientes de los resultados de titulacin y de las pruebas de esterilidad. Si estos
resultados son satisfactorios, la vacuna se congela.
b)
Liofilizacin
El medio de liofilizacin (medio Weybridge) se compone de lactalbmina al 2,5% (p/v), sacarosa al 5% (p/v)
y glutamato de sodio al 1% (p/v), pH 7,2.
Para proceder a la liofilizacin, se aade este medio a un volumen igual de la suspensin viral (que puede
haberse diluido de antemano para obtener el nmero deseado de dosis de vacuna por botella). La mezcla
resultante se conserva en fro, homogeneizada; a continuacin se distribuye en botellas y se liofiliza. Al final
173
de un ciclo de liofilizacin, se regula la sonda y se conserva a 35C durante 4 horas. Una vez completada la
operacin, las botellas se tapan al vaco. Se seleccionan muestras al azar (por ejemplo, 5%) de este lote
final y se someten a pruebas en relacin a su inocuidad, eficacia y esterilidad, y la humedad residual se
estima segn el mtodo de Karl Fisher (ptimo 3,5%). Si estas pruebas dan resultados no satisfactorios,
se destruye el lote completo.
3.
Control durante el proceso
Debe comprobarse que las clulas utilizadas en los cultivos celulares tengan aspecto normal y estn libres de
virus contaminantes, especialmente del virus de la diarrea vrica bovina. Debe llevarse a cabo una titulacin del
virus del lote de inculo empleando para ello medio MEM (sin suero) y realizando una serie de diluciones
decimales (0,5 ml virus 4,5 ml diluyente) hasta 106. Las clulas Vero de un frasco se tripsinizan y se
resuspenden en un medio de cultivo completo a una concentracin de 300.000/ml. Se distribuyen en una placa
de 96 pocillos (a razn de 30.000 clulas por pocillo, equivalente a 100 l de suspensin celular). A continuacin,
se aaden 100 l de dilucin decimal del virus (diluciones que varan desde 102 hasta 106) a las clulas. Para
las clulas no infectadas se emplea como control una hilera de pocillos, a la que se aade medio de cultivo sin
virus (100 l). La placa se incuba a 37C en presencia de CO2. La lectura de las placas se realiza 1015 das
despus de la infeccin (examinando la aparicin de ECP).
El ttulo del virus se determina mediante el mtodo de SpearmanKrber. El ttulo mnimo por dosis es de 102,5.
4.
Control de lotes
a)
Identidad
El contenido de cada recipiente procedente de cada lote envasado debe comprobarse en relacin a su
identidad mediante cultivo, despus de la neutralizacin con un antisuero especfico.
b)
Esterilidad
Consiste en comprobar de la existencia de contaminantes vricos, bacterianos o fngicos. Se lleva a cabo
sobre clulas y sueros antes de su utilizacin en la produccin de vacuna, en el stock de inculo y en la
vacuna antes y despus de la liofilizacin. Cualquier producto que no pase esta prueba se destruye.
Las pruebas relacionadas con la esterilidad y la ausencia de contaminacin de los materiales biolgicos se
pueden encontrar en el Captulo I.1.5.
c)
Inocuidad
Esta prueba se lleva a cabo en roedores con el fin de detectar la toxicidad no especfica asociada al
producto. Para la realizacin de la prueba se necesita la vacuna reconstituida en disolvente (el contenido de
cinco botellas mezclados), seis cobayas que pesen cada uno 200250 g; diez ratones no destetados (17
22 g, lnea Swiss o similar).
Se inyectan 0,5 ml de la vacuna intramuscularmente en una de las extremidades traseras de dos cobayas,
0,5 ml en la cavidad intraperitoneal de dos cobayas y 0,1 ml en la cavidad peritoneal de seis ratones. Dos
cobayas y cuatro ratones se conservan como controles sin inocular. Los animales se observan durante 3
semanas. La prueba debe repetirse si muere un cobaya o dos ratones. Los animales muertos se someten a
examen post-mortem con el fin de determinar la causa de la muerte. Al final de la tercera semana de
observacin, se sacrifican todos los animales para la realizacin de un examen post-mortem. Se registran
todos los resultados. Se considera que la vacuna es satisfactoria, si durante la primera o segunda prueba,
al menos el 80% de los animales continan con buen estado de salud durante el perodo de observacin y
no se encuentran lesiones post-mortem significativas.
d)
Potencia y eficacia en los pequeos rumiantes

Para la realizacin de esta prueba se requiere el siguiente material: la vacuna reconstituida con solucin
salina normal (los contenidos de cinco botellas mezclados) para producir 100 dosis y 0,1 dosis/ml; seis
cabras y seis ovejas, que tengan todas 1 ao de edad aproximadamente y estn libres de anticuerpos
frente a la peste bovina o la PPR; jeringas estriles y agujas y el PPRV patgeno, previamente titulado en
cabras, diluido con solucin salina normal estril para obtener 103 de la dosis letal 50% para las cabras
(LD50).
Se vacunan dos cabras y dos ovejas subcutneamente con 100 dosis por animal; se vacunan dos cabras y
dos ovejas subcutneamente con 0,1 dosis por animal; los restantes animales se mantienen como controles
174
de animales que estn en contacto. Durante tres semanas se observan los animales y diariamente se
registran sus temperaturas corporales. Al final de este perodo, se toma sangre de todos los animales para
la obtencin de sueros. Todos los animales se desafan mediante una inyeccin subcutnea de 1 ml de la
suspensin del PPRV patgeno (103 DL50 por animal). Durante dos semanas se observan los animales y
diariamente se registran sus temperaturas corporales
Se considera que la vacuna es satisfactoria si todos los animales vacunados resisten la infeccin de
desafo, mientras que por lo menos la mitad de los animales control que han estado en contacto desarrollan
signos de la PPR. La prueba de neutralizacin srica debe ser positiva para el anticuerpo de la PPR (en
suero diluido al menos 1/10) en los animales vacunados, nicamente en las muestras tomadas tres
semanas despus de la vacunacin. Si alguno de los controles tambin es positivo, el experimento debe
repetirse empleando otro lote de PPRV patgeno. Si los animales vacunados reaccionan al desafo
virulento, el lote de vacuna se destruye.
Titulacin del anticuerpo neutralizante de la PPR
Para la realizacin de esta prueba, se requiere los siguiente: suspensiones celulares a una concentracin
de 600.000 clulas/ml; placas de cultivo de clulas de 96 pocillos; los sueros a titular (inactivados por calor
a 56C durante 30 minutos); medio completo de cultivo celular; diluciones del PPRV que den 1.000, 100, 10
y 1 DICC50/ml.
Se diluyen los sueros a 1/5, y despus se hace una dilucin doble en medio de cultivo celular. Se mezclan
100 l de virus a 1.000 DICC50/ml (para dar 100 DICC50 en cada pocillo) y 100 l de una dilucin dada de
suero (empleando seis pocillos por dilucin) en los pocillos de las placas de cultivo celular. Para el virus y
para las clulas no infectadas se dispone una serie de pocillos de control de la siguiente forma: seis pocillos
con 100 DICC50 (100 l) por pocillo; seis pocillos con 10 DICC50 (100 l) por pocillo; seis pocillos con 1
DICC50 (100 l) por pocillo; seis pocillos con 0,1 DICC50 (100 l) por pocillo y seis pocillos con 200 l de
cultivo sin virus (control de clulas) por pocillo.
Los pocillos que contienen los controles de virus se completan hasta 100 l con medio de cultivo completo,
y se incuban las placas a 37C durante 1 hora, en presencia de CO2. Las placas se leen a la semana y a
las dos semanas de incubacin. Los resultados deberan ser los siguientes: Aparicin de efecto citoptico
del 100% en los pocillos de control de virus de 100 y 10 DICC50, efecto citoptico del 50% para la dilucin
1 DICC50, no debe aparecer efecto citoptico en la dilucin 0,1 DICC50 ni en los pocillos donde el virus haya
sido neutralizado con suero durante la prueba y habr efecto citoptico en los pocillos donde el virus no
haya sido neutralizado con suero durante la prueba.
e)
La duracin de la inmunidad es de 3 aos, como mnimo.
f)
Estabilidad
La vacuna liofilizada puede conservarse a 28C durante al menos dos aos (aunque es mejor a 20C),
siempre y cuando se guarde al vaco y protegida de la luz. Recientemente se ha demostrado que esta
vacuna, resuspendida en un medio con trehalosa y sometida al mtodo ultrarrpido de hidratacin, puede
resistir a 45C por un perodo de 14 das con una prdida mnima de potencia (32).
5.
a)
Inocuidad
Vase Seccin C.4.c.
c)
Potencia
Vase Seccin C.4.d.
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*
* *
NB: Existen laboratorios de referencia de la OIE para la Peste de los pequeos rumiantes (ver Cuadro en la
177
CAPTULO 2.1.6.
PLEURONEUMONA BOVINA
CONTAGIOSA
RESUMEN
La pleuroneumona contagiosa bovina (PBC) es una enfermedad del ganado bovino causada por
Mycoplasma mycoides subsp. mycoides SC (biotipo bovino) (MmmSC; SC= colonias pequeas).
Se manifiesta con anorexia, fiebre y sntomas respiratorios como disnea, poliapnea, tos y
descargas nasales. El diagnstico depende del aislamiento del agente etiolgico. Los principales
problemas para el control o la erradicacin son la presencia frecuente de infecciones subagudas o
asintomticas y la persistencia de portadores crnicos despus de la fase clnica.
Identificacin del agente: Las muestras que hay que tomar de animales vivos incluyen frotis
nasales y/o lavados broncoalveolares, o lquido pleural obtenido por puncin. Las muestras a
tomar en las necropsias incluyen material de las lesiones pulmonares, ndulos linfoides, lquido
pleural y lquido sinovial de los animales con artritis. Es posible realizar el examen directo de los
exudados o frotis, pero ello requiere gran destreza.
Para el cultivo del agente patgeno, se homogenizan los tejidos en medios con antibiticos y se
inoculan en medios de cultivo que contienen inhibidores para evitar el crecimiento de las bacterias
contaminantes. El crecimiento de MmmSC tarda varios das.
En medio lquido, el crecimiento se observa en 3-10 das como una turbidez homognea que forma
remolinos cuando se agita; en medio slido, aparecen pequeas colonias, de 1 mm de dimetro,
con la clsica morfologa de "huevo frito". Las caractersticas bioqumicas de MmmSC son:
sensibilidad a la digitonina, reduccin de sales de tetrazolio, utilizacin de glucosa, ausencia de
arginina hidrolasa, de fosfatasa y de actividades proteolticas. Se han descrito medios especiales
que se recomiendan para estas pruebas. El diagnstico se confirma con pruebas inmunolgicas,
como la prueba de inhibicin del crecimiento y la prueba de inmunofluorescencia (ambas utilizan
sueros hiperinmunes). La reaccin en cadena de la polimerasa se utiliza actualmente como una
prueba rpida, especfica, sensible y fcil de usar.
Pruebas serolgicas: La prueba de fijacin de complemento de Campbell & Turner modificada,
contina siendo la prueba de diagnstico prescrita para el comercio internacional. Sin embargo,
presenta limitaciones importantes respecto a sensibilidad y especificidad. Se ha considerado al
enzimoinmunoensayo como una prueba alternativa por el Comit Internacional de la OIE en Mayo
de 2000, y como una prueba prescrita ordenada por la OIE para el comercio internacional en el
2004. Se ruega consultar la pgina web de la OIE para la versin ms reciente de este captulo. Se
ha evaluado una prueba de inmunotransferencia y se ha descrito que es muy especfica y sensible.
Requisitos para las vacunas: Para la produccin de las vacunas se recomienda la cepa atenuada
T1/44. El ttulo mnimo recomendado es 107 micoplasmas viables por dosis de vacuna.
A. INTRODUCCIN
La pleuroneumona bovina contagiosa (PBC) es una enfermedad contagiosa del ganado bovino causada por
Mycoplasma mycoides subsp. mycoides SC (biotipo bovino) (MmmSC; SC=colonias pequeas). Se sabe que la
PBC se presenta en Europa desde el siglo XVI pero alcanz una distribucin mundial durante la segunda mitad
del siglo XIX debido al aumento en el mercado internacional de ganado vivo. A comienzos del siglo XX se
erradic de muchos pases mediante polticas de extirpacin. Sin embargo, la enfermedad persiste an en
muchas partes de frica y del sur de Europa; en Asia, la situacin es confusa. En Europa no se han descrito
brotes desde 1999. En condiciones naturales, MmmSC slo afecta a rumiantes del gnero Bos, es decir
178
Captulo 2.1.6. Pleuroneumona bovina contagiosa
principalmente ganado bovino y cebes. En Italia se ha aislado MmmSC (biotipo bovino) de bfalos (Bubalus
bubalus) (25), y en frica y ms recientemente en Portugal, de ovejas y cabras. Entre los animales salvajes se
ha descrito un nico caso en bfalos americanos (bison) y ninguno en bfalos africanos (Syncerus caffer) u otros
rumiantes salvajes. Los animales salvajes no representan ningn papel en la epidemiologa de la enfermedad. La
PBC se manifiesta por anorexia, fiebre y sntomas respiratorios, como disnea, poliapnea, tos y descargas
nasales. En el caso de brotes agudos en condiciones experimentales, la tasa de mortalidad puede alcanzar el
50% sin tratamiento con antibiticos. Esta mortalidad puede ser mucho menor en el campo; sin embargo, cuando
en un rea se presenta por primera vez un brote, la mortalidad puede ser mayor. Los sntomas clnicos no son
siempre evidentes. Con frecuencia se presentan formas subagudas o asintomticas cuando los animales se
recuperan parcialmente. En este caso, sus pulmones muestran lesiones encapsuladas tpicas denominadas
"secuestros". Estos animales pueden ser responsables de la persistencia desapercibida de la infeccin en una
poblacin o una regin y desempear un papel importante en la epidemiologa de la enfermedad. La transmisin
tiene lugar por contacto directo entre un animal infectado y otro sano. No existe evidencia de transmisin a travs
de fomites ya que MmmSC no persiste en el ambiente. Las estrategias de control en la mayora de los
continentes se basan en la deteccin inicial de los brotes, el control de los movimientos de los animales y una
poltica de extirpacin. En frica, el control de la enfermedad se basa en campaas de vacunacin utilizando
cepas atenuadas de MmmSC como la T1/44 o T1sr. Aunque tericamente el uso de antibiticos est prohibido,
se aplican ampliamente en condiciones de campo. Todava no se han evaluado las consecuencias de estos
tratamientos antibiticos en trminos de eficacia clnica, emergencia de cepas resistentes, persistencia de
portadores crnicos e impacto sobre la salud humana. El grupo de M. mycoides comprende seis especies de
micoplasmas o grupos de cepas de origen bovino y caprino (9, 21, 28). Este grupo se puede subdividir en dos
grupos, capricolum y mycoides, que incluyen especies estrechamente relacionadas. Estas seis especies de
micoplasmas comparten caractersticas serolgicas y genticas, y esto plantea problemas taxonmicos y de
diagnstico (9) con las tcnicas convencionales. La identificacin especfica de MmmSC se puede llevar a cabo
en la actualidad mediante la reaccin en cadena de la polimerasa (PCR) o mediante la utilizacin de anticuerpos
monoclonales (MAbs). Aunque se ha considerado que MmmSC es un biotipo muy homogneo, algunas tcnicas
moleculares recientes, como la digestin enzimtica del ADN completo o la transferencia tipo southern utilizando
como sonda un elemento de insercin, han identificado diferencias entre las cepas. Una tcnica descrita
recientemente, que supone un modo ms fcil de realizar epidemiologa molecular de la PBC, consiste en un
anlisis de la secuencia de locus mltiples (o tipado). Esta tcnica permite diferenciar tres lneas principales que
se correlacionan con los orgenes geogrficos (Europa, Sudfrica y resto de frica) (17). Las cepas de origen
europeo se pueden diferenciar claramente de las africanas (8, 32). Las cepas europeas recientes se caracterizan
por la deleccin de un gran fragmento de ADN y son incapaces de oxidar el glicerol, lo que puede explicar una
patogenicidad aparente inferior (33). Sin embargo, las cepas europeas aisladas en 1967 no mostraban esa
deleccin. Las cepas africanas parecen ser ms diversas. No hay duda de que un mayor desarrollo tcnico
permitir una caracterizacin ms fina de las cepas.
1.
El microorganismo causante se puede aislar de muestras de animales vivos o de material procedente de una
necropsia. Las muestras de animales vivos son frotis o descargas nasales, lavados broncoalveolares o
transtraqueales y lquido pleural tomado aspticamente por puncin en la parte baja de la cavidad torcica entre
la sptima y octava costilla. Tambin se puede cultivar la sangre (14). Las muestras de una necropsia son los
pulmones con lesiones, el lquido pleural ("linfa"), los ndulos linfticos del tracto broncopulmonar y el lquido
sinovial de los animales con artritis. Las muestras deben tomarse de la interfase de las lesiones entre el tejido
enfermo y el normal.
El agente etiolgico se puede detectar por cultivo, por mtodos de estudio de cidos nucleicos y por mediante
pruebas inmunolgicas, que se describen ms adelante. El estudio del agente es complejo y se puede llevar a
cabo por pruebas bioqumicas, mtodos de deteccin de cidos nucleicos y mtodos inmunolgicos. Estos
mtodos se describen aqu en sus aspectos generales; sin embargo, se recomienda que la identificacin
definitiva sea realizada por un laboratorio de referencia de la OIE.
La presencia de los patgenos vara mucho en funcin del estado de desarrollo de las lesiones, y un resultado
negativo no es definitivo, en particular despus de un tratamiento con antibiticos.
Cuando se envan muestras al laboratorio, se aconseja utilizar un medio para el transporte que proteja los
micoplasmas y evite la multiplicacin de otras bacterias (caldo de infusin de corazn sin peptona y glucosa,
10% de extracto de levadura, 20% de suero, 0,3% de agar, 500 Unidades Internacionales [IU]/ml de penicilina,
acetato de talio, 0,2 g/litro).
179
Las muestras se mantienen fras a 4C si se mantienen unos das, o se congelan a -20C o menos por ms
tiempo. Para traslados entre laboratorios, los fragmentos de pulmn o el lquido pleural tambin pueden
congelarse. Si no se pueden procesar el mismo da de su recogida las muestras se deberan congelar.
a)
Cultivo
MmmSC necesita medios apropiados para crecer (24). Para el aislamiento se pueden requerir 2-3 pases.
Muchos intentos de aislamiento fracasan porque el microorganismo es lbil, se presenta a menudo en
pequeas cantidades, y es exigente en sus requerimientos nutritivos. Los medios deben contener un medio
bsico (como infusin de corazn o peptona), extracto de levadura (preferiblemente fresco) y suero de
caballo (10%). Se pueden aadir otros componentes, como glucosa, glicerol, ADN y cidos grasos, pero los
efectos varan segn las cepas. Son necesarios inhibidores, como penicilina, colistina o acetato de talio,
para evitar el crecimiento de otras bacterias. El medio se puede utilizar lquido o solidificado con 1.0-1.2%
de agar. Todos los medios de cultivo preparados deben someterse a controles de calidad y deben permitir
el crecimiento de Mycoplasma spp. a partir de inculos pequeos. La cepa de referencia se debe de cultivar
en paralelo con las muestras sospechosas para asegurar que las pruebas funcionan correctamente.
Las muestras de pulmn se homogenizan en caldo con antibiticos, se diluyen diez veces para reducir la
contaminacin bacteriana y se inoculan en cinco tubos de caldo y en medio slido. El lquido pleural se
puede inocular directamente sin dilucin previa. Se recomienda el uso de cierres hermticos en las placas
Petri o de incubadores con humedad controlada para evitar la desecacin. Para asegurar las mejores
condiciones de crecimiento de los micoplasmas debe utilizarse un incubador de CO2 o una jarra de
anaerobios. Los tubos y las placas de Petri se inspeccionan diariamente durante 10 das. En medio lquido,
por lo general aparece en 2-4 das una turbidez homognea, con frecuencia con un filamento frgil y
sedoso llamado "cometa", que es caracterstico de MmmSC (o de M. capricolum subsp. capripneumoniae,
la causa de la pleuroneumona caprina contagiosa). Durante los siguientes das se desarrolla una opacidad
uniforme con remolinos cuando se agita. En medio slido, las colonias son pequeas (1 mm de dimetro) y
presentan la forma clsica de "huevo frito" con un centro denso. En esta fase se puede realizar la prueba de
la inmunofluorescencia indirecta (IFI).
b)
Pruebas bioqumicas
Las pruebas bioqumicas se consideran pruebas confirmativas, para realizarse en laboratorios de
referencia. Para el uso rutinario, las pruebas inmunolgicas son suficientes, pero cuando stas dan
resultados dudosos y en todos los casos de primeros aislamientos, las pruebas bioqumicas deben
confirmarse en un laboratorio de referencia. A este fin, despus de uno o dos pases, se deben eliminar del
medio los antibiticos para comprobar si el aislado es un micoplasma o una forma-L de una bacteria que
recuperar su forma original en el medio sin inhibidores. Una vez hecho esto, y despus de clonar (deben
seleccionarse al menos tres colonias), se puede identificar el microorganismo utilizando pruebas
bioqumicas (2, 12)
MmmSC es sensible a la digitonina (como todos los miembros del orden Mycoplasmatales), no produce
"velo y manchas", fermenta la glucosa, reduce las sales de tetrazolio (aerbica o anaerbicamente), no
hidroliza la arginina, carece de actividad fosfatasa y no tiene propiedades proteolticas o stas son muy
dbiles.
Se han desarrollado medios especiales para estas pruebas que contienen los mismos ingredientes bsicos
(caldo de infusin de corazn o caldo Bacto PPLO [organismos semejantes a los de la pleuroneumona],
suero de caballo, 25% de solucin de extracto de levadura, 0,2% de solucin de ADN), a los que se aade
1% de una solucin de glucosa al 50% para ver la utilizacin de glucosa, 4% de una solucin de argininaHCl al 38% para ver la hidrlisis de arginina, y 1% de una solucin de cloruro de dimetil tetrazolio para la
reduccin del tetrazolio, ms un indicador de pH (por ejemplo, rojo fenol). Para la demostracin de
proteolisis, se realiza el crecimiento sobre agar casena y/o agar con suero coagulado.
Una vez realizada la caracterizacin bioqumica, se debe realizar una de las siguientes pruebas
inmunolgicas para confirmar la identificacin: prueba de inhibicin del crecimiento en disco (DGIT),
inmunofluorescencia (FAT) y prueba de inmunounin en punto sobre un filtro de membrana (MF-dot).
El aislamiento e identificacin del agente de la PBC puede ser difcil y consumir mucho tiempo, y depende
del manejo cuidadoso de los procedimientos y medios adecuados. Cuando resulte posible, los laboratorios
bacteriolgicos clsicos deberan montar una seccin especial para trabajar solo con micoplasmas.
c)

Se han desarrollado sondas radioactivas o enzimticas, pero su uso es restringido principalmente por
razones de seguridad.
180
Por otra parte, la PCR es sensible, muy especfica, rpida y fcil de realizar. Se han descrito cebadores
especficos para el grupo M. mycoides (26) y para MmmSC (10, 20, 31) y se han desarrollado pruebas PCR
(5, 10, 20) que incluyen una nueva tcnica que permite la identificacin especfica de las cepas T1
vacunales (18). La PCR se puede aplicar directamente despus de desnaturalizar en agua hirviendo
muestras tales como exudados de pulmn, sin extraccin de ADN. No obstante, la ebullicin de las
muestras es menos sensible que la extraccin de ADN y no debe utilizarse de modo rutinario. Incluso puede
aplicarse a muestras secas sobre papel de filtro. Los fragmentos de pulmn se tienen primero que
homogenizar y centrifugar a baja velocidad antes de la desnaturalizacin y la PCR. Tambin puede
realizarse la PCR con orina o con sangre. La principal ventaja de la tcnica de la PCR es que se puede
aplicar a muestras mal conservadas (contaminadas o sin micoplasmas viables, como puede ocurrir despus
de un tratamiento con antibitico. Si falla la deteccin directa del ADN en el rgano estudiado, las muestras
deben enriquecerse cultivndolas durante 24-48 horas en un medio apropiado, e intentar despus la
deteccin del ADN en el cultivo. La PCR se ha convertido en el instrumento ms importante para la
caracterizacin y diferenciacin entre los miembros del grupo M. mycoides y MmmSC.
d)
Pruebas inmunolgicas
Se puede poner de manifiesto el agente etiolgico o sus antgenos mediante pruebas inmunoqumicas en
tejidos infectados, lquidos tisulares y/o cultivo del microorganismo. Sin embargo, como algunas de estas
pruebas dependen de que est presente en la muestra un nmero mnimo de microorganismos, solo se
tienen en cuenta los resultados positivos.
i)

La prueba IFI se puede realizar sobre frotis de materiales clnicos utilizando suero de conejo
hiperinmune contra MmmSC y anti-IgG marcada, de origen bovino. Se ha utilizado suero hiperinmune
bovino, pero puede tener anticuerpos con reaccin cruzada. La prueba es satisfactoria cuando se
aplica a frotis de lquido pleural, pero lo es menos con frotis de pulmn, debido a una considerable
fluorescencia inespecfica. Sin embargo, se pueden obtener buenos resultados utilizando frotis de
pulmn con negro Ericromo como tincin de contraste.
ii)
Prueba del anticuerpos fluorescentes

Por lo general, esta prueba (FAT) se realiza sobre cultivos lquidos y slidos. Es un poco menos
especfica que la prueba IFI.
Cultivo lquido: Colocar dos gotas en un porta. Fijar 15 minutos con alcohol metlico y en una cmara
hmeda dejar en contacto durante 30 minutos a 37C con el suero hiperinmune marcado. Lavar tres
veces con solucin salina tamponada con fosfato (PBS, pH 7,2) y examinar en un microscopio de
epifluorescencia (x80).
Colonias en medio slido: Tomar un trozo de agar con varias colonias jvenes y colocarlo en un porta
con las colonias hacia arriba. Depositar una o dos gotas del suero hiperinmune marcado sobre el trozo
y dejarlo en una cmara hmeda durante 30 minutos. Colocar el trozo en un tubo y lavar dos veces
durante 10 minutos con PBS. Colocar el trozo en un porta con las colonias hacia arriba y examinar
como antes.
Cultivo en placa de Petri: El gel no debe ser muy grueso (menos de 3 mm) y debe contener el menor
suero de caballo posible. Lavar el gel tres veces con PBS, extender por la superficie 1 ml del suero
marcado e incubar 30 minutos en una cmara hmeda. Lavar cuatro veces con PBS y examinar
directamente en un microscopio. La FAT en una placa de Petri se utiliza fundamentalmente despus
del aislamiento y antes de clonar, ya que es muy til en el caso de infecciones mixtas con varias
especies de micoplasmas.
Interpretacin de la FAT: En medio lquido, los micoplasmas aparecen de color verde brillante sobre
fondo oscuro. Sin embargo, con la FAT realizada sobre colonias en agar, se requiere experiencia
porque el fondo aparece como verde oscuro.
iii)
Prueba de inhibicin del crecimiento en disco

La DGIT se basa en la inhibicin directa del crecimiento del agente en medio slido por un suero
inmune especfico (12). Sin embargo, con frecuencia se presentan reacciones cruzadas con el grupo
mycoides y se debe tener mucho cuidado en diferenciar MmmSC (biotipo bovino) de MmmLC (biotipo
caprino; LC: colonias grandes). Es una prueba sencilla de realizar pero la interpretacin de algunos
resultados requiere experiencia: pequeas zonas de inhibicin (de anchura menor de 2 mm), inhibicin
parcial con "colonias invasoras", reacciones negativas y positivas falsas (muy raras). En esta prueba,
la calidad del suero hiperinmune utilizado resulta crtica para obtener buenos resultados.
iv)
Prueba de inmunodifusin en medio slido

La prueba de inmunodifusin en gel de agar (IGDA) permite detectar el antgeno especfico que est
presente en la superficie del MmmSC y el galactano circulante que invade el sistema hemolinftico de
los animales enfermos (13). Se puede probar lquido pleural o fragmentos homogenizados de pulmn
181
frente a un suero hiperinmune en dos pocillos practicados sobre el gel y separados entre s 5 mm. El
gel se compone de agar Noble (12 g) y acetato de talio (0,2 g/litro) en PBS, pH 7,2 (1.000 ml). Se
considera que la prueba carece de sensibilidad y se sabe poco sobre su especificidad, pero ha servido
como prueba de anlisis y solo se deben tener en cuenta los resultados positivos. Los resultados son
mejores cuando la placa se incuba a 37C y puede leerse en 24 horas. Se ha desarrollado una prueba
de campo, sencilla, que utiliza discos de papel impregnados, en vez de pocillos (23).
v)
Inmunotransferencia de punto en membrana de filtracin

La prueba MF-dot se puede utilizar como prueba de rutina en el laboratorio. Esta tcnica se puede
realizar con antisueros policlonales adoptando un procedimiento cuantitativo (22), aunque pueden
presentarse reacciones cruzadas dentro del grupo mycoides. Se han empleado MAbs especficos que
pueden evitar este problema (7).
vi)
Inmunohistoqumica
En lesiones pulmonares se pueden detectar sitios inmunoreactivos para MmmSC utilizando el mtodo
peroxidasa-antiperoxidasa en secciones de muestras incluidas en parafina (11). En el diagnstico de
la PBC esta prueba es solo suplementaria, pues en casos crnicos o despus de tratamiento con
antimicrobianos no siempre se obtiene el aislamiento del agente (6); un resultado negativo no es
concluyente.
2.
Pruebas serolgicas
Las pruebas serolgicas para la PBC solo son vlidas a nivel de poblaciones. Las pruebas individuales con
animales pueden resultar equvocas porque el animal se encuentre en las primeras fases de la enfermedad,
antes de que se produzcan los anticuerpos especficos, o porque pueda estar en la fase crnica de la
enfermedad, cuando muy pocos animales son seropositivos.
a)
Fijacin de complemento (una prueba adecuada para determinar la ausencia de la enfermedad y la

prueba prescrita para el comercio internacional)
La prueba de fijacin de complemento (FC) de Campbell & Turner contina siendo el procedimiento
recomendado con carcter general (aunque el mtodo actual difiere ligeramente del original), y es muy
utilizado en todos los pases donde se presenta la infeccin (24). La prueba FC, como micromtodo, se ha
homologado en la Unin Europea (19). A efectos de titulacin de antgeno y de armonizacin, se
prepararon sueros positivos como estndares internacionales (840 y 845, PS1 y PS2, respectivamente) y
estn disponibles en el Laboratorio Nacional de Investigacin Veterinaria, en Lisboa, Portugal (19). Sin
embargo, la prueba FC todava resulta de difcil realizacin y requiere personal bien entrenado y con
experiencia.
182
Reactivos
i)
Tampn Veronal (VB) pH 7,3. Se utiliza una solucin base concentrada que se diluye al 1/5 en agua
estril bidestilada.
ii)
Las muestras de suero, sin eritrocitos, deben inactivarse a 56C durante 30 minutos y diluirse al 1/10
en VB.
iii)
El antgeno consiste en una suspensin de MmmSC previamente titulada y se utiliza a la dosis de 2

unidades fijadoras de complemento (unidades FC). Se debe mantener a 4C sin congelar. Se produce,
prueba y distribuye por laboratorios reconocidos internacionalmente.
iv)
El complemento (C) se obtiene a partir de suero normal de cobaya. Se liofiliza y se reconstituye en

agua bidestilada. Despus de la reconstitucin se debe mantener a -20C. Se titula practicando una
serie de diluciones en VB con una cantidad apropiada de antgeno que se utiliza en la prueba.
Despus de incubar a 37C durante 2 horas, a cada dilucin se aade una cantidad apropiada de
eritrocitos de oveja sensibilizados (SRBC). El resultado de la titulacin se lee despus de incubar otra
hora. La dilucin mas alta que provoca hemolisis completa de los SRBC es igual a 1 unidad de C, de
donde se calcula la dilucin requerida para 2,5 unidades en 25 l.
v)
La hemolisina es un suero hiperinmune de conejo contra SRBC. La cantidad utilizada es de 6 dosis

hemolticas ledas a punto final del 50% (HD50 [dosis hemoltica del 50%]).
vi)
Los SRBC se obtienen por puncin asptica de la vena yugular. Se pueden conservar en solucin de
Alsever o con citrato sdico. Se utilizan como suspensin al 6%.
vii)
El sistema hemoltico (HS) se prepara diluyendo hemolisina en VB hasta una dosis de 12 HD50. Se
aade un volumen igual de suspensin de SRBC al 6% y el sistema se lleva a un bao de agua a
37C durante 30 minutos con agitacin peridica.
viii) Los dos sueros positivos estndar, PS1 y PS2, son sueros bovinos de animales infectados
naturalmente con un ttulo bajo y alto, respectivamente, para armonizacin y control de la prueba FC, y
para titulacin de antgeno (PS2). Son negativos para anticuerpos frente a Brucella, Mycobacterium
paratuberculosis,
Chlamydia,
Coxiella
burnetii,
Leptospira,
rinotraqueitis
bovina
infecciosa/vulvovaginitis pustular infecciosa, Mycoplasma bovis y virus de la leucosis bovina.
ix)
El suero de control negativo (NS) es un suero de bovino sano, negativo para los microorganismos
sealados.
Procedimiento de la prueba (utilizando microplacas)
i)
Colocar 25 l de las muestras de los sueros de ensayo (ya diluidas a 1/10). Aadir 25 l de antgeno a
una dosis de 2 unidades FC.
ii)
Aadir 25 l de Ca una dosis de 2,5 unidades. Agitar vigorosamente e incubar a 37C durante
30 minutos con agitacin peridica.
iii)
Aadir 25 l de HS, agitar vigorosamente e incubar a 37C durante 30 minutos con agitacin peridica.
Es necesario disponer de los siguientes controles:
Complemento: 0,5, 1 y 2,5 unidades.
Sistema hemoltico: 75 l de VB + 25 l de HS.
Antgeno: 25 l de 2 unidades FC de antgeno + 25 l de Ccon 2,5 unidades + 25 l de HS.
Nota: las microplacas deben agitarse vigorosamente dos veces durante el perodo de incubacin. Se
utilizan siempre los controles indicados arriba, el PS y el NS, en cada microplaca o en una serie de
microplacas en que se utilizan los mismos lotes de reactivos.
iv)
Lectura e interpretacin de los resultados: Despus de centrifugar las microplacas a 125 g durante
2 minutos, la lectura se basa en el porcentaje observado de fijacin de complemento.
Resultado positivo: 100% de hemolisis a 1/10;
Resultados dudosos: 25, 50 o 75% de hemolisis a 1/10.
Se recomienda que cualquier fijacin de complemento, incluso parcial (25, 50 75%), a una dilucin
1/10 de suero se contine con investigaciones adicionales.
Las limitaciones de la prueba FC resultan bien conocidas. Con una sensibilidad de >99,5%, la prueba FC
puede detectar casi todos los animales enfermos con lesiones agudas, pero slo una pequea proporcin
de animales en las primeras fases de la enfermedad o con lesiones crnicas. Adems, las intervenciones
teraputicas o las operaciones profilcticas ejecutadas de modo incorrecto (sacrificio parcial de la
poblacin) pueden aumentar el nmero de reacciones negativas falsas. Sin embargo, para grupos de
animales (una manada o unidad epidemiolgica) la FC es capaz de detectar prcticamente el 100% de los
grupos infectados.
La naturaleza de la patognesis de la enfermedad es tal que el perodo de incubacin, durante el cual los
anticuerpos resultan indetectables por la prueba FC, puede prolongarse varios meses.
Pese a la alta sensibilidad de la prueba FC, pueden producirse resultados positivos falsos. Una causa
importante de ello es la existencia de reacciones serolgicas cruzadas con otros micoplasmas, en particular
con otros miembros del grupo M. mycoides. La validez de los resultados debe confirmarse mediante
examen post-mortem y bacteriolgico, y mediante pruebas serolgicas con sangre tomada en el momento
del sacrificio.
b)
Enzimoinmunoensayo competitivo (prueba prescrita para el comercio internacional)

Se ha sometido a evaluacin (3) un enzimoinmunoensayo competitivo (C-ELISA) desarrollado por el Centro
de Colaboracin de la OIE para el diagnstico y Control de Enfermedades Animales en Pases Tropicales
(ver Cuadro en la Parte 3 de este Manual) (16). En la actualidad, la IAEA est evaluando un ELISA indirecto
basado en una lipoprotena (1). En mayo de 2000 se design a la C-ELISA como una "prueba alternativa"
por el Comit Internacional de la OIE y en mayo 2004 como una prueba prescrita. Comparada con la
prueba FC, la prueba C-ELISA tiene una sensibilidad similar pero una especificidad mayor. La C-ELISA es
una prueba para poblaciones de animales ms fcil de realizar que la FC, pero sus caractersticas no han
183
sido determinadas por completo, todava (16). Los reactivos para C-ELISA se pueden obtener como
preparaciones comercializadas1.
Las pruebas de validacin llevadas a cabo en varios pases europeos y africanos (3, 16) indican i) que la
verdadera especificidad de C-ELISA es de al menos 99,9%; ii) que la sensibilidad es similar a la de la
prueba FC; y iii) que mediante C-ELISA los anticuerpos se detectan muy poco tiempo despus de que se
pueden detectar por la prueba FC y que los anticuerpos detectados por C-ELISA persisten mediante ms
tiempo.
Esta prueba C-ELISA se suministra ahora como una preparacin comercial lista para ser utilizada, que
contiene todos los reactivos necesarios incluyendo placas recubiertas, que se mantienen selladas por papel
de aluminio. La preparacin se ha diseado especialmente para ser resistente y ofrecer una buena
reproducibilidad. Los sueros se analizan en pocillos nicos. El substrato se ha modificado y en la actualidad
es TMB (tetrametil benzidina) en tampn lquido y la lectura se realiza a 450 nm. El color del substrato
cambia de verde plido a azul en una primera fase y es amarillo despus de aadir la solucin de parada.
Los controles de MAbs muestran un color ms oscuro mientras que los controles de suero muy positivo son
muy claros. El punto de corte se ha tomado al 50% y debera ser vlido en cualquier pas. En una poblacin
afectada muchos animales mostrarn resultados positivos.
c)
Reactivos
i)
El antgeno base se prepara lavando una suspensin concentrada de micoplasmas (2 mg/ml) y lisando
con dodecil sulfato sdico al 0,1%. El antgeno base se mantiene a -20C hasta su uso.
ii)
Los MAbs se pueden conseguir del Centro de Colaboracin de la OIE para el Diagnstico y Control de
Enfermedades Animales en Regiones Tropicales (ver Cuadro en la Parte 3 de este Manual).
iii)
El conjugado es DAKO P260 diluido 1/1500 en PBS con 0,5% de suero de caballo y 0,05% de Tween
20.
iv)
El substrato es 1 mM ABTS (2, 2-azino-bis-[3-etilbenzotiazolina-6-cido sulfnico]) y H2O2 en tampn

citrato.
i)
Las placas para ELISA se recubren con una solucin

pH 7,4 (100 l/pocillo) y se incuban toda la noche a 4C.
ii)
Se lavan las placas una vez en PBS diluido 1/5 con 0,05% de Tween 20.
iii)
Sueros no inactivados por el calor (diluidos 1/10) y MAb diluidos en PBS con 0-5% de suero de caballo
y 0,05% de Tween 20 se dejan en contacto con el antgeno durante 1 hora a 37C con agitacin
moderada, en una cmara hmeda. El suero inactivado por calor no proporciona buenos resultados.
iv)
Se lavan las placas dos veces y se aade el conjugado a todos los pocillos (100 l); luego se incuba
durante 1 hora a 37C.
v)
Se lavan las placas tres veces y se aade el substrato a todos los pocillos (100 l).
vi)
Se realiza la lectura a 405 nm cuando la absorbancia alcanza 0,8-1,6 en el control de MAb.
de
antgeno
lisado
en
PBS,
Prueba de inmunotransferencia
Se ha desarrollado una prueba inmunoenzimtica denominada prueba de inmunotransferencia (prueba IB)
que se considera con valor diagnstico. Una estimacin en condiciones de campo indic una sensibilidad y
especificidad ms altas que la prueba de FC. Se considera inmunodominante un perfil bsico de bandas
antignicas, que se presentan en animales infectados tanto experimental como naturalmente. La visin
ajustada del estado inmune del animal que proporciona esta prueba se debe a la posibilidad de un anlisis
ms preciso de la respuesta inmune del hospedador en relacin con el perfil electrofortico de los antgenos
de MmmSC; por tanto, esta prueba supera problemas relacionados con unin inespecfica. Debera
utilizarse fundamentalmente como una prueba confirmativa, despus de otras pruebas, y en todos los casos
en los que la prueba FC ha dado un resultado falso sospechoso. Particularmente, posee valor donde se
estn implantando polticas de control o erradicacin de la enfermedad.
184
International Atomic Energy Agency, Wagramerstrasse 5, P.O. Box 100, A-1400 Viena, Austria, o CIRAD/EMVY, Sant
Animale, Campus International de Baillarguet, TA30/G, 34398 Montpellier cedex 5, Francia.
Preparacin de tiras de antgeno
i)
El antgeno se prepara lavando una suspensin de clulas de micoplasmas obtenida de un cultivo de

48 horas.
ii)
Se prepara una SDS/PAGE (dodecil sulfato sdico/electroforesis en gel de poliacrilamida) con gel de
concentracin al 4% y gel de resolucin en gradiente del 5-15% y se utiliza para electroforesis de la
muestra con marcadores apropiados de peso molecular.
iii)
Las protenas separadas se transfieren a membranas de 0,45 m de nitrocelulosa (14 x14 cm) a un
voltaje constante de 70 V en tampn de transferencia (20% de metanol en 193 mM de glicina, 25 mM
de Tris/HCl, pH 8,3).
iv)
Se seca la membrana y se marca el lado sobre el que se encuentran las protenas. Se incuba la
membrana de nitrocelulosa en tampn de bloqueo (PBS que contiene 5% de leche desnatada, 1 M de
glicina y 1% de ovolabmina) durante 2 horas a temperatura ambiente. Despus de tres lavados de 15
minutos en PBS con 0,1% (v/v) de Tween 20, la membrana se lava de nuevo con PBS solo. Se seca la
membrana y se corta una tira del borde, que se ensaya. Se identifican las bandas especficas de 110,
98, 95, 62/60 y 48 kDa.
v)
La hoja de la membrana de nitrocelulosa se corta en tiras de 0.4 cm de anchura y se marca cada tira.
Estas tiras son el antgeno usado en la transferencia.
NB: Las tiras deben disponerse con el antgeno hacia arriba durante el procedimiento.
d)
i)
Las muestras del suero de prueba se diluyen al 1/3 y se preparan sueros control positivo y negativo
utilizando tampn de dilucin (PBS con 0,1% de leche desnatada y 0,1% de ovoalbmina).
ii)
Se coloca una tira de antgeno en cada muestra de estudio (y en los controles) y se incuba a 37C
durante 2 horas con agitacin continua. Despus se lavan las tiras, como antes.
iii)
Las tiras se incuban con una dilucin adecuada de Ig anti-bovina (cadenas H +L) conjugada con
peroxidasa, en tampn de dilucin, durante 1 hora a temperatura ambiente y con agitacin continua.
Despus, lavar como antes.
iv)
El substrato se prepara aadiendo 30 mg de 4-cloro-1-naftol, disuelto en 10 ml de metanol, a 50 ml de

PBS y 30 l de H2O2. Se aade substrato a las tiras, que se dejan en la oscuridad con agitacin
continua y se examinan peridicamente hasta que las bandas de protenas aparecen oscuras. La
reaccin se detiene con agua destilada.
v)
Lectura de los resultados: Las tiras se secan y se examinan respecto a la presencia del perfil bsico
de inmunotransferencia de IgG para cinco bandas antignicas especficas de 110, 98, 95, 62/60 y
48 kDa. Los sueros que dan un perfil inmunolgico similar se consideran positivos.
Otras pruebas
Para detectar aglutininas especficas se ha desarrollado una prueba rpida de campo de aglutinacin en
porta (SAT) con sangre entera o con suero (30): el antgeno es una suspensin densa de micoplasmas
coloreados que se mezcla con una gota de suero o sangre. Debido a una sensibilidad escasa, la prueba
slo detecta animales en los estados iniciales de la enfermedad (es decir, la fase aguda). Debe usarse solo
a nivel poblacional. Se ha desarrollado una prueba de aglutinacin con ltex que es ms fcil de interpretar
que la SAT (4).
Para la PBC, las pruebas FC y ELISA se pueden utilizar en programas de anlisis y erradicacin, y la
prueba IB altamente especfica debera usarse como confirmativa. Sin embargo, la prueba IB no satisface el
anlisis masivo y puede ser difcil de estandarizar en pases con servicios de laboratorio marginales.

Desde principios del siglo XX se han descrito muchas vacunas contra la PBC (vacunas muertas y vacunas
heterlogas), pero ninguna ha sido realmente satisfactoria. En la actualidad, las nicas vacunas utilizadas se
producen con cepas atenuadas de MmmSC.
185
1.
Control del inculo
a)

Para preparar vacunas contra la PBC se utilizan dos cepas: la cepa T1/44, una cepa atenuada
naturalmente y aislada en 1951 por Sheriff & Piercy en Tanzania, y la cepa T1sr (34, 35). El pase nmero
44 por huevo es lo suficientemente atenuado para proteger al ganado sin producir reacciones postvacunales importantes. Despus de la vacunacin pueden presentarse reacciones locales en el punto de la
vacunacin. Las razas de ganado deben caracterizarse en cuanto a sensibilidad antes de proceder a
vacunar en masa. Debe advertirse que cuando la vacuna se suministra por intubacin puede producir PBC;
sin embargo, si se inyecta subcutneamente no debe crear un problema serio de enfermedad (15).
La identidad de la cepa se puede comprobar con la insercin del perfil de la secuencia o por ensayo
especfico con PCR (18).
La cepa de inculo original se mantiene en forma liofilizada a -20C.
b)
Mtodo de cultivo
Para la produccin de vacunas se utiliza un sistema de lotes de inculos liofilizados que se obtienen de
cultivos del inculo primario. Estos lotes de inculo se mantienen a -20C.
Los medios utilizados para los cultivos de siembra son el medio de Gourlay o el medio F66: ambos
contienen los mismos ingredientes bsicos, pero el F66 es ms complejo (24). Los medios se esterilizan por
filtracin, poseen un pH de 7,8-8,0, y deben utilizarse en pocos das despus de su preparacin. El medio
se debe distribuir en tubos incubados a 37C durante 48 horas para comprobar su esterilidad antes del uso.
Para cultivos en masa de la cepa de vacuna se debe inocular directamente el contenido completo de un vial
de inculo de siembra a 100 ml de medio, para evitar el riesgo de clonar sin pretenderlo el inculo de la
vacuna.
2.
Mtodo de produccin
Los medios para producir vacunas, de Gourlay o F66, se describen en la Seccin C.1.b. Deben distribuirse en
matraces de 1 litro (500 ml por matraz) y de 10 litros (5 litros por matraz) e incubarse a 37C durante 48 horas
para comprobar la esterilidad antes de su utilizacin.
Para obtener un recuento bacteriano alto, se deben recoger los cultivos justo antes del final de la fase logartmica
de crecimiento, antes del punto mximo, pues el nmero de micoplasmas viables se reduce despus
rpidamente. Por consiguiente se debe realizar una cintica de la curva de crecimiento en cada laboratorio de
produccin. El contenido de un vial de inculo de trabajo se usa en tubos en diluciones seriadas. Si no se
produce contaminacin despus de la incubacin, se utiliza el segundo tubo, cuando el cultivo an est en fase
exponencial, para inocular matraces de 1 litro. Los matraces de 10 litros se inoculan con el cultivo de 48 horas de
un matraz de 1 litro (10 ml/ litro de medio) y se incuban a 37C. Despus de 24 horas de incubacin, se
recomienda que la agitacin magntica sea lenta. Justo antes de que se alcance el mximo (entre 60 y 70 horas
de incubacin), se prepara el cultivo para liofilizacin.
Los siguientes pasos deben hacerse en hielo:
Adicin del medio protector de liofilizacin: leche en polvo desnatada (al 4,5%, es decir 225 g por cada 5
litros).
Distribucin en viales (el volumen depende del nmero de dosis necesarias por vial y de los pasos de la
liofilizacin).
Para liofilizar se recomiendan liofilizadores con estantes para controlar y observar los diferentes pasos. Los
viales deben cerrase en la mquina del liofilizador para evitar roturas.
3.
Control interno
En cada paso deben realizarse exmenes microscpicos de preparaciones teidas con la tincin de Gram del
caldo, o de cultivos del caldo en medio slido con sangre, para comprobar la ausencia de contaminacin
bacteriana.
186
Tambin debe realizarse un examen rpido para comprobar la presencia de MmmSC en el medio recogido, por
microscopa de contraste de fases y mediante FAT con un suero hiperinmune marcado.
Se inoculan muestras liofilizadas de las vacunas en agar micoplasma o en caldo para llevar a cabo pruebas de
inhibicin del crecimiento (11).
4.
Control de lotes
a)
Esterilidad
Se inoculan caldos bacteriolgicos, as como agar sangre, y se incuba a 37C. Todos los medios deben
permanecer estriles (24). Las pruebas para esterilidad pueden encontrarse en el Captulo I.1.5.
b)
Titulacin
El ttulo mnimo es de 107 micoplasmas por dosis de vacuna, pero se recomiendan ttulos ms altos, de al
menos 108. La titulacin se lleva a cabo despus de reconstituir la vacuna liofilizada en el diluyente
recomendado para la vacunacin. Las titulaciones se deben realizar en al menos cinco viales de cada lote.
Tcnica clsica: Se realizan diluciones decimales en medio de Gourlay. Para homogenizar la suspensin en
cada tubo resulta til emplear un agitador de tipo vrtex. Primero, 5 ml de los tubos con diluciones de 10-6 a
10-12 se inoculan en cinco tubos de medio (1 ml por tubo, cinco tubos por dilucin). Todos los tubos se
incuban luego 4 das a 37C y se detecta el crecimiento por el cambio de color en el indicador. El ttulo se
obtiene utilizando la tabla del "Nmero Ms Probable" de MacCrady o por modificacin del mtodo de Reed
& Muench. Esta tcnica es simple y fcil de realizar pero carece de precisin (+ 0,5 log).
Se ha descrito un mtodo de microtitulacin que es ms exacto (27) y que debera utilizarse cuando sea
posible.
Existen procedimientos alternativos de titulacin que incluyen el uso de diluciones decimales preliminares,
como en la tcnica clsica, pero la siembra de 20 alcuotas de 100 l, por cada dilucin, en una microplaca
que ya contiene el "medio con glucosa" y un indicador de pH. Se pueden probar cuatro diluciones en una
microplaca, dejando dos columnas para el control del medio. El ttulo se calcula por una modificacin del
mtodo de Reed y Mench que consiste en restar 0,25 log del ttulo final para obtener un "nmero de
organismos viables" y no una dosis infectiva del 50%. La precisin final debe ser del orden de 0,2-0,25 log.
Se pueden obtener titulaciones comparativas sembrando alcuotas de 20 l de cada una de las diluciones
primarias en un medio slido conveniente. Los ttulos se obtienen luego como CFU (unidades formadoras
de colonias) y no debera diferir mucho de los ttulos obtenidos en medio lquido. La titulacin en medio
slido requiere ms destreza que en medio lquido.
c)
Inocuidad
Despus de la reconstitucin en tampn fro, la vacuna se inocula subcutneamente en dos ratones, e
intraperitonealmente en otros dos ratones y en dos cobayas machos. Ninguno de los animales debe morir
en el mes siguiente y los cobayas no deben mostrar signos de orquitis. Las pruebas de inocuidad se deben
realizar por lo menos en dos cabezas de ganado bovino o de cebes. Cada una se inocula con diez dosis
de vacuna y se observan para efectos adversos durante 4 semanas.
d)
Potencia
Se inyectan subcutneamente por lo menos diez cabezas de ganado bovino en el sitio recomendado,
indicado en el prospecto. Se mantienen como controles no vacunados otros tantos animales. Despus de
por lo menos 2 meses, todos los animales se ponen en contacto con ganado infectado experimentalmente,
en un espacio cerrado, utilizando al menos un donante de la infeccin por cada tres cabezas sometidas a
prueba. El ganado se mantiene en contacto durante 3 meses. Despus, se sacrifican todos los animales y
se realizan exmenes post-mortem. Los animales vacunados no deberan mostrar ms que sntomas
clnicos ligeros de la enfermedad, ni presentar lesiones post-mortem de pleuroneumona. Al menos el 80%
de los animales control deben mostrar las tpicas lesiones post-mortem. Esta prueba de potencia solo se
necesita realizar una vez; los lotes siguientes no se tienen que volver a probar, siempre que se produzcan
con arreglo a un protocolo estndar (34, 35). Cualquier modificacin de tal protocolo estndar, como
incrementar el nmero de pases in vitro, debe estar estrictamente prohibido. Otras modificaciones, como la
produccin en fermentadores con ajuste continuo de pH o adicin de reactivos, debe acompaarse siempre
de una prueba de potencia para asegurar que la proteccin inducida no se ha visto alterada.
187
e)
La cepa T1/44 confiere una proteccin aproximada de 1 ao (14), pero la lograda con la cepa T1sr puede
durar slo 6 meses. En algunos animales se produce seroconversin (prueba FC). Los anticuerpos
desaparecen a los tres meses de la vacunacin.
f)
Estabilidad
La titulacin peridica de la vacuna almacenada permite calcular la caducidad. Las vacunas liofilizadas
deben conservarse a -20C. A esta temperatura su perodo de conservacin es de por lo menos 1 ao (24),
y la viabilidad se puede conservar por muchos aos sin prdida de titulacin, lo que permite la constitucin
de stocks de emergencia. Naturalmente, los ttulos de estos depsitos necesitan un control regular.
g)
Conservantes
Para liofilizar se aade leche desnatada en polvo: 45 g/litro de medio de cultivo. Para la reconstitucin de
una vacuna liofilizada se utiliza solucin salina normal. Alternativamente, se utiliza a temperatura ambiente
una solucin molar de sulfato magnsico (248 g por litro). Esta solucin molar protege a los micoplasmas de
la inactivacin por el calor (24). Es importante la pureza de las sales que se emplean.
h)
Los procedimientos para uso en condiciones de campo y la reconstitucin de las vacunas liofilizadas se han
descrito por Provost et al. (24).
Cuando se vacunan animales infectados, pueden aparecer reacciones intensas, como las que tuvieron
lugar recientemente despus de las campaas de vacunacin de emergencia en el este de frica. Por lo
general, estas reacciones se presentan en 2-3 das. Tambin pueden aparecer reacciones locales en el
sitio de la inyeccin despus de 2-3 semanas con la cepa T1/44. Estas reacciones se conocen como
"reaccin de Willems" y comprenden un edema invasivo que lleva a la muerte si no se administra
tratamiento antibitico con tetraciclina o tilosina. La cepa T1sr carece por completo de patogenicidad
residual, lo que supone una alternativa de eleccin a la T1/44, aunque la duracin de la inmunidad es ms
corta. Hubo sospechas de ineficacia de la T1sr para controlar brotes en frica del sur, lo que llev a su
suspensin (29).
La sensibilidad general de una poblacin bovina determinada debe probarse primero vacunando grupos de
muestra (24).
5.
Estas pruebas se deben realizar despus de la reconstitucin de un conjunto de al menos cinco viales de la
vacuna liofilizada con el diluyente recomendado.
a)
Inocuidad
Las pruebas de inocuidad deben realizarse en ganado bovino o cebes, de acuerdo con lo expuesto en la
Seccin C.4.c.
b)
Potencia
Esta prueba se realiza siguiendo el protocolo descrito en la seccin C.4.d. Debido a que la PBC no se
puede reproducir experimentalmente con facilidad, y por su coste, solo se necesita realizar una prueba de
potencia en cada lote de inculo, con tal de que el ttulo sea satisfactorio y que no cambien los parmetros
de produccin.
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Trop., 52, 171179.
*
* *
NB: Existen laboratorios de referencia de la OIE para la Pleuroneumona bovina contagiosa (ver Cuadro en
la parte 3 de este Manual de animales terrestres o consultar la pgina web de la OIE para una lista
190
CAPITULO 2.1.7.
DERMATOSIS NODULAR CONTAGIOSA
RESUMEN
La dermatosis nodular contagiosa de los bvidos (DNC) (Lumpy skin, LSD), knopvelsiekte) es una
enfermedad del ganado debida a poxvirus que se caracteriza por fiebre, ndulos en la piel, en
membranas mucosas y rganos internos, extenuacin, inflamacin de los ndulos linfticos,
edema cutneo, y a veces muerte. La enfermedad tiene importancia econmica porque causa un
descenso en la produccin, particularmente en vacas de leche. Tambin causa daos en la piel.
DNC es producida por cepas de capripoxvirus que son indistinguibles de las que causan la viruela
de la oveja y de la cabra. Sin embargo, DNC tiene una distribucin geogrfica diferente a la viruela
ovina y caprina, lo que sugiere que las cepas de capripoxvirus de bvidos no infectan ni se
transmiten a ovejas y cabras. Se estima que la transmisin del virus productor de DNC se efecta
predominantemente a travs de insectos, y que la transmisin natural por contacto en ausencia de
insectos vectores es poco efectiva. Hasta 1988, esta enfermedad se limitaba al frica sub
sahariana, pero luego se extendi a Egipto. Slo se ha confirmado en laboratorio un brote de DNC
fuera de frica, en 1989 en Israel, que se elimin por sacrificio de todos los animales infectados o
en contacto con ellos, y por vacunacin. Los brotes descritos en 1993 en Bahrain y Reunion no
pudieron confirmarse mediante aislamiento de los virus.
Identificacin del agente: La confirmacin ms rpida de la DNC es la demostracin de los
viriones tpicos de los capripoxvirus en materiales de biopsias o en las costras desecadas usando
el microscopio electrnico de transmisin en combinacin con una historia clnica de la dermatosis
nodular contagiosa generalizada y de inflamacin de los ganglios linfticos superficiales en el
ganado. El capripoxvirus es distinto del parapoxvirus, que causa la estomatitis papular bovina y la
seudoviruela bovina, pero no puede diferenciarse morfolgicamente del de la viruela bovina y del
virus vacunal, que son en ambos casos ortopoxvirus que infectan a los bvidos. Sin embargo,
ninguno de stos producen una infeccin generalizada y ambos son bastante raros en los bvidos.
El virus productor de la DNC crece en cultivos de tejidos de origen bovino, ovino y caprino, aunque
el mejor crecimiento se obtiene utilizando clulas testiculares de cordero. El capripoxvirus produce
un efecto citoptico, y cuerpos de inclusin intracitoplasmticos caractersticos, y difiere del virus
de la seudoDNC (Allertonmamitis herptica), que es un herpesvirus productor de sincitios y
cuerpos de inclusin intranucleares. El antgeno del virus se puede poner de manifiesto en cultivo
de tejidos mediante tincin con inmunoperoxidasa o inmunofluorescencia y el virus se puede
neutralizar utilizando antisueros especficos.
Para la deteccin del antgeno se ha desarrollado un enzimoinmunoensayo (ELISA) usando en la
deteccin un suero policlonal obtenido frente a un recombinante del antgeno inmunodominante del
capripoxvirus. Tambin se ha descrito la deteccin del genoma usando cebadores especficos del
capripoxvirus que corresponden a los genes que codifican las protenas responsables de la fusin
y de la unin.
Pruebas serolgicas: La prueba de neutralizacin vrica representa la tcnica serolgica ms
especfica, pero, debido a que la inmunidad a la infeccin por la DNC es fundamentalmente de tipo
celular, el ensayo no es lo suficientemente sensible como para identificar animales que han tenido
contacto con el virus productor de la DNC y que han desarrollado solo bajos niveles de anticuerpo
neutralizante. Las pruebas de inmunodifusin en gel de agar y las de inmunofluorescencia indirecta
son menos especficas debido a reacciones cruzadas con anticuerpos frente a otros poxvirus. La
tcnica Western blot utilizando la reaccin entre el antgeno P32 del virus de la DNC con sueros
problema es sensible y especfica, pero de realizacin difcil y costosa. El uso de este antgeno,
191
Captulo 2.1.7. Dermatosis nodular contagiosa
expresado por un vector adecuado, en un enzimoinmunoensayo ofrece perspectivas para constituir

una tcnica serolgica aceptable y estandarizada.
Requisitos para las vacunas y los materiales de diagnstico: Todas las cepas de capripoxvirus
examinadas hasta la fecha, bien sean derivadas de ganado vacuno, ovino o caprino, comparten
antgenos inmunizantes. Se han empleado como vacunas vivas cepas atenuadas de origen bovino
y cepas derivadas de ovejas y cabras.
A. INTRODUCCIN
La dermatosis nodular contagiosa de los bvidos (DNC) se detect primero en Zambia en 1928, extendindose a
Botswana en 1943 (15), y luego a Sudfrica, donde infect a ms de ocho millones de cabezas de ganado
causando importantes prdidas econmicas. En 1957 alcanz a Kenia, asociada a un brote de viruela ovina (24).
En 1970, la DNC se extendi hacia el norte por Sudn, y en 1974 se extendi al oeste alcanzando Nigeria,
siendo descrita en Mauritania, Mali, Ghana y Liberia en 1977. Otra epizootia de DNC afect entre 1981 y 1986 a
Tanzania, Kenia, Zimbabwe, Somalia y Camern, con un nivel de mortalidad del 20% en el ganado infectado. Sin
embargo la verdadera dimensin de esta epizootia no est clara y probablemente afect a un rea considerable
de frica central. En 1988, la DNC se estableci en Egipto, y en 1989 se describi en Israel un nico brote. La
DNC debe ser considerada como una enfermedad potencialmente capaz de establecerse fuera de frica. El
mtodo principal de transmisin es mecnico por medio de artrpodos vectores (6, 9).
La gravedad de los signos clnicos de la DNC (Dermatosis nodular contagiosa), o DNC (Lumpy skin, Neethling o
knopvelsiekte), depende de la cepa de capripoxvirus y de la raza del hospedador. Bos taurus es ms susceptible
a la enfermedad que Bos indicus; tambin se ha descrito que el bfalo asitico es susceptible. Dentro de Bos
taurus, la raza Channel Island de piel fina desarrolla una enfermedad mas grave, siendo los terneros lactantes
los que presentan mas riesgo. No obstante, incluso dentro de grupos de ganado de la misma raza mantenidos
juntos en las mismas condiciones, existe una amplia variacin en cuanto a los signos clnicos presentes, que
vara desde una infeccin subclnica hasta la muerte (7). Puede darse el caso de imposibilidad de infeccin de un
grupo entero por el virus, en funcin de la prevalencia del vector.
En animales con infeccin aguda, se presenta fiebre inicial, que puede superar los 41C y persistir durante una
semana. El perodo de incubacin en condiciones de campo no se ha descrito, pero, despus de una
inoculacin, es de 69 das hasta la aparicin de la fiebre. Aparece rinitis y conjuntivitis, y en ganado lechero se
produce una reduccin notable en la produccin. Se desarrollan ndulos de 25 cm de dimetro por todo el
cuerpo, en especial por la cabeza, cuello, ubres y perin. Estos ndulos afectan a la dermis y a la epidermis e
inicialmente pueden exudar suero, aunque en las siguientes dos semanas se convierten en tapones necrticos
que atraviesan todo el grosor de la piel. Todos los ndulos linfticos superficiales aumentan de tamao, los
miembros se vuelven edematosos y el animal tiende a no moverse. Los ndulos que aparecen en las
membranas mucosas de los ojos, la nariz, la boca, el recto, las ubres y los genitales se ulceran rpidamente, y
por entonces todas las secreciones contienen virus DNC. Con la aparicin de los signos clnicos, las descargas
nasales y oculares se vuelven mucopurulentas y puede aparecer queratitis. Tambin se desarrollan ndulos en la
boca, tejido subcutneo y en el msculo, en la trquea y tracto alimentario, sobre todo en el abomaso, y en los
pulmones, desembocando en una neumona primaria y secundaria. Las vacas preadas pueden abortar, y se
han descrito abortos con fetos cubiertos de ndulos. Los toros pueden quedar estriles de modo permanente o
temporal. La recuperacin de la infeccin grave es lenta; el animal queda extenuado, puede presentar neumona
y mamitis, y los tapones necrticos de la piel, que pueden haber sido objeto de ataque por las moscas, se
eliminan dejando profundos huecos en la piel (21).
El virus de la DNC no se transmite a humanos.
1.
Recogida de muestras, envo y preparacin
El material para aislamiento del virus y deteccin del antgeno debe recogerse de los ndulos de la piel, lesiones
pulmonares o ndulos linfticos mediante biopsia o postmortem. Las muestras para aislamiento de virus y la
deteccin de antgeno por enzimoinmunoensayo (ELISA) se deberan recoger en la primera semana de aparicin
de los sntomas clnicos, antes de que se desarrollen anticuerpos neutralizantes (12). Las muestras para
deteccin genmica por la reaccin en cadena de la polimerasa (PCR) pueden obtenerse cuando los anticuerpos
neutralizantes ya estan presentes. No obstante, la presencia de virus se puede evidenciar hasta transcurridos 35
das en lesiones antiguas. Tambin se puede usar para aislar el virus la capa pardusca que aparece en la sangre
192
mantenida en heparina o EDTA (cido etiln diamino tretraactico) durante la fase virmica del DNC (antes de la
generalizacin de las lesiones o dentro de los 4 das de la generalizacin). Las muestras para histologa deben
incluir tejido del rea adyacente y han de ser colocadas inmediatamente despus su recogida en formalina al
10% en un volumen 10 veces superior al volumen de la muestra.
Los tejidos con formalina no necesitan requisitos especiales de transporte. Las muestras de sangre con
anticoagulante para el aislamiento de virus a partir de la capa pardusca deben colocarse inmediatamente en
hielo y procesarse tan pronto como sea posible. En la prctica, las muestras pueden mantenerse a 4C hasta 2
das antes de su posterior manipulacin, pero no deberan congelarse ni mantenerse a temperatura ambiente.
Los tejidos para aislamiento de virus y deteccin de antgeno deben mantenerse a 4C, en hielo o a 20C. Si
resulta necesario transportar las muestras a grandes distancias sin refrigeracin, el medio debe contener glicerol
al 10%; las muestras deben de ser de un tamao suficiente para que el medio no penetre durante el transporte la
parte central de la biopsia, que debera usarse para el aislamiento de virus.
El material para histologa debe prepararse por tcnicas estndar y teirse con hematoxilina y eosina (H&E) (2).
El material de las lesiones para aislamiento de virus y deteccin de antgeno se trocea usando tijeras y pinzas
estriles y luego se pulveriza a mano en un mortero estril con arena estril y un volumen igual de tampn
fosfato salino (PBS) tambin estril que contiene penicilina sdica (1.000 unidades internacionales [UI]/ml, sulfato
de estreptomicina (1 mg/ml), micostatin (100 UI/ml) o fungizona (2.5 g/ml) y neomicina (200 UI/ml). La
suspensin se congela y descongela tres veces y luego se clarifica parcialmente mediante centrifugacin usando
una centrfuga de mesa a 600 g durante 10 minutos. Las capas de color pardusco se preparan a partir de sangre
no coagulada por centrifugacin a 600 g durante 15 minutos, y la capa se extrae con cuidado usando una pipeta
Pasteur estril y se lleva a 5 ml de agua fra doblemente destilada. Despus 30 segundos se aaden 5 ml de
medio de crecimiento fro a doble concentracin y se mezcla. La mezcla se centrifuga a 600 g durante 15
minutos, se elimina el sobrenadante y el precipitado sedimento celular se suspende en 5 ml de medio de
crecimiento, como medio Eagle modificado de Glasgow (GMEM). Despus centrifugar a 600 g otros 15 minutos,
el precipitado sedimento resultante se resuspende en 5 ml de CMEM fresco. Alternativamente, la capa pardusca
se puede separar de una muestra con heparina utilizando un gradiente de Ficoll.
a)
Cultivo
El virus de la DNC crecer en cultivos de tejidos de origen bovino, ovino o caprino, aunque se considera
que los cultivos primarios y secundarios de clulas de testculo de cordero (LT) son las ms adecuadas,
especialmente las procedentes de la raza ovina de lana. La muestra se prepara como antes, es decir, 1 ml
de sobrenadante clarificado o de la capa pardusca se inocula en un frasco de cultivo de 25 cm2 a 37C y se
permite la absorcin durante 1 hora. El cultivo se lava luego con PBS caliente y se recubre con 10 ml de un
medio adecuado, como GMEM, que contenga antibiticos y 2% de suero fetal bovino. Si se dispone de
ellos, tambin se infectan tubos de cultivo de tejidos que contengan clulas LT y un cubreobjetos, o
portaobjetos para cultivo de tejidos.
Los frascos de cultivo se examinan diariamente durante 14 das para observar el efecto citoptico (ECP) y
se reemplaza el medio cuando aparece turbio. Las clulas infectadas desarrollan un ECP caracterstico que
consiste en la retraccin de la membrana celular de las clulas adyacentes, y en un eventual
redondeamiento de las clulas y la marginacin de la cromatina nuclear. Al principio slo se ven pequeas
reas de ECP, a veces tan slo a los 2 das despus de la infeccin; en los siguientes 46 das las reas se
extienden hasta abarcar toda la lmina de clulas. Si no aparece ECP despus 14 das, el cultivo se debe
congelar y descongelar tres veces, y el sobrenadante clarificado se inocula en un cultivo fresco de clulas
LT. Al primer signo de ECP en los frascos, o antes si se usan cubres infectados, se toma un cubre, se fija
con acetona y se tie con H&E. La presencia de cuerpos de inclusin citoplasmticos que sean
eosinoflicos, variables en tamao pero que pueden ser como la mitad del ncleo y rodeados por un halo
claro, constituye un diagnstico de infeccin por poxvirus. El ECP se puede evitar o retrasar incluyendo en
el medio un antisuero especfico antiDNC. El herpesvirus o el virus seudoDNC producen un cuerpo de
inclusin intranuclear de tipo Cowdry A. La formacin de sincitios no es una caracterstica de la infeccin
por capripoxvirus, a diferencia del herpesvirus que causa la seudoDNC.
Algunas cepas de capripoxvirus que causan DNC se han adaptado para crecer en la membrana
corioalantoidea de huevos de gallina embrionados y en clulas de rin de mono verde africano (clulas
Vero). Esto no es recomendable para el aislamiento primario.
Microscopa electrnica
Antes de la centrifugacin, el material de la suspensin de la biopsia original se prepara para su examen en

el microscopio electrnico de transmisin colocando una rejilla hexagonal de malla 400 para microscopa
electrnica, cubierta con una pelcula de carbn activado por descarga en vapor de pentilamida, sobre una
gota de la suspensin colocada sobre parafina o una placa de cera. Despus de 1 minuto, la rejilla se
transfiere a una gota de tampn Tris/EDTA, pH 7,8, durante 20 segundos y luego a una gota de cido
fosfotngstico al 1%, pH 7.2, durante 10 segundos. La rejilla se deseca con papel de filtro, se seca al aire y
193
se coloca en el microscopio electrnico. El virin del capripoxvirus tiene forma de ladrillo, est cubierto por
cortos elementos tubulares y mide aproximadamente 290 x 270 nm. Una membrana que procede de la
clula hospedadora puede rodear algunos de los viriones, y se deben examinar tantos como sea posible
para confirmar su aparicin (19).
Los viriones de los capripoxvirus no se diferencian de los de los ortopoxvirus, pero, aparte del virus vacunal
y del virus de la viruela, que no son comunes en el ganado y no causan infeccin generalizada, ningn otro
ortopoxvirus causa lesiones en el ganado vacuno. No obstante, el virus vacunal puede causar infeccin
generalizada en terneros jvenes inmunocomprometidos. Por el contrario, los ortopoxvirus son una causa
corriente de enfermedades cutneas en el bfalo domstico originando la viruela del bfalo, una
enfermedad que normalmente se manifiesta con lesiones de varioliformes en los pezones, pero que
tambin puede causar lesiones cutneas en otros sitios, como el perin, la zona media de los muslos y la
cabeza. Los ortopoxvirus que causan la viruela del bfalo no pueden distinguirse fcilmente por
microscopa electrnica de los capripoxvirus. Los viriones de los parapoxvirus que producen la estomatitis
papular bovina y la seudoviruela son mas pequeos, de tamao oval y cada uno est cubierto por un nico
elemento tubular continuo que aparenta formar estriaciones sobre el virin. El capripoxvirus es tambin
distinto del herpevirus que provoca la seudoDNC (Allerton mamitis herptica).
b)
Mtodos inmunolgicos
Pruebas con anticuerpos fluorescentes
El antgeno del capripoxvirus puede tambin identificarse en los cubres infectados o en los portas de cultivo
de tejidos usando pruebas con anticuerpos fluorescentes. Los cubres o los portas deben estar lavados y
secos y fijados en acetona fra durante 10 minutos. El mtodo indirecto, en el que se utilizan sueros de
ganado inmune, presenta mucho color de fondo y reacciones no especficas. Sin embargo, se puede
preparar un conjugado directo a partir de sueros de ganado vacuno enfermo (o de ovejas o cabras
enfermas por el capripoxvirus) o a partir de conejos hiperinmunizados con capripoxvirus purificado. Se debe
incluir un cultivo de tejidos no infectado como control negativo ya que pueden causar problemas las
reacciones cruzadas, debidas a la presencia de anticuerpos contra el cultivo celular.
Se ha usado una prueba de inmunodifusin en gel de agar (IGDA) para detectar el antgeno precipitante del
capripoxvirus, pero tiene la desventaja de que este antgeno tambin lo presentan los parapoxvirus. Se
prepara agarosa (al 1%) en tampn borato, pH 8,6, se calienta para disolver, y se vierten 2 ml en un porta
(76 x 26 mm). Cuando el agar se solidifica, se cortan pocillos sobre l para originar una roseta de seis
pocillos alrededor de un pocillo central. Cada pocillo tiene 5 mm de dimetro y debe haber una distancia de
7 mm entre el centro del pocillo central y el centro de cada pocillo perifrico. Los pocillos se llenan del
siguiente modo: a tres pocillos perifricos se aaden 10 l de la suspensin al 10% a partir de las lesiones,
alternando con pocillos que contengan controles positivos de antgeno, mientras que al pocillo central se
aaden 10 l de suero control positivo contra capropoxvirus. Los portas se colocan en una cmara hmeda
a temperatura ambiente durante 48 horas , y se examinan para ver lneas de precipitacin con un
transiluminador. El material ensayado es positivo si aparece una lnea de precipitacin con el suero control
que resulta confluente con la producida por el control positivo de antgeno.
Para preparar el antgeno para la prueba IGDA, se toman dos frascos de cultivo de 125 cm2 con clulas LT,
se infecta uno con el capripoxvirus y se recoge cuando presenta un 90% de ECP (812 das). El frasco se
congela y descongela dos veces, y las clulas se agitan para que se liberen de la superficie del frasco. El
contenido se centrifuga a 4.000 g durante 15 minutos, la mayor parte del sobrenadante se decanta y se
guarda, y el precipitado se resuspende en el resto de sobrenadante. Las clulas se lisan usando un
dispositivo de ultrasonicacin durante aproximadamente 60 segundos. Este homogenado se centrifuga
luego como antes, y el sobrenadante resultante se mezcla con el anteriormente obtenido. El sobrenadante
conjunto se aade a continuacin a un volumen idntico de sulfato amnico saturado a pH 7,4 y se deja a
4C durante 1 hora. Esta solucin se centrifuga a 4.000 g durante 15 minutos, y se recoge el precipitado
resuspendindolo en un pequeo volumen de solucin salina al 0.8% para su uso en la prueba IGDA. El
frasco no infectado se somete al mismo procedimiento para obtener un control de antgeno del cultivo de
tejidos (18).
Enzimoinmunoensayo
Despus la clonacin de la protena estructural P32 del capripoxvirus que es muy antignica, es posible
usar el antgeno recombinante expresado para la produccin de reactivos diagnsticos, incluyendo la
obtencin de antisuero policlonal monoespecfico contra P32 y la produccin de anticuerpos monoclonales
(Mabs). Estos reactivos han facilitado el desarrollo de un ELISA altamente especfico. Utilizando antisuero
de conejo hiperinmune, obtenido mediante inoculacin a conejos de capripoxvirus purificado, el antgeno
del virus presente en suspensiones de biopsias o en sobrenadantes de cultivo de tejidos puede ser
194
inmovilizado en una placa de ELISA. La presencia del antgeno puede as demostrarse utilizando suero de
cobaya, producido contra el grupo especfico de la protena estructural P32, inmunoglobulina anticobaya
comercial obtenida en conejo conjugada con peroxidasa de rbano y una solucin de substrato
cromognico.
c)

Mediante tcnicas serolgicas no es posible distinguir entre cepas de capripoxvirus de ganado vacuno,
ovejas o cabras. Sin embargo, se pueden caracterizar las cepas comparando los fragmentos genmicos
que se generan mediante digestin con el enzima HindIII a partir de sus ADN purificados (1,3,17). Esta
tcnica ha establecido diferencias entre aislamientos realizados en diferentes especies, pero no son slidas
y existe evidencia de la existencia de movimiento de cepas entre especies distintas y de recombinacin de
cepas en condiciones naturales (14).
Se puede utilizar PCR para detectar el genoma del capripoxvirus en muestras de biopsias o de cultivo de
tejidos. Los cebadores para los genes correspondientes a las protenas vricas de unin y de fusin son
especficos para capripoxvirus, y la naturaleza de los productos obtenidos por PCR se puede confirmar
usando los sitios reconocidos por enzimas de restriccin (16). El genoma del virus productor de la DNC
contiene unos 156 genes (23).
2.
Pruebas serolgicas
a)
Neutralizacin de virus
Un suero problema se puede titular frente a una concentracin constante de capripoxvirus (100 DICT50
[50% dosis infectiva en cultivo de tejidos]) o bien una cepa estndar de virus se puede titular frente a una
dilucin constante del suero problema para calcular el ndice de neutralizacin. Debido a variaciones en la
sensibilidad del cultivo de tejidos a los capripoxvirus, y la consiguiente dificultad en asegurar el uso de 100
DICT50 , el mtodo preferido es el ndice de neutralizacin. El mtodo se describe usando una placa de
microtitulacin para cultivo de tejidos con 96 pocillos de fondo plano, pero puede realizarse igualmente en
tubos de cultivo de tejidos con los cambios de volumen adecuados, aunque resulta ms difcil determinar en
tubos los resultados de punto final. Se ha descrito que el uso de clulas Vero en el ensayo de neutralizacin
del virus suministra resultados ms repetitivos.
i)
Los sueros problema, incluyendo un control positivo y un control negativo, se diluyen al 1/5 con medio
Eagle/HEPES (N2hidroxietilpiperazina, cido N2etanosulfnico) y se inactivan a 56C durante 30
minutos.
ii)
A continuacin, se aaden 50 l del primer suero inactivado a los pocillos de las columnas 1 y 2 , de
las filas A hasta la H, en la placa de microtitulacin. El segundo suero se coloca en las columnas 3 y 4,
el tercero en las columnas 5 y 6, el control de suero positivo en las columnas 7 y 8, el control de suero
negativo en las columnas 9 y 10, y se aaden 50 l de Eagle/HEPES sin suero en las columnas 11 y
12 y a todos los pocillos de la fila H.
iii)
Una cepa de referencia de capripoxvirus, normalmente una cepa vacunal que se sepa que crece bien
en cultivo de tejidos, y con un ttulo superior a 6 log10 DICT50 por ml se diluye con Eagle/HEPES en
pequeos recipientes para dar una dilucin seriada de 5.0; 4.0; 3.5; 3.0; 2.5; 2.0; 1.5 log10 DICT50 por
ml (equivalente a 3.7; 2.7; 2.2; 1.7; 1.2; 0.7; 0.2 log10 DICT50 por 50 l).
iv)
Comenzando por la fila G y la preparacin de virus ms diluida, se aaden 50 l de virus a cada

pocillo de esa fila. Esto se repite con cada dilucin de virus, colocando la dilucin de virus de titulacin
mayor en la fila A.
v)
Las placas se cubren y se incuban 1 hora a 37C.
vi)
A partir de monocapas crecidas con anterioridad se preparan clulas LT en una suspensin que
contenga 105 clulas/ml en medio Eagle con antibiticos y 2% de suero fetal bovino. Despus incubar
las placas de microtitulacin, se aaden 100 l de la suspensin celular a todos los pocillos excepto a
los pocillos H11 y H12, que sirven como control para el medio. El resto de los pocillos de la fila H son
los controles de las clulas y del suero.
vii)
Las placas de microtitulacin se cubren e incuban a 37C por 9 das.
viii) Utilizando un microscopio invertido, las monocapas se examinan diariamente a partir del da 4 para
observar ECP. No debera apreciarse ECP en las clulas de la fila H. Utilizando la cepa vacunal 0240
KSGP de capripoxvirus, la lectura final se hace al da 9, y el ttulo del virus en cada titulacin por
duplicado se calcula segn Krber (1931). Si se deja ms tiempo, aparece de modo invariable un
195
aumento de virus debido a que el virus que fue en principio neutralizado parece disociarse del
anticuerpo.
ix)
Interpretacin de los resultados: El ndice de neutralizacin es el logaritmo del ttulo de la diferencia

entre el ttulo del virus en el suero negativo y en el suero problema. Un ndice > 1.5 se considera
positivo. El ensayo se puede hacer ms sensible si se examina el suero del mismo animal antes y
despus de la infeccin. Debido a que la inmunidad a los capropoxvirus est predominantemente
mediada por clulas, un resultado negativo, en especial despus una vacunacin en que la respuesta
es necesariamente suave, no implica que el animal del que deriva el suero no est protegido.
Se ha descrito un mtodo con virusconstante y suerovariable empleando diluciones de suero del
orden de 1/5 a 1/500 y clulas de msculo fetal bovino. Como estas clulas tienen menor sensibilidad
al capripoxvirus que las clulas LT, se evita el problema del aumento de virus cuando el ensayo se
deja ms tiempo.
Los anticuerpos al capripoxvirus se pueden detectar a los dos das de la aparicin de los sntomas
clnicos. Permanecen detectables durante unos 7 meses, pero normalmente se aprecia el ttulo ms
alto entre los das 21 y 42.
b)

La prueba IGDA no es recomendable como prueba serolgica en el diagnstico de la DNC por la reaccin
cruzada con anticuerpos contra los virus de la estomatitis papular bovina y de la seudoviruela. Una
consecuencia de estas reacciones cruzadas es la aparicin de resultados positivos falsos. La escasa
sensibilidad de la prueba tambin puede conducir a resultados negativos falsos.
c)

Para la prueba de inmunofluorescencia indirecta se puede usar un cultivo de tejidos infectado por
capripoxvirus crecido sobre cubres o sobre portas de los usados en microscopa. Se debe incluir en la
prueba un cultivo de tejidos no infectado, as como un control de suero positivo y negativo. Los cultivos
infectados y el control se fijan en acetona a 20C durante 10 minutos y se mantienen a 4C. Las diluciones
del suero problema se realizan en PBS, empezando a 1/20 o 1/40, y los positivos se identifican usando una
gammaglobulina antibovina conjugada con isotiocianato de fluorescena. El ttulo de anticuerpos puede
superar 1/1000 despus la infeccin. Los sueros pueden ser probados a 1/50 y 1/500. Pueden existir
reacciones cruzadas con el virus orf (dermatitis pustular contagiosa de la oveja), el de la estomatitis papular
bovina y quizs con otros poxvirus.
d)
Anlisis Western blot

La tcnica de Western blot realizada con sueros problema frente a lisados de clulas infectadas por
capripoxvirus representa un sistema sensible y especfico para detectar anticuerpos contra las protenas
estructurales del capripoxvirus, aunque la prueba resulta costosa y difcil de realizar.
Las clulas LT infectadas por capripoxvirus deben recogerse cuando se aprecia un 90% de ECP, se
congelan y descongelan tres veces, y los restos celulares se sedimentan por centrifugacin. El
sobrenadante se decanta, y las protenas se preparan para separacin por SDS/PAGE (dodecil sulfato
sdico/electroforesis en gel de poliacrilamida). Se recomienda un sistema vertical de gel discontinuo,
usando gel concentrador con acrilamida al 5% en Tris (125 mM), pH 6,8 y SDS (0,1%), y gel de resolucin
con acrilamida (1012.5%) en Tris (560 mM), pH 8,7, y SDS (0,1%), empleando como tampn de desarrollo
un tampn de glicina conteniendo Tris (250 mM), glicina (2M), y SDS (0.1 M). Las muestras de
sobrenadante se preparan por ebullicin durante 5 minutos con un tampn de lisis apropiado antes de su
carga en la electroforesis. Alternativamente, el antgeno derivado del cultivo de tejidos puede ser
reemplazado por virus purificados o por antgenos recombinantes.
Se deben correr en paralelo con las protenas de la muestra una serie de marcadores de peso molecular.
Las protenas separadas en el gel despus la SDS/PAGE se transfieren electroforticamente a una
membrana de nitrocelulosa (NCM). Despus de la transferencia, la NCM se lava exhaustivamente con PBS
y se bloquea con 3% de seroalbmina bovina (BSA) en PBS, o con 5% de leche en polvo desnatada en
PBS, en un agitador rotatorio a 4C durante toda la noche. A continuacin, la NCM se puede trocear
empleando un aparato comercial para permitir el ensayo simultneo de mltiples muestras de suero, o se
puede cortar en tiras y cada una de ellas incubarse luego por separado. La NMC se lava cuidadosamente
con cinco cambios de PBS durante 5 minutos en un agitador rotatorio y luego se incuba a temperatura
ambiente durante 1,5 horas en un agitador con el suero apropiado a una dilucin 1/50 en tampn
196
bloqueante (3% BSA y 0.05% de Tween 20 en PBS; o 5% de leche en polvo desnatada y 0,05% de Tween
20 en PBS). La membrana se lava de nuevo exhaustivamente y se incuba (en tampn bloqueante) con
antiinmunoglobulinas de la especie conjugadas con peroxidasa de rbano a una dilucin determinada por
la titulacin. Despus una incubacin posterior a temperatura ambiente durante 1,5 horas, se lava la
membrana y se aade una solucin de tetrahidrocloruro de diaminobenzidina (10 mg en 50 ml de 50mM
Tris-HCl, pH 7,5, y 20 l de perxido de hidrgeno al 30% [v/v]). Esto se incuba luego durante
aproximadamente 37 minutos a temperatura ambiente en un agitador con observacin constante, y la
reaccin se detiene lavando con PBS antes de que se desarrolle un excesivo color de fondo. En cada
ocasin se debera usar un suero negativo y positivo como control.
Las muestras que se consideran positivas en el ensayo y el control positivo producirn un modelo de
bandas que corresponde a la reaccin frente a protenas de peso molecular 67, 32, 26, 19 y 17 kDa que
son las principales protenas estructurales del capripoxvirus mientras que las muestras de suero negativo
no reaccionarn conforme a este modelo. Un suero hiperinmune preparado contra parapoxvirus (estomatitis
papular bovina, seudoviruela) reaccionar con algunas de las protenas de capripoxvirus, pero no con la
protena de 32 kDa que es especfica de capripoxvirus.
e)
Enzimoinmunoensayo
Se ha desarrollado una tcnica ELISA para capripoxvirus usando la protena estructural expresada P32 del
capripoxvirus y Mabs obtenidos contra la protena P32 (8).

Se han usado dos cepas atenuadas de capripoxvirus como vacunas para el control especfico de la DNC (3, 4):
una cepa de poxvirus de oveja y cabra de Kenia mantenida en cultivo durante 18 pases en clulas LT o clulas
de msculo fetal bovino, y una cepa de Sudfrica, despus 60 pases de cultivo en clulas de rin de cordero y
20 pases en membrana corioalantoidea de huevos embrionados de gallina. Todas las cepas de capripoxvirus
examinadas hasta la fecha, bien sean de origen bovino, ovino o caprino, comparten un sitio comn de
neutralizacin, de modo que los animales que se recuperan de la infeccin por una cepa se hacen resistentes a
la infeccin por cualquier otra cepa. Por ello, es posible proteger al ganado contra la DNC utilizando cepas de
capripoxvirus procedentes de ovejas o cabras (10). En 1989 y 1990 la cepa Rumana de la vacuna de la viruela
ovina se emple para ayudar a controlar el brote de la DNC en Egipto (20). Sin embargo, resulta esencial realizar
ensayos controlados antes de introducir una cepa vacunal no utilizada normalmente en el ganado, sobre todo
cuando se usan las razas ms susceptibles en el perodo de lactancia. La proteccin despus la vacunacin es
probablemente duradera, pero a medida que la inmunidad desaparece, puede ocurrir una replicacin localizada
de capripoxvirus en el lugar de inoculacin, aunque el virus no llegar a tener una extensin generalizada. Las
dos cepas de capripoxvirus que se han utilizado rutinariamente como vacunas pueden producir una fuerte
reaccin local en el sitio de inoculacin en razas de Bos taurus, que algunos propietarios consideran inaceptable.
Esto ha desalentado el uso de vacunas pese a que las consecuencias de un brote de la DNC son con seguridad
mas graves.
Se est desarrollando una nueva generacin de vacunas que emplea el genoma de los capripoxvirus como un
vector para genes de otros patgenos de rumiantes, por ejemplo genes de los virus de la peste bovina y de la
peste de pequeos rumiantes. La vacuna recombinante proporcionar proteccin contra la DNC y contra la peste
bovina mediante una nica vacunacin (22).
1.
Control del inculo
a)

La cepa de capripoxvirus usada en la produccin de vacunas debe estar acompaada de una historia que
recoja su origen y sus pases en cultivo de tejidos o en animales. Debe ser segura en cuanto a su uso en
todas las razas de ganado en las que se pretende emplearla, incluyendo animales gestantes. Tambin
debe ser no transmisible, permanecer atenuada despus posteriores pases en cultivo de tejidos, y
proporcionar una proteccin completa frente al desafo de cepas virulentas naturales durante un mnimo de
1 ao. Se debe preparar y almacenar una cantidad de inculo original del virus vacunal para disponer de
inculos de trabajo repetitivos para la produccin regular de la vacuna.
b)
Mtodo de cultivo
El inculo de vacuna debe ser liofilizado y guardado en viales de 2 ml a 20C. Se puede guardar en estado
hmedo a 20C, pero entonces es ms estable a 70C o a temperatura inferior. Para un rendimiento
197
ptimo, el virus debera ser cultivado en cultivos primarios o secundarios de clulas LT procedentes de
oveja de lana. Tambin pueden emplearse clulas Vero.
c)

Los lotes de inculo deben ser:
i)
Puros: Libres de virus ajenos, en particular de pestivirus, tal como los virus de la enfermedad de la
frontera y de la diarrea vrica bovina, y libres de contaminacin por bacterias, hongos y/o
micoplasmas.
ii)
Seguros: Producir una reaccin clnica mnima en todas las razas de ganado cuando se administran
por la va recomendada.
iii)
Eficaces: Estimuladores de inmunidad completa frente a la DNC en todas las razas de ganado durante
al menos 1 ao.
Las pruebas necesarias se describen en la Seccin C.4.
2.
Mtodo de produccin
Los lotes de vacuna se producen en monocapas frescas de cultivos secundarios de clulas LT. Se reconstituye
un vial de inculo con GMEM y se inocula sobre una monocapa de clulas LT que previamente se ha lavado con
PBS templado, y se permite la absorcin durante 15 minutos a 37C antes de aadir ms GMEM. Despus 4
6 das, se apreciar un ECP generalizado (5070%). El cultivo se congela y descongela tres veces, y se extrae la
suspensin centrifugndola a 600 g durante 20 minutos. Antes de la recogida, se debe examinar el cultivo para
detectar cualquier evidencia de ECP no especfica, turbidez del medio o cambio en el pH del medio. Se puede
necesitar un segundo pase para producir el virus suficiente para formar un lote productivo (para obtener
106 dosis se necesita la produccin de 5 frascos de cultivo de 175 cm2).
El proceso se repite y las cosechas de frascos numerados individualmente se mezclan cada una por separado
con un volumen igual de 5% de hidrolizado de lactoalbmina estril y 10% de sacarosa, y se transfieren a
botellas con numeracin individual para almacenamiento a 20C. Antes de la conservacin, se retiran 0,2 ml de
cada botella para control de esterilidad. Se extraen otros 0,2 ml adicionales; se obtiene una mezcla de 2 ml para
uso en titulacin de virus, a partir de muestras de 0,2 ml tomadas de 10 botellas. Se debe llevar un registro
escrito de todos los procedimientos para todos los lotes de vacunas.
3.
Control interno
Clulas: Las clulas deben proceder de los testculos de corderos jvenes sanos de una manada de ovejas de
lana que est exenta de priones (scrapie). Normalmente se suelen subcultivar con xito hasta diez veces.
Cuando se usan para produccin de vacunas, se deben crecer en paralelo cultivos control no infectados que se
mantienen durante al menos un pase adicional para observacin posterior. Deben ser analizados para descartar
la presencia de cepas no citopticas de virus de la diarrea vrica bovina o de la enfermedad de la frontera
mediante tcnicas de inmunofluorescencia o inmunoperoxidasa. Si resulta posible, se deben preparar y analizar
las clulas antes de la produccin de vacunas, y mantener un stock estril en DMSO (dimetil sulfxido)
conservado en nitrgeno lquido (alcuotas de 12 ml conteniendo 20 x 106 clulas /ml). El suero empleado en el
medio de crecimiento debe carecer de anticuerpos frente a capripoxvirus y de contaminacin con pestivirus.
Virus: El inculo de virus y la vacuna final deben valorarse en tubos de cultivo de tejidos o placas de
microtitulacin. La dosis de campo mnima recomendada de las vacunas de Kenia y de Sudfrica es
3,5 log10DICT50, aunque la dosis protectora mnima es 2,0 log10 DICT50. El capripoxvirus es muy susceptible a la
inactivacin por la luz solar, y se deben tomar medidas para evitar la prdida de actividad en condiciones de
campo. La dosis de campo recomendada en bvidos para la vacuna Rumana de viruela ovina es 2,5 log10dosis
infectivas en la oveja (SID50), y la dosis recomendada para bvidos de la cepa adaptada RM65 de la vacuna
Rumana de la viruela ovina es 3 log10DICT50 (11).
Se deben examinar muestras de vacunas para descartar la presencia de virus no deseados incluyendo cepas
citopticas y no citopticas de pestivirus, y se deberan mezclar con un suero inmune de alto ttulo frente a
capripoxvirus que se haya visto antes que sea negativo para anticuerpos frente a pestivirus, a fin de evitar que el
virus mismo de la vacuna interfiera en la prueba. La vacuna puede mantenerse a 20C hasta que se completen
198
todas las pruebas de esterilidad y de titulacin, y despus debe ser liofilizada. Se realiza una titulacin posterior
en cinco viales de las preparaciones liofilizadas escogidas al azar para confirmar el nivel de virus.
4.
Control de lotes
a)
Esterilidad
Las pruebas para esterilidad y ausencia de contaminacin con otros materiales biolgicos pueden
encontrarse en el Captulo I.1.5.
b)
Seguridad y eficacia
Seis cabezas de ganado de sensibilidad a la DNC conocida se confinan en una unidad animal amplia de
alto nivel de contencin y se recogen muestras de suero. Cinco viales escogidos al azar de la vacuna
liofilizada se reconstituyen con PBS estril y se mezclan. Dos cabezas se inoculan con 100 veces la dosis
de campo de la vacuna, el resto de la vacuna se diluye con PBS estril y se inoculan subcutneamente dos
cabezas de ganado con la dosis de campo recomendada. Las restantes dos cabezas son los animales
control. Los animales se examinan clnicamente todos los das y se anotan sus temperaturas rectales. El
da 21 despus la inoculacin se toman de nuevo muestras de suero y se infectan mediante inoculacin
intradrmica con una cepa virulenta conocida de capripoxvirus. Se anota la respuesta clnica durante los
siguientes 14 das. Los animales control deberan desarrollar los sntomas clnicos tpicos de la DNC,
mientras que no debera haber reaccin sistmica o local en los vacunados, excepto una reaccin de
hipersensibilidad tarda, que debe desaparecer a los 4 das. Se toman de nuevo muestras de suero a los
30 das de la vacunacin. Las muestras de suero del da 21 se analizan para detectar seroconversin
respecto a enfermedades vricas seleccionadas que pudieran haber contaminado la vacuna, y las muestras
de los das 0 y 30 se comparan para confirmar la ausencia de anticuerpos frente a pestivirus. Debido a la
variable respuesta del ganado a la infeccin por la DNC, puede no observarse una enfermedad
generalizada en los animales control, aunque debera presentarse una amplia reaccin local.
La vacuna totalmente reconstituda tambin se prueba en ratones y cobayas. Dos cobayas se inoculan
intramuscularmente con 0,5 ml en la pata trasera, y dos cobayas y seis ratones se inoculan
intraperitonealmente con 0,5 ml y 0,1 ml, respectivamente. Otros dos cobayas y cuatro ratones se
mantienen como controles no inoculados. Los animales se observan durante tres meses, se sacrifican y se
realiza un examen. No debera haber evidencia de patologa debida a la vacuna.
c)
Pruebas de potencia
Las pruebas de potencia en el ganado deben realizarse para cepas vacunales de capripoxvirus si no se
conoce la dosis mnima inmunizante. Esto se lleva a cabo normalmente comparando el ttulo de un virus de
prueba en el costado de animales vacunados y de animales control. Despus de la vacunacin, los flancos
de al menos tres animales y tres controles se afeitan para eliminar el pelo. Se preparan diluciones
logartmicas decimales del virus prueba en PBS estril y se inoculan intradrmicamente seis diluciones (0,1
ml por inculo) a lo largo de la longitud del costado; cuatro rplicas de cada dilucin se inoculan ms abajo
del costado. Se desarrollar un hinchamiento edematoso posiblemente en todos los 24 puntos de
inoculacin en los animales control, aunque habr poca o nula reaccin en los cuatro sitios de los inculos
ms diludos. Los animales vacunados deben desarrollar una reaccin inicial de hipersensibilidad en los
sitios de inoculacin a las 24 horas, que remiten con prontitud. Pueden aparecer pequeas reas de
necrosis en el sitio de inoculacin del virus de prueba ms concentrado. Se calcula el ttulo del virus prueba
para animales vacunados y animales control; una diferencia > 2.5 log10 en el ttulo logartmico se considera
como evidencia de proteccin.
d)
Despus la vacunacin, la inmunidad frente al virus natural virulento dura dos aos con la cepa de Kenia y
tres aos con la vacuna de Sudfrica, y la proteccin contra una infeccin generalizada despus de
inoculacin intradrmica es eficaz para toda la vida. La duracin de la inmunidad producida por otras cepas
vacunales debe ser establecida en bvidos realizando ensayos controlados en un medio en el que no haya
posibilidad de que las cepas naturales de capripoxvirus de campo interfieran los resultados.
e)
Estabilidad
Las preparaciones de vacuna la DNC adecuadamente liofilizadas, particularmente aquellas que contienen
un agente protector, como sacarosa e hidrolizado de lactoalbmina, son estables durante ms de 25 aos
si se guardan a 20C, y durante 24 aos si se almacenan a 4C. Hay evidencias de que pueden
199
permanecer estables a temperaturas ms elevadas, pero no se han descrito experimentos controlados de

larga duracin.
f)
Conservantes
Las preparaciones liofilizadas no requieren mas que un conservante, como sacarosa o hidrolizado de
lactoalbmina.
g)
No existen ms precauciones que las descritas anteriormente para esterilidad y ausencia de agentes no
deseados. Las cepas de la DNC no constituyen un riesgo para la salud humana.
5.
a)
Inocuidad
Se debe realizar pruebas de inocuidad en el producto final de cada lote como se indica en la Seccin C.4.b.
b)
Potencia
Una vez que se ha determinado la potencia de la cepa particular usada para la produccin de vacuna en
cuanto a la dosis mnima requerida para producir inmunidad, no es necesario repetir esto en el producto
final de cada lote, con tal que se haya determinado el ttulo del virus presente.
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24. WEISS K.E. (1968). Lumpy skin disease. Virol. Monogr., 3, 111131.
*
* *
NB: Existen laboratorios de referencia de la OIE para la Dermatosis nodular contagiosa (ver Cuadro en la
201
CAPITULO 2.1.8.
FIEBRE DEL VALLE DEL RIFT
RESUMEN
La fiebre del Valle del Rift (FVR) es una zoonosis aguda o hiperaguda de rumiantes domsticos de
frica. Est causada por un nico serotipo de un bunyavirus del gnero Phlebovirus que es
transmitido por mosquitos. La enfermedad se presenta en condiciones climticas que favorecen la
reproduccin de los mosquitos vectores y se caracteriza por lesiones hepticas. La enfermedad es
ms grave en ovejas, cabras y ganado bovino, en los que origina abortos en animales gestantes y
una alta tasa de mortalidad en los recin nacidos. Los animales adultos no gestantes, aunque son
susceptibles a la infeccin, son ms resistentes a las manifestaciones clnicas de la enfermedad.
Existe una amplia variacin en la susceptibilidad al FVR entre animales de distinto genotipo.
Aquellas razas o cepas que son exticas en frica o que proceden de reas donde la FVR no es
endmica, tienden a ser ms susceptibles. Los camellos sufren una infeccin asintomtica por
FVR, pero las tasas de aborto pueden ser tan altas como en el ganado bovino.
Los humanos resultan sensibles a la infeccin mediante contacto con material infectado o por
picaduras de mosquito. La infeccin humana por vectores es una caracterstica llamativa en pases
con una poblacin relativamente pequea de animales hospedadores. En tales reas, la FVR
puede manifestarse primero en humanos. Ha causado enfermedad grave en personal de
laboratorio y debe ser manejado con un alto nivel de bioseguridad (13,15). Se recomienda que el
personal de laboratorio est vacunado.
Identificacin del agente: el virus FVR representa un nico serotipo de un bunyavirus del gnero
Phlebovirus y tiene las propiedades morfolgicas y fisicoqumicas tpicas de los bunyavirus. El
virus tiene un genoma segmentado con ARN de una sola cadena y polaridad negativa y consta de
tres segmentos: L (grande), M (medio) y S (pequeo), cada uno de los cuales est contenido en
una nucleocpsida separada dentro del virin. El segmento S es un ARN de doble sentido, es
decir, presenta codificacin bidireccional (9).
El virus se puede aislar de la sangre, recogida preferentemente con anticoagulante, durante la fase
febril de la enfermedad, o del hgado, bazo y tejidos cerebrales de animales muertos o de los
rganos de fetos abortados. Los aislamientos primarios se hacen normalmente en cultivos
celulares de varios tipos, tales como clulas de rin de mono verde africano (clulas Vero),
clulas de rin de hmster neonato, retculo de embrin de pollo (CER: clulas desarrolladas por
Tsunemasa Motohashi en el Nippon Institute for Biological Science, Tokio, Japn) o en clulas
primarias de origen ovino o bovino. Alternativamente, para el aislamiento primario del virus se
pueden usar hmsteres, ratones adultos o lactantes, huevos de gallina embrionados o corderos de
dos das de edad.
Se puede efectuar un diagnstico rpido usando como antgeno el sobrenadante de muestras
homogenizadas en pruebas de neutralizacin vrica (NV); por tincin inmunofluorescente de frotis
de hgado, bazo, cerebro o cultivos celulares infectados; o por demostracin del virus en el suero
tomado durante la fase febril de la enfermedad mediante enzimoinmunoensayo o por
inmunodifusin.
La presencia de lesiones histopatolgicas caractersticas en el hgado sirve de ayuda al
diagnstico.
Pruebas serolgicas: Los animales infectados desarrollan anticuerpos especficos que pueden
ser demostrados por NV a los 3 das despus de la infeccin o por enzimoinmunoensayo a los 67 das, y por inhibicin de la hemaglutinacin. Otras pruebas serolgicas menos usadas incluyen
inmunofluorescencia, fijacin de complemento e inmunodifusin.
202
Captulo 2.1.8. Fiebre del Valle del Rift
Requisitos para las vacunas y los materiales de diagnstico: Las vacunas con virus vivos y los
antgenos para uso en pases donde FVR es endmica o en otros durante brotes epidmicos,
deben prepararse a partir de cepas no patgenas de virus FVR crecidas en cultivos celulares de
ratn o atenuadas por mutacin. La cepa de FVR atenuada por mutacin no se encuentra todava
en fase recomendable para su uso.
En pases que estn libres del virus FVR, las vacunas y las pruebas diagnsticas deben limitarse a
aquellas en las que se emplea virus inactivado. Se pueden obtener cepas adecuadas de virus en el
Laboratorio de Referencia para FVR de OIE (vase Cuadro presentada en la Parte 3 de este
Manual).
A. INTRODUCCIN
La Fiebre del Valle del Rift (FVR) es una enfermedad febril zoonsica aguda o hiperaguda, transmitida por
mosquitos, y causada por un virus de la familia Bunyaviridae, gnero Phlebovirus. Normalmente se presenta en
forma epizotica en extensas reas de un pas despus de fuertes lluvias e inundaciones, y se caracteriza por
altas tasas de abortos y mortalidad neonatal, principalmente en ovejas, cabras y ganado bovino. La
susceptibilidad al FVR vara considerablemente en razas diferentes. Algunos animales autctonos de frica
muestran slo infecciones asintomticas, mientras que los forneos o de otras razas sufren una manifestacin
clnica grave con mortalidad y aborto. Los animales susceptibles de mayor edad no gestantes y algunas otras
especies no muestran signos de enfermedad. Los camellos se han relacionado con frecuencia con las epidemias
de FVR en el este de frica y Egipto. La enfermedad clnica no aparece en camellos adultos, pero se presentan
abortos y se han observado algunas muertes postnatales tempranas.
Los sntomas de la enfermedad suelen ser poco especficos, haciendo difcil el reconocimiento de casos
individuales (5-8, 16, 28). Sin embargo, es caracterstica la existencia de numerosos abortos y de
mortalidad entre animales jvenes, junto a la enfermedad en humanos. La FVR tiene un perodo de incubacin
corto: 12-36 horas en corderos. Puede aparecer una fiebre bifsica de hasta 41C, y la fiebre permanece alta
hasta poco antes de la muerte. Los animales afectados muestran decaimiento, poca tendencia al desplazamiento
o a la alimentacin, y pueden presentar hinchazn en los ndulos linfticos superficiales y dolor abdominal. Los
corderos raramente sobreviven ms de 36 horas tras la aparicin de los signos de enfermedad. Los animales
mayores de 2 semanas pueden morir con manifestaciones agudas, hiperagudas o desarrollar una infeccin
asintomtica. Algunos animales pueden regurgitar la ingesta y presentar diarrea hemorrgica o sanguinolenta de
olor nauseabundo junto con descargas nasales mucopurulentas con restos de sangre. A veces se puede
observar ictericia, particularmente en los bvidos. Adems de estos sntomas, el ganado adulto puede presentar
lagrimeo, salivacin y falta de produccin lctea. En ovejas gestantes, la mortalidad y la frecuencia de aborto
varan del 5% a casi el 100% en diferentes brotes y en diferentes manadas. La tasa de muerte en el ganado
vacuno es normalmente inferior al 10%.
Las lesiones hepticas de la FVR son muy similares en todas las especies, variando principalmente con la edad
del individuo infectado (6). Las lesiones ms notables se presentan en fetos abortados y corderos recin nacidos
y consisten en un aumento de tamao moderado o grande del hgado que se presenta blando y sin consistencia,
con color que vara de marrn amarillento a marrn rojizo y manchas irregulares de congestin. En el
parnquima, siempre se presentan numerosos focos necrticos de color blanco grisceo, pero que pueden no
ser fcilmente discernibles. En la oveja adulta, las lesiones son menos graves y aparecen focos necrticos
distribuidos por todo el parnquima de color rojizo o blanco grisceo. Por lo general, la pared de la vescula biliar
presenta hemorragias y edema. Las lesiones hepticas en los corderos se acompaan casi siempre de
numerosas hemorragias pequeas en la mucosa del rumen. El contenido del intestino delgado y del rumen es de
color chocolate oscuro a consecuencia de la presencia de sangre parcialmente digerida. En todos los animales,
el bazo y los ndulos linfticos perifricos se inflaman, estn edematosos y pueden presentar petequias.
A nivel microscpico, la lesin ms evidente de la FVR tanto en animales como en humanos es la necrosis
heptica. En los fetos y neonatos de ganado vacuno y ovino, los focos necrticos consisten en agregados
densos de restos celulares y nucleares, algo de fibrina y unas cuantas clulas inflamatorias. Existe una
importante necrosis ltica en la mayora de los hepatocitos y se pierde la arquitectura normal del hgado. En casi
el 50% de los hgados afectados, se encuentran cuerpos de inclusin intranuclear que son eosinoflicos y ovales
o bacilares. Tambin se observa mineralizacin de los hepatocitos necrosados. En los animales adultos, la
necrosis heptica es menos difusa y en las ovejas la ictericia es mas frecuente que en los corderos (26).
En humanos, las infecciones por FVR son normalmente asintomticas o asociadas a una manifestacin no fatal
similar a la gripe que vara de moderada a grave (15). Una minora de pacientes puede desarrollar lesiones
oculares, encefalitis o una enfermedad heptica grave con manifestaciones hemorrgicas, que, por lo general, es
fatal. En humanos, el virus FVR ha causado infeccin grave entre personal de laboratorio. La plantilla debe ser
vacunada y trabajar con un nivel 3 de contencin, en condiciones de un nivel 4 de contencin, o llevar proteccin
203
respiratoria. Se necesita tener un cuidado especial cuando se trabaja con animales infectados o cuando se
realizan anlisis post-mortem (ver Captulo I.1.6. Seguridad humana en los laboratorios veterinarios de
microbiologa).
No se han demostrado diferencias antignicas significativas entre aislamientos de FVR y cepas cultivadas en
laboratorio de muchos pases, pero se han visto diferencias en cuanto a patogenicidad (27).
La infeccin en humanos a travs de mosquitos vectores es una caracterstica propia de pases que, como
Egipto, tienen una poblacin relativamente escasa de animales hospedadores y una gran poblacin de
mosquitos.
La FVR se presenta normalmente como epizootias en frica, que pueden incluir varios pases en una regin
aislada y al mismo tiempo. Estas manifestaciones siguen a ciclos peridicos de lluvias excepcionalmente fuertes
que pueden ocurrir muy raramente en zonas semiridas (ciclos de 25-35 aos), o ms frecuentemente (ciclos de
5-15 aos) en praderas de la sabana. En perodos entre epizootias puede ocurrir un bajo nivel indetectable de
FVR. Se debe sospechar la existencia de FVR cuando a lluvias extraordinariamente fuertes sigue la presentacin
de abortos junto a una enfermedad fatal caracterizada por necrosis y hemorragias en el hgado, que afecta sobre
todo a corderos, cabritos y terneros, y que es paralela a la aparicin de una enfermedad semejante a la gripe en
trabajadores de granjas y personal que maneja carne cruda.
Cuando existen sospechas de que se manipula carne y muestras de tejido infectadas por el virus FVR se deben
utilizar medidas preventivas para proteger a los trabajadores de la infeccin.
1.
El virus FVR se puede aislar del suero y de la sangre recogida con anticoagulante durante la fase febril de la
enfermedad, del hgado, del bazo, y del cerebro de animales que hayan muerto, o de fetos abortados.
Normalmente el aislamiento primario se realiza en hmsteres, ratones jvenes o adultos, o en cultivos celulares
de varios tipos.
a)
Cultivo
Para el aislamiento de virus debe disponerse de aproximadamente 5 ml de sangre recogida durante el
estado febril de la enfermedad o unos 5 g de hgado, bazo o cerebro recogidos tras la muerte. Las muestras
deben mantenerse a 0-4C durante el transporte. Si es probable que dicho transporte dure ms de 24
horas, la muestra se debe congelar y enviar en hielo seco.
Se suspende aproximadamente 1 g de tejido homogenizado al 1/10 en medio de cultivo celular o solucin
salina tamponada, pH 7.5, conteniendo penicilina sdica (1.000 Unidades Internacionales [UI]/ ml), sulfato
de estreptomicina (1 mg/ml), micostatin (100 UI/ ml) o fungizona (2.5 g/ ml). La suspensin se centrifuga a
1.000 g durante 10 minutos y el sobrenadante lquido se inyecta intracerebralmente en ratones de 1-5 das
o intraperitonealmente en hmsteres o ratones adultos. Los ratones jvenes morirn o estarn claramente
enfermos al da 2. Los ratones adultos muestran signos de afeccin 1-3 das ms tarde. Aunque los
animales de laboratorio preferidos son los ratones y hmsteres, tambin se pueden usar corderos y huevos
de gallina embrionados.
Para el cultivo del virus de la FVR pueden utilizarse varias clulas en monocapa, entre las que se incluyen
clulas de rin de mono verde africano (Vero), rin de hmster neonato (BHK), retculo de embrin de
pollo (CER: clulas desarrolladas por Tsunemasa Motohashi en el Nippon Institute for Biological Research,
Tokio, Japn; recaracterizada como una lnea celular de hmster) (3) y clulas primarias de rin o testculo
de ternero y cordero, que se inoculan con 1 ml de sobrenadante de la muestra y se incuban a 37C durante
1 hora . Se aconseja inocular tambin algunos cultivos con una dilucin 1/100 del inculo. Con esto se evita
la produccin de partculas defectivas que se produce con el uso de incula con muy alta concentracin de
virus. Tambin deben prepararse algunos tubos con cubreobjetos. Los cultivos se lavan con tampn fosfato
salino a temperatura ambiente y se recubren con medio que contiene 2% de suero exento de anticuerpos
contra FVR. Los cultivos se observan microscpicamente durante 5-6 das. El virus FVR produce un efecto
citoptico (ECP) caracterizado por provocar una ligera redondez en las clulas y a continuacin la
destruccin de toda la monocapa celular en 12-24 horas. La identificacin especfica del antgeno del virus
FVR se puede realizar 18-24 horas tras la infeccin mediante tincin por inmunofluorescencia de las
preparaciones en los cubres.
204
El virus tambin puede ser detectado por inmunofluorescencia en frotis de hgado, bazo y cerebro. A veces
se puede hacer un diagnstico rpido demostrando la presencia del antgeno vrico en tejidos o sueros de
animales febriles por pruebas de fijacin de complemento o de inmunodifusin en gel de agar (IGDA).
Tambin se puede lograr un diagnstico rpido mediante deteccin del ARN vrico usando una reaccin en
cadena de la polimerasa con trascripcin inversa (RT-PCR).
b)

La prueba IGDA es de utilidad en laboratorios sin disponibilidad de servicio de cultivo de tejidos. Se
homogeniza aproximadamente 1 gramo de tejido, preferentemente hgado, y se hace una suspensin al 1020% en tampn borato salino, pH 9,0. El material se centrifuga a 1.000 g y el sobrenadante se usa en la
prueba. Las versiones de micro-IGDAs se realizan en portas estndar para microscopa que se cubren con
3 ml de agarosa al 1% en tampn borato salino. Se preparan diseos de seis pocillos perifricos y un pocillo
central que se llenan con los reactivos del siguiente modo: un suero positivo, preferentemente hiperinmune,
en el pocillo central, control positivo de antgeno en los pocillos 1 y 4, tejidos problema en los pocillos 2 y 5,
y tejidos negativos en los pocillos 3 y 6. Se debe formar una lnea continua de precipitado entre el antgeno
control y el suero positivo que debera extenderse hasta incluir una lnea entre el tejido problema y el suero
en caso de la prueba que fuera positiva.
c)

Se puede conseguir tambin un diagnstico rpido por deteccin del ARN vrico (23) usando una prueba
RT-PCR. La PCR se us, entre otras tcnicas, para la deteccin de antgeno en dos recientes brotes de
FVR en frica uno en Kenia en 1998 y un brote limitado en Sudfrica en 1999. La RT-PCR seguida por
secuenciacin de la regin que codifica la protena NS(S) se ha empleado en anlisis filogenticos para
caracterizar dos ramas distintas del virus FVR una egipcia y otra sub-sahariana- convirtiendo a esta
tcnica en un poderoso instrumento de epidemiologa molecular (22).
d)
Histopatologa
El examen histopatolgico del hgado de los animales afectados revelar una citopatologa caracterstica, y
la inmunotincin permitir la identificacin especfica del antgeno viral del FVR en las clulas infectadas.
Esta es una herramienta diagnstica importante porque el hgado y otros tejidos se pueden mantener en
formol salino en condiciones de campo con propsitos de diagnstico, lo que facilita el manejo y transporte
en reas alejadas del laboratorio.
2.
Pruebas serolgicas
Las pruebas de neutralizacin del virus (NV) incluyendo la microneutralizacin, la neutralizacin por reduccin de
placas (PRN) y la neutralizacin en ratn se han usado para detectar anticuerpos contra el virus FVR en el suero
de una variedad de especies. Las pruebas de neutralizacin son muy especficas y reflejarn las respuestas ms
tempranas, pero estas pruebas slo pueden llevarse a cabo con virus vivos y su uso no es recomendable fuera
de las reas endmicas o en laboratorios sin los adecuados servicios de bioseguridad y personal vacunado.
Otras pruebas disponibles son enzimoinmunoensayo (ELISA), inhibicin de la hemaglutinacin (HI), IGDA,
inmunofluorescencia, radioinmunoensayo y fijacin de complemento. Sin embargo, en estas pruebas pueden
ocurrir reacciones cruzadas entre el virus FVR y otros phlevovirus. Una ventaja de estas pruebas es el hecho de
que pueden realizarse con antgeno inactivado y, por consiguiente, pueden ser utilizadas en pases exentos de
FVR.
La tcnica ELISA es un mtodo seguro y sensible que puede usarse con varias especies para detectar
anticuerpos contra el virus FVR. Una prueba ELISA con captura de IgM permite diagnosticar una infeccin
reciente en una muestra aislada de suero.
La prueba de HI puede emplearse con gran seguridad en reas no endmicas. No obstante, los sueros de
individuos que han tenido infecciones previas con phlebovirus distintos de FVR pueden reaccionar con el
antgeno de FVR a ttulos tan altos como 40 y, ms raramente, a ttulos de 320 (27). En casos sospechosos, el
Laboratorio de Referencia de la OIE para FVR (ver Cuadro mostrado en la Parte 3 de este Manual) puede ayudar
a realizar pruebas de neutralizacin para determinar la especificidad. El ttulo de anticuerpos por HI tras la
vacunacin con virus FVR vacunal puede ser tan alto como 640 o, raramente, 1.280, mientras que los ttulos que
se alcanzan tras infecciones naturales por el virus FVR son, por lo general, significativamente ms altos.
205
a)
Neutralizacin vrica
La prueba NV se puede usar para determinar la presencia de anticuerpos en animales infectados por va
natural y en animales vacunados con la vacuna VRF. La prueba es muy especfica y se puede usar para
probar sueros de cualquier especie. Normalmente se usa para medir la eficacia de la vacuna. Algunos
factores, adems de los anticuerpos neutralizantes, pueden jugar un papel en la resistencia frente al FVR.
Como antgeno se usa una cepa neurotrpica para cerebro de ratn muy atenuada del virus FVR
denominada cepa Smithburn (25), tambin conocida como virus vivo modificado y adaptado a cultivos
celulares. El antgeno se guarda a 4C en forma liofilizada. Este stock se titula para determinar la dilucin
que producir 100 DICT50 (dosis infectiva del 50% en cultivo de tejidos) en 25 l bajo las condiciones de la
prueba.
i)
Inactivar el suero problema durante 30 minutos en un bao a 56C.
ii)
Aadir 25 l del medio de cultivo celular con 5% de suero negativo para FVR y antibiticos en cada
uno de los 96 pocillos de una placa de cultivo celular.
iii)
Aadir 25 l del suero problema al primer pocillo de cada fila y hacer diluciones dobles. Titular cada
suero por duplicado de 1/10 a 1/80 a efectos de prueba o por cuadruplicado y a ms altas diluciones
para determinar el ttulo de punto final. Incluir controles positivos y negativos de sueros conocidos.
iv)
Aadir 25 l de antgeno vrico FVR (diluido con medio del cultivo celular y calculado para suministrar
100 DICT50 por pocillo) a cada pocillo que contenga el suero problema diluido y a los pocillos de las
filas que contengan controles de suero positivo y negativo. Adems, hacer diluciones dobles de
antgeno en al menos dos filas de las que contienen solo medio del cultivo celular.
v)
Incubar 30 minutos a 37C.
vi)
Aadir 50 l por pocillo de clulas Vero, CER o cualquier otra suspensin celular apropiada, a una
concentracin de 3 x 105 clulas/ml o a una dilucin que se conozca que origina una monocapa
confluente en 12 horas.
vii)
Incubar las placas durante 3-5 das en una atmsfera de 3-5% de CO2.
viii) Las monocapas se examinan diariamente usando un microscopio invertido para evidenciar ECP. No
debera producirse ECP en las filas que contienen el suero control positivo y debera presentarse un
ECP claro en las filas que contengan el suero control negativo indicando la presencia de virus.
Determinar los resultados por el mtodo de Spearman-Krber.
b)
Enzimoinmunoensayo
Se ha desarrollado y utilizado ampliamente un mtodo indirecto ELISA que emplea un antgeno inactivado
producido en cultivo celular y conjugado con protena G-peroxidasa (21). El antgeno FVR para ELISA se
prepara a partir de cultivos Madin-Darby y el control negativo de antgeno se prepara a partir de monocapas
no inoculadas. Los sedimentos celulares se extraen con un mtodo que emplea sacarosa-acetona (4) y se
inactivan con beta-propriolactona (24).
A menos que se seale lo contrario, los volmenes usados son 50 l/ pocillo, todas las diluciones se
hacen con tampn con 3% (peso/volumen) de leche deshidratada, y todos los lavados se repiten tres
veces.
206
i)
Cubrir la mitad de la placa con 50 l/pocillo de antgeno positivo y la otra mitad con antgeno negativo
a una dilucin predeterminada. Incubar toda la noche a 4C. Lavar la placa.
ii)
Aadir 100 l/pocillo de tampn bloqueante, incubar 1 hora a 37C. Lavar la placa.
iii)
Aadir el suero problema y los sueros control a una dilucin predeterminada por duplicado al antgeno
positivo y al negativo. Incubar 1 hora a 37C. Lavar la placa.
iv)
Aadir el conjugado de Protena G/peroxidasa de rbano a dilucin adecuada. Incubar 1 hora a 37C.
Lavar la placa.
v)
Aadir el substrato tetrametilbenzidina como se presenta comercialmente y dejar la placa 20 minutos a

temperatura ambiente (22C) en la oscuridad (tiempo de desarrollo).
vi)
Aadir solucin que detiene la reaccin (cido sulfrico 2 M) y leer la placa a una densidad ptica de
450/650 nm.
vii)
La disposicin de la placa es como se indica:
(1)
(1)
(5)
(2)
(2)
(6)
(3)
(3)
(19)
(4)
(4)
(20)
(1)
(1)
(5)
(2)
(2)
(6)
10
11
12
(5)
(cc)
(cc)
(6)
(c++)
(c++)
(19)
(c+)
(c+)
(20)
(c )
(c )
(5)
(cc)
(cc)
(6)
(c++)
(c++)
(3)
(3)
(19)
(19)
(c+)
(c+)
(4)
(4)
(20)
(20)
(c )
(c )
A, B, C y D = Ag positivo; E, F, G, y H= Ag negativo
c)
Inhibicin de la Hemaglutinacin
La prueba IH adaptada en versin de microtcnica se basa en Clarke & Casals (4). Se emplea antgeno de
hgado de hmster extrado en sacarosa/acetona en una placa de ensayo de 96 pocillos con fondo en U y
se diluye de modo que se usan en la prueba 4 unidades hemaglutinantes. Los inhibidores inespecficos de
la hemaglutinina se extraen de los sueros antes de la prueba mediante extraccin con caoln y luego por
adsorcin en eritrocitos de ganso prensados (RBC). Las diluciones dobles seriadas de los sueros se hacen
en tampn borato salino, pH 9,0, y se ensayan frente a volmenes iguales de antgeno. Las placas se dejan
a 4C durante la noche antes de aadir 50 l de RBC al 0,5% a cada uno de los pocillos. Las placas se
leen tras 30 minutos a temperatura ambiente y los puntos finales se indican como el inverso de la dilucin
ms alta de suero que produce una inhibicin total de la hemaglutinacin.
En cada prueba se incorporan sueros control positivo y negativo. Una prueba se considera vlida solamente
si los sueros control dan los resultados esperados. Los sueros con ttulos inferiores a 1/40 se consideran
negativos.
La tcnica de HI es una prueba adecuada de ensayo para inspecciones aunque no es muy especfica.
Entre los phlebovirus ocurren reacciones cruzadas notables, pero los ttulos homlogos exceden a los
heterlogos. Experimentalmente, se ha demostrado que hay phlebovirus africanos distintos del FVR que no
son patgenos para los rumiantes, y no es probable que los anticuerpos que ellos puedan inducir originen
confusin en el diagnstico de FVR (27).

Se ha usado una vacuna viva preparada con la cepa atenuada Smithburn del virus FVR para controlar FVR en
ganado bovino y ovino no gestante en reas endmicas y durante brotes epidmicos, mientras que se usan virus
vacunales inactivados a partir de cepas naturales en el caso de animales gestantes y en pases libres de FVR (1,
2). Las vacunas con virus inactivados deben prepararse a partir de cepas muy inmunognicas del virus FVR
producidas en cultivo celular. El virus debe inactivarse con formaldehdo y mezclarse con un adyuvante para
potenciar la inmunogenicidad. Las vacunas inactivadas deben ensayarse muy cuidadosamente en cuanto a
seguridad para garantizar que no existe ningn virus vivo residual.
Las directrices para la produccin de vacunas veterinarias se presentan en el Captulo I.1.7. Principios de
produccin de vacunas veterinarias. Las normas dadas aqu y en el Captulo I.1.7 intentan ser de naturaleza
genrica y pueden ser suplementadas con requisitos nacionales o regionales.
207
En humanos, se ha usado durante 25 aos una vacuna experimental inactivada con considerable xito en cuanto
a proteccin de personas con riesgo de FVR. En la actualidad esta vacuna se est produciendo en clulas
diploides. Sin embargo, la limitada disponibilidad de esta vacuna impide su uso en la poblacin general.
Dos nuevas candidatas a vacunas producidas a partir de aislamientos humanos de FVR estn siendo sometidas
a diversos ensayos con vistas a reemplazar las vacunas existentes.
La primera, MV P12, es una cepa mutada de virus cultivado en presencia de 5-fluorouracilo con mutagnesis
seriada que produce en una atenuacin para el ratn. Se ha probado en ovejas la inmunogenicidad y la
patogenicidad y el virus no provoca abortos en ovejas gestantes (17). MV P12 confiri proteccin en corderos
jvenes (10,14) y en ganado bovino (18, 19). En pruebas posteriores ms extensas realizadas en ovejas la
vacuna produjo abortos y teratologa fetal grave cuando se us despus de 28 das de gestacin (12).
La segunda candidata, Clon 13, una variante de virus que origina pequeas placas de lisis y que no reacciona
con dos anticuerpos monoclonales especficos, result ser avirulenta para ratones y hmsteres y muy
inmunognica. Su inmunogenicidad y patogenicidad se ha probado en corderos, ovejas, y cabras jvenes y
adultas (20). En ensayos adicionales se comport como no abortiva en ovejas gestantes y confiri ms de un
80% de proteccin frente a un virus prueba de desafo (11). El virus Clon 13 presenta la prdida de una porcin
del segmento de ARN pequeo que codifica protenas no estructurales, lo que podra conducir a una vacuna
estable.
En la siguiente descripcin de produccin de vacunas, se suministra informacin sobre la produccin de vacuna
viva junto a informacin sobre produccin de vacuna inactivada. Debe resaltarse que las vacunas vivas y las
inactivadas nunca deben producirse simultneamente en los mismos servicios, debido al riesgo de contaminar la
vacuna viva atenuada con una cepa virulenta de virus antes de ser inactivada. El personal que maneja virus FVR
vivo debe estar vacunado y trabajar con nivel de contencin 3 para minimizar el riesgo de autoinfeccin.
1.
Control del inculo
a)
Caractersticas del inculo vrico

Vacuna viva: El stock de antgeno deriva de la cepa original neurotrpica de Smithburn. Esta cepa no es
letal en ratones adultos inyectados intraperitonealmente y es segura cuando se usa en todas las razas de
ganado vacuno, ovejas y cabras. Sin embargo, puede causar anormalidades fetales o aborto en animales
gestantes.
Vacuna inactivada: Se puede usar como virus de inculo una cepa de virus FVR altamente inmunognica
adaptada a crecer en cultivos celulares. Se diferencia de la cepa atenuada en que es letal para los ratones
adultos cuando se inyecta intraperitonealmente.
b)
Mtodo de cultivo
Tanto las cepas de virus atenuado como la inactivada se producen en cultivos celulares de clulas BHK,
Vero o CER. Los virus se guardan en forma liofilizada en viales que contienen 1 ml de una suspensin de
cultivo celular. El ttulo vrico (tras inoculacin intracerebral en ratones jvenes) debe ser de al menos 106.5
LD50 en el ratn (50% de la dosis letal) por ml.
c)

Los virus inoculados deben carecer de agentes indeseables, ser seguros para el uso y capaces de
estimular una inmunidad eficaz en las especies y razas a las que va dirigida.
Pruebas
El inculo de virus liofilizado se regenera en medio de cultivo celular estril sin antibiticos y se comprueba
la ausencia de bacterias y hongos. El contenido de un vial as reconstitudo se inocula en dos tubos de
medio con tioglicolato y en dos tubos de medio con hidrolizado de soja y casena. Los cultivos con
tioglicolato se incuban a 37C durante 7 das y los cultivos con hidrolizado de soja y casena a 20C durante
14 das. Los cultivos deberan permanecer negativos.
Adems, se mezclan 5 ml del inculo de virus reconstitudo con un mismo volumen de antisuero especfico
contra FVR producido en conejos. Despus de incubar las mezclas suero/virus a 37C durante 30 minutos,
las suspensiones vricas se ensayan en cultivos celulares antes y despus de una neutralizacin, as como
en ratones adultos y jvenes, huevos embrionados y cobayas. El virus neutralizado es:
208
i)
Sembrado en seis cultivos en tubos rotativos con clulas primarias de rin de cordero y seis cultivos
en tubos rotativos con clulas BHK. Los cultivos celulares se incuban a 37C y se observan
diariamente durante 7 das para observar ECP, tras los cuales se someten a la prueba de
hemadsocin con RBCs de cobaya a 4C y a 37C. No debera presentarse ECP ni hemadsorcin. Si
el cultivo degenera o presenta sospechas de ECP, el material de estos cultivos debera mezclarse de
nuevo con antisuero y reinocularse en cultivos celulares frescos, que se observan durante otro perodo
adicional de 14 das. La presencia de ECP especfico o de hemadsorcin descalifica la muestra como
inculo vrico.
ii)
Inoculado intraperitonealmente (0,2 ml) en grupos de al menos seis ratones adultos y seis ratones de
2-5 das de edad. Los ratones deberan permanecer sanos durante 14 das. Si muriera algn ratn, se
emulsiona un tejido adecuado, se mezcla con antisuero y se reinocula en otros grupos de ratones,
observndolos de nuevo durante otro perodo de 14 das. Si existe alguna evidencia de mortalidad
especfica, se descalifica la muestra como inculo vrico.
iii)
Inoculado en al menos diez huevos de gallina embrionados de 8 das mediante el mtodo del punzn
(combinacin de la ruta de la membrana coriolantoidea y del saco alantoideo). Los huevos se incuban
a 37C durante 8 das y se observan diariamente con transiluminacin. Los embriones que mueren a
las 24 horas se eliminan. Si despus de 24 horas permanecen vivos menos del 70% de los embriones,
la prueba debera, no obstante, repetirse. La causa de muerte embrionaria durante el consiguiente
perodo de observacin debera determinarse estableciendo pruebas adecuadas de esterilidad y de
HI, y por examen de frotis del saco vitelino. Si estas pruebas resultan negativas, debera hacerse,
como antes, una reinoculacin de suspensiones obtenidas de los embriones mezcladas con antisuero.
Al da 4 de incubacin, se abren al menos 4 huevos y se recoge el lquido del alantoides. Los huevos
restantes se abren el da 8 de incubacin. Se examinan las membranas de ambos grupos en cuanto a
lesiones y en cuanto a anormalidades del embrin. El lquido del alantoides se somete a una prueba
HI con RCBs de cobaya y pollo a 4C y a 37C. La evidencia de mortalidad embrionaria especfica, de
actividad hemaglutinante en el lquido alantoideo, cualquier lesin en las membranas o anormalidades
embrionarias descalifican la muestra como inculo vrico.
iv)
Inyectado intraperitonealmente con 1,0 ml de inculo vrico en dos cobayas. Los cobayas deben
permanecer sanos en un perodo de observacin de 14 das.
No superar cualquiera de estas pruebas descalifica al antgeno para uso como inculo vrico.
2.
Mtodo de produccin
Un vial de inculo vrico liofilizado se reconstituye y se diluye entre 1/100 y 1/1.000 con medio Eagle en el caso
de las vacunas atenuadas y 1/1.000 en el caso de vacunas inactivadas. Para preparar una suspensin de
trabajo, se siembra el virus diludo en un cultivo confluente de clulas BHK en botellas rotativas y se incuba a
37C. Cuando el 70% de las clulas aparecen afectadas (ECP), se recoge el medio y las clulas y este material
se diluye entre 1/100 y 1/1.000, tras lo cual se siembran de nuevo 10 ml en botellas rotativas con clulas BHK
confluentes y se incuba otra vez. Tan pronto como se observa un 70% de ECP, se recoge el medio y las clulas
y se almacenan.
Tanto las suspensiones virales de las vacunas atenuadas como de las inactivadas se titulan intracerebralmente
en ratones neonatos y deberan presentar un ttulo de la menos 106.5 LD50/ml en ratn. Alternativamente, se
puede realizar una titulacin de lesiones en clulas CER.
La vacuna atenuada se liofiliza inmediatamente despus de completar las pruebas de titulacin y de esterilidad.
Debera usarse un estabilizador, como por ejempo 5% de peptona en tampn fosfato 0,3 M. El volumen de la
vacuna inactivada se ajusta de modo que la vacuna final contenga al menos 106.5 LD50/ml. La suspensin viral
ajustada se inactiva luego a 37C durante 24 horas con formaldehdo a una concentracin final de 0,2%. Tras la
inactivacin, se aade a la suspensin el mismo volumen de gel de hidrxido de aluminio. La vacuna debe tener
un pH final de 7-7,5.
3.
Control el proceso
Previamente a la inoculacin de los cultivos celulares, el inculo vrico se somete a pruebas de esterilidad en
medios con tioglicolato y con hidrolizado de soja y casena (ver Seccin C.1.c y Captulo I.1.5. Pruebas para
esterilidad y ausencia de contaminacin en materiales biolgicos).
209
Se selecciona una muestra representativa de cada lote de vacuna y cada contenido se reconstituye con 5 ml de
agua destilada estril analizndose para comprobar ausencia de bacterias y hongos.
En las vacunas inactivadas, debe comprobarse la inactivacin mediante dos pases en el mismo tipo de cultivo
celular que se us en la produccin de la vacuna.
4.
Control de lotes
a)
Esterilidad
Antes de la liofilizacin o de la inactivacin, cada envase de vacuna almacenada, y despus muestras
representativas de cada lote, se prueban respecto a esterilidad en medio con tioglicolato e hidrolizado de
soja y casena (ver tambin Captulo I.1.5. de este Manual).
b)
Inocuidad
Vacuna viva: Se seleccionan al azar recipientes finales de la vacuna atenuada liofilizada y cada uno se
reconstituye en agua destilada como si se tratara de una vacunacin. Se inyectan subcutneamente cuatro
ovejas susceptibles con una dosis de vacuna. Las ovejas se observan diariamente durante 14 das y se
anota su temperatura rectal. Las ovejas deben permanecer sanas.
La vacuna tambin se inyecta intraperitonealmente en seis ratones adultos (0,25 ml en cada uno), dos
hmsteres y dos cobayas (1 ml en cada uno). Los animales se observan diariamente durante un perodo de
14 das durante el cual deben permanecer sanos. Una mortalidad atribuble a la vacuna descalifica el lote.
Vacuna inactivada: En el caso de la vacuna inactivada contra FVR, se inyectan subcutneamente cuatro
ovejas susceptibles con 2,0 ml de vacuna, se observan diariamente durante 3 semanas y se anota la
temperatura rectal. Las ovejas deben permanecer sanas.
Adems, la seguridad se determina tambin por inyeccin intracerebral de seis ratones adultos y dos
familias de ratones neonatos, y mediante inyeccin intraperitoneal de dos cobayas y dos hmsteres. Los
ratones, hmsteres y cobayas se observan durante 14 das. Deben permanecer sanos. Una mortalidad
atribuble a la vacuna descalifica el lote.
c)
Potencia
Vacuna viva: Se recostituye la vacuna atenuada liofilizada de dos recipientes finales y se titula
intracerebralmente en ratones neonatos. La vacuna final debe contener al menos 104.4 LD50/dosis en ratn.
Alternativamente, se pueden hacer las titulaciones en cultivos celulares.
Dos recipientes finales se mantienen una semana a 37C, se recosntituyen y se titulan como antes. Cada
uno debe contener al menos 103.4 LD50/dosis en ratn. Alternativamente, se pueden hacer las titulaciones
en cultivos celulares.
Las ovejas inoculadas (ver seccin C.4.b.) se sangran a las 2 y 3 semanas de la vacunacin y su respuesta
en anticuerpos se determina por PRN. Un ttulo de anticuerpo neutralizante frente al virus de 100 o ms es
considerado satisfactorio.
Vacuna inactivada: Las ovejas, inyectadas subcutneamente para determinar la seguridad (Seccin C.4.b.),
se sangran a las tres semanas y su respuesta en anticuerpos se determina por la prueba NV. Un ttulo de
anticuerpo neutralizante frente al virus de 100 o ms es considerado satisfactorio.
d)
Tanto las vacunas vivas atenuadas como las inactivadas han tenido un amplio uso en condiciones de
campo. Se considera que la vacuna viva induce una inmunidad que dura toda la vida contra la enfermedad
clnica, aunque existe cierta controversia sobre la inmunogenicidad de la vacuna Smithburn. Sin embargo,
el ganado vacuno se puede inmunizar con la vacuna de virus vivo usando esta cepa. La experiencia sobre
la eficacia de campo de las vacunas inactivadas es limitada porque se han empleado en reas donde FVR
no es endmica, y donde en consecuencia no existe desafo natural frente a la vacuna. Sin embargo,
durante el brote de 1976-1978 en Sudfrica, observaciones realizadas por veterinarios estatales apoyan la
eficacia de la vacuna. En epizootias ms recientes en otras partes, la vacuna inactivada no tuvo xito en la
proteccin de los animales contra el aborto, tras dos vacunaciones. Cuando se usa la vacuna inactivada, se
210
debe dar una dosis de recuerdo a los 3-6 meses de la vacunacin inicial y despus la vacunacin se
debera repetir anualmente (1, 2).
e)
Estabilidad
Cuando se mantienen a 4C, las vacunas atenuadas liofilizadas son estables durante al menos 4 aos,
mientras que la vacuna inactivada puede mantenerse muchos aos. No se recomienda el almacenamiento
a temperaturas superiores.
f)
Conservantes
No se usan conservantes.
g)
Aunque los humanos se pueden infectar durante el manejo de material infectado, no se conoce ningn caso
de enfermedad en el hombre con virus de la vacuna atenuada, pero a menudo ocurre seroconversin. Sin
embargo, las cepas usadas para preparar vacuna inactivada pueden causar enfermedad. Por tanto, todo
personal con probabilidad de exposicin al virus de la vacuna debera ser vacunado con la vacuna
inactivada con formalina para el hombre.
5.
Pruebas en el producto final
a)
Esterilidad
Se recogen muestras representativas del producto final y se ensayan como se indica en la Seccin C.4.a.
b)
Contenido en humedad
La humedad presente en muestras liofilizadas de la vacuna atenuada no debera superar el 3%.
Agradecimiento
Partes de este captulo se tomaron del captulo sobre FVR en las ediciones previas de este Manual o estn
basadas en l.
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*
* *
NB: Existen laboratorios de referencia de la OIE para la Fiebre del valle del Rift (ver Cuadro en la parte 3 de
www.oie.int)
212
CAPTULO 2.1.9.
LENGUA AZUL
RESUMEN
La lengua azul (LA) es una enfermedad vrica infecciosa, no contagiosa y transmitida por insectos,
que se presenta en las ovejas y los rumiantes domsticos y salvajes, como cabras, ciervos, ovejas
cimarrn, la mayor parte de los antlopes africanos y muchos otros miembros de los artiodctilos.
El efecto de la infeccin vara desde una manifestacin que pasa desapercibida en la gran mayora
de los animales infectados hasta un resultado mortal en algunas ovejas, cabras, ciervos y
rumiantes salvajes infectados. Los sntomas clnicos de la enfermedad en rumiantes domsticos y
salvajes incluyen una respuesta febril caracterizada por inflamacin y congestin, edema facial con
hemorragias, y ulceracin de las membranas mucosas. En los casos graves la lengua azul puede
mostrar una hiperemia intensa y llegar a estar edematosa y sobresalir de la boca. La hiperemia se
puede extender a otras partes del cuerpo, en particular a las ingles, axilas y perineo. A menudo
ocurre una grave degeneracin muscular. La dermatitis puede ocasionar rotura de la lana. Las
ovejas pueden presentar cojera a consecuencia de coronitis, es decir, inflamacin de la banda
coronaria de las pezuas, o de miopata esqueltica. Una enfermedad grave similar de los
rumiantes salvajes es la causada por el virus de la enfermedad hemorrgica epizootica (EHDV)
que, como el virus de la LA (BTV), es un miembro del gnero Orbivirus, pero que est clasificado
en un serogrupo diferente. A veces, la EHD puede causar en el ganado sntomas clnicos que
parecen similares a los de la lengua azul.
Identificacin del agente: El BTV es un miembro del gnero Orbivirus de la familia Reoviridae.
Dentro del gnero hay 14 serogrupos. El serogrupo LA contiene 24 serotipos. Los primeros se
diferencian por pruebas inmunolgicas que detectan protenas vricas que estn conservadas
dentro de cada serogrupo. La mayora de los serogrupos parecen ser diferentes desde el punto de
vista inmunolgico, pero existe una reaccin cruzada considerable entre los integrantes de los
serogrupos LA y EHD. El serotipo de los virus individuales dentro de cada serogrupo se identifica
mediante pruebas de neutralizacin. Las partculas completas de BTV tienen una cpsida doble y
la cpsida externa contiene dos protenas, una de las cuales es el determinante principal de la
especificidad del serotipo. La cpsida interna icosadrica contiene dos protenas mayoritarias, tres
protenas minoritarias y diez mdulos de ARN de cadena doble. La protena VP7 es una protena
importante de la cpsida que posee los antgenos que confieren especificidad a cada serogrupo.
La identificacin tradicional del virus implica su aislamiento la amplificacin en cultivos de tejido y
la subsiguiente aplicacin de pruebas especficas para establecer el serogrupo y el serotipo.
Recientemente, la aplicacin de la tecnologa de la reaccin en cadena de la polimerasa (PCR) ha
permitido la amplificacin muy rpida del ARN del BTV en muestras clnicas, y, en la actualidad,
existen procedimientos basados en la PCR que permiten obtener informacin sobre el serogrupo y
el serotipo del virus.
Pruebas serolgicas: En los rumiantes las respuestas serolgicas aparecen a los 7-14 das
despus de la infeccin por BTV y, por lo general, son duraderas. Para detectar los anticuerpos
especficos contra un serogrupo de LA se usaban hasta hace poco pruebas como la
inmunodifusin en medio slido o el enzimoinmunoensayo indirecto (ELISA), aunque estas
pruebas tenan el inconveniente importante de ser incapaces de distinguir de forma fiable entre
anticuerpos contra los virus de los serogrupos de LA y de EDH. Un mtodo competitivo ELISA
basado en anticuerpos monoclonales ha resuelto este problema y para detectar especficamente
anticuerpos anti-BTV se recomiendan ensayos de tipo ELISA competitivo. Los procedimientos
actuales para determinar la especificidad de serotipo de los anticuerpos son tediosos porque
requieren determinar la capacidad de los sueros de ensayo para inhibir la infectividad de una serie
de virus de serotipo conocido mediante pruebas de neutralizacin de larga duracin.
213
Captulo 2.1.9. Lengua azul
Requisitos para las vacunas y los materiales de diagnstico: En varios pases, como
Sudfrica, donde no vacunar puede conducir a brotes de la enfermedad, se utilizan vacunas vivas
atenuadas que son especficas en cuanto a serotipo. Los virus atenuados se preparan por pases
seriados del virus natural en huevos embrionados de pollo o en clulas cultivadas. La virulencia se
atena despus de los pases seriados y, en paralelo, los virus se replican con ttulos ms bajos en
las ovejas. Las vacunas con virus atenuados son teratognicas y no se deben administrar a ovejas
grvidas durante la primera mitad del embarazo, debido a que pueden causar la muerte fetal y
anormalidades. Cuando se establece un grado adecuado de atenuacin a efectos de la vacuna, se
debe buscar un equilibrio entre un nivel de replicacin suficiente para reducir la virulencia, pero
debe estimular la inmunidad de proteccin en las ovejas, y la necesidad de reducir el ttulo del virus
en sangre para evitar la infeccin de insectos picadores. Los procedimientos para ensayar la
eficacia de la vacuna y el potencial teratognico en ovejas son de realizacin fcil. En contraste, se
han realizado pocos estudios para determinar si los virus atenuados pueden o no transmitirse de
ovejas vacunadas a otros animales mediante insectos. El hecho de que los virus atenuados sean
teratognicos hace que la determinacin de su transmisin sea un asunto muy importante,
especialmente si se usan por primera vez en un pas vacunas con virus vivos.
A. INTRODUCCIN
Las moscas del gnero Culicoides transmiten el virus de la lengua azul (BTV) a animales susceptibles, y a partir
de ellos, llegando a infectarse durante su alimentacin sobre vertebrados con viremia. Despus de un perodo de
replicacin de 6-8 das, y despus de su aparicin en la glndula salivar, el virus se puede transmitir a un
hospedador vertebrado durante la ingestin de sangre. Las moscas infectadas permanecen infectadas toda la
vida. El papel central del insecto en la epidemiologa de la LA implica que la prevalencia de la enfermedad est
gobernada por factores ecolgicos, como pluviosidad elevada, temperatura, humedad y caractersticas edficas
que favorezcan la supervivencia del insecto (6). En muchas partes del mundo la enfermedad tiene, por tanto, una
frecuencia estacional (13).
La LA es una enfermedad vrica infecciosa, no contagiosa y transmitida por insectos, que se presenta en las
ovejas y los rumiantes domsticos y salvajes, como cabras, ciervos, ovejas cimarronas, la mayor parte de los
antlopes africanos y otros artiodctilos. El efecto de la infeccin vara desde una manifestacin que pasa
desapercibida en la gran mayora de los animales infectados hasta un resultado mortal en algunas ovejas,
cabras, ciervos y rumiantes salvajes infectados. Aunque en general la frecuencia de infeccin por BTV es mayor
en el ganado bovino que en las ovejas, la enfermedad tpica es rara en el ganado bovino y los sntomas, cuando
ocurren, son mucho ms suaves que en las ovejas. En los rumiantes no domsticos, la enfermedad puede variar
de una manifestacin hemorrgica aguda con alta mortalidad, como la que se observa en el ciervo de cola
blanca (Oidocoilus virginianus), hasta una enfermedad desapercibida como la del alce norteamericano (Cervus
canadensis). El virus de la enfermedad hemorrgica epizootica (EHDV) puede producir una enfermedad en los
rumiantes salvajes con manifestaciones clnicas idnticas a las observadas despus de la infeccin por BTV.
Los sntomas clnicos de la enfermedad en los rumiantes domsticos y en los salvajes varan desde estados
subclnicos en la mayor parte de los casos hasta una respuesta febril aguda caracterizada por inflamacin y
congestin, que conduce a un edema en la cara, prpados y orejas, y hemorragias y ulceracin de las
membranas mucosas. Pueden aparecer grandes erosiones en los carrillos y en la parte de la lengua opuesta a
los molares. La lengua puede tener una hiperemia intensa y aspecto edematoso, sobresalir de la boca y, en
casos graves, volverse ciantica. La hiperemia se puede extender a otras partes del cuerpo, en particular a las
ingles, axilas y perineo. A menudo existe una grave degeneracin muscular. La dermatitis puede originar roturas
de la lana. Es corriente la presencia de coronitis con hemorragia en la banda coronaria de la pezua, pudiendo
causar cojera. Cuando una oveja muere a consecuencia de la enfermedad de la LA aguda, los pulmones pueden
mostrar hiperemia interalveolar con edema alveolar grave y el rbol bronquial puede contener espuma. La
cavidad torcica puede contener varios litros de lquido parecido al plasma y el saco del pericardio puede
presentar hemorragias petequiales. La mayor parte de los casos presentan una hemorragia caracterstica cerca
de la base de la arteria pulmonar (11).
El BTV es un miembro del gnero Orbivirus, que es uno de los nueve gneros clasificados en la actualidad
dentro de la familia Reoviridae. Dentro del gnero Orbivirus, se diferencian 14 grupos, desde el punto de vista
serolgico. Los orbivirus mejor estudiados pertenecen a los serogrupos de la LA, EHD y la enfermedad africana
del caballo (AHS). Dentro de los serogrupos, los miembros individuales se diferencian por pruebas de
neutralizacin y hasta la fecha se han descrito 24 serotipos de BTV. Existe una notable reaccin cruzada
inmunolgica entre los miembros de los serogrupos de la LA y la EHD (16). En este captulo no se presentarn
detalles de las pruebas especficas para la EHD.
214
Las partculas del BTV se componen de tres capas proteicas. La cpsida externa contiene dos protenas, la VP2
y la VP5. La VP2 es el antgeno de neutralizacin ms importante y el determinante de la especificidad de
serotipo. Esta protena es tambin la responsable de la hemaglutinacin y de la unin del BTV a las clulas de
mamferos. La capacidad de un MAb contra VP5 para neutralizar el virus de la AHS (AHSV) y para reaccionar
con la protena equivalente del BTV y del EDHV confirma el papel de VP5 en la neutralizacin de los orbivirus y
destaca la extensin de la reaccin cruzada inmunolgica entre los miembros de los distintos serogrupos de
Orbivirus (24). La eliminacin de la cpsida externa VP2/VP5 deja una partcula con una cpsida icosadrica
interna formada por dos capas compuestas de dos protenas mayoritarias, la VP7 y la VP3, tres protenas
minoritarias, y diez mdulos de ARN de cadena doble. La VP7 es un determinante importante de la especificidad
de serogrupo y el componente que contiene los eptopos que se usan en enzimoinmunoensayos competitivos (CELISA) para detectar anticuerpos contra BTV. La VP7 tambin puede ser la responsable de la unin del BTV a
las clulas de insectos (39). Las subunidades de VP7 contienen dos dominios.
1.
Identificacin del agente (una prueba prescrita para el comercio internacional)
a)

Se usan los mismos procedimientos para rumiantes domsticos y salvajes. Hay varios sistemas en uso para
el aislamiento de virus, pero dos de los ms eficaces son los huevos embrionados de pollo (ECE) y la oveja.
La identificacin de BTV por inoculacin en oveja puede ser una estrategia til si el ttulo de virus en la
muestra de sangre es muy bajo, como suele ser el caso despus de varias semanas despus de la
infeccin vrica. Los intentos de aislar el virus en cultivos celulares in vitro pueden ser ms adecuados, pero
con frecuencia la probabilidad de xito es mucho menor que la lograda mediante sistemas in vivo. Dentro
de una poblacin de virus, no todas las partculas de BTV son idnticas a nivel gentico y de composicin
en aminocidos, y slo una pequea proporcin de los virus presentes en la sangre de animales infectados,
quizs nfima, puede tener las secuencias de aminocidos precisas en las protenas vricas que son crticas
para unirse y replicarse en las clulas en cultivo. Este puede ser el motivo por el que la inoculacin directa
de clulas cultivadas con sangre virmica que contiene un nmero relativamente pequeo de partculas
virales sea un modo ineficaz de aislar el BTV. Por uno o dos pases en ECE es ms probable que se genere
una preparacin con un ttulo alto de virus, y una que contenga virus con la capacidad de replicarse en
cultivo de tejidos. El cultivo celular parece ser una tcnica ms sensible para el aislamiento del EHDV.
Aislamiento en huevos embrionados de pollo
i)
Se recoge sangre de animales febriles con un anticoagulante como heparina, EDTA (cido etilamina
diamina tetra-actico) o citrato sdico, y las clulas sanguneas se lavan tres veces con solucin salina
estril tamponada con fosfato (PBS). Las clulas lavadas se resuspenden en PBS o en cloruro sdico
isotnico y se guardan a 4C o se usan inmediatamente para intentar el aislamiento del virus.
ii)
Para guardar a largo plazo cuando no es posible la refrigeracin, las muestras de sangre se recogen
en oxalato-fenol-glicerina (10). Si las muestras se pueden congelar, se recogen entonces en solucin
tamponada de peptona con lactosa o dimetil sulfxido al 10% (36) y se mantienen a 70C o a
temperatura inferior. El virus no es estable a 20C en perodos largos.
iii)
El bazo y los ndulos linfticos son los rganos preferidos para intentos de aislamiento del virus en
casos mortales. Los rganos y tejidos deben mantenerse a 4C y transportarse a un laboratorio donde
se homogenizan en PBS o solucin salina isotnica, y se utilizan como se describe ms adelante para
las clulas de la sangre.
iv)
Se resuspenden en agua destilada clulas de la sangre lavadas o se sonican en PBS y se inoculan

0,1 ml intravascularmente en 6-12 ECE de 9-12 das de edad. Este proceso es difcil de realizar y
requiere prctica. El trabajo de Clavijo et al. contiene los detalles (8).
v)
Los huevos se incuban en una cmara hmeda a 33,5C y se observan diariamente al trasluz.
Cualquier muerte embrionaria ocurrida en las primeras 24 horas post-inoculacin se considera
inespecfica.
vi)
Los embriones que mueren entre los das 2 y 7 se mantienen a 4C y los que permanecen vivos el da
7 se sacrifican. Con frecuencia, los embriones infectados presentan un aspecto hemorrgico. Los
embriones muertos y los que vivan el da 7 se homogenizan por separado. Se homogenizan los
embriones completos, despus de eliminar sus cabezas, u rganos concretos, como el hgado, y los
restos de eliminan por centrifugacin.
215
vii)
El virus se puede identificar directamente en el sobrenadante mediante ELISA de captura de antgeno

(18) o indirectamente por mtodos de deteccin de antgenos, como inmunofluorescencia o
inmunoperoxidasa, despus de su amplificacin en cultivo celular, como se describe en la seccin
siguiente.
viii) Si, despus de la inoculacin con el material de la muestra, los embriones no mueren, se hace un
inculo con el material del primer pase por huevo y se vuelve a pasar por ECE o por cultivo celular.
Aislamiento en cultivo celular
Los virus tambin se pueden aadir a clulas L de ratn en cultivo, o a clulas de rin de hmster neonato
(BHK-21), de rin de mono verde africano (Vero) o de Aedes albopictus (AA). Mediante adicin directa a
clulas en cultivo, la eficacia del aislamiento suele ser ms baja en comparacin con la que se alcanza en
ECE. La mejor eficacia de aislamiento en cultivo celular se logra pasando primero los homogenados de
ECE por clulas AA, y luego por aplicacin de procedimientos de deteccin de antgeno o pases
adicionales por lneas celulares de mamferos, como clulas BHK-21 o Vero. En clulas AA no se observa
necesariamente un efecto citoptico (ECP). Se analizan las monocapas celulares para observar la
presencia de un ECP durante 5 das a 37C con 5% de CO2 y humedad. Si no aparece ECP, se realiza un
segundo pase en cultivo celular.
La identidad del BTV en el medio de cultivo de clulas que manifiestan un ECP se puede confirmar
mediante varios mtodos que se describen ms adelante, incluyendo la prueba ELISA de captura de
antgeno, inmunofluorescencia, inmunoperoxidasa, o neutralizacin del virus (NV).
b)
Aislamiento en oveja
i)
Las ovejas se inoculan con clulas lavadas procedentes de 10 ml a 500 ml de sangre, o con 10-50 ml
de suspensin de tejido. Los inculos se administran subcutneamente en alcuotas de 10-20 ml.
Volmenes superiores pueden facilitar el aislamiento del virus y deben administrarse
intravenosamente.
ii)
Las ovejas se mantienen 28 das para comprobacin de los anticuerpos utilizando la prueba de
inmunodifusin en medio slido (1) o la prueba C-ELISA como se describe ms adelante.
Mtodos inmunolgicos
Serogrupo de los virus
Los aislamientos de Orbivirus se suelen seroagrupar por su reactividad con antisueros estndar especficos
que detectan protenas, como la VP7, que se conservan dentro de cada serogrupo. La reaccin cruzada
entre miembros de los serogrupos LA y EHD plantea la posibilidad de que un aislamiento de EHD pueda
confundirse con BTV debido a una reaccin de inmunofluorescencia dbil con un antisuero policlonal antiBTV. Por esta razn, se puede usar un MAb especfico del serogrupo LA. Varios laboratorios han generado
tales reactivos especficos de grupo (3, 22). En contraste con el seroagrupamiento, el mtodo corriente de
serotipado es mediante pruebas de NV usando mtodos que se describen ms adelante. Los mtodos ms
utilizados para la identificacin de los virus a nivel de serogrupo son los siguientes.
i)
Inmunofluorescencia
Se infectan monocapas de clulas BHK o Vero sobre portas de vidrio con virus adaptado al cultivo de
tejido o con virus de lisados de ECE. Despus de 24-48 horas, o despus de la aparicin de un ECP
incipiente, las clulas infectadas se fijan con agentes como paraformaldehdo, acetona o metanol, se
deja secar y el antgeno vrico se detecta utilizando un antisuero anti-BTV y los procedimientos
estndar para inmunofluorescencia.
ii)
Enzimoinmunoensayo de captura de antgeno

Se pueden detectar directamente los virus en lisados de ECE, en el medio de cultivo y en insectos
infectados. En esta tcnica, los virus y/o las partculas de la cpsida se capturan por el anticuerpo
adsorbido a una placa ELISA y el virus unido se detecta usando un segundo anticuerpo. El anticuerpo
de captura puede ser policlonal o un MAb especfico de serogrupo. Para detectar los virus capturados,
se han usado con xito MAbs especficos de serogrupo y anticuerpos policlonales contra las partculas
de la cpsida expresadas en baculovirus (18).
iii)
Prueba inmune puntual (14)

Se adsorben sobre nitrocelulosa pequeos volmenes (2 l) de sobrenadante de cultivo de clulas
infectadas o de clulas infectadas que han sido lisadas o sonicadas y se deja secar. Los sitios de
unin inespecfica se bloquean incubando con una solucin que contenga protena de leche
216
desnatada. Despus de incubar con un MAb reactivo para el serogrupo LA, el anticuerpo se detecta
utilizando IgG anti-ratn conjugada con peroxidasa de rbano.
Serotipado por neutralizacin de virus
Las pruebas de neutralizacin son especficas de tipo para los 24 serotipos de BTV actualmente
reconocidos y pueden emplearse para serotipar un virus aislado o modificarse para determinar la
especificidad de los anticuerpos en los sueros. En el caso de un aislamiento no tipado, la localizacin
regional caracterstica de los serotipos de BTV eliminar, por lo general, la necesidad de realizar la
neutralizacin con todos los 24 antisueros, en particular cuando se han identificado los serotipos
endmicos.
Existe una serie de mtodos disponibles, que se basan en el cultivo celular, para detectar la presencia de
anticuerpos neutralizantes anti-BTV. Las lneas celulares ms utilizadas son BHK, Vero y L929. Ms
adelante se resumen cuatro mtodos para serotipar el BTV. Se ha descrito que los antisueros especficos
de serotipo generados por cobayas y conejos presentan menos reaccin cruzada que los obtenidos de
ganado vacuno u ovino. Es importante incluir controles del antisuero para asegurarse de que se utiliza un
nivel eficaz de antisuero de referencia frente a ttulos comparables y estandarizados de virus de referencia y
virus no tipado.
i)
Reduccin de placas (o calvas)

El virus que va a ser serotipado se diluye hasta que contenga aproximadamente 100 unidades
formadoras de placas (PFU) y se incuba sin suero o con antisueros individuales estndar de una serie
de serotipos de BTV. Se aaden las mezclas de virus/antisuero a las monocapas celulares y se
determina el ttulo de virus mediante ensayos de placas (o calvas). Se considera que el virus no
identificado es serolgicamente idntico a un serotipo estndar cuando ste ltimo resulta neutralizado
de forma similar si se realiza la prueba en paralelo con el virus problema.
ii)
Inhibicin de placas (o calvas)

Las pruebas se realizan en placas Petri de 90 mm de dimetro que contienen monocapas celulares
confluentes que se infectan con aproximadamente 5 x 104 PFU de virus estndar y de virus no tipado.
Despus de la adsorcin y la eliminacin del inculo, la monocapa se cubre con agarosa. En discos
individuales de papel de filtro se aaden antisueros estndar anti-BTV, que se colocan sobre la
superficie de agarosa. Las placas se incuban por lo menos 4 das. Alrededor del disco que contenga el
antisuero homlogo aparecer una zona de neutralizacin del virus con la consiguiente supervivencia
de la monocapa celular.
iii)
Neutralizacin en microtitulacin
En una placa de microtitulacin con pocillos de fondo plano se aaden aproximadamente 100 DICT50
(dosis infectiva del 50% en cultivo de tejidos) del virus estndar y del virus no tipado en un volumen de
50 l por pocillo, y se mezcla con el mismo volumen de antisuero estndar diluido con medio de cultivo
de tejidos. En un volumen de 100 l se aaden aproximadamente 104 clulas por pocillo y, despus de
incubar durante 4-6 das, se leen los resultados de la prueba utilizando un microscopio invertido. Los
pocillos se analizan respecto al grado de ECP observado. Los pocillos que contengan slo clulas o
clulas y antisuero no deberan mostrar ECP. Por el contrario, los pocillos con clulas y virus deberan
mostrar un ECP claro. Se considera que el virus no identificado es serolgicamente idntico al serotipo
estndar de BTV si ambos resultan neutralizados en la prueba con un grado similar.
iv)
Prueba de inhibicin de la fluorescencia (5)

Este mtodo de neutralizacin, rpido y sencillo, requiere varias concentraciones de un virus
desconocido y concentraciones estndar de antisueros de referencia. Los virus aislados que han
crecido en cultivo celular se diluyen en serie y se mezclan con antisueros individuales de referencia en
los pocillos de una placa Lab-Tek durante 1 hora antes de aadir las clulas. Despus de incubar
16 horas, las clulas se fijan y se tratan con un procedimiento inmunofluorescente que utiliza un MAb
especfico del serogrupo LA. El serotipo del virus se indica por la especificidad del antisuero que causa
una reduccin mayor en el nmero de clulas fluorescentes.
c)
Reaccin en cadena de la polimerasa (prueba prescrita para el mercado internacional)

La amplificacin del cido nucleico vrico dirigida por cebadores ha revolucionado el diagnstico de la LA (8,
26, 37). Las tcnicas de la reaccin en cadena de la polimerasa (PCR) han permitido la identificacin rpida
del cido nucleico vrico del BTV en la sangre y otros tejidos de animales infectados. Respecto al comercio
internacional, la PCR ha permitido la identificacin de animales con anticuerpos contra BTV que son
negativos para la presencia del cido nucleico viral, lo que permite su importacin. La PCR tambin se
puede emplear para establecer el serogrupo de los Orbivirus y, en ltimo trmino, para serotipar el BTV a
los pocos das de recibir una muestra clnica, como sangre de una oveja infectada. Los enfoques clsicos,
que dependen del aislamiento del virus y de su identificacin serolgica, pueden tardar por lo menos 3-4
semanas en suministrar informacin sobre serogrupos y serotipos.
217
Los cebadores oligonucleotdicos utilizados hasta ahora derivan del ARN 7 (gen VP7) (37), del ARN 6 (gen
NS1) (9), del ARN 3 (gen VP3) (30), del ARN 10 (gen NS3) (4) y del ARN 2 (VP2) (26). En general, el
tamao de los productos amplificados de la transcripcin es pequeo -del orden de varios centenares de
nucletidos- pero tambin puede ser un gen completo. En el procedimiento que se describe ms adelante
con detalles se amplifica un fragmento del ARN 6 con 101 nucletidos. Los cebadores que derivan de
genes ms conservados, como el VP3, VP7 y NS1, se pueden utilizar para serogrupos (es decir,
reaccionarn con todos los miembros del serogrupo LA), mientras que aquellos cuya secuencia deriva de
las secuencias de genes VP2 permiten obtener informacin sobre el serotipo vrico. Se ha utilizado un
ensayo de PCR mltiple, que depende del tamao de los productos amplificados, para identificar en una
sola reaccin los cinco serotipos norteamericanos del BTV, tanto aislados como en mezclas (19).
En el BTV, la secuencia nucleotdica de genes homlogos puede variar en funcin del rea geogrfica del
aislamiento del virus (17). Esto supone una oportunidad nica para complementar estudios epidemiolgicos
sobre el BTV, al suministrar informacin sobre el potencial origen geogrfico de los virus aislados, un
proceso que se denomina genotipado o topotipado. Por tanto, la determinacin de la secuencia de
porciones del ARN 3 y ARN 6 puede indicar si el virus procede de Australia, Norteamrica o Sudfrica.
Parece probable que la secuenciacin de BTV aislados de otras partes del mundo permita una
discriminacin ms fina del origen geogrfico. No obstante, la relacin entre la secuencia y el origen
geogrfico puede no ser directa. Por anlisis mediante PCR del ARN del segmento genmico 7 (38) los
genotipos especficos de zonas geogrficas no quedaron tan claramente definidos como lo fueron usando
el ARN del segmento genmico 3 (17). El desarrollo del topotipo como instrumento epidemiolgico
depende, por tanto, de la adquisicin de datos sobre las secuencias de BTV aislados de muchas regiones
diferentes del mundo y de la disponibilidad de los datos en bancos de datos de fcil acceso. En principio,
con una base de datos sobre secuencias del ARN 2 suficientemente grande, se podra determinar
rpidamente el serotipo del virus por amplificacin del ARN 2 mediante PCR. Para facilitar este proceso, se
deberan hacer accesibles nuevos datos de secuenciacin derivados tanto de aislamientos de BTV
caracterizados como no caracterizados enviando los datos a sitios de la web tales como:
http://www.iah.bbsrc.ac.uk/dsRNA_virus_proteins/ and
http://www.iah.bbsrc.ac.uk/dsRNA_virus_proteins/btv_sequences.htm.
El sitio de la web http://www.iah.bbsrc.ac.uk/dsRNA_virus_proteins/btv2-segment-2-tree.htm presenta
anlisis de rboles filogenticos de aislamientos de BTV basados en la secuencia del ARN 2. Estos datos
representarn un recurso para estudios epidemiolgicos, la identificacin de nuevos aislados y el diseo de
nuevos cebadores para PCR posterior por trascripcin inversa (RT) y, posiblemente, para pruebas
especficas de serotipo de BTV.
Se ha observado que en la sangre de terneros y ovejas infectadas se puede detectar el cido nucleico del
BTV durante al menos 30 das, y a veces hasta 90 das, despus de que el virus pueda aislarse. Cuando la
sangre positiva para el virus (infecciosa) o negativa para el virus pero positiva por PCR (detectable slo por
PCR) se inocul o se dio por alimento al vector Culicoides sonoriensis, se demostr que el virus se
multiplicada y se transmita slo por los vectores expuestos a la sangre infecciosa. Los vectores expuestos
a sangre slo positiva por PCR no amplificaban ni transmitan el BTV (23). Debido a esto, el diagnstico
basado en PCR debe interpretarse con limitaciones. El procedimiento basado en PCR detecta cido
nucleico especfico del virus, pero no indica necesariamente la presencia de virus infeccioso.
La capacidad de las pruebas PCR para detectar un pequeo nmero de molculas de cido nucleico
significa que tales pruebas son muy sensibles a la contaminacin por cidos nucleicos extraos, incluyendo
cualquier cebador utilizado en el laboratorio o polonucletidos amplificados previamente. Por tanto es
importante disponer de un rea "limpia" que contenga todo el equipo necesario para la preparacin de los
reactivos y de las pruebas y un rea separada para el propio equipo de amplificacin. Se deben utilizar
guantes de ltex y cambiarlos con frecuencia en todas las fases del procedimiento, en particular despus
de trabajar con muestras de ARN o de ADN amplificado. Esto ayuda a proteger a los reactivos y a las
muestras de la contaminacin por ARNasas ubicuas y otros agentes y de la contaminacin cruzada con
ADN. La posibilidad de falsos positivos por contaminacin de la muestra realza la importancia de secuenciar
los productos de la PCR para determinar, por ejemplo, si la secuencia amplificada es idntica o diferente de
la de un control positivo. Los resultados negativos falsos, debidos, por ejemplo, a muestras de baja calidad
o a cebadores inadecuados, se pueden identificar determinando la imposibilidad de amplificar algn gen del
BTV o del hospedador, como el de la globina, en extractos de clulas infectadas.
La prueba de PCR que se describe comprende tres procedimientos separados. En el primero se extrae el
ARN del BTV a partir de sangre mediante un agente caotrpico como tiocianato de guanidina (GuSCN) para
desnaturalizar las protenas y liberar el ARN vrico. Para esto existen varias preparaciones comerciales en
el mercado y el protocolo indicado describe la utilizacin de uno de esos preparados, el IsoQuick (Orca
Research, Bothell, Washington, EE.UU.). Los reactivos suministrados con la preparacin vienen numerados
y su uso se indica en el protocolo descrito ms adelante. Existen otras preparaciones disponibles y una de
218
ellas, la TRIZOL (Life Technologies, Grand Island, New York, EE.UU.), es particularmente til para la
extraccin del cido nucleico del virus del bazo o de cogulos de sangre. Los operadores deben seguir las
indicaciones sealadas en cada caso y el uso de las soluciones de los reactivos suministradas o
recomendadas. El segundo procedimiento es la desnaturalizacin del ARN vrico de cadena doble y la
transcripcin inversa para generar cADN, que se amplifica por PCR. En el procedimiento descrito a
continuacin se utiliza el Superscript Amplification System (Life Tecnologies) para transcribir el ARN vrico
y reactivos de Perkin-Elmer para la PCR. Existen preparaciones y reactivos equivalentes en otras fuentes
comerciales. El paso final del proceso es el anlisis del producto de la PCR por electroforesis. Los
procedimientos para determinar la secuencia del producto amplificado no se describen aqu.
Extraccin del ARN viral
i)
Se recoge, en tubos con EDTA, sangre entera de los animales a ensayar y de controles no infectados
y se centrifuga a 800-1.000 g durante 10 minutos. Se aspira el plasma y los eritrocitos (RBCs) se
resuspenden suavemente en PBS estril. Los RBCs se sedimentan por centrifugacin a 1.000 g
durante 10 minutos y se elimina el sobrenadante.
ii)
A continuacin se aaden 400 l de los RBCs de ensayo a cada uno de cuatro tubos de
microcentrfuga de 1,7 ml y otros 400 l de RBCs control a cada uno de dos tubos de microcentrfuga.
A cada tubo se aade el mismo volumen de agua libre de ARNasa y se agitan brevemente en un
vrtex para mezclar y lisar las clulas. Se congelan dos tubos que contengan los RBCs de ensayo a 70C con fines de reposicin y se contina la extraccin por duplicado.
iii)
Se centrifugan los RBCs lisados del ensayo y del control a 12.000-16.000 g durante 10 minutos y se
elimina el sobrenadante. Luego se aaden 800 l de agua libre de ARNasa y los tubos se agitan en un
vrtex y se centrifugan de nuevo a la misma velocidad durante 10 minutos. Se elimina el sobrenadante
y el precipitado con los RBCs se deja escurrir.
iv)
Se aade un pequeo volumen de BTV (por ejemplo, 5 l que contengan de 103 a 107 PFU) a uno de
los dos tubos con el precipitado de RCBs control. Este es el control positivo. El otro tubo que contiene
el precipitado de RCBs control se convierte en el control negativo.
v)
A continuacin se aade a cada precipitado 75 l de tampn de muestra (reactivo A de IsoQuick), y se

agitan vigorosamente en un vrtex, aadiendo despus 125 l de la solucin de lisis que contiene
GuSCN (reactivo 1 de IsoQuick). La mezcla se agita vigorosamente en un vrtex durante
30 segundos.
vi)
Antes de utilizar la matriz de extraccin que acompaa a la preparacin comercial (reactivo 2 de

IsoQuick ms el colorante 2A) se agita vigorosamente y se aaden 500 l a los lisados. Despus se
aaden 400 l de tampn de extraccin (reactivo 3 de IsoQuick) y los tubos se agitan en un vrtex
durante 10 segundos.
vii)
Se incuban los tubos a 65C durante 10 minutos, se agitan brevemente despus de 5 minutos y se
centrifugan a 12.000 g durante 5 minutos.
viii) La fase acuosa (500 l) se transfiere a un tubo nuevo de microcentrfuga y se aade el mismo
volumen de matriz de extraccin (reactivo 2 de IsoQuick). Los tubos se agitan en vrtex durante
10 segundos y se centrifugan a 12.000 g durante 5 minutos.
ix)
La fase acuosa (330 l) se transfiere a un tubo nuevo de microcentrfuga y se aaden 33 l acetato

sdico al 10% (reactivo 4 de IsoQuick) y 365 l de isopropanol. Despus de mezclar suavemente, se
colocan los tubos de 20 minutos a 1 hora a -20C.
x)
El ARN se precipita por centrifugacin a 12.000 g durante 10 minutos. Se decanta el sobrenadante y

se aade 1,0 ml de etanol al 70% mezclando suavemente. Despus de centrifugar a 5.000 g
durante 5 minutos, se decanta el sobrenadante y se aade 1,0 ml de etanol al 100%. Se guardan los
tubos a 70C hasta que se usen en la RT-PCR.
Reaccin en cadena de la polimerasa con transcripcin inversa
i)
Se centrifuga el ARN en etanol a 12.000 g durante 5 minutos. Se decanta el l etanol y se invierten los
tubos para dejar escurrir. El precipitado, que puede pasar desapercibido, no debe secarse porque esto
hara difcil su resuspensin. Tambin es posible que un precipitado seco se desprendiera del tubo
invertido.
ii)
Se aade a cada tubo 12 l de agua libre de ARNasa, se mezcla y se calienta a 65C durante 510 minutos. Las muestras se colocan en hielo.
iii)
En una campana de bioseguridad "limpia", se preparan en agua libre de ARNasa las soluciones stock
que contienen 200 pmoles/l de los cebadores A, B, C y D y se guardan a -70C.
219
Cebadores de la primera fase de la PCR (para amplificar el ARN 6 desde el nucletido 11 al 284)
Cebador A: 5-GTT-CTC-TAG-TTG-GCA-ACC-ACC-3
Cebador B: 5-AAG-CCA-GAC-TGT-TTC-CCG-AT-3
Cebadores de la PCR (para amplificar el RNA 6 del nucletido 170 al 270)
Cebador C: 5-GCA-GCA-TTT-TGA-GAG-AGC-GA-3
Cebador D: 5-CCC-GAT-CAT-ACA-TTG-CTT-CCT-3
iv)
Las soluciones stock de los cebadores se diluyen a una concentracin de 15-20 pmoles/l. Se
preparan los cebadores para la primera fase de la reaccin de PCR mezclando volmenes iguales de
A y B. Se preparan los cebadores para la otra fase de la reaccin de PCR mezclando volmenes
iguales de C y D. Las mezclas de cebadores se congelan a -20C en pequeas alcuotas.
v)
Se rotulan los tubos de reaccin y se aade a cada tubo 4 l de mezcla de los cebadores (A+B) para
la primera fase de sntesis. Los tubos se dejan en hielo.
vi)
En una campana extractora de humos "limpia" se diluyen por separado, en agua libre de ARNasa,
hidrxido metilmercrico a 50 mM (dilucin 1/20) y 2-mercaptoetanol a 350 mM (dilucin 1/40). Estos
compuestos estn catalogados respectivamente como extremadamente txico y muy txico. Hay que
utilizar ambos con mucho cuidado y eliminarlos, as como las puntas de pipeta utilizadas con ellos,
segn las normas de seguridad,
vii)
Despus se aaden 4 l de las muestras de ARN de ensayo y de control positivo y negativo (paso (ii))
sobre los 4 l de mezcla de cebadores de PCR (38).
viii) A cada tubo de PCR se aaden 2,0 l de la dilucin 1/20 de hidrxido metilmercrico con agitacin
suave y se deja estar a temperatura ambiente durante 10 minutos antes de aadir 2,0 l de la dilucin
1/40 de 2-mercaptoetanol. Por razones de seguridad, algunos laboratorios utilizan formamida en vez
de hidrxido metilmercrico para desnaturalizar el ARN de dos cadenas. Sin embargo, es preferible el
hidrxido metilmercrico para una sensibilidad ptima.
ix)
En una campana "limpia" se prepara una mezcla para ADNc que contenga los siguientes reactivos en
volumen suficiente para el nmero de muestras que se van a ensayar. La cantidad indicada es por
muestra y los reactivos son los contenidos en la preparacin Superscript Preamplification System
(Life Technologies).
10tampn SuperscriptTM (200 mM Tris/HCl, pH 8,4, y 500 mM KCl)
MgCl2 (25 mM
Mezcla de dNTP (10 mM de dATP, dCTP, dGTP, dTTP)
Dithiothreitol (DTT) (0,1 M)
Transcriptasa inversa (200 units/l)
2,0
2,0
1,25
2,0
0,75
l
l
l
l
l
x)
Despus se aaden 8 l de la mezcla a cada tubo de PCR hasta un volumen final de20,0 l.
xi)
Se colocan los tubos de PCR en un termociclador, como el GeneAmp PCR System 9600, que se
programa para transcripcin inversa del siguiente modo:
Mantener 44C
Mantener 4C
xii)
50 minutos
Constante
Se sacan los tubos del termociclador y se aade a cada tubo 1,0 l de ARNasa H y una bola de cera.
El ciclador se programa del siguiente modo:
Mantener 37C
Mantener 98C
Mantener 4C
20 minutos
4 minutos
Constante
xiii) En una campana "limpia" se prepara una mezcla de primera amplificacin que contenga los siguientes
reactivos en volumen suficiente para el nmero de muestras de ensayo. Todos los reactivos, excepto
el agua, son comercializados por Perkin-Elmer. La cantidad que se indica es por muestra.
ARNasa sin agua
10tampn PCR Perkin-Elmer (100 mM Tris/HCl, pH 8,3, y 500 mM KCl)
MgCl2 (25 mM)
Mezcla de dNTP (2,5 mM de dATP, dCTP, dGTP, dTTP)
Taq ADN polimerasa (5 unidades/l)
62,0 l
7,0 l
7,0 l
4,0 l
0,85 l
xiv) La mezcla de la primera fase se saca del rea "limpia" y se lleva al rea del termociclador y se
depositan 80 l en cada tubo con muestra. La capa de cera no debe romperse. Cada tubo debe
contener entonces 101 l.
220
xv)
Se colocan los tubos en el termociclador que se programa como se indica para la primera fase de
amplificacin (correcto para el GeneAmp PCR System 9600 -la programacin en otros termocicladores
debe determinarse):
Un ciclo:
Mantener 95C
Mantener 58C
Mantener 72C
3 minutos
20 segundos
30 segundos
40 ciclos:
Mantener 95C
Mantener 58C
Mantener 72C
20 segundos
20 segundos
20 segundos
Un ciclo:
Mantener 95C
Mantener 58C
Mantener 72C
Mantener 4C
20 segundos
20 segundos
5 minutos
Constante
xvi) 15 minutos antes de que se complete la programacin, se preparan tubos de PCR para la siguiente
reaccin en una campana "limpia", y se mantienen en hielo:
ARNasa sin agua
Mezcla de cebadores (C+D)
Bola de cera
17 l por tubo
4,0 l por tubo
xvii) Cuando se completa la primera fase de amplificacin, se sacan los tubos del termociclador y se
colocan en una cabina de seguridad biolgica (no la campana "limpia). Despus, se transfiere 1,5 l
del producto de la primera fase al tubo correspondiente de PCR de la segunda fase que contiene
cebador, agua y una bola de cera.
xviii) Se colocan los tubos en el termociclador que se programa como se indica para la formacin de una
capa de cera:
Mantener 98C
Mantener 4C
4 minutos
Constante
xix) En una campana "limpia" se prepara la mezcla de los siguientes reactivos en volumen suficiente para
el nmero de muestras a ensayar. Los reactivos son los mismos que en la primera fase (paso xii). Las
cantidades que se indican son por muestra:
ARNasa sin agua
10 tampn PCR
MgCl2
Mezcla de dNTP
Taq ADN polymerasa
17,0 l
5,0 l
3,5 l
4,5 l
0,5 l
xx)
La mezcla se pasa de la campana "limpia" al termociclador y se depositan 30 l en cada tubo. Cada

tubo debe contener entonces 52 l.
xxi)
Se colocan los tubos en el termociclador, que se programa como se indica para la segunda
amplificacin. Despus de completar el proceso, los tubos se mantienen a 4C o a 20C hasta la
electroforesis:
Un ciclo:
40 ciclos:
Un ciclo:
Mantener
95C
Mantener
58C
Mantener
72C
3 minutos
20 segundos
30 segundos
Mantener
95C
Mantener
58C
Mantener
72C
20 segundos
Mantener
95C
Mantener
58C
Mantener
72C
Mantener 4C
20 segundos
20 segundos
20 segundos
20 segundos
5 minutos
Constante
221
Anlisis electrofortico del producto de la PCR
i)
Al principio se prepara tampn 1 x TBE (Tris/borato, pH 8,6, y EDTA 1,5 mM) a partir de una solucin
stock x 10. Para el sistema de Bio-Rad Wide Mini-Sub cell, se preparan 700 ml (100 ml para el gel y
600 ml para el depsito de tampn).
ii)
Se prepara en tampn TBE una solucin al 3% de agarosa NuSieve 3/1 (FMC Bioproducts, Rockland,
Maine, EE.UU.) o una agarosa equivalente. La solucin se hierve hasta que la agarosa se disuelve por
completo y luego se deja enfriar hasta 40C. Se aade bromuro de etidio a una concentracin de
0,5 g/ml tanto al tampn de la agarosa como al del depsito. El bromuro de etidio es mutagnico y
txico. Se debe utilizar siempre guantes, ropa protectora y proteccin ocular.
iii)
Se cierran los extremos de la bandeja de electroforesis y se vierte la solucin de agarosa. El peine se

inserta en la agarosa hasta que se solidifica en una superficie nivelada a los 30-60 minutos. El peine y
el cierre se eliminan con cuidado de la bandeja de electroforesis.
iv)
Verter el tampn en el depsito del aparato de electroforesis e insertar la bandeja con la agarosa de
modo que el tampn cubra la agarosa.
v)
Las muestras de ensayo y los controles positivos y negativos se preparan para electroforesis en tubos
de microcentrfuga del modo siguiente:
Solucin de gel de carga (Cat. G-2526, Sigma, St Louis, Missouri, EE.UU.) 5,0 l
ADN amplificado de cada tubo de PCR y un tubo extra para
un ADN marcador
15,0 l
Solucin de gel de carga (Cat. G-2526, Sigma, St Louis, Missouri, EE.UU.) 5,0 l
Marcador de 100 pares de bases (Cat. 15268-019, Life Technologies,
Grand Island, New York, EE.UU.)
1,0 l
vi)
Se cargan las muestras en los pocillos adecuados del gel y se corren a 65-75 voltios durante 1-1,5
horas o hasta que el colorante alcance la mitad de la longitud del gel. El gel se lleva a un
transiluminador y se fotografa para documentacin permanente. Usar proteccin ocular para
visualizar las bandas en el gel.
vii)
Las muestras positivas para LA tendrn una banda de 101 pares de bases. Para que la prueba sea
vlida, el control positivo debe mostrar una banda del tamao correcto, y el negativo y los controles sin
ARN no deben mostrar banda. Las muestras se consideran positivas si hay una banda del mismo
tamao que la del control positivo. Las muestras duplicadas deberan mostrar la misma reaccin. Si
existe disparidad, la prueba debe repetirse.
viii) Durante una noche se coloca en el tampn del depsito un envase (Ameresco, Solon, Ohio, EE.UU.)
al objeto de eliminar el bromuro de etidio. Despus se puede verter el tampn al alcantarillado y debe
colocarse el envase, despus de reutilizarlo 10-15 veces,
en un recipiente identificado
adecuadamente como bromuro de etidio y, finalmente, incinerado.
Los equipos y reactivos para dos pruebas serolgicas ordenadas - la prueba de inmunodifuein en gel de
agar (IGDA) y la prueba C-ELISA- se pueden obtener de tres fabricantes autorizados en EE.UU (VMRD,
P.O. Box 502, Pullman, Washington 99163, U.S.A.; o Veterinary Diagnostic Technology, 4980 Van Gordon
Street, Suite 101, Wheat Ridge, Colorado 80033, U.S.A.; o Diagxotics, 27 Cannon Road, Wilton,
Connecticut 06897, U.S.A.). Los reactivos para C-ELISA estn disponibles en: European Union Community
Reference Laboratory for BTV (Pirbright Laboratory, Ash Road, Pirbright, Woking GU24 0NF, United
Kingdom).
2.
Pruebas serolgicas
Los anticuerpos contra BTV generados en animales infectados pueden detectarse de varios modos que
dependen de la sensibilidad y el tipo de prueba utilizada. Se inducen tanto anticuerpos especficos de serogrupo
como anticuerpos especficos de serotipo, y si el animal no ha estado previamente expuesto al BTV, los
anticuerpos neutralizantes que se generan son especficos para el virus infectante. Las infecciones mltiples con
diferentes serotipos de BTV dan lugar a la produccin de anticuerpos capaces de neutralizar serotipos a los que
el animal no ha estado expuesto. Hay dos explicaciones para este fenmeno. Primero, varios serotipos
comparten eptopos de neutralizacin definidos por MAbs monoclonales. Segundo, los serotipos tambin
comparten un gran nmero de eptopos que estn presentes en una conformacin neutralizante en un serotipo,
pero en conformaciones no neutralizantes en otros serotipos.
a)
Fijacin de complemento
Hasta 1982 se utiliz ampliamente una prueba de fijacin de complemento (7) para detectar anticuerpos
contra BTV, que fue en gran medida reemplazada por la prueba IGDA aunque la prueba FC todava se
utiliza en algunos pases.
222
b)
Inmunodifusin en gel de agar (una prueba prescrita para el mercado internacional)

La prueba IGDA para detectar anticuerpos anti-BTV es de desarrollo simple y el antgeno utilizado en la
prueba es relativamente fcil de generar. Desde 1982, la prueba ha sido el procedimiento estndar de
ensayo para controlar el movimiento internacional de rumiantes. Sin embargo, una de las desventajas de la
IGDA utilizada para LA es su falta de especificidad, por la que puede detectar anticuerpos contra otros
Orbivirus, en particular los del serogrupo EHD. Por tanto, los sueros positivos por IGDA deben ser probados
de nuevo utilizando una prueba especfica para el serogrupo LA. La falta de especificidad y la subjetividad
que se ejerce durante la lectura de los resultados ha promovido el desarrollo de procedimientos basados en
ELISA para la deteccin especfica de anticuerpos anti-BTV. La versin preferida, una tcnica C-ELISA, se
describe en la seccin B.2.c.
c)
i)
Se prepara una capa de 2,8 mm de grosor de agarosa al 0,9% en NaCl al 0,85% y se cortan pocillos
circulares de 4,0 mm de dimetro separados entre s 2,4 mm, con un pocillo central y seis pocillos
perifricos.
ii)
Se prepara antgeno vrico generando una preparacin soluble de clulas BHK o Vero infectadas 2448 horas antes con un serotipo individual de BTV. El antgeno se puede concentrar por precipitacin o
ultrafiltracin.
iii)
Se colocan tres sueros positivos y tres sueros de ensayo de forma alterna en los pocillos que rodean
el pocillo central que contiene el antgeno y se incuban las placas 24 horas en un ambiente hmedo a
20-25C.
iv)
Se forma una serie de lneas de precipitina entre el antgeno y los sueros positivos, y las lneas
generadas por los sueros de ensayo positivos se juntarn con las de los controles positivos. Con
muestras dbilmente positivas las lneas control se curvan hacia el antgeno y se separan del pocillo
de la muestra de ensayo, pero no forman una lnea continua con los pocillos de control de la prueba.
Con muestras negativas, las lneas de precipitina continan en los pocillos de la muestra sin curvarse
hacia el antgeno.
v)
Todas las muestras dbilmente positivas y otras muestras que produzcan resultados dudosos deben
repetirse utilizando pocillos de 5,3 mm de dimetro separados entre s 2,4 mm o probarse de nuevo
utilizando C-ELISA como se describe a continuacin.
La prueba competitiva ELISA, o prueba ELISA bloqueante para LA, se desarroll para medir anticuerpos
especficos contra BTV sin detectar anticuerpos de reaccin cruzada con otros Orbivirus (1, 3, 22, 28, 31).
La especificidad es el resultado de utilizar uno de varios MAbs con reactividad de serogrupo para LA, como
MAb-3-17-A3 (3) o MAb 20E9 (21, 22). Los anticuerpos proceden de varios laboratorios y, aunque son
diferentes, todos parecen unirse a la regin amino-terminal de la principal protena de la cpsida, VP7. En la
prueba C-ELISA, los anticuerpos de los sueros de ensayo compiten con los MAbs para unirse al antgeno.
El siguiente procedimiento de C-ELISA se ha estandarizado despus de estudios comparativos en varios
laboratorios internacionales.
i)
Durante una noche a 4C o durante 1 hora a 37C, se recubren los 96 pocillos de las placas de
microtitulacin con 50-100 l de antgeno derivado de cultivos celulares obtenido por sonicacin (3) o
del antgeno principal de la cpsida VP7 expresado en baculovirus (29) o levaduras (25), y diluidos en
0,05 M de tampn carbonato, pH 9,6.
ii)
Las placas se lavan cinco veces con PBST (0,01 M de PBS con 0,05% o 0,1% de Tween 20, pH 7,2).
iii)
A continuacin se aaden por duplicado 50 l de sueros de ensayo a una nica dilucin, 1/5 (1) o 1/10
(22), en PBST que contenga 3% de seroalbmina bovina (BSA).
iv)
Inmediatamente, se aade a cada pocillo 50 l de una dilucin predeterminada de MAb diluido en

PBST que contenga 3% de BSA. Los pocillos de control de MAb contienen tampn de dilucin en vez
de suero de ensayo.
223
v)
Se incuban las placas 1 hora a 37C o 3 horas a 25C, con agitacin continua.
vi)
Despus de lavar como se indic anteriormente, los pocillos se llenan con 100 l de una dilucin
apropiada de IgG (H+L) anti-ratn obtenida en conejo y marcada con peroxidasa de rbano, realizada
en PBST con 2% de suero normal bovino.
vii)
Despus de incubar 1 hora a 37C, se elimina la solucin del conjugado y las placas se lavan cinco
veces con PBS o PBST. Los pocillos se llenan con 100 l de solucin de substrato que contiene 1,0 M
de ABTS (2,2-azino-bis-[3-etilbenzotiazolina-6 cido sulfnico]), y 4 mM de H2O2 en 50 mM de citrato
sdico, pH 4,0, y las placas se agitan a 25C durante 30 minutos. (Se pueden utilizar otros substratos
y dejar que la reaccin contine con agitacin por un tiempo adecuado para permitir el desarrollo de
color).
viii) La reaccin se detiene adicionando un agente bloqueante, como azida sdica.

ix)
Despus de poner a cero el lector de ELISA con los pocillos que slo contienen substrato y agente
bloqueante, se miden los valores de absorbancia a 414 nm. Los resultados se expresan como
porcentajes de inhibicin y derivan de los valores medios de absorbancia de cada muestra por la
frmula siguiente:
% inhibicin = 100 -[(Media de la absorbancia de la muestra de ensayo) / (Media de la absorbancia del
control de MAb)] x 100.
NB: Algunos laboratorios prefieren usar un control de suero negativo que previamente se ha visto que
tiene un porcentaje de inhibicin igual a cero como alternativa al control de MAb.
x)
Porcentajes de inhibicin >50% se consideran positivos. Una inhibicin entre el 40% y el 50% se
considera sospechosa. Los resultados de los duplicados de los sueros de ensayo pueden variar con
tal de que los valores caigan dentro del valor de inhibicin escogido.
xi)
En cada placa se deben incluir sueros positivos fuertes y dbiles y un control de suero negativo. Un
positivo dbil debe dar un 60-80% de inhibicin y un negativo menos de 40% de inhibicin.

De las varias opciones de vacunas posibles, es decir, las vivas atenuadas, las muertas, o las recombinantes,
slo estn en uso las vacunas con virus vivos atenuados en varios pases. En Sudfrica, por ejemplo, se han
usado durante ms de 40 aos y se saben que inducen una inmunidad eficaz y duradera (11). Aunque algunos
estudios de laboratorios han investigado la eficacia de las vacunas inactivadas contra el virus (15), stas no
parecen haberse utilizado en condiciones de campo. Existen varias posibilidades en el desarrollo de vacunas
recombinantes contra BTV, como la presentacin por otros virus vivos de los antgenos de neutralizacin del BTV
y de partculas incompletas (VLP) que se generan en clulas de insectos infectadas por medio de baculovirus
recombinantes que expresan las cuatro protenas mayoritarias de la cpsida VP2, 3, 5 y 7. Slo la ltima
posibilidad ha demostrado ser una promesa significativa (33). Sin embargo, queda an mucho por determinar,
como la duracin de la respuesta neutralizante generada con las VLP, la necesidad de mltiples VLPs de
diferentes serotipos, y el escalado comercial de la produccin de VLP como proceso eficaz y de coste adecuado.
La descripcin que sigue es aplicable a las vacunas con virus atenuados.
1.
Control del inculo
a)

El inculo base o primario se prepara a partir de una placa o calva nica de BTV atenuado que se ha
cultivado por pases seriados. Los lotes de inculo secundario, que se utilizan como inculos en la
produccin de vacunas, derivan por lo general de no ms de tres pases adicionales respecto al inculo
primario. El virus del inculo primario debe estar exento de bacterias, virus, hongos y micoplasmas
contaminantes, y en particular de contaminacin por pestivirus, y tiene que mostrar la especificidad
serotpica deseada. Antes de la produccin de la vacuna, cada lote de inculo primario debera probarse
tambin para transmisin y reversin de la virulencia. Se deben probar en ovejas la avirulencia, seguridad e
inmunogenicidad de muestras de la vacuna preparada de inculos vricos secundarios del mximo nivel de
pases permitidos.
b)
Mtodo de cultivo
Las primeras vacunas de la LA se propagaron en ECE (2). Ms recientemente, se han utilizado varias
clulas diferentes para adaptarlas al cultivo celular y a los pases seriados. Entre stas estn las clulas
224
primarias de embrin bovino, clulas de rin de cordero y de cordero fetal, y la lnea celular continua de
clulas BHK. Las clulas utilizadas para la atenuacin deben ser cuidadosamente comprobadas para
detectar la presencia de virus contaminantes. No slo las lneas celulares pueden contener virus
oncognicos, sino que tambin las clulas primarias pueden tener infecciones latentes o no aparentes,
como las debidas a contaminacin por pestivirus. A este respecto, se debe tener un cuidado especial con el
suero fetal bovino utilizado en los cultivos celulares, pues puede estar contaminado. Los virus de las
vacunas se atenan por pases en ECE, en cultivos celulares, o en ambos sistemas.
c)

Las vacunas atenuadas contra la LA deben ser seguras y eficaces, y a continuacin se presenta una
descripcin breve de las pruebas relacionadas con estos parmetros. Adems, los virus atenuados no
deben revertir a virulentos durante su replicacin en animales vacunados ni transmitirse desde tales
animales por insectos vectores. Este ltimo criterio es muy importante porque la transmisin de virus
atenuados mediada por insectos desde animales vacunados a no vacunados, con los subsiguientes pasos
replicativos en cada especie hospedadora, aumenta la probabilidad de reversin a la virulencia. Aunque las
pruebas de reversin a virulencia y de transmisin se realizan raramente, se resumen en una breve
descripcin los requisitos.
i)
Avirulencia
Se inoculan varias ovejas, que por C-ELISA sean seronegativas para LA, con el stock de inculo
primario o un volumen equivalente de medio de cultivo celular. Las temperaturas se anotan dos veces
al da. Los animales se controlan regularmente durante 28 das para sntomas clnicos o reacciones
locales y sistmicas a fin de asegurar la avirulencia e seguridad. Las muestras de sangre que se
toman a intervalos regulares se pueden utilizar para determinar la viremia y la respuesta de
anticuerpos. La prueba es vlida si todas las ovejas inoculadas con vacuna muestran evidencia de
crecimiento vrico sin signos de enfermedad, excepto una enfermedad suave y pasajera. En Sudfrica
se calcula un ndice de reaccin clnica (33) para cada animal entre los das 4 y 14, y debe estar por
debajo de un valor estndar especfico.
ii)
Inocuidad
Las pruebas de inocuidad de las vacunas atenuadas no contemplan la cuestin de la teratogenicidad
(34). Las vacunas con virus atenuados son teratognicas y no deben administrarse a ovejas gestantes
durante la primera mitad del embarazo debido a que pueden causar anormalidades fetales y muerte
(20).
iii)
Eficacia
Las ovejas vacunadas y no vacunadas reciben un inculo de desafo con virus virulento del mismo
serotipo, y los animales se analizan para sntomas clnicos de LA. Se toman diariamente las
temperaturas rectales dos veces. Las ovejas control no vacunadas deberan mostrar signos de LA. Sin
embargo, es difcil asegurar la aparicin de la enfermedad clnica en ovejas por la inoculacin de
algunos serotipos y aislados de BTV y, por tanto, la evidencia de infeccin en las ovejas control no
vacunadas puede reducirse a la aparicin de un aumento de temperatura de por lo menos 1.7C sobre
la media anterior al inculo de desafo. Se analizan los sueros, pre- y post-vacunacin, para la
presencia de anticuerpos neutralizantes.
iv)
Transmisin
Los procedimientos para determinar si un virus atenuado se puede transmitir por insectos que se
alimentan sobre ovejas virmicas vacunadas son difciles de realizar y de analizar estadsticamente.
Por ello, es raro que se investigue este criterio de validacin de la vacuna Hay datos que indican que
los virus adaptados a condiciones de laboratorio se pueden transmitir por insectos vectores (35). Un
procedimiento adecuado para determinar la transmisin de un virus atenuado requiere que las ovejas
estn vacunadas y que, durante la viremia, estn expuestas a Culicoides no infectados a los que se
deja alimentar sobre animales no infectados controlados para presencia de BTV y anticuerpos antiBTV. Como el ttulo de virus atenuados en la sangre de las ovejas vacunadas es muy bajo, se
necesitaran muchos Culicoides, y slo una pequea proporcin de stos llegaran a infectarse y vivir
lo suficiente para alimentarse sobre otra oveja no infectada y transmitirle potencialmente el virus. Es
difcil disear un experimento de laboratorio que tenga en cuenta el nmero de variables presentes en
situaciones de campo. Sin embargo, en Sudfrica se estima que el ttulo mnimo de virus circulante en
el torrente sanguneo de un animal debe ser por lo menos 103 antes de que un Culicoides se infecte al
alimentarse, aunque tambin se ha sugerido que a veces un ttulo inferior puede resultar infectivo.
Para seleccionar una cepa de virus atenuado que sea adecuada, se recoge sangre completa entre los
das 4 y 14 post-vacunacin y se determina el ttulo viral. Slo los virus atenuados que generan ttulos
inferiores a 103 se consideran aceptables para vacunas.
Lo datos actuales indican que durante la viremia, y a diferencia de los virus de tipo salvaje, las cepas
de BTV adaptadas a condiciones de laboratorio pueden aparecer en el semen de toros y carneros
(32). Las implicaciones de estas observaciones en la transmisin de los virus son confusas.
225
v)
Reversin a la virulencia
Los estudios de validacin confirman que en ovejas vacunadas los virus atenuados no revierten a
virulentos. Por consiguiente, si los insectos no transmiten los virus atenuados de animales vacunados
a no vacunados, la reversin a la virulencia resulta ser slo una posibilidad terica. Sin embargo, si los
virus atenuados pudieran transmitirse de animales vacunados, la reversin a la virulencia durante
varios ciclos de replicacin en oveja-insecto sera una posibilidad bien distinta. El nico modo
apropiado de comprobar la reversin a la virulencia bajo estas circunstancias es comparar la virulencia
del virus vacunal con la del virus sujeto a varios ciclos de replicacin oveja-insecto, como se coment
anteriormente. Esto es difcil de realizar. Por consiguiente, no se ha determinado el efecto de varios
pases en insecto y en oveja sobre la virulencia de los virus atenuados. En Sudfrica se considera que
si, durante la fase virmica, la sangre de los animales vacunados se pasa en serie tres veces por
oveja sin reversin a la virulencia, las posibilidades de reversin en el campo sern muy pequeas.
2.
Mtodo de produccin
La atenuacin de aislados naturales de BTV se realiz primero por pases seriados en ECE. Ms recientemente,
parece claro que el pase por clulas en cultivo tambin resulta en atenuacin de la virulencia. No se han hecho
estudios para relacionar con precisin el nmero de pases y el grado de atenuacin de virus o serotipos
individuales. Para preparar virus atenuados, los aislamientos de campo se adaptan a cultivo celular y se pasan in
vitro hasta 40 veces o ms. En teora, en esta etapa se seleccionan varios virus purificados de placas o calvas y
cada uno se examina para el nivel de viremia que generan y su capacidad para inducir una respuesta inmune de
proteccin en ovejas vacunadas. El virus ideal es el que se replica a bajo ttulo pero que induce respuesta
inmune protectora y ste puede representar la fuente del stock de virus para inculo primario de la vacuna.
3.
Control interno
Todos los componentes de origen animal, como el suero y las clulas, deben probarse para presencia de
bacterias, virus, hongos o micoplasmas viables.
4.
Control de lotes
a)
Esterilidad
Cada lote de vacuna tiene que ser probado para presencia de bacterias, virus extraos, hongos y
micoplasmas, y en particular contaminacin por pestivirus. Por ejemplo, en Sudfrica, se inocula un
conjunto de diez ampollas seleccionadas al azar en caldo de soja y caldo de tioglicolato y se incuba a
temperatura ambiente y a 37C, respectivamente, durante 14 das. Si el cultivo aparece contaminado, el
lote queda descalificado.
b)
Inocuidad
Cada lote se prueba para inocuidad en ratn adulto y neonato, en cobayas y en oveja. Si se advierten
reacciones adversas o sntomas notables, se repite la prueba. Cualquier incremento en la temperatura
corporal del animal por encima de la esperada para esa cepa particular de virus atenuado que se est
ensayando debe considerarse como sintomtico. Si los resultados no son satisfactorios, el lote se
descalifica.
c)
Potencia
Cada lote se prueba inoculando ovejas susceptibles. Los sueros de pre-vacunacin y los de 21 y 28 das
post-vacunacin se prueban por ensayos NV para determinar los niveles de anticuerpos neutralizantes.
Para superar este aspecto, el ttulo de anticuerpo debe ser igual o superior a unos valores establecidos por
estndares internacionales de vacunas.
d)
Los estudios sobre vacunas con BTV vivo atenuado han mostrado que en ovejas los anticuerpos aparecen
antes del da 10 post-vacunacin, alcanzan un mximo aproximadamente 4 semanas despus y persisten
durante ms de un ao. Existe una relacin temporal entre el aumento en el ttulo de anticuerpos
neutralizantes y la desaparicin del virus de la circulacin perifrica. Las vacunas con BTV vivo atenuado se
han usado ms de 40 aos y se sabe que inducen una inmunidad eficaz y duradera (13). En reas
endmicas de Sudfrica se presentan muchos serotipos de BTV, y se usan vacunas polivalentes. La
inclusin en la vacuna de 15 serotipos implica que no se genera una respuesta inmune eficaz frente a todos
los serotipos, probablemente porque la masa antignica de algunos antgenos individuales especficos de
serotipo es pequea. Para intentar ampliar la respuesta, se repite anualmente la vacunacin (12).
226
e)
f)
Estabilidad
La estabilidad debe probarse a lo largo de un perodo de 2 aos. Se considera que las vacunas
en forma lquida o liofilizada tienen una caducidad de 1 y 2 aos, respectivamente. Cada lote de
vacuna se somete a una prueba de caducidad acelerada, guardndolas a 37C durante 7 das.
Luego se titulan y evalan con arreglo a un procedimiento estndar, como se determina en las
pruebas iniciales de la vacuna.
La vacuna polivalente es segura excepto cuando se usa en ovejas en la primera mitad del embarazo. Los
corderos que tengan inmunidad por el calostro no pueden ser vacunados con eficacia antes de los 6 meses
de edad.
5.
a)
Inocuidad
b)
Ver C.4.b.
Potencia
Ver C.4.c.
AGRADECIMIENTOS
Se agradece al Dr. Peter Mertens su valiosa correspondencia sobre el futuro del diagnstico por PCR, al Dr. H.
Aitchison por suministrar informacin sobre la produccin y ensayo de la vacuna LA en Sudfrica, a los
Laboratorios Nacionales de Servicios Veterinarios en Ames, Iowa, EE.UU., por facilitar el protocolo detallado de
PCR para la lengua azul, y a todos los crticos del captulo publicado previamente en el Manual del ao 2000.
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*
* *
NB: Existen laboratorios de referencia de la OIE para la Lengua azul (ver Cuadro en la parte 3 de este
229
CAPTULO 2.1.10.
VIRUELA OVINA Y VIRUELA CAPRINA
RESUMEN
La viruela ovina y caprina son enfermedades vricas de las ovejas y de las cabras que se
caracterizan por fiebre, aparicin de ppulas o ndulos generalizados, vesculas (raramente),
lesiones internas (particularmente en los pulmones), y por la muerte. Ambas enfermedades estn
causadas por cepas de capripoxvirus, que pueden infectar a las ovejas y a las cabras, y, aunque la
mayora de las estirpes examinadas causan la enfermedad clnica en su forma ms grave ya sea
en las ovejas o en las cabras, se han aislado algunas cepas que son igualmente patgenas en
ambas especies. Se ha propuesto que se haga referencia a la viruela maligna de las ovejas y de
las cabras causada por capripoxvirus, incluyendo la viruela ovina y caprina de Kenia, la dermatitis
caprina de India y la forma nodular de la enfermedad de las ovejas y de las cabras del norte de
frica, como la viruela caprina.
La viruela caprina es endmica en frica (al norte del Ecuador), Oriente Medio, Turqua, Irn,
Afganistn, India, Nepal, en zonas de la Repblica Popular China, y, desde 1984, en Bangladesh.
Recientemente, la enfermedad ha hecho frecuentes apariciones en el sur de Europa.
Identificacin del agente: La confirmacin ms rpida de la viruela caprina en el laboratorio es la
identificacin de los viriones tpicos de la viruela caprina utilizando el microscopio electrnico de
transmisin en combinacin con una historia clnica de la infeccin generalizada de la viruela
caprina. El virin de la viruela caprina es diferente del de otro poxvirus que comnmente infecta a
las ovejas y a las cabras un parapoxvirus que causa el ectima contagioso o dermatitis pustular
contagiosa. Se puede identificar un antgeno de precipitacin mediante una prueba de
inmunodifusin en gel de agar (IGDA) utilizando material de biopsia de un ganglio linftico de un
caso temprano de viruela caprina y de sueros inmunes especficos; sin embargo, se produce una
reaccin cruzada con parapoxvirus. El capripoxvirus crece en los cultivos de tejidos de origen
ovino, caprino o bovino, aunque los aislados de campo pueden necesitar hasta 14 das para
crecer, o requerir uno o ms pases adicionales en cultivos de tejidos. El virus produce inclusiones
intracitopasmticas que se observan con claridad mediante la tincin con hematoxilina y eosina. El
antgeno se puede detectar tambin en cultivos de tejidos utilizando sueros especficos y las
tcnicas de inmunoperoxidasa o de inmunofluorescencia. El antgeno de capripoxvirus y los
cuerpos de inclusin se pueden observar en secciones obtenidas en un criostato o en secciones
de parafina teidas de material procedente de lesiones de biopsias o exmenes post-mortem.
Se ha elaborado un enzimoinmunoensayo (ELISA) utilizando un suero de deteccin policlonal
obtenido frente a un recombinante del antgeno inmunodominante de capripoxvirus. Se ha descrito
tambin la deteccin del genoma empleando cebadores especficos de capripoxvirus para los
genes de las protenas de fusin y de unin.
Pruebas serolgicas: La prueba de neutralizacin viral es la prueba serolgica ms especfica,
pero, debido a que la inmunidad a la infeccin de la viruela caprina est predominantemente
mediada por clulas, la prueba no es lo suficientemente sensible para identificar a los animales
que han tenido contacto con el virus y que slo han desarrollado niveles bajos de anticuerpo
neutralizante. Las pruebas IGDA y de inmunofluorescencia indirecta son menos especficas debido
a las reacciones cruzadas con anticuerpos frente a otros poxvirus. El anlisis de
inmunoelectrotransferencia (Western blotting) es sensible y especfico, pero resulta caro y difcil de
llevar a cabo utilizando la reaccin entre el antgeno P32 de capripoxvirus y los sueros de ensayo.
230
Captulo 2.1.10. Viruela ovina y viruela caprina
El uso de este antgeno, expresado en un vector adecuado, en una prueba ELISA ofrece la
posibilidad de realizar una prueba serolgica aceptable y estandarizada.
Requisitos para las vacunas y los biolgicos de diagnstico: Las vacunas vivas y las
inactivadas se han empleado para el control de la viruela caprina. Todas las cepas de
capripoxvirus examinadas hasta ahora comparten un sitio de neutralizacin principal y muestran
proteccin cruzada. Las vacunas inactivadas proporcionan inmunidad a corto plazo en el mejor de
los casos.
A. INTRODUCCIN
La viruela ovina y la viruela caprina son endmicas en frica del norte y central, en Oriente Medio y en India. La
viruela caprina est causada por cepas de capripoxvirus y produce una enfermedad clnica caracterstica en
razas sensibles de ovejas y cabras, que no puede confundirse con ninguna otra. En los animales autctonos, la
enfermedad y la mortalidad generalizadas son menos frecuentes, aunque s se observan en los lugares donde la
enfermedad ha estado ausente en una zona o en un pueblo durante un perodo de tiempo al introducir mtodos
intensivos de cra, o en asociacin con otros agentes causantes de enfermedades, tal como el virus de la peste
de los pequeos rumiantes o el virus de la fiebre aftosa.
La viruela caprina es la restriccin ms importante para la introduccin de razas exticas de ovejas y cabras, y
para el desarrollo de la produccin intensiva de animales de cra. Las cepas de capripoxvirus que originan la
dermatosis nodular contagiosa (tal como la Neethling) se encuentran tambin en bovinos, pero no hay pruebas
de que estas cepas causen la enfermedad en ovinos y en caprinos de forma natural. La distribucin geogrfica
de la dermatosis nodular contagiosa difiere de la de la viruela ovina y caprina.
Las cepas de capripoxvirus se transmiten entre los ovinos y los caprinos, aunque la mayora solamente causan la
enfermedad clnica ms grave en una especie; tambin se produce recombinacin entre estas cepas, originando
un espectro que muestra preferencias intermedias por el hospedador y un rango de virulencia. Algunas cepas
son igualmente patgenas en ovinos y en caprinos. La viruela caprina tiene la capacidad de propagarse y
establecerse en pases fuera de su distribucin normal. En 1983 se propag a Italia, en 1985 y 1989 a Chipre, y
en 1988 y en numerosas ocasiones posteriores a Grecia, pero no lleg a establecerse en estos pases. Sin
embargo, en 1984 se propag a Bangladesh donde persiste. Durante la ltima dcada se produjeron apariciones
ms frecuentes en Grecia y en Bulgaria.
El perodo de incubacin est entre 8 y 13 das despus del contacto entre un animal infectado y animales
susceptibles. Dicho perodo puede reducirse a 4 das despus de una infeccin experimental por inoculacin
intradermal o por transmisin mecnica por insectos. Algunas razas de oveja europea, tal como la Soay, pueden
morir de una infeccin aguda antes del desarrollo de las lesiones cutneas. En otras razas se produce una
elevacin inicial de la temperatura rectal por encima de los 40C, seguido, en primer lugar, por el desarrollo de
mculas pequeas zonas rodeadas de hiperemia que son ms obvias sobre la piel no pigmentada entre los
25 das, y, posteriormente, por el desarrollo de ppulas hinchazones duras de entre 0,5 y 1 cm de dimetro
que pueden cubrir el cuerpo o restringirse a la entrepierna, la axila y el perineo. Las ppulas pueden estar
cubiertas por vesculas llenas de fluido, pero esto no es muy comn. En algunas razas de cabra europea se ha
observado una forma de viruela caprina hemorrgica, en la que todas las ppulas parecen coalescer o unirse por
todo el cuerpo; esta forma es siempre mortal.
Dentro de las 24 horas de la aparicin de ppulas generalizadas, los animales infectados desarrollan rinitis,
conjuntivitis y el aumento del tamao de todos los ndulos linfticos superficiales, en particular de los ndulos
linfticos prescapulares. Las ppulas sobre los prpados producen blefaritis de gravedad variable. Conforme se
ulceran las ppulas de las membranas mucosas de los ojos y de la nariz, las secreciones se vuelven
mucopurulentas, y las mucosas de la boca, el ano, y el prepucio o la vagina se necrosan. La respiracin se hace
pesada y ruidosa debido a la presin en el tracto respiratorio superior producida por los ndulos linfticos
retrofarngeos hinchados, y al desarrollo de lesiones pulmonares.
Si el animal afectado no muere en esta fase aguda de la enfermedad, las ppulas comienzan a necrosarse a
partir de la necrosis isqumica despus de la formacin de trombos en los vasos sanguneos situados en la
base de la ppula. En los siguientes 510 das, las ppulas forman costras que persisten hasta 6 semanas
dejando pequeas cicatrices. Las lesiones cutneas son susceptibles al ataque de las moscas, y es comn una
neumona secundaria. No es habitual la anorexia a no ser que las lesiones en la boca interfieran fsicamente la
alimentacin. El aborto es poco comn.
Las lesiones cutneas son a menudo menos obvias en el examen post-mortem del animal con infeccin aguda
que en el animal vivo. Las membranas mucosas estn necrosadas y todos los ndulos linfticos del cuerpo han
231
aumentado de tamao y estn edematosos. Las ppulas, que pueden ulcerarse, se pueden encontrar
habitualmente en la mucosa abomasal, y algunas veces en la pared del rumen y del intestino grueso, en la
lengua, en el paladar duro y en el blando, en la trquea y en el esfago. Ocasionalmente, pueden observarse
zonas de aproximadamente 2 cm de dimetro en la superficie del rin y del hgado, y se ha descrito su
presencia en los testculos. Hay numerosas lesiones graves de hasta 5 cm de dimetro por todas partes de los
pulmones y en particular, en los lbulos diafragmticos.
Los signos clnicos y las lesiones observadas en el examen post-mortem varan considerablemente con la raza
del hospedador y la cepa de capripoxvirus. Las razas autctonas son menos sensibles y, con frecuencia,
muestran slo unas pocas lesiones que pueden confundirse con picaduras de insectos o con la dermatitis
pustular contagiosa. Sin embargo, con frecuencia se observan casos de animales afectados de viruela caprina
de forma generalizada y a veces mortal en casos de: corderos que han perdido su inmunidad derivada de la
maternidad; animales que han sido mantenidos aislados; y animales trados a zonas endmicas, procedentes de
pueblos aislados, y, en particular, si se les ha sometido a estrs durantes el desplazamiento a largas distancias y
se les ha mezclado con otras ovejas y cabras y sus patgenos. Despus de la infeccin con capripoxvirus se
produce invariablemente una gran mortalidad en razas ovinas y caprinas importadas sin ninguna proteccin
previa. La viruela caprina no es infecciosa para los humanos.
1.
Recogida, envo y preparacin de muestras
El material para el aislamiento del virus y la deteccin del antgeno debe recogerse mediante biopsia o en el
examen post-mortem de las ppulas cutneas, de las lesiones de los pulmones o de los ndulos linfticos. Las
muestras para el aislamiento del virus y para el enzimoinmunoensayo (ELISA) de deteccin de antgenos se
recogern en la primera semana de la manifestacin de los signos clnicos, antes de que se produzcan
anticuerpos neutralizantes. Las muestras para la deteccin genmica mediante la reaccin en cadena de la
polimerasa (PCR) pueden recogerse cuando ya est presente el anticuerpo neutralizante. Para el aislamiento del
virus se puede tambin utilizar la capa leucoplaquetaria de la sangre recogida en heparina o EDTA (cido
etilendiamino tetractico) durante el estadio virmico de la viruela caprina (antes de la generalizacin de las
lesiones o en los cuatro das de generalizacin de la enfermedad). Las muestras para el examen histolgico han
de incluir tejido procedente de las reas circundantes, y se han de colocar inmediatamente despus de su
recogida en formalina al 10% en un volumen que sea diez veces el de la muestra.
Los tejidos en formalina no necesitan requisitos especiales para el transporte. Las muestras de sangre con
anticoagulante para el aislamiento del virus a partir de la capa leucoplaquetaria se colocarn inmediatamente en
hielo y se procesarn lo antes posible. En la prctica, las muestras deben conservarse a 4C durante dos das
antes de su procesamiento, pero no deben congelarse o mantenerse a temperatura ambiente. Los tejidos
destinados al aislamiento de virus, la deteccin de antgenos o la deteccin de genoma se conservarn a 4C, en
hielo o a 20C. Si hay que transportar las muestras a largas distancias sin refrigeracin, el medio de transporte
deber contener glicerol al 10%; las muestras tendrn el tamao suficiente para que el medio de transporte no
llegue a la parte central de la biopsia que se utilizar para el aislamiento/deteccin del virus.
El material para el anlisis histolgico se preparar mediante tcnicas normalizadas y se teirn con
hematoxilina y eosina (H-E). El material de las lesiones para el aislamiento de virus y para la deteccin del
antgeno se corta empleando tijeras y frceps, y despus se muele en un almirez con la mano de mortero con
arena estril y un volumen igual de tampn fosfato (PBS) que contenga penicilina sdica (1.000 unidades
internacionales [UI]/ml, sulfato de estreptomicina (1 mg/ml), micostatina (100 UI/ml) o fungizona (2,5 g/ml) y
neomicina (200 UI/ml). La suspensin se congela y descongela tres veces y posteriormente se clarifica por
centrifugacin, empleando una centrfuga de mesa, a 600 g durante 10 minutos. La capa leucoplaquetaria puede
prepararse a partir de sangre sin coagular por centrifugacin a 600 g durante 15 minutos, y transferirse
cuidadosamente a 5 ml de agua bidestilada fra empleando una pipeta Pasteur estril. Pasados 30 segundos, se
aaden 5 ml de medio de crecimiento fro y a doble concentracin, y se mezclan. La mezcla se centrfuga a 600
g durante 15 minutos, se desecha el sobrenadante y el sedimento de clulas se resuspende en 5 ml de medio de
crecimiento como el medio de Eagle modificado de Glasgow (GMEM). Despus de la centrifugacin a 600 g
durante 15 minutos, el sedimento resultante se resuspende en 5 ml de GMEM recin preparado.
Alternativamente, la capa leucoplaquetaria se puede preparar a partir de una muestra heparinizada utilizando un
gradiente de Ficoll.
a)
Cultivo
El capripoxvirus crecer en cultivos de tejidos de origen bovino, ovino y caprino, aunque se considera que
los cultivos primarios y secundarios de clulas de testculo (LT) o de rin (LK) de cordero son las ms
232
susceptibles, en particular las que se derivan de una raza ovina lanar. Se inocula un frasco de cultivo
celular de 25 cm2 de clulas ovinas de testculo o rin (con un 90% de confluencia) con 1 ml ya sea de la
suspensin de la capa leucoplaquetaria o del sobrenadante de la preparacin clarificada de la biopsia, y se
permite la absorcin a 37C durante 1 hora. Posteriormente, se lava el cultivo con PBS caliente y se cubre
con 10 ml de un medio adecuado, como GMEM, conteniendo antibiticos y suero fetal bovino al 2%. Si se
dispone de ellos, se infectan tambin tubos de cultivos de tejidos que contengan clulas LT o LK y un
cubreobjetos, o portaobjetos con cultivos de tejidos.
Los frascos se examinarn diariamente durante 14 das en busca de indicios de efecto citoptico (ECP), y si
el medio est turbio se reemplaza. Las clulas infectadas desarrollan un ECP caracterstico consistente en
la retraccin de la membrana celular de las clulas circundantes, y finalmente en el redondeamiento de las
clulas, quedando la cromatina nuclear situada en el margen. Al principio slo se observan pequeas zonas
de ECP, algunas veces tan slo 4 das despus de la infeccin, que se expanden durante los siguientes 4-6
das hasta cubrir todo el tapiz celular. Si antes de 14 das no hay pruebas del ECP, se congelar y
descongelar el cultivo tres veces, y el sobrenadante clarificado se inocular en un cultivo fresco de clulas
LT o LK. Al primer signo de ECP en los frascos, o antes, en el caso de que se estn usando varios
cubreobjetos infectados, se tomar un cubreobjetos, se fijar con acetona y se teir empleando H-E. La
presencia de los cuerpos de inclusin intracitoplsmticos eosinfilos que son de tamao variable, pero que
pueden ser hasta la mitad del tamao del ncleo y estn rodeados por un halo claro, constituye un
diagnstico de la infeccin por poxvirus. La formacin de sincitios no es una caracterstica de la infeccin
por capripoxvirus. El efecto citoptico se puede evitar o retrasar mediante la inclusin en el medio de un
suero anticapripoxvirus. Algunas cepas de capripoxvirus se han adaptado para crecer en las clulas de
rin de mono verde africano (clulas Vero), pero stas no se recomiendan para el aislamiento primario.
Microscopa electrnica
Antes de la centrifugacin, el material de la suspensin original se prepara para su examen en un

microscopio electrnico de transmisin de la siguiente manera: sobre una gota de la suspensin colocada
sobre parafina o sobre una placa de cera, se deja flotar una rejilla de microscopa electrnica de 400 mallas
hexagonales con un substrato de pileoform-carbn activado por una descarga luminiscente en vapor de
pentilamina. Transcurrido 1 minuto, la rejilla se transfiere a una gota de tampn Tris/EDTA, pH 7,8, durante
20 segundos y despus a una gota de cido fosfotungstnico al 1%, pH 7,2, durante 10 segundos. Se
escurre la rejilla empleando papel de filtro, se deja secar al aire y se coloca en el microscopio electrnico. El
virin de la viruela caprina tiene forma de ladrillo, y est cubierto por elementos tubulares cortos y mide
aproximadamente 290 270 nm. Algunos de los viriones pueden rodearse de una membrana que procede
de la clula del hospedador y se debe examinar el mayor nmero posible de clulas para confirmar su
aparicin (16).
Los viriones de los capripoxvirus no se distinguen de los de ortopoxvirus, pero, aparte del virus vacunal,
ningn ortopoxvirus causa lesiones en las ovejas o en las cabras. Los viriones de parapoxvirus que causan
dermatitis pustular contagiosa son ms pequeos, de forma ovalada, y cada uno de ellos est cubierto por
un nico elemento tubular continuo que aparece como estriaciones sobre el virin.
Histologa
Despus de la preparacin, de la tincin con H-E y del montaje del material de biopsia fijado con formalina,
se examinarn varias secciones al microscopio ptico. En el examen histolgico, los aspectos ms
caractersticos de las lesiones cutneas en estado agudo son un infiltrado celular masivo, vasculitis y
edema. Las lesiones tempranas se caracterizan por una inflamacin perivascular marcada. Inicialmente, la
infiltracin es por macrfagos, neutrfilos y ocasionalmente eosinfilos, y a mediada que progresa la lesin
se infiltran ms macrfagos, linfocitos y clulas plasmticas. Un rasgo caracterstico de todas las
infecciones por capripoxvirus es la presencia en la dermis de cantidades variables de clulas de la viruela
ovina. Estas clulas de la viruela ovina pueden aparecer tambin en otros rganos en los que hay lesiones
microscpicas de viruela ovina y caprina. Estas clulas son grandes, estrelladas, eosinfilas, con
inclusiones intracitoplsmticas mal definidas y ncleos vacuolados. La vasculitis va acompaada de
trombosis e infartacin, produciendo edema y necrosis. Los cambios epidrmicos consisten en acantosis,
paraqueratosis e hiperqueratosis. Los cambios en los rganos son similares, con infiltracin celular
predominante y vasculitis. Las lesiones en el tracto respiratorio superior se caracterizan por la ulceracin.
Inoculacin animal
El sobrenadante de la preparacin de la biopsia clarificada (vase Seccin B.1.a. Cultivo) se puede utilizar
tambin para la inoculacin intradermal en corderos sensibles. Estos corderos se examinarn diariamente
en busca de evidencias de una reaccin cutnea.
233
b)
Mtodos inmunolgicos
Pruebas con anticuerpos fluorescentes
El antgeno de capripoxvirus puede tambin identificarse en cultivos de tejidos infectados sobre

cubreobjetos o sobre portaobjetos, utilizando las pruebas con anticuerpos fluorescentes. Los cubreobjetos o
los portaobjetos se lavarn, se dejarn secar al aire y se fijarn con acetona fra durante 10 minutos. La
prueba indirecta utilizando sueros ovinos o caprinos est expuesta a la aparicin de un color de fondo muy
oscuro y a reacciones no especficas. Sin embargo, se puede preparar un conjugado directo a partir de
sueros de ovejas o cabras convalecientes o de conejos hiperinmunizados con capripoxvirus purificado.
Como un control negativo, deben incluirse los cultivos de tejidos sin infectar, porque las reacciones
cruzadas pueden causar problemas debido a los anticuerpos contra los antgenos de los cultivos de tejidos.
Se ha utilizado tambin la tcnica con anticuerpos fluorescentes sobre portaobjetos en cortes de tejido
preparados en un criostato.
Para la deteccin del antgeno de precipitacin de capripoxvirus se ha utilizado la prueba de inmunodifusin

en gel de agar (IDGA), pero tiene la desventaja de que este antgeno es compartido por el parapoxvirus. La
agarosa (1%) se prepara en tampn borato, pH 8,6, se disuelve por calor, y se vierten 2 ml sobre un
portaobjetos de cristal (76 26 mm). Cuando al agar ha solidificado, se excavan 6 pocillos formando una
roseta alrededor de un pocillo central. Cada pocillo mide 5 mm de dimetro, y hay una distancia de 7 mm
entre el centro del pocillo central y el centro de cada uno de los pocillos perifricos. Los pocillos se llenan de
la siguiente manera: en tres pocillos de la periferia se depositan 18 l de la suspensin de la lesin
alternando con el antgeno de control positivo, y en el pocillo central se depositan 18 l de suero de control
positivo de capripoxvirus. Los portaobjetos de colocan en una cmara hmeda a temperatura ambiente
durante 48 horas, y se examinan para detectar la formacin de lneas de precipitacin visibles empleando
un transiluminador. El material ensayado es positivo si se forma una lnea de precipitacin con el suero
control que es confluyente con la producida por el antgeno de control positivo. Esta prueba, sin embargo,
no permite distinguir entre la infeccin de la viruela caprina y la dermatitis pustular contagiosa (ectima
contagioso).
Para preparar el antgeno para la prueba IDGA, uno de los dos frascos de 125 cm2 con clulas LT o LK se
infecta con capripoxvirus, y cuando se alcanza un grado de efecto citoptico del 90% (812 das) se
recogen las clulas. Se congela y descongela el frasco dos veces, y se agita ste para liberar las clulas del
frasco. El contenido se centrifugan a 4.000 g durante 15 minutos, se decanta la mayor parte del
sobrenadante y se guarda, y el sedimento se resuspende en el sobrenadante restante. Las clulas se
lisarn utilizando una sonda ultrasnica durante 60 segundos aproximadamente. A continuacin este
homogenado se centrifuga como antes, el sobrenadante resultante se mezcla con el que ya est recogido.
El sobrenadante mezclado se aade a un volumen igual de sulfato amnico saturado a pH 7,4 y se deja a
4C durante 1 hora. Esta solucin se centrifuga a 4.000 g durante 15 minutos, y el precipitado se recoge y
se resuspende en un volumen pequeo de solucin salina al 0,8% para su uso en la prueba IGDA. El frasco
que no se ha infectado se procesa de forma totalmente idntica para obtener el antgeno control del cultivo
celular (14).
Enzimoinmunoensayo
Despus de la clonacin de la protena estructural P32 de capripoxvirus, que es muy antignica, se puede
utilizar el antgeno recombinante expresado para la produccin de reactivos para el diagnstico, incluyendo
la obtencin de antisuero policlonal monoespecfico contra P32 y la produccin de anticuerpos
monoclonales (MAbs). Estos reactivos han facilitado la elaboracin de un ELISA muy especfico (4).
Utilizando antisuero de conejo hiperinmune, obtenido por inoculacin a conejos con capripoxvirus
purificado, se puede inmovilizar el antgeno de la viruela caprina procedente de suspensiones de biopsias o
del sobrenadante de cultivos de tejidos en una placa ELISA. A continuacin, la presencia del antgeno
inmovilizado puede ponerse de manifiesto utilizando un suero de cobaya obtenido contra el grupo
especfico de la protena estructural P32, la inmunoglobulina comercial anticobaya de ratn conjugada con
peroxidasa de rbano y una solucin substrato cromognico.
c)

Mediante tcnicas serolgicas no es posible distinguir entre cepas de capripoxvirus bovinos, ovinos o
caprinos. Sin embargo, estas cepas se pueden caracterizar comparando los fragmentos genmicos
originados por la digestin con HindIII de su ADN purificado (1, 13). Con esta tcnica se han identificado
diferencias entre aislados de diferentes especies, pero no son consistentes, y hay pruebas de movimiento
de cepas entre especies y de recombinacin entre cepas en condiciones naturales (9).
La tcnica de la PCR se puede utilizar para detectar el genoma de capripoxvirus en muestras de biopsia o
en cultivos de tejidos. Los cebadores para los genes de las protenas virales de unin y de fusin son
especficos para capripoxvirus, y la naturaleza de los productos de la PCR puede confirmarse utilizando los
lugares de reconocimiento de las enzimas de restriccin (10, 11).
234
2.
Pruebas serolgicas
a)
Neutralizacin viral
Un suero de ensayo se puede titular bien frente a un ttulo constante de capripoxvirus (100 DICC50 [dosis
infectiva 50% en cultivo celular]) o bien una cepa de un virus de referencia se puede titular frente a una
dilucin constante de un suero de ensayo para calcular el ndice de neutralizacin. El mtodo preferido es el
ndice de neutralizacin debido a la sensibilidad variable de los cultivos de tejidos a capripoxvirus, y la
consecuente dificultad para garantizar el uso de 100 DICC50. La prueba se describe utilizando placas de
microtitulacin de cultivos de tejidos de 96 pocillos de fondo plano, pero se puede realizar perfectamente
igual en tubos de cultivos de tejidos introduciendo los cambios apropiados para los volmenes utilizados,
aunque la lectura de un punto final en los tubos es ms difcil. Se ha descrito que el uso de clulas Vero en
la prueba de neutralizacin de virus produce resultados ms consistentes.
i)
Los sueros de ensayo, incluyendo un control positivo y un control negativo, se diluyen 1/5 en medio
Eagle/HEPES (N-2-hidroxietilpiperazina, cido N-2-etanosulfnico) y se inactivan a 56C durante 30
minutos.
ii)
A continuacin, se deposita un volumen de 50 l del primer suero inactivado en los pocillos de las
columnas 1 y 2, de las filas A a H de la placa de microtitulacin. El segundo suero se coloca en los
pocillos de las columnas 3 y 4, el tercero en las columnas 5 y 6, el suero de control positivo en las
columnas 7 y 8, el control de suero negativo en las columnas 9 y 10, y se depositan 50 l de medio
Eagle/HEPES sin suero en las columnas 11 y 12 y en todos los pocillos de la fila H.
iii)
Una cepa de referencia de capripoxvirus, que normalmente es una cepa vacunal que se sabe que
crece bien en cultivos de tejidos, con un ttulo superior a log10 6 DICC50 por ml se diluye en medio
Eagle/HEPES en botellas con tapa de rosca para obtener diluciones logartmicas seriadas de
log10 5,0; 4,0; 3,5; 3,0; 2,5; 2,0; 1,5 DICC50 por ml (equivalente a log10 3,7; 2,7; 2,2; 1,7; 1,2; 0,7; 0,2
DICC50 / 50 l).
iv)
Comenzando por la fila G y por la preparacin de virus ms diluida, se aaden 50 l de virus a cada
pocillo de esa fila. Esto se repite con cada dilucin del virus, colocando la dilucin con el ttulo ms alto
en la fila A.
v)
Las placas se cubren y se incuban a 37C durante 1 hora.
vi)
Las clulas LT se preparan a partir de monocapas crecidas con anterioridad en una suspensin de 105
clulas/ml en medio Eagle con antibiticos y suero fetal bovino al 2%. Despus de la incubacin de las
placas de microtitulacin, se aaden 100 l de la suspensin celular a todos los pocillos, excepto a los
pocillos H11 y H12, que sirven como pocillos de control para el medio. Los restantes pocillos de la fila
H son los controles celulares y sricos.
vii)
Las placas de microtitulacin se cubren y se incuban a 37C durante 9 das.
viii) A partir del da 4 se examinan diariamente las monocapas en busca de pruebas de ECP, utilizando un
microscopio de inversin. En las clulas de la fila H no ha de haber ECP. Utilizando la cepa vacunal
0240 KSGP de capripoxvirus, la lectura final se toma el 9 da, y el ttulo del virus en cada titulacin
rplica se calcula segn el mtodo Krber (1931). Si se deja ms tiempo, siempre se produce un
aumento del virus, de modo que el virus que al principio estaba neutralizado parece disociarse del
anticuerpo.
ix)
Interpretacin de los resultados: El ndice de neutralizacin es la diferencia del entre el ttulo del virus
en un suero negativo y el del suero de ensayo. Un ndice 1.5 es positivo. La prueba puede hacerse
ms sensible si el suero del mismo animal se examina antes y despus de la infeccin. Debido a que
la inmunidad a la viruela caprina est predominantemente mediada por clulas, un resultado negativo,
en particular despus de la vacunacin en la que la respuesta es dbil, no implica que el animal del
que deriva el suero no est protegido.
Se ha descrito un mtodo que mantiene constante el virus y vara el suero en el que se utilizan
diluciones del suero en un rango desde 1/5 a 1/500 y clulas de msculo fetal bovino. Debido a que
estas clulas tienen menor sensibilidad a capripoxvirus que las clulas LT, el problema del aumento
del virus queda resuelto.
b)

La prueba IGDA no puede recomendarse como una prueba serolgica para la diagnosis de la viruela
caprina, debido a la reaccin cruzada con anticuerpos contra el virus de la dermatitis pustular contagiosa,
que es la principal prueba diagnstica diferencial. Una consecuencia de esta reaccin cruzada es la
aparicin de resultados falsos positivos.
235
c)
Prueba indirecta con anticuerpos fluorescentes

Para la prueba indirecta con anticuerpos fluorescentes se pueden utilizar los cultivos de tejidos infectados
con capripoxvirus cultivados sobre cubreobjetos o los cultivos de tejidos sobre portaobjetos. En la prueba se
incluirn el control del cultivo celular sin infectar y los sueros de control positivo y negativo. Los cultivos
infectados y los cultivos control se fijan con acetona a 20C durante 1 hora y se guardan a 4C. Las
diluciones de los sueros de ensayo se realizan en PBS, comenzando con una dilucin 1/5, y los positivos se
identifican utilizando una gammaglobulina antioveja conjugada con isocianato de fluorescena (7). Las
reacciones cruzadas pueden tener lugar con el virus del ectima contagioso, con el de la estomatitis papular
bovina y quizs con otros poxvirus.
d)
Anlisis por inmunoelectrotransferencia (Western blot)

El anlisis por inmunoelectrotransferencia de los sueros de ensayo frente a lisados de clulas infectadas
por capripoxvirus proporciona un sistema sensible y especfico para la deteccin del anticuerpo contra las
protenas estructurales de capripoxvirus, aunque la prueba es cara y difcil de llevar a cabo (6).
Las clulas LT infectadas por capripoxvirus deben recogerse cuando se observe un efecto citoptico del
90%, a continuacin se congelan y descongelan tres veces, y los desechos celulares se sedimentan por
centrifugacin. Se decanta el sobrenadante y las protenas se separan despus por electroforesis en gel de
poliacrilamida con dodecilsulfato sdico (SDS/PAGE). Se recomienda un sistema vertical de gel
discontinuo, empleando gel de concentracin con acrilamida (5%) en Tris (125 mM), pH 6,8, y SDS (0,1%),
y gel de resolucin con acrilamida (1012,5%) en Tris (560 mM), pH 8,7, y SDS (0,1%), utilizando un
tampn de desarrollo de glicina conteniendo Tris (250 mM), glicina (2 M), y SDS (0,1%). Antes de cargar el
gel, se preparan las muestras del sobrenadante mediante ebullicin con un tampn de lisis adecuado.
Como alternativa al antgeno del cultivo celular, se puede utilizar tambin un virus purificado o la protena
recombinante expresada de P32 (5, 10).
Simultneamente con las muestras de protenas, se hacen correr los marcadores de peso molecular. Una
vez separadas las protenas en el gel SDS/PAGE se transfieren electroforticamente a una membrana de
nitrocelulosa (NCM). Despus de la transferencia, la membrana se aclara exhaustivamente con PBS y se
bloquea con albmina srica bovina (BSA) al 3% en PBS, o con leche en polvo desnatada al 5% en PBS, y
se deja en un agitador rotatorio a 4C toda la noche. A continuacin, la NCM puede separarse en tiras
utilizando un aparato comercial que permite el ensayo simultneo de mltiples muestras de suero, o bien se
puede cortar en tiras e incubar luego cada una de ellas por separado. La NCM se lava cuidadosamente
realizando cinco cambios de tampn PBS durante 5 minutos en un agitador rotatorio, y despus se deja en
un agitador a temperatura ambiente durante 1,5 horas con el suero apropiado a una dilucin de 1/50 en
tampn de bloqueo (3% BSA y Tween 20 al 0,05% en PBS; o leche en polvo al 5% y Tween 20 al 0,05% en
PBS). Se lava de nuevo la membrana exhaustivamente y se incuba (en el tampn bloqueante) con antiinmunoglobulinas de la especie conjugadas con peroxidasa de rbano a una dilucin determinada
previamente mediante titulacin. Despus de la incubacin a temperatura ambiente durante 1,5 horas, la
membrana se lava y se le aade una solucin de diamino bencidina tetrahidrocloruro (10 mg en 50 ml of
50 mM Tris-HCl, pH 7,5, y 20 l de perxido de hidrgeno al 30% [v/v]. Acto seguido se incuba en un
agitador a temperatura ambiente durante aproximadamente 37 minutos con observacin constante, y se
detiene la reaccin mediante lavado con PBS antes de que el color de fondo se vea en exceso. Para cada
ocasin se utilizar un suero de control positivo y negativo.
Las muestras que se consideren positivas en el ensayo y el control positivo originarn un patrn de bandas
consistente con una reaccin con las protenas de pesos moleculares 67, 32, 26, 19, y 17 kDa las
protenas estructurales principales de capripoxvirus mientras que las muestras de suero negativas no
reaccionarn dando este patrn. El suero hiperinmune preparado contra parapoxvirus (virus del ectima
contagioso) reaccionar con algunas de las protenas de capripoxvirus, pero no con la de 32 kDa que es
especfica de capripoxvirus.
e)
Enzimoinmunoensayo
Se ha elaborado un ELISA para capripoxvirus empleando la expresin de la protena estructural P32 de
capripoxvirus y MAbs obtenidos contra la protena P32 (5, 10).
C. REQUISITOS PARA VACUNAS Y MATERIALES DE DIAGNSTICO

Se ha utilizado una variedad de vacunas de capripoxvirus vivas atenuadas e inactivadas para proteger a las
ovejas y a las cabras contra la viruela caprina (vanse referencias 3 y 12 para las revisiones). Todas las cepas
de capripoxvirus de origen ovino, caprino o bovino examinadas hasta ahora comparten un sitio de neutralizacin
principal, de forma que los animales recuperados de la infeccin con una cepa son resistentes a la infeccin por
cualquiera de las otras (2). En consecuencia, es posible utilizar una sola cepa de capripoxvirus para proteger a
236
las ovejas y a las cabras contra todas las cepas de campo del virus, con independencia de que su origen
estuviera en Asia o frica (15, 17).
Hay dos formas antignicas de capripoxvirus, el virin intacto cubierto por elementos tubulares cortos, y el virin
intacto cubierto adems por una membrana que procede de la clula hospedadora. sta ltima es la forma
producida normalmente por el animal infectado, mientras la primera es la que se observa cuando el virus se
produce por congelacin y descongelacin de cultivos de tejidos infectados. Las vacunas muertas producidas a
partir de cultivos de tejidos estn formadas por viriones casi completamente desnudos, y cuando se utilizan como
una vacuna no estimulan la inmunidad para que el virin se envuelva con la membrana. Esto explica en parte el
poco xito que tienen las vacunas inactivadas. Un factor adicional es que las vacunas inactivadas son menos
eficaces que las vivas (que replican al virus vacunal) en la estimulacin de la respuesta inmune mediada por
clulas, que es la respuesta protectora predominante a la infeccin por poxvirus. Las vacunas muertas de la
viruela caprina proporcionan, como mucho, una proteccin temporal. Una serie de cepas de capripoxvirus han
tenido un uso extendido como vacunas vivas (8), por ejemplo, la cepa de la viruela ovina y caprina de
Kenia 0240 utilizada en ovejas y cabras, las cepas Rumana y RM-65 utilizadas principalmente en ovejas, y
Mysore y Gorgan utilizadas en cabras. La inmunidad en ovejas y cabras contra la viruela caprina despus de la
vacunacin con la cepa 0240 dura ms de un ao, y probablemente proporcionar una proteccin para toda la
vida frente al desafo letal. La cepa 0240 no se utilizar en razas bovinas Bos taurus.
Se est elaborando una nueva generacin de vacunas de la viruela caprina que utiliza el genoma de
capripoxvirus como vector para los genes de otros patgenos de rumiantes, por ejemplo, los genes de los virus
de la peste bovina y de la peste de los pequeos rumiantes (PPR). La vacuna recombinante proporcionar
proteccin contra la viruela caprina, la peste bovina y la PPR en una sola vacuna (18).
1.
Control del inculo
a)

Una cepa de capripoxvirus utilizada en la produccin de una vacuna debe ir acompaada de un historial en
el que se describa su origen y su pase por cultivos de tejidos o animales. Debe ser inocua para utilizarla en
todas las variedades de ovejas y cabras en las que se pretende emplear, incluyendo los animales preados.
No debe ser transmisible, debe permanecer atenuada despus del pase posterior por un cultivo celular, y
proporcionar una proteccin completa frente el desafo de cepas de campo virulentas por un mnimo de un
ao. Ser conveniente preparar una cantidad de inculo original del virus vacunal y guardarlo con el fin de
proporcionar un inculo de trabajo constante para la produccin regular de vacunas.
b)
Mtodo de cultivo
El inculo de vacuna debe liofilizarse y guardarse en viales de 2 ml a 20C. Se puede guardar en estado
hmedo a 20C, pero de ser as, es ms estable a 70C o a temperatura ms baja. Para obtener un
rendimiento ptimo, el virus debe cultivarse en clulas primarias o secundarias LT o LK de oveja lanar.
Tambin pueden utilizarse clulas Vero.
c)

Debe demostrarse que los lotes de siembra son:
i)
Puros: Libres de virus ajenos, en particular de pestivirus, tales como el virus de la enfermedad de
Border y de la diarrea viral bovina, y libres de contaminacin por bacterias, hongos y/o micoplasmas.
ii)
Inocuos: No produce reaccin clnica en ninguna de las razas de ovejas o cabras cuando se les
administra por la va recomendada.
iii)
Eficaces: Estimuladores de inmunidad completa a la viruela caprina en todas las razas de ovejas y
cabras durante al menos 1 ao.
En la Seccin C.4. se describen las pruebas necesarias.
2.
Mtodo de produccin
Los lotes de vacuna se producen sobre monocapas de clulas secundarias LT o de clulas primarias LK. Se
reconstituye un vial de inculo viral con GMEM y se inocula en una monocapa de clulas LT o LK, que
previamente se ha lavado con PBS templado, y se permite la absorcin a 37C durante 15 minutos antes de
recubrir la mezcla con GMEM adicional. Transcurridos 46 das, deber apreciarse un gran efecto citoptico (50
70%). El cultivo deber examinarse en busca de indicios de ECP no especfico, turbidez del medio o cambio en
el pH. Se congela y descongela el cultivo tres veces, se recoge la suspensin y se centrifuga a 600 g durante
20 minutos. Puede requerirse un segundo pase para producir una cantidad de virus suficiente para obtener un
lote productivo (para producir suficiente cantidad para 106 dosis se requiere la produccin de cinco frascos de
175 cm2).
237
Se repite el procedimiento y el producto recogido de cada uno de los frascos numerados por separado se mezcla
tambin por separado con un volumen igual de hidrolizado estril de lactalbmina al 5% fro y sacarosa al 10%, y
se transfiere a botellas numeradas por separado para su conservacin a 20C. Antes se toman 0,2 ml de cada
botella para un control de esterilidad, y una muestra adicional de 0,2 ml. Las mezclas de 2 ml formadas por las
muestras de 0,2 ml tomadas de las diez botellas se utilizan para la titulacin del virus. Debe conservarse un
registro escrito de todos los procedimientos para todos los lotes de vacunas.
Las vacunas inactivadas se producen normalmente a partir de cepas de campo de capripoxvirus sin atenuar,
crecidas en cultivos de tejidos como se ha descrito anteriormente, inactivadas con formaldehdo al 0,03%, y
mezcladas con un volumen igual de alhydrogel de adyuvante. Ya no se considera adecuado el formaldehdo para
la inactivacin de otras vacunas virales debido a que su modo de accin no puede garantizar que sea totalmente
eficaz para la inactivacin de todos los virus vivos. Este extremo no ha sido completamente investigado para
capripoxvirus.
3.
Control durante el proceso
Clulas: Las clulas se obtendrn de testculo o rin de un cordero joven y sano de un rebao libre de
tembladera de una raza de ovejas lanares. Las clulas deben observarse durante el cultivo en busca de
pruebas de efecto citoptico y de clulas con morfologa normal (predominantemente fibroblstica). Normalmente
se pueden hacer con xito hasta diez pases de estas clulas. Cuando stas se utilicen para la produccin de
vacunas, se realizarn paralelamente cultivos control sin infectar, y se mantendrn al menos durante un pase
ms para su posterior observacin. Se revisarn para determinar la presencia de cepas de virus no citopticos
de la diarrea viral bovina o de la enfermedad de Border mediante tcnicas de inmunofluorescencia o
inmunoperoxidasa. Si resulta posible, se har una preparacin de clulas y una criba antes de la produccin de
la vacuna, y se guardar un stock en DMSO estril (dimetilsulfxido) en nitrgeno lquido (alcuotas de 12 ml
conteniendo 20 106 clulas/ml). El suero utilizado en el medio de crecimiento debe estar libre de anticuerpos
contra capripoxvirus o de contaminacin con pestivirus.
Virus: El virus de inculo y la vacuna final deben titularse en tubos de cultivo celular o en placas de
microtitulacin. Las muestras de vacunas deben examinarse para la presencia de virus ajenos, incluyendo cepas
de pestivirus citopticas y no citopticas, y deben mezclarse con suero inmune contra capripoxvirus con un ttulo
alto que haya dado resultado negativo con relacin al anticuerpo para pestivirus, con el fin de impedir que el virus
vacunal mismo interfiera con la prueba. El material de la vacuna puede mantenerse a 20C hasta que se
completen todas las pruebas de esterilidad y de titulacin, y entonces se liofilizar en alcuotas de 1 ml en viales
suficientes para 100 dosis. El producto vacunal diluido con hidrolizado de lactalbmina y sacarosa tendr un
ttulo mnimo de log10 4,5 DICC50 por mililitro despus de la liofilizacin, equivalente a una dosis de campo de
log10 2,5 DICC50. Se lleva a cabo una titulacin posterior en cinco viales de la preparacin liofilizada, elegidos al
azar para confirmar el ttulo.
4.
Control de lotes
a)
Esterilidad
Las pruebas para determinar la esterilidad y la ausencia de contaminacin de los materiales biolgicos
pueden encontrarse en el Captulo I.1.5.
b)
Inocuidad y eficacia
En una unidad animal de alto nivel de contencin se confinan cuatro ovejas y cuatro cabras de sensibilidad
conocida a capripoxvirus, y se recogen muestras de suero. Se reconstituyen cinco viales elegidos al azar de
la vacuna liofilizada en 1 ml de PSB estril cada uno, y se mezclan. Se inoculan intradermalmente una
oveja y una cabra con 0,2 ml de la vacuna concentrada. La vacuna restante se diluye 20 veces con PBS
estril y se inoculan dos ovejas y dos cabras subcutneamente con 0,2 ml la dosis de campo
recomendada. Los animales control son la oveja y la cabra restantes. Los animales se examinan
clnicamente a diario y se registra la temperatura rectal. Al cabo de 21 das despus de la vacunacin, se
toman nuevas muestras de sangre a los ocho animales y se ensayan mediante inoculacin intradermal con
una cepa virulenta conocida de capripoxvirus. Se anota la respuesta clnica durante los 14 das siguientes.
Los animales control desarrollarn signos clnicos tpicos de la viruela caprina, mientras que no deber
haber reaccin local o sistmica en los vacunados excepto una reaccin de hipersensibilidad tarda, que
desaparecer a los 4 das. Se tomarn nuevas muestras de suero 30 das despus de la vacunacin. Las
muestras de suero del da 21 se examinan para observar si se produce seroconversin en cuanto a las
enfermedades vricas seleccionadas que podran haber contaminado la vacuna, y las muestras del da 0 y
30 se comparan para confirmar la ausencia de anticuerpos contra pestivirus.
La vacuna totalmente reconstituida se prueba tambin en ratones y cobayas. Se inoculan dos cobayas con
0,5 ml por va intramuscular en la pata trasera, y dos cobayas y seis ratones intraperitonealmente con 0,5
ml y 0,1 ml respectivamente. Como controles sin inocular se conservan dos cobayas y cuatro ratones. Los
animales se observan durante tres semanas, se sacrifican de forma humanitaria y se lleva acabo un
examen post-mortem. No deber haber evidencia de patologa debido a la vacuna.
238
c)
Pruebas de potencia
Es suficiente con menos de 1 DICC50 de la cepa 0240 para inmunizar a una oveja o una cabra. Sin
embargo, deben realizarse pruebas de potencia para otras cepas de capripoxvirus si no se conoce la dosis
mnima inmunizante. Esto se lleva a cabo mediante la comparacin del ttulo de un virus de prueba virulento
y el de los animales control por inoculacin en los costados de los animales vacunados. Despus de la
vacunacin, se afeita la lana o el pelo del costado de al menos tres animales y de tres controles. Se
preparan diluciones logartmicas decimales del virus prueba en PBS estril, y se inoculan intradermalmente
seis de estas diluciones (0,1 ml por inculo) a lo largo de la longitud del flanco; inoculando adicionalmente
cuatro rplicas de cada dilucin verticalmente de arriba hacia abajo tambin en el flanco. Es posible que se
desarrolle una inflamacin edematosa en los 24 sitios de inoculacin en los animales de control, aunque
preferiblemente habr poca reaccin o ninguna en los cuatro sitios de los inculos ms diluidos. Dentro de
las 24 horas los animales vacunados desarrollarn una reaccin de hipersensibilidad inicial en los sitios de
inoculacin que disminuir rpidamente. Pueden desarrollarse pequeas zonas de necrosis en el lugar de
inoculacin del virus problema ms concentrado. El ttulo del virus problema se calcula para los animales
vacunados y para los animales de control; una diferencia en el ttulo logartmico >log10 2,5 se toma como
evidencia de proteccin.
d)
La inmunidad de las ovejas y de las cabras a los virus de campo virulentos despus de la vacunacin con
la cepa 0240 dura ms de 1 ao, y la proteccin contra la infeccin generalizada despus de la vacunacin
intradermal dura al menos tres aos, y es eficaz durante toda la vida. La duracin de la inmunidad
producida por otras cepas vacunales se establecer en las ovejas y en las cabras mediante la realizacin
de ensayos controlados en unas condiciones en las que no haya posibilidad de que las cepas de campo de
capripoxvirus interfieran los resultados.
Las vacunas inactivadas proporcionan inmunidad menos de un ao y, por las razones expuestas al
comienzo de esta seccin, no confieren inmunidad a la forma de capripoxvirus normalmente asociada con
la forma de transmisin natural.
e)
Estabilidad
Las preparaciones de la vacuna de la viruela caprina adecuadamente liofilizadas, en particular aqullas que
incluyen un protector como la sacarosa y el hidrolizado de lactalbmina son estables ms de 25 aos
cuando se guardan a 20C, y 24 aos si se hace a 4C. Hay evidencias de que son estables a
temperaturas ms altas, pero no se tiene constancia de experimentos controlados a largo plazo.
Las vacunas inactivadas deben conservarse a 4C, y su perodo de validez est normalmente fijado en
1 ao.
f)
Conservantes
Aparte de un protector, como la sacarosa y el hidrolizado de lactalbmina, no se requieren conservantes
para la preparacin del liofilizado.
g)
No existen precauciones, aparte de las descritas anteriormente, en relacin con la esterilidad y la ausencia
de agentes extraos. La cepa vacunal 0240 no se emplear en razas bovinas Bos taurus.
El capripoxvirus no infecta a los humanos.
5.
a)
Inocuidad
Las pruebas de inocuidad deben llevarse a cabo sobre el producto final de cada lote, como se describe en
la Seccin C.4.b.
b)
Potencia
Una vez que se haya determinado la potencia de una cepa concreta que se est utilizando para la
produccin de vacunas, en relacin con la dosis mnima que se requiere para proporcionar inmunidad, no
es necesario repetir la prueba de potencia sobre el producto final de cada lote, si se ha determinado el ttulo
del virus.
239
REFERENCIAS
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14. KITCHING R.P., HAMMOND J.M. & BLACK D.N. (1986). Studies on the major precipitating antigen of
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18. ROMERO C.H., BARRETT T., EVANS S.A., KITCHING R.P., GERSHON P.D. & BLACK D.N. (1993). Single
capripoxvirus recombinant vaccine for the protection of cattle against rinderpest and lumpy skin disease.
Vaccine, 11, 737742.
*
* *
NB: Existen laboratorios de referencia de la OIE para la Viruela ovina y viruela caprina (ver Cuadro en la
240
CAPTULO 2.1.11.
PESTE EQUINA AFRICANA
RESUMEN
La peste equina africana (PEA) es una enfermedad vrica infecciosa, pero no contagiosa, que
afecta a todas las especies de quidos, causada por un orbivirus de la familia Reoviridae y
caracterizada por alteraciones de las funciones respiratorias y circulatorias. La PEA se transmite
por al menos dos especies de Culicoides. Se han descrito nuevo serotipos diferentes.
En el este y el sur de frica se presentan todos los serotipos de la PEA. En el oeste africano, solo
se han detectado los serotipos 9 y 4, de donde ocasionalmente pasan a pases limtrofes del
Mediterrneo. Algunos ejemplos de focos ocurridos fuera de frica son: en el Oriente Medio (19591963), en Espaa (serotipo 9, 1966, serotipo 4, 1987-1990), y en Portugal (serotipo 4, 1989).
El diagnstico de laboratorio de la PEA es esencial. Aunque los sntomas y las lesiones clnicas
son caractersticas, se pueden confundir con las de otras enfermedades.
Como enfermedad vrica, el diagnstico de laboratorio de la PEA se puede basar en la
identificacin del virus infeccioso, del cido nucleico del virus, de los antgenos vricos o de
anticuerpos especficos. En los ltimos aos, se ha adaptado una amplia variedad de pruebas de
laboratorio para detectar tanto el virus de la PEA como los anticuerpos especficos.
Identificacin del agente: Siempre que ocurran focos fuera de las regiones enzooticas es
importante llevar a cabo el aislamiento y el serotipado del virus.
El AHSV se puede aislar de sangre tomada durante la fase febril inicial. Otros tejidos adecuados
para el diagnstico y aislamiento del virus son el bazo, los pulmones y los ndulos linfticos,
recogidos en la necropsia. Las muestras se pueden inocular en cultivos celulares, como los de
rin de hmster neonato-21 (BHK-21), clulas estables de mono (MS) o rin de mono verde
africano (Vero), o bien en cerebros de ratones recin nacidos. Se han desarrollado varios
enzimoinmunoensayos (ELISA) para la deteccin rpida del antgeno del virus de la PEA (AHSV)
en tejidos de bazo y en sobrenadantes de clulas infectadas. Tambin se ha logrado la
identificacin del ARN del AHSV usando un mtodo de reaccin en cadena de la polimerasa por
transcripcin inversa. Los aislamientos de virus se pueden serotipar por una prueba serolgica con
especificidad de tipo como la de neutralizacin vrica (NV) y por una reaccin en cadena de la
polimerasa por transcripcin inversa (PCR).
Pruebas serolgicas: Los caballos que sobreviven a una infeccin natural desarrollan anticuerpos
contra el serotipo infeccioso del AHSV a los 8-12 das de la infeccin. Esto se puede demostrar por
varios mtodos serolgicos, como la prueba de fijacin de complemento, por ELISA, por
inmunotransferencia y por VN. La ltima tcnica es la usada en el serotipado. Otras pruebas que
se han descrito son la inmunodifusin y la inhibicin de la hemaglutinacin.
Requisitos para las vacunas y los materiales de diagnstico: Actualmente se dispone de
vacunas vivas atenuadas (mono y polivalentes) para uso en caballos, mulas y asnos. Se produca
una vacuna inactivada monovalente, pero ya no se encuentra en el mercado. Algunas nuevas
vacunas, incluyendo una vacuna de subunidades, estn en fase de evaluacin experimental.
A. INTRODUCCIN
La peste equina africana (PEA) (African horse sickness, Peste equine) (AHS) es una enfermedad infecciosa de
los quidos, no contagiosa y transmitida por artrpodos, que est causada por un orbivirus con ARN de cadena
doble perteneciente a la familia Reoviridae. El gnero Orbivirus tambin incluye al virus causante de la lengua
241
Captulo 2.1.11. Peste equina africana
azul y al virus de la enfermedad hemorrgica epizotica, que tienen propiedades morfolgicas y bioqumicas
similares pero distintas propiedades patolgicas y antignicas, as como un diferente rango de hospedadores. El
genoma del virus de la PEA (AHSV) comprende diez segmentos de ARN de doble cadena que codifican siete
protenas estructurales (VP1-7), la mayor parte de las cuales han sido secuenciadas por completo en los ASHV
de serotipo 4,6 y 9 (25, 31, 34), y cuatro protenas no estructurales (NS1, NS2, NS3, NS3A) (9, 17). Las
protenas VP2 y VP5 forman la cpsida externa del virin, y las protenas VP3 y VP7 son las protenas
principales de la cpsida interna. Las protenas VP1, VP4 y VP6 constituyen las protenas minoritarias de la
cpsida interna. Recientemente se ha sealado que las protenas NS3 son las segundas ms variables de entre
las protenas del AHSV (32), siendo la ms variable la protena mayoritaria de la cpsida externa VP2. Esta
protena, VP2, es tambin la principal responsable de los diferentes serotipos del AHSV y, junto con VP5, de la
actividad de neutralizacin del virus (23). Por ensayos de neutralizacin se han identificado nueve serotipos
antignicamente distintos en el AHSV, pero no se han observado reacciones cruzadas con otros orbivirus
conocidos.
La PEA es una enfermedad enzotica en el frica sub-sahariana, aunque se han dado focos ocasionales en el
norte de frica (1965, 1989-1990), en el Oriente Medio (1959-1961) y en Europa (Espaa, 1966, 1987-1990, y
Portugal, 1989).
La enfermedad tiene incidencia estacional (final de verano/otoo) y cclica, con las mayores epizootias durante
las estaciones calurosas en Sudfrica (1). La mortalidad por el AHSV depende de la especie de quido afectada
y de la cepa y el serotipo del virus. Existen al menos dos vectores naturales implicados en la transmisin:
Culicoides imicola y C. bolitinos. Entre la familia de los quidos, los caballos son los ms susceptibles a la AHS,
con una mortalidad del 50-95%, seguidos por las mulas, cuya mortalidad es de alrededor del 50%. En las
regiones enzooticas de frica, los asnos son muy resistentes al AHSV AHS y experimentan solo infecciones
subclnicas. Sin embargo, en pases europeos y asiticos, los asnos son moderadamente susceptibles y
presentan una mortalidad del 10%. Las cebras son tambin notablemente resistentes, sin sntomas clnicos,
aunque pueden tener una extensa viremia (hasta 40 das).
El diagnstico de laboratorio es esencial. Aunque algunos sntomas y lesiones clnicas son caractersticas, se
puede confundir la PEA con otras enfermedades. Por ejemplo, la inflamacin supraorbital que se presenta con
frecuencia en caballos con PEA subaguda, en combinacin con un historial adecuado, es suficiente para un
diagnstico preliminar. Otros signos y lesiones son menos especficos de la PEA, y se deberan excluir otras
enfermedades equinas como la encefalosis, la anemia infecciosa, la neumona por morbilivirus, la arteritis viral, la
babesiosis y la prpura hemorrgica. Hay cuatro formas clsicas de PEA: pulmonar, cardaca, mixta y
enfermedad febril del caballo (6).
La forma hiperaguda o pulmonar, que tiene un perodo de incubacin corto (3-5 das), se caracteriza por una
disnea grave muy marcada y por complicaciones respiratorias progresivas. El nico sntoma puede ser una
reaccin febril aguda de 1-2 das de duracin y que alcanza un mximo de unos 40-41C. A esto sigue un cuadro
de dificultad respiratoria la frecuencia respiratoria puede aumentar a 60 o incluso a 75 respiraciones por minuto.
Se puede observar que el animal se sostiene con sus patas delanteras separadas, con la cabeza extendida y sus
ollares completamente dilatados. Es comn una notable sudoracin y se puede observar una tos espasmdica
terminal, con un fluido espumoso exudado por los ollares. La muerte suele ocurrir a las pocas horas de los
primeros sntomas clnicos, con el animal literalmente empapado por su propio fluido seroso. Por lo general la
forma pulmonar se presenta en animales completamente susceptibles, en animales infectados por una cepa de
virus muy virulenta, o en animales que han trabajado durante la fase febril de la enfermedad. La recuperacin de
esta forma es muy rara y ocurre en <5% de los casos.
El perodo de incubacin de la forma subaguda, edematosa o cardaca vara de unos 7 a 14 das, y la aparicin
de la enfermedad est marcada por una reaccin febril (39-41C) que dura 3-6 das. Poco antes del descenso de
la fiebre pueden aparecer inflamaciones edematosas caractersticas. Al principio afectan las fosas temporales y
supraorbitales y los prpados, y ms tarde se extienden a los labios, carrillos, lengua, espacio intermandibular y
regin larngea. A veces el edema subcutneo se extiende a una distancia variable descendiendo por el cuello
hacia el pecho y, en casos graves, puede afectar al pecho y a la espalda, pero no a las patas inferiores. En fase
terminal, se pueden hemorragias petequiales en la conjuntiva y en bajo la superficie ventral de la lengua. El
animal se vuelve inquieto y puede mostrar sntomas de clico antes de la muerte por fallo cardaco. Tambin se
aprecia dificultad al tragar debida a parlisis del esfago. La mortalidad es del 50% y la muerte ocurre
normalmente a los 4-8 das de la aparicin de la reaccin febril. En casos de recuperacin, la inflamacin
desaparece de modo gradual en 3-8 das. Esta forma clnica de AHS se asocia por lo general con infecciones por
cepas de virus con baja virulencia o se presenta en animales inmunes infectados con cepas de virus heterlogos,
o puede depender de variacin biolgica en el animal infectado.
242
La forma aguda o mixta representa una mezcla de la forma pulmonar y de la cardaca. Aunque raramente se
diagnostica clnicamente, es la forma ms comn y se detecta en el examen post-mortem en la mayor parte de
los casos mortales de PEA en caballos y mulas. El perodo de incubacin vara de 5 a 7 das y la enfermedad
puede manifestarse de los modos siguientes:
Los sntomas iniciales pulmonares son relativamente suaves y se continan con marcadas
inflamaciones edematosas de cabeza y cuello, con muerte ocasionada por fallo cardaco.
La inflamacin edematosa, tpica de la forma subaguda, contina con una sbita aparicin de disnea y
otros sntomas clnicos tpicos de la forma hiperaguda pulmonar.
En la forma mixta la mortalidad es >80% y la muerte ocurre a los 3-6 das de la aparicin de la reaccin febril.
La enfermedad febril del caballo es la forma ms leve y con frecuencia pasa desapercibida en los focos
naturales. El perodo de incubacin vara de 5 a 14 das y contina con una reaccin febril (39-40C) de tipo
intermitente, con remisiones por la maana y subidas por la tarde, que dura de 5-8 das. Aparte de la reaccin
febril, son raros otros sntomas clnicos. Las conjuntivas pueden estar dbilmente congestionadas, puede
aumentar el pulso, y se puede presentar cierta anorexia y depresin. Esta forma de enfermedad se suele
observar en animales parcialmente inmunes o en especies resistentes, como el asno y la cebra.
No existen evidencias de que el hombre pueda infectarse por alguna cepa natural del AHSV, ni por contacto con
animales infectados natural o experimentalmente ni por manipulacin del virus en el laboratorio. No obstante, se
han descrito algunas cepas vacunales neurotrpicas que pueden causar encefalitis y retinitis en humanos tras
infecciones nasales (24). Se ha descrito la transmisin experimental y natural de la PEA a perros por ingestin de
carne de caballo infectada (3). Sin embargo, la evidencia de que los perros puedan infectarse por picaduras de
insecto es limitada y poco convincente (30).
1.
Se dispone de varias tcnicas para la identificacin vrica de la PEA que varan desde el enzimoinmunoensayo
(ELISA), con anticuerpos poli (PAbs) o monoclonales (MAbs), hasta la prueba de la reaccin en cadena de la
polimerasa (PCR), incluyendo una nueva PCR de transcripcin inversa (RT-PCR) para diferenciar los nueve
serotipos del AHSV (27), o el cultivo celular y la inoculacin en ratones recin nacidos. Si es posible se debe
realizar ms de una prueba para diagnosticar un brote de PEA, especialmente en el caso inicial. La primera
prueba puede ser un ensayo rpido como ELISA o PCR, seguido por el aislamiento del virus en cultivo celular.
La neutralizacin del virus (VN) para identificacin del serotipo debe realizarse en un brote lo antes posible para
poder seleccionar la vacuna correcta. A continuacin, las pruebas ELISA pueden ser muy tiles para el
diagnstico en el laboratorio.
Actualmente no hay estndares internacionales para virus ni para reactivos de diagnstico, ni tampoco una
metodologa normalizada para la determinacin del AHSV. Sin embargo, se ha evaluado una serie de virus y se
han realizado estudios comparativos entre diferentes laboratorios sobre tcnicas ELISA para determinacin de
antgeno del AHSV AHSV. Los resultados han demostrado un alto nivel de correlacin en cuanto a deteccin de
antgeno (26) usando la tcnica indirecta de ELISA en sandwich para estudios antignicos (11,16).
Un aspecto muy importante del diagnstico es la seleccin de muestras y su transporte al laboratorio.
a)
Muestras para el aislamiento de virus

Las mejores muestras para diagnstico son: sangre completa no coagulada recogida de animales enfermos
durante la fase febril de la enfermedad, as como pequeos trozos (2-4 g) de bazo, pulmn y ndulos
linfticos que hayan muerto. Las muestras se deben mantener a 4C durante el transporte y la
conservacin.
b)
Cultivo celular
Se ha usado con xito el aislamiento directo del AHSV sobre lneas celulares de rin de hmster neonato
(BHK-21), clulas estables de mono (MS) y clulas de rin de mono verde africano (Vero). Las muestras
de sangre recogidas con heparina se pueden usar sin diluir. Tras 60 minutos de adsorcin, los cultivos
celulares se lavan y se aade medio de mantenimiento. Alternativamente, y de modo ms frecuente, los
eritrocitos se lavan, se lisa y se diluye 1/10. Este procedimiento elimina anticuerpos indeseables que
podran neutralizar el virus y favorece la liberacin de los virus asociados con la membrana celular de los
eritrocitos. Cuando se utilizan muestras de tejidos, como bazo, pulmn, etc., se prepara una suspensin de
tejido al 10% en solucin salina tamponada con fosfato (PBS) o en medio de cultivo celular, que contenga
antibiticos.
243
Entre los 2 y 8 das despus de la infeccin puede aparecer un efecto citoptico (ECP). Se deben realizar
tres pases ciegos antes de considerar una muestra como negativa.
c)
Ratones neonatos
Este mtodo de aislamiento del AHSV supone la inoculacin intracerebral de dos familias de ratones de 1-3
das de edad. En los casos positivos, los animales desarrollan sntomas nerviosos entre los 5 y 15 das de
la inoculacin. Se deben tomar los cerebros de los animales enfermos, homogeneizarlos y reinocularlos
intracerebralmente en al menos seis ratones de 1-3 das de edad. Este segundo pase debe presentar un
perodo de incubacin acortado (2-5 das) y un 100% de infectividad.
d)
Prueba de enzimoinmunoensayo en sandwich

Se han desarrollado por lo menos dos ensayos ELISA de tipo sandwich y se han probado en condiciones
de campo para la deteccin de antgeno del AHSV en muestras naturales y en cultivos de tejidos infectados
en el laboratorio (11,16).
Una tcnica (11) utiliza Pabs contra el AHSV y la otra (6) utiliza Mabs contra una de las protenas
principales y ms conservadas en los serotipos la protena VP7. Est demostrado que ambos mtodos son
adecuados para diagnosticar PEA por su elevada sensibilidad y especificidad y por permitir tener resultados
en solo 2-4 horas (26). Se ha descrito el uso de una inmunoglobulina (IgY) de pollo para detectar todos los
serotipos del AHSV en un ensayo ELISA de tipo sandwich con doble anticuerpo (5).
Los reactivos para ELISA se pueden obtener de los Laboratorios de Referencia para la peste equina
africana de la OIE (ver Cuadro en la Parte 3 de este Manual).
Lo que sigue es un ejemplo de prueba de enzimoinmunoensayo con un anticuerpo monoclonal.

i)
Fase slida: Recubrir las placas para ELISA (por ejemplo, Nunc Maxisorb de alta capacidad de
adsorcin) con una mezcla de Mab 5G5 y 3D2 diluida en PBS, pH 7.2 (10 g/ml de cada uno).
Incubar toda la noche a 4C.
ii)
Lavar las placas cinco veces con agua destilada que contenga 0.05% (v/v) de
Tween 20 (solucin de lavado). Tocar suavemente las placas con un material absorbente para
eliminar cualquier residuo del lavado.
iii)
Bloquear las placas con PBS + 1% de seroalbmina bovina (BSA), pH 7.2, poniendo
200 l/pocillo, durante 1 hora a 37C.
iv)
Eliminar la solucin de bloqueo y limpiar ligeramente las placas con un material absorbente.
v)
Muestras de ensayo: Aadir las muestras a probar (diluciones dobles comenzando con
homogenados de bazo sin diluir, o con el sobrenadante de cultivo celular de AHSV) diluidas con
PBS + 1% de BSA, pH 7.2, poniendo 100 l/pocillo. Incubar 1 hora a 37C. (Homogenado de
bazo: homogeneizar aproximadamente 2 cm3 [1 g] de bazo con 3 ml de medio de cultivo MEM
[medio mnimo esencial]. Centrifugar a 600 g por 3 minutos y guardar el sobrenadante).
vi)
Lavar las placas como en el paso (ii).
vii)
Conjugado: Poner 100 l/pocillo de Mab 5G5 marcado con biotina diluido 1/500 en PBS + 1%
BSA, pH 7.2. Incubar 1 hora a 37C. Lavar las placas como en el paso ii. Aadir 100 l/pocillo de
avidina/peroxidasa a dilucin ptima en PBS + 1% de BSA. Incubar 45 minutos a temperatura
ambiente.
viii) Lavar las placas como se describe en el paso (ii).
244
ix)
Substrato: Aadir 200 l/pocillo de solucin de substrato (10 ml de 80.6 mM de DMAB [dimetil
aminobenzaldehdo] + 10 ml de 1.56 mM MBTH [hidrocloruro de 3-metil-2-benzo-tiazolinona
hidrazona] + 5 l de H2O2). Despus de unos 5-10 minutos, el desarrollo del color se detiene
aadiendo 50 l de SO4H2 3N (antes de que el control negativo comience a colorear).
x)
Leer las placas a 600 nm (o a 620 nm).
xi)
Interpretacin de los resultados: Calcular el valor de corte del modo siguiente: C + 0.06 = Corte
(donde C es el valor de absorbancia obtenido con el control negativo). Las muestras de ensayo
con valores de absorbancia menores que el corte se consideran negativas. Las muestras de
ensayo con valores de absorbancia superiores al corte + 0,20 se consideran positivas. Las
muestras con valores intermedios de absorbancia son dudosas y se debe emplear una segunda
tcnica para confirmar el resultado.
e)

Se ha desarrollado un ensayo por PCR para la deteccin especfica del ARN del AHSV. Los cebadores
corresponden al extremo 5 (nucletidos 1-21) y 3 (nucletidos 1160-1179) del segmento 8 del ARN (20,
29, 35).
La extraccin de cidos nucleicos de las muestras de bazo se hace de la siguiente forma: se homogeniza
1 g de muestra del tejido en 1 ml de solucin desnaturalizante (tiocianato de guanidinio 4 M, citrato sdico
25 mM, 2-mercaptoetanol 0,1 M, sarcosil al 0.5%). Tras centrifugar, se aade al sobrenadante 1 g de
ARN de levadura, 0,1 ml de acetato sdico 2 M pH 4, 1 ml de fenol y 0,2 ml de una mezcla de
cloroformo/alcohol isoamlico (49/1). La suspensin se agita vigorosamente y se enfra en hielo por
15 minutos. Tras centrifugar, el ARN presente en la fase acuosa se extrae con fenol, se precipita con
alcohol y se resuspende en agua estril. Los mtodos para sntesis de cADN y amplificacin por PCR se
realizan usando en todos los casos 37C como temperatura de renaturalizacin. Las secuencias utilizadas
como cebadores en la PCR son 5-GTT-AAA-ATT-CGC-TTA-GGA-TG-3, que corresponde al ARN con
polaridad de mensajero y 5-GTA-AGT-GTA-TTC-GGT-ATT-G-3, que es complementario al ARN con
polaridad de mensajero. El proceso de la PCR en s comprende 40 ciclos (94C por 1 minuto, 55C por
1.5 minutos, 72C por 2.5 minutos y 70C por 7 minutos) y luego los tubos de PCR se mantienen a 4C. El
anlisis de los productos de PCR se realiza mediante electroforesis en geles de agarosa al 1.2% (p/v) que
contienen bromuro de etidio. Las muestras positivas originarn una banda de 1179 pares de bases.
Se ha descrito una nueva RT-PCR para diferenciar los nueve serotipos del AHSV (27). Para cada serotipo
especfico se disearon nueve pares de cebadores. Los resultados obtenidos muestran un perfecto acuerdo
entre la prueba RT-PCR y la prueba VN.
Tambin se ha realizado el tipado de los nueve serotipos de AHS con sondas desarrolladas a partir de una
serie de genes VP2 clonados por completo, y pueden representar una alternativa a la amplificacin del
segmento genmico 2 (15).
2.
Pruebas serolgicas
Existen sueros de Referencia Internacional de la OIE disponibles en el Laboratorio de referencia de la OIE en

Valdeolmos, Madrid, Espaa (ver Parte 3 de este Manual). Estos sueros se desarrollaron para estandarizar los
ensayos ELISA, que constituyen una prueba recomendada por la OIE. Adems, se ha evaluado una serie de
antisueros de referencia y se han realizado estudios comparativos entre diferentes mtodos ELISA usando Mabs
y Pabs en varios laboratorios. Los resultados han demostrado un nivel de correlacin alto usando tcnicas ELISA
indirectas o competitivas para la deteccin de anticuerpo (10, 18, 26). Ms recientemente, se ha generado una
serie de sueros que estn siendo usados en la garanta anual de calidad de tres mtodos ELISA para deteccin
de anticuerpo segn se utilizan en laboratorios nacionales de Europa (8, 10, 18).
Para la deteccin de anticuerpos reactivos de grupo anti- AHSV AHSV, las tcnicas ELISA indirectas y
competitivas que utilizan antgeno soluble del AHSV o una protena VP7 recombinante (18), y un ELISA
competitivo que utiliza antgeno soluble del AHSV , han resultado ser buenos mtodos, especialmente para
investigaciones a gran escala (26). Ambos tipos de pruebas han sido reconocidos por la Comisin Europea (8).
El ELISA competitivo se ha usado tambin en poblaciones salvajes, pues con este mtodo no se requiere una
antiglobulina especfica de especie. Se ha adaptado una prueba de inmunotransferencia para determinacin de
anticuerpos anti-PEA (18). Es particularmente adecuado para pequeos nmeros de sueros. Tambin hay
disponible un mtodo ELISA indirecto que utiliza la protena no estructural NS3 del AHSV del serotipo 4 como
antgeno y que puede utilizarse para diferenciar animales infectados o vacunados con la vacuna viva de aquellos
otros vacunados con la vacuna inactivada hecha con viriones purificados (19). La prueba de fijacin del
complemento (CF) se ha usado con profusin, pero algunos sueros muestran actividad anticomplementaria.
a)
Enzimoinmunoensayo indirecto (una prueba prescrita para el comercio internacional)

Para la determinacin de anticuerpos contra el AHSV se ha usado como antgeno la protena VP7
recombinante con un alto grado de sensibilidad y especificidad (18, 33). Otras ventajas de este antgeno
son su estabilidad y su falta de infectividad.
i)
Fase slida: Recubrir las placas para ELISA (por ejemplo, Nunc Maxisorb de alta capacidad de
adsorcin) con VP7 recombinante de AHSV-4 diluida en tampn carbonato/bicarbonato, pH
9,6. Incubar toda la noche a 4C.
245
ii)
Lavar las placas cinco veces con agua destilada que contenga 0,01% (v/v) de Tween 20 (solucin de
lavado). Tocar suavemente las placas con un material absorbente para eliminar cualquier residuo del
lavado.
iii)
Bloquear las placas con PBS, pH 7,2 + 5% (p/v) de leche desnatada, 200 l/pocillo, durante 1 hora a
37C.
iv)
Retirar la solucin de bloqueo y limpiar suavemente las placas con un material absorbente.
v)
Muestras de ensayo: Las muestras de suero a ensayar, y los controles de suero positivo y negativo, se
diluyen 1/25 en PBS + 5% (p/v) de leche desnatada + 0,05% (v/v) de Tween 20, 100 l por pocillo.
Incubar 1 hora a 37C. Para la titulacin, aadir diluciones dobles seriadas desde 1/25 (100 l por
pocillo), poniendo un suero en cada columna de la placa, y hacer lo mismo con los controles positivos
y negativos. Incubar 1 hora a 37C.
vi)
Lavar las placas como en el paso (ii).
vii)
Conjugado: Depositar 100 l/pocillo de gamma-globulina anti-caballo conjugada con peroxidasa de

rbano diluida en PBS + 5% de leche +0,05% de Tween 20, pH 7,2. Incubar 1 hora a 37C.
viii) Lavar las placas como en el paso (ii).
b)
ix)
Substrato: Aadir 200 l/pocillo de solucin de substrato (10 ml de DAMB + 10 ml de TBTH + 5 l de

H2O2). Despus de unos 5-10 minutos, el desarrollo del color se detiene por adicin de 50 l de
H2SO4 3N (antes de que el control negativo empiece a colorear). Tambin se pueden usar otros
substratos como ABTS (2,2-azino-di-[3-etil-benzotiazolina]-6-cido sulfnico), TMB (tetrametil
benzidina) u OPD (ortofenildiamina)
x)
Leer las placas a 600 nm (o a 620 nm)
xi)
Interpretacin de los resultados: Calcular el valor de corte aadiendo 0,6 al valor del control negativo
(0.06 es la desviacin estndar derivada de un grupo de 30 sueros negativos). Las muestras con
valores de absorbancia menores que el corte se consideran negativas. Las muestras con valores de
absorbancia mayores que el corte + 0,15 se consideran positivas. Las muestras con valores
intermedios de absorbancia son dudosas y se requiere una segunda tcnica para confirmar el
resultado.
Inmunotransferencia
La unin de anticuerpos a protenas vricas separadas por electroforesis y transferidas a papel de
nitrocelulosa se ha empleado en la determinacin de anticuerpos anti-AHSV (18).
Las protenas de AHSV semipurificadas se separan por SDS/PAGE (dodecil sulfato sdico/ electroforesis
en gel de poliacrilamida) en geles con 15% (p/v) de acrilamida-N,N-dialiltartar-diamida (DATD). Las
protenas separadas se transfieren a un filtro de membrana de nitrocelulosa con corriente constante de 280
mA por 6 horas a 4C. La deteccin de inmunotransferencia de una membrana de nitrocelulosa cortada en
tiras se hace con sueros a una dilucin 1/20, una dilucin 1/500 de inmunoglobulina anti-caballo obtenida
en conejo y conjugada con peroxidasa, y una incubacin de 1 hora a 37C. Las bandas reconocidas por los
sueros se visualizan por la tcnica del 4-cloro-naftol.
Interpretacin de los resultados: La comparacin entre el modelo de bandas de un control de suero positivo
y otro negativo permite la identificacin de las bandas vricas especficas. La aparicin de una o ms
bandas especficas en un suero problema permite clasificarlo como un suero anti-AHS PEA positivo.
c)
Enzimoinmunoensayo con NS3

Se ha adaptado y evaluado un ensayo ELISA indirecto para distinguir entre caballos infectados y caballos
vacunados con la vacuna inactivada del serotipo 4 de AHSV purificado, usando como antgeno una protena
NS3 recombinante. Los resultados obtenidos (19) indican que la NS3 recombinante puede diferenciar entre
animales infectados y vacunados, lo que implica que esta recombinante podra ser un reactivo diagnstico
importante que permitira el transporte de animales vacunados. Para asegurar la exactitud de los
resultados, es esencial que la vacuna inactivada seleccionada contra AHSV sea una vacuna purificada.
Esto excluira con seguridad cualquier traza de NS3 que, si estuviera presente, estimulara la produccin de
anticuerpos anti-NS3 en los caballos vacunados, simulando por tanto una respuesta a la infeccin natural.
Este mtodo ELISA tambin ser til para distinguir entre caballos infectados y caballos vacunados con una
vacunas de subunidades en la que no est presente la protena NS3.
246
d)
Fijacin de complemento (una prueba prescrita para el comercio internacional)

La prueba CF se ha usado ampliamente, pero debido al efecto anti-complementario de algunos sueros, y a
los buenos resultados obtenidos con ensayos ELISA, su uso est disminuyendo. La prueba CF se utiliza
con frecuencia para poner de manifiesto anticuerpos especficos de grupo contra AHSV. Normalmente se
utiliza como antgeno un extracto de cerebro de ratn en sacarosa/acetona.
Reactivos
i)
Solucin salina tamponada con Veronal que contiene 1% de gelatina (VBSG).
ii)
Muestras de suero, libres de eritrocitos, que deben ser inactivadas por calor: el suero de caballo a
56C, el de cebra a 60C y el de asno a 62C, durante 30 minutos.
iii)
El antgeno es un extracto en sacarosa/acetona de cerebro de ratn infectado por ASHV. El antgeno

control es cerebro de ratn no infectado, extrado del mismo modo. En ausencia de un suero
internacional estandarizado, el antgeno debe titularse frente a un control de suero positivo preparado
localmente. En la prueba, se utilizan de cuatro a ocho unidades.
iv)
El complemento es un suero normal de cobaya.
v)
La hemolisina es un suero de conejo hiperinmune contra eritrocitos de oveja (SRBCs).
vi)
Los SRBCs se obtienen por puncin asptica de la vena yugular y se conservan en solucin de
Alsever1 o en citrato sdico.
vii)
El sistema hemoltico se prepara diluyendo la hemolisina hasta contener dos dosis hemolticas y
usando esto para sensibilizar a los SRBCs lavados. Los SRBCs se estandarizan a una concentracin
del 3%.
viii) Suero control: Se obtiene localmente un suero control positivo y se valida. Como suero control
negativo se utiliza suero de un caballo sano negativo para anticuerpos.
e)
i)
Los sueros, el complemento y el antgeno se dejan reaccionar a 4C por 18 horas en placas de

microtitulacin de fondo cncavo, o en tubos si se utiliza la macro-tcnica.
ii)
Los SRBCs sensibilizados (3%) se aaden a todos los pocillos de la placa.
iii)
La placa se incuba 30 minutos a 37C.
iv)
Las placas se centrifugan luego a 200 g, y los pocillos se analizan para la presencia de hemolisis.
v)
Se utilizan los siguientes controles: (a) suero y complemento; (b) suero y SRBCs; (c) antgeno FC y
control de antgeno, cada uno con 4 CH50 (unidades hemolticas medias de complemento), 2 CH50, y
1 CH50 de complemento; (d) antgeno FC y SRBCs; (e) control de antgeno y SRBCs; (f) diluciones de
complemento de 4 CH50, 2 CH50 y 1 CH50, y (d) SRBCs.
vi)
Los resultados se leen usando un 50% de hemolisis como punto final. El inverso de la dilucin ms
alta de suero que fija especficamente complemento con el antgeno FC representa el ttulo.
vii)
Un ttulo de 1/10 o ms es positivo y bajo 1/10 es negativo.
Neutralizacin de virus
El mtodo de eleccin para serotipado es NV. La prueba puede realizarse como se indica (12,13).
i)
Se diluye el virus obtenido para dar 30-100 DICCT50 (dosis infectiva media en cultivo de tejidos) por
cada 25 l, y se aaden 25 l a cada uno de cuatro pocillos de microtitulacin con 25 l de
diluciones de sueros. Para anlisis, se utiliza una dilucin final de suero de 1/10. Para titulaciones se
utilizan diluciones dobles seriadas.
ii)
Las mezclas suero/virus se incuban 60 minutos a 37C antes de aadir a cada pocillo de ensayo
0,1 ml de una suspensin de clulas Vero (200.000 clulas/ml).
iii)
Se prepara una titulacin del stock de virus para cada ensayo usando cuatro pocillos por dilucin
decimal, con 25 l por pocillo. Las placas de ensayo se incuban a 37C, con 5% de CO2, con 95% de
humedad, durante 4-5 das, hasta que la titulacin indique que el stock de virus contiene 30100 DICCT50.
20.5 g de dextrosa (114 mM), 7.9 g de citrato sdico 2 H2O (27 mM), 4.2 g NaCl (71 mM), H2O hasta 1 litro. Ajustar el pH
con cido ctrico 1 M.
247
iv)
A continuacin las placas se fijan y se tien con una solucin de 0,15% (p/v) de cristal violeta en 2%
(v/v) de glutaraldehdo y se lavan. Alternativamente, se pueden fijar con etanol y teirlas con fucsina
bsica al 1%.
v)
El ttulo del suero a punto final del 50% se calcula por el mtodo de Sperman-Krber y se expresa
como log10 negativo.

Son de uso general las vacunas vivas atenuadas poli o monovalentes contra AHS que estn basadas en la
seleccin de virus genticamente estables que producen macroplacas de lisis en cultivos de clulas Vero (7). Se
ha producido comercialmente una vacuna monovalente inactivada contra AHSV (de serotipo 4), pero ya no est
disponible en la actualidad (4, 14). Los requisitos tanto para vacunas atenuadas como para inactivadas se
resumen ms adelante.
Las directrices para la produccin de vacunas veterinarias se indican en el Captulo I.1.7. Principios de
produccin de vacunas veterinarias. Las normas dadas aqu y en el Captulo I.1.7 intentan ser de carcter
general y pueden suplementarse con requisitos nacionales y regionales.
C1. Vacuna atenuada contra la peste equina africana

1.
Control del inculo
a)

El inculo de virus se prepara a partir de AHSV genticamente estable tomado de grandes placas de lisis
seleccionadas en clulas Vero con bajo nivel de pases. Se liofiliza una gran cantidad de este antgeno y se
guarda a 20C como stock de antgeno para la siembra.
b)
Mtodo de cultivo
El virus de inculo se crece en frascos rotatorios de cultivos de clulas Vero.
c)

Por tcnicas apropiadas el virus de inculo debe estar libre de virus contaminantes, bacterias y
micoplasmas. Se confirma la identidad del serotipo del virus de inculo.
2.
Mtodo de produccin
Al principio de una fase de produccin, se producen antgenos de trabajo en cultivos celulares de clulas BHK-21
o Vero a partir del stock de antgeno de inculo. Los antgenos de trabajo se prueban en cuanto a esterilidad,
pureza e identidad y deberan contener un mnimo de 1 x 106 unidades formadoras de placas (PFU)/ml del virus
infeccioso.
Los cultivos de clulas Vero se crecen en frascos rotatorios usando en el medio suero bovino irradiado con
radiacin gamma. Una vez que los cultivos llegan a ser confluentes, el medio se elimina y las clulas se
siembran con los antgenos de trabajo. Tras 1 hora, se aade a los cultivos medio de mantenimiento. La
incubacin se contina durante 2-3 das a 37C. Cuando el ECP est avanzado, se recogen tanto las clulas
como el medio lquido sobrenadante. Los productos del mismo serotipo se agrupan y se guardan a 4C.
3.
Control interno
El material recogido de los serotipos individuales se analiza para esterilidad y se ensaya para infectividad
mediante titulacin de formacin de placas en cultivos de clulas Vero. El ttulo mnimo aceptable es de 1 x 106
PFU/ml.
Finalmente, se preparan dos vacunas cuatrivalentes mezclando volmenes iguales de los serotipos 1, 3, 4, 5 y 2,
6, 7, 8 respectivamente. Posteriormente el serotipo 5 de AHSV se ha eliminado de esta vacuna. Tambin se
puede preparar un tipo monovalente. Tras la adicin de un estabilizador apropiado, la vacuna se distribuye en
volmenes de 1 ml en viales de vidrio y se liofiliza.
248
4.
Control de lotes
a)
Esterilidad
Despus de la liofilizacin, se seleccionan al azar cinco frascos de vacuna y se ensayan para esterilidad por
mtodos aceptados internacionalmente. Las pruebas para esterilidad y ausencia de contaminacin de los
productos biolgicos se indican en el Captulo I.1.5.
b)
Inocuidad
La prueba de que una vacuna sea inocua se realiza mediante inoculacin de la vacuna reconstituida en
ratones (0,25 ml, intraperitonealmente), cobayas (1,0 ml, intraperitonealmente), y un caballo (5,0 ml,
subcutneamente). Todos los animales se observan diariamente durante 14 das. La temperatura rectal del
caballo se toma dos veces al da durante 14 das y nunca debe superar los 39C.
c)
Potencia
La potencia depende en gran medida de la concentracin de virus en la vacuna.
La dosis inmunizante mnima para cada serotipo es de alrededor de 1 x 103 PFU/dosis. El ttulo de
infectividad del producto final se ensaya por titulacin de placas en cultivo de clulas Vero y debera
contener al menos 1 x 105 PFU/dosis. El caballo usado en la prueba de inocuidad se utiliza tambin para
determinar la inmunogenicidad de una vacuna.
Se toman muestras de suero el da de la vacunacin y 21 das despus, y se ensayan para anticuerpos
neutralizantes contra cada serotipo por la prueba de reduccin de placas usando diluciones seriadas dobles
y unas 100 UPF de virus. El caballo debera desarrollar un ttulo de anticuerpos neutralizantes de al menos
20 contra un mnimo de tres de los cuatro serotipos presentes en la vacuna cuatrivalente.
d)
La duracin de la inmunidad no se confirma en cada lote de vacuna, pero se sabe que la inmunidad
persiste por al menos 4 aos. Sin embargo, a la vista de una posible interferencia entre los serotipos
individuales de cada vacuna cuatrivalente, se recomienda la revacunacin anual en regiones enzooticas. La
vacunacin con vacuna monovalente estimula una inmunidad que dura prcticamente toda la vida.
e)
Estabilidad
En estado liofilizado la vacuna retiene su potencia durante muchos aos si se guarda a 4-8C. Sin embargo,
se considera normalmente una caducidad de 2 aos.
C2. Vacuna inactivada contra la peste equina africana

1.
Control de inculos
a)

El virus de inculo es la cepa vacunal atenuada (AHSV de serotipo 4) que se utiliza ampliamente en el
campo en frica y en el sur de Europa (existen stocks de inculo disponibles en el Laboratorio de
Referencia de la OIE [Onderstepoort]). Para su atenuacin, el virus se pas diez veces por cerebro de ratn
recin nacido, y luego se pas otras diez veces por cultivo de clulas BHK-21 en frascos rotatorios. Este
material se purific tres veces por placa en cultivos celulares de clulas Vero mediante la seleccin de una
placa de lisis grande (4-6 mm) en diluciones terminales. El material de la placa final se pas una vez ms
por cerebro de ratn recin nacido y cuatro veces ms en cultivos celulares de clulas Vero. Este material
se liofiliz y constituye el inculo primario de virus.
b)
Mtodo de cultivo
El virus atenuado se propaga por pases en clulas BHK-21 en frascos rotatorios.
c)

Por mtodos apropiados, se debe demostrar que el inculo de virus est libre de virus contaminantes,
bacterias y micoplasmas. La identificacin del serotipo se confirma usando Mabs por un mtodo ELISA de
doble sandwich.
249
2.
Mtodo de produccin
El virus se recoge cuando el CPE caracterstico se ha desarrollado por completo. El cultivo posterior se realiza en
suspensiones celulares con medio de Stoker sin suero (MEM) a 37C. El crecimiento del virus se analiza
respecto a la viabilidad celular (CPE), y cuando se llega a las condiciones ptimas, se baja la temperatura del
fermentador de cultivo a 4C. La suspensin de virus se recoge en condiciones aspticas.
La suspensin filtrada del virus atenuado se inactiva con formaldehdo a una concentracin final de 1/1.000. La
suspensin se transfiere a otro tanque y se mantiene a 4C con agitacin suave durante un mnimo de 10 das
para asegurarse de que todo el virus est inactivado. Tambin se realizan controles de inactivacin.
Tras la inactivacin, la suspensin de antgeno se concentra por ultrafiltracin y luego se purifica mediante
precipitacin selectiva con un complejo de xido de etileno y cationes bivalentes segn un proceso patentado.
3.
Control interno
Se realizan pruebas sobre la identidad del virus por ELISA en doble sandwich, sobre la titulacin del virus antes
de la inactivacin en lneas celulares Vero, sobre la estimacin de la concentracin de partculas vricas por
anlisis en gradiente de sacarosa, y sobre la esterilidad.
4.
Control de lotes
a)
Esterilidad
Las pruebas sobre esterilidad y ausencia de contaminacin de los productos biolgicos se indican en el
Captulo I.1.5.
b)
Inocuidad
Se inoculan caballos susceptibles al AHSV por va intramuscular o subcutnea con una dosis sencilla o
doble de la vacuna. Se registran diariamente las temperaturas durante 14 das, y se observan los caballos
para posibles signos clnicos. Cinco cobayas reciben una dosis vacunal de caballo por ruta intramuscular.
Los sueros recogidos el da 21 se ensayan por NV para anticuerpos.
c)
Potencia
El control de potencia se realiza en caballos vacunados mediante una infeccin de desafo. Se vacuna a
algunos animales con una dosis de vacuna y a otros con dos dosis. A los 77 das despus de la primera
inoculacin de vacuna se hace la inoculacin de desafo por va intravenosa. Cuando se emplean dos
vacunaciones, la segunda dosis se suministra 21 das despus de la primera.
Se recogen muestras de suero el da de la vacunacin y 21 das despus y se ensayan para presencia de
anticuerpos neutralizantes y aislamiento de virus.
d)
No se han realizado estmulos de provocacin en caballos, sino solamente estudios serolgicos. Si el nivel
de anticuerpos despus de dos inyecciones (protocolo de campo recomendado) y el de 12 meses despus
de la vacunacin es equivalente al nivel logrado por una vacunacin simple a los 28 das despus de tal
vacunacin, se considera que los caballos estn protegidos. Con esta norma, la duracin de la inmunidad
es de 1 ao, comenzando a los 7-10 das despus de la primera inyeccin. En los aos siguientes es
suficiente una dosis de refuerzo cada ao para conseguir un nivel de proteccin. El protocolo de vacunacin
recomendado por los fabricantes incluye dos vacunaciones (separadas por 21 das) y una dosis de refuerzo
a los 365 das despus de la primera vacunacin.
e)
Estabilidad
Como la vacuna inactivada es un producto relativamente nuevo, no hay muchos datos disponibles sobre la
duracin de su estabilidad. Se han obtenido resultados que demuestran que la estabilidad de la vacuna
sobrepasa los 3 aos.
C.3 Vacuna de subunidades contra la peste equina africana

Se han usado en diferentes combinaciones las protenas VP2 y VP5 de la cpsida externa del AHSV de serotipo
4, junto con la protena VP7 de la cpsida interna, para inmunizar caballos (21). Estas protenas derivaban de
250
vectores de expresin de baculovirus con recombinaciones simples y dobles. Los extractos celulares crudos que
contenan las tres protenas estructurales fueron suficientes para obtener una respuesta inmune de proteccin
completa en caballos sometidos a inoculaciones de desafo con virus AHSV virulentos (106 DICCT50). No se
detect viremia en los caballos vacunados (21). Un anlisis adicional de un lisado crudo que confera proteccin
parcial revel que slo la protena soluble VP2 era capaz de inducir anticuerpos neutralizantes. Se ha logrado
definir los sitios de neutralizacin de la protena viral VP2 de los serotipos 3,4 y 9 de AHSV (2, 22, 31) y ms
recientemente se ha descrito la proteccin completa de caballos inmunizados con una protena VP2 soluble y
recombinante (de AHSV de serotipo 5) administrada con saponina, frente a un desafo con AHSV letal (28).
Aunque se necesita realizar ms experimentos para estimar la duracin de la inmunidad inducida por estas
protenas, los datos indican la eficacia de esta candidata a vacuna.
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179188.
*
* *
NB: Existen laboratorios de referencia de la OIE para la Peste equina africana (ver Cuadro en la parte 3 de este
253
CAPTULO 2.1.12.
PESTE PORCINA AFRICANA
RESUMEN
La peste porcina africana (PPA) es una enfermedad infecciosa de cerdos domsticos y salvajes
que afecta animales de todas las razas y edades y que est causada por un virus que produce una
serie de sndromes. La enfermedad aguda se caracteriza por fiebre elevada, hemorragias en el
sistema retculoendotelial y elevadas tasas de mortalidad. El virus infeccioso sobrevive durante
meses en carne fresca y en derivados crnicos desecados y salados.
El virus de la PPA (ASFV) es el nico miembro de la familia Asfarviridae.
Los procedimientos de laboratorio para diagnstico forman dos grupos: el primero incluye pruebas
para aislar los virus y la deteccin de los antgenos vricos, as como el ADN genmico, y el
segundo contiene pruebas para detectar anticuerpos. La seleccin de las pruebas a realizar
depende de la situacin de la enfermedad en el rea o pas.
En pases libres de PPA donde se sospecha su presencia, el diagnstico debe dirigirse al
aislamiento del virus, realizando en paralelo una inoculacin de leucocitos de cerdo o cultivos de
mdula sea, la deteccin del antgeno en frotis o cortes de tejidos congelados por la prueba de la
inmunofluorescencia directa (IFD) y, cuando resulte posible, la deteccin del ADN genmico por la
reaccin en cadena de la polimerasa (PCR). Al mismo tiempo tambin debe llevarse cabo la
deteccin de anticuerpos en lquidos tisulares por inmunofluorescencia indirecta (IFI).
Identificacin del agente: Los tejidos enviados de casos sospechosos de enfermedad en el
campo, deben examinarse en frotis o cortes para el antgeno vrico por FAT y para la presencia de
virus por inoculacin de cultivos primarios de leucocitos de cerdo, que se analizan diariamente
para hemadsorcin y efecto citoptico. Las clulas de los cultivos negativos se investigan para el
antgeno mediante FAT y se vuelven a inocular en cultivos nuevos de leucocitos.
Se puede utilizar PCR para detectar el genoma del virus en los tejidos y resulta particularmente til
si los tejidos son inadecuados para el aislamiento del virus o la deteccin del antgeno.
En casos dudosos, el material se vuelve a cultivar y los procedimientos descritos anteriormente se
repiten.
Pruebas serolgicas: Cuando la enfermedad es endmica o cuando un brote inicial est causado
por una cepa de baja virulencia, la investigacin de nuevos brotes debe incluir la deteccin de
anticuerpos mediante inmunoensayo en el suero o en los extractos de los tejidos enviados.
Requisitos para las vacunas y los materiales de diagnstico: Actualmente no existe vacuna
para la PPA.
A. INTRODUCCIN
El virus de la peste porcina africana (ASFV) se clasific inicialmente como un miembro de la familia Iridoviridae,
pero la estructura del genoma y la estrategia de replicacin del virus muestran muchas caractersticas comunes
con los miembros de la familia Poxviridae (14). En 1984, en el Sexto Congreso del Comit Internacional de
Taxonoma de Virus (ICTV) en Sendai (Japn), se acept la propuesta de que el ASFV se considere como una
familia separada de la de los Iridoviridae. En la actualidad el virus se clasifica como el nico miembro de la
familia denominada Asfarviridae.
254
Manual de la OIE sobre Animales Terrestres 2004
Captulo 2.1.12. Peste porcina africana
Los virus de la PPA producen una serie de sndromes que varan desde la enfermedad aguda a la crnica, y
existen portadores del virus aparentemente sanos. Las cepas ms virulentas producen una enfermedad
hemorrgica aguda caracterizada por fiebre elevada, prdida de apetito, hemorragias cutneas y de los rganos
internos, y muerte a los 2-10 das. Las tasas de mortalidad pueden alcanzar el 100%. Las cepas menos
virulentas producen sntomas clnicos suaves fiebre ligera, apetito reducido y depresin- que pueden
confundirse fcilmente con otras condiciones de los cerdos y no llevar a la sospecha de PPA. En varios pases,
cepas avirulentas y no hemadsorbentes producen una infeccin subclnica no hemorrgica y seroconversin,
pero algunos animales pueden desarrollar lesiones aisladas en los pulmones o en la piel en reas con salientes
seos y otras zonas susceptibles de traumatismos.
La PPA no puede distinguirse de la peste porcina clsica (PPC) (clera del cerdo) por examen clnico o postmortem, y ambas enfermedades deben considerarse en el diagnstico diferencial de cualquier sntoma febril
agudo y hemorrgico en el cerdo. Las septicemias bacterianas tambin pueden confundirse con la PPA y la PPC.
Para distinguir entre estas enfermedades son esenciales las pruebas de laboratorio.
En pases libres de PPA donde se sospecha su presencia, el diagnstico de laboratorio debe dirigirse al
aislamiento del virus realizando en paralelo una inoculacin de leucocitos de cerdo o cultivos de mdula sea, y
a la deteccin del antgeno en frotis o cortes de tejidos congelados por la prueba de la inmunofluorescencia
directa (IFD). Sin embargo, tambin debe realizarse al mismo tiempo la deteccin de anticuerpos en el suero o
los lquidos tisulares por enzimoinmunoensayo, inmunotransferencia o inmunofluorescencia indirecta (IFI) para
evitar retrasos en la deteccin de la infeccin por un virus inesperado de baja virulencia. La serologa puede ser
un instrumento valioso de ayuda para confirmar un brote ya que a menudo se pueden detectar los anticuerpos en
animales muertos por enfermedad aguda.
Una tcnica adicional que est ahora disponible es la reaccin en cadena de la polimerasa (PCR), que puede
emplearse para detectar el genoma vrico en la sangre o en los tejidos, y que es particularmente til si las
muestras disponibles son inadecuadas para aislar el virus o para detectar el antgeno debido a la putrefaccin.
1.
Cuando se sospecha PPA, se deben enviar al laboratorio las siguientes muestras: sangre con anticoagulante
(heparina o cido etiln diamino tetra-actico [EDTA]), bazo, amgdalas, rin y ganglios linfticos. Las muestras
deben mantenerse tan fras como sea posible sin congelarlas. Cuando las muestras llegan al laboratorio, si el
proceso de anlisis se retrasa, se guardan a 70C. Como no siempre es posible mantener la cadena de fro, se
pueden enviar las muestras en solucin salina con glicerol; esto puede reducir ligeramente la probabilidad de
identificar el virus, pero facilita la llegada de envos al laboratorio para poder confirmar un brote.
Preparacin de muestras para hemadsorcin e inoculacin en cerdos

i)
Preparar suspensiones de los tejidos homogenizando pequeos trozos en un mortero con arena estril
y aadiendo 5-10 ml de una solucin salina tamponada o medio de cultivo de tejidos que contenga
antibiticos.
ii)
Clarificar las suspensiones mediante centrifugacin a 1.000 g durante 5 minutos.
Utilizar el sobrenadante para hemadsorcin (Seccin B.1.a., ms adelante) y para inoculacin en cerdos
(Seccin B.1.d., ms adelante), aunque no se recomienda la inoculacin en cerdos.
a)
Prueba de hemadsorcin
La prueba de hemadsorcin (HAD) (6) es definitiva para PPA y depende del hecho de que los eritrocitos
porcinos se adhieren a la superficie de los monocitos o macrfagos porcinos que estn infectados con el
ASFV, y de que la mayora de los aislamientos de virus producen este fenmeno de hemadsorcin. Se ha
aislado un pequeo nmero de virus no hemadsorbentes, en gran parte avirulentos, aunque algunos
producen PPA aguda tpica. La prueba se realiza inoculando sangre o una suspensin de tejidos de
animales sospechosos a cultivos primarios de leucocitos (Procedimiento 1) o preparando cultivos de
leucocitos de la sangre de cerdos inoculados en el laboratorio o de cerdos sospechosos en el campo
(Procedimiento 2). Se pueden preparar hasta 300 cultivos de cada 100 ml de sangre desfibrinada o
heparinizada recogida. Resulta esencial realizar los procedimientos de forma que se evite la contaminacin
de los cultivos.
255
Procedimiento 1: Prueba de hemadsorcin en cultivos primarios de leucocitos
i)
Recoger el volumen necesario de sangre de cerdo fresca con heparina (100 Unidades Internacionales
[UI]/ml de sangre).
ii)
Centrifugar a 700 g durante 30 minutos, obtener la capa de clulas leucocitarias y lavar con medio.
iii)
Resuspender las clulas a una concentracin de 107 clulas/ml en medio de cultivo de tejidos que
contenga 10-30% de suero porcino y antibiticos. Para evitar la hemadsorcin inespecfica, el medio
debe contener suero o plasma del mismo cerdo del que se obtienen los leucocitos. Si se prueba un
gran volumen de muestras, los sueros homlogos pueden reemplazarse por suero que se haya
identificado como capaz de evitar la formacin de auto-rosetas inespecficas en un pre-anlisis.
iv)
Depositar alcuotas de 1,5 ml en tubos de 160 x 16 mm e incubar en posicin oblicua (5-10 de la

horizontal) a 37C.
Nota: Para diagnstico rutinario, solo los cultivos de 2-4 das son suficientemente sensibles.
v)
Inocular tres tubos de clulas aadiendo 0,2 ml de muestras de tejido preparadas por cada tubo. Se
aconseja inocular en los cultivos diluciones 1/10 y 1/100, y esto es particularmente importante cuando
el material recibido del campo es de mala condicin.
vi)
Inocular cultivos control positivos con virus hemadsorbente. Son esenciales los controles negativos no
inoculados para controlar la posibilidad de hemadsorcin inespecfica.
vii)
A los 3 das, aadir a cada tubo 0,2 ml de una preparacin reciente de eritrocitos al 1% en solucin
salina tamponada.
viii) Examinar diariamente al microscopio los cultivos durante 7-10 das para efecto citoptico (ECP) y
hemadsorcin.
ix)
Lectura de los resultados: La hemadsorcin consiste en la unin de muchos eritrocitos porcinos a la

superficie de las clulas infectadas. En ausencia de hemadsorcin, un ECP basado en la reduccin
del nmero de clulas adherentes puede deberse a citotoxicidad del inculo, al virus de la enfermedad
de Aujeszky o a ASFV no hemadsorbente, lo cual puede detectarse mediante FAT en el sedimento
celular o por PCR (ver ms adelante). Si no se observa cambio, o si los resultados de la
inmunofluoresencia o de PCR son negativos, el sobrenadante se vuelve a inocular en cultivos nuevos
de leucocitos.
Procedimiento 2: Prueba de hemadsorcin en auto-rosetas con leucocitos de sangre perifrica de cerdos

infectados
Este procedimiento es ms rpido que la preparacin e inoculacin de cultivos primarios de leucocitos

porcinos (descrita antes en el Procedimiento 1) y en casos positivos suministra resultados ms tempranos.
Se puede realizar en laboratorios no equipados para anlisis virolgicos; los requisitos mnimos son portas
y cubres, un microcopio, medio estril, tubos o botellas y pipetas. Se recoge sangre con heparina de cerdos
sospechosos en el campo o de cerdos inoculados en el laboratorio y se preparan cultivos de leucocitos para
examen directo de hemadsorcin. No obstante, los resultados de la prueba son difciles de estimar y el
mtodo est siendo reemplazado por la PCR.
b)
i)
Recoger 20 ml de sangre completa en una jeringa que contenga 2.000 UI de heparina en 2 ml se

solucin salina, mezclar y transferir a un tubo de vidrio o a una botella estrecha.
ii)
Colocar el tubo o botella verticalmente en un incubador o en un bao de agua a 37C y dejar

sedimentar las clulas. La sedimentacin se favorece aadiendo 2 ml de un dilatador del volumen del
plasma, como Dextravan 150 que es una solucin de Dextrano 150 en NaCl al 0,9% (Fisons,
Inglaterra).
iii)
Incubar los cultivos durante 6-8 horas a 37C y examinarlos despus cada 2-3 horas pasando a un
porta pequeas alcuotas del sobrenadante enriquecido en leucocitos, junto con algunos eritrocitos, e
identificando al microscopio las clulas hemadsorbentes.
Deteccin de antgeno por prueba de inmunofluorescencia

Se puede utilizar FAT (2) como un mtodo adicional para detectar antgeno en tejidos de cerdos que son
sospechosos en el campo o inoculados en el laboratorio. Por s sola, esta prueba no es suficiente para un
diagnstico de PPA. Tambin puede emplearse para detectar antgeno del ASFV en cultivos de leucocitos
donde no se ha observado HAD y poder as identificar cepas no hemadsorbentes de virus. Tambin
distingue entre el ECP producido por ASFV y por otros virus, como el virus de la enfermedad de Aujeszky o
por un inculo citotxico.
256
c)
i)
Preparar cortes o frotis de impresin de tejidos problema, o extender el sedimento celular de cultivos
de leucocitos inactivados en portas, secar al aire y fijar con acetona durante 10 minutos a temperatura
ambiente.
ii)
Teir con inmunoglobulina anti-ASFV conjugada con isotiocianato de fluorescena (FITC) a la dilucin
recomendada o pretitulada durante 1 hora a 37C en una cmara hmeda.
iii)
Fijar y teir preparaciones control positivas y negativas de forma similar.
iv)
Lavar con solucin salina tamponada con fosfato (PBS), montar los tejidos teidos en PBS/glicerol, y
examinar al microscopio de luz ultravioleta con proteccin adecuada y filtros de excitacin.
v)
Lectura de los resultados: Los tejidos son positivos si se observa una fluorescencia granular especfica
y citoplsmica en el tejido paracortical de rganos linfoides o en los macrfagos fijados en otros
rganos.
Deteccin del genoma vrico por la reaccin en cadena de la polimerasa

Se han desarrollado tcnicas de PCR utilizando cebadores de una regin muy conservada del genoma para
detectar e identificar una amplia gama de aislamientos pertenecientes a todos los genotipos vricos
conocidos, incluyendo virus no hemadsorbentes y de baja virulencia. Las tcnicas de PCR son
particularmente tiles para identificar virus con ADN en tejidos de cerdos que son inadecuados para el
aislamiento de virus o la deteccin de antgeno debido a que han sufrido putrefaccin o cuando hay buenas
razones para sospechar que el virus puede haberse inactivado antes de que las muestras hayan llegado al
laboratorio. Se describen dos mtodos de PCR que consisten en un procedimiento de preparacin de la
muestra y un procedimiento de la prueba.
Mtodo de la PCR
Este procedimiento y el procedimiento 2 sirven de modelo general y como un punto inicial para protocolos
de PCR. Las condiciones ptimas de reaccin (tiempos de incubacin y temperatura, modelos y
suministradores de equipos, concentraciones de los reactivos de ensayo, como cebadores y dNTPs)
pueden variar, de modo que primero deberan comprobarse las condiciones descritas. En el Captulo I.1.4
de este Manual se presentan detalles sobre validacin de la PCR y procedimientos que aseguran la validez
de la prueba. Se pueden introducir alteraciones en el protocolo para lograr una mejor realizacin.
Preparacin de la muestra
i)
Preparar suspensiones de tejido homogenizando pequeos trozos del tejido en un mortero con arena
estril, y hacer una dilucin 1/10 aadiendo 5-10 ml de PBS con 1% de suero de buey y antibiticos.
ii)
Centrifugar a 500 g durante 5 minutos.
iii)
Extraccin para muestras control: tejidos homogeneizados al 1/10 (los mismos tejidos que las
muestras analizadas): (a) un control negativo: utilizar 500 l de un tejido homogeneizado negativo para
ASFV; (b) un control positivo: utilizar 500 l de un tejido homogeneizado positivo para ASFV.
iv)
Transferir 500 l a un tubo Eppendorf con tapn roscado y hervir durante 10 minutos.
v)
Centrifugar a 13.000 g en una microfuga durante 5 minutos.
El sobrenadante se utiliza en la prueba de PCR.

El procedimiento de preparacin de muestra indicado anteriormente es sencillo y barato, pero puede
producir resultados negativos falsos por la presencia de inhibidores de la PCR. A continuacin se describe
un procedimiento alternativo de extraccin que utiliza el kit NucleoSpin Virus (Macherey Nagel). Este kit
incluye los reactivos, RAV1, RAV3, y columnas filtrantes NucleoSpin.
Procedimiento de trabajo para muestras lquidas: plasma, suero, medio de cultivo celular.
(Tngase en cuenta que para rganos y muestras de tejidos se debe preparar primero un homogeneizado
del material al 1/10 en PBS y centrifugar despus a 12.000 g durante 5 minutos. Utilizar el sobrenadante)
Extraccin para muestras control: tejidos homogeneizados al 1/10 (los mismos tejidos que las muestras
analizadas): (a) un control negativo: utilizar 150 l de un homogeneizadode tejido negativo para ASFV; (b)
un control positivo: utilizar 150 l de un homogeneizado de tejido positivo para ASFV.
257
i)
Aadir 600 l de RAV1 (incluido ARN transportador) a 150 l de muestra. Pipetear varias veces arriba
y abajo y agitar bien con vrtex. Incubar 5-10 minutos a temperatura ambiente.
ii)
Opcional: si la solucin resultante es turbia, centrifugarla 1 minuto para su clarificacin. Transferir el

sobrenadante a un nuevo tubo.
iii)
Aadir 600 l de etanol para clarificar la solucin y mezclar con vrtex.
iv)
Pasar 700 l de muestra a una columna de NucleoSpin, colocada en un tubo de centrfuga de 2 ml.
v)
Centrifugar durante 60 segundos a 6.000 g a temperatura ambiente. Eliminar el sobrenadante.
vi)
Cargar el resto de muestra (unos 600 l) en la misma columna de NucleoSpin y centrifugar como
antes. Eliminar el sobrenadante.
vii)
Aadir 500 l de tampn RAV3 a la columna de NucleoSpin.
viii) Centrifugar durante 30 segundos a 6.000-8.000 g. Eliminar el sobrenadante y repetir este paso de
lavado.
ix)
Eliminar el sobrenadante, colocar despus la columna de NucleoSpin en un tubo nuevo de centrfuga

de 2 ml, y centrifugar durante 5 minutos a la mxima velocidad para eliminar por completo el tampn
RAV3.
x)
Elucin de cido nucleicos: Colocar la columna NucleoSpin en un tubo de centrfuga estril de 1,5 ml,
aadir 50 l de tampn de elucin (Tris/HCl 5 mM, pH 8,5, precalentado a 70C) e incubar durante 2
minutos.
xi)
Centrifugar durante 60 segundos a 8.000 g.
xii)
Hasta uso, mantener a 20C los 50 l de ADN eluido.
Soluciones de stock
i)
Se dispone comercialmente de ADN polimerasa Taq y de tampn de amplificacin de PCR (10x).
ii)
Solucin stock de dNTP 1,25 mM: Preparar soluciones stock 50 mM de cada uno de los siguientes
nucletidos: dATP, dCTP, dGTP y dTTP. Aadir 10 l de cada una de estas soluciones stock a 360 l
de agua destilada estril.
iii)
Cebadores a concentracin de 20 pmol/l: Secuencia del cebador 1, 5-ATGGA-TACCG-AGGGAATAGC-3 (cadena positiva); Secuencia del cebador 2, 5-CTTAC-CGATG-AAAAT-GATAC-3 (cadena
negativa).
iv)
Tampn de carga: 0,25% de Orange G en una solucin acuosa de glicerol al 30%.
v)
Tampn TAE (50x) para el gel de agarosa: Tris base (242 g); cido actico glacial (57,1 ml); 0,5 M de
EDTA, pH 8,0 (100 ml); agua destilada (hasta 1 litro).
vi)
ADN marcador: existe un marcador comercializado de 100 pares de bases.
Procedimiento 1
i)
Aadir los siguientes reactivos al nmero necesario de tubos Eppendorf de 0,75 ml de polipropileno:
Agua destilada estril (24,5 l); (10x conc.) tampn de amplificacin de PCR (5l); cloruro magnsico
25 mM (4 l); solucin stock de dNTP 1,25 mM (8 l); cebador 1, 20 M (1l); cebador 2 (1 l);
sobrenadante de tejido (10 l); ADN polimerasa Taq 5U/l (0,25 l).
ii)
Los tubos control no contienen sobrenadante de tejido

Control negativo (sin ADN): Aadir 10 l de agua destilada.
Control positivo: Aadir 2 l de ADN de ASFV y 8 l de agua destilada.
iii)
Cubrir la mezcla con 60 l de aceite mineral.
iv)
Colocar todos los tubos en un termociclador automatizado de ADN y desarrollar el siguiente programa:
Un ciclo a 94C durante 5 minutos.
35 ciclos a 94C durante 1 minuto, 50C durante 1 minuto y 72C durante 1 minuto.
258

Mantener a 4C.
v)
Al final del programa, extraer con cuidado 20 l de cada mezcla de reaccin bajo el aceite mineral,
pasar a un tubo nuevo y aadir 2 l de tampn de carga.
vi)
Poner todas las muestras en el gel de agarosa al 2% en tampn TAE que contenga bromuro de etidio
a una concentracin final de 0,5 g/ml.
Aadir el ADN marcador a una calle de recorrido a cada lado del gel.
vii)
Correr el gel a voltaje constante de 150 voltios durante 2 horas.
viii) Lectura de los resultados: Examinar el gel con luz UV. En una muestra positiva, se presentar una
banda definida que co-emigrar con el producto de la PCR del control positivo. Calcular el tamao de
los productos de PCR en las muestras problema y en el control positivo con referencia a los
marcadores estndar. El producto de la PCR del control positivo tiene un tamao de 278 pares de
bases. No deben verse bandas en el control negativo.
Procedimiento 2: Protocolo de PCR con TaqMan (5)
El mtodo descrito es el publicado en la referencia 5. Existen otros kits comercializados para extraccin de
ADN y para la preparacin del molde apropiado para la PCR dependiendo de la muestra enviada para
anlisis, y pueden ser adecuados para utilizarlos en Laboratorios de Referencia.
A continuacin se describe el procedimiento basado en el QIAamp Viral RNA Mini Kit (QIAGEN) (protocolo
de centrifugacin, Enero 1999). Este sistema se puede utilizar con sangre de cerdos sospechosos de estar
afectados de peste porcina. En estos casos, la deteccin del ASFV se puede realizar en paralelo con la del
virus de la PPC (ver Captulo 2. 1. 13 para mtodos de deteccin molecular del CSFV).
i)
Pipetear 560 l del tampn AVL suministrado en tubos de microcentrfuga de 1,5 ml.
ii)
Aadir 140 l de muestra problema o control y mezclar en un vrtex durante 15 segundos. Se deben
procesar en paralelo con las muestras problema otras muestras como control negativo, que consisten
en homogeneizados de bazo, mdula sea (PBM) y clulas mononucleares de sangre perifrica (PBL)
de cerdos no infectados. Tambin pueden prepararse controles negativos adicionales de extraccin
para cada muestra problema y un control negativo no infectado desarrollando en paralelo extracciones
con agua exenta de nucleasas (todos los controles deben ensayarse despus por PCR junto con las
muestras problema).
iii)
Incubar por lo menos 10 minutos a temperatura ambiente.
iv)
Centrifugar el tubo de microcentrfuga de 1,5 ml brevemente para quitar gotas del interior de la tapa.
v)
Aadir 560 l de etanol a la muestra, someter a vrtex durante aproximadamente 15 segundos y

centrifugar brevemente para quitar gotas del interior de la tapa.
vi)
Aadir 630 l de la solucin del paso v) a una columna de centrifugacin QIAamp (en un tubo de 2 ml)
sin mojar el borde. Cerrar la tapa y centrifugar 1 minuto a 6000 g. Colocar la columna de
centrifugacin en un tubo limpio de 2 ml y desechar el tubo que contiene el filtrado.
vii)
Abrir cuidadosamente la columna de centrifugacin QIAamp y repetir el paso vi.
viii) Abrir cuidadosamente la columna de centrifugacin QIAamp y aadir 500 l de tampn AW1. Cerrar la
tapa y centrifugar 1 minuto a 6.000 g. Colocar la columna de centrifugacin en un tubo limpio de 2 ml y
desechar el tubo que contiene el filtrado.
ix)
Abrir cuidadosamente la columna de centrifugacin QIAamp y aadir 500 l de tampn AW2. Cerrar la
tapa y centrifugar 3 minutos a 20.000 g.
x)
Colocar la columna de centrifugacin QIAamp en un tubo nuevo de microcentrfuga de 1,5 ml.

Desechar el tubo anterior con el filtrado. Abrir cuidadosamente la columna de centrifugacin QIAamp y
aadir 60 l de tampn AVE. Cerrar la tapa e incubar 1 minuto a temperatura ambiente. Centrifugar 1
minuto a 6.000 g.
xi)
Desechar la columna de centrifugacin QIAamp. Guardar a 20C el ADN extrado (60 l) hasta que
se requiera para el proceso de amplificacin por PCR.
259
Soluciones stock
i)
Agua estril exenta de nucleasas u otra agua estril apropiada y mezcla base de reaccin TaqMan
PCR (x 2).
ii)
Cebadores a una concentracin de 50 pmoles/l: Secuencia del Cebador 1 5-CTGCT-CATGGTATCA-ATCTT-ATCGA-3 (cadena positiva); Secuencia del Cebador 2 5-GATAC-CACAA-GATC(AG)GCCGT-3 (cadena negativa)
iii)
Sonda TaqMan a una concentracin de 5 pmoles/l: (5-[6-carboxi-fluorescena (FAM)]-CCACGGGAGG-AATAC-CAACC-CAGTG-3-[6-carboxi-tetrametil-rodamine (TAMRA)]).
Amplificacin por PCR por la prueba TaqMan (5)
i)
Preparar para cada muestra la mezcla de reaccin que se describe abajo, en un tubo estril de
microcentrfuga de 1,5 ml. Preparar la mezcla de reaccin de una sola vez, teniendo en cuenta el
nmero de muestras en la prueba y considerar adems una muestra extra adicional.
Agua estril o libre de nucleasa (7,5 l); (concentrada x2) mezcla base de reaccin TaqMan para
PCR (12,5 l); cebador 1, 50 pmoles (0,5l); cebador 2, 50 pmoles (0,5l); sonda TaqMan, 5 pmoles
(1l).
ii)
Aadir 22 l de mezcla de reaccin a un pocillo de una placa de reaccin ptica MicroAmp por cada
muestra ensayada.
iii)
Aadir 3 l de la muestra del molde extrado o de un control de extraccin en blanco, y cubrir bien con
una tapa.
iv)
Centrifugar la placa durante 1 minuto en una centrfuga adecuada para mezclar el contenido de cada
pocillo.
v)
Colocar la placa en un sistema de deteccin de secuencias TaqManpara amplificacin por PCR y

desarrollar el siguiente programa:
Cuarenta ciclos a 95C durante 15 segundos, 58C durante 1 minuto.
Nota: Si no se dispone de termociclador TaqMan, se puede utilizar un termociclador ordinario y
analizar los productos de PCR por lectores de fluorescencia a punto final o, alternativamente, por
electroforesis en un gel de agarosa al 1,5%.
vi)
d)
Lectura de los resultados: Asignar un valor de ciclo umbral (CT) a cada reaccin de PCR en un anlisis
de todas las representaciones grficas de amplificacin (una grfica de la seal de fluorescencia frente
al nmero de ciclos). Las muestras problema negativas, los controles negativos no infectados o los
controles de extraccin en blanco deben tener un valor CT >40,0. Las muestras problema positivas y
los controles deben tener un valor CT<40,0 (las muestras fuertemente positivas tienen un valor
CT<30,0).
Inoculacin en cerdos
En el pasado, se utilizaba la inoculacin en cerdos para diferenciar entre la PPC y la PPA, aunque estas
enfermedades producen sntomas clnicos indistinguibles. Se inoculaban muestras en dos grupos de
cerdos, uno vacunado contra la PPC (clera del cerdo) y otro sin vacunar. Esta prueba ya no es necesaria
debido a la existencia de pruebas alternativas de laboratorio que proporcionan resultados fiables tanto para
la PPA como para la PPC: la prueba de inoculacin en cerdos es lenta, cara y difcil de realizar, y ocasiona
adems dolor agudo en los animales implicados, lo que supone seria preocupacin para el bienestar
animal. Esta prueba ya no se recomienda.
2.
Pruebas serolgicas
En cerdos recuperados, los anticuerpos persisten durante largos perodos despus de la infeccin, a veces
durante toda la vida, y existen varias pruebas para detectar estos anticuerpos, aunque solo unas cuantas se han
desarrollado para uso rutinario en los laboratorios de diagnstico (1, 3, 8, 9, 12). El ms utilizado es el ELISA (13,
15), que es adecuado para examinar sangre o lquidos tisulares. Las pruebas confirmativas de muestras
260
positivas en el ELISA deben realizarse en casos crticos mediante una prueba alternativa, como la prueba IFA
(11), la tincin con inmunoperoxidasa o la inmunotransferencia (3, 10). Normalmente no se producen anticuerpos
en cerdos infectados con ASFV virulentos. En cerdos infectados con virus de la PPA de baja o moderada
virulencia se producen altos niveles de anticuerpos, pero no son neutralizantes.
Cuando la PPA es endmica, la confirmacin de casos sospechosos de enfermedad se lleva a cabo
preferentemente por una prueba serolgica estndar (ELISA), combinada con una prueba serolgica alternativa
(IFA) o una prueba de deteccin de antgeno (FAT). En algunos pases, ms del 95% de los casos positivos se
han identificado por una combinacin de pruebas IFA y FAT (12).
Debe destacarse que cuando los cerdos se infectan con cepas avirulentas o de baja virulencia, las pruebas
serolgicas pueden ser el nico modo de detectar a los animales infectados.
Tanto la prueba de contra-inmunoelectroforesis como el ELISA pueden utilizarse para anlisis de sueros a gran
escala, aunque el ELISA es ms sensible para detectar sueros positivos individuales y se ha empleado
ampliamente como parte de programas de erradicacin.
El mtodo utilizado depende del personal y del equipamiento disponible.
a)
Enzimoinmunoensayo (prueba prescrita para el comercio internacional)

El ELISA (1, 9) es una prueba directa que permite detectar anticuerpos contra el ASFV en cerdos que han
sido infectados por virus con baja o moderada virulencia.
Preparacin del antgeno
El antgeno para ELISA se prepara de clulas infectadas crecidas en presencia de suero porcino (4).
i)
Infectar clulas MS (clulas estables de mono) a una multiplicidad de infeccin de 10 con virus
adaptado, e incubar en un medio con 2% de suero porcino.
ii)
Recoger las clulas a las 36-48 horas de la infeccin, cuando el ECP es extenso. Lavar con PBS,
precipitar a 650 g durante 5 minutos, lavar el sedimento celular con sacarosa 0,34 M en Tris/HCl
5 mM, pH 8,0, y centrifugar para precipitar las clulas.
Realizar los pasos (ii) a (v) en hielo:
iii)
Resuspender el precipitado celular con sacarosa 67 mM en Tris/HCl 5 mM, pH 8,0 (1,8 ml por
recipiente de 175 cm2) y despus de 5 minutos dejar con agitacin durante 10 minutos.
iv)
Aadir el detergente no inico Nonidet-P40 a una concentracin final de 1% (p/v) y despus de

5 minutos dejar con agitacin 10 minutos.
v)
Aadir sacarosa a una concentracin final de 64% (p/p) en Tris/HCl 0,4 M, pH 8,0, y centrifugar a
1.000 g durante 10 minutos para precipitar los ncleos.
vi)
Recoger el sobrenadante y aadir EDTA (concentracin final 2 mM), beta-mercaptoetanol

(concentracin final 50 mM) y NaCl (concentracin final 0,5 M) en Tris/HCl 0,25 mM, pH 8,0, e incubar
durante 15 minutos a 25C.
vii)
Centrifugar a 100.000 g durante 1 hora a 4C sobre una capa de sacarosa al 20% (p/p) en Tris/HCl
50 mM, pH 8,0.
Extraer la banda situada inmediatamente por encima de la capa de sacarosa y utilizarla como antgeno en
el ELISA. Guardarla a 20C.
Procedimiento de la prueba (13)
i)
Antigenar placas de microtitulacin para ELISA aadiendo a cada pocillo 100 l de la dilucin
recomendada o pretitulada del antgeno en tampn carbonato/bicarbonato 0,05 M, pH 9,6.
ii)
Incubar a 4C durante 16 horas (toda la noche) y a continuacin lavar cinco veces con Tween 20 al
0,05% en PBS, pH 7,2.
261
ii)
Diluir el suero problema y los sueros control positivo y negativo a 1/30 con Tween 20 al 0,05% en
PBS, pH 7,2, y aadir por duplicado 100 l de cada dilucin de suero a pocillos de las placas
antigenizadas.
Si se aaden cuatro pares de cada control positivo y negativo a pocillos en diferentes partes de la placa, se
pueden probar 40 sueros por duplicado en una placa, como indica la disposicin de la placa que se muestra
abajo.
1
10 11 12
iv)
Incubar las placas a 37C durante 1 hora (de modo opcional, en un agitador de placas) y lavar
despus cinco veces con Tween 20 al 0,05% en PBS.
v)
Aadir a cada pocillo 100 l del conjugado protena-A/peroxidasa de rbano a la dilucin recomendada
o pretitulada en Tween 20 al 0,05% en PBS.
vi)
Incubar las placas a 37C durante 1 hora y lavar despus cinco veces con Tween 20 al 0,05% en PBS.
vii)
Aadir perxido de hidrgeno a la solucin de substrato (0,04% de ortofenilndiamina en tampn

fosfato/citrato, pH 5,0) a razn de 10l/25 ml, y aadir 100 l de substrato a cada pocillo.
viii) Incubar a temperatura ambiente durante aproximadamente 10 minutos; el tiempo necesario para la
aparicin del color depender de la temperatura del substrato aadido a los pocillos y de la
temperatura ambiente.
b)
ix)
Detener la reaccin aadiendo a cada pocillo 100 l de cido sulfrico 1,25 M.
x)
Lectura de los resultados: Los sueros positivos tienen color amarillo claro, visible a simple vista, pero
para asegurarse de identificar todos los sueros positivos, es necesario leer espectrofotomtricamente
la absorbancia de cada pocillo a 492 nm en un lector de ELISA. Se considera que un suero es positivo
si tiene un valor de absorbancia superior a dos veces el valor medio de la absorbancia de los sueros
control negativos en la misma placa.

Esta prueba debe utilizarse como una prueba confirmativa para sueros procedentes de reas libres de PPA
que son positivos en el ELISA, y para sueros de reas endmicas que dan resultados dudosos en el ELISA.
262
i)
Preparar una suspensin de clulas de rin porcino o de mono infectadas con el ASFV a una
concentracin de 5 105 clulas /ml, colocar gotas pequeas en portas, secar al aire y fijar con acetona
a temperatura ambiente durante 10 minutos. Los portas se pueden guardar hasta su uso a 20C.
ii)
Inactivar los sueros problema por calor a 56C durante 30 minutos.
iii)
Aadir a los portas de clulas infectadas, y a los de clulas control no infectadas, diluciones
apropiadas de los sueros problema y de los controles de suero positivo y negativo en solucin salina
tamponada. Incubar durante 1 hora a 37C en una cmara hmeda.
iv)
Lavar los portas con PBS y despus con agua destilada.
v)
Aadir a todos los portas diluciones recomendadas o predeterminadas de conjugados de

inmunoglobulina anti-cerdo/FITC o de protena-A/FITC. Incubar durante 1 hora a 37C en una cmara
hmeda.
c)
vi)
Lavar los portas con PBS y despus con agua destilada, montar con PBS/glicerol, y examinar en un
microscopio de luz ultravioleta con filtros adecuados de barrera y de excitacin.
vii)
Lectura de los resultados: El suero control positivo debe ser positivo sobre clulas infectadas y todos
los otros controles deben ser negativos antes de la lectura de la prueba. Los sueros son positivos si
los cultivos infectados muestran fluorescencia especfica.
Prueba de inmunotransferencia
Esta prueba debe utilizarse como alternativa a la prueba IFA para confirmar resultados dudosos con sueros
individuales. La prueba de inmunotransferencia es muy especfica, pero puede tener menos sensibilidad
que la prueba IFA.
Preparacin de tiras de antgeno
i)
Preparar protenas vricas citoplsmicas solubles como se describe para la preparacin de antgeno
para ELISA en la Seccin B.2.a.
ii)
Realizar una electroforesis en geles de 17% de acrilamida/N,N-dialiltartardiamida (DATD) con

estndares adecuados de peso molecular.
iii)
Transferir las protenas a membranas de nitrocelulosa de 14 x 14 cm2 mediante electroforesis a

corriente constante de 5 mA/cm en tampn de transferencia (metanol al 20% en glicina 196 mM,
Tris/HCl 25 mM, pH 8,3).
iv)
Secar las membranas y marcar la cara a la que se pasaron las protenas por electroforesis.
v)
Cortar una tira desde el borde del filtro y realizar inmunotransferencia por el procedimiento que se
describe ms adelante. Identificar la regin que contenga protenas de 23-35 kDa comparando con los
estndares de peso molecular desarrollados en paralelo, y cortar esta regin en tiras de 0,5 cm de
ancho. Marcar cada tira por el lado al que se pasaron las protenas por electroforesis.
Estas tiras, de aproximadamente 4 cm. de longitud, constituyen las tiras de antgeno utilizadas en
inmunotransferencia y contienen protenas con las que reaccionarn los anticuerpos de los sueros de
cerdos enfermos y convalecientes. En algunos cerdos estos anticuerpos persisten durante toda la vida.
Preparacin de la solucin de substrato cloranaftol
Esta solucin debe prepararse inmediatamente antes de uso.

i)
Disolver 6 mg de 4-cloro-1-naftol en 2 ml de metanol y aadir lentamente esta solucin a 10 ml de

PBS mientras se agita.
ii)
Eliminar por filtracin en papel de filtro Whatman No. 1 el precipitado blanco que se forma (opcional).
iii)
Aadir 4 l de perxido de hidrgeno al 30%.
Las tiras de antgeno deben mantenerse con la cara marcada hacia arriba durante el proceso de la
inmunoreaccin.
i)
Incubar las tiras con antgeno en tampn de bloqueo (2% de leche en polvo desnatada en PBS) a
37C durante 30 minutos con agitacin continua.
ii)
Preparar diluciones 1/40 de los sueros problemas y de los sueros control positivos y negativos en
tampn de bloqueo.
iii)
Incubar las tiras con antgeno en el suero apropiado a 37C durante 45 minutos con agitacin
continua. Incubar una tira de antgeno con el suero control positivo y otra con el suero control negativo.
Estas dos tiras son los controles. Lavar cuatro veces con tampn de bloqueo; el lavado final debe
durar 5 minutos con agitacin continua.
iv)
Aadir a todas las tiras con antgeno el conjugado de protena-A/peroxidasa de rbano a la dilucin
recomendada o pretitulada en tampn de bloqueo. Incubar a 37C durante 45 minutos con agitacin
continua. Lavar cuatro veces con tampn de bloqueo; el lavado final debe durar 5 minutos con
agitacin continua.
v)
Preparar la solucin de substrato, aadirla a las tiras con antgeno, e incubar a temperatura ambiente
durante 5-15 minutos con agitacin continua.
vi)
Detener la reaccin con agua destilada cuando las bandas de protena sean adecuadamente visibles.
263
vii)
d)
Lectura de los resultados: Los sueros positivos reaccionan con ms de una protena vrica en la tira
con antgeno; deben tener un modelo proteico similar y con la misma intensidad que las tiras de
antgeno teidas con el control de suero positivo.
Prueba de contra-inmunoelectroforesis (inmunoelectro-osmoforesis)

Esta prueba (7) se puede realizar rpidamente y en algunos sueros permite detectar anticuerpos
especficos 30 minutos despus del inicio de la prueba. Requiere el empleo de un equipo de electroforesis
(cubeta de electroforesis, placas, cortador de geles) y una fuente de intensidad constante de 500-voltios.
Debido a su baja sensibilidad, esta prueba se recomienda para analizar grupos de cerdos, pero no animales
individuales.
i)
Colocar el nmero necesario de placas de vidrio de 2,5 x 10 cms. en el equipo sobre una mesa
nivelada y cubrir las placas con el volumen recomendado de agarosa al 0,6% en tampn
veronal/acetato, pH 8,6 (fuerza inica 0,025), que contenga 0,1% de azida sdica, y dejar reposar.
ii)
Cortar en el gel de cada placa cuatro pares de pocillos de 3 mm de dimetro y separados 10 mm

como se indica abajo
Ag
Ag
(S = suero; Ag = antgeno; = electrodo positivo; = electrodo negativo)

iii)
Llenar los pocillos con los reactivos adecuados utilizando tubos capilares (para hematocrito),
incluyendo controles positivos y negativos de antgenos y de sueros.
iv)
Colocar las placas en la cubeta de electroforesis y desarrollar 30 minutos a voltaje constante de 19

voltios/cm.
v)
Despus de la electroforesis, analizar las placas con luz indirecta para lneas especficas de
precipitacin.
vi)
Lavar las placas con una solucin de NaCl al 2% durante la noche y despus durante 2 horas con
varios cambios de agua destilada antes de secar.
vii)
Teir las placas secadas con 0,075% de negro amido diluido en volmenes iguales de etanol, cido
actico al 12% y acetato sdico al 1,6%, y conteniendo 0,007% de glicerol, durante 5-10 minutos.
Desteir mediante tres lavados de 10 minutos con una solucin acuosa de metanol al 45% y de cido
actico glacial al 10%.
viii) Lectura de los resultados: En las placas teidas, las lneas de precipitacin que se observan entre los
pocillos del antgeno y del suero problema de una muestra positiva deben ser similares a las formadas
entre los pocillos del control positivo de antgeno y del control de suero positivo.

Actualmente no hay vacuna para la PPA.
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inducidas por el virus cone pesosmoleculares comprendidos entre 23 y 35 kilodaltons, en el desarrollo de
un kit de diagnstico. (Confirmation of sera positive by ASF ELISA with the immunoblotting technique. Use
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immunosorbent assay for the detection of African swine fever antigen and antibody. J. Hyg., 83, 363369.
*
* *
NB: Existen laboratorios de referencia de la OIE para Peste porcina africana (ver Cuadro en la Parte 3 de este
Manual de animals terrestres o consultar la pgina Web de la OIE para una lista ms actualizada: www.oie.int).
265
CAPTULO 2.1.13.
PESTE PORCINA CLSICA (CLERA DEL CERDO)
RESUMEN
La peste porcina clsica (PPC), tambin denominada clera del cerdo, es una enfermedad vrica
contagiosa de los cerdos. El agente causal es un miembro del gnero Pestivirus de la familia
Flaviviridae, estrechamente relacionado con los virus de la diarrea bovina fetal y de la enfermedad
de la frontera. Solo existe un serotipo de virus de la PPC (CSFV).
La enfermedad puede tener un desarrollo agudo, subagudo, crnico, de aparicin tarda o
inaparente, dependiendo de varios factores vricos y del hospedador, siendo los ms importantes
la edad de los animales, la virulencia del virus y el tiempo de infeccin (pre- o post-natal). Los
cerdos adultos suelen mostrar menos sntomas graves de la enfermedad que los jvenes y tienen
mayor probabilidad de supervivencia. En cerdas gestantes, el virus puede atravesar la barrera
placentaria e infectar los fetos. La infeccin intrauterina con cepas del virus de baja o moderada
virulencia origina lo que se conoce como el sndrome de la "cerda portadora", que se caracteriza
por la muerte prenatal o perinatal, el nacimiento de lechones enfermos o una camada
aparentemente "sana" pero infectada. Un brote de PPC tiene graves consecuencias econmicas
para el mercado de los cerdos y de productos derivados.
La elevada variabilidad clnica de la PPC dificulta a menudo el diagnstico realizado sobre bases
clnicas y patolgicas. Los mtodos de laboratorio son por tanto esenciales para un diagnstico
inequvoco. La deteccin del virus en la sangre y de anticuerpos en el suero son los mejores
mtodos para diagnosticar PPC en cerdos vivos, mientras la deteccin del virus o de antgeno en
muestras de rganos resulta ms adecuada en cerdos muertos.
Identificacin del agente: Para la deteccin del antgeno de la PPC se utiliza la
inmunofluorescencia directa (FAT) en cortes de rganos de cerdos afectados. Para determinar si la
fluorescencia se debe a antgenos de PPC o de Pestivirus que no producen PPC se emplean
varios anticuerpos monoclonales. El aislamiento del CSFV se debe intentar en la lnea celular de
rin de cerdo (PK-15) o en otra lnea celular adecuada. Los cultivos se examinan en cuanto a
crecimiento vrico por inmunofluorescencia o tincin con inmunoperoxidasa; los aislamientos
positivos se caracterizan posteriormente por medio de MAbs y por secuenciacin gnica parcial.
En varios laboratorios, para la identificacin del cido nucleico del CSFV se utilizan protocolos
basados en la reaccin en cadena de la polimerasa. El aislamiento y la caracterizacin de cepas
patgenas sospechosas deben realizarse en un laboratorio con medidas de seguridad adecuadas
para trabajar con virus.
Pruebas serolgicas: La deteccin de anticuerpos especficos contra el virus es particularmente
til en piaras donde se sospecha una infeccin por CSFV iniciada al menos 30 das antes. Los
mtodos serolgicos son tambin adecuados para el control y para estudios de prevalencia, y
resultan esenciales en el caso de que un pas desee el reconocimiento internacional de estar
exento de la enfermedad en ausencia de vacunacin.
Como en los cerdos de cra se observan ocasionalmente anticuerpos contra CSFV que muestran
reaccin cruzada con Pestivirus de rumiantes, las pruebas de anlisis deben acompaarse de
pruebas confirmativas que sean especficas para CSFV Algunas pruebas ELISA son relativamente
especficas para CSFV pero la prueba de neutralizacin comparativa es el mtodo definitivo de
diferenciacin, y compara el nivel de anticuerpo frente a diferentes especies de Pestivirus.
Requisitos para las vacunas y los materiales de diagnstico: Las vacunas contra la PPC
contienen un virus vivo que se ha atenuado mediante pases en cultivos celulares o a travs de
hospedadores adecuados que no pertenezcan a la familia Suidae. La produccin de estas vacunas
266
Captulo 2.1.13. Peste porcina clsica (clera del cerdo)
con virus vivos modificados (MLV) se basa en un sistema de lotes de inculos que se ha validado
respecto a identidad vrica, esterilidad, pureza, seguridad, falta de transmisin, estabilidad e
inmunogenicidad. Si se utiliza CSFV para la produccin de vacunas o en estudios de infeccin
experimental, las instalaciones deben cumplir los requisitos de la OIE para patgenos del Grupo 4
de Contencin.
No se dispone de vacunas convencionales eficaces con virus completo inactivado. Recientemente,
se han desarrollado "vacunas marcadoras" que, en contraste con las vacunas con MLV, inducen
anticuerpos que pueden distinguirse de los inducidos por el virus natural utilizando una prueba
diagnstica de acompaamiento. Las "vacunas marcadoras" registradas en la actualidad se basan
en la principal glicoprotena de la envoltura vrica del CSFV (subunidad E2), y se producen en
insectos mediante la tecnologa de ADN recombinante.
A. INTRODUCCIN
Los virus que causan la peste porcina clsica (PPC), la diarrea vrica bovina (DVB) y la enfermedad de la frontera
(EF) son miembros de la familia Flaviviridae, del gnero Pestivirus, y estn estrechamente relacionados entre s
tanto antignica como estructuralmente. Los sntomas clnicos y las lesiones observadas post-mortem en los
cerdos afectados por PPC son muy variables debido a factores del virus y de los hospedadores. Adems, las
infecciones congnitas con pestivirus de rumiantes pueden dar lugar en cerdos a una enfermedad clnica que es
indistinguible de la PPC (22, 24, 25).
Los sntomas ms destacados de la enfermedad son su aparicin en todos los grupos de edad, acompaada por
pirexia, agrupamiento de animales, inapetencia, torpeza, debilidad, conjuntivitis, estreimiento seguido de diarrea
y una forma de andar vacilante. Varios das despus de la aparicin de los sntomas clnicos, las orejas, el
abdomen y la parte interna de los muslos pueden mostrar una decoloracin morada. Los animales con
enfermedad aguda mueren en 1-2 semanas. La muerte sbita en ausencia de enfermedad clnica no es
sintomtica de la PPC.
En algunas circunstancias relacionadas con la edad del animal y su condicin, as como con la cepa de virus
implicado, puede aparecer la enfermedad en forma subaguda o crnica y durar 2-4 semanas o incluso meses. La
enfermedad crnica acarrea una disminucin del crecimiento, anorexia, pirexia intermitente y diarrea. Las
infecciones congnitas persistentes pueden pasar indetectables durante meses y limitarse solo a unos cuantos
lechones de la piara. Los sntomas clnicos son inespecficos: debilidad en ausencia de pirexia. Las infecciones
crnicas y persistentes siempre conducen a la muerte del animal. Las tasas de mortalidad en la piara pueden
superar ligeramente el nivel esperado. La PPC afecta al sistema inmune, y una caracterstica es una leucopenia
generalizada, que a menudo puede detectarse antes de la aparicin de la fiebre. La inmunosupresin puede
acarrear infecciones concurrentes.
En casos agudos, las lesiones patolgicas grandes son a menudo poco llamativas o estn ausentes. En los
casos tpicos, los ndulos linfticos se inflaman y enrojecen, y se presentan hemorragias en el epicardio, en los
riones, la vejiga urinaria, la piel y la subepidermis. En los casos subagudos y crnicos, adems de las lesiones
anteriores, pueden observarse lceras necrticas o en "botn" en la mucosa del tracto gastrointestinal, la
epiglotis y la laringe.
Los hallazgos histopatolgicos no son patognomnicos. Las lesiones pueden incluir una degeneracin
parenquimatosa del tejido linftico, proliferacin celular del tejido vascular intersticial y una meningoencefalitis no
supurativa, con o sin desgarro vascular.
La variabilidad de los sntomas clnicos y de las lesiones post-mortem no suministran una evidencia firme para
establecer un diagnstico inequvoco. Otras enfermedades vricas, como la peste porcina africana, el sndrome
de debilidad multisistmica post-destete, la dermatitis porcina y el sndrome de nefropata, as como situaciones
septicmicas de tipo salmonelosis, pasteurelosis, actinobacilosis e infecciones con Haemophilus suis, pueden
confundirse con la PPC. De hecho, estas bacterias causan frecuentes infecciones concurrentes y el aislamiento
de estos patgenos puede enmascarar al virus de la PPC (CSFV) como la causa real de la enfermedad,
Por tanto, un diagnstico presuntivo basado en sntomas clnicos y en lesiones post-mortem debe confirmarse
con investigaciones en el laboratorio. As las pruebas laboratoriales de diagnstico van a ser fundamentales
considerando las graves consecuencias que puede tener un brote de PPC en el mercado porcino y de productos
derivados.
267
Los mtodos de laboratorio para el diagnstico de PPC se dirigen a detectar el virus, el cido nucleico vrico o los
antgenos vricos, o bien a la deteccin de anticuerpos especficos. Para una interpretacin correcta de los
resultados de estas pruebas, el inspector veterinario debe prestar una atencin particular a la presentacin
simultnea y agrupada de dos o ms de los sntomas predominantes de la enfermedad citados anteriormente.
Para el diagnstico de la PPC no se debe realizar el muestreo al azar. Sino que como uno de los primeros
sntomas de la PPC es la pirexia y se acompaa por viremia (6), el mtodo pertinente para detectar piaras
infectadas en una fase temprana es la toma de muestras en animales febriles para la deteccin de virus en
sangre con etiln-diamino tetra-actico (EDTA), o en tejidos. Adicionalmente, se pueden tomar muestras de
sangre de un grupo mayor de cerdos para deteccin de los virus.
La PPC est bajo control oficial y el virus tiene un elevado riesgo de dispersin desde el laboratorio: en
consecuencia, debe realizarse un anlisis de riesgos para determinar el nivel necesario de seguridad para el
diagnstico y la caracterizacin del virus. La instalacin debe cumplir los requisitos del Grupo de Contencin
apropiado segn determina la estimacin de riesgos resumida en el Apndice I.1.6.1. del Captulo I.1.6. de este
Manual. Los pases sin acceso a un laboratorio regional o nacional especializado de ese tipo, deberan enviar las
muestras a un laboratorio de referencia de la OIE.
Los anticuerpos aparecen en la tercera semana de la enfermedad y persisten durante toda la vida del animal
superviviente. Las muestras para deteccin de anticuerpo se recogen en tubos ordinarios (no heparinizados)
cuando hayan transcurrido > 30 das desde que ocurri el contacto sospechado con un brote confirmado,
utilizando cerdos convalecientes y piaras en contacto.
1.
a)
Mtodos inmunolgicos
Prueba de inmunofluorescencia
La prueba de inmunofluorescencia (FAT) es una prueba rpida que puede utilizarse para detectar el CSFV
en cortes finos de amgdalas, bazo, rin, ndulos linfticos o porciones distales del leon. Los tejidos
deben recogerse de varios animales (3) y transportarse sin conservantes en fro, pero no congelados. Los
cortes se tien directamente con inmunoglobulina anti-PPC conjugada con isotiocianato de fluorescena
(FITC) o indirectamente utilizando un conjugado secundario con FITC, y se examinan en un microscopio de
fluorescencia. El tejido de las amgdalas es el ms adecuado durante la primera fase de la infeccin, ya que
es el primero en ser afectado independientemente de la ruta de infeccin (18). En casos subagudos y
crnicos, el leon es con frecuencia positivo y a veces puede ser el nico tejido que muestre fluorescencia.
Un resultado negativo por FAT no elimina por completo la presencia de infeccin de PPC. Cuando se
mantiene la sospecha de PPC, se deben obtener ms muestras o intentar el aislamiento del virus en cultivo
celular (por ejemplo, en rin porcino [PK-15] u otra lnea celular de origen porcino que sea sensible y que
se conozca que est libre de contaminacin con Pestivirus).
En cada serie de muestras de rganos para examen deben incluirse cortes de control positivo y negativo.
268
i)
Se corta un trozo de las amgdalas, bazo, rin o leon, de aproximadamente 1 x 1 x 0,5 cm, y se
monta con un compuesto criosttico o con agua destilada en un criostato.
ii)
Se congela el trozo de rgano en el criostato.
iii)
Se cortan secciones de un grosor menor de 4 m y se montan en cubres libres de grasa de 10 x 32

mm con una esquina cortada. Todos los cortes se montan con esta esquina en la misma posicin (por
ejemplo, arriba a la derecha).
iv)
Despus de secar, los cortes montados se fijan con acetona (de grado analtico) durante 10 minutos a
temperatura ambiente, o al aire durante 20 minutos a 37C.
v)
Los cortes se sumergen brevemente en solucin salina tamponada con fosfato (PBS), se elimina el
exceso de lquido con papel absorbente y se colocan (con la esquina cortada arriba a la derecha) en
una cmara de incubacin hmeda con un pequeo volumen de agua colocada en el fondo de la
cmara.
vi)
Se deposita la solucin de trabajo de inmunoglobulina anti-PPC en los cortes y se incuban en la

cmara cerrada durante 30 minutos a 37C. Si se requiere un segundo conjugado con FITC, se lava el
corte cinco veces durante 2 minutos cada vez con PBS a temperatura ambiente, y luego se aade la
dilucin de trabajo del conjugado con FITC, incubndose como se ha descrito antes.
vii)
Los cortes se lavan cinco veces durante 2 minutos cada vez con PBS a temperatura ambiente.
viii) Se elimina el exceso de PBS con papel absorbente y se monta el cubre con el tampn de montaje en
un porta para microscopio (con el corte entre el cubre y el porta).
ix)
Se elimina el exceso del lquido de montaje con papel absorbente y se examinan los cortes para
fluorescencia en un microscopio de luz UV. Un corte positivo para PPC muestra clulas con
fluorescencia verde brillante. En las amgadalas, la fluorescencia es particularmente evidente en la
lnea epitelial de las criptas. En cortes de rin, la fluorescencia es ms abundante en los tbulos
proximales y distales del crtex renal y en los conductos colectores de la mdula. En el leon, la
fluorescencia es ms destacable en las clulas epiteliales de las glndulas de Lieberknhn, mientras
que en el bazo la reactividad es ms difusa, con concentraciones de clulas linfoides en la lmina
linfoide periarterial (PALS).
La FAT requiere utilizar una inmunoglobulina anti-PPC preparada de un anticuerpo policlonal contra el
CSFV que no distingue entre los antgenos de diferentes pestivirus. Los conjugados utilizados para FAT en
cortes o en cultivos celulares inoculados deben prepararse de gama-globulinas anti-CSFV de cerdos libres
del patgeno especfico. La dilucin de trabajo de los conjugados (al menos 1/30) debe combinar un
mximo de brillo con un mnimo de fondo.
Las cepas de virus vacunales vivos modificados (MLV) se multiplican principalmente en los ndulos
linfoides regionales y en el epitelio de las criptas de las amgdalas. Los cerdos vacunados con cepas MLV
pueden dar la prueba FAT positiva 2 semanas despus de la vacunacin (15, 19). La inoculacin en conejo
se utiliza para diferenciar entre cepas de CSFV adaptadas a conejo y cepas de campo. A diferencia de las
cepas de campo, las cepas adaptadas a conejo causan una reaccin febril e inducen una respuesta inmune
en conejos cuando se suministran intravenosamente.CSFV adaptadas a conejo.
En la prueba FAT, los cerdos infectados con pestivirus de rumiantes pueden dar reacciones positivas falsas.
Las infecciones congnitas con pestivirus de rumiantes pueden ocasionar sntomas clnicos y lesiones
patolgicas indistinguibles de las presentes en la PPC crnica (22, 24, 25). Las infecciones por CSFV o
pestivirus de rumiantes se pueden diferenciar probando sueros de la cerda y de la camada, o de otros
animales en contacto con un lechn FAT-positivo, para anticuerpos neutralizantes frente a cada virus. Otro
mtodo de distinguir estos virus es por inoculacin de lechones seronegativos con una suspensin de
material sospechoso y realizar 5 semanas despus pruebas de neutralizacin vrica (NV) en sus sueros
para los anticuerpos respectivos. Sin embargo, las pruebas NV pueden durar varios das y los mtodos de
inoculacin en animales duran varias semanas.
Diferenciacin de pestivirus mediante anticuerpos monoclonales por el procedimiento de la

inmunoperoxidasa
La utilizacin de un conjunto de tres anticuerpos monoclonales (MAbs), conjugados con peroxidasa de

rbano (HRPO) o con FITC, o usados en conjuncin con un conjugado anti-ratn, que sean capaces de
detectar de modo especfico todas las cepas naturales de CSFV, las cepas vacunales de CSFV y los
pestivirus de rumiantes, respectivamente, permitiran, por una parte, una diferenciacin inequvoca entre las
cepas de campo y las cepas vacunales del CSFV y, por otra, distinguir entre el CSFV y otros pestivirus (10,
26, 28). Un prerequisito es que el MAb contra el VPPC reconozca todas las cepas de campo y que el MAb
anti-vacunal reconozca todas las cepas vacunales empleadas en el pas. No hay ningn MAb que reaccione
selectivamente con todos los pestivirus de rumiantes (10). En reas no vacunadas, se puede omitir el MAb
para diferenciar la cepa vacunal. Como control positivo puede servir una inmunoglobulina policlonal antiPPC conjugada a HRPO. Se debe tener cierta cautela cuando se utiliza un solo MAb como nica
confirmacin de que un aislamiento corresponde a PPC. Un prerrequisito es que el MAb contra el CSFV
reconozca todas las cepas de campo y que el MAb anti-vacunal reconozca todas las cepas vacunales
empleadas en el pas. No hay ningn MAb que reaccione selectivamente con todos los pestivirus de
rumiantes (10). En reas no vacunadas, se puede omitir el MAb para diferenciar la cepa vacunal. Como
control positivo puede servir una inmunoglobulina policlonal anti-PPC conjugada a HRPO. Se debe tener
cierta cautela cuando se utiliza un solo MAb como nica confirmacin de que un aislamiento corresponde a
PPC.
i)
Cortar ocho o ms secciones (4 m) de las amgdalas que son positivas por FAT, o de otro rgano
positivo si no se dispone de amgdalas.
ii)
Fijar los cortes con acetona (grado anlitico) durante 10 minutos en cubres libres y dejar secar al aire.
iii)
Preparar diluciones de trabajo de los respectivos MAbs conjugados con peroxidasa en PBS + 0,01%
de Tween 80 + suero de caballo al 5%, pH 7,6. (tambin puede utilizarse MAb conjugado con FITC,
as como MAb sin conjugar siempre que se emplee un conjugado secundario).
iv)
Despus de lavar con PBS, se depositan en la dilucin de trabajo del conjugado monoclonal
respectivo dos cortes, y otros dos en la dilucin de trabajo del conjugado policlonal (controles).
269
v)
Incubar durante 1 hora a 37C en una cmara hmeda.
vi)
Lavar seis veces los cortes en PBS, durante 10 segundos cada vez.
vii)
Teir los cortes con solucin recin preparada de cromgeno del substrato* durante 5-15 minutos a
viii) Lavar los cortes con acetato sdico 0,05 M, pH 5,0, en agua destilada y montarlos en portas para
microscopa.
ix)
Examinar las secciones en un microscopio de fondo claro. La tincin del citoplasma de las clulas del
epitelio de las criptas de las amgdalas de un color rojo oscuro indica el reconocimiento del virus
aislado por el conjugado respectivo, y se considera positivo.
x)
Interpretacin de la prueba:
Anticuerpo
policlonal
Anticuerpo monoclonal especfico para
Interpretacin
Cepa PPC
Cepa PPC vacunal
Cepa DVB/EF
PPC cepa de campo
PPC cepa vacunal
Cepa DVB/EF
Otros Pestivirus*, no PPC
* Se debe considerar siempre la existencia de cepas nuevas de PPC y cualquier aislamiento de casos en que se
sospeche PPC debera enviarse al laboratorio de referencia de la OIE.
Prueba de captura de antgeno
Para un diagnstico rpido de PPC en cerdos vivos, se han desarrollado enzimoinmunoensayos de captura
de antgeno (ELISAs) para analizar piaras que se sospechan infectadas recientemente. Las pruebas ELISA
son del tipo de doble anticuerpo en sandwich, que emplean anticuerpos monoclonales y/o policlonales
contra varias protenas vricas en el suero, en la fraccin leucocitaria de la sangre o en sangre completa
anticoagulada (puede aadirse aqu un homogenado tisular clarificado ya que es un material adecuado para
ELISA) (7). La tcnica es de realizacin relativamente simple, no requiere servicios de cultivo de tejidos, se
puede automatizar y puede dar resultados en medio da. La desventaja de que es menos sensible que el
aislamiento del virus, sobre todo en cerdos adultos y en casos suaves o subclnicos, puede compensarse
probando todos los cerdos de la piara sospechosa con pirexia. No obstante, debe tenerse tambin en
cuenta la baja especificidad de estas pruebas.
b)
Aislamiento de virus
El aislamiento de virus en cultivos celulares es un mtodo de diagnstico de PPC ms sensible, pero ms
lento, que la inmunofluorescencia con cortes congelados. El aislamiento de realiza mejor en clulas PK-15,
que se dividen rpidamente, y que se siembran sobre cubres simultneamente con una suspensin de las
amgadalas al 2% en medio de cultivo. Para el aislamiento del CSFV se pueden utilizar otras lneas
celulares, pero deberan ser por lo menos tan sensibles como las clulas PK-15. Los cultivos se examinan
para focos fluorescentes por FAT despus de 24-72 horas.
Para fines diagnsticos, el rgano ms adecuado para aislar el virus de cerdos muertos o sacrificados son
las amgdalas. Alternativamente, se puede utilizar el bazo, el rin o ndulos linfticos.
A.
B.
C.
270
Solucin de cromgeno del substrato

Solucin base de cromgeno: 0,4% de 3-amino-9-etil carbazol; N, N-dimetil-formamida (1 ml). Cuidado, compuesto
TXICO.
Acetato sdico 0,05 M, pH 5,0; 19 ml (esterilizados por filtracin con membrana).
Solucin base de substrato (perxido de hidrgeno al 30%).
Mantener las soluciones base A y C a 4C en oscuridad y la solucin B a temperatura ambiente. La solucin base A
puede mantenerse a 4C durante al menos 6 meses y la solucin C por 1 ao. Inmediatamente antes de uso, diluir 1 ml
de la solucin A en 19 ml de la solucin B. Aadir despus 10 l de la solucin base C. Mezclar bien y teir los cortes.
Un procedimiento detallado del aislamiento de virus es el siguiente:

i)
Preparar una solucin base concentrada 100 veces de glutamina-antibitico: disolver glutamina (2,92
g) en 50 ml de agua destilada (solucin A) y esterilizar por filtracin. Disolver cada uno de los
siguientes antibiticos en 5-10 ml de agua destilada estril: penicilina (106 Unidades Internacionales
[UI]; estreptomicina (1 g); mycostatn (5 x 105 U); polimixina B (15 x 104 U); y kanamicina (1 g). Juntar
estas soluciones (solucin B). Mezclar aspticamente las soluciones A y B, completar hasta 100 ml
con agua destilada estril y guardar a -20C en alcuotas de 5 ml.
ii)
Cortar en trozos pequeos 1-2 g de tejido y moler en un mortero con arena estril y un pequeo
volumen de medio de cultivo hasta formar una pasta homognea. Alternativamente, se puede utilizar
una trituradora a 4C.
iii)
Hacer una suspensin al 20% (p/v) aadiendo solucin salina equilibrada de Hanks (BBS) o medio
mnimo esencial de Hanks (MEM); por cada 10 ml de suspensin, se aade 1 ml del base de
glutamina-antibitico. La mezcla se mantiene a temperatura ambiente durante 1 hora.
iv)
Centrifugar a 1.000 g durante 15 minutos
v)
Se tripsiniza una monocapa de clulas PK-15, se centrifuga la suspensin celular a 160 g durante 10
minutos y se resuspende para que contenga 2 x 106 clulas/ml en medio de cultivo (MEM de Eagle
con sales de Earle; 5% de suero bovino fetal libre de pestivirus de rumiantes y de anticuerpos contra
pestivirus; y 0,2 ml de la solucin stock de glutamina-antibitico por cada 10 ml de la suspensin
celular).
vi)
Mezclar nueve partes de la suspensin celular (del paso (v)) y una parte del sobrenadante (del paso
(iv)) e inocular 1,0-1,5 ml en 6-8 tubos Leighton con cubres, o en otros recipientes apropiados de
cultivo celular. Tres tubos se inoculan como controles con slo 1,0-1,5 ml de suspensin celular.
Despus de completar las inoculaciones de la muestra, se inoculan tres tubos como controles
positivos con CSFV. Hay que tener cuidado en evitar la contaminacin con esta suspensin vrica
positiva. Tambin deben prepararse cultivos negativos.
vii)
En los das 1, 2 y 3 post-inoculacin, se lavan dos cultivos, junto con un cultivo control positivo y otro
negativo, dos veces durante 5 minutos cada vez con BBS de Hanks, MEM de Hanks o PBS, se fijan
con acetona fra (de grado analtico) durante 10 minutos, y se tien con un conjugado directo antiCSFV a la dilucin de trabajo apropiada, o bien se tien indirectamente, como se describe en la
Saccin B.1.a.
Si la suspensin de amgdalas al 2% resulta txica para las clulas, la prueba debe repetirse utilizando
una dilucin mayor u otro rgano.
viii) Despus de lavar tres veces con PBS durante 5 minutos cada una, los cubres se montan en 90% de
glicerol tamponado con carbonato/bicarbonato, pH>8,0, y se examinan para focos de fluorescencia.
En lugar de tubos Leighton, pueden utilizarse placas de 6 pocillos con cubres. Alternativamente, pueden
usarse tambin para el aislamiento del virus cultivos en placas de microtitulacin de fondo plano o placas
M24. En tal caso, las placas se fijan y se tien como se describe ms adelante para la prueba de
neutralizacin ligada con peroxidasa (NPLA).
La sangre completa (tratada con heparina o EDTA) de cerdos clnicamente enfermos es una muestra
adecuada para diagnosticar PPC. Se puede utilizar la fraccin de leucocitos u otros componentes, pero por
razones de sensibilidad y sensibilidad, es preferible la sangre completa (9). El procedimiento es el siguiente:
i)
Congelar una muestra de sangre completa a -20C y descongelar en un bao a 37C.
ii)
Inocular 300 l de sangre hemolizada en una monocapa de clulas PK-15 crecidas hasta un 75% de
confluencia* en una placa M24, y permitir la adsorcin durante 1 hora a 37C.
iii)
Eliminar el inculo, lavar la monocapa una vez con BBS de Hanks o MEM de Hanks, y aadir medio
de cultivo.
iv)
Despus de una incubacin de 3-4 das, las placas se lavan, se fijan y se tien, como se describe ms
adelante para NPLA, utilizando en cada paso un volumen de 300 l para compensar la mayor
superficie celular.
Nota: este mtodo es menos sensible que el aislamiento convencional del virus para la deteccin de
PPC aguda.
La inoculacin simultnea, aunque ligeramente ms sensible, es menos adecuada pues el anticoagulante puede interferir
con la adhesin de las clulas a la superficie.
271
Reaccin de transcripcin inversa en cadena de la polimerasa
Se han descrito muchos mtodos de transcripcin inversa en cadena de la polimerasa (RT-PCR) y otros se
estn an desarrollando. Una alternativa internacionalmente aceptada al ELISA de captura de antgeno y al
mtodo de aislamiento del virus es una reaccin de transcripcin inversa en cadena de la polimerasa
anidada en un solo tubo (RT-nPCR) (14). Este mtodo es rpido y ms sensible que los ELISA de captura
de antgeno, el aislamiento vrico o la RT-PCR, lo que lo hace particularmente adecuado al diagnstico
preclnico. Tiene la ventaja adicional de reducir el riesgo de contaminacin porque los tubos no se abren
entre las transcripciones inversas sucesivas, la primera PCR y la PCR anidada (17). Estn en desarrollo
mtodos de PCR en tiempo real. An no hay un mtodo disponible de RT-PCR estandarizado
internacionalmente. Se pueden obtener ejemplos de un protocolo adecuado en la literatura o de los
laboratorios de referencia de la OIE para la PPC (ver Cuadro en la Parte 3 de este Manual). Debido a su
velocidad y sensibilidad, la RT-PCR es un enfoque adecuado para analizar casos sospechosos de
enfermedad y est aceptada por la Unin Europea (1), aunque se recomienda que, debido a la facilidad con
la que pueden ocurrir positivos falsos, los resultados positivos de brotes deberan confirmarse siempre con
otras pruebas. La prueba puede aplicarse a muestras de sangre individual o colectiva as como a rganos
slidos y se ha utilizado con xito para controlar brotes.
La epidemiologa molecular de la PPC se basa en la comparacin de diferencias genticas entre los virus
aislados. La amplificacin del ARN del CSFV por RT-PCR y la secuenciacin nucleotdica es el mtodo ms
simple de obtener los datos de secuencias para hacer estas comparaciones. Se pueden analizar varias
regiones diferentes del genoma del CSFV para estudios epidemiolgicos moleculares (16). Se han
estudiado en particular dos regiones que permiten suministrar muchos datos de la secuencia para comparar
nuevos aislamientos. Una de estas zonas se encuentra en la regin 5 no codificante (5NCR) del genoma
(150 nucletidos) y la otra en el gen de la glicoprotena mayor E2 (190 nucletidos). En resumen, el mtodo
usado consiste en extraer el ARN vrico de cultivos de clulas PK-15, realizar una RT-PCR para amplificar
una o ambas zonas dentro de 5NCR o del gen E2, y luego determinar la secuencia nucleotdica de los
productos y comparar con la informacin acumulada en las bases de datos. En el Laboratorio de Referencia
de la OIE para PPC (Hanover, Alemania) existe una base de datos disponible de estas secuencias. Los
CSFV aislados de brotes primarios deben enviarse a un laboratorio de referencia de la OIE para
investigacin epidemiolgica molecular. Se debe obtener un permiso de importacin antes de su envo.
2.
Pruebas serolgicas
La deteccin de anticuerpos especficos contra el virus es til cuando se sospechan infecciones con cepas de
PPC de baja virulencia. Debido al efecto inmunosupresor del VPCC, no se pueden detectar anticuerpos hasta 21
das post-infeccin. Las investigaciones serolgicas dirigidas a detectar focos residuales de infeccin,
especialmente en piaras de produccin, pueden ser tambin tiles para la erradicacin de PPC en una fase
terminal.
Como la incidencia de la infeccin con pestivirus de rumiantes puede ser elevada en instalaciones de cra, solo
resultan tiles las pruebas que discriminen entre anticuerpos contra PPC y contra DVB/EF. Las pruebas NV y
ELISA que utilizan MAbs satisfacen los requisitos de sensibilidad, pero los resultados positivos deberan
confirmarse por pruebas NV comparativas.
Las pruebas de neutralizacin se realizan en cultivos celulares utilizando un mtodo virus constante/suero
variable. Como el CSFV no es citoptico, cualquier virus no neutralizado debe detectarse, tras multiplicacin, por
un sistema indicador. La prueba de neutralizacin vrica con anticuerpo fluorescente (FAVN) (13) y la NPLA (20)
son las tcnicas ms ampliamente utilizadas. Ambas pruebas se pueden llevar a cabo en microplacas. El sistema
con peroxidasa tiene la ventaja de que puede estimarse a simple vista.
a)
272
Prueba de neutralizacin vrica con anticuerpo fluorescente (FAVN) (prueba prescrita para el
comercio internacional)
i)
Sembrar una suspensin de clulas PK-15 a una concentracin de 2 x 105 clulas/ml en placas Petri
de 5 cm con cubres extendidos en el fondo, o en tubos Leighton con un cubre, o en microplacas de
fondo plano.
ii)
Incubar los cultivos 1-2 das a 37C en una cabina de CO2 hasta que alcancen el 70-80% de
confluencia. Se puede utilizar un incubador ordinario para tubos Leighton cerrados.
iii)
Inactivar los sueros durante 30 minutos a 56C. A efectos del mercado internacional, es mejor probar
con una dilucin inicial del suero de 1/5 (dilucin final 1/10).
iv)
Incubar durante 1-2 horas a 37C volmenes iguales de suero diluido y de suspensin vrica que
contenga 200 DICT50 (dosis infectiva del 50% en cultivo de tejidos) por 0,1 ml. Por tanto se utiliza una
cantidad constante de CSFV de 100 DICT50 por cada pocillo de reaccin.
v)
Extraer los cubres de las placas Petri o de los tubos Leighton, lavar brevemente en medio sin suero,
cubrir la capa celular con la mezcla virus/suero (del paso iv) e incubar durante 1 hora a 37C en
atmsfera hmeda.
vi)
Colocar los cubres en un tubo Leighton limpio e incubar los cultivos en medio de mantenimiento
durante dos das ms.
vii)
Sacar los cubres de los tubos Leighton, lavar las monocapas dos veces con PBS, pH 7,2, durante 5
minutos cada vez, fijar con acetona pura durante 10 minutos y teir con la solucin de trabajo del
conjugado durante 30 minutos a 37C antes de lavar.
viii) Montar para microscopa los cubres en portas sin grasa con 90% de glicerol tamponado con
carbonato/bicarbonato, pH > 8,0, y examinar por flluorescencia.
Cuando la prueba FAVN se realiza en placas de microtitulacin, se puede seguir el procedimiento para la
NPLA (ver ms adelante) hasta el paso (viii). Las placas se tien a continuacin con la dilucin de trabajo
del conjugado durante 30 minutos a 37C y se examinan para fluorescencia. Nota: cuando se detecta
fluorescencia, las microplacas se examinan mejor desde arriba, utilizando una lente objetivo de gran
longitud focal.
b)
Prueba de neutralizacin ligada a peroxidasa (NPLA) (prueba obligada para el comercio

internacional).
La NPLA se realiza en placas de microtitulacin de fondo plano. Los sueros se inactivan antes a 56C
durante 30 minutos. A efectos del mercado internacional, es mejor probar una dilucin inicial de suero de
1/5 (dilucin final 1/10). Para programas de seguimiento en un pas, puede ser suficiente una dilucin de
1/10. En cada prueba deben incorporarse controles apropiados para asegurar la especificidad y la
sensibilidad de las reacciones.
i)
En dos pocillos de una placa de microtitulacin se depositan 50 l de diluciones de suero en medio de

crecimiento (MEM de Eagle, suero fetal bovino al 5% y antibiticos). El suero fetal bovino debe estar
libre de BVDV y de anticuerpos contra dicha enfermedad. Para cada muestra se puede incluir un
tercer pocillo con suero y sin virus como un control del suero (para citotoxicidad y/o tincin
inespecfica).
ii)
Aadir a los pocillos 50 l de suspensin vrica, diluida en medio de crecimiento hasta contener
aproximademente 100 DICT50/50 l, y mezclar el contenido en un agitador de microplacas durante
20 segundos.
iii)
Incubar las placas en un incubador de CO2 durante 1 hora a 37C.
iv)
Aadir a todos los pocillos 50 l de medio de crecimiento con 2 x 105 clulas/ml.
v)
Dejar crecer las clulas en 5% de CO2 hasta confluencia, normalmente en 3-4 das.
vi)
Eliminar el medio de crecimiento y lavar las placas una vez con NaCl 0,15 M.
vii)
Las placas se secan por absorcin en papel absorbente.
viii) Las monocapas celulares pueden fijarse por uno de los siguientes mtodos:
ix)
Las placas se incuban 45 minutos a 37C, y luego a -20C durante al menos 45 minutos. Se
sacan las placas del congelador, se llenan los pocillos con 100 l de paraformaldehido al 4% en
PBS y se reincuban a temperatura ambiente durante 5-10 minutos. Se elimina el
paraformaldehido y las placas se lavan con NaCl 0.15M; o
Las placas se incuban a 70-80C durante 1-2 horas; o
Las placas se fijan en acetona al 20% en PBS durante 10 minutos seguidos de un secado total
a 25-30C durante 4 horas. (Esto se puede acelerar mediante la ayuda de un secador de pelo se obtiene un secado completo despus de 3-5 minutos-, segn se observa por el color
blanquecino de la monocapa celular).
Aadir a cada pocillo 50 l de un suero porcino hiperinmune contra la PPC, diluido en NaCl 0,5 M que
contiene 1% de Tween 80 + 0,1 ml de azida sdica, pH 7,6. Incubar a 37C durante 15 minutos. La
273
dilucin de trabajo del antisuero debe determinarse por titulacin previa: es decir, un suero con un
ttulo por NPLA de 1/30.000 puede utilizarse a 1/100.
x)
Lavar cinco veces las placas con NaCl 0,15 M que contenga 1% de Tween 80, pH 7,6.
xi)
Aadir a cada pocillo 50 l de un conjugado de Ig-HRPO antiporcina, diluida a su dilucin de trabajo

con NaCl 0,5 M que contenga 1% de Tween 80, pH 7,6, y luego incubar durante 10 minutos a 37C.
xii)
Lavar las placas cinco veces con NaCl 0,15 M que contenga 1% de Tween 80, pH 7,6.
xiii) Aadir 50 l de solucin de cromgeno del substrato a cada pocillo y teir durante 15-30 minutos a
temperatura ambiente. Esta solucin se describe en la Seccin B.1.a. "Diferenciacin de pestivirus
mediante anticuerpos monoclonales por el procedimiento de la inmunoperoxidasa".
xiv) La prueba se lee visualmente. Las capas celulares infectadas se tien total o parcialmente de color
marrn rojizo. En casos dudosos, la monocapa debe examinarse por microscopa a baja resolucin. El
citoplasma de las clulas infectadas se tie de rojo oscuro.
xv)
En la prueba se incluyen los siguientes controles: control de clulas, de suero positivo y de titulacin
del virus problema. La titulacin del virus debe confirmar que el virus se ha utilizado a una
concentracin entre 30 y 300 DICT50/ 50 l.
En ocasiones, los sueros de cerdos infectados con BVDV reaccionan a baja dilucin en las pruebas FAVN o
NPLA como si estuvieran infectados por el CSFV. La amplitud de la reaccin cruzada depende de la cepa
de BVDV implicada y del intervalo entre la infeccin y el tiempo de muestreo (27). Los altos niveles de
anticuerpo que se alcanzan normalmente despus de exposicin a la infeccin por PPC, incluso con cepas
de baja virulencia, permiten el uso de diluciones relativamente altas en las pruenas NPLA para anticuerpos
contra PPC, lo que evita muchas, aunque no todas, las reacciones cruzadas (20, 21). En caso de duda
continuada, son tiles las pruebas comparativas que utilizan una cepa de CSFV, una cepa de BVDV y una
cepa de BDV que sean representativas del pas o de la regin. Las pruebas comparativas de neutralizacin
son titulaciones a punto final en las que la misma serie de diluciones dobles de la muestra de suero
sospechoso se prueba por duplicado contra 100 DICT50 de cada cepa vrica seleccionada. Las pruebas
comparativas se realizan segn los protocolos descritos para FAVN o NPLA; las lneas celulares deben ser
adecuadas para el BVDV y el DVB. Los ttulos de neutralizacin se expresan como el inverso de la dilucin
ms alta de suero que evita el crecimiento celular en el 50% de dos pocillos duplicados. Una diferencia de
cuatro veces o ms entre los puntos finales de dos titulaciones debe considerarse decisiva para una
infeccin por la especie de virus que da el ttulo ms alto.
c)
Enzimoinmunoensayo (prueba prescrita para el comercio internacional)

Las tcnicas competitivas, bloqueantes e indirectas pueden utilizarse con cualquier soporte adecuado. Las
pruebas utilizadas deben minimizar las reacciones cruzadas con el BVDV y otros pestivirus. Sin embargo, el
sistema de prueba debe asegurar la identificacin de todas las infecciones de PPC, y a todas las fases de
la respuesta inmune a la infeccin.
Antgeno: El antgeno debe derivar de, o corresponder a, protenas vricas de una de las cepas
recomendadas de CSFV. Las clulas utilizadas para preparar antgeno deben estar libres de cualquier otra
infeccin con Pestivirus.
Antisueros: Los antisueros policlonales para pruebas competitivas o bloqueantes deben obtenerse de
cerdos o conejos infectados con una de las cepas recomendadas de CSFV o con la cepa C adaptada a
conejo. Los MAbs deben estar dirigidos contra una protena vrica inmunodominante del CSFV. Los
ensayos indirectos deben utilizar una inmunoglobulina anti-cerdo que detecte tanto IgG como IgM.
La sensibilidad de la prueba ELISA debe ser lo bastante grande como para considerar positivo cualquier
suero de animal convaleciente, es decir, que reaccione en la prueba de neutralizacin al menos 21 das
post-inoculacin. La prueba ELISA slo puede utilizarse con muestras de suero o plasma derivadas de
cerdos individuales. Si el procedimiento ELISA empleado no es especfico para la PPC, las muestras
positivas deben analizarse adems por pruebas diferenciales para distinguir entre PPC e infecciones por
otros pestivirus.
El ELISA bloqueante de captacin de complejos (4) es un mtodo de un solo paso muy adecuado para
utilizar en sistemas ELISA automatizados. Los sueros se emplean sin diluir. La prueba es rpida y fcil de
274
realizar, y detecta anticuerpos contra cepas de CSFV de baja virulencia en las primeras fases de la
infeccin. Como los MAbs son especficos para el CSFV, el ELISA bloqueante de captacin de complejos
detectar anticuerpos contra el BVDV solo muy raramente, aunque los anticuerpos contra EF pueden ser
ms problemticos. Los sueros positivos se vuelven a probar por NPLA para confirmacin.
Se puede obtener ms informacin sobre los kits comerciales de los laboratorios de referencia de la OIE.

No existen vacunas eficaces con virus completo inactivado contra la PPC.
C1. Vacunas con virus vivos modificados

Las vacunas de tipo MLV se producen con cepas de CSFV que se atenan por pases en cultivo celular o en una
especie hospedadora adecuada que no pertenezca a la familia Suidae. La produccin de lleva a cabo basndose
en un sistema de lotes de siembra. ste debe ser validado respecto a identidad, esterilidad, pureza, seguridad,
ausencia de transmisin, estabilidad e inmunogenicidad.
Las normas para la produccin de vacunas veterinarias se presentan en el Captulo I.1.7. Principios de
produccin de vacunas veterinarias. Las directrices dadas aqu y en el Captulo I.1.7. son de naturaleza general y
puede suplementarse con requisitos nacionales y regionales.
El servicio de produccin de vacunas debe funcionar bajo adecuadas medidas y prcticas de bioseguridad. Si se
utiliza el CSFV para produccin de vacunas o para estudios de desafo de las vacunas, la parte del servicio
donde se realiza este trabajo debe cumplir los requisitos de Contencin del Grupo 4 de patgenos como se
seala en el Apndice I.1.6.1. del Captulo I.1.6. de este Manual.
Para producir un lote de siembra y una vacuna final de alta calidad, se deben determinar las condiciones ptimas
para la obtencin del virus. Para las vacunas producidas en cultivos celulares, se deben hacer experimentos con
curvas de crecimiento para estudiar el efecto de la composicin del medio, de la regulacin del pH y del
contenido atmosfrico del CO2, la concentracin inicial de clulas sembradas, la relacin entre la superficie de la
capa celular y el volumen de medio, la fase de crecimiento de las clulas al tiempo de la infeccin vrica,
condicin estacionaria o rotatoria del cultivo durante la replicacin vrica, etc. Para las vacunas producidas en
animales, los factores que deben ser investigados para determinar el mximo de crecimiento vrico y los tejidos a
recoger son, entre otros, la edad, raza, peso, tamao del inculo (nmero de ID50 animal [dosis infecciosa del
50%]), patognesis de la infeccin, y sntomas clnicos.
Cualquiera que sea el mtodo de produccin, el substrato debe recogerse en condiciones aspticas y someterse
a un ciclo de congelacin y descongelacin para liberar los virus asociados a las clulas. Los elementos
celulares grandes o los restos de tejidos se eliminan por filtracin o centrifugacin a baja velocidad. Se aade un
estabilizador, como lactosa, a una concentracin final de 5%. La vacuna se homogeniza antes de su liofilizacin
para asegurar un lote uniforme.
En el producto final, el virus vacunal no debe diferir del material utilizado para validar el lote de siembra en ms
de cinco pases. La vacuna comercial debe producirse en lotes en forma liofilizada como un producto homogneo.
1.
Control del inculo
a)

Para validar un lote de siembra de una vacuna MLV contra la PPC, las muestras del inculo de siembra
deben superar primero varios experimentos piloto. Excepto para pruebas de confirmacin de identidad,
esterilidad, pureza y estabilidad de la atenuacin, los experimentos piloto tambin deben realizarse con
muestras representativas del producto comercial final. Estas muestras se deben originar del mismo lote de
siembra probado antes.
A menos que se especifique de otro modo, todos los cerdos utilizados en pruebas piloto son cerdos sanos
de 6-8 semanas de edad, sin anticuerpos contra CSFV y BVDV, de la misma raza y origen, agrupados al
azar si es necesario, y mantenidos en las mismas condiciones. Las cerdas gestantes deben ser de igual
paridad.
275
El virus de siembra debe ser estril e inducir anticuerpos neutralizantes que sean especficos contra una
cepa virulenta de CSFV en cerdos.
b)
Mtodo de cultivo
La produccin se realiza en cultivos celulares o en un hospedador adecuado de una especie que no
pertenezca a la familia Suidae.
c)

i)
Pureza
La vacuna debe ser virolgicamente pura.
Cada uno de tres cerdos seronegativos se inocula intramuscularmente con una cantidad de virus del
lote de siembra equivalente a diez veces la cantidad de virus contenido en una dosis de vacuna. Esto
se repite 3 semanas despus utilizando la misma dosis y ruta de administracin. Se toman muestras
de suero 2 semanas despus de la ltima inoculacin y se analizan por el mtodo ms sensible para
ausencia de anticuerpos contra los virus de la peste porcina africana, enfermedad de Aujeszky, DVB,
fiebre aftosa (todos los tipos), gastroenteritis transmisible, enfermedad vesicular porcina, sndrome
porcino reproductivo y respiratorio, gripe porcina (tipos H1N1 y H3N2), y contra adenovirus porcinos,
enterovirus porcinos (tipos 1 y 2), parvovirus porcino y circovirus.
ii)
Seguridad
En las pruebas de seguridad, cada uno de diez cerdos seronegativos se inocula intramuscularmente
con diez dosis de vacuna. Otros diez cerdos sirven de control. Todos los cerdos se observan durante
las 3 semanas siguientes. Diariamente se anotan las temperaturas corporales y se toman muestras de
sangre con un anticoagulante durante la primera semana. Se anotan los pesos al tiempo de la
inoculacin y 2 semanas ms tarde. Ningn animal debe morir o mostrar sntomas de enfermedad
causada por el virus de la vacuna (lote de siembra). La temperatura diaria media del cuerpo no debe
alcanzar o superar los 40,5C durante el perodo de la prueba. El aumento diario de peso medio no
debe descender significativamente (p< 0,05) respecto al del grupo control. Se puede despreciar la
leucopenia (nmero de leucocitos < 7 x 106 clulas/ml) si slo ocurre en un cerdo durante 1 da.
Cada uno de diez cerdos se inmunosuprime por inyecciones diarias con 2 mg de prednisolona/kg de
peso corporal durante 5 das consecutivos. Al da 3 cada animal se inocula con el equivalente de una
dosis de vacuna, y se observa durante las tres semanas siguientes. Ningn animal debe morir o
enfermar debido al virus vacunal.
Cada una de diez cerdas gestantes de 25-35 das, se inoculan intramuscularmente con el equivalente
de una dosis de vacunas. Otros diez animales de la misma paridad y gestacin sirven de control. La
vacunacin no debe de interferir con la gestacin a trmino, y el nmero de lechones vivos nacidos del
grupo de prueba no debe ser significativamente menor (p<0,05) que el del grupo control.
Para ensayos de campo se utiliza un mnimo de 200 cerdos paridos y criados por al menos 20 cerdas,
y que sean seronegativos para CSF y BDV. Las camadas se distribuyen del mismo modo en dos
granjas por lo menos. La mitad de los lechones de cada camada se inoculan intramuscularmente a los
7-14 das de edad con el equivalente de una dosis de vacuna. Los lechones no inoculados son los
controles. Todos los lechones se pesan al tiempo de la inoculacin y 2 semanas ms tarde, y se
observan durante 3 semanas. Una tasa de mortalidad que supera el 5% debido a causas ajenas a la
vacunacin invalida la prueba. Ningn animal debe morir o mostrar signos de la enfermedad debido al
virus vacunal. El peso medio ganado por los lechones inoculados no debe ser un 20% menor que el
de los controles durante las 2 semanas post-inoculacin.
iii)
Ausencia de transmisin
Para confirmar la ausencia de transmisin, se dividen 24 cerdos seronegativos en cuatro grupos
iguales. En cada grupo se inoculan cinco cerdos intramuscularmente con el equivalente de una dosis
de vacuna. El resto de los cerdos representa los controles. Todos los cerdos se inoculan 6 semanas
despus como desafo con al menos 105 PID50 (dosis infecciosa del 50% de los cerdos) de una cepa
virulenta de CSFV. Todos los animales control deben ser serolgicamente negativos al tiempo del
desafo, y morir despus durante las 3 semanas siguientes. Todos los cerdos vacunados deben
permanecer sanos y sobrevivir.
iv)
Estabilidad de la atenuacin
Para confirmar la estabilidad de la atenuacin vrica, cada uno de dos cerdos se inocula
intramuscularmente con una cantidad de virus de lote de siembra equivalente a 100 dosis de vacuna y
276
se sacrifican 6-7 das despus. Se juntan las amgdalas de ambos cerdos y se prepara una
suspensin al 10% en PBS, pH 7,2. Esto se usa para inocular intramuscularmente otros dos cerdos
con 2 ml y luego se sacrifican 6-7 despus. Este protocolo se repite 5 veces. Durante estos pases, el
tejido de amgdalas se puede guardar a 4C, si el almacenamiento es menor de 24 horas, o a -70C
por perodos ms largos. Al mismo tiempo, la presencia del antgeno de PPC se confirma en cada
pase por una prueba directa de FAT en cortes finos de las amgdalas o por aislamiento del virus en un
substrato adecuado. Si despus de un cierto pase no se puede demostrar CSFV o antgeno, se realiza
una segunda serie de pases para mostrar infeccin, comenzando con los ltimos dos cerdos de la
serie previa.
Se inoculan intramuscularmente cinco cerdos con el sexto pase del virus del lote de siembra,
equivalente a una dosis de vacuna o, si no se ha alcanzado este pase, con el pase ms alto de las dos
series en que se detect virus o antgeno vrico. Se inoculan de modo similar cinco cerdos adicionales
con una dosis de virus del lote de siembra, equivalente a una dosis de la vacuna. Todos los cerdos se
pesan al tiempo de la inoculacin y de nuevo 2 semanas ms tarde. Se recoge sangre diariamente
con anticoagulante durante la primera semana, y todos los cerdos se mantienen bajo observacin
durante 3 semanas. Ningn animal debe morir o enfermar por el virus de la vacuna. El peso medio
adquirido en los dos grupos durante las primeras dos semanas no debe diferir significativamente
(p<0,05). Cuando mucho, se permite leucopenia (nmero de leucocitos < 7 x 106 clulas/ml) en un
cerdo de cada grupo durante 1 da.
v)
Inmunogenicidad
Para demostrar una inmunogenicidad adecuada, se inoculan diez cerdos con una cantidad de virus
equivalente a una dosis de vacuna cada uno, y otros dos cerdos se mantienen por separado no
inoculados como controles. Todos los cerdos se someten una inoculacin de desafo 7 das despus
con 105 PID50 de una cepa virulenta de CSFV. Solo deben morir los controles.
En una prueba para establecer la duracin de la inmunidad, se inoculan diez cerdos con unas dosis de
vacuna cada uno y otros dos se mantienen por separado como control. Seis meses despus, los
sueros de los cerdos inoculados se prueban para anticuerpos contra PPC; al menos ocho cerdos
deben resultar positivos. Todos los cerdos se inoculan despus en desafo con al menos 105 PID50 de
una cepa virulenta de VPCC y se observan durante 3 semanas. Solo deben morir los controles.
Para determinar la proteccin al desarrollo del sndrome de la cerda portadora, se dividen al azar 20
cerdas grvidas en la misma fase de gestacin en dos grupos. Un grupo se vacuna una o dos veces
con una cantidad equivalente a una dosis de vacuna, y cuatro semanas despus de la ltima
inoculacin se inoculan intranasalmente con una cepa de campo de baja virulencia, junto con las
cerdas control no vacunadas. Todas las cerdas se sacrifican 4 semanas despus y los fetos se
examinan para presencia de CSFV o antgeno vrico. La vacunacin debera reducir de modo
significativo la transmisin transplacentaria del virus.
En las condiciones de conservacin prescritas por el fabricante para el producto final, un volumen de
virus equivalente a una dosis de vacuna debe mantener su inmunogenicidad por lo menos hasta el
final de la caducidad que se indique.
2.
Mtodo de produccin
Cada lote de vacuna de tipo MLV contra la PPC debe derivar del mismo lote de inculo utilizado para las pruebas
piloto. Adems, cada lote debe prepararse de acuerdo con el protocolo de produccin y bajo las condiciones
expresadas para registrar el producto final. Las propiedades de cada lote y las del lote de siembra deben ser
uniformes.
3.
Control del proceso
El protocolo de produccin depender de la cepa vacunal, del sistema de produccin (animales o cultivos
celulares) y de los servicios disponibles. Las normas para vacunas obtenidas de cultivos celulares pueden variar
en funcin del sistema de produccin, es decir, si proceden de cultivos primarios, lneas celulares, monocapas o
cultivos en suspensin.
4.
Control de lotes
Todos los cerdos utilizados en las pruebas de control deben tener 6-8 semanas y estar libres de anticuerpos
contra el CSFV o el BVDV. Deben tener un origen, raza, y crianza uniforme y, cuando sea necesario, estar
distribuidos en grupos aleatorios.
277
a)
Identidad
La vacuna debe inducir anticuerpos neutralizantes especficos contra una cepa viruenta de CSFV.
b)
Esterilidad
Las pruebas para esterilidad y ausencia de contaminacin de materiales biolgicos se presentan en el
Captulo I.1.5.
c)
Inocuidad
Se inoculan intramuscularmente tres cerdos con diez dosis cada uno de la vacuna reconstitiuida, en una
nica inyeccin. Los cerdos se observan durante 3 semanas y se toma diariamente la temperatura corporal
durante la primera semana. Ningn cerdo debe morir o mostrar sntomas de la enfermedad atribuidos a la
vacuna, su temperatura corporal diaria no debe alcanzar nunca los 40,5C o ms, y deben crecer
normalmente.
d)
Pureza
El lote debe ser virolgicamente puro. Para probar esto, se inoculan intramuscularmente tres cerdos con
diez dosis de vacuna cada uno. Se recogen muestras de suero al tiempo de la inoculacin y 5 semanas
despus. Los sueros se prueban para anticuerpos contra el DVB (neutralizacin durante 1 hora a 37C) y
contra parvovirus porcinos (inhibicin de la hemaglutinacin utilizando cuatro unidades hemaglutinantes).
Los tres cerdos deben permanecer sin enfermedad. No es necesario realizar pruebas para pureza biolgica
con vacunas producidas en conejos.
e)
Potencia
La potencia se expresa como el nmero de dosis protectoras del 50% (PD50) contenidas en una dosis de
vacuna. Una dosis de vacuna tiene al menos 100 PD50.
Se inoculan intramuscularmente dos grupos de cinco lechones de 6-8 semanas con una dilucin 1/40 y
1/160 de la vacuna reconstituida, respectivamente, utilizando solucin salina tamponada, pH 7,2. Dos
semanas despus, los cerdos vacunados y dos cerdos control se inoculan intramuscularmente con
105 PID50 de una cepa virulenta de CSFV como desafo. Los cerdos se observan durante las dos semanas
siguientes, perodo en el que los controles deben morir. Usando mtodos estadsticos normales, a partir de
los cerdos sobrevivientes que no muestran sntomas de PPC, se calcula el nmero de PD50 contenido en la
vacuna.
La prueba de potencia se puede reemplazar por una prueba de infectividad, siempre que el fabricante
pueda demostrar que existe una relacin clara y reproducible entre el contenido del virus de la vacuna y la
proteccin que confiere a cerdos en una inoculacin de desafo.
f)
Estabilidad
El perodo de validez de un lote de vacuna liofilizada contra la PPC no debe ser menor de 1 ao.
C2. Vacunas marcadoras

Pese a la existencia de vacunas MLV seguras y eficaces contra la PPC, su uso no ha sido favorecido en la
Unin Europea y algunos otros pases libres de PPC o casi libres, debido a que los anticuerpos que inducen
tales vacunas no pueden distinguirse de los inducidos por el virus natural. Esta desventaja no se presenta
en una "vacuna marcadora" capaz de provocar una respuesta inmune protectora que puede distinguirse de
la respuesta inmune inducida por el virus natural. Un prerrequisito para distinguir entre animales vacunados
y animales infectados naturalmente es la disponibilidad de una prueba serolgica acompaante que es muy
discriminatoria para revelar infecciones residuales.
Las exigencias mnimas para las vacunas marcadoras contra la PPC y las pruebas discriminatorias
acompaantes se resumen del siguiente modo (5):
a)
Vacuna
La vacuna debe suministrar proteccin frente a cualquier contacto con el virus natural. La eficacia de la
vacunacin debe demostrarse experimentalmente mediante estudios que analicen la transmisin del virus
natural en grupos de cerdos vacunados. El efecto protector de la vacunacin debe alcanzarse en el menor
tiempo posible. Con preferencia, la proteccin rpida y fiable debe obtenerse despus de una nica
aplicacin. Adems, debe asegurarse que la infeccin de cerdas gestantes vacunadas no ocasiona
278
infeccin transplacentaria ni el nacimiento de cras con infeccin congnita por CSFV. La duracin de la
inmunidad debe ser superior a 6 meses.
Hay muchas vacunas marcadoras contra la PPC en fase de desarrollo, pero en la Unin Europea se han
registrado hasta ahora dos. Ambas son vacunas con subunidades, que emplean como inmungeno la
glicoprotena E2 del CSFV y que se han sometido a valoracin independiente (8, 23). La subunidad E2 se
produce en clulas de insectos infectados por baculovirus modificados genticamente, que contienen el gen
E2 del CSFV. Las vacunas, por tanto, no contienen ningn CSFV, y el baculovirus vector se inactiva
qumicamente. La preparacin final contiene aceites minerales como adyuvantes para formar una emulsin
doble (agua/aceite/agua) o simple (agua en aceite).
b)
Prueba discriminatoria acompaante

La prueba serolgica discriminatoria acompaante debe ser muy sensible puesto que la vacunacin
reducir la prevalencia de la enfermedad. Debe ser utilizada como una prueba a nivel poblacional. Una
sensibilidad elevada reduce la especificidad de la prueba, ya comprometida por la presencia de anticuerpos
contra otros pestivirus, por lo que se debe disponer de pruebas confirmativas adecuadas y rpidas para
diferenciar los resultados positivos de los positivos falsos.
Las pruebas acompaantes que existen para las vacunas con subunidad E2 son pruebas ELISA basadas
en la deteccin de anticuerpos contra la protena Erns (11, 12). Tal prueba se ha aprobado recientemente
por la Comisin Europea (2) para la determinar si las piaras vacunadas con una vacuna con subunidad E2
tambin pueden haber estado expuestas al virus natural.
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of pestivirus strains with monoclonal antibodies against hog cholera virus. Vet. Microbiol., 21, 920.
*
* *
NB: Existen laboratorios de referencia de la OIE para la Peste porcina clsica (ver Cuadro en la Parte 3 de este
Manual de animales terrestres o consultar la pgina Web de la OIE para una lista actualizada: www.oie.int)
280
CAPTULO 2.1.14.
GRIPE AVIAR MUY VIRULENTA
RESUMEN
La gripe aviar muy virulenta (GAMV), tambin conocida como la peste aviar, est causada por
virus especficos de la gripe del grupo A que son miembros de la familia Orthomyxoviridae. Existen
tres tipos de gripe - A, B y C; slamente infectan las aves los influenzavirus del tipo A. El
diagnstico se realiza mediante el aislamiento y la caracterizacin del virus. Ello se debe a que las
infecciones en las aves pueden dar lugar a una amplia variedad de signos clnicos dependiendo
del hospedador, la cepa de virus, el estado inmune del hospedador, la presencia de algn
microorganismo secundario exacerbante y las condiciones ambientales.
Identificacin del agente: Se inoculan en la cavidad alantoidea de embriones de pollo de 911 das de edad suspensiones en una solucin de antibiticos obtenidas a partir de frotis
traqueales o cloacales (o heces) recogidos de aves vivas, o de heces y muestras de rganos de
aves muertas. Los embriones se incuban a 35-37C durante 4-7 das. El lquido alantoideo de
aquellos huevos que contienen embriones muertos o moribundos y todos los embriones en el
periodo final de incubacin se utilizan para determinar la presencia de actividad hemaglutinante. La
existencia de virus de la gripe tipo A puede confirmarse mediante un ensayo de inmunodifusin
entre el virus concentrado y un antisuero frente a los antgenos de la nucleocpsida o de la matriz,
que son comnes en todos los virus de la gripe tipo A. Recientemente, en ciertos casos, se ha
sustituido el aislamiento en embriones por la reaccin en cadena de la polimerasa inversa.
Para realizar el subtipado del virus, el laboratorio debe poseer antisueros monoespecficos
preparados frente a los antgenos aislados de cada uno de los 15 subtipos de hemaglutinina (H1H15) y 9 subtipos de neuraminidasa (N1-N9) de los virus de gripe tipo A, los cuales pueden
utilizarse en ensayos de inmunodifusin. Alternativamente, el virus recin aislado puede
examinarse mediante ensayos de inhibicin de la hemaglutinacin y de la neuraminidasa frente a
una serie de anticuerpos policlonales contra un amplio rango de cepas de todos los subtipos.
Como los trminos GAMV y peste aviar se refieren a la infeccin con cepas virulentas del virus
de la gripe tipo A, es necesario evaluar la virulencia de un aislamiento en aves domsticas.
Mientras que todas las cepas aisladas hasta la fecha han pertenecido bien al subtipo H5 H7, la
mayora de los aislamientos H5 H7 han mostrado una baja virulencia. En los ltimos aos los
mtodos empleados para la determinacin de la virulencia de una cepa en las aves han
evolucionado y existe una mayor comprensin de las bases moleculares de la patogenicidad, pero
todava implican la inoculacin del virus infeccioso de un mnimo de ocho gallinas susceptibles de
4-8 semanas de edad; las cepas se consideran muy virulentas si causan ms del 75% de
mortalidad en 10 das. El aislamiento y la caracterizacin de las cepas del virus patgenas que son
sospechosas deberan realizarse en un laboratorio de seguridad virolgica.
Ensayos serolgicos: Como todos los virus de la gripe tipo A poseen nucleocpsidas y antgenos
de la matriz similares antignicamente, para detectar anticuerpos frente a estos antgenos se
emplean ensayos de inmunodifusin en gel de agar. Se utilizan en estos ensayos las
preparaciones de virus concentradas que contienen uno o ambos tipos de antgenos. No todas las
aves desarrollan anticuerpos precipitantes demostrables. Los ensayos de inhibicin de la
hemaglutinacin tambin se han empleado en la serologa diagnstica de rutina, aunque es posible
que esta tcnica no detecte algunas infecciones concretas debido a que la hemaglutinina es
especfica del subtipo vrico. Se han empleado los enzimoinmunoensayos para detectar
anticuerpos frente a antgenos especficos del virus de la gripe tipo A.
281
Captulo 2.1.14. Gripe aviar muy virulenta
Requisitos para las vacunas y los materiales de diagnstico: En la mayora de los pases las
vacunas diseadas especficamente para contener o prevenir la GAMV se encuentran prohibidas o
estn desaconsejadas por las agencias gubernamentales porque pueden interferir con las polticas
de control o eliminacin de la enfermedad. Durante la dcada de 1990 en Mxico y Pakistn se
utilizaron profilcticamente vacunas inactivadas mediante emulsin con aceites para controlar
brotes generalizados de GAMV, y en Mxico tambin se prob, en pruebas de campo, una vacuna
recombinante del virus de la viruela aviar que expresaba un gen HA homlogo. Durante el brote de
1999-2001 en Italia, se utiliz una vacuna inactivada del mismo tipo de hemaglutinina que el virus
salvaje, pero con una neuraminidasa diferente. Ello permiti distinguir entre las aves vacunadas y
aquellas infectadas con el virus salvaje.
Si la GAMV se utiliza para la produccin de vacuna o en estudios de sensibilizacin, la instalacin
debera cumplir los requisitos de la OIE para la Contencin de los patgenos del Grupo 4.
A. INTRODUCCIN
La gripe aviar muy virulenta (GAMV), tambin conocida como la peste aviar, est causada por virus de la gripe
del tipo A de la familia Orthomyxoviridae. Los virus de la gripe tipo A son los nicos ortomyxovirus conocidos que
afectan a las aves. Se ha demostrado que muchas especies de aves son susceptibles a la infeccin con los virus
de la gripe tipo A; las aves acuticas constituyen el reservorio mayoritario de estos virus, pero una abrumadora
mayora de los aislamientos han sido poco patognicos en los pollos y pavos, que son las principales aves con
importancia econmica afectadas. Los virus de la gripe tipo A poseen nucleocpsidas y protenas de la matriz
relacionadas antignicamente, aunque se clasifican en subtipos en base a los antgenos de hemaglutinina (H) y
neuraminidasa (N) (40). En la actualidad se reconocen 15 subtipos H (H1-H15) y 9 subtipos N (N1-N9). Hasta la
fecha, los virus muy virulentos de la gripe tipo A, que producen una enfermedad clnica aguda en los pollos y
pavos, solamente se han asociado con los subtipos H5 y H7 (con la excepcin de dos subtipos H10 que podran
tambin cumplir las definiciones de la OIE y la Unin Europea [UE]), aunque las razones no estn claras.
Muchos virus del subtipo H5 y H7 aislados a partir de aves han sido poco virulentos en las aves de corral (1).
Dependiendo de la edad, el tipo de ave y los factores ambientales, la enfermedad muy virulenta puede variar
desde una muerte sbita con pocos signos o sin signos patentes, hasta una enfermedad ms caracterstica con
sntomas respiratorios, exceso de lacrimeo, sinusitis, edema en la cabeza, cianosis de la piel no cubierta de
plumas y diarrea. Sin embargo, ninguno de estos signos puede considerarse patognomnico. Por lo tanto, el
diagnstico de la enfermedad depende del aislamiento del virus y de la demostracin de su virulencia en un
hospedador adecuado. La comprobacin de los sueros de las aves sospechosas empleando mtodos
inmunolgicos puede complementar el diagnstico, aunque estos mtodos no son adecuados para una
identificacin detallada. El diagnstico con vistas a un control oficial se establece en base a los criterios de
patognesis acordados oficialmente, de acuerdo con ensayos in-vivo o determinantes moleculares (p. ej. la
presencia de muchos aminocidos bsicos en el sitio de corte de la hemaglutinina). Estas definiciones
evolucionan con el aumento del conocimiento cientfico de la enfermedad.
La GAMV est sometida a un control oficial y el virus presenta un gran riesgo de diseminarse fuera del
laboratorio; en consecuencia, debera realizarse una valoracin de riesgo para determinar el nivel de
bioseguridad que es necesario para el diagnstico y la caracterizacin del virus. La instalacin debera cumplir
los requerimientos para el Grupo de Contencin adecuado, determinado mediante la valoracin del riesgo, como
se resume en el Apndice I.1.6.1 del Captulo I.1.6 de este Manual de animales terrestres. Los pases que
carezcan de acceso a un laboratorio nacional o regional especializado deberan enviar sus muestras a un
laboratorio de referencia de la OIE.
1.
Las muestras recogidas a partir de las aves deberan incluir el contenido intestinal (heces) o frotis cloacales y
oro-nasales. Las muestras de la trquea, pulmones, sacos areos, intestino, bazo, rin, cerebro, hgado y
corazn tambin pueden recogerse y procesarse, bien separada o conjuntamente.
Las muestras de aves vivas deberan incluir frotis traqueales y cloacales, aunque estos ltimos frotis son los que,
con mayor probabilidad, proporcionan virus. Como las aves pequeas y frgiles pueden ser daadas durante la
realizacin del frotis, la recogida de las heces puede servir como una alternativa adecuada.
282
Las muestras deberan colocarse en tampn salino fosfato isotnico (PBS), pH 7,0-7,4, con antibiticos. Los
antibiticos pueden modificarse de acuerdo con los condicionantes locales, pero podran ser, por ejemplo, la
penicilina (2.000 unidades/ml), estreptomicina (2 mg/ml), gentamicina (50 g/ml) y micostatina
(1.000 unidades/ml) para los tejidos y los frotis traqueales, pero a una concentracin cinco veces mayor para las
heces y los frotis cloacales. Es importante reajustar el pH de la solucin hasta un pH 7,0-7,4 despus de la
adicin de los antibiticos. Las heces y los tejidos finamente picados deberan prepararse como suspensiones
del 10-20% (p/v) en la solucin de antibiticos. Las suspensiones deberan procesarse lo antes posible despus
de la incubacin durante 1-2 horas a temperatura ambiente. Cuando no se pueda realizar el procesado inmediato
las muestras pueden guardarse a 4C hasta 4 das. Para un almacenamiento prolongado, las muestras
diagnsticas y los aislamientos deberan almacenarse a 80C.
El mtodo preferido para el cultivo de los influenzavirus de tipo A es mediante la inoculacin de embriones de
pollo especficamente libres de patgenos (SPF), o al menos embriones especficamente libres de anticuerpos
(SAN). Los lquidos sobrenadantes de las heces o las suspensiones de tejidos obtenidos mediante clarificacin
por centrifugacin a 1.000 g se inoculan en la cavidad alantoidea de al menos 5 embriones de aves SPF con 911 das de incubacin. Los embriones se incuban a 35-37C durante 4-7 das. Los huevos que contienen
embriones muertos o moribundos, y todos los embriones restantes al final del periodo de incubacin, deberan en
primer lugar enfriarse hasta los 4C, y entonces los fluidos alantoideos deberan estudiarse para determinar la
presencia de actividad hemaglutinante (HA) (ver Seccin B.3.b.). La deteccin de la actividad HA indica una alta
probabilidad de presencia de un virus de gripe tipo A o de un paramyxovirus aviar. Los fluidos que dan una
reaccin negativa deberan pasarse en, al menos, uno o ms lotes de embriones de pollo.
La presencia del virus de la gripe tipo A puede confirmarse en pruebas de inmunodifusin en gel de agar (IGDA),
demostrando la presencia de los antgenos de la nucleocpsida o la matriz, siendo ambos comunes a todos los
virus de gripe tipo A (ver Seccin B.3.a.). Los antgenos pueden preparase concentrando el virus a partir del
lquido alantoideo infectivo o extrayendo las membranas corioalantoideas infectadas; estas se prueban frente a
antisueros positivos conocidos. Los virus pueden concentrarse a partir del lquido alantoideo infectivo mediante
ultracentrifugacin, o mediante precipitacin en ambiente cido. Este ltimo mtodo consiste en la adicin de HCl
1,0 M al lquido alantoideo infectivo hasta que alcanza aproximadamente un pH de 4,0. La mezcla se coloca en
un bao con hielo durante 1 hora y entonces se clarifica mediante centrifugacin a 1.000 g a 4C. Se descarta el
lquido sobrenadante. Los concentrados vricos se resuspenden en tampn glicina/sarcosil: consiste en un 1% de
lauril sarcosinato sdico tamponado hasta pH 9,0 con glicina 0,5 M. Estos concentrados contienen polipptidos
de la nucleocpsiday de la matriz.
Las preparaciones del antgeno enriquecido en nucleocpside pueden tambin obtenerse a partir de las
membranas corioalantoideas para su uso en el ensayo IGDA (5). Este mtodo implica retirar las membranas
corioalantoideas de los embriones infectados que presentan lquidos alantoideos con actividad HA. Entonces las
membranas se homogenizan o se trituran hasta obtener una pasta. Esta se somete a tres ciclos de congelacindescongelacin, seguido de una centrifugacin a 1.000 g durante 10 minutos. El precipitado se desecha y el
sobrenadante se emplea como antgeno despus de un tratamiento con formalina al 0,1%.
El empleo del ensayo IGDA para demostrar los antgenos de la nucleocpsida o la matriz constituye una forma
satisfactoria de indicar la presencia de virus de la gripe aviar en el lquido amnioalantoideo, aunque actualmente
estn disponibles varios enzimoinmunoensayos (ELISAs). Existe un ELISA sensible y especfico que demuestra
la nucleoprotena del virus de la gripe tipo A empleando un anticuerpo monoclonal frente a la nucleoprotena de
este virus (27, 28, 33). Se encuentra disponible como un sistema comercial.
Cualquier actividad HA en los fluidos estriles concentrados a partir de los embriones inoculados es debida, muy
probablemente, a un virus de gripe tipo A o a un paramyxovirus aviar (unas cuantas cepas de reovirus aviar
pueden dar esta reaccin, o el fluido no estril podra contener HA de origen bacteriano). Actualmente existen
nueve serotipos reconocidos del paramyxovirus aviar. La mayora de los laboratorios dispondrn de antisuero
especfico frente al virus de la enfermedad de Newcastle (paramyxovirus aviar tipo 1), y en vista de su existencia
ampliamente generalizada y uso casi universal como vacuna viva en las aves de corral, es mejor evaluar su
presencia mediante ensayos de inhibicin de la hemaglutinacin (IH) (ver el Captulo 2.1.15.).
Alternativamente, la presencia de virus de la gripe puede confirmarse mediante el empleo de la reaccin en
cadena de la polimerasa inversa (RT-PCR) empleando cebadores conservados especficos de la nucleocpsida
(2). La presencia de los subtipos H5 H7 del virus de la gripe tambin puede confirmarse utilizando cebadores
especficos de los subtipos H5 H7 (13, 26, 39).
El mtodo recomendado por el Comit de Expertos de la Organizacin Mundial de la Salud (OMS)(40) para el
subtipado antignico definitivo de los virus de la gripe tipo A implica la utilizacin de antisueros muy especficos
dirigidos frente a los subtipos H y N (25), y preparados en un animal que ofrezca un mnimo de reacciones
inespecficas (p.ej. la cabra). Una tcnica alternativa consiste en el uso de antisueros policlonales obtenidos
frente a una serie de virus de la gripe intactos. La identificacin del subtipo mediante esta tcnica se encuentra
fuera del alcance de la mayora de los laboratorios de diagnstico no especializados en el virus de la gripe.
283
Existe ayuda disponible por parte de los Laboratorios de Referencia de la OIE (ver el Cuadro que se muestra en
la Parte 3 de este Manual de animales terrestres).
2.
Evaluacin de la patogenicidad
El trmino gripe aviar muy virulenta implica la relacin con cepas virulentas del virus. Se emplea para describir
una enfermedad en las aves con signos clnicos tales como el lacrimeo excesivo, fatiga respiratoria, sinusitis,
edema de la cabeza y la cara, cianosis de la piel no cubierta de plumas, y diarrea. La muerte repentina puede ser
el nico sntoma. Estos sntomas pueden variar enormemente dependiendo del hospedador, la edad del ave, la
presencia de otros microorganismos y las condiciones ambientales. Adems, los virus que normalmente no
causan enfermedad o causan una enfermedad leve pueden imitar a la gripe aviar muy virulenta si se dan
condiciones exacerbantes.
En el Primer Simposium Internacional sobre la Gripe Aviar celebrado en 1981 (3), se decidi abandonar el
trmino peste aviar y definir a las cepas muy virulentas en base a su capacidad para producir no menos de un
75% de mortalidad en 8 das, en al menos ocho pollos susceptibles de 4-8 semanas de edad e inoculados por la
va intramuscular, intravenosa o en el saco areo caudal. Sin embargo esta definicin result poco adecuada
cuando se aplic a los virus responsables de los brotes extensos surgidos en gallinas en 1983 en Pensilvania y
los estados circundantes de los EEUU. El problema fue causado principalmente por la presencia de un virus con
baja patogenicidad, demostrada en ensayos de laboratorio, pero que mostr ser muy patgeno despus de sufrir
una mutacin puntual. Despus de considerarlo detenidamente, varios grupos internacionales asumieron
consideraciones posteriores para incluir a tales virus como potencialmente patgenos.
Las consideraciones finales realizadas se basaron en el hecho de que mientras que se han producido numerosos
aislamientos de cepas de los subtipos H5 y H7 de baja patogenicidad, todas las cepas de la gripe de alta
patogenicidad aisladas hasta la fecha han presentado hemaglutinina bien de tipo H5 H7. Puede obtenerse ms
informacin relativa a la patogenicidad potencial de los subtipos H5 H7 secuenciando su genoma, ya que la
patogenicidad se encuentra asociada con la presencia de mltiples aminocidos bsicos (arginina o lisina) en el
sitio de corte de la hemaglutinina. Por ejemplo, los virus del subtipo H7 con baja virulencia han presentado los
motivos de aminocidos en el sitio de corte HA0 PEIPKGR*GLF- o PENPKGR*GLF-, mientras que algunos
ejemplos de motivos de aminocidos en los virus HPAI (o virus GAMV) H7 son: -PEIPKKKKR*GLF-,
PETPKRKRKR*GLF, -PEIPKKREKR*GLF-, y -PETPKRRRR*GLF-. La secuenciacin de aminocidos del sitio de
corte en los aislamientos de virus de la gripe con baja virulencia en aves de los subtipos H5 y H7 permitira
identificar los virus que, como el virus Pennsylvania, tienen la capacidad de convertirse en muy patgenos para
las aves de corral despus de sufrir una mutacin puntual.
Posteriormente la OIE adopt los siguientes criterios para clasificar los virus de la gripe aviar como muy
patgenos:
a)
Cualquier virus que es letal para seis, siete u ocho gallinas susceptibles de 4-8 semanas de edad durante
10 das despus de la inoculacin intravenosa con 0,2 ml de una dilucin 1/10 de lquido alantoideo
infectivo libre de bacterias.
b)
Si el aislamiento mata de uno a cinco pollos pero no pertenece al subtipo H5 H7, es necesario realizar el
siguiente ensayo adicional: el crecimiento del virus en cultivo celular1 con efecto citoptico o formacin de
placas en ausencia de tripsina. Si no se observa crecimiento, el aislamiento no se considera un aislamiento
GAMV.
c)
Si se observa crecimiento en cultivo celular sin tripsina en los virus H5 y H7 de baja patogenicidad y en
otros virus de la gripe, debe determinarse la secuencia de aminocidos del pptido de enlace con la
hemaglutinina. Si la secuencia es similar a la observada en otros aislamientos GAMV, el aislamiento que se
est ensayando puede considerarse muy patgeno.
En la U.E. se adopt una definicin parecida en la Directiva 92/40/EEC (11), aunque en este caso se emple el
ensayo del ndice de patogenicidad intravenoso (IPIV) como el mtodo de confirmacin de la virulencia. Con el
fin de confirmar la enfermedad e implementar las medidas de control de la Directiva, se aplica la siguiente
definicin:
una infeccin de las aves de corral causada por un virus de la gripe tipo A que tiene un ndice de
patogenicidad intravenosa >1- 2 en pollos de 6 semanas de edad, o cualquier infeccin con virus de la gripe
284
Por ejemplo, clulas primarias, como las clulas de embrin de pollo, o lneas celulares, como las clulas MDCK, aunque
la mayora de los cultivos celulares permiten el crecimiento de los virus de la gripe GAMV o aquellos con patogenicidad
baja en presencia de tripsina.
tipo A de los subtipos H5 H7 en los que la secuenciacin de nucletidos ha demostrado la presencia de

mltiples aminocidos bsicos en el sitio de corte de la hemaglutinina
El ensayo IPIV se realiza como sigue.
i)
Se diluye 1/10 en tampn salino estril el fluido alantoideo fresco con un ttulo >1/16 (>24 o >log2 4
expresado como el inverso).
ii)
Se inyectan 0,1 ml del virus diluido intravenosamente en diez pollos SPF de 6 semanas de edad.
iii)
Las aves se examinan en intervalos de 24 horas durante 10 das. Durante cada observacin cada ave
se punta como 0 si se encuentra normal, 1 si est enferma, 2 si est muy enferma, 3 si se ha muerto.
(El juicio sobre las aves enfermas o muy enfermas es una valoracin clnica subjetiva. Normalmente
las aves enfermas deberan manifestar uno de los siguientes sntomas, y las muy enfermas ms de
uno: afectacin respiratoria, depresin, diarrea, cianosis en la piel expuesta o en las barbas, edema en
la cara y/o en la cabeza, sntomas nerviosos. Las aves muertas deben puntuarse como 3 en cada uno
de los das siguientes de observacin despus de la muerte.)
iv)
El ndice de patogenicidad intravenosa (IVPI) es la puntuacin media por ave por observacin durante
un periodo de 10 das. Un ndice de 3,00 significa que todas las aves murieron en 24 horas, y un
ndice de 0,00 significa que ninguna ave mostr signo clnico alguno durante los 10 das del periodo de
observacin.
Se han empleado con xito una variedad de tcnicas y estrategias para secuenciar los nucletidos de la regin
del gen HA que codifica la regin del sitio de corte de la hemaglutinina de los subtipos H5 y H7 del virus de la
gripe aviar, lo que permite deducir los aminocidos presentes. El mtodo utilizado ms frecuentemente ha sido
RT-PCR empleando parejas de cebadores complementarios a zonas del gen a cada lado de la regin codificante
del sitio de corte, seguido de secuenciacin directa (38). Pueden facilitarse varias fases del protocolo empleando
sistemas comerciales y secuenciadores automticos.
Ya que la presencia de mltiples aminocidos bsicos en el sitio de corte de la HA se ha establecido como un
indicador preciso de la virulencia o virulencia potencial de los virus de la gripe H5 y H7, parece inevitable que la
determinacin del sitio de corte mediante secuenciacin u otros mtodos se convertir en el mtodo de eleccin
para la valoracin inicial de la virulencia de estos virus, y se incorporar en las definiciones acordadas. Ello
permitir reducir el nmero de ensayos in vivo, aunque, en la actualidad, todava se requerira la inoculacin de
las aves para confirmar un resultado negativo, ya que no puede desecharse la posibilidad de existencia de
cultivos vricos que contengan poblaciones mixtas de virus con alta y baja virulencia.
Aunque los virus GAMV verdaderos aislados hasta la fecha han pertenecido a los subtipos H5 H7, se ha
descrito que al menos dos aislados, ambos del subtipo H10 (H10 N4 y H10 N5), habran cumplido las
definiciones de la OIE y la UE para los virus GAMV (36), ya que mataron 7/10 y 8/10 pollos con valores IVPI>1,2
cuando las aves se inocularon por va intravenosa. Sin embargo no produjeron muertes o signos de la
enfermedad cuando se inocularon intranasalmente, y no presentaron mltiples aminocidos bsicos en sus sitios
de corte de la hemaglutinina.
3.
Pruebas serolgicas
a)

Todos los virus de la gripe poseen una nucleocpsida y antgenos de la matriz similares antignicamente.
Este hecho permite detectar la presencia o ausencia de anticuerpos frente a cualquier virus de la gripe
mediante ensayos IGDA. Las preparaciones concentradas de virus, como se describi anteriormente,
contienen antgenos de la matriz y la nucleocpsida; el antgeno de la matriz difunde ms rpidamente que
el antgeno de la nucleocpsida. Los ensayos IGDA se han empleado extensa y rutinariamente para
detectar anticuerpos especficos en rebaos de pollos o pavos como un indicador de la existencia de
infeccin. Generalmente, estos ensayos han utilizado preparaciones enriquecidas de nucleocpsida
obtenidas a partir de las membranas corioalantoideas de embriones de pollo (5) que han sido infectados a
los 10 das de edad, se han homogenizado, congelado y descongelado tres veces, y centrifugado a 1.000 g.
Los fluidos sobrenadantes se inactivan mediante la adicin de formalina al 0,1% o betapropiolactona al 1%,
se centrifugan de nuevo y se utilizan como antgeno. No todas las especies de aves pueden producir
anticuerpos precipitantes despus de la infeccin con el virus de la gripe.
Normalmente, los ensayos se realizan empleando geles de agarosa al 1% (p/v) o agar purificado con un 8%
(p/v) de NaCl en tampn fosfato 0,1M, pH 7,2, que se vierten en placas de Petri o en portaobjetos hasta
obtener un grosor de 2-3 mm. Se cortan pocillos en el agar de aproximadamente 5 mm de dimetro y
separados 2-5 mm empleando un molde y un cter. Usando un patrn para los pocillos, debe colocarse
cada suero sospechoso al lado de un suero y antgeno positivo conocido. Ello crear una lnea continua de
285
identidad entre el control positivo conocido, el suero sospechoso y el antgeno de la nucleocpsida.

Deberan aadirse en cada pocillo aproximadamente 50 l de cada reactivo.
Las lneas de precipitina pueden detectarse despus de aproximadamente 24-48 horas, aunque esto puede
depender de las concentraciones de anticuerpo y antgeno. Estas lneas se observan mejor frente a un
fondo oscuro iluminando por detrs. Se considera un resultado especfico positivo cuando la lnea de
precipitina entre el pocillo del control positivo es continua con la lnea entre el antgeno y el pocillo
problema. Las lneas cruzadas se interpretan como debidas a un suero problema que carece de identidad
con los anticuerpos del pocillo del control positivo.
b)
Ensayos de hemaglutinacin e inhibicin de la hemaglutinacin

En diferentes laboratorios se realizan distintas variantes de los protocolos de los ensayos de HA y HI. Los
siguientes ejemplos recomendados se basan en el uso de placas de micropocillos de plstico con el fondo
en V, y en las que el volumen final para ambos ensayos es de 0,075 ml. Los reactivos necesarios para
realizar estos ensayos son PBS isotnico (0,1 M), pH 7,0-7,2, y hemates (RBCs) obtenidos a partir de un
mnimo de tres pollos SPF y resuspendidos en un volumen igual de solucin de Alsever. (Si no existen
pollos SPF disponibles, la sangre se puede recoger a partir de aves seguidas con regularidad, y que se
sabe que estn libres de anticuerpos frente a la gripe aviar). Las clulas deberan lavarse tres veces en
PBS antes de emplearse como una suspensin al 1% (clulas concentradas v/v). Cuando sea adecuado
deberan utilizarse en cada ensayo antgenos y sueros control positivos y negativos.
Ensayo de hemaglutinacin
i)
Distribuir 0,025 ml de PBS en cada pocillo de un placa de microensayo de plstico con el fondo en V.
ii)
Colocar 0,025 ml de la suspensin vrica (p.ej. fluido alantoideo infectivo) en el primer pocillo. Para una
determinacin precisa del contenido de HA, debera realizarse a partir de un rango estrecho de una
serie de diluciones, p.ej. 1/3, 1/4, 1/5, 1/6, etc.
iii)
Preparar y distribuir diluciones medias de 0,025 volmenes de la suspensin vrica en toda la placa.
iv)
Distribuir 0,025 ml ms de PBS en cada pocillo.
v)
Repartir 0,025 ml de RBCs de pollo al 1% (v/v) en cada pocillo.
vi)
Mezclar cuidadosamente tapando la placa y dejar sedimentar los RBCs durante 40 minutos a
temperatura ambiente, p.ej. 20C, o durante 60 minutos a 4C si la temperatura ambiente es elevada,
por lo que los RBCs deberan sedimentarse hasta observar un botn ntido.
vii)
La HA se determina inclinando la placa y observando la presencia o ausencia de arrastre de los RBCs

con forma de gota. El ttulo debera leerse como la dilucin ms alta que da lugar a una HA completa
(ausencia de arrastre); esto representa 1 unidad HA (UHA) y puede calcularse de manera precisa a
partir del rango inicial de las diluciones.
Ensayo de inhibicin de la hemaglutinacin
i)
Distribuir 0,025 ml de PBS en cada pocillo de una placa de microtitulacin con fondo en V.
ii)
Colocar 0,025 ml de suero en el primer pocillo de la placa.
iii)
Preparar y distribuir diluciones medias de 0,025 volmenes de suero en toda la placa.
iv)
Aadir 4UHA de virus/antgeno en 0,025 ml a cada pocillo y dejar durante un mnimo de 30 minutos a
temperatura ambiente (p. ej. unos 20C) o 60 minutos a 4C.
v)
Aadir 0,025 ml de RBCs de pollo al 1% (v/v) en cada pocillo y, despus de mezclar cuidadosamente,
dejar sedimentar los RBCs durante unos 40 minutos a temperatura ambiente, p. ej. 20C, o durante
60 minutos a 4C si la temperatura ambiente es elevada, por lo que los RBCs deberan sedimentarse
hasta observar un botn ntido.
vi)
El ttulo HI es la dilucin ms alta de suero que ocasiona la inhibicin completa de 4UHA de antgeno.
La aglutinacin se valora inclinando las placas. Solamente en aquellos pocillos en los que los RBCs se
arrastran en la misma proporcin que los pocillos control (que contienen slo 0,025 ml de RBCs y
0,,05 ml de PBS) debera considerarse que presentan inhibicin.
vii)
La validez de los resultados debera evaluarse frente a un suero negativo control, el cual no debera
producir un ttulo >1/4 (>22 o >log2 expresado como el inverso), y un suero control positivo en el que el
ttulo debera encontrarse dentro de una dilucin del ttulo conocido.
Los ttulos HI pueden considerarse positivos si existe inhibicin a una dilucin del suero de 1/16 (>24 o
>log2 4 expresado como el inverso) o ms alta frente a un antgeno de 4UHA. Algunos laboratorios
286
prefieren emplear 8UHA en los ensayos HI. Aunque est permitido, afecta a la interpretacin de los
resultados de forma que un ttulo positivo es 1/8 (23 o log2 3) o ms alto.
En este ensayo los sueros de las gallinas raramente dan lugar a reacciones positivas inespecficas, y por lo
tanto no es necesario su pretratamiento. Los sueros de otras especies distintas a las gallinas pueden a
veces causar la hemaglutinacin de sus RBCs, por lo que esta propiedad debera determinarse antes y
eliminarse mediante adsorcin del suero con RBCs de gallina. Se realiza aadiendo 0,025 ml de RBCs
concentrados de gallina a 0,5 ml de cada antisuero, agitando cuidadosamente y dejando reposar durante al
menos 30 minutos; los RBCs se precipitan mediante centrifugacin a 800 g durante 2-5 minutos y se
decantan los sueros adsorbidos. Alternativamente pueden usarse los RBCs de las aves investigadas.
El ensayo de inhibicin de la neuraminidasa se ha utilizado para identificar el tipo de neuraminidasa AI de
los aislados, y para caracterizar los anticuerpos en las aves infectadas. El procedimiento necesita unos
conocimientos y reactivos especializados; en consecuencia este ensayo se realiza normalmente en un
Laboratorio de Referencia de la OIE. La estrategia DIVA (distincin de los animales infectados de los
vacunados) tambin se basa en el empleo de un ensayo serolgico para detectar anticuerpos especficos
anti-N; se ha descrito el procedimiento del ensayo (9).
Se encuentran disponibles sistemas comerciales ELISA que detectan anticuerpo frente a la protena de la
nucleocpsida. Se utilizan diferentes ensayos y mtodos de preparacin del antgeno. Normalmente, tales
ensayos han sido evaluados y validados por el fabricante, y es por tanto importante que se sigan
cuidadosamente las instrucciones especficas para su empleo.
4.
Tcnicas para el diagnstico de la gripe aviar en vas de desarrollo
En la actualidad, las tcnicas convencionales para el aislamiento, caracterizacin y diagnstico del virus de la
gripe aviar continan siendo el mtodo elegido, al menos para el diagnstico inicial de las infecciones. Sin
embargo los mtodos convencionales tienden a ser costosos, emplean numerosa mano de obra y son lentos.
Los ltimos 10 aos han visto grandes desarrollos y mejoras en las tcnicas moleculares y en otras tcnicas
diagnsticas, muchas de las cuales se han aplicado para el diagnstico de las infecciones de gripe aviar.
a)
Deteccin del antgeno

El sistema disponible comercialmente Directigen Flu A (Becton Dickinson Microbiology Systems), que
consiste en un sistema de enzimoinmunoensayo de captura antignica, se ha utilizado concretamente en
EEUU para detectar la presencia de virus de la gripe tipo A en las aves de corral (28). El sistema utiliza un
anticuerpo monoclonal frente a la nucleoprotena, y por lo tanto debera ser capaz de detectar cualquier
virus de la gripe del tipo A. Aunque se desarroll para detectar virus en infecciones de mamferos, se ha
aplicado con xito para detectar virus en aves de corral y otras aves, aunque puede existir alguna variacin
en la sensibilidad en diferentes muestras. La principal ventaja de este ensayo consiste en que puede
demostrar la presencia de AI en 15 minutos. Las desventajas son que puede carecer de sensibilidad, no ha
sido validado para diferentes especies de aves, no se consigue la identificacin del subtipo vrico y es un
sistema caro.
b)
Deteccin directa del ARN

Aunque, como queda demostrado por las definiciones actuales de la GAMV, las tcnicas moleculares se
han empleado para el diagnstico de la gripe aviar durante algn tiempo, recientemente se han producido
avances para su aplicacin en la deteccin y caracterizacin de los virus de la gripe aviar directamente a
partir de muestras clnicas de las aves infectadas.
Con la definicin de los cebadores adecuados, la tcnica de RT-PCR con muestras clnicas podra conllevar
una deteccin rpida e identificacin del subtipo (al menos del H5 H7), adems de posibilitar la obtencin
de un ADNc que puede emplearse para la secuenciacin de nucletidos (22, 30, 31). Los resultados
obtenidos por Koch (19) indicaron que debera ponerse cuidado en qu muestras clnicas se utilizan, ya
que, mientras que las muestras traqueales de aves infectadas mostraron una alta sensibilidad y
especificidad en relacin con el aislamiento del virus, los ensayos de RT-PCR con muestras fecales
carecieron de sensibilidad. La aplicacin efectiva de los ensayos de RT-PCR puede consistir en la
identificacin rpida de brotes sucesivos una vez que se han detectado los casos primarios y ha sido
caracterizado el virus. Esta tcnica se utiliz con xito durante los brotes de GAMV en 2003 en los Pases
Bajos.
Se han aplicado modificaciones en el empleo de la RT-PCR para reducir el tiempo de identificacin del
subtipo vrico y la secuenciacin. Por ejemplo, Spackman et al. (29) emplearon un sistema de RT-PCR de
un slo paso con cebador/hidrlisis de sonda fluorescente en tiempo real, para permitir la deteccin de
virus de la gripe aviar y la determinacin del subtipo H5 H7. Los autores concluyeron que el ensayo
287
cumpli bien su funcin en relacin al aislamiento del virus y ofreci una alternativa ms barata y mucho
ms rpida.
Se han diseado modificaciones del mtodo RT-PCR directo para la deteccin de ARN vrico con el fin de
reducir el efecto de sustancias inhibidoras presentes en la muestra recogida, la posible existencia de cidos
nucleicos contaminantes, y el tiempo necesario para obtener un resultado. Por ejemplo, la amplificacin de
secuencias basadas en cidos nucleicos (NASBA) junto con la deteccin electro-quimioluminiscente
(NASBA/ECL) consiste en una reaccin isoterma continua en la que no se necesita un equipamiento
especializado tipo termociclador. Se han desarrollado ensayos NASBA para la deteccin en 6 horas del
virus de la gripe aviar de los subtipos H5 y H7 en muestras clnicas (10, 18).
Parece muy probable que en muy poco tiempo la tecnologa basada en mtodos moleculares se haya
desarrollado lo suficiente para permitir realizar ensayos a pie del rebao para la deteccin de la presencia
del virus de la gripe aviar, el subtipo especfico y los marcadores de virulencia. El grado en que empleen
tales ensayos en el diagnstico de la gripe aviar depender mucho del acuerdo y la adopcin de
definiciones legales de las infecciones con vistas al control y el comercio.

En algunos pases las vacunas designadas para contener o prevenir la GAMV se encuentran prohibidas
especficamente o desaconsejadas por las agencias del gobierno porque pueden interferir con las polticas de
control de eliminacin de la enfermedad. Sin embargo, la mayora de normas de control de la GAMV se reservan
el derecho de utilizar vacunas en caso de emergencias, como ha ocurrido en Mxico y Pakistn.
Desde la dcada de 1970 en EEUU ha existido un empleo generalizado de vacunas inactivadas producidas bajo
una licencia especial con fines comerciales (16, 21, 24). Estas vacunas se han utilizado principalmente en pavos
frente a virus que no son muy patgenos pero que pueden causar graves problemas, principalmente en
circunstancias exacerbantes. Se han utilizado cantidades significativas de vacuna (15, 21). La vacuna inactivada
se prepar a partir de un virus de baja virulencia del subtipo H7N3 responsable de una serie de brotes en pavos
en Utah en 1995, y se emple junto con otras medidas para controlar tales brotes (17). Despus de la
eliminacin de los brotes de la GAMV H7N1 en Italia, resurgieron virus de baja virulencia del mismo subtipo y se
permiti la vacunacin bajo estrictas medidas de control.
La existencia de un gran nmero de subtipos vricos, junto con la conocida variacin de diferentes cepas de un
subtipo, plantea serios problemas a la hora de seleccionar cepas para producir vacunas de la gripe. Adems,
algunos aislados no crecen hasta un ttulo suficientemente elevado como para producir vacunas potentes sin
tener que realizar una concentracin previa costosa. Las vacunas producidas han sido bien endgenas, p. ej.,
preparadas a partir de aislados implicados especficamente en una epizootia, o se han preparado a partir de virus
que poseen el mismo subtipo de hemaglutinina y que proporcionan grandes concentraciones de antgeno. En
este ltimo caso en los EEUU se ha llevado a cabo cierta estandarizacin, en el sentido de que los National
Veterinary Services Laboratories han propagado y mantenido virus de la gripe de cada subtipo para su empleo
como inculo vrico en la preparacin de vacunas inactivadas (4). Estas vacunas y aquellas que se utilizaron en
Italia (9, 12) frente a virus de baja patogenicidad, y frente a GAMV en Mxico (14) y Pakistn (23), se han
preparado a partir de lquido alantoideo infectivo, inactivado con beta-propiolactona o formalina y han sido
emulsionadas con aceite mineral.
Durante el brote que tuvo lugar en Italia entre 1999-2001, fue erradicado el subtipo de GAMV H7N1, pero
resurgi un virus de la gripe aviar de baja patogenicidad. Con vistas a complementar las medidas directas de
control, se desarroll una estrategia DIVA basada en el empleo de una vacuna inactivada emulsionada en aceite
que contiene el mismo subtipo H que el virus salvaje, pero una N distinta, en este caso H7N3. Las aves
vacunadas y las infectadas naturalmente se distinguieron empleando un ensayo serolgico para detectar
anticuerpos especficos anti-N (7, 8).
La informacin que se da a continuacin se basa principalmente en la experiencia en EEUU, y en las
instrucciones y poltica para la licencia de las vacunas de gripe aviar en ese pas (34). Los principios bsicos de
produccin de vacunas, concretamente las vacunas inactivadas, son comunes a varios virus, p. ej. la enfermedad
de Newcastle (Captulo 2.1.15).
Las instrucciones para la produccin de vacunas veterinarias se dan en el Captulo I. 1. 7. Principios de
produccin de vacunas veterinarias. Las directrices que se muestran aqu y en el Captulo I. 1. 7 pretenden ser
de carcter general y pueden completarse mediante requisitos nacionales o regionales.
288
La instalacin para la produccin de la vacuna debera funcionar bajo los procedimientos y prcticas de
seguridad adecuados. Si se emplea un virus GAMV para la produccin de la vacuna o en estudios de
sensibilizacin con la vacuna, la zona de la instalacin donde se realiza este trabajo debera cumplir los
requisitos para la Contencin de los patgenos del Grupo 4 como se resume en el Apndice I.1.6.1 del Captulo
I.1.6 de este Manual de animales terrestres.
No se recomiendan las vacunas vivas convencionales de la gripe frente a ningn subtipo.
1.
Control del inculo
a)

Solamente deberan emplearse virus de la gripe tipo A bien caracterizados y de probada baja
patogenicidad, obtenidos preferiblemente a partir de un depsito nacional o internacional, para establecer el
inculo original para la obtencin de vacunas inactivadas de cualquier subtipo.
b)
Mtodo de cultivo
Se establece un inculo original, y a partir de ste un inculo de trabajo. Si la cepa ha sido clonada, el
establecimiento de un cultivo original puede implicar solamente la produccin de un gran volumen de lquido
alantoideo infectivo (mnimo 100 ml), que puede almacenarse en alcuotas liofilizadas (0,5 ml).
c)

El inculo original debera revisarse despus de su preparacin en cuanto a su esterilidad, inocuidad,
potencia y ausencia de agentes externos especficos.
2.
Mtodo de fabricacin
Para producir la vacuna, en primer lugar se establece un inculo de trabajo, a partir del cual se producen los
lotes de vacuna, mediante la expansin de una alcuota del inculo original hasta un volumen suficiente que
permita la produccin de la vacuna durante 12-18 meses. Es mejor almacenar el inculo original en forma lquida
a menos de 60 C, ya que los virus liofilizados no siempre se multiplican con ttulos altos despus del primer
pase.
Las vacunas inactivadas de la gripe preparadas a partir de virus convencionales se producen en embriones de
pollo. El mtodo de produccin consiste bsicamente en la propagacin del virus de manera asptica; todos los
procedimientos se llevan a cabo en condiciones estriles.
Es habitual diluir el inculo de trabajo en PBS estril, pH 7,2, de manera que se inoculan en la cavidad alantoidea
de 9 10 embriones de pollo SPF de diez das de edad aproximadamente 103-104 EID50 (dosis infectiva 50% por
embrin ) por 0,1 ml. Dichos embriones se incuban a 37C. Los embriones que mueren en 24 horas deberan
descartarse. El periodo de incubacin depender de la cepa de virus que se emplee y tendr que ser
predeterminado para asegurar un mximo rendimiento con el mnimo nmero de muertes de embriones.
Los embriones infectados deberan enfriarse a 4C antes de concentrarse. Se elimina la cscara de la parte
superior de los huevos y los lquidos alantoideos se aspiran despus de hundir el embrin. Deber evitarse la
inclusin de cualquier material de la yema y albmina. Todos los fluidos deberan almacenarse inmediatamente a
4C y ensayarse para la existencia de contaminacin bacteriana antes de que se preparen grandes cantidades
para ser inactivadas.
Durante la preparacin de vacunas inactivadas, el lquido alantoideo concentrado se trata, bien con formaldehdo
(una concentracin tpica es 1/1.000) o beta-propiolactona (una concentracin tpica final es 1/2.000-1/4.000). El
tiempo necesario debe ser suficiente para asegurar la ausencia de virus vivos. La mayora de las vacunas
inactivadas no se concentran; el lquido alantoideo inactivado se emulsiona normalmente con aceite mineral o
vegetal. Las formulaciones precisas generalmente son secretos comerciales.
3.
Control del proceso
En las vacunas inactivadas, la eficacia del proceso de inactivacin debera ensayarse en embriones de pollo,
tomando 25 alcuotas de 0,2 ml de cada lote y pasando cada alcuota tres veces en embriones SPF.
4.
Control del lote
La mayora de los pases han publicado especificaciones para el control de la produccin y ensayo de las
vacunas, que incluyen la definicin de las pruebas obligatorias con las vacunas durante y despus de su
fabricacin.
289
a)
Esterilidad
Las determinaciones de esterilidad y ausencia de contaminacin con materiales biolgicos pueden
encontrarse en el Captulo I.1.5.
b)
Inocuidad
En las vacunas inactivadas, se administra una dosis doble por la ruta recomendada a diez aves de 3
semanas de edad, y se observa durante 2 semanas la ausencia de signos clnicos de enfermedad o
lesiones locales.
c)
Potencia
Generalmente, en las vacunas preparadas para proteger frente a GAMV o los subtipos H5 H7 puede
emplearse un ensayo convencional de potencia que implique la utilizacin de tres dosis diluidas y la
sensibilizacin con el virus virulento (p. ej. Captulo 2.1.15.). En las vacunas inactivadas frente a otros
subtipos cuando no se encuentran disponibles virus virulentos, los ensayos de potencia pueden basarse en
la medida de la respuesta inmune o la sensibilizacin y valoracin de la morbilidad. La valoracin del
contenido de antgeno de hemaglutinina (37) puede permitir la extrapolacin in vitro de la potencia en los
siguientes lotes de vacuna.
d)
Estabilidad
Cuando se almacena bajo las condiciones recomendadas, la vacuna debera mantener su potencia durante
al menos 1 ao. Las vacunas inactivadas no deben congelarse.
e)
Conservantes
Puede utilizarse un conservante para la vacuna distribuida en contenedores multidosis.
f)
Debe tenerse cuidado en evitar la autoinyeccin con las vacunas emulsionadas en aceite.
5.
a)
Inocuidad
Ver Seccin C. 4. b. arriba
b)
Potencia
Ver Seccin C. 4. c. arriba
6.
Nuevas vacunas
Se han preparado, evaluado y utilizado en ensayos de campo en Mxico vacunas recombinantes de virus de la
viruela aviar que contienen HA H5 (15).
Se ha empleado un sistema de expresin en baculovirus para producir antgenos H5 y H7 recombinantes para su
incorporacin en vacunas (35).
El ADN que codifica la hemaglutinina H5 se ha evaluado como una vacuna potencial en aves de granja (20).
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*
* *
NB: Existen laboratorios de referencia de la OIE para la Gripe aviar muy virulenta (ver Cuadro en la Parte 3 de
este Manual de animales terrestres o consultar el sitio Web de la OIE para encontrar la lista ms actualizada:
www.oie.int).
292
CAPTULO 2.1.15.
ENFERMEDAD DE NEWCASTLE
RESUMEN
La enfermedad de Newcastle (EN) est causada por virus especficos del paramixovirus aviar de
tipo I (APMV-1) que es un serotipo del gnero Avulavirus perteneciente a la familia
Paramyxoviridae. Existen nueve serotipos de paramixovirus aviar designados desde APMV-I a
APMV-9.
Las cepas del virus de la EN varan ampliamente en cuanto a la severidad de la enfermedad que
pueden provocar en las aves. Las cepas menos patgena pueden inducir una enfermedad grave
si se exacerban por la presencia de otros organismos o mediante condiciones ambientales
adversas. El mtodo preferido de diagnstico es el aislamiento del virus y su subsiguiente
caracterizacin.
Identificacin del agente: Se preparan suspensiones en solucin antibitica de muestras
traqueales o cloacales (o heces) obtenidas de aves vivas o de heces y muestras de rganos
seleccionados procedentes de aves muertas que se inoculan en la cavidad alantoidea de
huevos embrionarios de aves de corral de 911 das de edad. Los huevos se incuban a 37C
durante 47 das. El lquido alantoideo de cualquier huevo que contenga embriones muertos o
moribundos, cuando surgen, y todos los huevos al final del periodo de incubacin se ensayan para
detectar actividad hemaglutinante.
Cualquiera de los agentes hemaglutinantes debera probarse para demostrar la inhibicin
especfica con un antisuero monoespecfico frente al virus de la EN. El virus de la EN (APMV-1)
puede mostrar alguna relacin cruzada antignica con algunos otros serotipos del paramixovirus
aviar, particularmente el APMV-3 y el APMV-7.
La patogenicidad de cualquier nuevo virus aislado se puede evaluar mediante la determinacin del
tiempo medio de muerte en embriones de pollo, el ndice de patogenicidad cerebral en polluelos
de 1 da de edad o mediante el ndice de patogenicidad intravenosa en pollos de 6 semanas. En
algunos pases se utilizan variaciones de estas tcnicas estandarizadas. La patogenicidad de los
aislados tambin se puede valorar empleando tcnicas moleculares, p. ej. la reaccin en cadena
de la polimerasa de transcripcin inversa y la secuenciacin. El aislamiento y la caracterizacin de
cepas del virus sospechosas de ser patgenas se deberan llevar a cabo en un laboratorio de
seguridad vrica.
Pruebas serolgicas: La prueba de inhibicin de la hemaglutinacin es la ms ampliamente
utilizada en la serologa del virus de la EN; su relevancia en el diagnstico depende del estado
inmune vacunal de las aves a ensayar y de las condiciones predominantes de la enfermedad.
Requisitos para las vacunas y los materiales de diagnstico: Dependiendo de la situacin de
la enfermedad, se emplean virus vivos de baja virulencia (lentognicos) o de virulencia moderada
(mesognicos) para la vacunacin de aves de corral. Tambin se utilizan vacunas inactivadas.
Las vacunas vivas se pueden administrar a las aves por diversas vas. Normalmente se preparan
mediante la extraccin de lquidos alantoideos/amniticos infectados procedentes de huevos
embrionarios de aves inoculados; algunas se preparan a partir de cultivos celulares infectados. Se
debera obtener el producto final de la expansin de los inculos original y de trabajo.
Las vacunas inactivadas se administran por va intramuscular o subcutnea. Habitualmente se
obtienen mediante la adicin de formaldehdo a preparaciones vricas infectivas o mediante
293
Captulo 2.1.15. Enfermedad de Newcastle
tratamiento con beta-propiolactona. La mayora de vacunas inactivadas se prepara para uso

mediante una emulsin con aceite vegetal o mineral.
Si se emplean formas patgenas del virus de la EN para la produccin de vacunas o en estudios
de desafo, el servicio debera cumplir los requisitos de la OIE para los patgenos del nivel de
Contencin del Grupo 4.
A. INTRODUCCIN
La enfermedad de Newcastle (EN) est causada por el paramixovirus aviar de tipo I (APMV-1), que es un
serotipo del gnero Avulavirus perteneciente a la subfamilia Paramyxovirinae, familia Paramyxoviridae. Los
paramixovirus aislados procedentes de especies aviares se han clasificado mediante pruebas serolgicas en
nueve serotipos designados desde APMV-1 a APMV-9; el virus de la EN se ha denominado APMV-1 (4).
Desde su reconocimiento en 1926, la EN se considera endmica en muchos pases. La vacunacin profilctica
se practica en casi todos los pases productores de aves de corral a escala comercial.
Una de las propiedades ms caractersticas de las cepas diferentes del virus de la EN es su enorme variacin
respecto a la patogenicidad para los pollos. Las cepas del virus de la EN se agrupan en cinco patotipos sobre la
base de los signos clnicos observados en los pollos infectados (13). Estos son:
1.
Velognico viscerotrpico: es muy patognica en la que se observan frecuentemente lesiones intestinales

hemorrgicas;
2.
Velognico neurotrpico: se presenta con mortalidad elevada, habitualmente seguida de signos

respiratorios y nerviosos;
3.
Mesognico: se presenta con signos respiratorios y signos nerviosos ocasionales pero baja mortalidad;
4.
Lentognico o respiratorio: se presenta con una infeccin respiratoria leve o subclnica;
5.
Entrico asintomtico: normalmente consiste en una infeccin entrica subclnica.
Raramente los agrupamientos en patotipos son claros (6), e incluso en infecciones de aves libres de patgenos
especficos (SPF), se puede apreciar un considerable solapamiento. Adems, puede tener lugar una
exacerbacin de los signos clnicos inducida por las cepas ms benignas si se superponen infecciones de otros
organismos o cuando se presentan condiciones medioambientales adversas.
Como los signos de la enfermedad clnica en pollos varan ampliamente y el diagnstico puede complicarse
posteriormente por las respuestas diferentes a la infeccin en los distintos hospedadores, los signos clnicos por
s solos no presentan una base fiable para el diagnstico de la EN. Sin embargo, los signos clnicos y las
lesiones asociadas con los patotipos virulentos proporcionarn una fuerte sospecha de enfermedad.
1.
a)
Muestras para el aislamiento vrico

Cuando las investigaciones de la EN son el resultado de la aparicin de enfermedad severa y mortalidad
elevada en grupos de aves, es corriente intentar el aislamiento del virus a partir de aves muertas
recientemente o aves moribundas que se sacrifican de forma indolora. Las muestras procedentes de aves
muertas deberan consistir en frotis oronasales, tanto como muestras procedentes de tejidos de pulmn,
riones, intestino (incluyendo contenidos), bazo, cerebro, hgado y corazn. Pueden ser recogidos
separadamente o en conjunto, aunque, habitualmente, las muestras intestinales se procesan de forma
separada de otras muestras.
Las muestras procedentes de aves vivas deberan incluir tanto frotis traqueales como cloacales; las ltimas
deberan estar visiblemente cubiertas de material fecal. Los pjaros pequeos y delicados pueden daarse
por el muestreo pero la recogida de heces frescas puede servir como alternativa adecuada.
En el caso de que sean limitadas las oportunidades de obtener muestras, es importante que se examinen
los frotis cloacales (o fecales) y los frotis traqueales (o tejido traqueal) tanto como los rganos o tejidos
ms afectados o asociados con la enfermedad clnica. Las muestras deberan tomarse en las etapas
tempranas de la enfermedad.
294
Se tendran que colocar las muestras en solucin salina isotnica tamponada con fosfato (PBS), pH 7,0
7,4, que contenga antibiticos. Los antibiticos pueden variar de acuerdo a las condiciones locales, pero
podra ser, por ejemplo, penicilina (2.000 unidades/ml); estreptomicina (2 mg/ml); gentamicina (50 g/ml); y
micostatina (1.000 unidades/ml) para frotis traqueales y de tejidos, pero a concentraciones cinco veces
superiores para frotis cloacales y de heces. Es importante reajustar la solucin a pH 7,07,4 despus de la
adicin de los antibiticos. Las heces y los tejidos tomados finamente deberan prepararse como
suspensiones al 1020% (p/v) en la solucin de antibitico. Las suspensiones deberan procesarse tan
pronto como fuera posible despus de una incubacin durante 12 horas a temperatura ambiente. Cuando
es impracticable el procesamiento inmediato, las muestras pueden conservarse a 4C hasta 4 das.
b)
Cultivo del virus

Los lquidos sobrenadantes de las heces o las suspensiones de tejidos obtenidos mediante la clarificacin
por centrifugacin a 1.000 g durante aproximadamente 10 minutos a una temperatura que no exceda los
25C se inoculan en volmenes de 0,2 ml en la cavidad alantoidea de cada uno de al menos cinco huevos
embrionarios de aves SPF de 911 das de incubacin. Despus de la inoculacin, se incuban a 3537C
durante 47 das. Los huevos que contengan embriones muertos o moribundos cuando surgen, y todos los
huevos que permanezcan hasta el final del periodo de incubacin, deberan enfriarse primero a 4C y
probar los lquidos alantoideos para detectar actividad de hemaglutinacin (HA). Los lquidos que den una
reaccin negativa deberan ser pasados en al menos un lote posterior de huevos.
c)
Identificacin del virus

La actividad HA detectada en lquidos bacteriolgicamente estriles recogidos a partir de huevos
inoculados puede deberse a la presencia de cualquiera de los 15 subtipos de hemaglutininas de los virus
de la gripe A o de los ocho restantes serotipos de paramixovirus. (El lquido no estril podra contener
actividad HA bacteriana). El virus de la EN puede confirmarse empleando antisuero especfico en una
prueba de inhibicin de la hemaglutinacin (HI). Habitualmente se utiliza el antisuero de pollo preparado
contra una de las cepas del virus de la EN.
Las reacciones cruzadas en las pruebas HI entre el virus de la EN y algunos otros APMVs, especialmente
los virus de los serotipos APMV-3 y APMV-7 pueden causar algunos problemas que pueden resolverse
empleando controles adecuados de antgeno y antisuero.
d)
ndices de patogenicidad
La variacin extrema en la virulencia de los diferentes aislamientos vricos de la EN y el uso generalizado
de vacunas vivas implica que la identificacin de un aislamiento como virus de la EN a partir de aves que
muestren signos clnicos no confirma un diagnstico de la EN, por lo que tambin se requiere una
valoracin de la virulencia del aislado (vase Seccin B.1.f. bajo el ttulo Definicin de la enfermedad de
Newcastle). Se investigan por parte de varios grupos en todo el mundo varias pruebas in vitro potenciales
para establecer la virulencia normalmente relacionada con la base molecular de la patogenicidad (Seccin
B.1.e. ms adelante). Hasta la fecha, una valoracin definitiva de la virulencia del virus se basa
habitualmente en una o ms de las siguientes pruebas in vivo, aunque la definicin actual de la OIE
(Seccin B.1.f. abajo) permite una valoracin molecular de la virulencia:
Tiempo medio de muerte en huevos
i)
Se diluye el lquido alantoideo infectivo, estril y fresco en solucin salina estril para preparar
diluciones decimales en serie comprendidas entre 106 y 109.
ii)
Para cada dilucin se inocula 0,1 ml en la cavidad alantoidea de cada uno de cinco huevos
embrionarios de aves SPF de 910-das de edad y entonces se incuban a 37C.
iii)
Las diluciones vricas restantes se mantienen a 4C y se inoculan otros cinco huevos con 0,1 ml de
cada dilucin 8 horas ms tarde y se incuban a 37C.
iv)
Cada huevo se examina dos veces al da durante 7 das y se registran los tiempos a los que muere
cada embrin.
v)
La dosis letal mnima es la dilucin vrica ms alta que causa la muerte de todos los embriones
inoculados con ella.
vi)
El tiempo medio de muerte (MDT) es el tiempo medio en horas en el que la dosis letal mnima
provoca la muerte de todos los embriones inoculados.
vii)
El MDT se ha utilizado para clasificar las cepas del virus de la EN dentro de los grupos siguientes:
velognico (tarda menos de 60 horas en matar); mesognico (tarda entre 60 y 90 horas en matar) y
lentognico (tarda ms de 90 horas en matar).
295
ndice de patogenicidad intracerebral
i)
El lquido alantoideo infectivo y fresco con un ttulo HA >24 (>1/16) se diluye 1/10 en solucin salina
isotnica estril sin aditivos, tales como antibiticos.
ii)
Se inyectan por va intracerebral 0,05 ml del virus diluido en diez polluelos procedentes de huevos de
un grupo de aves SPF. En el momento de la inoculacin, estos polluelos deben tener ms de
24 horas y menos de 48 horas.
iii)
Las aves se examinan cada 24 horas durante 8 das.
iv)
En cada observacin, las aves se puntan: 0 si es normal, 1 si est enferma y 2 si est muerta. (Los
individuos muertos deben puntuarse como 2 en cada una de las observaciones diarias siguientes a la
muerte).
v)
El ndice de patogenicidad intracerebral (ICPI) es la puntuacin media por ave y por observacin
durante el periodo de 8 das.
Los virus ms virulentos presentarn ndices que se aproximan a la puntuacin mxima de 2,0, mientras
que las cepas lentognicas presentarn valores prximos a 0,0.
ndice de patogenicidad intravenosa
i)
El lquido alantoideo infectivo recogido en fresco (que no debera tener ms de 2448 horas y que
debera demostrarse que est exento de contaminacin bacteriana) con un ttulo HA de >24 (>1/16)
se diluye 1/10 en solucin salina isotnica estril.
ii)
Se inyecta por va intravenosa 0,1 ml del virus diluido en diez pollos SPF de seis semanas.
iii)
Se examinan las aves a intervalos de 24 horas durante 10 das y se punta cada observacin: 0 si es
normal, 1 si est enferma, 2 si est paralizada o muestra algunos signos nerviosos y 3 si est muerta.
(Los individuos muertos deben puntuarse como 3 en cada una de las observaciones diarias
siguientes a la muerte).
iv)
El ndice de patogenicidad intravenosa (IVPI) es la puntuacin media por ave y por observacin
durante el periodo de 10 das.
Las cepas lentognicas y algunas cepas mesognicas tendrn valores IVPI de 0, mientras que los ndices
de las cepas virulentas se aproximarn a 3,0.
Se han recomendado algunas variaciones en estas pruebas. El muestreo de la cloaca y de la conjuntiva de
pollos de 8 semanas con lquido alantoideo no diluido se ha sustituido por la prueba IVPI (23). La intencin
es distinguir entre los virus velognicos viscerotrpicos y los velognicos neurotrpicos.
Interpretacin de los ndices de patogenicidad
No resulta sencilla la interpretacin de los ndices de patogenicidad obtenidos con vistas a un comercio
impositivo, o a restricciones en el movimiento u otras polticas. El objetivo es controlar las cepas que son
significativamente ms virulentas que las cepas lentognicas, tales como la Hitchner-B1 o La Sota. Como
los virus capaces de producir una enfermedad bastante severa pueden tener valores IVPI de 0, se utiliza la
prueba ICPI con ms frecuencia para tales valoraciones. Sin embargo, como en esta prueba cepas
diferentes muestran un rango de valores desde 0,00 hasta 2,00, est claro que cualquier valor utilizado
para definirlas debe regirse por el sentido prctico.
e)
Base molecular de la patogenicidad

Durante la replicacin, las partculas del virus de la EN se producen con un precursor glicoproteico, F0, que
tiene que escindirse en F1 y F2 para que las partculas vricas sean infectivas. Esta divisin posttraduccional est mediada por proteasas de la clula hospedadora. La tripsina es capaz de escindir F0 de
todas las cepas vricas de la EN.
Parece ser que las molculas F0 de los virus virulentos para los pollos pueden dividirse mediante una
proteasa del hospedador o proteasas encontradas en un rango amplio de clulas y tejidos y, de este modo,
extenderse a travs del hospedador daando rganos vitales, mientras que las molculas F0 en los virus
de baja virulencia estn limitadas en su ruptura a ciertas proteasas del hospedador, lo que resulta en la
restriccin de estos virus a replicarse slo en ciertos tipos de clulas hospedadoras.
La mayora de los virus de la EN que son patognicos para los pollos tienen la secuencia 112R/K-R-Q-K/RR116 en el extremo C-terminal de la protena F2 y un residuo de F (fenilalanina) en la posicin 117, en el
extremo N-terminal de la protena F1, mientras que los virus de baja virulencia tienen secuencias en la
misma regin de 112G/E-K/R-Q-G/E-R116 y un residuo de L (leucina) en la posicin 117. Algunos de las
296
variantes vricas de la paloma examinadas (PPMV-1) tienen la secuencia 112G-R-Q-K-R-F117, pero tienen
valores ICPI altos. De modo que parece que existe el requerimiento de al menos un par de aminocidos
bsicos en las posiciones 116 y 115 ms una fenilalanina como residuo 117 y un aminocido bsico (R) en
la posicin 113 si el virus muestra virulencia hacia los pollos.
Se han realizado diversos estudios empleando tcnicas moleculares para determinar la secuencia del
punto de escisin de F0 mediante la reaccin en cadena de la polimerasa de trascripcin inversa (RTPCR), bien en virus aislados o bien en tejidos y heces procedentes de aves infectadas, realizndose a
continuacin el anlisis del producto mediante el anlisis con enzimas de restriccin, la hibridacin con
sonda o la secuenciacin de nucletidos al objeto de establecer una prueba in vitro rutinaria para
determinar la virulencia (para una revisin vase ref.2). La determinacin de la secuencia de escisin de
F0 puede proporcionar una indicacin clara de la virulencia del virus y esto se ha incorporado a la
definicin de la EN (vase Seccin B.1.f.).
En el diagnstico de la EN es importante entender que la demostracin de la presencia del virus con
mltiples aminocidos bsicos en el punto de escisin de F0 confirma la presencia de virus virulentos o
potencialmente virulentos, pero la falta de deteccin de virus o la deteccin de virus de la EN sin mltiples
aminocidos bsicos en el punto de escisin de F0 empleando tcnicas moleculares no confirma la
ausencia de virus virulentos. Una primera correspondencia mala o la posibilidad de que en una misma
poblacin estn mezclados virus virulentos y avirulentos, implica que todava ser necesario el aislamiento
del virus y una valoracin in vivo de la virulencia.
Los anlisis recientes de virus aislados en Irlanda en 1990 y los realizados durante los brotes de la EN de
19982000 en Australia han proporcionado una clara evidencia de que los virus virulentos pueden surgir a
partir de virus progenitores de baja virulencia (5, 39). Tambin se ha generado de manera experimental un
virus virulento de la EN a partir de un virus de baja virulencia mediante pases en pollos (34).
f)
Definicin de la enfermedad de Newcastle

Parece probable que la gran mayora de aves sea susceptible a la infeccin con virus de la EN tanto de
virulencia alta como de virulencia baja para los pollos, aunque los signos clnicos observados en aves
infectadas con el virus de la EN varan ampliamente y dependen de factores tales como: el virus, la especie
hospedadora, la edad del hospedador, la infeccin con otros organismos, el estrs medioambiental y el
estado inmune. Bajo algunas circunstancias la infeccin con los virus extremadamente virulentos puede
provocar una mortalidad repentina alta con signos clnicos relativamente escasos. As que los signos
clnicos son variables y estn influidos por otros factores de modo que ninguno puede considerarse
patognomnico.
Incluso en los hospedadores susceptibles, tales como los pollos, los virus de la EN muestran un rango
considerable de virulencia. Generalmente, la variacin consiste en grupos alrededor de los dos extremos
en pruebas utilizadas para valorar la virulencia, pero, por diversas razones, algunos virus pueden mostrar
virulencia intermedia.
La variacin enorme en la virulencia y en los signos clnicos implica la necesidad de definir
cuidadosamente lo que constituye la EN para los propsitos de comercio, polticas y medidas de control.
La definicin de la EN actualmente en uso en todos los estados miembros de la Unin Europea es la que
se contempla en la Directiva 92/66/EEC (17).
La definicin de la OIE para anunciar un foco de la EN es:
La enfermedad de Newcastle se define como una infeccin de aves causada por un virus del serotipo 1
del paramixovirus aviar (APMV-1) que cumple uno de los criterios siguientes de virulencia:
a)
El virus tiene un ndice de patogenicidad intracerebral (ICPI) en polluelos de un da (Gallus

gallus) de 0,7 o superior.
o
b)
Se han demostrado en el virus mltiples aminocidos bsicos (o directamente o por deduccin)

en el extremo C-terminal de la protena F2 y un residuo de fenilalanina en la posicin 117, la
cual est en el extremo N-terminal de la protena F1. El trmino mltiples aminocidos bsicos
se refiere a que existen al menos tres residuos de arginina o lisina entre las posiciones 113 y
116. La imposibilidad de demostrar el modelo caracterstico de residuos de aminocidos como
se ha descrito anteriormente requerira la caracterizacin del virus aislado mediante una prueba
ICPI.
297
En esta definicin, los residuos de aminocidos se numeran desde el extreme N-terminal de la secuencia
de aminocidos deducida a partir de la secuencia de nucletidos del gen F0 donde las posiciones 113116
corresponden de la 4 a la 1 a partir del punto de escisin.
g)
Anticuerpos monoclonales
Se han utilizado anticuerpos monoclonales de ratn (MAbs) dirigidos contra cepas del virus de la EN en
pruebas HI para conseguir una identificacin rpida del virus de la EN sin las posibles reacciones cruzadas
con otros serotipos APMV que pueden tener lugar con sueros policlonales. Se han creado MAbs que dan
reacciones en pruebas HI y que son especficos para cepas particulares o variantes de aislados del virus
de la EN (4, 9).
Se han empleado tablas de MAbs para establecer perfiles antignicos de aislamientos del virus de la EN
basndose en si reaccionan o no con los virus. Se ha demostrado que es un mtodo valioso para agrupar y
diferenciar los aislados del virus de la EN y ha sido particularmente de valor para entender la epidemiologa
de los brotes (9).
h)
Estudios filogenticos
En los ltimos aos el desarrollo de tcnicas mejoradas para la secuenciacin de nucletidos, la
disponibilidad de datos de la secuencia de ms virus de la EN en bases de datos informatizadas y la
demostracin de que incluso longitudes de secuencia relativamente cortas pueden dar resultados
significativos en anlisis filogenticos, han conducido a un incremento considerable en tales estudios. Se
ha detectado una diversidad gentica considerable, pero los virus que comparten parmetros temporales,
geogrficos, antignicos o epidemiolgicos tienden a encuadrarlos en linajes o grupos taxonmicos
especficos, y se ha comprobado que esto es importante para valorar tanto la epidemiologa global como la
propagacin local de la EN (3, 8, 16, 24, 27, 28, 33, 3638).
Aunque en el pasado los estudios filogenticos han sido impracticables como herramienta rutinaria, en la
actualidad la mayor disponibilidad y el incremento en la velocidad de obtencin de resultados empleando
kits sofisticados y disponibles comercialmente para la RT-PCR y secuenciadores automticos permite que
tales estudios se encuentren dentro de los equipamientos de muchos ms laboratorios de diagnstico y
que puedan proporcionar resultados significativos que sean contemporneos en lugar de retrospectivos
(2).
i)
Tcnicas moleculares para el diagnstico

Adems del uso de la RT-PCR y de otras tcnicas similares para la determinacin de la virulencia de los
virus de la EN (vase Seccin B.1.e.) o para estudios filogenticos (vase Seccin B.1.h.), han habido
varias publicaciones sobre el uso de tales tcnicas moleculares para detectar el virus de la EN en muestras
clnicas, con la ventaja de la demostracin extremadamente rpida de la presencia del virus e incluso de su
virulencia si se emplean cebadores que cubran la parte del genoma que codifica el punto de escisin de F0
(12, 20, 21). Se debera tener cuidado en la seleccin de muestras clnicas ya que algunos estudios han
demostrado falta de sensibilidad en la deteccin de los virus en algunos rganos y particularmente en las
heces (20, 21, 25). Como ocurre en la determinacin de la virulencia, es importante que tales tcnicas no
se empleen solas para registrar un resultado como negativo en las investigaciones en las que se sospeche
la EN.
La EN, como se define en la Seccin B.1.f. de este captulo, est sujeta a un control oficial y el virus tiene un
riesgo elevado de propagacin a partir del laboratorio; en consecuencia, debera llevarse a cabo una valoracin
del riesgo para determinar el nivel de bioseguridad necesario para el diagnstico y la caracterizacin del virus. El
servicio debera cumplir los requisitos para el apropiado Grupo de Contencin, como se determina mediante la
valoracin del riesgo y como lo recoge el Apndice I.1.6.1 del Captulo I.1.6. de este Manual de animales
terrestres. Los pases que carezcan de acceso a tales laboratorios especializados, nacionales o regionales,
deberan enviar las muestras a un laboratorio de referencia de la OIE.
2.
Pruebas serolgicas
El virus de la EN puede emplearse como un antgeno en una variedad amplia de pruebas serolgicas, lo que
permite que se utilicen las tcnicas de neutralizacin o de enzimoinmunoensayo (ELISA) para el diagnstico. En
la actualidad, la prueba HI es la ms ampliamente utilizada. Los sueros de pollo raramente dan reacciones
positivas no especficas en esta prueba y es innecesario cualquier pretratamiento de los sueros. Los sueros
procedentes de especies distintas a las de los pollos a veces pueden causar aglutinacin de los eritrocitos
(RBC) de pollo, as que esta propiedad debera determinarse primero, y posteriormente extraer mediante
adsorcin del suero con RBC de pollo. Esto se realiza adicionando 0,025 ml de RBC de pollo empacados a cada
0,5 ml de antisueros, agitando suavemente y dejndolos durante al menos 30 minutos; a continuacin los RBC
se precipitan mediante centrifugacin a 800 g durante 25 minutos y se decantan los sueros adsorbidos.
298
En diferentes laboratorios se practican variaciones de los procedimientos para las pruebas HA y HI. Los
siguientes ejemplos recomendados emplean placas de microtitulacin de plstico y fondo en V en las que el
volumen final para ambos tipos de prueba es de 0,075 ml. Los reactivos necesarios para estas pruebas son PBS
isotnico (0,1 M), pH 7,07,2, y RBC procedentes de un mnimo de tres pollos SPF y agrupados en un volumen
igual de solucin de Alsever. (Si no se dispone de pollos SPF, se puede emplear sangre procedente de aves no
vacunadas que se controlen regularmente y muestren estar libres de anticuerpos frente al virus de la EN). Las
clulas se deberan lavar tres veces en PBS antes de usarlas como suspensin al 1% (clulas empacadas v/v).
Debera realizarse en cada prueba, de modo apropiado, un control positivo y negativo de los antgenos y de los
antisueros.
a)
Pruebas de hemaglutinacin y de inhibicin de la hemaglutinacin
Pruebas de hemaglutinacin
i)
Se distribuyen 0,025 ml de PBS en cada pocillo de una placa de microtitulacin de plstico y fondo en
V.
ii)
A cada pocillo se adicionan 0,025 ml de la suspensin vrica (p. ej. lquido alantoideo infectivo). Para
una determinacin precisa del contenido de HA, se debera hacer a partir de una serie de diluciones
muy cercanas a una inicial, p. ej. 1/3, 1/5, 1/7, etc.
iii)
A lo largo de toda la placa se practican diluciones al doble de la suspensin vrica en volmenes de

0,025 ml.
iv)
Posteriormente se adicionan a cada pocillo 0,025 ml de PBS.
v)
En cada pocillo se dispensan 0,025 ml de RBC de pollo al 1% (v/v).
vi)
La solucin se mezcla golpeando suavemente la placa. Se dejan estticos los RBC durante unos 40
minutos a temperatura ambiente, p. ej. aproximadamente a 20C, o durante 60 minutos a 4C si las
temperaturas son altas, considerando que los RBC control deberan sedimentar de una forma distinta.
vii)
La HA se determina inclinando la placa y observando la presencia o ausencia de una corriente en

forma de lgrima de los RBC. Debera leerse la titulacin a la dilucin ms alta a la que se de una HA
completa (sin corriente); esto representa 1 unidad HA (HAU) y puede calcularse de forma precisa a
partir del rango inicial de diluciones.
Prueba de inhibicin de la hemaglutinacin
i)
Se dispensan 0,025 ml de PBS en cada pocillo de una placa de microtitulacin de plstico y fondo en
V.
ii)
Se adicionan 0,025 ml de suero en el primer pocillo de la placa.
iii)
A lo largo de la placa se realizan diluciones dobles del suero en volmenes de 0,025 ml.
iv)
A cada pocillo se aaden 4 HAU de virus/antgeno en 0,025 ml y la placa se deja durante un mnimo
de 30 minutos a temperatura ambiente, p. ej. en torno a 20C, o 60 minutos a 4C.
v)
A cada pocillo se aaden 0,025 ml de RBC de pollo al 1% (v/v) y, despus de mezclar suavemente,
los RBC se dejan estticos unos 40 minutos a temperatura ambiente, p. ej. en torno a 20C, o durante
unos 60 minutos a 4C si las temperaturas del ambiente son altas, considerando que los RBC control
deberan sedimentar de una forma distinta.
vi)
El ttulo de HI es la dilucin mayor de suero que causa la inhibicin completa de 4 HAU de antgeno.
La aglutinacin se valora inclinando las placas. Debera considerarse que muestran inhibicin slo
aquellos pocillos en los que la corriente de RBC se produce a la misma velocidad que los pocillos
control (que contienen 0,025 ml de RBC y 0,05 ml de PBS).
vii)
La validez de los resultados debera evaluarse frente a un suero control negativo, que no debera
presentar un ttulo >1/4 (>22 o >log2 2 cuando se expresa como el recproco), y un suero control
positivo para el cual el ttulo debera encontrarse entre una de las diluciones del ttulo conocido.
El valor de la serologa en el diagnstico est relacionado claramente con el estado inmune esperado de
las aves afectadas. Los ttulos de HI pueden considerarse positivos si hay inhibicin a una dilucin del
suero de 1/16 (24 o log2 4 cuando se expresa como el recproco) o superior contra 4 HAU de antgeno.
Algunos laboratorios prefieren usar 8 HAU en las pruebas de HI. Mientras esto se permita, afectar a la
interpretacin de los resultados de modo que un ttulo positivo ser 1/8 (23 o log2 3) o superior. Se debera
incluir una nueva titulacin del antgeno en todas las pruebas para verificar el nmero de HAU utilizadas.
Los ttulos de HI pueden emplearse para evaluar el estado inmune de un grupo de aves. En grupos
vacunados que estn siendo controlados serolgicamente, es posible identificar respuestas anamnsicas
como resultado de una infeccin de desafo con el virus de campo (11), pero se debera proceder con gran
299
cautela porque se pueden producir variaciones por otras causas. Por ejemplo, se ha demostrado que las
infecciones por el virus APMV-3 de pavos vacunados contra el virus de la EN darn por resultado ttulos
sustancialmente elevados frente al virus de la EN (7).
Se dispone comercialmente de una variedad de kits de pruebas ELISA que se basan en diversas
estrategias para la deteccin de anticuerpos contra el virus de la EN, incluyendo ELISA indirecto, tipo
sndwich y de bloqueo o competitivo, que emplean MAbs. Al menos uno de los kits utiliza una subunidad
antignica. Habitualmente estas pruebas se han validado y evaluado por el fabricante y, por tanto, es
importante que para su uso, se sigan cuidadosamente las instrucciones especificadas.

Se ha publicado una descripcin detallada de todos los aspectos de las vacunas del virus de la EN, incluyendo
su produccin y usos (11) y debera consultarse para conocer los detalles de los procedimientos que aqu se
recogen. En el Captulo I.1.7. Principios de produccin de vacunas veterinarias, se indican las directrices para la
produccin de este tipo de vacunas. Las directrices dadas aqu y en el Captulo I.1.7 pretenden ser de carcter
general y pueden complementarse en el caso de que existan requisitos regionales y nacionales.
En esta seccin se considerarn vacunas convencionales vivas e inactivadas, porque todava se emplean
universalmente. Sin embargo, se debera recordar que existen muchos trabajos recientes sobre la aplicacin de
tcnicas de biologa molecular en la produccin de nuevas vacunas y hay constancia del xito en la obtencin
de inmunidad protectora con virus recombinantes de la viruela aviar, el virus vacunal, el virus de la viruela de la
paloma, el herpesvirus del pavo y las clulas aviares en las que se expresan el gen HN, o el gen F, o los dos
genes, del virus de la EN. En algunos pases se ha autorizado el uso de varios de estos virus recombinantes.
Las cepas vricas de la EN empleadas en las vacunas comerciales de virus vivos se encuadran en dos grupos:
vacunas lentognicas tales como Hitchner-B1, La Sota, V4, NDW, I2 y F, y vacunas mesognicas, tales como
Roakin, Mukteswar y Komarov. Las cepas de ambos grupos han sido seleccionadas y clonadas para satisfacer
los diferentes criterios en su produccin y aplicacin. Todos los virus de vacunas mesognicas tienen dos pares
de aminocidos bsicos en el punto de escisin F0 y valores ICPI de aproximadamente 1,4. Esto significa que
las infecciones de aves con estos virus entraran dentro de la definicin propuesta para la EN (Seccin B.1.f.)
pero como estas vacunas se emplean principalmente en pases donde la EN es endmica, este hecho puede
que no excluya necesariamente su uso.
El servicio de produccin de vacunas debera operar bajo los procedimientos y prcticas apropiados de
bioseguridad. Si la EN, como se define en la Seccin B.1.f. de este captulo, se utiliza para la produccin de
vacunas o para estudios de desafo de la vacuna, la parte del servicio donde se realice el trabajo debera
cumplir los requisitos para los patgenos del nivel de Contencin del Grupo 4, como se recoge en el Apndice
I.1.6.1 del Captulo I.1.6 de este Manual.
La mayora de vacunas con virus vivos crecen en la cavidad alantoidea de huevos embrionarios de aves pero
algunas, notablemente algunas cepas mesognicas, se han adaptado a una variedad de sistema de cultivos de
tejidos.
Las vacunas con virus vivos pueden administrarse a las aves incorporndolas en el agua de bebida,
administrndose como un spray grueso o mediante instilacin conjuntival o intranasal. Algunas cepas
mesognicas se obtienen por inoculacin intradrmica en la membrana del ala. Se han preparado vacunas que
dan resultados ptimos mediante la aplicacin de vas especficas. En general, las vacunas vivas ms
inmunognicas son ms virulentas y, por tanto, es ms probable que causen efectos secundarios adversos. Por
ejemplo, la vacunacin con la cepa La Sota causar problemas considerablemente mayores en aves
susceptibles jvenes que la cepa Hitchner-B1, aunque La Sota induce una respuesta inmune ms fuerte.
Las vacunas inactivadas se consideran ms caras que las vacunas vivas y su empleo entraa la manipulacin e
inyeccin de aves individuales. Se preparan a partir de lquido alantoideo al que se inactiva su infectividad
mediante la adicin de formaldehdo o beta-propiolactona. Se incorpora en una emulsin con aceite mineral y se
administra por va intramuscular o subcutnea. As las aves individuales reciben una dosis estndar. No se
produce la propagacin subsiguiente del virus ni reacciones respiratorias adversas. Se utilizan tanto cepas
virulentas como avirulentas como inculo vrico aunque, desde el punto de vista del control de la seguridad, el
uso de stas ltimas parece menos adecuado. Como despus de la administracin no se produce la
multiplicacin vrica, se requiere una cantidad de antgeno para la inmunizacin mucho mayor que en el caso de
la vacunacin con virus vivos. Es importante un rendimiento elevado de virus para producir una vacuna potente,
y, para este propsito, es muy adecuada la cepa Ulster 2C.
La duracin de la inmunidad depende del programa de vacunacin elegido. Una de las consideraciones ms
importantes que afectan a los programas de vacunacin es el nivel de inmunidad maternal de los pollos jvenes
300
que puede variar considerablemente de granja a granja, de lote a lote y entre pollos individuales. Por esta razn,
se emplean diversas estrategias. O los pjaros no se vacunan hasta las 2-4 semanas de vida cuando la mayora
de ellos ser susceptible, o se vacunan con 1 slo da de vida por instilacin conjuntival o mediante la aplicacin
de un spray grueso. Se establecer una infeccin activa en algunas aves que persistir hasta que la inmunidad
maternal decrezca. Entonces, se llevar a cabo una revacunacin 3-4 semanas ms tarde. Se ha demostrado
que las vacunas inactivadas tambin pueden ser empleadas adecuadamente para vacunar polluelos de 1 da
que tienen cierto grado de inmunidad maternal (15), y los mejores resultados se han obtenido cuando a los
polluelos maternalmente inmunes de 1 da se les da una combinacin de vacunas viva e inactivada, comparada
con vacunas vivas o inactivadas dadas de forma separada (14). La vacunacin de aves de 1 da totalmente
susceptibles, incluso con las vacunas vivas ms suaves, puede provocar en enfermedad respiratoria,
especialmente si estn presentes en cantidad significativa bacterias patgenas comunes.
Normalmente se practica una vacunacin despus de 3 semanas de vida slo en gallinas de crianza y gallinas
de puesta. Se debera llevar a cabo con intervalos de suficiente frecuencia para mantener una inmunidad
adecuada. Los programas de vacunacin emplean con frecuencia vacunas con virus vivos un poco ms
patognicos para reforzar la inmunidad de las usadas inicialmente. Tambin pueden usarse estas vacunas vivas
ms patognicas despus de una vacunacin inicial con vacunas inactivadas en emulsin de aceite.
Cuando se disea un programa de vacunacin, debera tenerse en consideracin el tipo de vacuna utilizada, el
estado inmune y de enfermedad de las aves a vacunar y el nivel de proteccin requerido en relacin a cualquier
posibilidad de infeccin con el virus de campo bajo las condiciones locales (11). Aqu se indican dos ejemplos
de programas de vacunacin que pueden utilizarse en diferentes circunstancias de enfermedad. Para el primer
ejemplo, cuando la enfermedad es leve y espordica se sugiere que se adopte el siguiente orden de
vacunacin: vacuna viva Hitchner-B1 mediante administracin conjuntival o de spray a 1 da de edad; vacuna
viva Hitchner-B1 o La Sota a los 1821 das de vida en el agua de bebida; vacuna viva La Sota en el agua de
bebida a las 10 semanas de vida y una vacuna inactivada en emulsin de aceite en el momento de la puesta.
Para el segundo ejemplo, cuando la enfermedad es severa y ms extendida, se adopta el mismo protocolo ya
indicado hasta los 21 das de vida y a esto le sigue la revacunacin a los 3542 das de vida con la vacuna viva
La Sota en el agua de bebida o como spray; esta revacunacin se repite a las 10 semanas de vida con una
vacuna inactivada (o una vacuna viva mesognica) y de nuevo se repite en el momento de la puesta (11).
1.
Control del inculo
a)

El primer principio a considerar cuando se selecciona una cepa para una vacuna viva del virus de la EN es
si se va a usar como vacuna primaria o secundaria, siendo su patogenicidad las principal consideracin.
Los mtodos de aplicacin y frecuencia de uso son consideraciones vlidas. El uso de MAb ha demostrado
una variacin considerable en la antigenicidad de cepas diferentes (9). Esto puede indicar la necesidad de
adaptar las vacunas ms cuidadosamente a virus antignicamente relacionados con cualquier virus de
campo predominante.
Se ha introducido una vacuna viva basada en la cepa V4 del virus de la EN, seleccionada por su
estabilidad al calor, para combatir los problemas especficos asociados con la crianza del pollo campero en
los pases en desarrollo. La intencin es que esta vacuna pueda estar protegida por el alimento para los
pollos que se alimentan de restos. Hasta la fecha, los ensayos realizados en diferentes pases han
producido resultados mezclados; bien puede ser que los factores locales sean extremadamente
importantes afectando al xito de esta estrategia (35). Ms recientemente se ha desarrollado la vacuna
I2 termoestable especficamente para la vacunacin de los pollos camperos; actualmente se recomienda
que esta vacuna se suministre mediante gota al ojo (1).
El uso de vacunas vivas puede estar restringido por la legislacin. Por ejemplo, la Decisin de la Comisin
93/152/EEC (18) restringe el uso de vacunas en los estados miembros de la Unin Europea desde el 1 de
Enero de 1995 a aquellos para los que el inculo original se ha probado y muestra tener un ICPI <0,4 si se
administran a cada ave no menos de 107 dosis infectivas de huevo (EID50), o <0,5 si se administran a cada
ave no menos de 108 EID50. De manera similar, la Comisin de Estndares de la OIE ha recomendado que
mientras en principio las vacunas deberan tener un ICPI < 0,7 para poder explicar la variabilidad entre
distintos ensayos y laboratorios, se tendra que admitir un margen de seguridad con objeto de que las
cepas vricas del inculo original para la fabricacin de vacunas no tengan un ICPI que exceda el valor 0,4
(30).
La consideracin ms importante en la seleccin de un inculo para preparar una vacuna inactivada es la
cantidad de antgeno producida cuando crece en huevos embrionarios; raramente es rentable concentrar el
virus. Se han usado tanto cepas virulentas como lentognicas para preparar vacunas inactivadas, pero las
primeras ofrecen un riesgo innecesario porque supone la manipulacin de grandes cantidades de virus
virulentos as como el peligro de una inactivacin inadecuada y la posible contaminacin consiguiente.
Este riesgo est contemplado en la Decisin de la Comisin 93/152/EEC (18), que restringe el uso de virus
301
para la fabricacin de vacunas inactivadas en los estados miembros de la Unin Europea a partir del 1 de
enero de 1995 a aqullos para los cuales se ha probado el inculo original y muestra tener un ICPI <0,7 si
se administra a cada ave no menos de 108 EID50. Algunas cepas lentognicas crecen hasta niveles muy
altos en los huevos. Se pueden obtener ttulos excepcionalmente elevados mediante la cepa Ulster 2C, la
cual se recomienda como inculo para la vacuna inactivada (22). Sin embargo, cuando se usan como
inculos las cepas Hitchner B1, La Sota o F se consiguen vacunas inactivadas con xito comercial.
b)
Mtodo de cultivo
Se establece un inculo original y a partir del mismo un inculo de trabajo. Si la cepa se ha clonado
mediante dilucin limitante o seleccin en placa, el establecimiento de un cultivo maestro slo puede
implicar la produccin de un gran volumen de lquido alantoideo infectivo (como mnimo 100 ml), que
puede conservarse en forma de alcuotas liofilizadas (0,5 ml).
c)

A los virus del inculo de origen desconocido se les debera realizar pases a travs de huevos SPF y ser
clonados antes de producir el inculo original. Tambin puede ser conveniente algn pase a travs de
pollos SPF (11). En cualquier caso, despus de su preparacin, el inculo original se debera comprobar
su esterilidad, seguridad, potencia y presencia de agentes extraos.
2.
Mtodo de produccin
Para la produccin de la vacuna, primero se establece un inculo de trabajo, a partir de cualquiera de los lotes
de vacuna producidos, mediante la expansin de una alcuota del inculo original hasta un volumen suficiente
para permitir la produccin de la vacuna durante 1218 meses. Es mejor conservar el inculo de trabajo de
forma lquida a una temperatura de 60C o inferior porque el virus liofilizado no siempre se multiplica hasta un
ttulo alto en el primer pase subsiguiente (11).
La mayora de las vacunas de la EN se producen en huevos embrionarios de ave y las vacunas de virus vivos
deberan producirse en huevos SPF. El mtodo de produccin es la propagacin del virus asptica y a gran
escala; todos los procedimientos se llevan a cabo bajo condiciones de esterilidad.
Es habitual diluir el inculo de trabajo en PBS estril, pH 7,2, de modo que aproximadamente se inoculan 103
104 EID50/0.1 ml en la cavidad alantoidea de huevos embrionarios SPF de 9 o 10-das de vida. A continuacin
se incuban a 37C. Se deberan desechar los huevos que contengan embriones muertos en las 24 horas. El
tiempo de incubacin depender de la cepa vrica utilizada y se predeterminar para asegurar una produccin
mxima con el nmero mnimo de muerte de embriones.
Los huevos infectados deberan enfriarse a 4C antes de recogerse. Se quitan las partes superiores de los
huevos y se aspiran los lquidos alantoideos despus de la eliminacin del embrin. Debera evitarse la inclusin
de cualquier resto de yema o de albmina. Se deberan conservar todos los lquidos inmediatamente a 4C y
comprobar la ausencia de contaminacin bacteriana antes de preparar grandes cantidades para la liofilizacin o
inactivacin. Normalmente, las vacunas vivas se liofilizan. La metodologa depende de los aparatos utilizados y
de la pericia de los fabricantes, pero esta es una etapa muy importante ya que una liofilizacin inadecuada
resulta tanto en prdidas de ttulo como en un periodo de validez reducido.
En la produccin de vacunas inactivadas, se trata el lquido alantoideo recogido con formaldehdo (una
concentracin final tpica es 1/.1.000) o beta-propiolactona (una concentracin final tpica es 1/2.0001/4.000).
El tiempo requerido debe ser suficiente para asegurar que est libre de virus vivos. La mayora de vacunas
inactivadas no se concentran; el lquido alantoideo inactivado normalmente se emulsiona con aceite mineral o
vegetal. Generalmente, las frmulas exactas son secretos comerciales.
Generalmente, las vacunas inactivadas basadas en aceite se preparan como emulsiones primarias de agua en
aceite. Habitualmente, la fase oleosa consiste en nueve volmenes de aceite mineral altamente refinado, tal
como Marcol 52, Drakeol 6VR y BayolF, ms un volumen de agente emulsionante, tal como Arlacel A,
Montanide 80 y Montanide 888 (31). La fase acuosa es el virus inactivado al que se le adiciona un emulsionante
no inico como Tween 80. Normalmente la relacin fase oleosa a fase acuosa es de 1:1 hasta 1:4. Los
fabricantes se esfuerzan para conseguir un balance entre el efecto adyuvante, la viscosidad y la estabilidad. Si
la viscosidad es demasiado alta, la vacuna ser difcil de inyectar; si es demasiado baja, la vacuna es inestable.
3.
Control del proceso
Cada lote de vacuna con virus vivo debe probarse en cuanto a su viabilidad y potencia. Para aqullas
producidas en huevos, el control ms importante del proceso es comprobar la ausencia de contaminacin
302
bacteriana y fngica. Esto es necesario debido a la aparicin ocasional de huevos en estado de putrefaccin
que pueden no ser detectados hasta el momento de la recogida.
Para las vacunas inactivadas debe probarse la eficacia del proceso de inactivacin en huevos embrionarios,
tomando 25 alcuotas (0,2 ml) de cada lote y realizando pases cada tres veces a travs de embriones SPF (11).
4.
Control de lotes
La mayora de los pases han publicado especificaciones para el control de la produccin y comprobacin de las
vacunas del virus de la EN (p. ej. ref. 29), que incluyen la definicin de las pruebas obligatorias en vacunas
durante y despus de su manufactura.
Es necesario probar la infectividad de las vacunas con virus vivos para conseguir que se administren los niveles
adecuados de virus. Habitualmente se titula el virus en huevos embrionarios de aves hasta conseguir la EID50.
Esto implica realizar diluciones a la dcima del virus; se inoculan 0,1 ml de cada dilucin en entre cinco y siete
huevos embrionarios de aves de 910 das de vida. Despus de 57 das de incubacin a 37C, los huevos se
enfran y se prueban para demostrar su actividad hemaglutinante, que es una indicacin de la presencia del
virus vivo. La EID50 a punto final se calcula empleando una formula estndar tal como la de SpearmanKrber
(10).
a)
Esterilidad
Las pruebas para determinar que los materiales biolgicos estn estriles y libres de contaminacin se
encuentran en el Captulo I.1.5.
b)
Inocuidad
El uso de pollos para la comprobacin de las vacunas supone la inoculacin de diez o ms aves de la edad
indicada que procedan de un grupo SPF. Se administrarn diez dosis de vacuna viva por va
supraconjuntival a cada ave y a continuacin las aves se mantendrn en observacin durante 21 das.
Ningn pollo debera mostrar signos clnicos serios y ninguno debera morir por causas atribuibles a la
vacuna (19).
En el caso de las vacunas inactivadas, se administrar una dosis doble por la va recomendada a diez aves
de 3 semanas de edad y se mantendrn en observacin durante 2 semanas para comprobar la ausencia
de signos clnicos de enfermedad o lesiones locales.
c)
Potencia
Se han propuesto varios mtodos para comprobar la potencia de las vacunas del virus de la EN. Se ha
subrayado la importancia de usar una adecuada cepa de desafo para la valoracin (11). Una cepa
adecuada es la Herts 33. Para las vacunas vivas, el mtodo recomendado (19) supone la vacunacin de
20 aves SPF u otras completamente susceptibles a la mnima edad recomendada por la va sugerida,
empleando la dosis mnima recomendada. Despus de 1421 das, cada ave vacunada y diez aves control
se desafan por va intramuscular con 105 LD50 (dosis letal 50%) del virus de desafo de la EN. La vacuna
pasa la prueba si al cabo de 10 das el 90% de los pollos vacunados sobrevive sin sntomas de
enfermedad, pero todos los controles mueren en 6 das.
Para las vacunas inactivadas, se emplean pollos SPF o susceptibles de 2128-das. Se inyectan por va
intramuscular tres grupos de 20 aves con volmenes de vacuna equivalentes a 1/25, 1/50 y 1/100 de una
dosis. Se mantiene un grupo de diez pollos como control. Se desafan todas las aves mediante inyeccin
intramuscular de 106 LD50 del virus de desafo de la EN, 1721 das ms tarde. Se observan los pollos
durante 21 das. La PD50 (dosis protectora 50%) se calcula mediante mtodos estadsticos estndar. La
prueba slo es vlida si todas las aves control de desafo mueren en 6 das. La vacuna cumple con la
prueba si la PD50 no es menos que 50 por dosis y si el lmite de confianza menor no es menos que
35 PD50 por dosis. Algunas autoridades de control aceptan una prueba slo a 1/50, por razones de sanidad
animal.
No es necesario repetir la prueba de potencia en cada lote si se ha demostrado que ha pasado la prueba
un lote representativo del producto final procedente del inculo original.
d)
El nivel de inmunidad alcanzado con cualquier dosis nica o rgimen de vacunacin de la EN, variar
enormemente tanto con la vacuna como con la especie hospedadora. Es extremadamente complejo y
difcil de evaluar el nivel de inmunidad requerido en un hospedador dado (p. ej. para proteger contra la
muerte, la enfermedad, las prdidas de produccin de carne o huevos). Generalmente, se debera hacer
303
alguna evaluacin de la longevidad de los anticuerpos del suero y adoptarse regmenes de vacunacin
para mantener stos por encima de un nivel aceptable (11).
e)
Estabilidad
El producto o vacuna final, cuando se almacena bajo las condiciones recomendadas, debera mantener su
potencia durante al menos 1 ao. Las pruebas de estabilidad acelerada, tales como la reduccin de la
infectividad seguida de la incubacin a 37C durante 7 das (26), pueden utilizarse como una gua para las
capacidades de almacenaje de un lote de vacuna viva. Las vacunas en emulsin de aceite, tambin
deberan someterse a un agente acelerador mediante almacenamiento a 37C, durante un mnimo de un
mes, sin separacin de las fases acuosa y oleosa. Las vacunas con virus vivos deben emplearse
inmediatamente despus de su reconstitucin. Las vacunas inactivadas no se deben congelar.
f)
Conservantes
Para las vacunas vivas no se deben incluir conservantes en el producto liofilizado, pero los conservantes
antimicrobianos pueden incorporarse en el diluyente utilizado para reconstituir la vacuna.
g)
Las vacunas vivas de la EN pueden representar un riesgo para los humanos. Se ha informado de que los
virus de la EN, tanto los virulentos como los poco virulentos para los pollos, han infectado a humanos,
causando normalmente conjuntivitis aguda despus de la introduccin directa en el ojo. Habitualmente, las
infecciones son transitorias y no afectan a la crnea.
Las vacunas en emulsin de aceite mineral representan un riesgo serio para el vacunador. La inyeccin
accidental de humanos debera tratarse con prontitud mediante la incisin y el lavado de la zona, como
para el caso de una herida por inyeccin de grasa.
5.
a)
Inocuidad
Vase Seccin C.4.b. arriba
b)
Potencia
Vase Seccin C.4.c. arriba.
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*
* *
NB: Existen laboratorios de referencia de la OIE para la enfermedad de Newcastle (vase Cuadro en la Parte 3
de este Manual de animales terrestres o consulte la pgina Web de la OIE para una lista ms actualizada:
www.oie.int).
306
SECCIN 2.2.
ENFERMEDADES DE VARIAS ESPECIES

EN LA LISTA B
CAPTULO 2.2.1.
CARBUNCO
RESUMEN
El carbunco es primariamente una enfermedad de animales herbvoros, aunque todos los
mamferos, incluyendo los humanos, y al menos algunas especies aviares pueden contraerla. La
mortalidad puede ser muy alta, especialmente en herbvoros. El agente etiolgico es Bacillus
anthracis, que forma esporas, es Gram positivo y tiene forma bacilar. La enfermedad tiene
distribucin mundial y es una zoonosis. El carbunco es importante en la industria de produccin
animal, en algunas poblaciones de vida salvaje, y para los humanos, especialmente para aquellos
que por motivos ocupacionales estn expuestos a esta enfermedad.
Esta enfermedad est mediada por exotoxinas. Se han descrito formas hiperagudas, agudas,
subagudas y raramente crnicas de la enfermedad. Las seales clnicas ante-morten pueden estar
virtualmente ausentes en las formas hiperagudas y agudas de la enfermedad. La forma subaguda
de la enfermedad puede estar acompaada de fiebre progresiva, depresin, inapetencia, debilidad,
postracin y muerte. La enfermedad crnica puede mostrar hinchazn localizada, fiebre y
agrandamiento de ndulos linfticos; puede ocurrir la muerte si se obstruye el tracto respiratorio.
Un examen post-mortem de animales recin muertos (que debe llevarse a cabo con mucho
cuidado para evitar la infeccin de quien est haciendo el examen o la contaminacin ambiental)
puede mostrar un nmero indeterminado de lesiones, ninguna de las cuales tiene suficiente
entidad como para ser considerada patognomnica de la enfermedad o ser por completo
consecuente. Las lesiones que se ven con ms frecuencia son una septicemia generalizada
acompaada a menudo de un bazo agrandado, con consistencia de "mermelada de mora" y
sangre poco coagulada. Las hemorragias nasales, bucales y/o anales en el momento de la muerte
no constituyen un sntoma comn.
Identificacin del agente: La visualizacin de los bacilos encapsulados, generalmente en gran
nmero, en frotis de sangre teida con azul de metileno policrmico (reaccin de M'Fadyean) es un
diagnstico completo. Bacillus anthracis se asla de la sangre o de los tejidos de un animal recin
muerto de carbunco en cantidades relativamente grandes, y en cultivo puro, sobre cualquier medio
slido incubado aerbicamente a 37C. Su apariencia caracterstica sobre medio slido con sangre
hace de ste el medio de eleccin. A medida que se descompone la res muerta, especialmente en
climas clidos, las bacterias responsables de la putrefaccin compiten con el organismo infeccioso
dentro del cadver y finalmente lo eliminan. En estos casos la confirmacin del carbunco puede
depender del aislamiento del suelo que resulta contaminado por las descargas terminales.
La morfologa de las colonias de B. anthracis es caracterstica despus de su incubacin durante la
noche en agar sangre. La colonia es relativamente grande, de aproximadamente 0.3-0.5 cm de
dimetro. Su color vara del blanco grisceo al gris, no es hemoltica, presenta apariencia rugosa y
vtrea y tiene una consistencia muy adhesiva y pegajosa. A veces se ven masas microbianas
307
Captulo 2.2.1. Carbunco
radiales aisladas y unidas a la colonia principal, todas en la misma direccin. Esta caracterstica se
ha descrito como morfologa en "cabeza de medusa".
Las clulas vegetativas de B. anthracis son grandes, de 3-5 m de largo y aproximadamente 1 m
de ancho. Al final de la fase de crecimiento exponencial se forman esporas centrales elipsoidales,
que no hinchan el esporangio. Las clulas se tien fuertemente como Gram positivas y se ven
largas cadenas de clulas in vitro, mientras que in vivo se ven parejas o cadenas cortas. En el
tejido infectado los bacilos estn encapsulados, pero esta caracterstica se pierde cuando la
bacteria se crece in vitro aerbicamente. La formacin de cpsula puede inducirse incubando en
sangre de caballo desfibrinada durante al menos 5 horas, o cultivando el aislado en agar nutritivo
que contenga 0.7% de bicarbonato sdico e incubando a 37C en presencia de CO2.
Otras pruebas de laboratorio, adicionales y tiles, son la ausencia de movilidad, la susceptibilidad
diagnstica al bacterifago "gamma" y la sensibilidad a la penicilina. Se aconseja precaucin
cuando se usan estas pruebas, ya que se ha demostrado que algunos genotipos son resistentes al
fago gamma y a la penicilina. En la actualidad se pueden usar cebadores disponibles para mostrar
la presencia de los genes de la toxina y de la cpsula mediante reaccin en cadena de la
polimerasa como confirmacin de la virulencia, sustituyendo a la inoculacin animal. Una prueba
de termoprecipitina describa por Ascoli en 1911 se usa an en algunos pases para proporcionar
evidencia retrospectiva de la existencia de carbunco en cadveres descompuestos o en productos
animales.
Pruebas serolgicas: La deteccin de anticuerpos en suero de animales infectados se usa
raramente para diagnosis y es esencialmente una herramienta de investigacin. El procedimiento
actualmente predominante es el enzimoinmunoensayo (ELISA).
Requisitos para las vacunas y los materiales de diagnstico: La vacuna del carbunco usada
ms ampliamente en ganadera, desarrollada por Max Sterne en 1937, es una forma viva
esporulada, no encapsulada, mantenida en suspensin. En Rusia y algunos pases de Europa del
Este, se usa un tipo equivalente de vacuna (cepa 55). La vacuna Pasteur ya no se usa en Italia. Se
ha desarrollado una nueva vacuna, Carbosap, que retiene ambos plsmidos y muestra muy poca
virulencia. En las directrices del carbunco de la Organizacin Mundial de la Salud se proporciona
una lista de productores (14).
No existen requisitos estandarizados para materiales de diagnstico. El fago gamma de
diagnstico puede obtenerse, por ejemplo, de los Centros para Control y Prevencin de
Enfermedades de los Estados Unidos1 o de varias centrales veterinarias o laboratorios de
referencia del carbunco.
A. INTRODUCCIN
El carbunco es fundamentalmente una enfermedad de animales herbvoros, aunque algunos mamferos,
incluyendo los humanos, y al menos algunas especies aviares pueden contraerlo. La mortalidad puede ser muy
alta, especialmente en herbvoros. El agente etiolgico es Bacillus anthracis, formador de esporas, Gram-positivo
y con forma bacilar, el nico patgeno obligado dentro del gnero Bacillus. La mayora del resto de especies de
Bacillus, son saprofitas frecuentes en el medio ambiente, aunque algunos, particularmente B. cereus,
B. licheniformis y B. subtilis, se asocian en ocasiones con intoxicaciones alimenticias en el hombre y con otras
manifestaciones clnicas tanto en humanos como en animales.
El carbunco animal se presenta en al menos tres formas diferentes: la forma hiperaguda o apoplctica, la forma
aguda, y la forma subaguda o crnica. Los rumiantes son los ms propensos a manifestar las formas
hiperagudas y agudas, los caballos la forma aguda, y los perros, gatos y cerdos, una forma subaguda, crnica o
localizada. En la enfermedad hiperaguda, los signos que preceden a la muerte son a menudo inapreciables. La
historia clnica suele describir que unas pocas horas antes de la muerte el animal est en buenas condiciones. Si
se observa al animal inmediatamente antes de la muerte, los sntomas ms comunes son fiebre hasta 42C
(107F), temblores musculares, disnea y congestin de las mucosas. Poco despus, el animal tiene a menudo
convulsiones terminales, colapso y luego muere. Despus de la muerte se puede ver a veces exudacin de
sangre no coagulada por el ano, la vulva, las narices y/o la boca. Tambin es usual un rigor mortis incompleto.
308
The Division of Bacterial and Mycotic Diseases, Centers for Disease Control, 1600 Clifton Road, Atlanta, Georgia 30333,
United States of America.
La forma aguda puede ocurrir en el ganado y se pueden observar sntomas clnicos 48 horas antes de la muerte,
tales como depresin, anorexia, fiebre, respiracin rpida, aceleracin cardiaca, congestin de las membranas
mucosas e hinchamientos edematosos. La forma aguda se presenta normalmente en caballos y depende del
sitio de exposicin. Signos de enteritis y clico se acompaan con fiebre alta y depresin. La muerte ocurre, por
lo general, entre las 48-96 horas. Las esporas introducidas subcutneamente, por ejemplo, por insectos
picadores, provocan un hinchamiento local edematoso y caliente que se extiende al cuello, trax, abdomen,
prepucio o glndula mamaria. Tambin puede aparecer disnea debida al hinchamiento del cuello con la
consiguiente compresin de la trquea. La duracin de la enfermedad es normalmente de 1-3 das, aunque
algunos animales sobreviven durante una semana o ms.
La forma subaguda o crnica del carbunco aparece en cerdos domsticos y salvajes, en perros y en gatos. La
bacteria infecciosa penetra normalmente cuando el hospedador se alimenta de una fuente contaminada. El
organismo tiende a localizarse en los ndulos linfticos regionales del rea farngea, donde puede ocurrir un
hinchamiento grave, ocasionando la muerte por oclusin de la va respiratoria. En los casos en que esto no
ocurre, puede desarrollarse una bacteriemia fatal, aunque resulta relativamente comn la recuperacin despus
de unos das de enfermedad. En carnvoros y omnvoros tambin aparece una forma intestinal con gastroenteritis
aguda grave.
La sospecha de la existencia de carbunco depender de sntomas, tales como muerte sbita con o sin
hemorragia por los orificios y rigor mortis incompleto, o de la historia del lugar, la manada, etc. Si se sospecha
que puede ser carbunco, se hace un frotis delgado sobre un porta de microscopio con una pequea gota de
sangre. La sangre se puede obtener haciendo un pequeo corte en una vena de la oreja o de cualquier vena
disponible con una jeringa (ha de tenerse cuidado en evitar contaminar el ambiente o al operador). El frotis de
sangre se seca al aire, se fija por inmersin in alcohol de 95-100% durante 1 minuto y se decolora con azul de
metileno policrmico (se dan ms detalles ms adelante). La presencia de un bacilo encapsulado semejando
furgones del ferrocarril en pares o en cadenas cortas, generalmente en gran nmero, es prueba definitiva de
carbunco. Frotis hechos de la sangre que sale de cualquiera de los orificios revelar los bacilos encapsulados,
pero pueden contaminarse con otros organismos o artefactos. Se pueden tambin tomar muestras de la sangre
para cultivo.
En casos confirmados o sospechosos, para evitar la contaminacin ambiental, es normal no llevar a cabo una
necropsia de la res muerta. Si se abre el cadver para una necropsia o lo hacen animales carroeros, la forma
vegetativa de B. anthracis se liberar del entorno cido de la descomposicin y producir esporas que crearn
focos de contaminacin. En algunos pases, los anlisis post morten estn prohibidos. Sin embargo, los
hallazgos despus de anlisis post morten estn bien documentados. No hay lesiones patognomnicas grandes
y se ven considerables similitudes con otras causas txicas o infecciosas de muerte aguda. Es frecuente la
sangre oscura poco coagulada, el bazo pulposo agrandado con consistencia de "mermelada de mora", y
mltiples hemorragias petequiales caractersticas de septicemia. En los caballos, los hallazgos post morten
pueden ser similares a los de los rumiantes, pero a veces pueden consistir simplemente en lesiones edematosas
confinados a la garganta y cuello sin involucrar a rganos internos. En omnvoros (cerdos) y carnvoros, se
pueden dar sntomas de septicemia como los descritos para los rumiantes, pero se produce con ms frecuencia
un extenso edema e inflamacin en el rea farngea. Si el foco de la infeccin est en el tracto gastrointestinal,
se puede ver inflamacin grave, a veces con hemorragia y necrosis, en el estmago, intestino y ndulos linfticos
mesentricos, acompaada de peritonitis y excesivo lquido peritoneal.
La descomposicin natural de una res muerta destruye la mayor parte de los organismos vegetativos por la
accin de bacterias que causan la putrefaccin. Esto puede ocurrir en uno o dos das en climas clidos si la res
muerta no se toca. Puede que los bacilos encapsulados no se vean fcilmente en frotis de muestras de sangre
tomadas despus de que esto haya sucedido, a pesar de que la sangre puede dar positiva para cultivos durante
un da o ms. Puede ocurrir cierta esporulacin en los fluidos exudados a travs de las aberturas naturales del
cuerpo y, especialmente si la res muerta ha sido abierta por carroeros, se pueden dispersar muchas esporas al
medio ambiente. Muestras de fluidos congelados o muestras de suelo contaminado por los fluidos es probable
que desarrollen B. anthracis en cultivo. El cultivo de muestras de suelo puede ser la mejor forma de confirmar
que la muerte fue debida a carbunco en reses muertas putrefactas.
Eliminacin despus de la recogida de muestras
La adecuada eliminacin por incineracin de una res muerta infectada (aunque es un procedimiento trabajoso y
con consumo de energa) es el mtodo ms deseable y con frecuencia el dispuesto por ley. El suelo
contaminado, los lechos, etc. deberan incinerarse junto con la res muerta, e, idealmente, el lugar debera ser
desinfectado para ms seguridad. Donde no se pueda llevar a cabo la incineracin, la alternativa es un
enterramiento profundo (preferentemente con cal viva), aunque la recuperacin peridica de esporas de
carbunco en algunas sitios de antiguos enterramiento de reses muertas, ha puesto de manifiesto que esta
alternativa es menos satisfactoria.
309
Factores de riesgo para manipuladores de reses muertas por carbunco
El riesgo de inhalar dosis infecciosas es importante en ocupaciones que impliquen el procesamiento de

materiales derivados del animal en la fabricacin de productos (carbunco industrial). stas incluyen el procesado
del cuero, de la lana, de la piel para alfombras, de los huesos, y otras ocupaciones en industrias similares donde
el potencial de aerosolizacin de una cantidad importante de esporas incrementa el riesgo de exposicin a dosis
infecciosas. Los que trabajan en laboratorios deberan tener una buena prctica cuando trabajan con
especmenes de casos sospechosos de carbunco y cuando crezcan B. anthracis. Se requiere una cabina de
seguridad biolgica para la manipulacin de caldos de cultivo o suspensiones de esporas. La descontaminacin
de todos los materiales y superficies contaminadas debe llevarse a cabo mediante el autoclave, incineracin o
tratamiento con hipoclorito sdico al 10% (leja). No se requiere el uso de animales de laboratorio para
diagnstico, pero si se usan, los lechos y las jaulas deben pasarse por el autoclave despus de su uso y el lecho
debe ser incinerado. Ha de tenerse cuidado en no producir aerosoles de polvo cuando se maneje el lecho.
Tambin han de evitarse heridas en la piel por instrumentos afilados o picaduras y araazos de animales.
1.
La demostracin de B. anthracis encapsulado en frotis de sangre o de tejidos de cadveres frescos infectados de

carbunco, y el crecimiento del organismo en placas de medio slido con sangre, no resulta muy complicado y
est al alcance de la mayora de los laboratorios de bacteriologa. Puede haber cierta dificultad en el caso de
cerdos y carnvoros en los cuales la bacteriemia terminal no es muy marcada, o en animales que recibieron
antibiticos antes de morir.
La recuperacin de B. anthracis de reses antiguas muertas en descomposicin, de materiales procesados
(hueso, carne, pellejo), o de muestras ambientales (suelo contaminado) es a menudo difcil, requiriendo
procedimientos de mucho tiempo y trabajo.
a)
Muestras frescas
Visualizacin de la cpsula
Como se ha descrito anteriormente, ha de buscarse el B. anthracis encapsulado y virulento presente en

tejidos, sangre y otros fluidos del cuerpo de los animales muertos por carbunco en los frotis de estas
muestras que se han secado, fijado en alcohol absoluto durante 3 minutos y teido con azul de metileno
policrmico (reaccin de M'Fadyean) o tincin de Giemsa. La cpsula se colorea de rosa, mientras que las
clulas del bacilo se tien de azul oscuro. Las clulas se encuentran en pares o en cadenas cortas y a
menudo terminan como cortadas a bisel (las cadenas a veces parecen un conjunto de coches del tren -la
llamada apariencia en "furgn de ferrocarril"). La tincin de Gram no revela la cpsula. La cpsula no se
presenta en B. anthracis cuando crece aerbicamente sobre agar nutritivo o en caldo nutritivo, pero puede
verse cuando la bacteria virulenta se cultiva durante unas pocas horas en unos mililitros de sangre (la
sangre desfibrinada del caballo parece ser la que mejor funciona). Alternativamente, la cpsula se produce
cuando B. anthracis virulento se cultiva en medio de agar nutritivo que contenga 0,7% de bicarbonato
sdico y se incuba en presencia de CO2 (20% es ptimo, pero tambin sirve una jarra de anaerobios). El
medio slido se prepara poniendo en 90 ml de agua el suficiente agar nutritivo en polvo para hacer 100 ml
de medio slido. Despus se lleva al autoclave y se enfra a 50C en bao de agua; se aaden 10 ml de
una solucin de bicarbonato sdico al 7% esterilizada por filtracin (filtro de 0,22-0,45 m) y se mezcla. La
solucin se vierte despus en placas Petri. B. anthracis encapsulado formar colonias mucosas y la cpsula
se puede visualizar haciendo frotis finos sobre portas de microscopio, fijando y tiendo como antes con azul
de metileno policromtico.
Azul de metileno policromtico (tincin de M'Fadyean)
El azul de metileno policromtico se prepara de la siguiente forma: 0,3 g de azul de metileno se disuelven
en 30 ml de etanol al 95%; 100 ml de 0,01% de hidrxido potsico (KOH) se mezclan con la solucin de
azul de metileno. Esta solucin preferentemente debera exponerse al aire, con agitacin ocasional, durante
al menos 1 ao para que se oxide y madure. La adicin de K2CO3 (a una concentracin final del 1%)
acelera la "maduracin" del colorante, pero antes de que se considere fiable desde el punto de vista
diagnstico, debe establecerse su eficacia probndola en paralelo con un lote previo de colorante funcional
sobre muestras bona fide. Se ha encontrado que las tinciones que dan reaccin positiva con cultivos de
B. anthracis cultivado artificialmente en sangre de caballo no dan a veces resultados positivos en el campo.
La preparacin comercial de tincin de azul de metileno policrmico (M'Fadyean) es cada vez ms difcil de
obtener.
310
Para hacer frotis para tinciones, solo se necesitan gotitas de sangre o fluido del tejido, y es mejor un frotis
pequeo. Despus de fijarla en etanol y secarla, una gota de colorante (aproximadamente 20 l) se coloca
sobre el frotis y se extiende sobre l con un asa de cultivo. Despus de 1 minuto, el colorante se lava con
agua, se empapa el exceso, se seca al aire y se observa inicialmente usando una lente con un objetivo de
10x bajo el cual las cadenas cortas aparecen como cabellos pequeos; una vez encontradas, se pueden
observar con aceite de inmersin (1.000x) para buscar la presencia de la cpsula rosa rodeando los bacilos
teidos de azul/negro. Para evitar la contaminacin en el laboratorio, la placa y el papel absorbente se
deben llevar al autoclave o dejar durante algunas horas en una disolucin de hipoclorito sdico al 10%.
Identificacin y cultivo de Bacillus anthracis
Bacillus anthracis crece fcilmente en la mayora de los tipos de medios slidos nutritivos, aunque el medio
de diagnstico que se suele escoger es medio slido con sangre de caballo u oveja. La inclusin de
polimixina (100.000 unidades por litro de medio) suprimir las bacterias contaminantes y ayudar al
aislamiento de B. anthracis. La sangre es el material clnico primario para someter a examen. Frotis de
sangre, de otros fluidos del cuerpo o tomados de incisiones en tejidos u rganos se pueden sembrar por
extensin sobre placas de medio slido con sangre. Despus de incubacin durante toda la noche a 37C,
las colonias de B. anthracis son de un color entre blanco grisceo y gris, con un dimetro entre 0,3-0,5 mm,
no hemolticas, con una superficie hmeda traslcida, y muy pegajosa cuando se toma con un asa de
cultivo. A veces se ven rastros y manojos prominentes de crecimiento hacia la colonia de origen, todos en la
misma direccin. Esta caracterstica se puede describir como apariencia en forma de "cabeza de medusa".
La confirmacin de que se trata de B. anthracis se puede llevar a cabo demostrando la presencia en el
cultivo con sangre de un bacilo encapsulado, formador de esporas y Gram-positivo. Se puede determinar la
ausencia de movilidad como una prueba adicional.
La susceptibilidad de B. anthracis al bacterifago gamma fue descrita inicialmente por Brown y Cherry en
1955 (3). El fago esta disponible en el CDC (ver nota a pie de pgina 1), en varios laboratorios veterinarios
centrales nacionales y en otros laboratorios de referencia del carbunco. El procedimiento para la prueba es
simplemente sembrar en estra una lnea con el organismo sospechoso sobre una placa con medio slido
nutritivo o con sangre, o en una porcin de una placa (se pueden llevar a cabo varias pruebas sobre una
placa), y colocar una gota de 10-15 l de la suspensin del fago sobre una parte del rea sembrada y
colocar un disco de penicilina de 10-unidades en el otro lado. Hay que dejar que la gota de la suspensin
del fago penetre e incubar la placa a 37C. Se debe incluir un cultivo control; la vacuna de Sterne se puede
usar para este propsito. Si el cultivo es B. anthracis, el rea bajo el fago estar desprovista de crecimiento
bacteriano, debido a la lisis, y una zona clara se podr ver alrededor del disco de penicilina despus de
incubacin durante la noche. (Nota: muy ocasionalmente se encuentra aislados de B. anthracis resistentes
al fago; de forma similar, en la literatura hay algunos informes de resistencia a la penicilina). La induccin de
la cpsula se describi anteriormente.
Confirmacin de la virulencia con la reaccin en cadena de la polimerasa
La confirmacin total de la virulencia se puede llevar a cabo usando la reaccin en cadena de la polimerasa
(PCR). Las siguientes instrucciones estn tomadas de la referencia 14. El ADN molde para PCR se puede
preparar desde una colonia fresca de B. anthracis sobre agar nutritivo por resuspensin de la masa de
crecimiento que se recoge con un asa en 25 l de agua estril desionizada (o destilada) y calentando a
95C durante 20 minutos. Es importante considerar que, si se usa de otra forma una colonia joven, podra
haber algunas bacterias vivas en el lisado. Despus de enfriar hasta aproximadamente 4C y de centrifugar
brevemente, el sobrenadante se puede usar para la reaccin PCR.
Los cebadores adecuados (2,6) para confirmar la presencia de los plsmidos pX01 y pX02 se dan en el
cuadro que se incluye a continuacin.
Diana
Cebador ID
Secuencia 53
Tamao del
producto
Concentracin
Antgeno de
proteccin
(PA)
PA 5
30483029
TCC-TAA-CAC-TAA-CGA-AGT-CG
596 bp
1 mM
PA 8
24522471
GAG-GTA-GAA-GGA-TAT-ACG-GT
1234
14111430
CTG-AGC-CAT-TAA-TCG-ATA-TG
846 bp
0,2 mM
1301
22572238
TCC-CAC-TTA-CGT-AAT-CTG-AG
Cpsula
311
La PCR se puede llevar a cabo en volmenes de 50 l usando los cebadores indicados anteriormente, 200
M en cada caso de dATP, dCTP, dTTP y dGTP, 1,5 mM de MgC2 y 2,5 unidades de polimerasa amplitaq,
todo en tampn NH4, seguido de la adicin de 5 l de ADN molde. Se ha encontrado que un gel de agarosa
al 2% funciona bien con estos fragmentos pequeos.
Alternativamente, hay preparaciones "Ready-to-GoTM" que estn disponibles comercialmente en Pharmacia
Biotech2. Se trata de preparados secos, mezclados previamente, y ya distribuidos, que son estables a
temperatura ambiente, y que contienen todos los reactivos necesarios, excepto el molde y el cebador, para
llevar a cabo reacciones de PCR de 25 l. El molde se puede aadir en un volumen de 2.5 l.
Se puede usar el siguiente ciclo de PCR: 1 x 95C durante 5 minutos; 30 x 95C durante 0,5 minutos
seguido de 0,5 minutos a 55C y de 0,5 minutos a 72C; 1 x 72C durante 5 minutos; enfriar a 4C.
Ha de tenerse en cuenta que los cebadores incluidos en el cuadro anterior, que se han usado durante
algunos aos en una instalacin de referencia del carbunco, han sido tiles para confirmar la presencia o
ausencia de pXO1 y/o pXO2 en cultivos puros de aislamientos procedentes de especies animales
(incluyendo humanos) o en muestras ambientales. Sin embargo, no son adecuados para la deteccin
directa de B. anthracis en tales casos. En la ref. 7 se puede encontrar una seleccin de alternativas. En el
caso improbable de que un aislamiento carezca tanto de pXO1 como de pXO2, se debera usar tambin un
marcador cromosmico; los cebadores para stos se proporcionan en la ref. 7.
b)
Identificacin del agente en muestras antiguas o descompuestas, materiales procesados y muestras

ambientales, incluyendo suelo.
Estas muestras contienen con frecuencia contaminantes saprofitas que inhiben y obscurecen el crecimiento
de B. anthracis en medios slidos no selectivos. Se sugiere el siguiente procedimiento:
i)
La muestra se mezcla con dos volmenes de agua estril destilada o desionizada y se coloca en un
bao de agua a 62,5 0,5C durante 15 minutos.
ii)
Se preparan diluciones decimales de 10-2 o 10-3. De cada dilucin se siembran 10-100 l en medio
slido con sangre y 250-300 l en medio slido PLET (polimixina, lisozima, EDTA [cido etiln diamino
tetraactico], acetato talioso) (8,14). Todas las placas se incuban a 37C.
iii)
Las placas de medio slido con sangre se examinan para la aparicin de colonias tpicas como se ha
descrito previamente despus de la incubacin durante toda la noche, y las placas con medio PLET se
examinan despus de 40-48 horas. La confirmacin de la identidad de colonias sospechosas de
B. anthracis se lleva a cabo como se describi anteriormente.
El medio PLET (8,14) se prepara usando medio slido base de infusin de corazn (DIFCO) segn las
instrucciones del fabricante y aadiendo 0,25-0,3 g/litro de EDTA y 0,04 g/litro de acetato talioso. (NOTA: el
acetato talioso es venenoso y debe manejarse con cuidado). La mezcla se lleva al autoclave y se enfra
uniformemente hasta 50C antes de aadir la polimixina a 30.000 unidades/litro y la lisozima a 300.000
unidades/litro. Despus de mezclar homogneamente, el medio slido se distribuye en placas Petri.
Estn surgiendo informes sobre procedimientos para la deteccin directa de B. anthracis en suelos y otras
muestras ambientales usando la tcnica de PCR. Hasta ahora, ninguno de ellos tiene uso rutinario.
Si todos los otros mtodos fallan, se puede tener en cuenta la inoculacin en animales para recuperar
B. anthracis. Un ejemplo es el caso de muestras de animales que han recibido terapia antibitica antes de
la muerte, o de muestras ambientales que contengan compuestos inhibidores de las esporas. A causa del
aumento en la preocupacin por eliminar el uso de animales en pruebas biolgicas, este enfoque debera
usarse como ltimo recurso y solamente si estuviera justificado. Los ratones o cobayas adultos son los
animales de eleccin. Si las muestras son de suelos, los animales deberan pretratarse el da antes de la
prueba con antisueros contra el ttanos y la gangrena gaseosa. Las muestras se preparan como se
describi para el cultivo (Seccin B.1.a., ms arriba), incluyendo un choque trmico a 62,5C por
15 minutos. Los ratones se inyectan subcutneamente con 0,05-0,1 ml; los cobayas se inoculan
intramuscularmente con hasta 0,4 ml (0,2 ml en el msculo de cada muslo). Cualquier B. anthracis presente
provocar la muerte en 48-72 horas y el organismo se puede cultivar de la sangre como se describi
anteriormente.
312
Uppsala, Sweden, producto nmero 27-9555-01.
c)
Deteccin inmunolgica y diagnstico

Hay que resaltar que B.anthracis est muy relacionado antignicamente con B.cereus, que es un
componente ubicuo de la microflora ambiental. Los nicos antgenos no compartidos que permiten
diferenciar por mtodos inmunolgicos estas dos especies son los antgenos de la toxina del carbunco, que
se producen durante la fase exponencial de crecimiento, y la cpsula de B. anthracis. Esto limita
considerablemente la medida en que los mtodos inmunolgicos pueden usarse en sistemas de deteccin
rutinaria.
Pruebas de Ascoli (1)
En 1911, Ascoli (1) public un procedimiento para detectar el antgeno termoestable del carbunco en tejidos
animales usados en la fabricacin de productos derivados. Este ensayo usa antisuero obtenido en conejos
para producir una reaccin de precipitacin. La prueba carece de elevada especificidad, ya que los
antgenos termoestables de B. anthracis son compartidos por otras especies de bacilos, y es dependiente
de la probabilidad de que B.anthracis sea el nico que prolifere en el animal y produzca antgenos
suficientes para dar una reaccin positiva. Hoy da parece usarse solamente en la Europa del Este.
Para realizar la prueba de Ascoli, se ponen aproximadamente 2 g de muestra en 5 ml de solucin salina
conteniendo una concentracin final de cido actico de 1/100 y se hierve durante 5 minutos. La solucin
resultante se enfra y se pasa a travs de papel de filtro. Se colocan unas cuantas gotas de antisuero de
conejo (ver la preparacin ms adelante) en un pequeo tubo de ensayo. El filtrado del paso previo se
deposita cuidadosamente sobre el antisuero. Un ensayo positivo es la formacin de una banda visible de
precipitacin en menos de 15 minutos. Se deberan incluir suspensiones con muestras control positivas y
negativas.
El antisuero se prepara en conejos por la inoculacin subcutnea de la vacuna Sterne del carbunco los das
1 y 14. Los das 28 y 35 los conejos reciben 0,5 ml de una mezcla en solucin salina de varias cepas
virulentas de B. anthracis que no exceda de 105 unidades formadoras de colonias (CFU)/ml.
Alternativamente, las bacterias vivas virulentas se pueden inactivar por suspensin prolongada en solucin
salina con 0,2% de formol, pero la masa de antgenos se incrementa entonces a 108-109 CFU/ml. La
suspensin debera analizarse en cuanto a inactivacin de B. anthracis antes de la inoculacin en el animal
mediante cultivo de 0,1 ml en 100 ml de caldo nutritivo que contenga 0,1% de histidina y, despus de
incubar por 7 das a 37C, mediante subcultivo en sangre o agar nutritivo. El rgimen de dosis para la
suspensin con formol despus de la vacunacin inicial los das 1 y 14 consiste en dosis incrementadas de
0,1, 0,5, 1, y 2 ml suministradas intravenosamente cada cuatro o cinco das. En cualquiera de estos
procedimientos se hace necesaria una sangra de prueba a los diez das despus de la ltima inyeccin
para determinar si se deberan administrar dosis adicionales de 2 ml para estimular el ttulo de precipitina.
Inmunofluorescencia
Aunque se ha obtenido un cierto xito con la inmunofluorescencia aplicada a la observacin de cpsulas en

contextos de investigacin (4), la misma no se presta a mtodos usuales de diagnosis.
2.
Pruebas serolgicas
Histricamente, no ha habido mucha necesidad de apoyo serolgico para la diagnosis del carbunco en animales.
O el animal tena carbunco, reconocible por la reciente historia de la manada o del sitio, y era tratado
convenientemente, o falleca. La mayor parte del inters en el desarrollo de pruebas serolgicas ha derivado de
investigaciones sobre la respuesta humoral en humanos, y en menor medida en animales, a fin de evaluar
vacunas y para estudios epidemiolgicos que implicaban seroconversin adquirida naturalmente en humanos,
animales domsticos y mamferos salvajes.
En la actualidad se acepta que el mejor procedimiento serolgico es el enzimoinmunoensayo (ELISA) en placas
de microtitulacin con revestimiento del componente del antgeno de proteccin (PA) de la toxina del carbunco a
3-5 g/ml en tampn carbonato de revestimiento a alto pH (9,5). Los antgenos de la toxina parecen ser
verdaderamente especficos para B. anthracis, aunque actualmente no estn comercialmente disponibles. Esto
implica que la serologa del carbunco est reducida en la actualidad a la actividad de unos cuantos laboratorios
especializados. Existen varias versiones de ELISA que se pueden encontrar en manuales estndar de
laboratorio; cualquier versin es vlida para serologa del carbunco, aunque algunos sueros parecen ser ms
pegajosos que otros. Un detalle til es usar leche reconstituida en polvo como agente bloqueante y elevar su
concentracin hasta que los sueros control negativos den resultados negativos de forma repetitiva. Para suero
bovino, suele ser una suspensin al 10% o ms alta.
En otra parte se recogen ejemplos de aplicacin con xito de la serologa para el carbunco en condiciones de
campo (5, 11, 15),
313
3.
Prueba de la hipersensibilidad (Antraxina TM) 3
En Europa Central y del Este se ha extendido el uso de una prueba cutnea usando AntraxinaTM, autorizada
primero en la antigua URSS en 1962, para la diagnosis retrospectiva del carbunco en humanos y animales y para
la evaluacin de vacunas (12). Es un producto comercial que contiene un complejo termoestable de
protena/polisacrido/cido nucleico, obtenido del fluido edematoso de animales inoculados con la vacuna STI o
con las cepas Zenkowsky de B. anthracis. La prueba consiste en la inyeccin intradrmica de 0,1 ml de Antraxina
y la inspeccin 24 horas despus del eritema y la induracin que aparece en tal sitio y que dura hasta 48 horas
despus de la inyeccin. Esta hipersensibilidad de tipo retardado se cree que refleja la inmunidad mediata por
clulas contra el carbunco y ha sido la prueba capaz de diagnosticar de modo retrospectivo la existencia de una
infeccin primaria de 31 aos de antigedad en el 72% de los casos. Tambin se us con xito en Suiza en una
investigacin retrospectiva de una serie de casos ocurridos en una fbrica de tejidos donde se combinaban fibras
sintticas con pelo de cabra de Pakistn (10). La fiabilidad diagnstica de la Antraxina, como la de la prueba de
Ascoli, depende de la naturaleza del carbunco ms bien que de la especificidad de los antgenos implicados.
C.1. REQUISITOS PARA LAS VACUNAS Y LOS MATERIALES DE DIAGNSTICO:

VACUNAS
La vacuna de ms amplio uso para prevenir el carbunco en animales es la desarrollada por Sterne en 1937 (13).
Este autor obtuvo una variante rugosa de B. anthracis virulento en cultivos slidos con suero en atmsfera de
elevado contenido en CO2. Esta variante, llamada 34F2, era incapaz de formar cpsula y despus se descubri
que haba perdido el plsmido pX02, que codifica la formacin de la cpsula. Ha llegado a ser la cepa ms usada
en todo el mundo para produccin de vacunas contra el carbunco en animales. En Europa Central y del Este, el
ingrediente activo de las vacunas actuales para el ganado es un derivado equivalente, la cepa 55, que tambin
carece de pX02. En el Apndice V de la ref. 14 se suministra una lista de fabricantes de vacuna contra el
carbunco para uso en animales.
La siguiente informacin referente a la preparacin de vacuna contra carbunco, para uso en animales est
basada en las referencias 9 y 16. Se describen procedimientos generales, pero las Autoridades Reguladoras
Nacionales deben ser consultadas en relacin a las operaciones de los procedimientos estndares que pueden
ser de incumbencia local.
1.
Control del inculo
a)

La produccin de vacunas del carbunco se basa en un sistema de lotes de inculos. Un lote de inculo es
una cantidad de esporas de composicin uniforme que son procesadas a la vez y mantenidas con el fin de
preparar vacunas. Cada lote de inculo no tiene ms de tres pases del cultivo original y debe producir una
vacuna que sea eficaz y segura para uso en animales. Se recomienda preparar un gran lote de siembra de
la cepa original y conservarlo por liofilizacin para preparacin de futuros lotes. Los cultivos originales se
pueden adquirir4. El lote se siembra es aceptable para producir LA vacuna de carbunco si una vacuna
preparada de dicho lote o una suspensin derivada de un cultivo del lote supera los requisitos de control
final respecto a ausencia de contaminacin bacteriana, seguridad y eficacia (inmunogenicidad),
b)
Preparacin del inculo original

Se cultivan lotes de siembra sobre medios slidos diseados para favorecer la esporulacin del organismo
(ver Seccin C.1.2, ms adelante). La frmula del medio slido de la ref. 9 es: 50 g de casena digerida con
tripsina de (tripticasa); 10 g de extracto de levadura; 0.1 g CaCl2.6H2O; 0,01 g de FeSO4.7H2O; 0,05 g de
MgSO4.7H2O; 0,03 g de MnSO4.4H2O; 5,0 g de K2HPO4; 1,0 g de KH2PO4; 22 g de agar; 1.000ml de agua
desionizada o destilada. Los ingredientes se disuelven en agua convenientemente calentada; la solucin se
ajusta a pH 7.4, se distribuye en botellas Roux (120 ml por botella) u otro recipiente apropiado, se esteriliza
por autoclave y se enfra en posicin horizontal. Despus de que el agar se haya solidificado, se extrae
aspticamente el exceso de lquido y las botellas se dejan en un incubador (37C) por al menos 2 das para
secarse y para comprobar su esterilidad.
Sobre el agar de las botellas Roux se siembran volmenes de 2 ml de inculo vacunal de un laboratorio de
referencia, y se debe incubar a 37C hasta que se aprecie un mnimo de 80% de esporulacin (al menos
72 horas) mediante examen microscpico de muestras tomadas aspticamente con el asa de cultivo. La
3
4
314
V.O. Medexport, 113461 Moscow, Russia

National Institute for Biological Standards and Control, Blanche Lane, South Mimms, Potters Bar, Hertfordshire EN6 3QG,
United Kingdom.
masa microbiana se recoge con 10 ml de de agua estril desionizada o destilada por botella y se
comprueba su pureza. Despus de lavar tres veces con agua estril desionizada o destilada se aade a la
suspensin final un estabilizador estril para liofilizacin, en el mismo tipo de agua, y se distribuye la
solucin en viales para liofilizacin, que luego se congelan.
c)
Preparacin y prueba del inculo de trabajo

Se reconstituye un vial del stock de inculos y se siembran varios cultivos (de aproximadamente 10 ml) para
esporulacin en tubos con agar inclinado (con tripticasa). Se incuban 72 horas a 37C y se guardan en
nevera. Los tubos con agar inclinado se ensayan en cuanto a pureza mediante cultivo en placas de agar
nutritivo y en caldo nutritivo (0,1 ml en 100 ml de caldo nutritivo). ste ltimo se debe subcultivar en agar
nutritivo despus de incubar a 37C durante 7 das y debera ser un cultivo puro de B. anthracis. Tambin
se debe ensayar una muestra del caldo nutritivo para comprobar la falta de movilidad.
Para un proceso de produccin, los volmenes de inculo que se necesitan deben calcularse dependiendo
de la cantidad de esporas recogidas de cada tubo de agar inclinado con 10 ml de agua estril desionizada o
destilada, que se usarn para inocular cinco botellas Roux.
d)
Seguridad del lote de inculo

Se deben inyectar subcutneamente no menos de 5 x 109 esporas cultivables en cada una de tres ovejas
no vacunadas de 1-2 aos de edad, que deben sobrevivir despus de un perodo de observacin que
supere 10 das.
e)
Inmunogenicidad del lote de inculo

Se deben inocular al menos 10 cobayas sanos, de 300-500 g de peso, con 5 x 106 esporas viables y
tenerlos en observacin 21 das. Debe sobrevivir al menos el 80% de los animales. Los animales
inmunizados, junto con tres controles, deben de ser luego desafiados con 10 dosis letales medias (LD50) de
la cepa JB de B. anthracis. Durante un perodo de observacin de 10 das, ninguno de los animales debe
sucumbir ante el desafo o descarga mientras que todos los controles deben morir de carbunco. Se deber
repetir la prueba en caso de muerte de alguno de los animales inmunizados.
2.
Mtodo de produccin
a)
Preparacin de concentrados de vacuna

Se preparan botellas Roux con medio de agar tripticasa como para el caso del inculo original visto antes
en la Seccin C.1.1.b. Una botella Roux puede suministrar unas 2.000 dosis de vacuna. Cada botella Roux
se inocula con 2 ml de suspensin de inculo de trabajo y se incuba a 37C con tapn poroso durante
varios das hasta que muestras de cultivo tomadas con un asa de siembra de botellas seleccionadas al azar
revelen que al menos un 90% de los organismos estn en forma esporulada cuando dichas muestras se
examinan en preparaciones montadas para contraste de fases (las esporas aparecen brillantes en contraste
de fases) o mediante tincin de esporas. Entonces se recoge el crecimiento de cada botella con 20 ml de
solucin salina fisiolgica. Se deben realizar pruebas de contaminacin por subcultivo en placas de agar
nutritivo e inoculacin de 100 ml de caldo nutritivo con 0,1 ml de las esporas recogidas y su posterior
subcultivo en agar nutritivo despus de 7 das a 37C y mediante pruebas de movilidad. Las masas
microbianas recogidas despus de el crecimiento que sean aceptables (es decir, aquellas que no muestran
evidencia de contaminacin), se almacenan juntas.
b)
Glicerinacin
Al volumen de masa microbiana final recogida se debe aadir el doble del volumen de glicerol neutro puro y
estril. Tambin se puede aadir en este paso saponina (a concentracin final de 0,1%) si se tuviera que
incluir como adyuvante. Se mezcla exhaustivamente (la adicin de perlas de vidrio esterilizadas suele ser
de ayuda). Se realizan pruebas de pureza como antes y se mantiene el producto a temperatura ambiente
durante 3 semanas para permitir la lisis de cualquier forma de bacteria vegetativa, se realiza una
determinacin de esporas viables y se guarda despus en nevera.
c)
Determinacin del ttulo y dilucin para uso

El nmero de esporas cultivables en el producto se determina luego sembrando por extensin diluciones
decimales sobre placas con agar nutritivo. La suspensin se diluye de modo que la masa final contenga el
nmero deseado de esporas cultivables. El diluyente empleado debe contener la misma proporcin de
solucin salina, glicerol y (en su caso) saponina que la presente en el concentrado de vacuna. La vacuna
debe contener no menos de 10 millones de esporas viables por dosis para el ganado bovino, bfalos y
caballos, y no menos de 5 millones de esporas por dosis para ovejas, cabras y cerdos.
315
d)
Inocuidad
La prueba de seguridad se realiza sobre dos ovejas o cabras sanas y consiste en la inoculacin subcutnea
del doble de la dosis vacunal recomendada. Los animales se observan por 10 das. El producto final supera
la prueba si no se desarrollan reacciones sistmicas y si no se observa algo ms que un edema transitorio
en el lugar de la inyeccin. Si la prueba se realiza solo en ovejas, un edema progresivo indica que la
vacuna puede resultar inadecuada para cabras.
e)
Llenado de recipientes
La distribucin de alcuotas de las vacunas en recipientes de mono y multidosis se realiza como se indica
en el Informe Tcnico No. 363 de la serie publicada por la Organizacin Mundial de la Salud titulada
Requisitos Generales para Establecimientos de Produccin y Laboratorios de Control (Requirementes for
Biological Substances No.1), 1965, 16-17. Bsicamente, el producto final se distribuye en los recipientes de
modo asptico en un rea no usada para la produccin, y se debe evitar cualquier contaminacin o
alteracin del producto. Despus de la distribucin, la vacuna debe liofilizarse en recipientes adecuados a
las dosis. Los recipientes se sellan tan pronto como sea posible con un material que no perjudique al
producto y que se a capaz de mantener un cierre hermtico durante la validez de la vacuna.
3.
Control del proceso
Las pruebas de pureza se basan en el examen microscpico de frotis teidos y en pruebas de cultivo y movilidad
como se indico (10) en la Seccin C1.2.a.
4.
Control de lotes y pruebas sobre el producto final
a)
Esterilidad
La vacuna es un cultivo de esporas vivas de B. anthracis; la esterilidad no es de aplicacin, pero los lotes
se deben ensayar en cuanto a ausencia de contaminacin (ver Captulo I.1.5,).
b)
Eficacia
La eficacia o inmunogenicidad se prueba en el producto final del siguiente modo: se inoculan al menos 10
cobayas sanos de 300-500 g con una dosis de vacuna para ovejas. Los cobayas se observan por 21 das, y
durante este perodo debe sobrevivir al menos el 80% de los animales. Los cobayas inmunizados
supervivientes y tres controles no vacunados se desafan con una dosis apropiada de B. anthracis virulento.
Un desafo recomendado es suministrar 200 LD50 de la cepa Pasteur II (JB), que se puede obtener de la
misma fuente que la cepa vacunal Sterne 34F2. Si 10 das despus del estmulo de desafo, todos los
cobayas vacunados sobreviven y los animales control mueren, se estima que el producto final es
satisfactorio. Si durante el perodo que sigue al desafo muere cualquier animal vacunado por causa distinta
al carbunco, y la muerte no se asocia con la vacuna, la prueba debe repetirse.
c)
Dosis
La dosis mnima recomendada para ganado vacuno y para caballos es 10 x 106 esporas cultivables; para
ovejas, cabras y cerdos es 1-5 x 106 esporas cultivables. La vacuna debe contener estas esporas en un
volumen apropiado, por ejemplo 1 x 107/ml.
d)
La mayor parte de los expertos consideran que la inmunidad es buena durante al menos 1 ao y se
recomienda dar una dosis estimulatoria anual de recuerdo. Los caballos pueden ser ms lentos en el
desarrollo de la inmunidad despus de la vacunacin inicial; en consecuencia, algunos productores
recomiendan una vacunacin inicial con dos dosis, administradas con separacin de 1 mes, seguida por
una nica dosis anual de recuerdo.
e)
Estabilidad
Al no existir una prueba de aceptacin general para la estabilidad de las vacunas del carbunco, se
recomienda que, al llenar cada lote, se determine el nmero de esporas cultivables antes y despus de
conservarlos a una temperatura apropiada por un cierto perodo. No debera evidenciarse un descenso en
el nmero de esporas cultivables.
316
f)
Conservantes y almacenamiento
Las esporas de Bacillus anthracis son estables en vacunas liofilizadas y no liofilizadas y no se necesitan
conservantes. Se recomienda su almacenamiento con refrigeracin (4C).
g)
Se sabe que la vacuna produce enfermedad en algunas cabras y llamas; esto puede deberse al adyuvante
de saponina. No se recomienda el uso de la vacuna en hembras grvidas ni en animales destinados al
sacrificio a las 2-3 semanas de la vacunacin. Las regulaciones locales en algunos pases o regiones
pueden especificar otros intervalos temporales, pero no existe ninguna razn cientfica para considerar que
la carne de animales clnicamente sanos no es apta para el manejo o consumo humano despus de un
perodo de retencin de 2 semanas despus de la vacunacin. Est contraindicada la administracin
simultnea de antibiticos a animales vacunados, pues el antibitico puede interferir con la vacuna. No se
deben dar antibiticos durante algunos das antes y algunos das despus de la vacunacin. La vacuna viva
no usada, los viales vacos, y el equipo usado para la vacunacin estn contaminados con esporas vivas y
deberan ser autoclavados, desinfectados o incinerados. En el hombre, la inoculacin accidental se trata
eliminando en lo posible el inculo en el sitio de la inyeccin y lavando extensamente la herida con agua y
jabn. Debe buscarse atencin mdica si se desarrollara infeccin.
5.
a)
Seguridad
Cada lote de vacunas debe ser ensayado en cuanto a seguridad como se describe en la Seccin C1.2.d.
b)
Potencia
Cada lote de vacunas debe ser ensayado en cuanto a potencia como se describe en la Seccin C1.4.b.
C2. REQUISITOS PARA LAS VACUNAS Y LOS MATERIALES DE DIAGNSTICO:

MATERIALES BIOLGICOS DE DIAGNSTICO
Propagacin del bacterifago gamma para diagnstico
1.
Preparar un crecimiento en csped de B. anthracis en placas de 150 x 15 mm con medio Mueller-Hinton y

5% de sangre de oveja.
2.
Incubar por 4-6 horas a 37C, y si hay suficiente crecimiento vegetativo (visible a simple vista) sembrar el
cultivo con fago. Si el crecimiento es dbil, incubar entonces toda la noche antes de sembrar el fago.
3.
La siembra se hace usando una pipeta estril de transferencia. Se colocan 2 ml aproximadamente del stock
de bacterifago gamma sobre la superficie del crecimiento vegetativo. La placa se ladea hasta permitir que
el fago cubra todo el rea de crecimiento. Esto se debe repetir hasta que toda la superficie del crecimiento
vegetativo se cubra con el fago.
4.
Se incuba la placa a 37C toda la noche.
5.
Se colocan las placas en un congelador a 20C toda la noche.
6.
El da siguiente se sacan las placas del congelador y se deja descongelar durante 2 horas.
7.
Se recoge el lquido marrn rojizo y se pre-filtra a travs de papel de filtro Whatman No. 3.
8.
Se lleva a cabo una esterilizacin final por filtracin con un recipiente de recogida estril usando filtros de
0,22 .
9.
Para confirmar la potencia del fago se hace una dilucin seriada 1/1, 1/10, hasta 1/10,000 y se prueba
frente a B. anthracis para susceptibilidad.
10. Guardar el fago en un refrigerador a 2-8C. No congelar.
317
REFERENCIAS
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method for detection and identification of Bacillus anthracis in soil samples from former tanneries. Salisbury
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diagnosis of anthrax after an outbreak of cutaneous anthrax in Paraguay. J. Infect. Dis., 160, 706710.
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HUTSON R.A., DUGGLEBY C.J., LOWE J.R., MANCHEE R.J. & TURNBULL P.C.B. (1993). The development and
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JACKSON P.J., HUGH-JONES M.E., ADAIR D.M., GREEN G., HILL K.K., KUSKE C.R., GRINBERG L.M., ABRAMOVA,
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presence of multiple Bacillus anthracis strains in different victims. Proc. Natl Acad. Sci. USA, 95, 1224
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skin test with the Russian allergen Anthraxin in a recent epidemic in Switzerland. Salisbury Med. Bull., No.
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11. REDMOND C., HALL G.A., TURNBULL P.C.B. & GILLGAN J.S. (1996). Experimentally assessed public health risks
associated with pigs from farms experiencing anthrax. Vet. Rec., 141, 244247.
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kinetics pattern. Vaccine, 15, 631636.
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15. TURNBULL P.C.B., DOGANAY M., LINDEQUE P.M., AYGEN B. & MCLAUGHLIN J. (1992). Serology and anthrax in
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Anthrax Spore Vaccine (Live for Veterinary Use) (Requirements for Bioiogical Substances No. 13). World
Health Organization (WHO) Technical Report Series No. 361. WHO, Geneva, Switzerland.
LECTURA ADICIONAL
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Microbiology, Seventh Edition, Murray P.R., Baron E.J., Pfaller M.A., Tenover F.C. & Yolken R.H., eds.
American Society for Microbiology, Washington DC, USA, 357369.
B.
QUINN C.P. & TURNBULL P.C.B. (1998). Anthrax. In: Topley & Wilsons Microbiology and Microbial Infections,
Vol. 3, Ninth Edition, Collier L., Balows A. & Sussman M., eds. Arnold, London, UK, 799818.
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C.
TURNBULL P.C.B., (ED.) (1996). Proceedings of the International Workshop on Anthrax. Salisbury Med. Bull.,
Special Supple. No. 87, 139 pages.
D.
TURNBULL P.C.B. (1998). Anthrax. In: Zoonoses. Biology, Clinical Practice, and Public Health Control. Palmer
S.R., Soulsby E.J.L. & Simpson D.I.H., eds. Oxford University Press, Oxford, UK, 316.
E.
WHITFORD H.W. & HUGH-JONES M.E. (1994). Anthrax. En: Handbook Series in Zoonoses, Second Edition,
Beran G.W., editor-in-chief. CRC Press, Boca Raton, Florida, USA, 6182.
*
* *
NB: Existen laboratorios de referencia de la OIE para Carbunco (vase Cuadro en la Parte 3 de este Manual de
animales terrestres o consulte la pgina Web de la OIE para una lista ms actualizada: www.oie.int).
319
CAPTULO 2.2.2.
ENFERMEDAD DE AUJESZKY
RESUMEN
La enfermedad de Aujeszky o seudo rabia porcina est causada por un alfaherpesvirus que infecta
el sistema nervioso central y otros rganos, como el tracto respiratorio, en prcticamente todos los
mamferos excepto el hombre y los monos sin cola. Se asocia inicialmente con los cerdos, que
representan su hospedador natural, en los que permanece latente despus de la recuperacin
clnica. La enfermedad se controla por aislamiento de las piaras infectadas y mediante el uso de
vacunas y la eliminacin de los animales con infeccin latente.
El diagnstico de la enfermedad de Aujeszky se realiza por deteccin del agente (aislamiento del
virus, reaccin en cadena de la polimerasa [PCR]) y mediante la deteccin de una respuesta
serolgica en animales vivos.
Identificacin del agente: El aislamiento del virus de la enfermedad de Aujeszky se puede lograr
inoculando en una lnea celular susceptible, como la de rin porcino (PK-15) o SK6, o en clulas
de rin de cultivo primario o secundario, un extracto de tejido, por ejemplo de cerebro y
amgdalas, o de material recogido de la nariz/garganta. La especificidad del efecto citoptico se
comprueba por inmunofluorescencia, inmunoperoxidasa o neutralizacin con un antisuero
especfico. Tambin puede identificarse el virus usando PCR, pero esta tcnica es an muy
novedosa.
Pruebas serolgicas: La presencia de anticuerpos contra el virus de la enfermedad de Aujeszky
se demuestra por neutralizacin del virus, aglutinacin en ltex o enzimoinmunoensayo (ELISA).
Se encuentran comercialmente disponibles varios tipos de ensayos ELISA por todo el mundo. Un
suero internacional estandarizado por la OIE define el lmite inferior de sensibilidad para pruebas
rutinarias en los laboratorios que llevan a cabo el diagnstico serolgico de la enfermedad de
Aujeszky.
Desde 1990 es posible distinguir entre los anticuerpos producidos por la infeccin natural y los
originados despus de vacunacin mediante el uso de vacunas con genes eliminados.
Requisitos para las vacunas y los materiales de diagnstico: Las vacunas, bien sean por virus
vivos modificados o por antgenos de virus inactivados, deben evitar o al menos limitar la excrecin
de virus por parte de los cerdos infectados. Recientemente, estas vacunas convencionales se han
visto reforzadas por la aparicin de vacunas con virus vivos de la seudo rabia que llevan genes
eliminados mediante ADN obtenido por transcripcin inversa (rADN) o por virus naturales con
genes incompletos. Los virus usados en estas nuevas vacunas, a veces denominadas vacunas
marcadoras, carecen de una glicoprotena especfica (gG, gE o gC).
A. INTRODUCCIN
La enfermedad de Aujeszky, tambin llamada seudo rabia porcina, est causada por un alfaherpesvirus de la
familia Herpesviridae. El virus infecta el sistema nervioso central y otros rganos, como el tracto respiratorio, en
prcticamente todos los mamferos excepto el hombre y los monos sin cola. Se asocia inicialmente con los
cerdos, que representan su hospedador natural, en los que permanece latente despus de la recuperacin
clnica. La enfermedad se controla por aislamiento de las piaras infectadas y mediante el uso de vacunas y la
eliminacin de los animales con infeccin latente.
320
Captulo 2.2.2. Enfermedad de Aujeszky
Aunque el aislamiento del virus de la seudorrabia (PRV) supone una ayuda en el diagnstico provisional en el
caso de formas letales de la enfermedad de Aujeszky o en su manifestacin clnica en cerdos, se requieren otras
tcnicas y pruebas serolgicas para diagnosticar las infecciones latentes. Sin embargo, excepto los cerdos,
muchos animales infectados no viven lo suficiente como para producir una respuesta serolgica notable.
1.
a)

El diagnstico de la enfermedad de Aujeszky puede confirmarse en cerdos vivos por el aislamiento del PRV
en el flujo buco-farngeo, fluidos nasales (frotis) o biopsias de las amgdalas, o en muestras de cerdos
muertos, o despus de la aparicin de sntomas clnicos tales como encefalitis en herbvoros o carnvoros.
Las muestras de cerebro y de amgdalas son las ms adecuadas para el aislamiento post-mortem de PRV.
En el ganado bovino, la infeccin se caracteriza normalmente por la aparicin de prurito, en cuyo caso
puede ser necesario disponer de una muestra de la correspondiente seccin de la mdula espinal para el
aislamiento del virus. En cerdos con infeccin latente, el ganglio trigmino es el sitio ms apropiado para
aislar el virus, aunque el virus latente es por lo general difcil de cultivar.
Las muestras se homogenizan en solucin salina normal o en medio de cultivo celular con antibiticos y la
suspensin que resulta se clarifica por centrifugacin a baja velocidad, a 900 g por 10 minutos. El
sobrenadante se usa para inocular cualquier sistema de cultivo celular que resulte sensible. Muchos tipos
de lneas celulares o de cultivos celulares primarios son sensibles al PRV, pero se suele emplear una lnea
celular de rin de cerdo (PK-15). El medio para el cultivo debe contener antibiticos (como: 200 UI/ml de
penicilina; 100 g/ml de estreptomicina; 100 g/ml de polimixina; y 3 g/ml de fungizona).
PRV produce un efecto citoptico (ECP) que suele aparecer en 24-72 horas, pero el cultivo celular debe
incubarse por 5-6 das. La monocapa presenta acumulaciones de clulas refringentes, a las que sigue una
separacin completa de la placa de toda la capa celular. Tambin se desarrollan sincitios, que son variables
en forma y tamao. En caso de ausencia de ECP visible, se aconseja hacer un pase a otros cultivos. Se
puede obtener una evidencia adicional mediante tincin con hematoxilina y eosina de cultivos infectados en
cubres para demostrar las inclusiones acidfilas intranucleares caractersticas de los herpesvirus con
marginacin de la cromatina. La identidad del virus debe confirmarse por inmunofluorescencia, por
inmunoperoxidasa, o por neutralizacin con un antisuero especfico.
El aislamiento del PRV confirma la enfermedad de Aujeszky, pero la falta de aislamiento no garantiza la
ausencia de infeccin.
b)
Identificacin del virus por la reaccin en cadena de la polimerasa

La reaccin en cadena de la polimerasa (PCR) puede utilizarse para identificar la presencia de genomas del
PRV en secreciones o en muestras de rganos. Como esta tcnica es an nueva, todava no es posible
especificar un procedimiento estandarizado. Solamente se suministra alguna informacin general al
respecto.
La tcnica de PCR se basa en la amplificacin selectiva de una parte determinada del genoma usando dos
cebadores localizados en cada uno de los extremos de la secuencia seleccionada. En un primer paso, se
asla el ADN completo por mtodos estndar (por ejemplo, mediante digestin con proteinasa K y
extraccin con fenol-cloroformo). Mediante ciclos de desnaturalizacin de ADN que originan moldes de ADN
de cadena nica, por hibridacin de los cebadores, y por sntesis de las secuencias complementarias
utilizando una ADN polimerasa termoestable, las secuencias elegidas se pueden amplificar hasta un milln
de veces. Los cebadores se deben disear de modo que amplifiquen una secuencia que sea comn a todas
las cepas de PRV, por ejemplo se han usado partes de los genes gB o gD, que codifican glicoprotenas
esenciales del virus.
Se puede identificar el producto amplificado por su peso molecular, que se determina por su
desplazamiento en geles de agarosa, y cuando es posible mediante posterior confirmacin por hibridacin
de tipo Southern usando una sonda complementaria. Hay tcnicas ms recientes que implican hibridacin
en medio lquido usando sondas marcadas con enzimas, que dan una reaccin coloreada despus de
incubacin con el substrato adecuado. Una mejora de la tcnica, conocida como PCR combinada, utiliza
dos tipos de cebadores, uno de los cuales se localiza dentro de la secuencia amplificada por el primer tipo
de cebadores. Mediante temperaturas adecuadas de hibridacin en una reaccin de dos pasos, se puede
mejorar la sensibilidad y la especificidad de la PCR.
321
En todos los casos, la principal ventaja de la PCR es su rapidez en comparacin con las tcnicas
convencionales de aislamiento del virus, pues se puede completar una identificacin preliminar en un da y
confirmar el producto de la PCR al da siguiente. Con los equipos ms modernos, todo el proceso se puede
completar en un da. Sin embargo, debido a la naturaleza de la prueba, es necesario tomar muchas
precauciones para evitar la contaminacin de los ensayos con ADN extrao procedente de ensayos previos
o de la contaminacin general ambiental del laboratorio (ver Captulo I.1.5. Pruebas para esterilidad y
ausencia de contaminacin en materiales biolgicos). Esto puede limitar el valor de la prueba en muchos
laboratorios, y por consiguiente la tcnica no se recomienda por completo para diagnsticos de rutina,
aunque existen disponibles mtodos que evitan la contaminacin por ADN ambiental (por ejemplo, el
sistema dUTP-UNG [d-uracil trifosfato/uracil-N-glicosilasa]). Muchos laboratorios de diagnstico deberan
limitar el uso de la PCR a la deteccin de la infeccin latente.
2.
Pruebas serolgicas
Cualquier prueba serolgica debe ser lo suficientemente sensible como para dar un resultado positivo con el
Suero Estndar de Referencia Internacional de la OIE. Este suero se puede obtener del Laboratorio de
Referencia de la OIE para la Enfermedad de Aujeszky en Francia (ver Cuadro de la Parte 3 de este Manual) y
antes de uso debera reconstiturse siguiendo las instrucciones de la hoja de datos. A efectos del mercado
internacional, la prueba debera de ser lo suficientemente sensible para detectar el suero estndar diluido 1/2.
La neutralizacin del virus (NV) es un mtodo de referencia reconocido para serologa (4,27), pero para
diagnstico general ha sido ampliamente reemplazado por el enzimoinmunoensayo (ELISA) a causa de su
adecuacin para ensayos a gran escala (2, 11, 15,17). Las pruebas se pueden realizar con extracto de carne o
con suero.
Tambin se ha desarrollado una prueba de aglutinacin en ltex que puede usarse para la deteccin de
anticuerpos. Existen preparaciones comerciales de la prueba disponibles.
a)
Neutralizacin del virus (una prueba prescrita para el mercado internacional)

En cultivo celular, la prueba NV se puede realizar de varios modos, dependiendo de la duracin de la
incubacin de las mezclas virus/suero (por ejemplo, 1 hora a 37C o 24 horas a 4C) y de la presencia o
ausencia de complemento. La mayora de los laboratorios usan un perodo de reaccin de 1 hora a 37C en
ausencia de complemento porque resulta fcil y rpido. No obstante, la sensibilidad resulta mejorada
aumentando el tiempo de incubacin a 24horas a 4C, lo cual facilita la deteccin de niveles de anticuerpo
10-15 veces menores que los detectados por el mtodo de 1 hora. En el caso del mercado internacional, el
mtodo debe ser validado para que sea lo suficientemente sensible para detectar el Suero Estndar de
Referencia de la OIE a una dilucin 1/2.
No se puede usar la prueba NV para diferenciar los anticuerpos debidos a vacunacin de los debidos a una
infeccin natural. Es una de las dos pruebas disponibles que satisfacen el requisito que la OIE establece en
el captulo Cdigo de Salud de Animales Terrestres cuando se refiere a una prueba diagnstica para el
virus completo.
Clulas: Se usan clulas susceptibles a la infeccin por PRV; pueden ser lneas celulares (por ejemplo PK15, SK6) o cultivos celulares primarios o secundarios.
Medio de cultivo celular: El medio depende del tipo de clulas. Por ejemplo, el medio para clulas PK-15 es
el medio mnimo esencial de Eagle (MEM) + 10% de suero fetal bovino y antibiticos (100 UI/ml de
penicilina y 100 g/ml de estreptomicina, o alternativamente, 50 g/ml de gentamicina).
Mantenimiento de las clulas: Las clulas se cultivan en recipientes para cultivos celulares de, por ejemplo,
75 cm2. Se subcultivan semanalmente una o dos veces por tripsinizacin. En caso de una tripsinizacin
semanal, las clulas se cultivan en 50 ml de medio, con un ndice de multiplicacin de 5. En caso de dos
tripsinizaciones a la semana, las clulas se cultivan en 30 ml de medio, con un ndice de multiplicacin de 3.
Para la tripsinizacin, se elimina el medio de crecimiento una vez que la monocapa celular est completa.
La monocapa se lava con unos 5 ml de una solucin recientemente descongelada de tripsina/cido etiln
diamino tetra-actico (EDTA) (0.25%). Se elimina el lquido de lavado y la preparacin se lava de nuevo,
dejando solo unas cuantas gotas de la solucin de tripsina. El recipiente se coloca en un incubador a 37C
por 5-10 minutos hasta que las clulas se separen. Una vez que la monocapa se haya separado y las
clulas estn bien aisladas, se suspenden en 90 ml de medio de crecimiento, y esta suspensin se
distribuye en tres botellas de 75 cm2 para cultivo celular.
322
Virus: Se mantiene a una temperatura de 70C o inferior, o en forma liofilizada a 4C, una cepa adecuada
de PRV, como la cepa Kojnok o la cepa NIA-3.
Preparacin de una suspensin stock de virus: Se elimina el sobrenadante de una botella de cultivo celular
que contenga una monocapa en completa confluencia. Se aade 1 ml de una suspensin de virus de ttulo
conocido (aproximadamente 107 DICT50/ml [dosis infectiva media en cultivo de tejidos]) y la botella se
incuba a 37C por 1 hora. Luego, se aaden 30 ml de medio de cultivo y se incuba de nuevo la botella a
37C. Se examina frecuentemente la botella hasta que presente cerca de un 75% de destruccin celular
(despus de unas 36-48 horas). A continuacin se congela a una temperatura de 20C o inferior para
romper las clulas.
La botella se descongela despus y se agita vigorosamente. Se recoge el medio y se centrifuga a 1.500 g
por 15 minutos. El sobrenadante se divide en porciones (de unos 0,5 ml) en tubos pequeos que se marcan
(con la fecha y el virus de referencia) antes de almacenarse a una temperatura de 70C o inferior hasta su
uso.
Titulacin de la suspensin stock de virus: La titulacin de la suspensin stock de virus se realiza por el
mtodo de Reed & Muench o el de Karber, y el ttulo se expresa por 50 l y por ml.
La prueba NV requiere un suero de control interno de calidad con un ttulo conocido de anticuerpos
neutralizantes frente a PRV (que debe ser calibrado contra un suero estndar internacional o un estndar
secundario preparado de dicho suero), y un suero como control negativo (de un cerdo que no contenga
anticuerpos especficos, por ejemplo de una piara oficialmente libre de la enfermedad de Aujeszky). Los
mismos sueros de ensayo deben de ser de buena calidad. El suero debe ser separado del cogulo sin
retraso, para evitar toxicidad.
Existen procedimientos cualitativos y cuantitativos para la prueba NV, que se describen a continuacin.
Tcnica cualitativa
i)
Se destruye el complemento del suero calentando en un bao de agua a 56C durante 30 minutos.
ii)
Cada suero sin diluir se coloca en tres pocillos de una placa de microtitulacin de 96 pocillos para
cultivo celular, poniendo 50 l por pocillo.
iii)
A cada pocillo se aaden 50 l de una suspensin del virus que contenga 100 DICT50/50 l (o 2 x 103
TCDI50/ml), obtenida mediante dilucin con MEM de la suspensin stock de virus de ttulo conocido.
iv)
Se agita la placa y se coloca en un incubador durante 1 hora a 37C (la presencia de CO2 es
opcional).
v)
Se aade a cada pocillo 150 l de suspensin celular que contenga aproximadamente 150.000
clulas/ml.
vi)
La placa se cubre (para incubacin en CO2) o se sella cuidadosamente por los bordes de la placa con
un plstico (para incubacin en aire). La placa se agita suavemente para favorecer una distribucin
uniforme de las clulas en el fondo de los pocillos, y se coloca en el incubador a 37C (la presencia de
CO2 es opcional).
vii)
Controles: cada placa debe incluir los siguientes controles:

Control de virus: Tiene como objeto comprobar la cantidad de virus realmente usada en la prueba. La
dosis de virus usada para neutralizacin por suero (diana virca con titulacin de 100 DICT50/50 l) se
diluye 1/10, 1/100 y 1/1.000 con MEM. Se aaden 50 l de cada dilucin en al menos ocho pocillos, a
los que se aaden 50 l de medio antes de incubar los pocillos por 1 hora a 37C. La suspensin
celular se aade del mismo modo que para el suero ensayado.
Control de clulas: En al menos dos pocillos se colocan 150 l de suspensin celular y 100 l de
medio.
Control de suero positivo: Se usa un suero de ttulo conocido de anticuerpos neutralizantes frente a
PRV. Se preparan cinco diluciones del mismo modo que para el suero ensayado: una dilucin que
corresponda al ttulo del suero, diluciones dobles y cudruples, y diluciones a y (equivalente a T,
T/2, T/4, 2T y 4T, donde T es el ttulo del suero, es decir, suero sin diluir para la prueba cualitativa). A
50 l de las diluciones de suero positivo control se aaden 50 l de la suspensin de virus que
contiene100 DICT50/50 l. Los pocillos se incuban y se aade la suspensin celular como en el caso
de los sueros ensayados.
Control del suero: Tiene como objeto comprobar la ausencia de un efecto txico sobre las clulas
debida a los sueros. Los pocillos que contienen 50 l de cada suero se incuban durante 1 hora a 37C
323
en presencia de 50 l de medio. Luego se aaden 150 l de suspensin celular como en el caso de

los sueros ensayados.
Control de suero negativo: Se realiza como en el caso de los sueros ensayados.
viii) Lectura de los resultados: Para examinar los pocillos en cuanto a efecto txico y ECP despus de 48 y
72 horas, se usa un microscopio de imagen invertida (x 100). Para que la prueba sea vlida, los
controles deben dar los siguientes resultados:
Control de virus: El ttulo de la suspensin viral debe estar entre 30 y 300 DICT50/50 l.
Control de clulas: la monocapa de clulas debe aparecer intacta
Control de suero positivo: El ttulo obtenido debe coincidir con el previsto, dentro de una dilucin.
Control de suero: El examen para ECP debe tener en cuenta un posible efecto txico sobre las
clulas.
Control de suero negativo: Debe evidenciarse ECP.
ix)
En los sueros ensayados pueden encontrase los siguientes resultados: Presencia de ECP en tres
pocillos = resultado negativo; ausencia de ECP en tres pocillos a los 3 das = resultado positivo;
presencia de ECP en un pocillo pero no en los otros dos = resultado dudoso, la prueba debe repetirse;
pequeas calvas indicando ECP a los 3 das = resultado dudoso, la prueba debe repetirse; toxicidad
en los pocillos de suero control y de ensayo = resultado no concluyente, la prueba debe repetirse
(cambiar el medio con medio fresco despus de 16 horas de incubacin puede reducir la toxicidad sin
afectar al ttulo de anticuerpo especfico).
x)
Interpretacin de los resultados: Esta prueba es capaz de detectar la presencia o la ausencia de

anticuerpos neutralizantes frente a PRV. Es incapaz de distinguir entre animales vacunados y
animales infectados.
La tcnica descrita (NV por 1 hora a 37C) puede dar resultados negativos falsos y resultados
positivos falsos. Se puede aumentar su sensibilidad (reduciendo la aparicin de negativos falsos)
adoptando un mtodo de neutralizacin de 24 horas de contacto entre el virus y el suero a 4C, antes
de la adicin de las clulas.
Una tcnica cualitativa como sta, que emplea suero sin diluir (dilucin final ), puede originar en
algunos casos un resultado positivo falso debido a neutralizacin inespecfica del virus. Este problema
puede superarse realizando una prueba confirmativa mediante la tcnica cuantitativa (ver a
continuacin).
Tcnica cuantitativa
Es similar al procedimiento cualitativo, pero cada suero se utiliza tanto sin diluir como en diluciones
seriadas. Dependiendo de la precisin deseada, del propsito de la prueba y del ttulo esperado, se usan
uno o ms pocillos para cada dilucin de suero, y un mayor o menor intervalo de diluciones. Tericamente,
el procedimiento puede describirse para un intervalo de diluciones que alcance un mximo inicial de 1/256,
con tres pocillos para cada dilucin.
324
i)
Se destruye el complemento de las muestras de suero por calentamiento en un bao de agua a 56C
por 30 minutos.
ii)
En una placa de microtitulacin para cultivos celulares de 96 pocillos se aaden 50 l de MEM a los
pocillos A3 hasta A6.
iii)
A los pocillos A1 a A3 se aaden 50 l de suero no diluido, y se contina con los pocillos de las filas B,
C, etc., con muestras de otros sueros.
iv)
Usando una pipeta mltiple, se mezcla el contenido de los pocillos de la fila 3, y se transfieren 50 l a
la fila 4, y as hasta la fila 6 o ms hasta una fila predeterminada, usando las mismas boquillas de la
pipeta. Las porciones de 50 l que quedan despus de la ltima fila se desechan.
v)
Se establecen los controles como se indica en la tcnica cualitativa.
vi)
A la fila 1 se aaden 50 l de MEM en vez de virus: esta es una fila control de sueros. En las otras filas
se deposita la suspensin de virus en los pocillos. Las manipulaciones que siguen son las mismas que
se indican en la tcnica cualitativa.
vii)
Lectura de los resultados: El ttulo neutralizante de un suero se expresa como el denominador de la

dilucin ms alta que lleva a cabo una neutralizacin completa del ECP en el 50% de los pocillos. La
neutralizacin se considera positiva a cualquier dilucin (incluso sin diluir, equivalente a una dilucin
final de ). Si el suero solo muestra neutralizacin cuando no est diluido (con crecimiento del virus y
aparicin de ECP a dilucin y subsiguientes diluciones), se aconseja usar pruebas alternativas
(ELISA o aglutinacin por ltex) para confirmar el resultado, o solicitar otra muestra del animal, al
menos 8 das despus de la primera.
b)
Enzimoinmunoensayo (prueba prescrita para el mercado internacional)

La sensibilidad de las tcnicas ELISA suele ser superior a la de la prueba NV usando 1 hora de
neutralizacin sin complemento. Algunos sueros dbilmente positivos son detectados ms fcilmente por
pruebas de tipo NV cuando se usa neutralizacin por 24 horas, mientras que otros resultan ms fciles de
detectar por tcnicas ELISA.
Para medir los niveles de anticuerpo, las preparaciones ELISA que estn en el mercado usan tcnicas
indirectas o competitivas. Difieren en el modo de preparacin del antgeno, del conjugado, o del substrato,
por el tiempo de incubacin y por la interpretacin de los resultados. Una ventaja general es que permiten
un rpido procesamiento de gran nmero de muestras. Esto puede automatizarse y que los resultados sean
analizados por ordenador. Algunas de estas preparaciones comerciales permiten diferenciar entre animales
vacunados o infectados naturalmente cuando se usan con una vacuna a juego (6, 20, 21).
Alternativamente, se pueden adoptar protocolos ELISA no comercializados (2,17) con tal de que sean
capaces de detectar como positivo el Suero Estndar de Referencia Internacional de la OIE a una dilucin
de (sensibilidad mnima a efectos de mercado internacional). Se recomienda usar una preparacin
comercial o casera que haya sido validada por este estndar mediante pruebas externas de control de
calidad realizadas por un laboratorio independiente. A continuacin se presenta un protocolo adecuado de
ensayo para anticuerpos frente a virus completos (17).
i)
Se usa una lnea celular sensible a PRV, como la PK-15 o clulas testiculares de cerdo fetal. Debe
estar libre de virus exgenos, como el virus de la diarrea bovina vrica. Las clulas deben dividirse
para subcultivo y sembrarse en recipientes nuevos de 75 cm2 el da antes de la inoculacin. Para
cubrir al cultivo se usa un medio adecuado como el MEM, sin suero.
ii)
A lo largo del procedimiento se procesan en paralelo recipientes inoculados con virus y otros no
inoculados como control. Se usa una cepa PRV apropiada y bien caracterizada, como la cepa
Kojnock. Cuando se desarrolla una monocapa celular confluente (hacia las 24 horas despus de la
siembra), se inocula con 108 DICT50 de PRV en 5 ml de medio; y se aaden 5 ml de medio (sin virus)
a los recipientes control. Los cultivos se dejan 30 minutos a 37C para que ocurra la adsorcin, y luego
se recubren con 20 ml de medio.
iii)
En el momento que comienza a aparecer el ECP, se retira el medio sobrenadante y se aaden 4 ml de

KCl (solucin 4 mM) y perlas de vidrio. Los frascos se agitan suavemente para separar las clulas.
iv)
Las clulas se lavan tres veces mediante centrifugacin a 770 g en KCl 4 mM. El precipitado se
resuspende en 4 mM de KCl con 0.2% de Triton X-100 (1 ml por recipiente) mediante 60 golpes en un
homogenizador de vidrio.
v)
El homogenizado celular se coloca sobre una solucin de sacarosa 0.25 mM en KCl 4 mM y se

centrifuga por 10 minutos a 770 g.
vi)
El precipitado se resuspende en tampn de dilucin del antgeno, pH 9,6 (0,1 M de Tris, 2 mM de

EDTA, 0,15 mM de NaCl) hasta 1/50 del volumen original del medio de cultivo. Despus puede
guardarse a 70C en pequeas alcuotas. En esta forma el antgeno es estable durante 2 aos.
Recubrimiento de las placas de microtitulacin
i)
El antgeno vrico y el control (sin virus) s diluyen en tampn de dilucin, pH 9,6 (ver arriba) hasta una
dilucin predeterminada en titulaciones de doble entrada por el mtodo del tablero de ajedrez.
ii)
En cada pocillo de una placa para ELISA de 96 pocillos se ponen 200 l de antgeno, recubriendo filas
alternadas con antgeno PRV positivo y con control de antgeno. Se incuba por 18 horas a 4C,
iii)
Las placas se lavan tres veces con solucin de lavado (Tween 20, 0,5ml/litro).
iv)
Las placas recubiertas se guardan a 20C o a 70C. Son estables durante varios meses.
i)
Las muestras de los sueros de ensayo se diluyen 1/30 en tampn PBS/Tween, pH 7,2 (137 mM de
NaCl, 9,5 mM de tampn fosfato, 0,5 ml/litro de Tween 20)
ii)
A los pocillos recubiertos con antgeno vrico y con control de antgeno se aaden las muestras
diluidas, y se incuba a 37C por 30 minutos.
iii)
Las placas se lavan tres veces con solucin de lavado (0,5 ml/litro de Tween 20).
325
iv)
Se aade a todos los pocillos el conjugado protena A/peroxidasa a una dilucin predeterminada en
tampn PBS/Tween, pH 7,2 (ver arriba) suplementado con la fraccin V de seroalbmina bovina
(10 g/litro), y las placas se incuban a 37C por 30 minutos.
v)
Las placas se lavan tres veces con solucin de lavado (0,5 ml/litro de Tween 20).
vi)
Se aade a cada pocillo de la placa una mezcla apropiada de cromgeno/substrato, tal como tetra
metil benzidina (TMB)/perxido de hidrgeno.
vii)
La reaccin se detiene con 2 mM de cido sulfrico. Se lee la absorbancia a 492 nm.
La prueba debe ser validada por completo usando sueros negativos y positivos, y calibrada frente al Suero
Estndar de Referencia Internacional de la OIE. Todos los ensayos deben incluir controles internos
positivos y negativos, incluyendo uno dbilmente positivo que, cuando se diluya ala dilucin apropiada para
el ensayo, tenga una actividad equivalente a la dilucin del Suero Estndar de Referencia Internacional
de la OIE. Para ms detalles, vase la referencia 17 y el Captulo I.1.3. Principios de validacin para
pruebas diagnsticas de enfermedades infecciosas. Los equipos comerciales de ELISA tambin tienen que
ser validados en el rango en el que van a ser usados.
Adems de para el ensayo de sueros, los mtodos ELISA se pueden adaptar a ensayos en disco de papel
de filtro que han sido impregnados de una pequea cantidad de sangre obtenida por puncin de una vena
superficial. Esta tcnica es adecuada para recoger muestras de sangre de un nmero elevado de cerdos
(3,18). Los discos se secan al aire antes de enviarlos al laboratorio.
Varias autoridades responsables del control han definido los requisitos para la deteccin de anticuerpos
frente a gE por ELISA en cerdos destinados al sacrificio, que van a ser introducidos en zonas libres de la
enfermedad de Aujeszky. El Cdigo Internacional de Salud Animal de la OIE especifica las circunstancias
en las que pueden usarse pruebas especficas para gE. Las tcnicas ELISA para gE tambin se pueden
adaptar para ensayos de sangre sobre discos de papel de filtro.

La enfermedad de Aujeszky se puede controlar usando vacunas que contienen virus vivos modificados o
antgenos vricos inactivados. Recientemente, estas vacunas convencionales se han suplementado con vacunas
vivas recombinantes derivadas de PRV cuyo ADN presenta genes eliminados o con vacunas vivas de PRV con
delecciones naturales. Estas nuevas vacunas, a veces denominadas vacunas marcadoras, estn hechas con un
virus que carece de una glicoprotena especfica (normalmente la gE, aunque tambin se han descrito vacunas
carentes de la gG o gC). Al menos una vacuna disponible comercialmente tiene delecciones dobles. Respecto a
las vacunas convencionales con virus completo, estas vacunas marcadoras con genes eliminados tienen la
ventaja de que es posible distinguir a los animales vacunados no infectados de aquellos otros con una infeccin
natural. Esto se hace mediante pruebas para anticuerpos dirigidos contra la protena codificada por el gen
eliminado, que estarn ausentes en cerdos no infectados vacunados con vacunas marcadoras pero presentes en
cerdos con infeccin natural. Por tanto, en pases con cerdos infectados, donde se planee la erradicacin de la
enfermedad de Aujeszky, estas vacunas marcadoras son las vacunas de eleccin. Se describen las normas
estndar aplicables a la produccin de vacunas con virus vivos e inactivados. En lo que respecta a vacunas
marcadoras, las pruebas deben incluir la demostracin en cerdos vacunados de la ausencia de una respuesta
serolgica a la protena codificada por el gen eliminado, y adems la demostracin de respuesta a la misma
protena en cerdos vacunados que estn infectados por el virus natural.
Las directrices para la produccin de vacunas veterinarias se presentan en el Captulo I.1.7. Principios de la
produccin de vacunas veterinarias. Las normas dadas aqu y en el Captulo I.1.7 tratan de ser de naturaleza
general y se pueden suplementar con requisitos nacionales y regionales.
1.
Control del inculo
a)

Las vacunas se producen mediante un sistema de lotes de inculo en que se prepara un inculo de virus
original (MSV) a partir de una cepa adecuada del virus de la enfermedad de Aujeszky. Para la produccin
de vacunas se usan varias cepas. En una vacuna inactivada el antgeno puede ser una de las muchas
cepas de tipo natural, o el virus Bucharest con delecciones naturales, o virus con genes eliminados a travs
de ADN recombinante. Las vacunas vivas convencionales con virus modificado y las vacunas con virus con
ADN modificado por ingeniera gentica usan muchas cepas, como la Bartha (8-10, 14, 16, 22,26), o
derivan del aislamiento original de Aujeszky o de otros aislamientos naturales, como la cepa NIA-3.
326
Se recomienda que para diferenciar entre animales vacunados e infectados deberan usarse cepas con
delecciones.
En la elaboracin del MSV se debe realizar una prueba de identidad del virus (usando una prueba de
anticuerpo fluorescente, una prueba de neutralizacin [mtodo de suero constante/virus decreciente], o
cualquier otra prueba de identidad adecuada).
El MSV debe estar libre de micoplasmas, bacterias, hongos, virus citopatognicos o hemadsorbentes,
parvovirus porcino, pestivirus ovinos y bovinos citopticos y no citopticos, y otros agentes ajenos, como
circovirus, segn se determina por cultivo y por procedimientos de anticuerpo fluorescente, o por otros
mtodos como PCR.
b)
Mtodo de cultivo
La mayor parte de las lneas celulares que se usan para propagar el PRV son lneas continuas, como la
lnea PK-15. Se establece un stock original de clulas (MCS) a un nivel determinado de nmero de pases.
El MCS y el nivel ms alto de pases (MCS x n) que se usa en la preparacin de un producto biolgico se
detalla en un Diseo de Produccin. Tanto MCS como MCS x n se controlan de varios modos para
caracterizar la lnea celular y para asegurar que est libre de agentes exgenos. Las clulas porcinas se
ensayan para citomegalovirus porcino, para el virus de la diarrea bovina/virus de la fiebre porcina clsica,
virus de la rabia, fiebre porcina africana, influenza porcina, sndrome respiratorio y reproductivo porcino, y
estomatitis vesicular. Esta lista se puede modificar si el pas de origen de las clulas est exento de una
enfermedad determinada.
El MCS se debe controlar en cuanto a la especie original. Debe examinarse un mnimo de 50 clulas
mitticas tanto en el MCS como al nivel de pases MCS x n. El nmero modal en el MCS x n no debe
superar el 15% del nmero modal del MCS. Cualquier marcador cromosmico en el MCS debe estar
tambin presente despus del nmero ms alto de pases celulares.
Si existe evidencia de que la lnea celular puede inducir dao en la especie para la cual est dirigido el
producto, se prueba la lnea celular en cuanto a capacidad tumoral y oncogenicidad.
c)

i)
Pureza
El MSV debe estar libre de micoplasmas, bacterias, hongos, virus citopatognicos o hemadsorbentes,
parvovirus porcino, pestivirus ovinos y bovinos citopticos y no citopticos, y otros agentes ajenos,
como circovirus, segn se determina por cultivo y por procedimientos de anticuerpo fluorescente, o por
otros mtodos como PCR.
ii)
Pruebas de estabilidad
Deben realizarse pruebas para comprobar la caducidad propuesta por el fabricante. Estas pruebas
deben estar basadas siempre en estudios de tiempo real; deben hacerse sobre un nmero suficiente
de lotes (al menos tres) que se produzcan siguiendo el proceso de produccin descrito y sobre los
productos almacenados en el recipiente final, y normalmente comprenden pruebas sobre la estabilidad
biolgica y fisicoqumica. El fabricante debe suministrar los resultados de los anlisis que apoyan la
caducidad propuesta en todas las condiciones de almacenamiento previstas. Por lo general, la
caducidad propuesta corresponde al perodo en que el producto se mantiene estable menos tres
meses.
iii)
Pruebas de seguridad
Se deben examinar reacciones locales y generales. Cuando se emplea una vacuna viva, es necesario
diferenciar las propiedades exactas de seguridad de la cepa vacunal de aquellas otras del producto
final si ste contiene un adyuvante.
En general, la seguridad se prueba inicialmente en condiciones experimentales. Cuando se conocen
los resultados de esta prueba preliminar, es necesario incrementar el nmero de animales vacunados
para evaluar la seguridad de la vacuna bajo condiciones prcticas.
Pruebas de laboratorio
Todas las pruebas se deben realizar en cerdos que no tengan anticuerpos contra el virus de la
enfermedad de Aujeszky o contra una fraccin del virus.
a.
Efectos generales
1.
Vacunas vivas
Las pruebas intranasales y la vacunacin de lechones de 3-5 das son muy tiles para determinar el
grado de seguridad de una vacuna. Deben usarse al menos cinco lechones.
327
Especialmente en el caso de las vacunas vivas, tambin resulta importante determinar las
propiedades de una vacuna en los animales a los que va dirigida bajo condiciones normales de uso y
a la edad ms temprana a la que se pretende vacunar; por ejemplo, en cerdos para engorde, que
normalmente se vacunan cuando tienen una edad entre 9 y 12 semanas, y en cerdas preadas hay
que determinar cundo se recomienda este uso de la vacuna por el fabricante y si este uso est
autorizado. Despus de la vacunacin no se deberan observar sntomas clnicos, incluyendo
reacciones trmicas significativas. Estos ensayos tienen que realizarse en al menos diez cerdos
vacunados, usando cerdos no vacunados como control.
Se debe examinar la reversin de la virulencia despus de pases seriados. La vacunacin inicial se
hace por la ruta intranasal. Se realiza al menos una serie de cinco pases en lechones. Si fuera
necesario, el organismo se propaga in vitro entre cada dos pases in vivo. En cada pase se deben
utilizar no menos de dos animales susceptibles.
El objeto de estas pruebas es determinar la estabilidad gentica de las cepas de la vacuna viva. Las
pruebas son menos necesarias cuando se emplea una cepa viva modificada genticamente, en
especial si contiene genes eliminados.
Se recomienda comprobar la posible excrecin de la cepa vacunal. A estos efectos, un mnimo de 14
lechones de 3-4 semanas reciben una dosis individual de vacuna por la ruta recomendada y en el sitio
adecuado. Se mantienen cuatro lechones no vacunados como control de contacto. Se realizan
pruebas individuales de sensibilidad apropiada para detectar el virus en las secreciones nasales y
orales del modo siguiente: se toman diariamente frotis nasales y orales desde el da anterior a la
vacunacin hasta 10 das despus de la vacunacin. Las cepas vacunales que se aslen de las
secreciones nasales u orales obtenidas de los cerdos en los que la vacuna se administra por va
parenteral no son recomendables.
La capacidad de la cepa de PRV presente en la vacuna para extenderse de un cerdo vacunado a otro
no vacunado (difusin) debe probarse usando la ruta de administracin recomendada que presente el
mayor riesgo de extensin. Como este fenmeno es difcil de detectar, se hace necesaria la repeticin
(cuatro veces) de los ensayos. Cada vez se deben usar cuatro lechones para vacunacin y colocarlos
en contacto, al da siguiente, con dos lechones no vacunados. Tambin puede resultar necesario
examinar la difusin de la cepa a otras especies no relacionadas que puedan ser susceptibles a la
cepa vacunal.
Las vacunas vivas atenuadas se prueban respecto a sus efectos generales administrando diez veces
la dosis de trabajo a lechones de 5-10 das de edad. La administracin de esta superdosis hace
posible detectar reacciones que no se producen en condiciones normales de uso. Tales reacciones se
pueden producir accidentalmente cuando se vacunan muchos animales.
2.
Vacunas inactivadas
Es importante probar las vacunas inactivadas en los animales a los que van dirigidas bajo condiciones
normales de uso para cerdos y cerdas cuando este uso es el pretendido por el fabricante y est
autorizado (25). Como se ha descrito antes, es fundamental utilizar criterios objetivos y cuantificables
para detectar y medir reacciones adversas en grupos vacunados y grupos control, como cambios en la
temperatura, rendimiento en el peso, tamao de las camadas, capacidad reproductora, etc. Las
pruebas deben realizarse por administracin de la vacuna a la dosis recomendada y por la ruta
apropiada de inoculacin en los cerdos a la que va dirigida.
Los cerdos y las cerdas se suelen mantener en observacin y sometidos a examen hasta que
cualquier reaccin haya desaparecido. El perodo de observacin no debe ser menor de 14 das desde
la administracin. Dicho perodo se extiende cuando, por ejemplo, se usa la vacuna en cerdas
preadas y resulta necesario determinar los posibles efectos de la vacuna en la capacidad
reproductora. En tal caso, el perodo de observacin dura todo el embarazo.
Las autoridades de control generalmente exigen una vacunacin con dosis doble de modo que las
reacciones adversas, que pueden estar bajo el lmite de deteccin cuando se administra una dosis
simple, resulten ms fcilmente detectadas.
b.
Reacciones locales
Las reacciones locales se asocian a menudo con el uso de vacunas inactivadas, ya que estos efectos
laterales pueden inducirse por la presencia de adyuvante, en particular por adyuvantes lipdicos (23).
No obstante, algunas vacunas vivas contra la enfermedad de Aujeszky se mezclan con adyuvantes
diferentes, lo que modifica lo que se observ en el pasado.
Las reacciones locales son fundamentalmente inflamatorias y ms o menos complicadas (necrticas o
supurativas) dependiendo de la naturaleza del adyuvante usado y de las condiciones aspticas de la
vacunacin. Los adyuvantes con aceite pueden provocar una variedad de efectos que incluyen
degeneracin muscular, granuloma, fibrosis y formacin de abscesos. Adems de la naturaleza del
aceite usado (la intensidad de la reaccin se reduce cuando en la vacuna se emplean aceites
metabolizables), el tipo de la emulsin empleada (agua/aceite, aceite/agua, agua/aceite/agua) provoca
328
una mayor o menor extensin de estas reacciones. En consecuencia, es necesario observar el lugar
de la inyeccin no solo desde fuera, sino tambin por diseccin despus del sacrificio, en especial en
el caso de cerdos para productos finales.
Pruebas de campo
Todas las pruebas deben hacerse con cerdos que no tengan anticuerpos contra el virus de la
enfermedad de Aujeszky o contra una fraccin del virus, aunque algunas pruebas se pueden realizar
usando animales con inmunidad materna.
Las pruebas de campo son necesarias para determinar la seguridad de la vacuna contra la
enfermedad de Aujeszky en un gran nmero de cerdos o cerdas . En Europa (7), las pruebas se
deben hacer en cada categora de animales a los que se intenta vacunar (cerdas, cerdos de engorde).
Se usan al menos tres grupos con no menos de 20 animales cada grupo, y el grupo control
correspondiente de al menos 10 animales. En el momento de la vacunacin, y 24 y 48 horas despus,
se mide la temperatura rectal de cada animal. En el sacrificio, se debe examinar para reacciones
locales el sitio de la inyeccin. Si la vacuna se usa en cerdas, debe registrarse la capacidad
reproductora. Los ensayos de campo se suplementan con estudios de laboratorio sobre la existencia
de correlacin entre eficacia y potencia de la vacuna.
iv)
Pruebas de eficacia
Ensayos de laboratorio
Todas las pruebas deben hacerse con cerdos que no tengan anticuerpos contra el virus de la
enfermedad de Aujeszky o contra una fraccin del virus, aunque algunas pruebas se pueden realizar
usando animales con inmunidad materna.
a.
Determinacin de inmunidad pasiva
Para probar la eficacia de las vacunas, es importante reflejar las condiciones naturales de la infeccin
(1). La infeccin por PRV origina prdidas importantes de lechones en cerdas no inmunizadas. Por
tanto, cuando se vacunan cerdas de vientre, el principal objetivo es proteger a los lechones mediante
la inmunidad pasiva a travs del calostro que se ingiere despus del nacimiento, junto con el objetivo
secundario de evitar abortos.
Se han desarrollado modelos experimentales para medir esta inmunidad pasiva y la proteccin
inducida en cerdas por la vacunacin. Las cerdas se vacunan durante el embarazo siguiendo el
procedimiento vacunal, Cuando, por ejemplo, los lechones tienen 6-10 das se les expone a una cepa
virulenta de PRV por va intranasal. Es preferible usar una cepa cuya titulacin se exprese en dosis
letales medias (LD50). Cada cerdo debe inocularse por la ruta nasal con 1 ml que contenga 102 LD50
para cerdo. La eficacia de la vacuna se determina comparando sntomas clnicos, y lo que es adems
ms importante, la mortalidad en lechones de cerdas no vacunadas respecto a la observada en
lechones de cerdas vacunadas.
Los lechones de cerdas vacunadas pueden tener un 80% de proteccin contra la mortalidad en
comparacin con los de cerdas control. Para que los resultados sean significativos se recomienda usar
ocho cerdas vacunadas y cuatro cerdas control (dependiendo de un nmero satisfactorio de lechones
por cada cerda).
b.
Determinacin de la inmunidad activa
1.
Proteccin clnica
Para medir la inmunidad activa inducida en cerdos por vacunacin se pueden seguir varios criterios.
Por lo general, los cerdos se vacunan al principio del perodo de crecimiento, es decir, cuando tienen
de 9 a 12 semanas de edad. Los ensayos de laboratorio se hacen mediante estmulos de desafo en
cerdos al final del perodo terminal, cuando pesan entre 80 y 90 kg.
En general, para estimar la proteccin clnica de los cerdos despus de la vacunacin y el estmulo de
desafo se usan al menos tres criterios, tales como las temperaturas rectales, las prdida de peso y los
sntomas clnicos (5). Los ttulos de anticuerpos tienen poco valor en la prediccin de la eficacia de las
vacunas. La prdida de peso comparativa entre grupos vacunados y grupos control suele ser el
parmetro ms repetitivo y fiable cuando las condiciones del estmulo de desafo estn bien
estandarizadas. La medida de la diferencia en ganancia o prdida de peso entre los dos grupos de
cerdos, y el intervalo temporal transcurrido desde el desafo (da 0 y da 7) tiene un valor de prediccin
muy bueno para la eficacia de la vacuna (13). Se pueden obtener resultados importantes cuando se
comparan los rendimientos en peso de un grupo de al menos ocho cerdos vacunados con otro grupo
control de ocho cerdos no vacunados.
En la prueba de desafo, normalmente se prefiere usar una cepa virulenta de elevado ttulo, pues esto
hace posible obtener diferencias ms marcadas entre los cerdos vacunados y los cerdos control.
Sobre la base de trabajos previos, puede ser suficiente una dosis de estmulo con al menos
106 DICT50/ml de cepa virulenta que no haya tenido ms de tres pases en clulas primarias, pero se
329

recomienda un ttulo mayor (107.5 DICT50/ml). Se debe usar la ruta buco-nasal para el estmulo de los
cerdos introduciendo la cepa virulenta en un volumen alto apropiado (> 4 ml).
Este mtodo de evaluar la eficacia de las vacunas con PRV est en la actualidad bien probado y ha
permitido establecer un ndice objetivo para determinar la eficacia de una vacuna. Tal ndice, que
compara la prdida relativa de peso entre cerdos vacunados y cerdos control, puede tambin ser
usado para probar la potencia de los lotes antes de su distribucin y para la prueba de eficacia de los
lotes. Sin embargo, el valor del ndice de corte ser diferente si las condiciones del ensayo no son
idnticas. La influencia de la inmunidad adquirida pasivamente por anticuerpos derivados de la madre
debe de ser evaluada de modo adecuado.
2.
Excrecin de virus virulento
Adems, es deseable que las vacunas eviten o al menos limiten la excrecin de virus en los cerdos
infectados (12, 19, 24). Cuando un programa de control de la enfermedad de Aujeszky se basa en la
vacunacin a gran escala, es esencial escoger las vacunas o el esquema de vacunacin que mejor
limite la multiplicacin del virus virulento en cerdos infectados. A este respecto se han realizado varios
ensayos para comparar las vacunas.
Generalmente los cerdos se vacunan y se estimulan despus a diferentes edades. Lo mejor, pero lo
ms laborioso en trminos de tiempo, es infectar a los cerdos al final del tiempo del mantenimiento.
Para medir la excrecin de virus, se toman diariamente de cada cerdo frotis nasales (tomados a 10 cm
de profundidad en la nariz) desde el da anterior a la estimulacin de desafo hasta al menos doce das
despus. Los bastoncillos de algodn se pueden pesar antes del muestreo e inmediatamente despus
para calcular el peso exacto del mucus recogido. Se aade luego medio a cada tubo que contiene la
muestra de frotis. El virus se titula a partir del medio despus de congelacin y descongelacin.
Se pueden utilizar diferentes ndices arbitrarios para expresar la cantidad de virus virulentos
excretados por los cerdos, teniendo en cuenta la duracin y el nivel de la excrecin de virus, y el
nmero de cerdos que excretan virus virulentos.
3.
Se recomienda que cualquier afirmacin en cuanto a la aparicin y duracin de la inmunidad est

apoyada por datos de ensayos. La determinacin de la duracin de la inmunidad puede basarse en
ensayos de estmulos de desafo o, en la medida de lo posible, en pruebas inmunolgicas y
serolgicas.
Ensayos de campo
En trminos generales, resulta muy difcil determinar la eficacia de una vacuna en poblaciones
animales. Para hacer esto sera necesario vacunar a los animales en ausencia del patgeno contra el
que protege la vacuna, esperar luego al momento de la infeccin y comparar los efectos de la
infeccin en los animales vacunados (o en la descendencia de cerdas vacunadas) con los efectos en
los no vacunados de la misma edad, en el mismo edificio y del mismo lote que los animales
vacunados (o los protegidos por inmunizacin pasiva). Como todas estas condiciones son difciles de
lograr en el campo, los ensayos de campo son ms apropiados para pruebas de seguridad que para
pruebas de eficacia.
2.
Mtodo de produccin
Como inculo para un producto vacunal solo se puede usar un MSV que se haya establecido que es puro. Las
clulas del MCS se propagan en medios muy diversos. Todos los lotes de vacuna deben proceder de entre el
primer y el vigsimo pase del MCS.
3.
Control interno
Es necesario realizar pruebas en cada una de las fases crticas del proceso de produccin. Las pruebas de
control se realizan tambin sobre productos intermediarios en la idea de comprobar la solidez del proceso de
produccin y del producto final.
4.
Control de lotes
Resulta importante diferenciar las pruebas llevadas a cabo de modo rutinario para distribuir los lotes de producto
final de aquellas que se realizan para definir las propiedades biolgicas de una vacuna. Los ensayos para
distribucin de los lotes no son los mismos que los efectuados para determinar la eficacia y seguridad de una
vacuna. Los controles de los lotes para distribucin son siempre ensayos a corto plazo, tan baratos como sea
posible, y no siempre realizados en cerdos. Su principal finalidad es asegurar la reproducibilidad de la calidad del
producto acabado, que tiene que coincidir con la calidad definida inicialmente en la solicitud para autorizacin de
la publicidad.
330
a)
Pruebas de esterilidad y pureza

Se deben hacer pruebas de esterilidad y ausencia de contaminacin (ver Captulo I.1.5.)
Cada lote de vacuna con PVR debe ensayarse para comprobar la ausencia de virus ajenos. La cepa viva
de la vacuna se neutraliza con una mnima cantidad de antisuero monoespecfico y se inocula en cultivos
celulares que sean sensibles a virus patgenos para el cerdo. No se debera detectar ECP ni agentes con
propiedades de hemadsorcin. Las vacunas deben estar exentas de pestivirus.
b)
Inactivacin
En las vacunas inactivadas se debe comprobar la inactivacin efectuando dos pases en el mismo tipo de
cultivo celular que se us en la produccin de la vacuna. Se pueden realizar pruebas vacunando animales
susceptibles tales como conejos.
c)
Identidad
Cuando sea necesario, se debe realizar una prueba especfica de identificacin del virus.
d)
Seguridad
En las vacunas vivas la seguridad se prueba administrando diez dosis de vacuna reconstituida por la ruta
mencionada en la hoja de instrucciones a por lo menos dos lechones de la edad mnima recomendada para
vacunacin y que estn libres de anticuerpos frente a PRV. Se mantienen dos lechones del mismo origen y
edad como control. No deberan ocurrir reacciones locales anormales ni sistmicas. La curva de peso de los
lechones vacunados no debera diferir mucho de la de los controles.
En las vacunas inactivadas, la seguridad se prueba inyectando dos dosis a lechones en las mismas
condiciones que las descritas anteriormente.
e)
Potencia
Se debe demostrar la potencia de la vacuna utilizando un mtodo apropiado, cuyo resultado tiene que
correlacionarse con las pruebas de eficacia descritas anteriormente.
El punto ms difcil de esta clase de prueba es determinar un umbral de aceptabilidad para usar o rechazar
el lote de acuerdo con los resultados obtenidos.
Las pruebas sobre el contenido en virus deberan realizarse usando al menos tres recipientes distintos. Se
debe determinar el ttulo del virus en la vacuna y, en general, no debera de ser superior a 1/10 de la dosis
empleada para comprobar que la vacuna era segura ni inferior al ttulo mnimo de distribucin.
f)
Conservantes
Si el producto final no contiene conservantes, el fabricante debe demostrar que el producto permanece
aceptable durante el perodo de uso recomendado despus de abrir el vial.
Debe demostrarse la eficacia de los conservantes en recipientes multidosis de vacuna. Tambin debe
comprobarse la concentracin del conservante en la vacuna final completa y su persistencia durante el
perodo de caducidad.
g)
Toda informacin sobre posibles reacciones adversas provocadas por la vacuna debe indicarse. Cualquier
riesgo potencial para la salud humana en caso de que el usuario reciba accidentalmente una pequea
cantidad del producto tiene que indicarse. El fabricante debera sealar todas las condiciones de uso de la
vacuna: mezcla, reconstitucin, almacenamiento, asepsia, longitud de la aguja, ruta de administracin y
estado sanitario de los animales vacunados.
5.
a)
Seguridad
Cada lote de vacunas se debe probar en cuanto a seguridad, como se describe en la Seccin C.4.d.
b)
Potencia
Cada lote de vacunas se debe probar en cuanto a potencia, como se describe en la Seccin C.4.e.
331
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*
* *
NB: Existen laboratorios de referencia de la OIE para la enfermedad de Aujeszky (vase Cuadro en la Parte 3 de
este Manual de animales terrestres o consulte la pgina Web de la OIE para una lista ms actualizada:
www.oie.int).
333
CAPTULO 2.2.3.
EQUINOCOCOSIS/HIDATIDOSIS
RESUMEN
El diagnstico de la equinococosis en perros u otros carnvoros susceptibles depende de la
demostracin de los cestodos del gnero Echinococcus en sus heces o en el intestino delgado. En
los hospedadores intermediarios, el diagnstico depende de la deteccin de la forma larvaria
qustica que puede infectar casi cualquier rgano, y en particular el hgado y los pulmones.
Identificacin del agente: Hasta la fecha, se consideran vlidas desde el punto de vista
taxonmico cuatro especies del gnero Echinococcus. Estas son E. granulosus, E. multilocularis,
E. oligarthrus y E. vogeli. Las dos ltimas especies se encuentran con menos frecuencia que las
otras. Las cuatro especies son morfolgicamente distintas tanto en el estado adulto como larvario.
Se han descrito distintas variantes intraespecficas de E. granulosus, que muestran caractersticas
morfolgicas y biolgicas y que se pueden diferenciar de manera fiable mediante el anlisis del
ADN.
Habitualmente las formas larvarias de Echinococcus se pueden detectar visualmente en los
rganos. Se debe tener un cuidado especial para realizar el diagnstico especfico de la
equinococosis en los casos en los que tambin Taenia hydatigena es un problema en las ovejas.
El examen histolgico puede confirmar el diagnstico despus de que el material fijado con
formalina se procese mediante mtodos convencionales de tincin. Se puede considerar como
una caracterstica especfica de los metacestodos de Echinococcus la presencia de una capa
laminada acelular, positiva a la tincin de cido peridico de Schiff, con o sin una membrana
germinal nucleada y celular interna. La identificacin de las larvas de E. multilocularis en roedores
y otros hospedadores es posible mediante el examen macroscpico o microscpico y mediante la
deteccin del ADN empleando la reaccin en cadena de la polimerasa (PCR).
En la necropsia se utiliza el intestino delgado para detectar la forma adulta de Echinococcus spp.
en carnvoros salvajes o domsticos. Generalmente, se ha adoptado el uso de arecolina en los
estudios llevados a cabo para determinar la prevalencia de Echinococcus granulosus en perros.
La manipulacin del material infectado representa un riesgo para el operador de contraer una
enfermedad potencialmente fatal. Se est consiguiendo un progreso significativo en el desarrollo
de las pruebas inmunolgicas para el diagnstico de las infecciones intestinales debidas a
Echinococcus utilizando mtodos de deteccin de coproantgenos. En la actualidad la tcnica se
est empleando en el estudio de E. multilocularis en poblaciones de zorros, perros y gatos. Es
posible la deteccin de coproantgenos en muestras fecales recogidas a partir de animales vivos o
muertos o procedentes del medio ambiente.
En la actualidad se han establecido como tcnicas de diagnstico en los laboratorios
especializados los mtodos PCR/ADN para la deteccin en hospedadores definitivos de
E. multilocularis y ms recientemente de E. granulosus.
Pruebas serolgicas: Se pueden detectar anticuerpos dirigidos contra antgenos de las
oncosferas, fluidos qusticos y protoesclices en el suero de ovejas y perros infectados, pero, hoy
en da, esta aproximacin es de una utilidad prctica limitada ya que no diferencia entre
infecciones actuales y previas. Tambin puede haber reaccin cruzada entre las especies de
Echinococcus y Taenia.
Requisitos para las vacunas y los materiales de diagnstico: Se ha logrado un progreso
excelente en el desarrollo de una vacuna contra el estado larvario de E. granulosus en ovejas y
vacas.
334
Captulo 2.2.3. Equinococosis/Hidatidosis
A. INTRODUCCIN
Hasta la fecha, desde el punto de vista taxonmico, se aceptan cuatro especies del gnero Echinococcus,
denominadas E. granulosus, E. multilocularis, E. oligarthrus, y E. vogeli. Son morfolgicamente distintas tanto en
su estado adulto como larvario. Se han descrito distintas variantes interespecficas e intraespecficas en el caso
de E. granulosus. Algunos genotipos de E. granulosus exhiben rasgos caractersticos que justificaran el
reconocimiento como especies separadas de acuerdo con algunos autores. Recientemente, se han propuesto
otras especies y genotipos de Echinoccocus (21). Se necesitan estudios posteriores para definir el rango
completo de diversidad gentica (12, 15, 16, 20). Echinococcus granulosus tiene una distribucin mundial. E.
multilocularis se encuentra en zonas amplias del Hemisferio norte, y E. oligarthrus y E. vogeli estn confinadas
en Amrica central y Sudamrica. Las cuatro especies son infectivas para el hombre y causan varias formas de
equinococosis. La equinococosis qustica humana, causada por E. granulosus y la equinococosis alveolar,
causada por E. multilocularis, se consideran de inters para la salud pblica en muchas partes del mundo (22).
Echinococcus granulosus
El parsito se transmite entre los perros domsticos y varias especies unguladas domsticas. El ciclo ms
importante es el del perro/oveja. Tambin pueden existir hospedadores intermediarios y definitivos salvajes, p.ej.
lobo/crvido. El estado adulto vara de 2 a 7 mm de longitud y habitualmente posee tres o cuatro segmentos,
raramente ms de seis. El segmento penltimo es maduro, y normalmente el poro genital se abre posterior a la
mitad tanto de los segmentos maduros como grvidos. Normalmente, el segmento ltimo (grvido) supone ms
de la mitad de la longitud del gusano completo. Presenta ganchos rostelares en el protoesclex formando dos
coronas de tamaos variables. El tamao de los ganchos vara entre 42 y 45 m en la primera corona y entre
18 y 38 m en la segunda. El tero grvido tiene saculaciones bien desarrolladas.
El estado larvario consiste en una vescula llena de lquido o quiste hidatdico que es unilocular, aunque tambin
existen cmaras comunicadas. El crecimiento es expansivo, y se pueden producir quistes hijos endgenos. Las
vesculas individuales pueden alcanzar un dimetro de hasta 30 cm y tienen lugar con mayor frecuencia en el
hgado y los pulmones, pero se pueden desarrollar en otros rganos internos. La infeccin con esta forma se
denomina equinococosis qustica.
Las especificidades de cepa de E. granulosus en los ciclos domsticos abarcan, perro/oveja en la regin
mediterrnea, Sudamrica (Argentina, Brasil, Chile, Per y Uruguay), frica (Etiopa, Kenia y Sudn), en Oriente
medio y regiones orientales, Rusia, Asia central (Kazajstn, Kirguizistn y Uzbekistn), Mongolia, Repblica
Popular China y Oceana; perro/caballo en Blgica, Irlanda y Reino Unido; perro/vaca en Blgica, Alemania,
Sudfrica y Suiza; perro/cerdo en Polonia; y perro o lobo/reno en regiones sub-rticas de Noruega, Suecia y
Alaska. El estado de la cepa perro/camello requiere una elucidacin posterior. Esta cepa se ha identificado
recientemente en algunos casos humanos de Argentina, Nepal e Irn (9, 17, 23). Hasta la fecha, todos los
genotipos de E. granulosus a excepcin de la cepa perro/caballo se ha visto que infectan al hombre.
Echinococcus multilocularis
El parsito se transmite entre los hospedadores definitivos salvajes (p.ej. Vulpes vulpes, Alopex lagopus, Canis
latrans) y pequeos roedores arviclidos (ratones de campo y lemmings). Son susceptibles los gatos y perros
domsticos, aunque los gatos menos que los perros. El estado adulto vara entre 1,2 y 3,7 mm de longitud y
habitualmente posee cuatro o cinco segmentos. El segmento penltimo es maduro de forma caracterstica, y el
poro genital se sita en la mitad anterior en los segmentos tanto maduros como grvidos. El tero grvido tiene
forma de saco. En el rostelo, la primera corona de ganchos mayores vara en tamao entre 27,6 y 34,3 m y la
corona interna de ganchos menores, vara entre 22,7 y 31,0 m.
El metacestodo es una estructura multivesicular que consiste en conglomerados de vesculas pequeas, que
normalmente no exceden de unos pocos milmetros de dimetro. A diferencia de E. granulosus, con frecuencia
la masa larvaria contiene una matriz semislida en vez de lquida. Proliferan mediante gemacin exgena y esto
provoca una infiltracin de los tejidos. La infeccin con esta forma se denomina comnmente equinococosis
alveolar. No hay pruebas de la existencia de genotipos o cepas distintas de E. multilocularis.
Echinococcus oligarthrus
Tpicamente, el parsito utiliza felinos salvajes como hospedadores definitivos (p.ej. Felis concolor,
F. jaguarundi) y roedores grandes (p.ej. Dasyprocta sp., Cuniculus paca) como hospedadores intermediarios. El
adulto vara entre 1,9 y 2,9 mm de longitud y normalmente posee tres segmentos, el penltimo de los cuales es
maduro. El poro genital est en la mitad anterior en los segmentos maduros y aproximadamente se sita a la
mitad en los segmentos grvidos. El tero grvido tiene forma de saco.
335
El metacestodo es poliqustico, est lleno de lquido y tiene tendencia a estar septado y

multicompartimentalizado. Los ganchos rostelares del protoesclex varan en longitud entre 25,9 y 37,9 m. Los
ganchos se describen con ms detalle en la seccin siguiente y se comparan con los de E. vogeli. El quiste
nico puede alcanzar un dimetro aproximado de 5 cm. Los lugares preferidos son los rganos internos y los
msculos. Hasta la fecha, slo hay constancia de tres casos en el hombre. El parsito parece que no madura en
los perros.
Echinococcus vogeli
El parsito utiliza el perro de monte (Speothus venaticus) como tpico hospedador definitivo salvaje, aunque el
perro domstico tambin es susceptible, actuando los grandes roedores (p.ej. Cuniculus paca) como
hospedadores intermediarios. El adulto vara entre 3,9 y 5,6 mm de longitud, y habitualmente presenta tres
segmentos, el penltimo de los cuales es maduro. El poro genital se sita en la mitad posterior en los
segmentos tanto maduros como grvidos. El tero grvido no presenta saculaciones laterales y se caracteriza
por ser relativamente largo y tener forma tubular, comparado con otros segmentos, que tienen forma de saco.
El metacestodo es similar al de E. oligarthrus. Se ha descrito que las dos especies se pueden distinguir si se
comparan las diferencias en las dimensiones y las proporciones de los ganchos rostelares en el protoesclex.
Los ganchos grandes de E. oligarthrus varan en longitud entre 25,9 y 37,9 m (media de 33,4 m) y los
pequeos, entre 22,6 y 29,5 m (media de 25,45 m). Los ganchos grandes de E. vogeli varan entre 19,1 y
43,9 m (media de 41,64 m) y los pequeos entre 30,4 y 36,5 m (media de 33,6 m). En el caso de
E. oligarthrus los guarda-ganchos dividen el gancho 50:50, en tanto que en el caso de E. vogeli, lo dividen
30:70.
Tanto E. vogeli como E. oligarthrus son agentes zoonsicos, si bien la primera de las especies ha causado
aproximadamente 60 casos humanos y la segunda slo ha provocado unos pocos. La infeccin debida a las dos
especies se denomina comnmente equinococosis poliqustica.
En el Manual WHO/OIE de equinococosis se puede encontrar una descripcin detallada de la equinococosis en
el hombre y otros animales (22).
1.
En el hospedador intermediario, el diagnstico depende de la deteccin de las formas larvarias qusticas, que
pueden encontrarse en casi todos los rganos, pero particularmente en el hgado y los pulmones. El diagnstico
de la equinococosis en los perros y otros carnvoros requiere la demostracin de los cestodos de Echinococcus
spp. en las heces o el intestino delgado o las pruebas de deteccin de los coproantgenos especficos.
Los investigadores que llevan a cabo estos procedimientos estn expuestos a riesgos de infeccin y
enfermedad severa, por lo que deben minimizarlos mediante procedimientos apropiados. El material infectivo se
puede descontaminar congelndolo a 80C (temperatura interna central) durante 48 horas o 70C durante 4
das. Se deben llevar puestos mascarillas faciales, guantes desechables y un delantal. No es fiable la
desinfeccin qumica aunque el hipoclorito sdico puede destruir una proporcin de huevos (3). El material
contaminado se debe destruir por calor; es muy efectiva el agua caliente a una temperatura de 85C o superior.
Se puede conseguir la descontaminacin de los laboratorios con una humedad reducida (40%) combinada con
una temperatura ambiente elevada (30C) durante al menos 48 horas.
a)
Diagnstico de la equinococosis larvaria
Necropsia
Mientras que la vigilancia de E. granulosus en los animales domsticos puede tener lugar en los mataderos
autorizados, la de Echinococcus sp. en los animales salvajes debe realizarse mediante estudios de campo.
Las muestras se deben preservar extrayendo el tejido y fijndolas en solucin salina con formol al 4% o
mantenindolas frescas a +4C y congelndolas rpidamente a 20C para su examen posterior.
Las larvas se pueden observar en muchos rganos, pero en los animales grandes, tales como ovejas y
vacas, se debera realizar una palpacin o incisin. Los cerdos, ovejas y cabras pueden estar infectados
con larvas de Taenia hydatigena, y a veces es difcil diferenciar entre estos dos parsitos cuando se
encuentran en el hgado. Ascaris suum causa manchas blancas en los hgados de las ovejas. Para
realizar un diagnstico diferencial en los animales salvajes, tales como rumiantes y roedores, se debera
considerar la posibilidad de otros diversos cestodos larvarios.
336
El material fijado con formalina se puede teir mediante tcnicas histolgicas convencionales. La presencia
de una capa laminada acelular, positiva a la tincin de cido peridico de Schiff (PAS), subyacente a una
capa de tejido conectivo y con o sin una membrana germinal nucleada celular interna se puede considerar
como una caracterstica especfica de los metacestodos de Echinococcus. La presencia de protoesclices
dentro de cpsulas prolgeras o en arena hidatdica es tambin un diagnstico del gnero. Habitualmente
se realiza la genotipificacin de E. granulosus o E. multilocularis con ADN procedente de protoesclices o
de material de tejido larvario que se congela, refrigera o conserva en etanol al 90%.
b)
Diagnstico de parsitos adultos en carnvoros
Necropsia
Invariablemente se emplea la necropsia en el estudio de la equinococosis de animales salvajes y resulta

til si los perros domsticos se sacrifican de forma indolora. Se debera enfatizar que es necesario aislar e
identificar el adulto de Echinococcus, porque en condiciones normales del examen fecal, los huevos de
Echinococcus no se pueden diferenciar de los de Taenia spp. Actualmente, los huevos de E. multilocularis
se pueden identificar y diferenciar de los de otros tnidos mediante la reaccin en cadena de la polimerasa
(PCR).
Se extrae el intestino delgado lo antes posible tras la muerte y se atan sus extremos. Si el material no se
congela o se fija con formalina (4-10%), se debera examinar rpidamente, ya que el parsito se puede
digerir en unas 24 horas. La formalina no destruye los huevos. El intestino fresco se divide en varias
secciones y se sumerge en solucin salina a 37C para realizar el examen. Los parsitos (tnidos o
cestodes) adheridos a la pared intestinal se puede observar y hacer su recuento mediante una lupa manual
(para E. granulosus y E. vogeli). Para realizar recuentos exactos, es mejor dividir el intestino no fijado en
cuatro o seis secciones, abrirlas y sumergirlas en solucin salina a 37C durante 30 minutos para liberar
los parsitos. Los contenidos se lavan en otro contenedor para realizar su examen detallado, y la pared
intestinal se raspa con una esptula. Todo el material se hierve y lava mediante un tamiz para eliminar la
mayora del material particulado. Los contenidos y raspados intestinales lavados se colocan en una
bandeja negra y se cuentan los parsitos con ayuda de una lupa manual o un microscopio estereoscpico.
Echinococcus granulosus se encuentra normalmente en el primer tercio del intestino delgado de los perros.
Frotis mucosales
En la necropsia de zorros (o perros) para detectar E. multilocularis, los canales o los intestinos se deben
congelar rpidamente y mantener congelados entre 70C y 80C durante 37 das antes de llevar a cabo
la necropsia. Los huevos de E. multilocularis son resistentes a la congelacin por debajo de 50C. Se
deben realizar unos raspados mucosales profundos empleando portas para microscopio y el material
adherente se transfiere a una placa Petri cuadrada de plstico. Los frotis se aplastan entre los portas y se
examinan al microscopio de luz estereoscpica (120). Se recomienda realizar cinco frotis mucosales
procedentes del tercio prximo, medio y posterior del intestino delgado (total 15). Echinococcus
multilocularis se encuentra normalmente en la segunda mitad del intestino delgado.
Conservacin de muestras
Los cestodes intactos son frgiles y para los estudios morfolgicos es mejor manejarlos en solucin salina
normal con una pipeta Pasteur. Se lavan para eliminar cualquier otro material y se dejan aproximadamente
30 minutos para que cese todo movimiento. Tras extraer el lquido, se aade formalina fra al 510% (5C)
o fijador FAA (etanol al 95% [80 ml], formaldehdo al 3740% [10 ml], y cido actico glacial [5 ml]) y los
gusanos se dejan durante otras 12 horas. Para la tincin, los parsitos se lavan en agua durante
15 minutos y se transfieren a Paracarmn de Mayer (cido carmnico [1,0 g], cloruro de aluminio [0,5 g],
cloruro clcico [4,0 g], y etanol al 70% [100 ml]) durante 1224 horas. Se elimina el exceso de colorante
mediante su inmersin en una solucin de cido clorhdrico al 0,51,0% durante unos pocos segundos. La
deshidratacin se logra tras varios pases en concentraciones ascendentes de alcohol (35, 50, 70, 85, 95,
100%) al menos durante 15 minutoss en cada una de ellas, con dos cambios en la del 100%. El alcohol se
extrae con xilol (10 minutos) y se aclara con metilsalicilato o creosota. Antes del montaje en un medio
adecuado tal como blsamo, picolyte, etc., se deberan devolver las muestras a xilol durante unos pocos
minutos. Al menos una vez al ao se aconseja examinar el suero de las personas implicadas en el anlisis
de estas muestras para detectar posibles anticuerpos anti-Echinococcus (22).
Recientemente, se han desarrollado algunos mtodos con el propsito de simplificar y mejorar las
investigaciones epidemiolgicas en las poblaciones de hospedadores definitivos y adems permitir el
diagnstico de los animales vivos. Entre estos mtodos estn la deteccin de coproantgenos y la
deteccin del ADN mediante PCR (vase ms abajo).
c)
Vigilancia e investigaciones con arecolina

La arecolina se ha utilizado para llevar a cabo investigaciones de las infecciones por gusanos planos en
poblaciones caninas. En la actualidad su empleo como agente de control se ha reemplazado por
praziquantel. La arecolina es un agente parasimpaticomimtico. Su accin tiene como resultado la
sudoracin y estimulacin de las glndulas salivares, lacrimales, gstricas, pancreticas e intestinales.
337
Provoca el incremento del tono intestinal y la movilidad del msculo liso, y este efecto es el responsable de
la purga. El hgado es el lugar principal de detoxificacin. La arecolina tambin ejerce una accin directa
sobre el propio gusano, causa su parlisis, pero no la muerte, y as provoca que se relaje su fijacin sobre
la pared intestinal. Por tanto, se debe administrar por va oral. La purgacin consecuente expulsa a los
parasitos (gusanos) con las heces. Es particularmente adecuada para los estudios de lnea de base de
E. granulosus, sin embargo, el 1525% de los perros pueden no resultar purgados. En los animales, la
purga con arecolina es de utilidad; de nuevo, los gusanos planos que se recuperen se identifican
morfolgicamente. Ya no se dispone de productos que contengan arecolina como antihelmntico, pero se
puede obtener de las empresas suministradoras de productos qumicos. Como presenta efectos
secundarios, se deberan excluir del tratamiento los animales viejos, enfermos o gestantes. Una dosis de 4
mg/kg debera conseguir la purgacin en menos de 30 minutos. Los paseos y el masaje abdominal en los
casos recalcitrantes o el enema para los perros estreidos pueden evitar la utilizacin de una segunda
dosis (2 mg/kg), que slo se debera administrar con mucho cuidado.
Los perros que han sido purgados con xito pueden mostrar al menos dos deposiciones; la primera
formar parte de las heces y puede ser ignorada, pero el moco que acompaa puede ser productivo. Este
puede dividirse en varias muestras y cada una de ellas ser examinada por separado, pero este mtodo no
se recomienda ya que los gusanos sern difciles de detectar. Preferiblemente, la muestra de moco
(aproximadamente de 4 ml) se diluye con 100 ml de agua corriente, se cubre con una capa fina de 1 ml de
queroseno (parafina) y se hierve durante 5 minutos. El queroseno evita la formacin de espuma y reduce el
olor.
Los investigadores que llevan a cabo estos procedimientos estn expuestos al riesgo de infeccin y
enfermedad severa. El personal debera llevar puestos monos completos, botas, guantes desechables y
mscara facial. Los monos se deberan lavar con agua hirviendo tras su utilizacin y las botas ser
desinfectadas con una solucin de hipoclorito sdico al 10%. La purga se debera hervir lo antes posible
tras su recogida. Los perros pueden continuar excretando huevos, progltides y parasitos (gusanos)
despus de la primera purga, por tanto, se aconseja que permanezcan atados durante 2 horas tras la
purgacin con acceso a agua para bebida. Tras la prueba con arecolina, la zona de tierra empleada para
mantener atados a los perros se debera fumigar con queroseno y prender fuego.
d)
Pruebas de deteccin de coproantgenos

Recientemente, se ha desarrollado una alternativa a la prueba con arecolina que se basa en la deteccin
del antgeno fecal mediante un enzimoinmunoensayo (ELISA) de tipo sndwich que ha demostrado ser
particularmente prometedora ya que los coproantgenos se pueden detectar poco tiempo despus de la
infeccin (1014 das) y su nivel desciende rpidamente despus de la expulsin de los gusanos. Se ha
estimado que la sensibilidad y especificidad de la prueba es del 70% y del 98%, respectivamente (1, 3, 7,
8).
A partir de la prueba con arecolina se pueden obtener tanto resultados cualitativos como cuantitativos, que
resultan de lo ms til en los estudios epidemiolgicos de lnea bsica sobre las tasas comparativas de
infeccin con los tnidos en perros. Los estudios posteriores puede que demuestren que la prueba de
deteccin de coproantgenos es ms efectiva respecto al coste que la de arecolina durante la vigilancia
rutinaria de E. granulosus en la poblacin canina.
Actualmente, se han desarrollado ELISAs1 para detectar el coproantgeno especfico con suficiente
especificidad y sensibilidad como para reemplazar a la prueba de arecolina en la deteccin de
Echinococcus en perros y en otros hospedadores definitivos (3). Cuando se prueba para detectar los
coproantgenos de Echinococcus especficos de gnero, la especificidad est prxima al 98% y en
conjunto la sensibilidad es aproximadamente del 70%; sin embargo, cuando las cargas medias de
parsitos (gusanos) son >50100, la sensibilidad se aproxima al 100% (1, 3, 4, 8). Se han investigado con
xito los perros, dingos, zorros y lobos con ensayos del tipo ELISA de deteccin de coproantgenos y,
significativamente, tambin se han detectado las infestaciones por el gusano E. multilocularis en zorros
rojos y perros domsticos (8, 18). Cuando el ELISA de captura utiliza los anticuerpos anti-ES o los de las
progltides anti-somticas dirigidos contra E. granulosus, se puede reducir la sensibilidad de deteccin de
la infeccin debida a E. multilocularis, aunque la especificidad de gnero permanece intacta. Los ELISAs
de coproantgenos basados en anticuerpos policlonales o monoclonales exhiben una sensibilidad y
especificidad elevadas para detectar E. granulosus (~80%), incluso aunque se desarrollen para
E. multilocularis (6, 18). Sin embargo, para cargas bajas de parsitos (gusanos) (<50), la sensibilidad del
ELISA para detectar el coproantgeno de E. multilocularis est por debajo de la del mtodo del frotis
mucosal en la necropsia (6).
338
El kit comercial del coproantgeno de Echinococcus para el ensayo ELISA se encuentra disponible a partir de: Genzyme
Virotech GmbH, Lowenplatz 5, 65428 Russelsheim, Alemania; y Dr Brommeli AG, Liebefeld-Berne, Suiza.
No se ha caracterizado la naturaleza exacta de los antgenos de Echinococcus liberados en las heces que
se detectan como coproantgenos. Sin embargo, su estabilidad en solucin salina con formol al 5%
despus de hervir y su susceptibilidad al tratamiento con periodato sugiere la implicacin de antgeno(s)
que contiene(n) carbohidratos (3).
Los coproantgenos se pueden detectar antes de que los gusanos Echinococcus liberen los huevos y, por
tanto, no estn relacionados con el antgeno(s) de los huevos (8, 18). Presentan la ventaja de poder
detectar las infecciones antes de que sean evidentes. Es ms, los niveles de coproantgenos vuelven a la
lnea basal que exista antes de la infeccin en 5 das de tratamiento con el antihelmntico de los perros
infectados.
La necropsia emplea bastante tiempo para conseguir detectar la infeccin de zorros por E. multilocularis.
Las pruebas de coproantgenos mediante el ensayo ELISA ofrecen una alternativa prctica especfica. Las
muestras fecales de los zorros se deberan tomar post mortem a partir del recto en lugar del intestino
delgado. Los coproantgenos de Echinococcus tambin son estables en las heces de zorros o perros
mantenidas a 20C durante 1 semana. Las pruebas de coproantgenos tambin se han utilizado con xito
para evaluar la eficacia de expulsin de gusanos de zorros salvajes infectados con E. multilocularis
utilizando un cebo que lleve enlazado praziquantel.
Procedimiento de la prueba de coproantgenos (Echinococcus granulosus) (1, 4)
i)
La muestra fecal se mezcla con un volumen igual de solucin salina tamponada con fosfato (PBS),
pH 7,2, que contenga Tween 20 al 0,3% (PBST), en un tubo desechable con tapn de 5 ml. Se agita
vigorosamente y se centrifuga a 2.000 g durante 20 minutos a temperatura ambiente. Los
sobrenadantes fecales se pueden ensayar inmediatamente o conservar a una temperatura igual o
inferior a 20C. Aunque los sobrenadantes aparezcan muy oscuros o viscosos se pueden utilizar.
ii)
Una placa de microtitulacin de 96 pocillos para la prueba ELISA (Immulon #4, Dynex Technologies)
se cubre con una concentracin ptima (tpicamente de 5 g por ml) de la fraccin IgG, purificada
utilizando la protena A, de extracto de conejo anti-progltide de E. granulosus (1) en 0,05 M
bicarbonato/carbonato, pH 9,6 (100 l por pocillo). La placa se cubre e incuba toda la noche a 4C.
iii)
Los pocillos se lavan tres veces con PBST durante 1 minuto en cada lavado; a cada pocillo se aaden
100 l del mismo tampn y se incuba la placa durante 1 hora a temperatura ambiente.
iv)
Se elimina el PBST y se aaden 50 l por pocillo de sobrenadantes de muestras fecales (en pocillos
duplicados) a 50 l de suero puro de ternero fetal. La placa se incuba a temperatura ambiente durante
1 hora con una lmina plstica que cubra la placa.
v)
Los pocillos se lavan como en la etapa iii, pero los contenidos se echan en una solucin de leja
(hipoclorito) al 10%.
vi)
Se prepara una dilucin optima de la IgG de extracto de conejo anti-progltide de E. granulosus

conjugada a peroxidasa (1) en PBST y se aaden 100 l a cada pocillo. La placa se incuba 1 hora a
vii)
Los pocillos se lavan como en la etapa iii.
viii) A continuacin, se aaden 100 l por pocillo del sustrato tetrametil benzidina (TMB, KPL Laboratorios)
y la placa se deja en la oscuridad durante 20 minutos a temperatura ambiente.
e)
ix)
Se para la reaccin enzima-sustrato aadiendo 100 l de 1 M cido fosfrico (H3PO4) a cada pocillo.
El color cambia de azul a amarillo si la reaccin es positiva. La Absorbancia de los pocillos se lee a
450 nm.
x)
Los laboratorios deberan establecer su propio criterio de punto final utilizando muestras estndares
positivas y negativas. Tambin se pueden obtener los estndares a partir de los laboratorios de
referencia de la OIE (vase Cuadro de la Parte 3 de este Manual de animales terrestres).
Normalmente, el umbral de positivo a negativo se acepta como 3 desviaciones estndares por encima
del valor medio de Absorbancia de los controles negativos, o frente a un control positivo estndar de
referencia empleando la equivalencia de las unidades de Absorbancia.
Mtodos de reconocimiento del ADN

Hospedadores definitivos: El diagnstico diferencial de las infecciones por E. granulosus y E. multilocularis
en hospedadores definitivos se puede conseguir detectando de modo especfico el ADN amplificado por
PCR procedente de los huevos de E. multilocularis presentes en las heces (2, 13). Los cebadores del gen
de ARN UIsn de E. multilocularis son especficos de especie, exhiben un 100% de especificidad despus
de una purificacin por flotacin en cloruro de zinc de los huevos a partir de las heces, y muestran una
sensibilidad del 94% para la infeccin por E. multilocularis en los zorros rojos (13). En la prctica, se
recomienda investigar a los hospedadores definitivos (p. ej. los zorros) empleando la prueba de los
coproantgenos y confirmndola con la prueba de deteccin del ADN por PCR. En Europa, generalmente la
339
transmisin de E. multilocularis se produce en regiones en las que E. granulosus no es endmico o

aparece con muy poca frecuencia. En otras regiones, entre las que se encuentra Oriente prximo (Turqua
e Irn), Asia central, Rusia y Repblica Popular China, estas dos especies pueden estar presentes a la vez
(5). Es necesaria una evaluacin posterior de la infeccin debida a E. multilocularis para investigar la
propagacin intermitente y duracin de dispersin del ADN del parsito. Recientemente, se ha desarrollado
una PCR para detectar el copro-ADN de E. granulosus en grupos diferentes.
Hospedadores intermediarios: En la actualidad no se utilizan los mtodos de hibridacin del ADN para la
deteccin de E. granulosus en el ganado de hospedadores intermediarios. Sin embargo, los mtodos
moleculares son importantes para la identificacin en aislamientos o cepas de E. granulosus con fines
epidemiolgicos (15).
La PCR resulta ser de gran valor para la identificacin de lesiones pequeas o calcificadas debidas a
E. multilocularis en hospedadores intermediarios o aberrantes (14).
2.
Pruebas serolgicas
a)
Hospedadores intermediarios
Las pruebas inmunolgicas, tiles para los casos humanos, son menos sensibles y especficos en los
ganados y hasta la fecha no pueden reemplazar a la necropsia (3, 10).
b)
Hospedadores definitivos
Se ha iniciado un programa extenso para desarrollar pruebas inmunodiagnsticas con la finalidad de
controlar la equinococosis canina. Despus de la ingestin de un quiste, el perro se ver expuesto a nivel
intestinal a varios antgenos durante el establecimiento del parsito, desarrollo y oognesis. Se pueden
detectar fcilmente anticuerpos especficos contra los antgenos de las oncosferas y los protoesclices en
el suero de los perros infectados. En la actualidad no se considera prctico ya que no diferencia entre
infecciones actuales y previas.

1.
Hospedadores intermediarios
Se ha desarrollado con xito una vacuna de uso contra T. ovis en ovejas que se basa en un antgeno
polipeptdico nico procedente de oncosferas y que se ha producido en Escherichia coli utilizando la tecnologa
del ADN recombinante. Actualmente esta misma tecnologa se ha aplicado con xito a E. granulosus (11).
Los ensayos de la fase I utilizan la vacuna EG95 del antgeno recombinante procedente de oncosferas y se
observa que proporciona un nivel de proteccin del 9698% frente al desafo experimental de ovejas con E.
granulosus. La proteccin puede durar hasta 12 meses y se puede transferir a los corderos va calostro. Los
ensayos de la fase II con el desafo natural de los corderos vacunados tuvieron como resultado unos niveles
similares de proteccin. Ahora la vacuna EG95 para E. granulosus se puede producir en masa y tiene la
capacidad potencial de reducir de forma significativa el tiempo de la fase de ataque de los programas de control
hidatdico. La vacuna de la hidatidosis ovina se utilizara en paralelo con las medidas dosis-perro y los
programas de educacin sanitarios.
2.
Hospedadores definitivos
A pesar de que se ha llevado a cabo una investigacin considerable con antgenos crudos para tratar de
proteger a los perros frente a la equinococosis, hasta la fecha no se ha demostrado su xito. Para progresar en
este sentido es necesaria una investigacin bsica acerca de la inmunologa mucosal canina y la infeccin
debida a Echinococcus.
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*
* *
NB: Existen laboratorios de referencia de la OIE para la Equinococosis/Hidatidosis (vase Cuadro en la Parte 3
de este Manual de animales terrestres o consltese la pgina Web de la OIE para conseguir la relacin ms
actualizada: www.oie.int).
342
CAPTULO 2.2.4.
LEPTOSPIROSIS
RESUMEN
La leptospirosis es una enfermedad contagiosa de los animales y de los humanos causada por
cualquiera de los miembros patgenos del gnero Leptospira. El diagnstico laboratorial de la
leptospirosis puede ser complejo e implica pruebas que se dividen en dos grupos. Uno de los
grupos de pruebas est diseado para detectar los anticuerpos antileptospiras, el otro est
diseado para detectar leptospiras, antgenos de leptospiras o cidos nucleicos de leptospiras en
tejidos animales o en fluidos corporales. El conjunto de pruebas concretas seleccionadas depende
del objetivo de la prueba (por ejemplo, los estudios de rebaos o el diagnstico en un animal
aislado) y de las pruebas o de la experiencia de la que se disponga en la zona.
Identificacin del agente: El aislamiento y la deteccin de las leptospiras en:
a)
los rganos internos (como el hgado, el pulmn, el cerebro y el rin) y en los fluidos
corporales (la sangre, la leche, los fluidos cerebroespinal, torcico y peritoneal) de los
animales infectados clnicamente proporciona un diagnstico definitivo de la enfermedad
clnica aguda o, en el caso de un feto, de la infeccin crnica de la madre.
b)
el rin, la orina o en el tracto genital de animales sin signos clnicos slo es diagnstico de
un estado de portador crnico.
El aislamiento de leptospiras a partir de material clnico y la identificacin de los aislados

constituyen una prdida de tiempo, y son cometidos de los laboratorios de referencia
especializados. El aislamiento seguido de la tipificacin a partir de portadores renales es muy til
en los estudios epidemiolgicos para determinar qu serovariedades estn presentes en un grupo
concreto de animales, en una especie animal o en una regin geogrfica.
La demostracin de la presencia de leptospiras mediante pruebas inmunoqumicas
(inmunofluorescencia e inmunohistoqumica) se adapta ms a la mayora de las condiciones de
laboratorio. Sin embargo, la eficacia de estas pruebas depende del nmero de organismos que
estn presentes en el tejido y carecen de la sensibilidad de un cultivo. A menos que se utilicen
reactivos especialmente elaborados, las pruebas inmunoqumicas no identifican la serovariedad
infectante, y los resultados deben interpretarse junto con los resultados serolgicos. Los reactivos
para inmunofluorescencia se elaboran mejor con sueros antileptospira con un ttulo alto de IgG,
que no estn disponibles comercialmente. El suero de conejo para la tipificacin de leptospiras
puede utilizarse para las pruebas inmunohistoqumicas y est disponible en los laboratorios de
referencia de leptospiras.
La presencia de material gentico de leptospiras en tejidos o en fluidos corporales se puede
demostrar empleando diversos ensayos basados en la reaccin en cadena de la polimerasa
(PCR). Los ensayos de PCR son sensibles, pero los procedimientos de control de calidad y el
procesamiento de las muestras para PCR son cruciales y deben adecuarse al tejido, al fluido y a la
especie que se est analizando. Al igual que ocurre con las pruebas inmunoqumicas, con la
mayora de los ensayos de PCR no se identifica la serovariedad infectante.
Pruebas serolgicas: Las pruebas serolgicas constituyen el medio ms ampliamente utilizado
para el diagnstico de la leptospirosis, y la prueba de aglutinacin microscpica (MAT) es la
prueba serolgica estndar. Los antgenos seleccionados para su utilizacin en la MAT deben
incluir las cepas representativas de los serogrupos que se sabe que existen en la regin concreta,
adems de aqullos que se sabe que persisten en otra regin en la especie hospedadora objeto de
estudio.
343
Captulo 2.2.4. Leptospirosis
La MAT se utiliza principalmente como una prueba de rebao. Para la obtencin de informacin
til, se deben examinar al menos diez animales o el 10% del rebao, el que mayor sea, y
documentar el historial de vacunacin de los animales. Como prueba en un animal aislado, la MAT
es muy til para el diagnstico de la infeccin aguda: un aumento de cuatro veces en los ttulos de
anticuerpos en las muestras de pares de sueros agudos o convalecientes tiene valor diagnstico.
La MAT tiene limitaciones en el diagnstico de la infeccin crnica en animales aislados y en el
diagnstico de las infecciones endmicas de rebaos. Los animales infectados pueden abortar o
ser portadores renales/genitales mostrando ttulos de MAT por debajo del ttulo mnimo significativo
ampliamente aceptado de 1/100 (dilucin final).
Los enzimoinmunoensayos (ELISA) tambin pueden ser tiles para la deteccin de anticuerpos
contra las leptospiras. Se han elaborado numerosos ensayos que se utilizan principalmente para la
deteccin de infecciones recientes y para la seleccin de animales experimentales que se emplean
en los estudios de infeccin. Los animales que han sido vacunados frente a la serovariedad
pertinente pueden dar resultados positivos en muchos ELISA, dificultando de esta manera la
interpretacin de los resultados.
Requisitos para las vacunas y los materiales de diagnstico: Las vacunas para uso veterinario
son suspensiones de una o ms serovariedades de Leptospira spp. inactivadas de tal forma que la
actividad inmungena se conserva. Aunque se ha probado una gama de vacunas experimentales
basadas en extractos celulares, las vacunas comerciales son, con pocas excepciones, productos
con clulas completas. Las leptospiras se cultivan en medios de cultivo adecuados que contienen a
menudo suero o protenas del suero. En caso de utilizarse, el suero y las protenas del suero
deben retirarse de los productos finales. Las vacunas pueden contener adyuvantes adecuados.
A. INTRODUCCIN
La leptospirosis es una enfermedad contagiosa de los animales y los humanos producida por la infeccin con la
espiroqueta Leptospira. Todas las leptospiras patgenas se clasificaron anteriormente como miembros de la
especie Leptospira interrogans; sin embargo, el gnero ha sido reorganizado recientemente y las leptospiras
patgenas ahora se clasifican en varias especies de Leptospira (11, 58, 85). Hay ms de 200 serovariedades
diferentes de leptospira reconocidas que se clasifican en 23 serogrupos (46). En un manual recientemente
publicado (31) se revisa Leptospira y la leptospirosis.
El uso, la interpretacin y el valor de los procedimientos de diagnstico de laboratorio para la leptospirosis varan
segn la historia clnica del animal o del rebao, la duracin de la infeccin y la serovariedad infectante. Debe
sospecharse de leptospirosis aguda en los siguientes casos: aparicin repentina de agalactia (en el ganado
lechero adulto y ovino); ictericia y hemoglobinuria, especialmente en animales jvenes; meningitis; y fallo renal
agudo o ictericia en perros. La leptospirosis crnica debe considerarse en los siguientes casos: aborto,
mortinatos, nacimiento de animales dbiles (pueden ser prematuros); infertilidad; fallo renal crnico o hepatitis
crnica activa en perros; y casos de oftalmia peridica en caballos. La localizacin y la persistencia de
leptospiras en el rin y en el tracto genital de machos y hembras son dos secuelas microbiolgicas crnicas
importantes de la infeccin por leptospiras que presentan problemas de diagnstico concretos. Los animales
infectados crnicamente pueden ser portadores durante toda la vida y servir de reservorios de la infeccin para
otros animales y para los humanos.
1.
La demostracin de la presencia de leptospiras en la sangre y la leche de los animales que muestran signos
clnicos que sugieren leptospirosis aguda tiene valor diagnstico. Sin embargo, el aislamiento a partir de la
sangre no es siempre satisfactorio, porque la bacteriemia es pasajera y no siempre se acompaa de signos
clnicos. Con frecuencia, los perros se tratan con antibiticos antes de tomar las muestras para analizar la
presencia de Leptospira, lo que despus disminuye la probabilidad de identificar el agente en la sangre. Tambin
tiene valor diagnstico la deteccin de una infeccin generalizada por leptospira en una serie de rganos
tomados en la necropsia. Sin embargo, si el animal vive lo suficiente o se le ha tratado con antibiticos, puede
resultar difcil la deteccin sistmica de organismos intactos; en estos casos la inmunohistoqumica puede ser
particularmente til en la identificacin del antgeno residual de leptospiras. La demostracin de la presencia de
344
leptospiras en el tracto genital, los riones o la orina slo debe interpretarse considerando en conjunto los signos
clnicos y los resultados serolgicos, ya que estos hallazgos puede que slo indiquen que el animal era portador.
El fallo en la demostracin de la presencia de leptospiras en la orina de un animal no descarta la posibilidad de
que ste sea portador renal crnico; slo indica que el animal no excretaba cantidades detectables de leptospiras
en el momento del examen. La toma de orina despus del tratamiento de los animales con un diurtico
aumentar las posibilidades de detectar el organismo (53). En los casos importantes en los que estn implicados
animales aislados (por ejemplo, la autorizacin para que un caballo semental vuelva a la reproduccin), las
pruebas negativas de muestras de orina de tres semanas consecutivas se considera una buena demostracin de
que el animal no elimina leptospiras por la orina.
La demostracin de las leptospiras en los fluidos corporales o en rganos internos (normalmente en el rin, el
hgado, el pulmn, el cerebro o en la glndula adrenal) de fetos abortados o nacidos muertos tiene valor
diagnstico de la leptospirosis crnica de la madre, y es una evidencia de la infeccin activa del feto.
El aislamiento de leptospiras es el mtodo ms sensible de la demostracin de su presencia, siempre que no
haya residuos de antibiticos, que no haya autolisis avanzada del tejido, que los tejidos se manejen con rapidez
para realizar cultivos despus de su recogida y, en el caso de la orina, que tenga un pH adecuado. Si los tejidos
o los fluidos no se pueden enviar al laboratorio inmediatamente para la realizacin de un cultivo de leptospiras, la
muestra se conservar a 4C para impedir el crecimiento excesivo de otras bacterias y la autolisis de las
muestras de tejido. Como medios de transporte para el envo de las muestras deben emplearse medio de
cultivo lquido o solucin al 1% de albmina srica bovina (BSA) con 5-fluorouracilo a una concentracin de 100
200g/ml.
El cultivo debe realizarse en un medio semislido (0,10,2% agar) con BSA o bien con Tween 80 (por ejemplo,
medio Tween 80/BSA o EMJH) (39) o con BSA y una combinacin de Tween 80 y Tween 40 (25). La
contaminacin se puede controlar aadiendo una serie de agentes selectivos, por ejemplo, 5-fluorouracilo (43),
cido nalidxico (44), fosfomicina (54), y una mezcla de rifamicina, polimixina, neomicina, 5-fluorouracilo,
bacitracina y actidiona (1). Sin embargo, el uso de agentes selectivos puede reducir las posibilidades de
aislamiento cuando slo haya un nmero pequeo de leptospiras viables, y muchas cepas de leptospiras no
crecern en medios selectivos que contengan mltiples antibiticos. La adicin de suero de conejo al 0,41% a
un cultivo semislido aumenta las posibilidades de aislar algunas serovariedades de leptospiras exigentes.
Los cultivos deben incubarse a una temperatura de 29 1C al menos durante 16 semanas y, preferentemente,
durante 26 semanas (25). El tiempo que se requiere para la deteccin de un cultivo positivo vara con la
serovariedad de leptospira y el nmero de organismos presentes en la muestra. Las serovariedades
menos exigentes (por ejemplo, Pomona y Grippotyphosa) pueden dar resultados positivos tan pronto como entre
710 das despus de la inoculacin; otras serovariedades (por ejemplo, Hardjo y Bratislava) pueden tardar
mucho ms tiempo. Los cultivos deben examinarse con un microscopio de campo oscuro cada 12 semanas. Es
importante utilizar una fuente luminosa de 100 vatios y un microscopio de campo oscuro de buena calidad.
La presencia de leptospiras se puede demostrar tambin mediante una serie de tcnicas de tincin
inmunoqumicas, por ejemplo, inmunofluorescencia (9, 26) y diversas tcnicas inmunohistoqumicas (4, 28, 63,
65, 86). Estas tcnicas son tiles para diagnosticar la infeccin en material patolgico que es inadecuado para la
realizacin de cultivos o donde se requiere un diagnstico rpido. Puesto que el xito de estas tcnicas depende
del nmero de organismos presentes, son menos apropiadas para diagnosticar el estado de portador crnico,
donde el nmero de organismos puede ser muy bajo o localizado. Las leptospiras no se tien bien con los
colorantes de anilina, y las tcnicas de tincin argntica carecen de sensibilidad y especificidad, aunque
constituyen un complemento til para el diagnstico histopatolgico (6).
Los ensayos basados en la reaccin en cadena de la polimerasa (PCR) se emplean en la actualidad en algunos
laboratorios de diagnstico y en la mayora de los laboratorios de referencia para la deteccin de leptospiras en
tejidos y fluidos corporales. Se han descrito diferentes juegos de promotores o cebadores para la realizacin de
ensayos de PCR (3, 5, 32, 34, 39, 45, 51, 66, 75, 79, 83), con algunos cebadores especficos para el gnero
Leptospira y otros que son especficos de serovariedad. Los ensayos de PCR pueden ser bastante sensibles,
pero la carencia de especificidad (es decir, resultados positivos falsos) puede representar un problema. El control
de calidad de los ensayos de PCR utilizados para el diagnstico de la leptospirosis requiere una atencin
especial en lo que se refiere al diseo y al volumen de trabajo del laboratorio para prevenir la contaminacin de
los materiales y al uso de muestras control apropiadas (24, 49). Adems, el procesamiento de la muestra para
PCR es decisivo y debe ser adecuado para el tejido, el fluido y la especie que se est analizando. Un
procedimiento para la preparacin de las muestras de orina para PCR en el que se emplean perlas magnticas
recubiertas de anticuerpos contra las leptospiras promete un aumento en la deteccin de leptospiras patgenas
en la orina (70).
La identificacin de los aislados de leptospiras es un cometido de los laboratorios de referencia especializados.
Para realizar una identificacin completa, debe utilizarse una combinacin de procedimientos que determinen: 1)
345
si el aislado es un patgeno o un saprofito; 2) la especie de Leptospira a la que pertenece el aislado y 3) el

serogrupo y la serovariedad del aislado. Un cultivo puro de leptospiras se identifica como perteneciente a una
especie patgena o saprofita mediante pruebas diferentes como la capacidad de infectar animales, la resistencia
relativa a la 8-azaguanina, la actividad lipasa, la tolerancia a la sal y a la temperatura (41, 42), la amplificacin del
ADNr de 23S (82) y el contenido de G+C del ADN (41).
Se han identificado nuevas especies de leptospiras basndose en el anlisis de hibridacin de ADNADN (11,
58, 85). En estos anlisis se utiliz, en la mayora de los casos, la cepa tipo para cada serovariedad; para unas
cuantas serovariedades se han examinado tambin los aislados clnicos para determinar las designaciones de
nuevas genoespecies. Los diferentes aislados pertenecientes a una nica serovariedad normalmente pertenecen
a la misma especie, pero ste no siempre es el caso. La identificacin de especies a partir de aislados de campo
todava es engorrosa, pero puede hacerse mediante anlisis de secuencias del ADNr de 16S o mediante anlisis
gentico de los genes de ARN ribosmico de 16S o 23S (14, 47, 55, 57, 80, 81).
Las cepas pertenecientes a Leptospira pueden diferenciarse a nivel de serogrupo mediante reacciones de
aglutinacin cruzada (23). La diferenciacin posterior a nivel de serovariedad se hace tradicionalmente mediante
absorcin por aglutinacin cruzada, aunque para la mayor parte de los aislados esto se hace ahora utilizando
mtodos que requieren menos tiempo como son: el anlisis del factor (23), los anticuerpos monoclonales (MAbs)
(71, 72), el anlisis con las endonucleasas de restriccin (38, 48, 73, 74) y diversas estrategias con PCR (14, 18,
22, 33, 56, 57, 59, 62, 87, 88). Sin embargo, las pruebas basadas en la gentica puede que no den siempre los
mismos resultados que la prueba de la absorcin por aglutinacin cruzada.
2.
Pruebas serolgicas
Las pruebas serolgicas constituyen el procedimiento de laboratorio utilizado con ms frecuencia para confirmar
el diagnstico clnico, para determinar la prevalencia en el rebao y para realizar los estudios epidemiolgicos.
Los anticuerpos de las leptospiras aparecen a los pocos das del comienzo de la enfermedad y persisten durante
semanas o meses y, en algunos casos, aos. Desafortunadamente, los ttulos de anticuerpos puede que caigan
hasta niveles indetectables mientras los animales permanecen infectados crnicamente. Para superar este
problema, se necesitan mtodos sensibles que detecten el organismo en la orina o en el tracto genital de
portadores crnicos.
Se ha descrito una amplia variedad de pruebas serolgicas que muestran grados variables de especificidad de
serogrupo y de serovariedad. La prueba de la aglutinacin microscpica (MAT) y el enzimoinmunoensayo
(ELISA) contribuyen al diagnstico veterinario.
a)

La prueba MAT en la que se emplean antgenos vivos es la prueba serolgica ms ampliamente utilizada.
Constituye la prueba de referencia frente a la que se evalan todas las otras pruebas serolgicas y se utiliza
en las comprobaciones para la importacin/exportacin. Para obtener una sensibilidad ptima deben
emplearse antgenos representativos de todos los serogrupos conocidos que existen en la regin en la que
se han encontrado los animales y, preferiblemente, cepas que representen a todos los serogrupos
conocidos. La presencia de un serogrupo normalmente viene indicada por la reaccin frecuente en la
seleccin serolgica o en el aislamiento de una serovariedad procedente de animales afectados
clnicamente. Se puede mejorar la sensibilidad de la prueba utilizando aislamientos locales en vez de cepas
de referencia, pero las cepas de referencia ayudan en la interpretacin de los resultados entre los
laboratorios. La especificidad de la MAT es buena; normalmente los anticuerpos frente a otras bacterias no
dan reaccin cruzada con Leptospira de manera significativa. Sin embargo, existe reaccin cruzada
serolgica significativa entre las serovariedades de Leptospira y es probable que un animal infectado con
una serovariedad tenga anticuerpos frente a la serovariedad infectante que d reaccin cruzada con otras
serovariedades (normalmente a un nivel ms bajo) en la MAT. Adems, los animales que han sido
vacunados contra la leptospirosis pueden tener anticuerpos frente a las serovariedades presentes en la
vacuna utilizada. Por tanto, es especialmente importante considerar el historial de vacunacin de los
animales objeto de estudio. Los dos mtodos para la realizacin de la prueba se han descrito
detalladamente (37, 52).
Las estirpes seleccionadas deben cultivarse en Tween 80 BSA o en un medio comercial adecuado a 29
1C y el cultivo debe tener al menos 4 das, pero no ms de 8. La transmitancia del antgeno debe ser del
6070% utilizando un espectrofotmetro con un filtro de 400 nm o tener un valor de 25 en una lectura en un
nefelmetro. El nmero de antgenos que se utilizan es determinado, y se puede realizar una seleccin con
una dilucin del suero de 1/50 (o una dilucin de inicio diferente basada en el objetivo de la prueba). A cada
pocillo se aade un volumen de cada antgeno, igual al volumen del suero diluido, para hacer una dilucin
final del suero de 1/100 en la prueba de seleccin. Las placas de microtitulacin se incuban a 29 1C
durante 2-4 horas, y se examinan mediante microscopa de campo oscuro. El grado de reaccin se
interpreta mediante la estimacin del porcentaje de leptospiras que se aglutinan. Si se aglutinan el 100% de
346
las leptospiras, la reaccin es 4+; 3+ equivale aproximadamente al 75% de aglutinacin; 2+ equivale al

50%; y 1+ equivale a menos del 50%. Si se realiza una prueba de seleccin, cualquier suero que d una
reaccin 2+ a una dilucin 1/100 se titula a punto final, empleando diluciones al doble del suero empezando
en una dilucin final de 1/100 hasta 1/12.800 o mayor. El ttulo de punto final es la inversa de la dilucin
ms alta con una reaccin 2+ o mayor.
La identidad de los antgenos es un factor crucial al realizar la MAT. Los antgenos deben evaluarse con
respecto a su identidad utilizando sueros hiperinmunes de conejo, MAbs, o un mtodo molecular que
confirme los pases a lo largo del tiempo, preferiblemente cada vez que se realiza la prueba, pero al menos
dos veces al ao. El suero de conejo hiperinmune para este fin puede prepararse utilizando un protocolo
como el ofrecido por la Subcomisin de Taxonoma de Leptospira (40). Brevemente, se seleccionan conejos
sanos con un peso entre 24 kg que no tengan anticuerpos antileptospiras detectables. A cada conejo se le
administra una inyeccin intravenosa de un cultivo vivo que haya crecido bien o de un cultivo clonado y
tratado con formalina con una densidad aproximada de 2 108 leptospiras/ml en una vena marginal de la
oreja. El cultivo debe hacerse en medio Tween 80 BSA o en otro medio apropiado. Se administran cinco
inyecciones de 1, 2, 4, y 6, ml a intervalos de 7 das. Una semana despus de la ltima inyeccin, se
determina el ttulo del anticuerpo homlogo mediante la MAT. Si el ttulo es 1/12.800, se anestesia el
conejo y se sangra mediante puncin cardiaca 7 das ms tarde (es decir, 14 das despus de la inyeccin
final). Si el ttulo es <1/12.800, se administra otra inyeccin de 6 ml de cultivo; 7 das despus de sta se
determina de nuevo el ttulo homlogo. El procedimiento debe repetirse con otro conejo a no ser que el
ttulo sea 1/12.800. Para la preparacin de cada antisuero se utilizan dos conejos. Si los ttulos son
satisfactorios en ambos conejos, los sueros se pueden mezclar. Para mantener la potencia es preferible
liofilizar el antisuero en volmenes de 2 ml y conservarlo a 4C. Alternativamente, el suero se puede
conservar en volmenes de 2 ml a 20C.
Debe comprobarse de forma regular la pureza de los antgenos utilizados en la MAT mediante el cultivo en
agar sangre y en caldo de tioglicolato. Los cultivos base de antgenos se pueden almacenar a 70C o en
nitrgeno lquido. Puede que despus de la liofilizacin haya una tasa de supervivencia baja de leptospiras.
El pase repetido de antgenos en medio de cultivo da lugar a una prdida de antigenicidad. En este caso, se
debe hacer un nuevo cultivo lquido a partir del cultivo base.
En algunas situaciones, los cultivos formalinizados o liofilizados se pueden emplear en la MAT. Las
principales ventajas del uso de organismos muertos son que los antgenos pueden estandarizarse y se
puede evitar el gasto, la dificultad y el riesgo de mantenimiento de cultivos vivos de Leptospira. Los ttulos
que se determinan empleando antgenos vivos y muertos no pueden compararse directamente, y muchas
de las personas que realizan diagnsticos tienen la sensacin de que la mxima sensibilidad de la MAT se
obtiene empleando antgenos vivos.
Como una prueba en un animal aislado, la MAT es muy til en el diagnstico de la infeccin aguda; tiene
valor diagnstico la demostracin de un aumento de cuatro veces en los ttulos de anticuerpos en muestras
de pares de sueros procedentes de animales enfermos agudos y convalecientes. La prueba tiene
limitaciones en el diagnstico de la infeccin crnica en animales aislados tanto en el diagnstico de
abortos (27) como en la identificacin de portadores renales o genitales (25). Esto es particularmente cierto
en las infecciones por leptospiras adaptadas al hospedador, por ejemplo, la infeccin por la serovariedad
Hardjo en el ganado vacuno. Cuando se toma como significativo un ttulo de 1/100 o superior, la
sensibilidad de la prueba slo es del 41%, e incluso cuando el ttulo significativo mnimo se reduce a 1/10, la
sensibilidad de la prueba slo es del 67% (25). Sirve de diagnstico la demostracin de anticuerpos en la
sangre fetal.
Puesto que la leptospirosis es un problema de rebao, la MAT tiene un uso mucho mayor como una prueba
de rebao. Para obtener informacin til, Cole et al. (17) sugirieron que se tomaran muestras de al menos
diez animales o del 10% del rebao, la que mayor sea. En un estudio de la infeccin por Hardjo en el
ganado vacuno, Hathaway et al. (37) encontraron que normalmente una muestra de diez vacas indicaba la
presencia o ausencia de infeccin en un rebao. El incremento en el tamao de la muestra mejoraba
notablemente la informacin epidemiolgica, las investigaciones de la enfermedad clnica y los rastreos
retrospectivos de salud pblica.
Al hacer un diagnstico serolgico de la leptospirosis, deben tenerse muy en cuenta la serovariedad
infectante y el estado clnico implicado. En el caso del aborto inducido por la serovariedad Pomona en el
ganado vacuno, normalmente se encuentra un ttulo alto en el momento del aborto, debido a que el
incidente clnico tiene lugar durante la fase aguda de la infeccin. El aborto en el ganado vacuno debido a la
serovariedad Hardjo es un hecho crnico; en este caso, la respuesta serolgica en el momento del aborto
es ms variable, apareciendo algunos animales seronegativos y otros que muestran ttulos altos. El ganado
vacuno puede experimentar una cada en la produccin de leche durante la fase aguda de la infeccin por
Hardjo, y este sntoma clnico est asociado con ttulos altos. Tambin debe tenerse en cuenta el historial
de vacunacin al interpretar los resultados de la MAT, pues la vacunacin extendida contribuye de forma
347
importante al nmero de animales seropositivos y puede enmascarar la presencia de infecciones crnicas

en el rebao, en particular por la serovariedad Hardjo.
b)
Enzimoinmunoensayo
Los ELISA para la deteccin de anticuerpos antileptospira se han elaborado empleando una serie de
preparaciones antignicas diferentes, protocolos de ensayo y programas de ensayo que incluyen pruebas
en placa y pruebas con tiras reactivas. En general, los ELISA son bastante sensibles, pero no tienen la
especificidad de serovariedad de la MAT. En Europa se ha desarrollado y evaluado un ELISA que cuantifica
la IgG y la IgM caninas frente a varias serovariedades de leptospira (35, 36). En este ensayo se detecta IgM
antileptospira tan slo 1 semana despus de la infeccin, antes de que estn presentes los anticuerpos
aglutinantes. Los anticuerpos IgG se detectan en perros infectados, comenzando 2 semanas despus de la
infeccin, y persisten durante largos periodos de tiempo. Por tanto, los perros con leptospirosis aguda
tienen ttulos de IgM altos y ttulos de IgG relativamente bajos; los perros que estn vacunados o han tenido
una infeccin previa por leptospiras tienen ttulos altos de IgG, pero bajos de IgM. Se han elaborado
tambin ensayos similares para la deteccin de anticuerpos bovinos, porcinos y ovinos antileptospira (2, 16,
21, 50, 60, 6769, 76, 84). El papel ms importante asociado a ELISA en el ganado es la utilizacin de un
ELISA de la IgM para la identificacin de infecciones recientes (21) y para la seleccin de rebaos en
regiones donde no se practica la vacunacin para la leptospirosis. Un ELISA de Ig total es til en la
identificacin de animales muy susceptibles que es conveniente para el trabajo de infeccin experimental
(29). Se han desarrollado tambin ensayos ELISA para la deteccin de anticuerpos de la serovariedad
Hardjo en la leche de vacas aisladas o en un tanque de almacenamiento de leche. Estas pruebas han sido
tiles en la identificacin de rebaos infectados por Hardjo. Sin embargo, los rebaos que estn vacunados
frente a la serovariedad Hardjo tambin darn resultados positivos en estos diferentes ELISA disminuyendo
su utilidad en las regiones donde la vacunacin es una prctica rutinaria.

Las vacunas contra la leptospirosis para uso veterinario son suspensiones de una o ms cepas patgenas de
Leptospira inactivadas de tal manera que la actividad inmungena se conserva. Aunque se han probado vacunas
experimentales basadas en extractos celulares (8), las vacunas comerciales son, con pocas excepciones,
productos que contienen clulas completas. Las leptospiras se cultivan en medios de cultivo apropiados que
pueden contener suero o protenas del suero. En caso de utilizarse, el suero y las protenas del suero deben
eliminarse del producto final. Las vacunas pueden contener adyuvantes adecuados.
Las directrices para la produccin de vacunas veterinarias se dan en el Captulo I.1.7. Principios de produccin
de vacunas veterinarias. Las directrices dadas aqu y en el Captulo I.1.7 tienen un carcter general y pueden
complementarse mediante requisitos nacionales o regionales.
1.
Control del inculo
a)

Para la produccin de vacunas es de suma importancia la seleccin adecuada de las cepas. La inmunidad
inducida mediante la vacunacin es en gran medida especfica de serovariedad (15). Una vacuna debe
formularse para su uso en una especie concreta de animal de una regin geogrfica concreta. Slo debe
contener aquellas serovariedades - y preferentemente aquellos genotipos - que causen problemas en la
especie animal, o que se transmitan de una especie animal a otra en la regin. Las cepas seleccionadas
para utilizarlas de cultivo de inculo original deben clonarse en medio slido para asegurar la ausencia de
contaminantes saprofitos de Leptospira y la uniformidad del cultivo.
Posteriormente, deben seleccionarse las cepas adecuadas por su capacidad para crecer con alto
rendimiento en las condiciones de cultivo de lotes.
b)
Mtodos de cultivo
Cada cepa componente que se incluye en la vacuna final debe cultivarse por separado en medio lquido,
preferiblemente en medio libre de protenas (7, 64) o bajo en protenas (7).
El volumen de cada cultivo de inculo original debe amplificarse mediante el crecimiento durante 210 das
a 29 1C en una serie de subcultivos hasta que se alcance un volumen suficiente para su uso como un
cultivo de inculo de produccin. Los cultivos deben airearse y agitarse cuando sea necesario.
348
Cada subcultivo del cultivo de inculo original debe comprobarse con respecto a su pureza y crecimiento
adecuado. La pureza puede comprobarse mediante la inoculacin del contenido de un asa del cultivo en
placas de agar sangre o en caldo de tioglicolato para su incubacin a 37C durante 25 das, y mediante el
examen de una extensin de precipitado del cultivo teida con Gram. El crecimiento se puede examinar con
el microscopio de campo oscuro. Para garantizar la pureza y la homologa, cada cultivo de inculo
produccin debe tambin comprobarse frente a su antisuero de conejo homlogo (23). Los MAb tambin se
pueden utilizar para este fin.
c)

Hay una gran cantidad de informacin sobre la eficacia de las vacunas contra la leptospirosis. En la mayora
de los casos, las vacunas proporcionan una proteccin importante frente a la enfermedad producida por una
infeccin homloga en las condiciones de campo.
Las vacunas son menos eficaces en la prevencin de la infeccin en animales, y un porcentaje de animales
vacunados se infectarn con la serovariedad pertinente, y pueden eliminar el organismo en la orina a pesar
de no presentar signos clnicos de la enfermedad.
Los ensayos de eficacia y la validacin de vacunas deben llevarse a cabo en la especie diana de la vacuna.
La vacuna debe administrarse como se indica en la etiqueta, y la inmunidad debe comprobarse mediante la
infeccin con cepas de campo virulentas de cada serovariedad por vas naturales de infeccin, es decir,
mediante la infeccin conjuntival y/o vaginal. Los estudios de validacin se han llevado a cabo con
frecuencia provocando la inmunidad mediante inyecciones intravenosas o intramusculares de leptospiras.
Las vacunas validadas de esta forma no siempre han ofrecido proteccin frente a la infeccin de campo que
tiene lugar por la exposicin de las membranas mucosas del ojo, la boca y el tracto genital a las leptospiras.
Especialmente las vacunas comerciales contra la leptospirosis que contienen la serovariedad Hardjo no
siempre protegen al ganado de la infeccin conjuntival o de campo con la serovariedad Hardjo (10). Se ha
elaborado un borrador monogrfico para la comprobacin de la eficacia que especifica el uso de vas de
infeccin ms naturales (30).
2.
Mtodo de produccin
La produccin se lleva a cabo mediante el cultivo de lotes en fermentadores de tamao apropiado. stos deben
estar equipados con tomas para la adicin estril del cultivo de inculo, aire y medio de cultivo. Deben contar
tambin con tomas para el muestreo de forma que puedan supervisarse la pureza y el crecimiento del cultivo de
produccin.
Para la produccin se emplean preferentemente los medios bajos o libres de protenas. Sin embargo, algunas
cepas requieren la presencia de protena animal para alcanzar rendimientos adecuados; esta se suministra
normalmente como BSA. Todos los componentes de los medios que no se degraden por el calor deben
esterilizarse por calor. Esto reduce el riesgo de contaminacin por las leptospiras saprofitas que lleva el agua,
que no son eliminadas mediante la esterilizacin por filtracin.
Despus de la adicin del cultivo de inculo, se puede supervisar el crecimiento del cultivo de produccin a
intervalos frecuentes con relacin al comienzo de la fase logartmica del crecimiento. Una vez observado esto,
entonces se agita y se airea el recipiente. El rendimiento final puede mejorarse con frecuencia mediante la
adicin de ms Tween 80 al cultivo cuando se observe por primera vez la ralentizacin en el crecimiento
logartmico. Un crecimiento adecuado puede requerir hasta 10 das de incubacin a 29 1C.
La inactivacin se hace normalmente mediante la adicin de formalina, pero tambin se ha utilizado el fenol, el
mertiolato y la inactivacin por calor.
Despus de un periodo adecuado de inactivacin, el cultivo puede concentrarse y el material proteico superfluo
puede eliminarse por ultrafiltracin. Despus se pueden mezclar volmenes iguales de las diferentes cepas que
se van a incluir en la vacuna final y aadir el adyuvante y el conservante, si se considera oportuno.
3.
Control del proceso
Durante la produccin, deben tomarse submuestras de forma diaria o dos veces al da y supervisar el
crecimiento de las leptospiras y la ausencia de contaminantes. El crecimiento se supervisa contando leptospiras
en una cmara de conteo en el microscopio de campo oscuro o mediante un nefelmetro. La ausencia de
contaminacin se puede establecer mediante el examen microscpico de preparaciones teidas con Gram de un
cultivo centrifugado.
349
Inmediatamente antes de la inactivacin, debe tomarse una muestra para su comprobacin frente a su
anticuerpo homlogo con una MAT. Debe comprobarse que el cultivo inactivado est libre de leptospiras viables.
Esto se hace inoculando alcuotas de cultivo inactivado en un medio de crecimiento apropiado como el medio de
Jonson & Harris (42), incubndolo a 29 1C durante al menos 4 semanas y examinndolo semanalmente
mediante microscopa de campo oscuro para detectar la presencia de leptospiras viables.
Despus de realizar la mezcla, los niveles de agentes inactivantes libres, de minerales presentes en los
adyuvantes (como el aluminio) y conservantes (como el tiomersal) deben estar dentro de los lmites prescritos.
4.
Control de lotes
a)
Esterilidad
Las muestras seleccionadas de la vacuna completa deben probarse para detectar la ausencia de bacterias
viables y de hongos (13, 19, 20, 77). En el Captulo I.1.5 pueden encontrarse las pruebas para comprobar la
esterilidad y la ausencia de contaminacin de materiales biolgicos.
b)
Inocuidad
Debe comprobarse la inocuidad de muestras procedentes del producto acabado. Los mtodos para realizar
esto se han descrito en otro sitio (12, 19, 78). La prueba debe llevarse a cabo para cada va de inoculacin
indicada en la etiqueta y en dos animales sanos de cada categora (por ejemplo, animales preados,
ganado joven) a los que va dirigida la vacuna. Los animales deben ser susceptibles a las serovariedades
empleadas en la vacuna y sus sueros deben estar libres de anticuerpos aglutinantes para esas
serovariedades. A cada animal se le administra una inyeccin de la vacuna a travs de la va recomendada
con el doble de la dosis recomendada, como se indica en la etiqueta. Los animales se observan durante 14
das y no deben mostrar efectos adversos locales o sistmicos atribuibles a la vacuna.
c)
Potencia
Deben examinarse muestras de la vacuna completa en cuanto a su potencia en hmsters o cobayas. La
potencia se mide normalmente por la capacidad de la vacuna para impedir la muerte del animal cuando se
infecta con 10--10.000 LD50 (dosis letal 50%). Con algunas serovariedades que no son letales para el
hmster o el cobaya, como la serovariedad Hardjo, la potencia se mide frente a la resistencia a la infeccin
renal cuando los animales se infectan con 10--10.000 ID50 (dosis infecciosa 50%) o mediante la induccin
de un ttulo de anticuerpos adecuado en conejos.
Un protocolo de ejemplo consiste en inyectar un 1/40 de la dosis de perro de la vacuna a diez hmsters
sanos de no ms de 3 meses. Despus de 1530 das, cada hmster vacunado y diez sin vacunar de la
misma edad se inyectan intraperitonealmente con una cantidad adecuada de un cultivo virulento de
leptospiras de la serovariedad utilizada para elaborar la vacuna (o una suspensin de tejido de hgado o
rin tomado de un animal infectado experimentalmente). En el caso de las vacunas bivalentes, cada
serovariedad se examina por separado. Para que la vacuna pase la prueba, al menos 8/10 animales
vacunados deben permanecer con buena salud durante 14 das despus de la muerte de los controles.
Otros protocolos pueden referirse a vacunas para ganado vacuno y porcino que contienen cinco o seis
componentes.
Las pruebas in-vitro de potencia para las vacunas contra la leptospirosis se estn elaborando basndose en
la cuantificacin del antgeno protector de la vacuna utilizando MAbs en un ELISA de captura (61). Estos
ensayos se estn estandarizando empleando vacunas de referencia y la correlacin con ensayos de
potencia existentes en hmsters o basados en anticuerpos y los datos de la eficacia dianahospedador.
d)
La duracin de la inmunidad debe comprobarse en la especie animal a la que la vacuna est dirigida,
empleando las vas naturales de infeccin (10). La inmunidad vacunal debe persistir al menos durante 6
meses o ms, dependiendo de la indicacin de la etiqueta.
e)
Estabilidad
Cuando las vacunas se almacenan en las condiciones prescritas, se espera que stas retengan su potencia
durante 12 aos. La estabilidad debe evaluarse mediante la determinacin de la potencia despus del
almacenamiento a 4C, a temperatura ambiente y a 37C.
350
5.
a)
Inocuidad
Vase la Seccin C.4.b.
b)
Potencia
Vase la Seccin C.4.c.
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*
* *
NB: Existen laboratorios de referencia de la OIE para la Leptospirosis (vase Cuadro en la Parte 3 de este
Manual de animales terrestres o consltese la pgina Web de la OIE para conseguir la relacin ms actualizada:
www.oie.int).
355
CAPTULO 2.2.5.
RABIA
RESUMEN
La rabia es una zoonosis importante para la cual se han estandarizado internacionalmente las
tcnicas de diagnstico. Como en la rabia no existen lesiones patognomnicas visibles, el
diagnstico solo se puede hacer en el laboratorio. Las tcnicas de laboratorio se realizan
preferiblemente con tejido del sistema nervioso central (SNC) extrado a travs del crneo. Se
debe probar un conjunto de muestras del SNC, y el tallo cerebral es el componente ms importante
de las muestras.
Identificacin del agente: La identificacin del agente se hace preferentemente por la prueba de
inmunofluorescencia (FAT). Se aade una gota de inmunoglobulina purificada, previamente
conjugada con isotiocianato de fluorescena, a un frotis de tejido cerebral fijado con acetona, a ser
posible hecho de varias partes del cerebro y que incluya el hipocampo, el cerebelo y la mdula
oblonga. Para gran nmero de muestras, como en el caso de anlisis epidemiolgicos, la tcnica
inmunoenzimtica puede proporcionar resultados rpidos (el inmunodiagnstico enzimtico rpido
para rabia [RREID]). Si se utiliza un conjugado potente, la prueba FAT proporciona un diagnstico
fiable en el 98-100% de los casos para todos los genotipos, mientras que la prueba RREID solo
detecta el virus de genotipo 1.
Las clulas neuronales infectadas se evidencian por pruebas histolgicas y estos procedimientos
revelan agregados de material vrico en el citoplasma de las neuronas (los cuerpos de Negri). Sin
embargo, la sensibilidad de las tcnicas histolgicas es mucho menor que la de los mtodos
inmunolgicos, especialmente si en la muestra hay autolisis. Por tanto, las tcnicas histolgicas ya
no se recomiendan.
Como una prueba negativa nica con muestras frescas no elimina la posibilidad de la infeccin, se
deben realizar simultneamente pruebas de inoculacin, u otras. Se inoculan intracerebralmente
ratones recin nacidos o de 3-4 semanas con varios tejidos del SNC, incluyendo el tallo cerebral, y
se mantienen en observacin durante 28 das. Para cualquier ratn que muera entre los 5 y los
28 das debe confirmarse la causa mediante FAT. Alternativamente, se inocula una monocapa de
clulas susceptibles con el mismo material utilizado para los ratones. Tras una incubacin
apropiada la prueba FAT demostrar la presencia o ausencia del antgeno vrico. Cuando sea
posible, el aislamiento del virus en cultivo celular debe reemplazar las pruebas de inoculacin en
ratones.
La identificacin del agente puede mejorarse en laboratorios especializados identificando variantes
de las cepas vricas mediante utilizacin de anticuerpos monoclonales, sondas especficas de
cido nucleico o la reaccin en cadena de la polimerasa y seguido de la secuenciacin del ADN de
reas del genoma Tales tcnicas permiten distinguir entre las cepas de campo y las vacunales e
identificar posiblemente el origen geogrfico de las cepas naturales. Estas tcnicas tan sensibles
deben llevarse a cabo por personal bien entrenado en laboratorios especializados.
Pruebas serolgicas: Las pruebas de neutralizacin de los virus (NV) en cultivos celulares son las
prescritas para el comercio internacional. Alternativamente, se puede usar una prueba que se
correlacione con sta, como un enzimoinmunoensayo con anticuerpo contra la protena G o la
prueba de neutralizacin en ratones. Los resultados se expresan en Unidades Internacionales o en
unidades equivalentes relativas a un antisuero estndar internacional.
Requisitos para las vacunas y los materiales de diagnstico: Las vacunas contra la rabia para usar
en animales contienen virus vivos atenuados para la especie animal concreta (como el Flury de
pocos pases en huevo, el Flury de muchos pases en huevo, el Street-Alabama-Dufferin o el Kelev),
356
Captulo 2.2.5. Rabia
o virus inactivados por medios qumicos o fsicos, o bien vacunas recombinantes. El virus se cultiva
en tejido del SNC de animales recin nacidos, en huevos embrionados o en cultivos celulares.
Normalmente las vacunas contra la rabia estn liofilizadas, pero las vacunas con virus inactivados
se pueden mantener en forma lquida, preferiblemente con adyuvante.
Antes de autorizar nuevas vacunas se debe determinar la duracin de la inmunidad derivada de su
empleo en animales vacunados de la especie concreta.
Para las vacunas con virus vivos, debe establecerse el mnimo de contenido vrico que proporcione
una respuesta inmune adecuada.
La potencia de las vacunas con virus inactivados se establece y controla por vacunacin en
ratones y por posterior inoculacin intracerebral de desafo mediante pruebas establecidas en los
EEUU, en Amrica por el Departamento de Agricultura de los EE. UU. y en otras partes por la
Farmacopea Europea. Los productos finales de ambos tipos de vacunas se someten a pruebas de
inocuidad y ausencia de toxicidad.
En las vacunas vivas que se preparan para vacunacin oral de animales silvestres (o domsticos)
se debe demostrar seguridad y eficacia para los animales a los que van dirigidas y seguridad para
otras especies.
A. INTRODUCCIN
La rabia est causada por un virus neurotrpico del gnero Lyssavirus de la familia Rhabdoviridae y se transmite
a todos los mamferos. Como tambin se transmite a los humanos por inoculacin o por inhalacin del virus
infeccioso, todo el material sospechoso de infeccin debe ser manejado bajo condiciones apropiadas de
seguridad especificadas por la Organizacin Mundial de la Salud (OMS) (37).
En el gnero Lyssavirus se pueden distinguir siete lneas genticas por pruebas de proteccin cruzada y por
anlisis de biologa molecular (5, 14, 21), a saber, el virus de la rabia clsica (RABV, genotipo 1, serotipo 1), el
virus del murcilago de Lagos (LBV, genotipo 2, serotipo 2), el virus Mokola (MOKV, genotipo 3, serotipo 3) y el
virus Duvenhage (DUUV, genotipo 4, serotipo 4). Los lyssavirus del murcilago europeo (EBLV), que se
subdividen en dos biotipos (EBLV1, genotipo 5 y EBLV2, genotipo 6), y el lyssavirus del murcilago australiano
(ABLV, genotipo 7), recientemente aislado en Australia (24), tambin son miembros del gnero Lyssavirus, pero
an no se han clasificado en serotipos. Los virus de los serotipos 24, los EBLV y el ABLV se designan como
virus relacionados con la rabia. El uso de anticuerpos monoclonales (MAbs) dirigidos contra los antgenos vricos
de la nucleocpsida o la glicoprotena, o la secuenciacin de fragmentos genmicos determinados ha hecho
posible la definicin de numerosos subtipos dentro de cada serotipo. Los lyssavirus causan una enfermedad
clnica indistinguible de la rabia clsica. Los sitios antignicos conservados en la nucleocpsida permiten el
reconocimiento de todos los lyssavirus con recientes preparaciones comerciales de anticuerpos antirrbicos
conjugados, que se utilizan en pruebas de diagnstico con muestras de cerebro. Los sitios antignicos
conservados en RABV, DUUV, EBLV y ABLV permiten la neutralizacin cruzada y la inmunidad cruzada
mediante vacunacin contra la rabia. Existe poca o nula proteccin cruzada contra MOKV o LBV por vacunacin
contra la rabia, y la mayora de los antisueros antirrbicos no neutralizan estos lyssavirus.
El personal que trabaja con material sospechoso debe vacunarse contra los lyssavirus y otros patgenos que
pueden estar presentes en las muestras utilizadas para diagnstico. El laboratorio debe cumplir con la normativa
nacional de biocontencin y de bioseguridad, para proteger al personal del contacto con los patgenos; tambin
debe cumplir las directrices sealadas en el Captulo I.1.6. Seguridad humana en el laboratorio veterinario de
Microbiologa.
La OMS recomienda la inmunizacin preventiva del personal expuesto. El protocolo de inmunizacin incluye tres
inyecciones en los das 0, 7 y 28. La evaluacin serolgica de la inmunizacin se realiza 1-3 semanas despus
de la ltima inyeccin y se comprueba cada 6 meses en el caso de trabajadores de laboratorio o cada 2 aos en
otro personal. Se debe suministrar vacunacin de refuerzo cuando el ttulo desciende por debajo de
0,5 Unidades Internacionales (IU) por ml. En ausencia de control serolgico, el rgimen de vacunacin debe
consistir en una vacunacin de refuerzo inicial despus de 1 ao y a continuacin cada 1-3 aos.
Como no existen sntomas clnicos o lesiones evidentes post-mortem que puedan considerarse patognomnicas
en animales domsticos o silvestres, el diagnstico de la rabia descansa en pruebas de laboratorio. La evidencia
serolgica de infeccin es raramente til debido a la seroconversin tarda y a la elevada tasa de mortalidad de
las especies hospedadoras, aunque tales datos se pueden usar en algunos anlisis epidemiolgicos.
357
1.
La observacin clnica solo puede conducir a la sospecha de rabia, porque los sntomas de la enfermedad no son
caractersticos y pueden variar mucho de un animal a otro (36). El nico modo de hacer un diagnstico fiable de
la rabia es identificar el virus o alguno de sus componentes especficos mediante pruebas de laboratorio.
Como el virus de la rabia se inactiva rpidamente, las muestras refrigeradas para diagnstico deben enviarse al
laboratorio por el medio ms rpido posible. Las condiciones de envo deben considerarse parte de la cadena de
diagnstico de la rabia.
Se pueden utilizar varias tcnicas, que han sido detalladas y estandarizadas en la cuarta edicin de Tcnicas de
Laboratorio para la Rabia de la OMS (37). Estos mtodos varan en eficacia, especificidad y fiabilidad.
Normalmente se aplican a tejido cerebral, pero pueden tambin aplicarse, aunque con menor eficacia, a otros
rganos (como las glndulas salivares). En el cerebro, el virus de la rabia es particularmente abundante en el
tlamo, puente y mdula. El hipocampo (asta de Ammon), cerebelo y distintas partes del cerebro se han descrito
como zonas negativas en el 3.9-11,1% de los cerebros positivos. La estructura de eleccin es el tlamo, pues fue
positivo en todos los casos. Para pruebas se recomienda disponer de un conjunto de tejidos cerebrales que
incluya el tallo cerebral (12). Para alcanzar estas partes del cerebro, es necesario extraer el rgano completo
despus de abrir el crneo en una sala de necropsias. Bajo algunas condiciones (como en el campo, o en el
muestreo de estudios epidemiolgicos amplios), se puede emplear un mtodo simplificado de muestreo a travs
del agujero occipital (11) o de la cavidad orbital (26).
a)
Envo de muestras
Durante el envo de muestras sospechosas para el diagnstico (cabezas de animales, cerebro y otras
muestras tisulares) no debe existir riesgo alguno de contaminacin para el hombre: los cerebros deben
colocarse en contenedores hermticos rgidos (las cabezas animales deben envolverse en material
absorbente) y seguir las regulaciones que indica la Normativa sobre Materiales Peligrosos de la Asociacin
Internacional para el Transporte Areo (IATA). Estas indicaciones se resumen en el Captulo I.1.1. Mtodos
de muestreo.
Cuando no es posible enviar muestras refrigeradas, se pueden utilizar otras tcnicas de conservacin. La
eleccin de conservantes est estrechamente ligada al tipo de prueba que se va a usar en el diagnstico:
b)
La formalina inactiva el virus, por lo que no se pueden utilizar pruebas de aislamiento. El diagnstico
depende entonces de la utilizacin de una prueba modificada y menos sensible como la
inmunofluorescencia directa (FAT), inmunohistoqumica o histologa (33, 37).
Si el material cerebral se mantiene en una mezcla de glicerol al 50% en solucin salina tamponada con
fosfato (PBS), la infectividad puede durar varios das a temperatura ambiente. La mezcla glicerol/PBS
reduce la actividad bacteriana y protege por tanto contra los efectos qumicos y biolgicos de la
putrefaccin. No protege contra el descenso del ttulo provocado por las condiciones trmicas y, en
consecuencia, como la rabia es termolbil, el ttulo vrico descender durante el almacenamiento en
glicerol/PBS. Bajo condiciones normales de transporte en los trpicos, esta proteccin solo puede ser
eficaz unos cuantos das. As, siempre que sea posible, las muestras en glicerol/PBS deben mantenerse
refrigeradas. Como el virus no se inactiva en glicerol/PBS, con estas muestras se pueden utilizar todas
las pruebas de laboratorio.
Recogida de muestras
Normalmente se recoge el cerebro por apertura del crneo en una sala de necropsias y se toman las
muestras apropiadas. Este paso puede ser arriesgado si el tcnico de laboratorio no est entrenado o se
realiza en condiciones de campo. En tales casos existen dos mtodos posibles de tomar algunas muestras
de cerebro sin abrir el crneo.
Ruta del foramen occipital para muestreo del cerebro
Se introduce en el foramen occipital en direccin al ojo una pajita de beber de 5 mm (11) o una pipeta
desechable de plstico de 2 ml (16). Pueden tomarse muestras del bulbo raqudeo, la base del cerebelo, el
hipocampo, el crtex y la mdula oblonga. Debe tenerse en cuenta la encefalopata bovina espongiforme
(BSE) en el diagnstico diferencial de todo ganado bovino considerado sospechoso de rabia. Para ambas
enfermedades se pueden tomar muestras del cerebro utilizando la esptula de cerebro o herramienta
desarrollada para muestreos de tejidos para BSE, en vez de una pajita o una pipeta. Las muestras tomadas
son relativamente fciles de reconocer, dependiendo del rea del cerebro muestreada.
358
Ruta retro-orbital para muestreo del cerebro
En esta tcnica se utiliza un trcar para hacer un agujero en la parte posterior de la cavidad ocular y luego
se introduce una pipeta de plstico a travs de este hueco. Las partes del cerebro muestreadas son las
mismas que en la tcnica anterior, pero se toman en la direccin opuesta.
c)
Pruebas normales de laboratorio

El diagnstico de laboratorio puede realizarse utilizando tres tipos de procedimientos.
Identificacin histolgica de lesiones celulares caractersticas
Los cuerpos de Negri se corresponden con agregados de protenas vricas, pero las tcnicas clsicas de
tincin solo detectan la afinidad de estas estructuras por colorantes acidfilos. Las pruebas
inmunohistoqumicas son la nica prueba histolgica especfica para la rabia.
Un frotis de tejido no fijado se puede teir por el mtodo de Seller y obtener el diagnstico en 1 hora. En
general, las pruebas histolgicas, como la de Mann, se realizan con material fijado despus de su inclusin
en parafina, y el resultado se obtiene en 3 das. Estas tcnicas tienen la ventaja de que el equipo de
laboratorio que se requiere es barato y se evita la necesidad de mantener las muestras fras una vez
fijadas. Cualquiera que sea el mtodo de tincin empleado, la evidencia de infeccin reside en la presencia
de cuerpos acidfilos intracitoplsmicos. Estos mtodos histolgicos, especialmente el de Seller, no se
siguen recomendando porque tienen muy baja sensibilidad y deben ser abandonados.
Identificacin inmunoqumica del antgeno del virus de la rabia
i)
La prueba ms utilizada en el diagnstico de la rabia es la FAT, que recomiendan tanto la OMS como
la OIE. La prueba puede hacerse directamente sobre un frotis, y puede utilizarse tambin para
confirmar la presencia del antgeno de la rabia en cultivo celular o en tejido cerebral de ratones que se
han inoculado para el diagnstico. La FAT produce resultados fiables en pocas horas en el 95-99% de
los casos. La sensibilidad de la FAT depende de la muestra (grado de autlisis y calidad de muestreo
del cerebro, ver Seccin B.1) (1, 9), del tipo de lyssavirus y de la eficacia del personal del equipo de
diagnstico. La sensibilidad puede ser ms baja en muestras de animales vacunados debido a la
localizacin del antgeno, que se limita al tallo cerebral. Para el diagnstico directo de la rabia, se
preparan frotis de una mezcla compuesta por tejido cerebral que incluya el tallo cerebral, se fijan con
acetona fra de grado alto y se tien con una gota del conjugado especfico. Los conjugados
fluorescentes contra la rabia se pueden preparar en el laboratorio. Los comercializados son
conjugados policlonales especficos para el virus completo o para la protena de la nucleocpsida
vrica, o pueden contener diferentes MAbs. En a prueba, los agregados especficos de protenas de la
nucleocpsida se identifican por su fluorescencia. Antes de su utilizacin se debe comprobar la
especificidad y sensibilidad de estos conjugados fluorescentes contra la rabia respecto a las variantes
del virus predominante a nivel local.
La FAT se puede utilizar en muestras conservadas en glicerol. Si la muestra se ha conservado en
formalina, solo se puede emplear FAT despus de que la muestra se haya tratado con un enzima
proteoltico (6, 7, 32, 33). No obstante, con muestras fijadas con formalina y digeridas, la FAT siempre
resulta menos fiable y ms lenta que cuando se realiza con muestras frescas.
ii)
Pruebas inmunoqumicas
El anticuerpo puede conjugarse con una enzima como la peroxidasa en vez de con isotiocianato de
fluorescena (FITC). Este conjugado se puede utilizar para el diagnstico directo con la misma
sensibilidad que el FAT (22) pero debe tenerse cuidado del riesgo de resultados positivos falsos
inespecficos. Este riesgo se reduce mucho con una cuidadosa formacin de los tcnicos. Debe
resaltarse que esta tcnica requiere un paso de incubacin ms que la FAT.
El conjugado con peroxidasa puede emplearse con cortes finos de tejidos fijados con formalina para
pruebas inmunohistoqumicas.
Una variacin de la prueba inmunoqumica es un enzimoinmunoensayo (ELISA) que detecta el
antgeno de la rabia. Esta prueba rpida de inmunodiagnstico enzimtico (RREID) est
comercializada (28). La correlacin entre FAT y RREID est entre 96-99% (8, 15). La versin normal
de esta prueba no es sensible a virus relacionados con la rabia ya que RREID slo detecta lyssavirus
de genotipo1.
Deteccin de la replicacin del virus de la rabia despus de la inoculacin
Estas pruebas detectan la infectividad de una suspensin de tejidos en cultivos celulares o en animales de
laboratorio. Deben emplearse si la FAT da resultados inciertos o cuando la FAT es negativa en el caso de
exposicin conocida al hombre.
359
i)
Prueba de inoculacin en ratn

Se inoculan intracerebralmente de cinco a diez ratones de 3-4 semanas (12-14 g), o una camada de
ratones recin nacidos de 2 das. Se recomienda, aunque no es esencial, utilizar ratones libres del
patgeno especfico (SPF). El inculo es el sobrenadante clarificado de un homogenado de material
cerebral al 20% (p/v) (crtex, asta de Ammon, cerebelo, mdula oblonga) en una solucin isotnica
tamponada con antibiticos. Los ratones deben anestesiarse para reducir el dolor de la inoculacin.
Los ratones jvenes se observan diariamente durante 28 das, y cada ratn muerto se examina para
rabia mediante FAT. Con cepas callejeras de la rabia de zorra, la muerte comienza generalmente a los
9 das de la inoculacin. Para resultados ms rpidos con ratones recin nacidos, es posible analizar
por FAT un ratn a los 5, 7, 9 y 11 das post-inoculacin.
Esta prueba in-vivo es cara, particularmente si se usan ratones SPF, y debe evitarse cuando sea
posible. No proporciona resultados rpidos (en comparacin con las pruebas de inoculacin in-vitro),
pero cuando la prueba resulta positiva se puede aislar una gran cantidad de virus de un nico cerebro
de ratn para identificacin de la cepa. Otra ventaja de esta prueba de baja tecnologa es que puede
aplicarse fcilmente en situaciones en que no se dispone del entrenamiento y la infraestructura
requerida para otras pruebas (por ejemplo, cultivos celulares).
ii)
Prueba de cultivos celulares

Para el diagnstico rutinario de la rabia se utilizan lneas celulares de neuroblastoma, como la CCL131 de la Coleccin Americana de Cultivos Tipo (ATCC)1. Las clulas se cultivan en medio de Eagle
modificado por Dulbecco (DMEM) con 5% de suero fetal bovino (FCS) y se incuban a 36 C con 5% de
CO2. Su sensibilidad es comparable a la de las clulas de rin de hmster neonato (BHK-21) (29).
Esta lnea celular es adecuada para aislamientos de cepas de la calle sin ningn paso de adaptacin,
pero debe ser analizada, antes de su empleo, para comprobar su susceptibilidad a variantes
predominantes del virus local. La presencia del virus de la rabia en las clulas se revela por FAT. El
resultado de la prueba se obtiene despus de 18 horas, por lo menos (un ciclo replicativo del virus en
las clulas); generalmente la incubacin se prolonga hasta 48 horas (10) y en algunos laboratorios
hasta 4 das.
Esta prueba es tan sensible como la de inoculacin en ratn. Si existe en el laboratorio una unidad de
cultivos celulares, esta prueba debera sustituir a la de inoculacin en ratn ya que evita el uso de
animales vivos, es menos costosa y da resultados ms rpidos.
Con frecuencia es deseable realizar ms de un tipo de prueba con cada muestra, por lo menos
cuando ha existido exposicin al hombre.
d)
Otras pruebas de identificacin

Las pruebas anteriores pueden completarse en laboratorios especializados (como los laboratorios de
referencia de la OIE o de la OMS) utilizando MAbs, sondas de cido nucleico, o la reaccin en cadena de la
polimerasa (PCR) seguida por secuenciacin de ADN de reas genmicas para tipificar el virus (16). Esto
permite hacer distinciones entre los virus vacunales y una cepa natural de campo, y posiblemente
determinar el origen geogrfico de sta ltima.
2.
Pruebas serolgicas
Las pruebas serolgicas se usan muy poco en estudios epidemiolgicos debido a la seroconversin tarda y al
bajo porcentaje de animales que sobreviven a la enfermedad con anticuerpos post-infeccin. El mtodo de
eleccin para el control de la rabia silvestre es la inmunizacin oral de los reservorios de rabia. Para
investigaciones de seguimiento de campaas de vacunacin oral, las pruebas de neutralizacin vrica (NV) en
cultivo celular son las preferibles. Sin embargo, si se dispone de sueros de baja calidad, las pruebas NV en
cultivo celular resultan sensibles a la cito toxicidad, lo que puede conducir a resultados positivos falsos. Se ha
comprobado que la utilizacin para tales muestras de una prueba ELISA indirecta con placas donde se usa como
antgeno la glicoprotena del virus de la rabia es tan sensible y especfica como la prueba NV con clulas (19).
a)
Prueba de neutralizacin vrica en cultivo celular: neutralizacin con anticuerpo fluorescente

(prueba prescrita para el comercio internacional)
El principio de la prueba de neutralizacin vrica con anticuerpo fluorescente (FAVN) (18) es la
neutralizacin in vitro de una cantidad constante del virus de la rabia ( cepa de virus estndar de desafo
[CVS] adaptada a cultivo celular) antes de inocular clulas susceptibles al virus de la rabia: clulas BHK-21
C13.
360
American Type Culture Collection (ATCC), 10801 University Boulevard, Manassas, Virginia 20110-2209, EE. UU.
El ttulo del suero es la dilucin a la que el 100% del virus resulta neutralizado en el 50% de los pocillos. El
ttulo se expresa en IU/ml comparndolo con la dilucin neutralizante de un suero estndar en las mismas
condiciones experimentales (suero de la OIE de origen canino o estndar de la OMS para inmunoglobulina
[humana] No. 2, o ambos). Puede usarse un control interno calibrado frente a un control internacional.
Este mtodo en microplaca utiliza placas de 96 pocillos y es una adaptacin de la tcnica de Smith et al.
(30), modificada por Zalan et al. (38) y por Perrin et al. (27). Varias publicaciones (17, 18) describen que la
prueba FAVN y la prueba rpida de inhibicin de foco fluorescente (RFFIT) proporcionan resultados
equivalentes.
Equipo bsico
Incubador a 37C con humedad y con 5% de CO2; incubador seco a 37C; cabina de contencin;
microscopio de fluorescencia adecuado para fluorescencia con FITC y equipado con ocular x10 y objetivo
x10. El aumento global del microscopio vara de x100 a x125 debido al aumento adicional de algunos
sistemas de epifluorescencia.
Reactivos y materiales
Tampn PBS, pH 7,2, sin Ca+2 ni Mg+2, mantenido a 4C;

Tripsina con etiln diamino tetra-actico (EDTA):
Acetona al 80% de grado alto (diluida con agua desionizada), mantenida a 4C;
Medio de Eagle modificado por Dulbecco (DMEM) + 10% de FCS inactivado por calor;
Conjugado anti-rabia con FITC;
Clulas: BHK-21 C13 (ATCC CCL-10);
Virus: cepa CVS-11 (ATCC VR 959), que est disponible en la ATCC o en el laboratorio de referencia de la
OIE para la Rabia, en Nancy, Francia (ver Cuadro en la parte 3 de este Manual). Los viales se mantienen a
80C;
Inmunoglobulina (humana) estndar de la OMS para la rabia No.2, 30 IU por ampolla2 (reconstituida con
5 ml de agua estril desionizada o destilada, mantenida a 20C, y diluida a 0,5 IU/ml con agua desionizada
antes de uso), o preferiblemente Suero Estndar de la OIE de origen canino (laboratorio de referencia de la
OIE para la Rabia, Nancy, Francia [ver Cuadro en la parte 3 de este Manual] mantenido a 20C y diluido a
0,5 IU/ml con agua estril desionizada o destilada segn el ttulo del lote). Se aconseja que, para control
interno rutinario, los laboratorios utilicen un suero positivo o un conjunto de sueros caninos que se hayan
calibrado frente al suero estndar internacional de la OIE;
Suero control: Conjunto de diez sueros caninos liofilizados, se mantiene a 4C y se reconstituye con 0,5 ml
de agua estril desionizada o destilada.
Produccin de CVS
i)
Cultivo celular: Las clulas BHK-21 C13 (ATCC CCL-10) para producir el virus CVS (ATCC VR 959
CVS-11) se tripsinizan durante la fase de crecimiento rpido, es decir, cuando estn en fase
exponencial de crecimiento. Si la confluencia de la capa es completa, debe hacerse un nuevo pase.
Las clulas en suspensin no deben agregarse; se utilizan 2 x 107 clulas por cada botella de cultivo
de 75 cm2. Las clulas se recogen en un volumen de 20-30 ml de medio de cultivo con 10% de FCS
inactivado por calor.
ii)
Infeccin de las clulas: Se ajusta la multiplicidad de infeccin (nmero de partculas infecciosas por
clula) ente 0,1 y 0,5. La botella de vidrio con la suspensin virus/clulas se incuba 60 minutos a 35,537C. El contenido de la botella se agita suavemente cada 10-15 minutos.
iii)
Crecimiento vrico: La suspensin virus/clulas se centrifuga a 800 g durante 15 minutos y el

precipitado se resuspende en medio de cultivo mezclado con 10% de FCS inactivado por calor. El
virus se recoge 2 das despus.
National Institute for Biological Standards and Control (NIBSC), Blanche Lane, South Mimms, Potters Bar, Hertfordshire
EN6 3QG, Inglaterra.
361
iv)
Recogida y almacenamiento: El sobrenadante se centrifuga a 800 g durante 15 minutos a 4C. Si se

han usado varias botellas, se mezclan los distintos sobrenadantes, se reparten despus en alcuotas y
se congelan a 80C. El ttulo infectivo del material se establece 3 das despus de la congelacin.
Titulacin del virus en DICT50 (dosis infectiva del 50% en cultivo de tejidos)
Este mtodo de titulacin utiliza clulas BHK-21 C13 (ATCC CCL-10) en placas de microtitulacin.
Diferentes pasos de este procedimiento se pueden adaptar a los sistemas de seguridad y los mtodos de
trabajo del laboratorio, pero los siguientes no deben cambiarse:
inoculacin de una capa celular de 24 horas,
diluciones decimales preparadas con 0,9 ml de diluyente y 0,1 ml de suspensin vrica,
seis rplicas de 50 l por dilucin,
incubacin durante 72 horas,
lectura cualitativa (es decir, el pocillo es negativo o positivo),
en cada sesin de titulacin se titula un vial de un lote control de virus y este ttulo se integra en una
tarjeta control para validar el proceso de titulacin.
el clculo se hace por el mtodo grfico neoprobit o por el de Spearman-Krber.
i)
Suspensin celular: El da antes de la titulacin se prepara una suspensin celular con 105 clulas/ml
en medio de cultivo con 10% de FCS inactivado por calor y se distribuye en las placas de
microtitulacin de 96 pocillos, con 200 l por pocillo. Las placas se incuban durante 24 horas a 35.537C con 5% de CO2.
ii)
Dilucin del virus: Las diluciones seriadas se realizan en tubos de 5 ml usando como diluyente un
medio de cultivo sin FCS. Se preparan diluciones de 10-1 a 10-12 (0,9 ml de diluyente con 0,1 ml de la
dilucin previa).
iii)
Infeccin de las clulas: El medio de las placas de titulacin se elimina con un sistema aspirante. En
cada pocillo se distribuyen 50 l de cada dilucin del virus. Se usan seis rplicas por cada dilucin. A
continuacin se incuba la placa de microtitulacin durante 1 hora a 35.5-37C con 5% de CO2.
Despus se aaden 200 l de medio de cultivo con 5% de FCS.
iv)
Incubacin: Se incuba durante 3 das a 35.5-37C en 5% de CO2.
v)
Tincin y clculo del ttulo: Las clulas se tien mediante FAT como se indica ms adelante. La lectura
es cualitativa y cada pocillo con fluorescencia se considera positivo. La determinacin del ttulo se
hace empleando:
el mtodo grfico neoprobit (2) o
a frmula de Spearman-Krber:
d
log10 (dilucin a punto final) = x 0 + d
2
ni
ri
x0 = (log10 de la dilucin menor con todos los pocillos positivos)

d = log10 de los saltos de dilucin, uno en este caso
ni = nmero de rplicas, seis en este caso
ri = nmero de pocillos positivos
362
Fig. 1. Utlizacin propuesta de las microplacas para la prueba de neutralizacin vrica con anticuerpo fluorescente.
Los pocillos a los que se debe aadir suero sin diluir se llenan con los 50 l indicados. Los pocillos a los que se
debe aadir 50 l del virus estndar de desafo diluido se muestran en sombreado. Las diluciones se expresan como
log10.
Placa 1: Controles
H
Titulacin
virus estndar
de desafo
3
4
Suero estndar
50 l
50 l
Suero canino
OMS u OIE
50 l
50 l
Control
(0.5 IU/ml)
50 l
50 l
(negativo)
50 l
50 l
50 l
Control positivo
50 l
10
Interno
50 l
11
50 l
12
log (dilucin)
log dilucin
Suero 1
Suero 2
0.48
0.95
1.43
1.91
2.39
2.87
3.35 Clulas
0.48
0.95
1.43
1.91
2.39
4.23
0.48
0.95
1.43
1.91
2.39
4.23
10
11
12
50 l
50 l
50 l
50 l
50 l
50 l
D 50 l
50 l
50 l
50 l
50 l
50 l
G 50 l
50 l
H 50 l
50 l
Suero 3
Suero 4
i)
Las microplacas se utilizan segn el modelo indicado en la Figura 1. La placa 1 se usa para la
titulacin de CVS (filas 1 a 4), y para los controles se emplean sueros estndar y suero canino control.
La placa 2 y las siguientes se utilizan para los sueros que se van a probar.
ii)
El medio se aade a los pocillos del siguiente modo: placa 1, filas 1 a 4 y pocillos A9 a A12: aadir
150 l por pocillo; placa 2 y siguientes: filas 6 y 12: aadir 200 l por pocillo; resto de los pocillos:
aadir 100 l.
iii)
Los sueros probados se inactivan por calor durante 30 minutos a 56C. Como indica la Figura 1, se
aaden 50 l de cada suero probado sin diluir a cuatro pocillos adyacentes.
iv)
La dilucin de los sueros se lleva a cabo en las microplacas del siguiente modo:
363
Suero de la OIE, suero de la OMS, control interno y control de suero canino: con una pipeta multicanal
de 50-200 l mezclar los pocillos de la primera dilucin aspirando y expeliendo al menos ocho veces,
transferir 50 l de una fila a la siguiente, hasta alcanzar la ltima. Eliminar 50 l de la ltima fila.
Sueros problema (todas las placas): como antes, transferir sucesivamente 50 l de una fila a la
siguiente hasta las filas 5 y 11 (dil. 10-2,39). Con una pipeta multicanal de 5-50 l, transferir 10 l de las
filas 5 y 11 a las filas 6 y 12, respectivamente (de la dil. 10-2,39 a la dil. 10-4,23). Utilizando una pipeta
multicanal ajustada a 100 l, mezclar las filas 6 y 12 y eliminar 180 l. Luego aadir a estas filas 70 l
de medio. Este paso final no lleva por s mismo a mayor rendimiento de la prueba. Para alcanzar o
superar la dilucin final recomendada pueden usarse procedimientos alternativos. Esto puede requerir
modificaciones en la distribucin de la placa.
364
Adicin del virus estndar de desafo
i)
El stock de CVS se guarda en microtubos de 1 ml a 80C. Un tubo se descongela rpidamente con

agua corriente fra y se coloca en hielo.
ii)
Se prepara una dilucin de este tubo para obtener 100 DICT50 en 50 l. De esta dilucin se aaden
50 l a cada pocillo con suero (ver Figura 1). Para titulacin del virus se aaden 50 l a los pocillos H1
a H4 (placa 1). A continuacin, transferir 50 l de fila a fila (placa1, lneas 1-4). Eliminar 50 l de la
ltima fila (placa 1, pocillos A1 a A4). A los pocillos A9 a A12 de la placa 1 (controles) no se aade
virus.
iii)
Incubar las microplacas a 37C en un incubador con humedad y 5% de CO2 durante 1 hora.
iv)
Adicin de clulas: Tripsinizar un cultivo subconfluente de clulas BHK-21 de 3 das. Resuspender las
clulas para obtener una suspensin de 4 x 105 clulas/ml en DMEM suplementado con 10% de FCS
inactivado por calor. Aadir 50 l de la suspensin celular a cada pocillo.
v)
Incubar las microplacas durante 48 horas a 37C en un incubador con humedad y 5% de CO2.
Fijacin y tincin
i)
Despus del perodo de 48 horas de incubacin, se elimina el medio, y las microplacas se lavan una
vez con PBS, pH 7,2, y una vez con 80% de acetona. Luego se fijan con 80% de acetona a
temperatura ambiente durante 30 minutos (sin tapadera) y se secan a temperatura ambiente durante
al menos 1 hora.
ii)
A cada pocillo se aaden 50 l de la dilucin de trabajo del conjugado anti-rabia con FITC se agitan
las microplacas ligeramente y se incuba a 37C durante 30 minutos. Se elimina el conjugado
fluorescente y las microplacas se lavan dos veces con PBS. Se elimina el exceso de PBS invirtiendo
brevemente las microplacas sobre papel absorbente.
Lectura e interpretacin de los resultados
i)
Se observa la superficie total de cada pocillo. La lectura de evaluacin es cualitativa (ms o menos): si
no hay fluorescencia en las clulas, se asigna un al pocillo; si hay fluorescencia en las clulas (una o
ms clulas), se asigna un + al pocillo.
ii)
Se leen primero los controles. Para las clulas control, titulacin de CVS, suero control, y sueros
estndar (estndar de la OMS y/o de la OIE), los ttulos se calculan por el mtodo de SpearmanKrber o por el mtodo grfico neoprobit (2).
iii)
Los resultados de la titulacin de CVS (DICT50), suero control (D50 [dosis media]) y estndar positivo
(D50) se reflejan en una tarjeta de control en cada caso. Los resultados del control de la prueba actual
se comparan con los resultados de las pruebas de control de pruebas anteriores utilizando el mismo
lote de control. La prueba se valida si los valores obtenidos para los tres controles de la prueba actual
no son estadsticamente diferentes de la media de los valores obtenidos en pruebas anteriores segn
esta tcnica.
iv)
El resultado de la prueba corresponde a los virus no neutralizados tras la incubacin con el suero de
referencia o con el suero problema. Estos ttulos se calculan con el mtodo grfico neoprobit (2) o con
la frmula de Spearman-Krber (37). La comparacin del ttulo medido en los sueros probados con el
del suero estndar positivo de ttulo neutralizante conocido permite la determinacin del ttulo
neutralizante de los sueros problema en IU/ml.
b)
Prueba rpida de inhibicin de foco fluorescente (RFFIT) para la determinacin de anticuerpos

neutralizantes contra el virus de la rabia (prueba obligatoria para el comercio internacional)
Procedimiento estndar (tomado de Tcnicas de Laboratorio para la Rabia de la OMS, 1996; [ref.
37])
Preparacin de la suspensin de virus de inculo
i)
Tripsinizar un cultivo de 3 das de clulas de neuroblastoma de ratn (MNA)3 en botella de 150 ml.
Estas clulas prefieren un medio cido suplementado con vitaminas (34). Puede obtenerse una lnea
celular similar (CCL-31) por peticin a la ATCC (ver nota 1 a pie de pgina).
ii)
En un tubo cnico de centrfuga de 50 ml, resuspender 3 x 107 clulas en 2,7 ml de medio mnimo
esencial de Eagle suplementado con 10% de suero fetal bovino (EMEM-10).
iii)
Con procedimientos estndar de seguridad contra la rabia, aadir 1 x 107 unidades infecciosas del
virus de la rabia CVS-11 (ATCC, VR959) y mezclar con el vrtex una vez. Incubar las clulas y el virus
durante 15 minutos a 37C; durante este tiempo, someter una vez las clulas al vrtex.
iv)
Aadir 10 ml de EMEM-10, mezclar con vrtex, y centrifugar las clulas a 500 g durante 10 minutos.
v)
Eliminar el sobrenadante. Resuspender las clulas en 30 ml de medio de cultivo y transferir a una

botella de 150 ml.
vi)
Agitar el recipiente suavemente para mezclar la suspensin celular y despus preparar tres portas con
cmara para cultivo de tejidos con ocho pocillos pipeteando 0,2 ml de la suspensin celular en un
pocillo de cada porta.
vii)
Incubar las botellas y los portas a 37C en un incubador con humedad con 0,5% de CO2. La botella
debe incubarse como cultivo cerrado (tapn ajustado).
viii) A las 20, 40 y 60 horas despus de la infeccin, fijar con acetona y teir un porta por la tcnica de
inmunofluorescencia (23) para determinar la infectividad vrica. 24 horas despus de que las clulas
muestren un 100% de infectividad (generalmente a las 40 horas de la infeccin), debe recogerse el
sobrenadante.
ix)
Transferir el sobrenadante a un tubo de centrfuga de 50 ml y centrifugar a 4.000 g durante

10 minutos.
x)
Distribuir y guardar el sobrenadante a 70C en alcuotas de 0,5 ml.
Titulacin de la suspensin vrica de inculo
i)
Descongelar una alcuota del virus de inculo y preparar diluciones decimales seriadas (de 10-1 a 10-8)
en EMEM-10.
ii)
Distribuir 0.1 ml de cada dilucin de virus en un pocillo de un porta con cmara para cultivo de tejidos
con ocho pocillos. Aadir a cada pocillo 0,2 ml de clulas MNA suspendidas en EMEM-10
(concentracin de 5 x 104 clulas por 0,2 ml).
iii)
Mezclar las clulas y el virus moviendo suavemente el porta e incubar despus durante 40 horas a
37C en un incubador con humedad y 0,5% de CO2.
iv)
Fijar con acetona y teir el porta por la tcnica de inmunofluorescencia. Se debe observar infeccin
vrica con la dilucin 10-6 del virus, lo que indica que el stock de la suspensin vrica contiene al
menos 1 x 106 unidades infecciosas por 0,1 ml. Preparar suficiente virus de inculo para que no sean
necesarios frecuentes pases seriados del virus.
Preparacin de la suspensin stock de virus
i)
Infectar 3 x 107 clulas MNA con 1 x107 unidades infecciosas de la preparacin de virus de inculo
(ver anteriormente).
ii)
Recoger el sobrenadante 24 despus de que las clulas alcancen el 100% de infectividad

(generalmente a las 40 horas de la infeccin).
iii)
Distribuir y guardar el sobrenadante a 70C en alcuotas de 0,5 ml.
Disponible previa solicitud al Rabies Laboratory, Division of Viral and Rickettsial Diseases, Centres for Disease Control
and prevention, Atlanta, Georgia, EE.UU.
365
Titulacin de la suspensin stock de virus
i)
Descongelar una alcuota del virus de inculo y preparar diluciones decimales seriadas (de 10-1 a 10-8)
en EMEM-10.
ii)
Distribuir 0,1 ml de cada dilucin de virus en un pocillo de un porta con cmara para cultivo de tejidos
con ocho pocillos. Aadir a cada pocillo 0,2 ml de clulas MNA suspendidas en EMEM-10
(concentracin de 1 105 clulas por 0,2 ml).
iii)
Mezclar las clulas y el virus moviendo suavemente el porta e incubar despus a 37C en un
incubador con humedad y 0,5% de CO2 durante 20 horas.
iv)
Fijar con acetona y teir el porta por la tcnica de inmunofluorescencia.

Cada pocillo de un porta con cmara para cultivo de tejidos contiene 25-50 campos microscpicos
distintos cuando se observan a x160-200 aumentos. Una unidad de virus por la prueba RFFIT se
expresa como la dilucin a la que el 50% de los campos microscpicos observados contiene uno o
ms focos de clulas infectadas (dosis formadora de focos, FFD50). La suspensin stock de virus debe
contener al menos 1 x 104 FFD50 por 0,1 ml (es decir, el pocillo con la dilucin 10-4 de virus debe
contener por lo menos un foco de clulas infectadas en el 50% de los campos microscpicos
observados). Una suspensin stock de virus con este ttulo se puede diluir luego a 10-2,3 para obtener
una suspensin de virus que contenga 50 FFD50.
Sueros de referencia
En cada prueba debe incluirse un suero estndar de referencia nacional o internacional diluido a una
potencia de 2,0 IU/ml. El suero de referencia utilizado en los Centros para Control y Prevencin de
Enfermedades es el primer estndar internacional de inmunoglobulina antirrbica (35) y puede
obtenerse del NIBSC (ver nota 2 a pie de pgina). El suero de referencia debe mantenerse en
alcuotas congeladas en cantidad suficiente para 1 semana de pruebas. Tambin deben prepararse
por el laboratorio, e incluirse en cada prueba, un suero control estndar positivo diluido a una potencia
de 0,1 IU/ml y un suero control estndar negativo.
Sueros problema
Antes de la prueba los sueros problema deben calentarse a 56C durante 30 minutos para inactivar el
complemento. Si estn congelados, deben ser recalentados despus de la descongelacin. Se
pueden preparar diluciones seriadas de los sueros problema en un porta con cmara para cultivo de
tejidos con ocho pocillos. El anlisis de las diluciones 1/5 y 1/50 es suficiente para una evaluacin
rutinaria de la eficacia vacunal y se hacen como se indica:
366
i)
Preparar una dilucin 1/2,5 aadiendo a uno de los portas 0,1 ml del suero inactivado y 0,15 ml de
EMEM-10. Mezclar por agitacin suave del porta.
ii)
Transferir 0,05 ml de la dilucin 1/2,5 a un segundo pocillo que contenga 0,45 ml de EMEM-10.
Desechar todo excepto 0,1 ml del pocillo que contiene la dilucin 1/2,5.
iii)
Mezclar el segundo pocillo y desechar todo excepto 0,1 ml.
iv)
Aadir a todas las diluciones de suero 0,1 ml de la preparacin de stock de virus (que contenga 32100 FFD50).
v)
Mezclar e incubar a 35C durante 90 minutos en un incubador con humedad y 5% de CO2.
Adicin de clulas
i)
Durante el perodo de incubacin, tripsinizar un cultivo de 3-5 das de clulas MNA.
ii)
Resuspender las clulas en EMEM-10 a una concentracin final de 1 x 105 clulas por 0,2 ml.
iii)
Distribuir 0,2 ml de la suspensin celular en cada pocillo del porta e incubar a 35C en un incubador
con humedad y 5% de CO2 durante 20 horas.
Fijacin con acetona y tincin por inmunofluorescencia
i)
Despus de 20 horas, sacar los portas del incubador y eliminar el medio vertindolo sobre una
solucin virucida.
ii)
Lavar los portas una vez con PBS y luego fijar con acetona fra (-20C).durante 10 minutos a
temperatura ambiente
iii)
Dejar secar los portas durante 10 minutos antes de aadir el suero antirrbico conjugado con FITC. El
conjugado se puede preparar en EMEM-10 o PBS; no hay necesidad de adsorber el conjugado con
papel o clulas. La dilucin del conjugado debe determinarse por titulacin. Los portas se tien
durante 20-30 minutos a 37C y despus se lavan con PBS y agua destilada, respectivamente.
iv)
Observar los portas con un microscopio de fluorescencia.
Determinacin de los ttulos de anticuerpo neutralizante
Los virus residuales se detectan mediante un microscopio normal de fluorescencia. El ttulo de

neutralizacin a punto final del suero se define como el factor de dilucin de la dilucin ms alta de suero a
la que el 50% de los campos microscpicos observados contiene una o ms clulas infectadas (es decir, un
97% de reduccin en el inculo vrico). Este valor se puede obtener por interpolacin matemtica.
Alternativamente se puede determinar un ttulo del 100% de neutralizacin anotando la dilucin ms alta de
suero a la que se neutraliza el 100% del inculo y no hay clulas infectadas en ninguno de los campos de
observacin. Por ambos mtodos de titulacin, se puede obtener el ttulo de anticuerpo en el suero
problema (en IU/ml) mediante comparacin con el ttulo del estndar nacional de referencia incluido en cada
prueba. Debe sealarse que tambin resulta vlido realizar la prueba RFFIT utilizando clulas BHK-21 en
lugar de clulas de neuroblastoma. Para tal fin se ha publicado un protocolo modificado (37).
c)
Neutralizacin del virus en ratones

El principio de esta prueba es la neutralizacin in vitro de una cantidad constante del virus de la rabia
(50 LD50 [dosis letal del 50%] por 0,03 ml de la cepa CVS) mediante cantidades variables del suero que se
va a titular durante un paso de incubacin de 90 minutos a 37C. La mezcla virus/suero (0,03 ml) se inocula
en el cerebro de ratones de 3 semanas. El ttulo del suero es la dilucin final del suero en la mezcla
virus/suero que protege al 50% de los ratones (la mortalidad es del 100% en ausencia de neutralizacin). El
ttulo se puede expresar en IUs mediante comparacin con la dilucin neutralizante de un suero estndar
bajo las mismas condiciones experimentales.
Para realizar la prueba se descongela una ampolla de virus CVS y se prepara una suspensin con
100 LD50/0,03 ml (teniendo en cuenta que se diluye a la mitad por adicin del mismo volumen del suero de
prueba antes de la inyeccin). La cantidad de virus realmente utilizado durante la prueba (lmites
permisibles: 30-300 LD50/0,03 ml) se comprueba titulando cuatro diluciones de la preparacin vrica, cada
una de las cuales se inocula a cinco ratones. El suero problema se calienta a 56C durante 30 minutos para
inactivar el complemento.
Para comprobar las condiciones de la titulacin se debe incluir un suero estndar. La mxima diferencia
permitida entre la capacidad neutralizante esperada y la medida durante la titulacin es 100,5. La mayor
dilucin no debe neutralizar el virus. El diluyente es el mismo que el que se utiliza para la preparacin vrica.
A cada dilucin de suero se aade un volumen igual de la preparacin vrica con 100 LD50/0,03 ml. Las
mezclas se incuban en un bao a 37C durante 90 minutos y a continuacin en un bao con hielo para
reducir la inactivacin de los virus debida a la temperatura. La reaccin se detiene por inmersin en hielo.
Durante la inoculacin, los tubos que no se usan de inmediato se mantienen a 4C.
Para cada dilucin se inoculan intracerebralmente cinco ratones con 0,03 ml de la mezcla suero/virus. Se
registra la mortalidad durante 21 das despus de la inoculacin, pero las muertes que ocurren durante los
primeros 4 das se consideran inespecficas (debidas a estrs, infeccin, etc.). El ttulo del suero se puede
calcular por comparacin con un suero estndar internacional.
d)
Enzimoinmunoensayo
Esta prueba ELISA indirecta permite la deteccin cualitativa de anticuerpos contra la rabia en muestras de
sueros individuales de perros y gatos despus de la vacunacin. De acuerdo con las recomendaciones de
la OMS (36), el ttulo mnimo medible de anticuerpos frente a la rabia que se considera que representa un
nivel de inmunidad que correlaciona con la capacidad de proteger contra la infeccin es 0,5 IU por ml.
Aunque el ELISA indirecto tiene menor sensibilidad que FAVN o RFFIT, puede utilizarse como una prueba
rpida de ensayo (en 4 horas), que no requiere manejar el virus vivo de la rabia, para determinar si los
perros y los gatos presentan seroconversin. Debido a la menor sensibilidad de la prueba, los resultados
negativos deben confirmarse por FAVN o RFFIT.
La reaccin comprende tres pasos:
1. Cada nuestra de suero problema se coloca en un pocillo de una placa de microtitulacin pre-llenada con
antgenos inactivados del virus de la rabia. Los anticuerpos presentes en la muestra se unen a los
antgenos vricos de la superficie del plstico.
367
2. Despus de lavar, se aade el conjugado protena A/peroxidasa, que se une a las inmunoglobulinas
(anticuerpos) previamente capturadas formando un complejo: (antgeno de la rabia)-(anticuerpo
antirrbico)-(protena A/peroxidasa).
3. El exceso de conjugado se elimina por lavado. El enzima unido al complejo se detecta aadiendo un
substrato que se transforma en un producto coloreado. Despus de detener la reaccin, se miden las
densidades pticas.
La cepa G5, 25 Wistar del virus de la rabia (derivada de la cepa Pasteur) se obtiene en clulas NIL2 con
pocos pases, originadas de cultivos celulares de embrin de hmster. El virus recogido se clarifica para
eliminar restos celulares por filtracin en gel y la suspensin vrica se inactiva con beta-propiolactona. Para
la reaccin en las placas se utiliza un stock de antgeno de 4,1 g/ml.
Reactivos4
Microplaca con seis filas de 16 pocillos sensibilizados con antgenos de la rabia. Se deben usar en 4
semanas despus de abrir la bolsa, que se debe cerrar despus de cada uso;
Conjugado (CJ): Protena A/peroxidasa (concentrada x10). Diluir 10 veces con el diluyente del conjugado
(CD) y usar dentro de las 24 horas que siguen a la dilucin;
Substrato de la peroxidasa tamponado (PS): 3,3, 5, 5-tetrametilbenzidina;
Suero control negativo (N), sueros libres de patgenos diluidos en Stabilzyme, un estabilizador comercial
suministrado por Surmodic Inc., MN 55344-3523 EE.UU.;
Suero control positivo (P), sueros hiperinmunes de perros vacunados diluidos en Stabilzyme, un
estabilizador comercial suministrado por Surmodic Inc., MN 55344-3523 EE.UU.;
Diluyente de la muestra (SD), tampn PBS, pH 7,8, que incluye casena al 0,28% (p/v) y Triton X100 al
0,055% (v/v);
PEG al 0,55% (p/v), SDS al 0,056% (p/v), PVP al 1% (p/v), Tetronic al 0,42% (p/v) y suero bovino inactivado
por calor al 1% (v/v);
Solucin de lavado (N), tampn Tris/NaCl, pH 7,5 con Tween 20 al 1%;
Diluyente del conjugado (CD), tampn Tris, pH 8;
Solucin de parada (S), solucin de cido sulfrico 4N + tiomersal al 0,02% (p/v).
Los reactivos diluidos deben guardarse a 5C + 3C. Al menos 1 hora antes de uso, todos los reactivos se
pasan a temperatura ambiente.
Muestras
La reaccin se realiza con sueros individuales inactivados por calor (30 minutos a 56C) diluidos a 1/100.
Es necesario probar las diluciones apropiadas del suero estndar de referencia de la OIE que contiene
6,7 IU/ml (disponible en el laboratorio de referencia de la OIE para Rabia, Nancy, Francia).
Las muestras deben mantenerse a 5C + 3C. Para conservacin prolongada, las muestras de suero deben
congelarse a 20C.
Pasos preliminares de predilucin
Seguir estrictamente el procedimiento indicado a continuacin. Utilizar controles positivos y negativos por
duplicado en cada prueba y/o para cada placa.
i)
368
Fijar cuidadosamente la identificacin y distribucin de los controles y las muestras utilizando el

protocolo que se seala ms abajo.
Disponibles en Synbiotics Europe S.A.S., 2 rue Alexander Fleming, 69367 Lyon Cedex 07, Francia.
ii)
Preparar los sueros problema. Las diluciones se realizan con el diluyente de muestras (SD) del modo
siguiente: primero se prediluyen las muestras a 1/10 en una microplaca en blanco (10 l de muestra
en 90 l de SD).
iii)
Para titulacin del suero, debe hacerse un conjunto de seis diluciones del Suero Estndar de la OIE en
tubo o en una microplaca en blanco, comenzando con la dilucin inicial 1/10, luego 1/30, 1/100, 1/300,
1/1.000 hasta la dilucin final 1/3000. Estas diluciones del Suero Estndar de la OIE deben incluirse
en cada prueba y/o microplaca con una dilucin inicial de 1/10, 1/30, 1/100, 1/300, 1/1.000 y 1/3.000.
Se recomienda el siguiente esquema para preparar las diluciones apropiadas:
Dilucin OIE
Preparacin
1/10
10 l de Suero Estndar Internacional de la OIE + 90 l de diluyente de muestra
1/30
10 l de Suero Estndar Internacional de la OIE + 290 l de diluyente de muestra
1/100
10 l de la dilucin 1/10 + 90 l de diluyente de muestra
1/300
1/1000
1/3000
Este rango de diluciones del Suero Estndar de la OIE debe estar presente en todas las placas.
i)
Distribucin de control: depositar 90 l de diluyente de muestra, y en los pocillos A1 y A2 aadir 10 l

del control negativo y en los pocillos B1 y B2 10 l del control positivo.
ii)
Distribucin de muestras y diluciones del suero estndar de la OIE: en los pocillos problema depositar
90 l de diluyente de muestra, aadir 10 l de la predilucin 1/10 de la muestra o de cada una de las
diluciones de 1/10 a 1/3.000 del suero OIE y mezclar cuidadosamente.
Las diluciones de la muestra y del suero estndar de la OIE deben probarse por duplicado. Se
recomienda la siguiente distribucin (que recoge las diluciones finales de prueba):
Cuantificacin de anticuerpos (dilucin final)
1
N 1/10
N 1/10
S1 1/100
S1 1/100
P 1/10
P 1/10
S2 1/100
S2 1/100
OIE 1/100
OIE 1/100
S3 1/100
S3 1/100
OIE 1/300
OIE 1/300
S4 1/100
S4 1/100
OIE 1/1000
OIE 1/1000
S5 1/100
S5 1/100
OIE 1/3000
OIE 1/3000
S6 1/100
S6 1/100
OIE 1/10000
OIE 1/10000
S7 1/100
S7 1/100
OIE 1/30000
OIE 1/30000
S8 1/100
S8 1/100
Se deben colocar siempre las filas marcadas sobre el soporte de modo que se pueda utilizar tanto el
lavador como el lector. Los pocillos se cubren con cinta adhesiva cortada a la longitud necesaria en
funcin del nmero de filas utilizadas. Mezclar por agitacin manual suave de la placa o mediante un
agitador de placas.
iii)
Incubar las placas de microtitulacin durante 1 hora + 5 minutos a 37C + 3C.
iv)
Dilucin del reactivo:

Tampn de lavado: diluir la solucin de lavado concentrada (W) a 1/10 con agua destilada o
desmineralizada.
Conjugado: diluir el concentrado (CJ) a 1/10 con el diluyente del conjugado (CD); se necesitan 2 ml
para una fila, es decir, 20 l de CJ en 1,88 ml de CD.
v)
Retirar con cuidado la cinta adhesiva y lavar cuatro veces
vi)
Aadir 100 l de conjugado diluido a todos los pocillos y cubrir con una tira nueva de cinta adhesiva.
369
vii)
Incubar el conjugado durante 1 hora + 5 minutos a 37C + 3C.
viii) Retirar con cuidado la cinta adhesiva y lavar cuatro veces.

ix)
Aadir 100 l por pocillo de substrato tamponado para la peroxidasa (PS). No cubrir con cinta
adhesiva en esta fase. Mezclar por agitacin manual suave de la placa o mediante un agitador de
placas para asegurar una correcta homogenizacin.
x)
Incubar durante 30 + 5 minutos a la temperatura del laboratorio (20C + 5C) y protegida de la luz.
xi)
Aadir 50 l de solucin de parada (S) por pocillo. Mezclar por agitacin manual suave de la placa o
mediante un agitador de placas. Comprobar la ausencia de burbujas en los pocillos. Secar
cuidadosamente el fondo de los pocillos.
xii)
Medir la densidad ptica (OD) bicromticamente a 450 y 630 nm o monocromticamente a 450 nm (en
el espectro amarillo).
Cuantificacin de anticuerpos: expresin e identificacin de los resultados
Clculo del ttulo utilizando la curva de regresin

i)
Calcular el valor medio de la OD para cada muestra problema y cada dilucin del suero de la OIE.
ii)
Calcular el valor del logaritmo natural (ln) de cada OD media y el valor ln de la concentracin de
anticuerpo para cada dilucin de la OIE (de 6,7 a 0,0223 IU/ml, sin tener en cuenta el factor de dilucin
1/100 de la prueba).
iii)
Representar el ln de la OD (en ordenadas, eje Y) en funcin del ln de la concentracin de Ab contra la

rabia (en abcisas, eje X) para obtener la curva de referencia para el suero estndar de la OIE.
iv)
Con todos los resultados individuales obtenidos de las diluciones del suero estndar de la OIE se
realiza una regresin lineal entre el ln de la concentracin de anticuerpo contra la rabia (expresada en
Unidades ELISA/ml) y el ln de la OD, para establecer el correspondiente modelo matemtico:
ln de la concentracin de anticuerpo contra la rabia = a + b x ln OD
v)
Para cada muestra probada, calcular el valor medio de la OD y despus la concentracin de

anticuerpo contra la rabia de la muestra expresada como unidades equivalentes por ml (EU/ml) a
partir del modelo establecido:
Concentracin de Ab contra la rabia en la muestra (EU/ml) = e (a+b x ln OD)
Validacin de la prueba
Los resultados de cada prueba (o de cada placa) son vlidos:
si la densidad ptica del control positivo (OD P) es mayor o igual a 0,300, y
si la densidad ptica del control negativo (OD N) es menor que 0,50 x OD P.
el coeficiente de correlacin entre ln ODs y ln de la concentracin de Ab contra la rabia en el Suero

Estndar de la OIE es mayor que 0,95.
Ejemplos
Muestra 1:
Muestra 2:
Control positivo:
OD en B1 = 0.610
OD en B2 = 0.690
__
OD P = 0.650
Control negativo:
OD en A1 = 0,190
OD en A2 = 0,210
__
OD N = 0,200
OD en 1 = 1.790
OD en 1 = 0,350
OD en 2 = 1.750
OD en 2 = 0,390
__
OD = 1.770
OD = 0,370
OD P = 0,650 > 0,300 y OD N = 0,200 < 0,50 0.650 = 0,325, por consiguiente la prueba es vlida.
370
Resultados e interpretacin (titulacin cuantitativa de anticuerpos)
Si el ttulo calculado es > 0,6, se considera que el animal presenta seroconversin despus de la
vacunacin.
Si el ttulo calculado es < 0,6, se considera que el animal no presenta suficiente nivel de anticuerpo. Como
el mtodo ELISA es una prueba de ensayo, se deberan realizar pruebas confirmativas de tipo FAVN o
RFFIT con las muestras de suero con ttulo < 0,6.

Las vacunas contra la rabia preparadas de la cepa original 1885 de Pasteur y sus cepas derivadas (virus
Pasteur, virus de desafo (challenge) estndar, Pitman-Moore, etc.), y de cepas aisladas ms recientemente
(Flury, Street-Alabama-Dufferin [SAD], Vnukovo y Kelev), protegen contra todas las cepas de genotipo 1 aisladas
hasta la fecha. Las vacunas convencionales contra el virus de la rabia pueden no suministrar una adecuada
proteccin cruzada contra otros lyssavirus; no existe proteccin contra el virus Mokola (31). Los principios que
rigen la preparacin de vacunas inactivadas contra la rabia son idnticos para las que se usan en humanos o en
animales, aunque en las vacunas para uso en animales se puede aadir un adyuvante.
En animales, las vacunas vivas tambin son eficaces por ruta oral y se pueden distribuir en cebos para inmunizar
animales salvajes (o domsticos). Tambin resultan eficaces las vacunas vivas recombinantes (por ejemplo,
glicoprotena recombinante del virus de la rabia expresada en poxvirus) (25).
Las normas para la produccin de vacunas veterinarias se indican en el Captulo I.1.7. Principios de produccin
de vacunas veterinarias. Las directrices dadas aqu y en el captulo I.1.7. son de carcter general y pueden
suplementarse con requisitos nacionales y regionales.
Se aplican diferentes estndares a las vacunas con virus vivos modificados por pases en animales, huevos o
cultivos celulares, para reducir su virulencia en el animal, que a las vacunas preparadas con virus inactivados.
Ambos tipos de vacunas tienen sus ventajas e inconvenientes (5), pero los dos tipos pueden utilizarse para
inmunizar a animales por perodos de entre 1 y 3 aos. En algunos pases no se aceptan las vacunas con virus
vivos atenuados. No son adecuadas para proteger animales no vacunados previamente que se hayan expuesto
a la infeccin (13). La eficacia de un tratamiento con vacuna sola despus de la exposicin solamente se ha
demostrado en humanos, pero incluso en estos casos se recomienda administrar adicionalmente
inmunoglobulina antirrbica.
Toda manipulacin del virus durante la produccin y ensayo de las vacunas debe adaptarse a las estrictas
precauciones de seguridad especificadas por la OMS (36, 37), la OIE (Captulo I.1.6) y las directrices y normas
nacionales.
1.
Control de inculos
a)

Resulta adecuada cualquier cepa de serotipo 1 que demuestre proteger contra los virus naturales de la
rabia (que se encuentren actualmente en el pas donde se va a usar la vacuna). La cepa de virus utilizada
debe tener propiedades biolgicas (patogenicidad) y antignicas (tipadas por MAbs) bien conocidas. Si se
emplea como vacuna viva, el inculo primario de virus no debe causar rabia clnica. Deben probarse al
menos dos animales (preferiblemente cinco o seis por grupo) de cada una de las especies a las que va
dirigida la vacuna, y si fuera posible de cualquier especie que pueda estar en contacto con la vacuna o con
animales vacunados. Esto se realiza inoculando en un nervio importante o en sus inmediaciones una dosis
diez veces superior al ttulo vrico contenido en una dosis del producto final propuesto. Los animales deben
observarse por lo menos durante 90 das para cualquier efecto que se pueda atribuir al inculo primario.
b)
Mtodo de cultivo
Se debe preparar y mantener a 70C, o a temperatura inferior, un stock de clulas primarias del virus de
inculo, cuyos subcultivos se utilizarn para la produccin de vacuna. La multiplicacin del virus se
comprueba por titulacin durante el crecimiento del virus de inculo.
c)

Antes de autorizar una vacuna deben establecerse evidencias de su eficacia mediante inoculaciones de
desafo en los animales vacunados y en animales control de cada especie determinada. La prueba de
desafo debe realizarse despus de la vacunacin, al final del perodo en que el fabricante manifiesta que
371
se mantiene la inmunidad. La cintica de produccin de anticuerpos debe determinarse tambin para

establecer la correlacin entre el ttulo de anticuerpos y la resistencia al desafo.
La eficacia de la vacuna producida se determina por estudios con cada especie a la que va dirigida,
vacunada previamente segn se recomiende. La proteccin al final del perodo de inmunidad se controla
midiendo los anticuerpos neutralizantes especficos y por desafo con el virus de la rabia. Las condiciones
experimentales de este desafo deben reflejar las condiciones naturales de la infeccin, aunque, desde un
punto de vista prctico, puede resultar ms fcil obtener un 100% de mortalidad en los animales control con
una cepa del virus de la rabia bien conocida que con una aislada localmente. En los animales vacunados
con vacunas inactivadas, el porcentaje de seroconversin y el nivel medio de anticuerpos permiten una
buena prognosis para superar el desafo (3).
Se debe establecer la correlacin entre la potencia, en la especie en cuestin, y el valor antignico
determinado en ratones (ver Seccin C.4.c. ms adelante).
A efectos de autorizar una vacuna, se deben realizar pruebas de seguridad en la especie a la que va
dirigida. En el caso de las vacunas con virus vivos (incluyendo las vacunas recombinantes) que se utilizan
en campaas de vacunacin oral, las pruebas de seguridad tambin deben realizarse en aquellas otras
especies que viven en las reas de vacunacin y que podran estar expuestas a la vacuna (5).
La estabilidad de la vacuna se determina probando lotes despus de un almacenamiento dilatado,
generalmente despus de 1-2 aos. A veces se utiliza un procedimiento de envejecimiento acelerado,
mantenindola a 37C durante 1 semana. El tiempo de validez o vencimiento manifestado por el fabricante
se comprueba por la autoridad nacional. En general es de 12-18 meses para las vacunas lquidas y
posiblemente de 24 meses para las liofilizadas.
2.
Mtodo de produccin
Cualquiera que sea el mtodo adoptado, se debe prestar una especial atencin a la calidad del substrato. Tanto
los animales como los huevos deben ser de un origen SPF, y los cultivos celulares, como las lneas BHK, deben
cumplir con los estndares internacionales de esterilidad e inocuidad.
a)
En animales
El virus se inocula intracerebralmente y cuando el animal muere en las fases terminales de la rabia se
recoge el tejido nervioso. El virus se inactiva por mtodos fsicos, como irradiacin con luz ultravioleta, o
qumicos, como la adicin de fenol o beta-propiolactona. Las vacunas deben prepararse en animales
jvenes (ratones, corderos, etc.) para obtener gran rendimiento vrico y para reducir el contenido en mielina
de la vacuna y otros efectos adversos asociados. En algunos casos el virus no se inactiva por completo,
como por ejemplo en las vacunas de tipo Fermi tratadas con fenol, pero tales vacunas ya no se
recomiendan.
b)
En huevos
Se inocula una cepa modificada de virus, adaptada a huevos, en huevos embrionados de pollo SPF, que se
incuban a 38C durante 5-6 das. El virus se recoge en forma de tejidos embrionarios infecciosos y
normalmente se liofiliza y se emplea como una vacuna viva. Ejemplos de estas vacunas son las que
contienen el Flury de pocos pases en huevo (LEF), o la cepa variante ms deseable de muchos pases en
huevo (HEP), que es ms segura para algunas especies animales como el gato.
c)
En cultivos celulares
Los cultivos se infectan con cepas del virus de la rabia adaptadas al cultivo celular y se incuban a 35-36C.
stos se pueden utilizar como vacunas con virus vivos (como en las vacunas Flury y SAD) o como vacunas
inactivadas despus de la adicin de fenol (vacuna Semple) o cualquier otro compuesto, como la betapropiolactona.
Los cultivos tambin pueden utilizarse para obtener virus vectores (por ejemplo poxvirus) que lleven el gen
que codifica la expresin de la glicoprotena del virus de la rabia (25).
Durante la produccin se controla la multiplicacin de los virus en uno de los substratos antes mencionados
y se recoge el virus al tiempo ms apropiado, normalmente a los 4-6 das de la inoculacin de los animales,
los huevos o los cultivos celulares. El virus obtenido se suspende en una solucin tamponada a una dilucin
que provoque una antigenicidad ptima. Si se necesita, la suspensin se inactiva o liofiliza. Se recomienda
un adyuvante para vacunas con virus inactivados, as como para otros antgenos de la vacuna que puedan
incorporarse a vacunas polivalentes.
372
3.
Control del proceso
Consiste en el seguimiento del crecimiento vrico para obtener un ttulo ptimo y asegurar la ausencia de
contaminacin microbiana indeseable.
En vacunas con virus vivos, debe establecerse la cintica del crecimiento vrico para asegurar un ttulo final de
virus que se correlacione con la proteccin deseable de las especies concretas.
En vacunas con virus inactivados, deben evaluarse las propiedades inmunognicas del producto final por
tcnicas in vitro (por ejemplo, en ELISA, inmunodifusin en medio slido, pruebas de unin a anticuerpo o tincin
de clulas infectadas). Estas estimaciones indicarn el mejor tiempo para recoger los virus de los cultivos
celulares.
4.
Control de lotes
a)
Esterilidad
Las pruebas para esterilidad y ausencia de contaminacin de los materiales biolgicos se encuentran en el
Captulo I.1.5.
b)
Inocuidad
Las pruebas de seguridad de los lotes de vacunas con virus inactivados se llevan a cabo mediante
inoculacin en cultivo celular o intracerebralmente en ratones para detectar virus viables. Para vacunas
vivas contra la rabia, debe realizarse una prueba de seguridad adecuada para cada lote de vacuna en la
especie hospedadora concreta. Por lo menos tres, y preferiblemente cinco o seis animales de la especie
hospedadora en cuestin deben recibir una dosis equivalente a diez veces la dosis de campo recomendada
por la ruta normal de administracin. Los animales deben observarse durante 90 das para reacciones
adversas atribuibles a la vacuna.
c)
Potencia
La cantidad de virus presente en vacunas vivas atenuadas y en las recombinantes se determina por
titulacin. Una vez establecida una correlacin entre la actividad de la vacuna en la especie a la que va
dirigida y los ttulos vricos, las titulaciones representan unos indicadores fiables de la eficacia de la vacuna.
Esto se realiza utilizando cultivos celulares o por inoculacin intracerebral de ratones lactantes (en ratones
solo es posible con unos cuantos virus atenuados). Las vacunas recombinantes deben controlarse para la
expresin de la protena de la rabia hasta asegurar que la estabilidad de la expresin se mantiene en el
proceso de produccin. El ttulo del vector puede usarse entonces como un indicador fiable de la eficacia de
la vacuna.
Para las vacunas con virus inactivados, la correlacin entre la potencia en la especie a la que van dirigidas
y el valor antignico estimado en ratones representa un indicador fiable de la actividad de la vacuna. En
EE.UU. la potencia de la vacuna se establece por la prueba del NIH (National Institutes of Health). En otras
partes tiene gran aceptacin la prueba de la Farmacopea Europea.
De acuerdo con la Farmacopea Europea (20) se inoculan grupos de al menos diez ratones de 3-4 semanas
con dosis decrecientes nicas de vacuna, o con dos dosis, separadas por 1 semana, segn la prueba del
NIH (37). Se compara un nmero suficiente de diluciones para determinar la dilucin a la que el 50% de los
ratones se protegen contra una inoculacin intracerebral de desafo 14 das despus (20, 37).
Para la calibracin de estndares nacionales existe una vacuna internacional estndar de la OMS (ver nota
2 a pie de pgina), de modo que los resultados de la prueba de antigenicidad se pueden expresar en IUs.
La prueba no es vlida a menos que:
i)
Tanto para la vacuna examinada y la preparacin estndar, la PD50 (dosis de proteccin al 50%) se
encuentre entre la mayor y la menor dosis dada a los ratones.
ii)
La titulacin de la suspensin del virus de desafo muestre que 0,03 ml de la suspensin contena al
menos 10 LD50. La dosis de desafo debe estar entre 12-50 LD50 para una prueba vlida.
iii)
El intervalo de confianza ( = 0,95) para la prueba no debe ser menor del 25% ni superior al 400% de
la potencia estimada: el anlisis estadstico debe mostrar una notable pendiente sin desviaciones
importantes de la linealidad o paralelismo de las lneas dosis-respuesta.
373
La vacuna supera la prueba si la potencia estimada es superior a 1 IU por dosis o la potencia demostrada
en la prueba de duracin de la inmunidad para autorizar el producto es la dosis prescrita ms pequea.
Tambin se puede utilizar una prueba simplificada a efectos de anticipar qu vacunas es probable que
tengan un valor antignico > 1 IU por dosis (4). Esta prueba se emplea como prueba de investigacin
aproximada para reducir el nmero de ratones utilizados en las pruebas de control de la potencia de la
vacuna.
d)
Debe establecerse la duracin de la inmunidad inducida por el producto autorizado, en la especie a la que
va dirigida, con un protocolo de vacunacin definido. Despus de esto, no se prueba cada lote (ver
anteriormente Seccin C.4.c.)
e)
Estabilidad
Se debe comprobar por pruebas adecuadas el vencimiento (la caducidad) que se propone. Estos
experimentos incluyen pruebas biolgicas y de estabilidad fsico-qumica, y deben realizarse sobre un
nmero suficiente de lotes de vacuna mantenidos en las condiciones recomendadas.
La termoestabilidad de las vacunas con virus vivos en forma lquida suele ser baja. En las vacunas
liofilizadas con virus inactivados la estabilidad suele garantizarse por 2 aos a 4C.
f)
Conservantes
Las vacunas con virus inactivados pueden tener conservantes (formalina, mertiolato). La naturaleza y
cantidad de dichos conservantes debe cumplir las normas nacionales de control.
5.
a)
Inocuidad
Ver Seccin C.4.b.
b)
Potencia
Ver Seccin C.4.c.
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*
* *
NB: Existen laboratorios de referencia de la OIE para la Rabia (ver Cuadro en Parte 3 de este Manual de
animales terrestres o consultar la pgina Web de la OIE para una lista ms actualizada: www.oie.int).
376
CAPTULO 2.2.6.
PARATUBERCULOSIS
(Enfermedad de Johne)
RESUMEN
La paratuberculosis (enfermedad de Johne) es una enteritis crnica de los ruimiantes causada por
Mycobacterium avium subsp. paratuberculosis (M. paratuberculosis) (34).
Identificacin del agente: El diagnstico de la paratuberculosis se divide en dos partes: el
diagnstico de la enfermedad clnica y la deteccin de la infeccin subclnica. Esto ltimo es
esencial para el control de la enfermedad en las explotaciones ganaderas, tanto a nivel nacional
como internacional.
El diagnstico de la paratuberculosis se realiza sobre bases clnicas que despus se confirman
demostrando la presencia de M. paratuberculosis en las heces por microscopa, por cultivo o
empleando sondas de ADN y la reaccin en cadena de la polimerasa. El diagnstico por necrosis
(1) se lleva a cabo mediante la bsqueda de lesiones patognomnicas de la enfermedad en los
intestinos, o simplemente (2) con la demostracin de los tpicos organismos cido-resistentes en
frotis de impresin de las lesiones o histolgicamente, y mediante el aislamiento de M.
paratuberculosis en cultivo.
La deteccin de la infeccin subclnica se realiza mediante la deteccin serolgica de anticuerpos
especficos, o mediante cultivos de M. paratuberculosis procedentes de heces o tejidos recogidos
en la necropsia, o por la demostracin de respuesta mediada por clulas empleando la tcnica del
interfern gamma. La eleccin de la prueba depende de las circunstancias y el grado de
sensibilidad requerido a nivel individual o a nivel de rebao.
Los cultivos de M. paratuberculosis se pueden obtener a partir de heces o tejidos, despus de
tratamiento descontaminante, mediante inoculacin en medios artificiales con o sin el factor de
crecimiento especfico micobactina- que es esencial para el crecimiento de M. paratuberculosis.
Pruebas serolgicas: El nico problema grave en el control de la paratuberculosis es la dificultad
de detectar la infeccin subclnica en los rumiantes. Las pruebas serolgicas ms habituales para
la paratuberculosis en ganado vacuno son la fijacin del complemento (FC), la tcnica de
enzimoinmunoensayo (ELISA) y la inmunodifusin en gel. La sensibilidad y la especificidad se
determinan a menudo con referencia al cultivo de heces, el cual por si mismo es de sensibilidad
incierta (3) en ganado vacuno infectado subclnicamente. Algunas pruebas, por ejemplo la FC y la
tcnica ELISA de absorcin son muy adecuadas para confirmar el diagnstico de paratuberculosis
en vacas con sntomas clnicos tpicos.
Requisitos para las vacunas y los materiales de diagnstico: En la fabricacin de las vacunas
para la paratuberculosis pueden emplearse bacterias vivas atenuadas o muertas a las que (4) se
les incorpora un adyuvante o bien se liofilizan y se les adiciona el adyuvante, durante la
reconstitucin. El recuento celular es difcil y el contenido bacteriano de las vacunas se puede
basar en el peso, mientras que la potencia de la vacuna puede estimarse mediante un conjunto de
pruebas de desarrollo de capacidad sensibilizante,(5) empleando cobayas.
La seguridad de la vacuna o anormal toxicidad tambin puede ser analizada en cobayas.
Para las pruebas diagnsticas cutneas, se emplean la tuberculina johnina y aviar que son
derivados proteicos purificados (PPD) de cultivos tratados por calor de M. paratuberculosis o M.
avium, respectivamente. El contenido de PPD en la johnina est estandarizado mediante ensayos
qumicos y su actividad biolgica se identifica en cobayas sensibilizadas con M. paratuberculosis.
377
Captulo 2.2.6. Paratuberculosis (enfermedad de Johne)
La actividad de la tuberculina aviar se determina en cobayas sensibilizadas con M. avium por

comparacin con una preparacin de referencia calibrada en unidades internacionales.
A. INTRODUCCIN
Mycobacterium avium subespecie paratuberculosis (M. paratuberculosis) es un organismo que fue observado
por primera vez por Johne & Frothingham en 1895. Mycobacterium paratuberculosis causa paratuberculosis o
enfermedad de Johne, una infeccin granulomatosa intestinal. La paratuberculosis, inicialmente reconocida en
ganado vacuno, despus en ovejas y posteriormente en cabras, se encuentra muy a menudo en rumiantes
domsticos y silvestres y presenta una distribucin global. Se ha descrito la enfermedad en caballos, cerdos,
ciervos y alpacas, y recientemente en conejos, armios, zorros y comadrejas (3, 10). En condiciones naturales,
la enfermedad en vacas se transmite mediante ingestin de M. paratuberculosis a partir del ambiente
contaminado. La enfermedad persiste despus de la introduccin de animales infectados. La infeccin puede
transmitirse verticalmente al feto (16) y el semen puede infectarse con el organismo (31). La fuente primaria de
contagio en terneros (6) es la leche procedente de vacas infectadas o leche contaminada con heces de bvidos
enfermos.
La identificacin de M. paratuberculosis se basa en su requerimiento de micobactina y su patogenicidad en el
hospedador. La dependencia de micobactina se ha utilizado ampliamente como una caracterstica taxonmica
de M. paratuberculosis porque la mayora de las micobacterias son capaces de sintetizar micobactina. Sin
embargo, Mycobacterium paratuberculosis, M. silvaticum y algunos aislados primarios de M. avium carecen de
esta capacidad y requieren micobactina para crecer en el laboratorio. As, el requerimiento de micobactina no es
exclusivo de M. paratuberculosis; esta caracterstica existe en diferentes grados dentro del grupo de M. avium
(33).
Los sntomas clnicos de la paratuberculosis son debilitamiento lento y progresivo y trastornos diarreicos, que
son intermitentes al principio y se hacen progresivamente ms severos hasta su presencia constante en los
bovinos (9). La diarrea es menos comn en rumiantes pequeos.
En las etapas tempranas de la infeccin, las lesiones se encuentran restringidas a las paredes del intestino
delgado y provocan el drenaje de los ndulos linfticos mesentricos. Cuando progresa la enfermedad, las
lesiones aparecen en el leon, yeyuno, intestino delgado terminal, ciego (7) y colon y en los ndulos linfticos
mesentricos. Mycobacterium paratuberculosis est presente en las lesiones y, finalmente, por todo el cuerpo.
Las lesiones intestinales son responsables de la prdida de protenas y del sndrome de malabsorcin proteica,
lo que conduce a un desgaste muscular. Los sntomas clnicos habitualmente aparecen primero en la etapa
adulta temprana pero la enfermedad puede presentarse en animales a cualquier edad por encima de 1-2 aos.
Despus de unas pocas semanas de infeccin, comienza una fase de multiplicacin de M. paratuberculosis en
las paredes del intestino delgado. Dependiendo de la resistencia del individuo, esta infeccin se elimina o el
animal permanece infectado como portador asintomtico. La proporcin de animales en estas categoras es
desconocida. Una ltima fase de multiplicacin de los organismos en una proporcin de portadores, conduce a
la extensin de las lesiones, la interferencia con el metabolismo intestinal y los sntomas clnicos de la
enfermedad. Los portadores subclnicos excretan un nmero variable de M. paratuberculosis en las heces. En la
mayora de los casos se excreta un gran nmero organismos cuando se desarrolla la enfermedad clnica.
La hipersensibilidad de tipo retardado (DTH) se detecta tempranamente durante la infeccin y permanece
presente en una proporcin de los portadores asintomticos, pero cuando la enfermedad progresa, la DTH
decrece y puede estar ausente en los casos clnicos. Los anticuerpos sricos se detectan con posterioridad a la
DTH. Tambin pueden estar presentes en los portadores que se han recuperado de la infeccin. Los
anticuerpos sricos estn presentes de forma ms constante y son de mayor ttulo cuando las lesiones se
extienden, reflejando la cantidad de antgeno presente. En las ovejas, puede haber una respuesta serolgica
detectable en los casos clnicos.
Otras enfermedades e infecciones micobacteriales, incluyendo la tuberculosis de mamferos y aves, causa DTH
y la presencia de anticuerpos sricos. Por tanto, estas enfermedades necesitan ser diferenciadas de la
paratuberculosis y de la infeccin por M. paratuberculosis, tanto clnicamente como mediante el uso de pruebas
diagnsticas especficas. La exposicin a micobacterias saprfitas del ambiente puede tambin sensibilizar al
ganado, provocando reacciones de DTH inespecficas.
Los animales vacunados contra la paratuberculosis desarrollan tanto DTH como anticuerpos sricos. La
vacunacin ayuda a prevenir la enfermedad clnica pero no evita necesariamente la infeccin. Tambin interfiere
con programas de diagnstico y control de la tuberculosis bovina. As, si se necesita diagnosticar la infeccin en
los vacunados, slo se pueden usar pruebas de deteccin de M. paratuberculosis en las heces (14).
378
En animales individuales, especialmente procedentes de una explotacin ganadera en la que previamente no ha

sido diagnosticada la enfermedad, un diagnstico clnico presuntivo puede confirmarse mediante pruebas de
laboratorio. Sin embargo, el diagnostico definitivo puede ser garantizado en base a fundamentos clnicos slo si
los sntomas clnicos son tpicos y la enfermedad es reconocida como presente en el rebao. La confirmacin de
paratuberculosis depende del descubrimiento de lesiones gruesas con la demostracin de los tpicos
organismos cido-resistentes en frotis de impresin o por la aparicin de las lesiones patognomnicas
microscpicas y el aislamiento en cultivo de M. Paratuberculosis
Para diagnosticar la presencia de paratuberculosis en un animal individual clnicamente sospechoso, pueden
utilizarse varias pruebas de laboratorio que incluyen: frotis fecales, cultivos fecales y de tejidos, sondas de ADN
que emplean materiales fecales o tejidos, pruebas serolgicas, de necropsia (9) e histolgicas.
En los rebaos se llevan a cabo pruebas de deteccin de la infeccin subclnica para determinar la prevalencia
de la infeccin, normalmente con la finalidad de establecer medidas de control. Como ninguna prueba es 100%
sensible o especfica, el control de la enfermedad por eliminacin de los reactivo-positivos se realiza con
pruebas repetidas a intervalos de 6 meses o de un ao durante varios aos y la eliminacin de los reactivopositivos a las pruebas serolgicas o vertidos fecales; tambin se considera prudente la separacin de la
descendencia de las hembras reactivas. Incluso estos procedimientos no siempre tienen xito sin cambios en
los hbitos de higiene y en el manejo del ganado para reducir la transmisin de la infeccin en el rebao (2).
1.
a)
Necropsia
La paratuberculosis no puede ser diagnosticada en un examen superficial de los intestinos buscando
sntomas de engrosamiento. Los intestinos deben ser abiertos desde el duodeno al recto para exponer la
mucosa. No existe una relacin estrecha entre la gravedad de los sntomas clnicos y la extensin de las
lesiones intestinales. La mucosa, especialmente del leon terminal, se inspecciona para detectar el
plegamiento y engrosamiento patognomnico. Las lesiones tempranas se ven manteniendo el intestino
hacia la luz, entonces pueden visualizarse las placas discontinuas. Los ndulos linfticos mesentricos
pueden ser prominentes y edematosos. Los frotis de la mucosa afectada y los cortes superficiales de los
ndulos linfticos deben teirse por el mtodo de ZiehlNeelsen y examinarse microscpicamente para
observar los organismos cido-resistentes que tienen la morfologa caracterstica de M. paratuberculosis.
Sin embargo, los organismos cido-resistentes no estn presentes en todos los casos. Es por tanto mejor
confirmar el diagnstico recogiendo mltiples muestras de pared intestinal y de ndulos linfticos
mesentricos en un fijador (solucin salina con formol al 10%) para el subsiguiente examen histolgico.
Deben examinarse las secciones teidas con hematoxilina-eosina y las secciones teidas segn el mtodo
de ZiehlNeelsen. Las lesiones patognomnicas consisten en la infiltracin de la lmina propia, las placas
de Peyer y el cortex de los ndulos linfticos mesentricos con clulas epiteloides grandes, teidas
plidamente y clulas multinucleadas gigantes de Langhans, en las que se encuentran habitualmente, pero
no invariablemente, bacilos cido-resistentes en agregados o de forma aislada. Las clulas gigantes de
Langhans no son inusuales y contienen algunos organismos.
Las lesiones en ovejas y cabras son similares a las observadas en vacas. A menudo, hay slo un ligero
engrosamiento e inflamacin de la mucosa, pero a veces se forman ndulos de caseificacin y calcificacin
en el intestino y los ndulos linfticos asociados. El aumento de tamao de los ndulos linfticos
mesentricos ha sido observado en alpacas. En ocasiones se ha observado la forma pigmentada de la
paratuberculosis en ovejas.
b)
Bacteriologa (microscopa)
Los frotis fecales teidos segn el mtodo de ZiehlNeelsen se examinan al microscopio. Se
puede diagnosticar paratuberculosis si se encuentran agregados (tres o ms organismos) de pequeos
(0,51,5 m) y fuertemente teidos bacilos cido-resistentes. La presencia de bacilos cido-resistentes
aislados en ausencia de agregados no permite un diagnstico definitivo. La desventaja de esta prueba es
que slo un tercio aproximado de los casos puede confirmarse mediante examen microscpico de una
muestra fecal nica.
c)
Bacteriologa (cultivo)
La infeccin por Mycobacterium paratuberculosis afecta principalmente a la parte final del intestino delgado
y ciego adyacente. Las bacterias Mycobacterium paratuberculosis estn en un nmero muy superior al de
otras bacterias en muestras de heces y tejidos intestinales.
379
Las colonias primarias de M. paratuberculosis pueden aparecer en cualquier momento a partir de las 5 a
14 semanas, despus de la inoculacin. Las colonias primarias en el medio de Herrold conteniendo
micobactina1 son muy pequeas (1 mm de dimetro), incoloras, translcidas y hemisfricas. Son redondas
y de contorno liso y sus superficies son suaves y brillantes. Cuando prosigue la incubacin, las colonias se
hacen ms opacas y aumentan de tamao (4 o 5 mm). La morfologa colonial cambia con la edad de suave
a rugosa y de hemisfrica a mamilar (32).
La inusual cepa pigmentada amarilla brillante de ovejas es difcil de crecer en medio artificial. Se ha
descrito que las cepas no pigmentadas de oveja crecen peor que las cepas bovinas, pero no se deberan
descartar cultivos como negativos sin realizar una incubacin prolongada.
Para la identificacin de M. paratuberculosis, se deben realizar resiembras empleando pequeos inculos
de las colonias sospechosas en el mismo medio con o sin micobactina, para demostrar la dependencia a la
micobactina. (Las pruebas no son fiables si est presente un gran nmero de bacilos).
Hay dos mtodos bsicos para cultivar M. paratuberculosis a partir de muestras clnicas: el mtodo que
emplea cido oxlico y NaOH para la descontaminacin y el medio LwensteinJensen para el
crecimiento, y el mtodo que emplea cloruro de hexadecilpiridinio (HPC) para la descontaminacin en
combinacin con el medio de yema de huevo de Herrold (HEYM) para el crecimiento. Ambos medios
contienen micobactina.
Medios
Ejemplos de medios adecuados son:

i)
Medio de yema de huevo de Herrold con micobactina (19)

Para 1 litro de medio: 9 g de peptona; 4,5 g de cloruro sdico; 2,7 g de extracto de buey; 27 ml de
glicerol; 4,1 g de piruvato sdico; 15,3 g de agar; 2 mg de micobactina; 870 ml de agua destilada; seis
yemas de huevo (120 ml); y 5,1 ml de una solucin acuosa de verde de malaquita al 2%. Se miden
los primeros seis ingredientes y se disuelve calentando en el agua destilada. Se ajusta el pH del
medio lquido a 6,97,0 usando NaOH al 4%, y se prueba para asegurar que el pH de la fase slida
es de 7,27,3. Se aade la micobactina y se disuelve en 4 ml de alcohol etlico. Se autoclava a 121C
durante 25 minutos. Se enfra hasta 56C y de forma asptica se aaden seis yemas de huevo
estriles2 y la solucin estril de verde de malaquita. Se mezcla suavemente y se distribuye en tubos
estriles.
Se puede aadir 50 mg de cloranfenicol, 100.000 U de penicilina y 50 mg de anfotericina B.
ii)
Medio modificado de Dubos (28)

Para 1 litro de medio: 2,5 g de casaminocidos de Difco; 0,3 g de asparragina; 2,5 g de fosfato
disdico anhidro; 1 g de fosfato monopotsico; 1,5 g de citrato sdico; 0,6 g de sulfato magnsico
cristalino; 25 ml de glicerol; 50 ml de una solucin al 1% de Tween 80; y 15 g de agar. Disolver cada
sal en agua destilada con un suave calentamiento y llevar hasta 800 ml. Aadir micobactina en una
solucin alcohlica al 0,05% (2 mg disueltos en 4 ml de alcohol etlico), calentar el medio a 100C
hasta ebullicin, y despus esterilizar en autoclave a 115C durante 15 minutos. Enfriar hasta 56C
en un bao de agua, aadir los antibiticos (100.000 U de penicilina; 50 mg de cloranfenicol; y 50 mg
de anfotericina B) y suero (200 ml suero bovino esterilizado por filtracin a travs de un equipo Seitz
EX e inactivado calentando a 56C durante 1 hora). El medio se mezcla minuciosamente y entonces
se distribuye en tubos estriles. Una ventaja de este medio es que es transparente, lo cual facilita la
deteccin temprana de las colonias.
1
2
380
iii)
Medio Middlebrook 7H9, 7H10 y 7H11 (Difco), y medio Bactec 7H12 enriquecido con micobactina en
la misma proporcin que para el medio de Herrold pueden ser tambin usados. La ventaja de este
medio es que es transparente, lo cual facilita la deteccin temprana de las colonias.
iv)
Medio LwensteinJensen con o sin micobactina (13).
La micobactina se puede obtener comercialmente (mycobactin J) a partir de Allied Monitor, P.O. Box 71, 201 Golden
Drive, Fayette, MO 65248, USA, o Symbiotic Society, 299 av. Jean Jaurs, 69007 Lyon, Francia.
Use huevos frescos sin que hayan transcurrido ms de 2 das desde su puesta y que no hayan recibido antibiticos. Con
un cepillo, limpie los huevos con agua y detergente. Enjuage con agua y coloque los huevos en alcohol de 70 durante
30 minutos. Squelos insertndolos entre dos toallas estriles. Con unos frceps de diente de rata estriles, chasque un
extremo de la cscara, haciendo un agujero de aproximadamente 10 mm y elimine la clara con ayuda de los frceps y de
la gravedad. Agrande el agujero y rompa la yema. Mezcle la yema de huevo y elimine el vitelo. Vierta la yema de huevo
mezclada en el medio.
Aunque el cultivo de materia fecal es tcnicamente complicado y lento, sigue siendo un mtodo adecuado
para el diagnstico de paratuberculosis en animales vivos. Es la nica prueba que no produce resultados
falso-positivos (100% de especificidad). Detectar animales infectados 6 meses o ms antes de que
desarrollen los sntomas clnicos, y durante la etapa clnica su sensibilidad se aproxima al 100%.
Procesamiento de las muestras de tejido

No se deben emplear conservantes qumicos. Los tejidos pueden ser congelados a 20C.
Para evitar la contaminacin, se deben eliminar las heces de las porciones del tracto intestinal antes
de su envo al laboratorio.
i)
Digestin de los tejidos

Aproximadamente 4 g de mucosa de la vlvula leocecal o 4 g de ndulo mesentrico se introducen
en una jarra batidora estril conteniendo 50 ml de tripsina (2,5%). La mezcla se ajusta hasta
neutralidad con NaOH al 4% y papel de pH, agitndose durante 30 minutos a temperatura ambiente
con un agitador magntico. La mezcla digerida se filtra a travs de gasa. El filtrado se centrifuga
aproximadamente a 2.0003.000 g durante 30 minutos. El sobrenadante se extrae y se desecha.
ii)
Descontaminacin del inculo.

El precipitado se resuspende en 20 ml de HPC al 0,75% y se mantiene esttico durante 18 horas a
temperatura ambiente. Las partculas que precipitan al fondo del tubo se emplearn como inculo y
sern extradas con una pipeta sin remover el sobrenadante. Se pueden utilizar otros mtodos de
descontaminacin, como por ejemplo el tratamiento con cido oxlico al 5%.
iii)
Inoculacin del medio de cultivo e incubacin

Se transfieren aproximadamente 0,1 ml de inculo a cada tres tubos de agar inclinado con medio de
Herrold conteniendo micobactina y a un tubo sin micobactina. El inculo se distribuye uniformemente
sobre la superficie inclinada de los tubos. Los tubos permanecern en posicin inclinada a 37C
durante aproximadamente 1 semana con los tapones de rosca aflojados.
Los tubos se pondrn en posicin vertical una vez que se haya evaporado la humedad libre de la
superficie. Se aprietan los tapones y los tubos se colocan en cestos y se incuban a 37C.
El huevo del medio de Herrold contribuye con suficientes fosfolpidos a neutralizar la actividad
bactericida del HPC residual en el inculo. Los otros medios (Dubos modificado y Middlebrook) no
tienen esta propiedad. Se pueden utilizar otros tratamientos para la descontaminacin de la muestra,
por ejemplo cido oxlico al 5%.
El HPC es relativamente ineficaz para controlar el crecimiento de hongos contaminantes. Merkal &
Richards (22) encontraron que la anfotericina B (fungizona) resulta efectiva para impedir el desarrollo
fngico en los medios inoculados. La fungizona puede incorporarse en el medio de Herrold a una
concentracin final de 50 g por ml de medio. Debido a la prdida de actividad antifngica, el
almacenamiento del medio de Herrold conteniendo fungizona debe limitarse a 1 mes a 4C.
Los tubos de agar inclinado se incuban durante 1520 semanas y se observan semanalmente a partir
de la sexta semana en adelante.
Procesamiento de las muestras fecales

No se emplean refrigerantes ni conservantes qumicos. Las muestras fecales pueden congelarse a
70C.
i)
Suspensin y descontaminacin de las heces

1 g de heces se transfiere a un tubo de 50 ml conteniendo 20 ml de agua destilada estril. Se agita la
mezcla durante 30 minutos a temperatura ambiente. Las partculas de mayor tamao sedimentarn a
los 30 minutos. Los 5 ml de la parte superior de la suspensin de heces se transfieren a un tubo de
50 ml conteniendo 20 ml de HPC. Se invierte la posicin del tubo varias veces para asegurar una
distribucin homognea y se mantiene esttico durante 18 horas a temperatura ambiente.
ii)
Inoculacin del medio de cultivo

0,1 ml del sedimento que ha permanecido esttico se transfiere a cada uno de cuatro tubos de agar
inclinado conteniendo medio de Herrold, tres con micobactina y uno sin ella. Se puede realizar un
frotis del sedimento tiendo la muestra segn el mtodo de ZiehlNeelsen.
iii)
Incubacin y observacin de los tubos de agar inclinado

Lo mismo que para las muestras de tejido.
381
Se han descrito variaciones de los mtodos anteriores (4, 15, 21, 24, 27, 38, 39). La sensibilidad del cultivo
puede aumentar usando medios lquidos y centrifugacin en lugar de tcnicas de sedimentacin. El
mtodo de la doble incubacin ayuda a la descontaminacin del inculo (30).
Una tcnica ms rpida para el aislamiento de M. paratuberculosis emplea un sistema radiomtrico de
deteccin, the Bactec 460. El crecimiento de las micobacterias se valora mediante la liberacin de 14CO2 a
partir de palmitato como consecuencia del metabolismo bacteriano. Sin embargo, como este sistema est
basado en la radiometra, no es posible su uso en algunos laboratorios y en otros ha sido reemplazado.
Recientemente se han comenzado a emplear tres mtodos rpidos basados en fluorescencia, el sistema
Bactec 960, el sistema MGIT (Mycobacterial Growth Indicator Tube) (tubo indicador del crecimiento de
micobacterias) (Becton Dickinson) y el sistema MBBact (Organon Technica). Durante los experimentos
iniciales surgieron serios problemas cuando se probaron estos mtodos con muestras fecales, debido al
desarrollo de otras bacterias (formas esporuladas y hongos); sin embargo, estos mtodos se han
desarrollado posteriormente y hoy en da se emplean con bastante xito en muchos laboratorios.
d)
Sondas de ADN
Se han desarrollado sondas de ADN que permiten detectar M. paratuberculosis en el diagnstico de
muestras e identificar rpidamente las bacterias aisladas (8, 20). Se han empleado para diferenciar
M. paratuberculosis de otras micobacterias, especialmente aqullas del grupo de M. avium .
McFadden et al. han identificado una secuencia (17, 18), denominada IS900, que es una secuencia
especfica de insercin de M. paratuberculosis. Se ha descrito que un pequeo nmero de aislados
distintos a M. paratuberculosis producen productos amplificados del mismo tamao que el esperado en el
caso de M. paratuberculosis. Se puede aplicar la digestin con enzimas de restriccin a los productos
positivos IS900 para confirmar que su secuencia corresponde a la de M. paratuberculosis (5). Se ha
publicado la utilizacin de la IS900 como sonda de ADN para la identificacin especfica de
M. paratuberculosis en muestras fecales de ganado vacuno mediante la amplificacin enzimtica del ADN
empleando la reaccin en cadena de la polimerasa (PCR) (36). Se ha desarrollado una prueba diagnstica
comercial basada en la deteccin de las secuencias IS900 despus de el aislamiento de las micobacterias
a partir de muestras fecales y el enriquecimiento de la fraccin de ADN correspondiente a las secuencias
IS900 mediante PCR. La prueba est disponible en forma de kit3 adecuado para uso en laboratorios.
Presenta una reducida sensibilidad diagnstica comparada con los cultivos fecales. Actualmente se
dispone de otro kit, PCR Adiavet Paratb3.
2.
Pruebas serolgicas
Las pruebas serolgicas usadas habitualmente para la paratuberculosis en ganado vacuno son la fijacin del
complemento (FC), la tcnica de enzimoinmunoensayo (ELISA) y la inmunodifusin en gel de agar (IGDA) (29)
en lo referente a inmunidad humoral, y la tcnica del interfern gamma cuando se trata de inmunidad celular.
a)
Prueba de fijacin del complemento

La prueba FC ha sido durante muchos aos la prueba estndar empleada en bvidos. La prueba FC es
adecuada cuando se trata de animales clnicamente sospechosos, pero no presenta suficiente
especificidad para fiarse de su uso con propsitos de control en la poblacin general. Sin embargo, a
menudo es solicitada por pases que importan ganado. Se usan internacionalmente una variedad de
procedimientos de la prueba FC. Un ejemplo de un mtodo de microtitulacin mediante FC es como sigue:
382
i)
Se emplea como antgeno un extracto acuoso de la bacteria del que se han eliminado los lpidos
(cepa M. paratuberculosis 316F). Tambin se puede usar Mycobacterium avium D9.
ii)
Todos los sueros se inactivan en un bao de agua a 60C durante 30 minutos y se diluyen 1/4, 1/8 y
1/16. Para cada placa se debe incluir un suero control positivo y un suero control negativo. Tambin
se preparan los siguientes controles: antgeno control, complemento control y control de sistema
hemoltico.
iii)
El complemento liofilizado y reconstituido se diluye hasta contener seis veces H50 (dosis hemoltica
50%) calculndose mediante titulacin frente al antgeno.
iv)
Los eritrocitos de oveja, 2.5%, se sensibilizan con 2 unidades de H100 hemolisina.
v)
Todas las diluciones y reactivos se preparan en tampn veronal calico/magnesio; se distribuyen

volmenes de 25 l de cada reactivo en placas de microtitulacin de 96 pocillos de fondo redondo.
Kit de pruebas IDEXX DNA Probe para la deteccin de Mycobaterium paratuberculosis o el kit PCR Adiavet Paratb.
b)
vi)
La incubacin primaria es a 4C toda la noche y la incubacin secundaria es a 37C durante

30 minutos.
vii)
Lectura e interpretacin de resultados: Se pueden dejar las placas hasta que sedimenten o
centrifugarse e interpretarse como se indica a continuacin: 4 = 100% fijacin, 3 = 75% fijacin, 2
= 50% fijacin, 1 = 25% fijacin y 0 = hemolisis completa. El ttulo del suero problema ser el
recproco de la dilucin mayor de suero que provoca el 50% de fijacin. Una reaccin de 2 en la
dilucin 1/8 se considera positiva. Los resultados deben interpretarse en relacin a los sntomas
clnicos y a otros descubrimientos de laboratorio.
Tcnica de enzimoinmunoensayo
La tcnica ELISA es, hasta el momento, la prueba ms sensible y especfica para ensayos de anticuerpos
sricos contra M. paratuberculosis. Su sensibilidad es comparable con la de la prueba FC en los casos
clnicos, pero es mayor que la de FC en portadores asintomticos. La especificidad de la prueba ELISA se
incrementa mediante la absorcin de sueros a M. phlei.
El ELISA de absorcin ideado por Yokomizo et al. (43, 44) y modificado por Milner et al. (23), fue
desarrollado en forma de kit comercial por Cox et al. (6). Este kit fue evaluado por Ridge et al. (25), y se
encontr que tena una sensibilidad en casos clnicos del 88,3%, y en casos subclnicos del 48,8%, y una
especificidad del 99,8% en vacas, y en ovejas una sensibilidad del 3554% y una especificidad del 98,2
98,5%. Sin embargo, otros investigadores han encontrado una sensibilidad y especificidad menor (40).
El ELISA de absorcin combina la sensibilidad del ELISA con la especificidad aadida de una etapa de
absorcin. Los sueros a analizar se diluyen en un tampn que contiene un antgeno soluble de M. phlei
antes de ser ensayados mediante un ELISA indirecto El procedimiento elimina los anticuerpos que
provocan reacciones cruzadas inespecficas. En versiones anteriores, los sueros se absorban a M. phlei
completo que se eliminaba por centrifugacin antes de la prueba.
Se ha desarrollado un formato de placa de microtitulacin en el que el antgeno M. paratuberculosis
recubre los 96 pocillos de las placas. Las muestras se diluyen en diluyente de muestra conteniendo M.
phlei para eliminar los anticuerpos que provocan reaccin cruzada. Durante la incubacin en los pocillos de
la muestra diluida, el anticuerpo especfico contra M. paratuberculosis forma un complejo con los antgenos
ligados a los pocillos. Despus de lavar para eliminar los materiales no unidos en los pocillos, se adiciona
inmunoglobulina anti-bovina marcada con peroxidasa de rbano (HPRO). Esto reacciona con las
inmunoglobulinas unidas al antgeno de la fase slida. La tasa de conversin del sustrato es proporcional a
la cantidad de inmunoglobulina unida. El color desarrollado, medido (a 450 nm) espectrofotomtricamente
es proporcional a la cantidad de anticuerpo presente en la muestra problema.
El antgeno usado para recubrir las placas ELISA est disponible comercialmente.
Como conjugado se emplea una IgG anti-bovina marcada con HRPO. La solucin sustrato-cromognica es
peroxido de hidrgeno tetrametil benzidina. Se emplea una solucin de H2SO4 0,5 M para parar la reaccin
cuando la absorbancia del suero control positivo alcanza un punto predeterminado.
Se dispone comercialmente de varios kits ELISA de absorcin. En las instrucciones que acompaan al kit
comercial se describe detalladamente el mtodo y materiales necesarios para realizar la prueba, la
interpretacin de los resultados y los clculos. El procedimiento es el mismo que el de cualquier ELISA de
rutina. En las pruebas de chequeo se emplea habitualmente un pocillo para cada suero, pero son poco
fiables, y las pruebas diagnsticas deben ser realizadas en pocillos por duplicado.
c)
Prueba de inmunodifusin en gel de agar

La prueba IGDA es til para confirmar la enfermedad en vacas, ovejas y cabras clnicamente sospechosas.
(26). Estn en uso diversas variaciones de este mtodo.
El antgeno empleado es un extracto protoplsmico crudo de una cepa de laboratorio de M. avium 18
(anteriormente M. paratuberculosis 18) preparado mediante rotura celular en un fraccionador de clulas a
presin hidrulica. Las clulas se rompen y centrifugan a 40.000 g durante 2 horas para eliminar los restos
de paredes celulares, y la fraccin sobrenadante se conserva y liofiliza. Este antgeno se resuspende en
agua a una concentracin de 10 mg/ml.
La agarosa se disuelve en tampn barbital, pH 8,6, conteniendo azida sdica, hasta una concentracin
final de agarosa de 0,75%. La agarosa puede ser vertida en placas Petri o en portas. Se cortan los pocillos
segn un modelo hexagonal. Los pocillos son de 4 mm de dimetro, con una separacin de 4 mm y el agar
debe tener 34 mm de profundidad. El antgeno se aade en el centro de los pocillos. Los sueros
problema, control positivo y negativo se adicionan a pocillos perifricos alternos.
383
Las placas se incuban en una cmara hmeda a temperatura ambiente. Los geles se examinan para
observar las lneas de precipitacin despus de 24 y 48 horas de incubacin. La aparicin de una o ms
lnea(s) de precipitacin definida(s), mostrando identidad con aqulla de un suero positivo control, antes o
a las 48 horas, constituye un resultado de prueba positivo. La ausencia de cualquier lnea de precipitacin
es considerada como un resultado de prueba negativo. Se pueden producir lneas inespecficas.
3.
Pruebas de inmunidad mediada por clulas
a)
Tcnica del interfern gamma

Esta tcnica se basa en la liberacin de interfern gamma a partir de linfocitos sensibilizados durante un
periodo de incubacin de 1836-horas con antgeno especfico (tuberculina del tipo derivado proteico
purificado [PPD] aviar, tuberculina PPD bovina o johnina) (42). La deteccin cuantitativa del interfern
gamma bovino se lleva a cabo mediante un ELISA tipo sandwich que emplea dos anticuerpos
monoclonales para el interfern gamma bovino. La sensibilidad y especificidad puede compararse con la
reaccin cutnea de la tuberculina. Se ha desarrollado una prueba diagnstica comercial basada en la
deteccin de interfern gamma. En las instrucciones que acompaan al kit4 comercial se describe
detalladamente el mtodo y materiales necesarios para realizar la prueba, la interpretacin de los
resultados y los clculos.
b)
Hipersensibilidad de tipo retardado

La prueba de hipersensibilidad de tipo retardado (DTH) es una medida de inmunidad mediada por clulas,
pero tiene un valor limitado. La prueba se realiza mediante la inoculacin intradrmica de 0,1 ml de
tuberculina PPD aviar5 o johnina (la tuberculina aviar y la johnina son de una sensibilidad y especificidad
comparable) en una zona esquilada o afeitada, normalmente en el costado del tercio medio del cuello. El
grosor de la piel se mide con un calibrador antes y 72 horas despus de la inoculacin. Los aumentos del
grosor de piel por encima de 2 mm se considerarn indicativos de la presencia de DTH. Debe destacarse
que las reacciones positivas en los ciervos pueden tener apariencia de placas difusas ms que
inflamaciones localizadas discretas, lo que dificulta la interpretacin de los resultados. La presencia de
cualquier inflamacin en estas especies debe ser considerada como positiva. Sin embargo, la
sensibilizacin hacia el complejo M. avium est muy extendida en animales, y ni la tuberculina aviar ni la
johnina son muy especficas (12). Una prueba en una explotacin ganadera nicamente da idea del
nmero de animales sensibilizados y puede as ser usada slo como una prueba preliminar previa a la
iniciacin de un programa de control.

Vacunas: Las vacunas empleadas contra la paratuberculosis son: vivas, atenuadas, con aceite y piedra pmez
incorporados; liofilizadas, vivas, atenuadas que pueden emplear como adyuvante, por ejemplo, aceite
adicionado en la reconstitucin; y bacterinas muertas por tratamiento trmico. Las vacunas se pueden preparar
a partir de una cepa de M. paratuberculosis 316F o 2E (Weybridge) o M. paratuberculosis 3 y 5 o II (cepas
Canadienses), o las tres juntas. La informacin que se indica ms adelante tiene aplicacin para el caso de una
vacuna viva atenuada adyuvada con aceite y piedra pmez (7, 35, 41). La vacunacin puede causar una
reaccin en la zona de inyeccin. La vacunacin tambin puede interferir con los programas de erradicacin
basados en la eliminacin de los animales infectados y puede interferir con la interpretacin de las pruebas
cutneas de DTH de la tuberculosis bovina.
Productos diagnsticos: La PPD johnina es una preparacin de los productos tratados por calor del crecimiento
y lisis de M. paratuberculosis. La tuberculina PPD aviar es una preparacin de productos tratados por calor del
crecimiento y lisis de M. avium D4ER o TB 56. Los detalles de la tuberculina PPD aviar estn en el Captulo
2.7.8. Tuberculosis aviar. Estas dos preparaciones se emplean, mediante inyeccin intradrmica, para revelar
DTH como una medida de identificacin de animales infectados o sensibilizados con M. paratuberculosis.
Las directrices a seguir para la produccin de vacunas de inters veterinario se indican en el Captulo I.1.7.
Principios de produccin de vacunas veterinarias. Las directrices dadas aqu y en el Captulo I.1.7 pretenden ser
en esencia generales y pueden ser complementadas ante requerimientos regionales y nacionales.
4
5
384
Kit de pruebas Mycobacterium paratuberculosis gamma-interferon, CSL Limited (Veterinary), 45 Poplar Road, Parkville,
Victoria 3052, Australia.
La tuberculina aviar puede obtenerse de VLA Weybridge, New Haw, Addlestone, Surrey KT15 3NB, Reino Unido, o a
partir de Symbiotic Society, 299 av. Jean Jaurs, 69007 Lyon, Francia.
1.
Control del inculo
a)

Vacuna: Las cepas del inculo deben ser de un tipo prevalente, que puede ser comprobado mediante
biotipado o anlisis gentico. Debe haberse demostrado que son inocuas al administrarse siguiendo la ruta
de vacunacin recomendada para las especies diana a las que va dirigida.
Johnina: Las cepas de M. paratuberculosis empleadas para preparar los cultivos del inculo deben
identificarse mediante biotipado o anlisis gentico. Debe demostrarse que estn libres de organismos
contaminantes.
b)
Mtodo de cultivo
Vacuna: Los cultivos del inculo se pueden hacer empleando cortes de patata parcialmente inmersos en
un medio adecuado, como por ejemplo el medio sinttico de Reid6 (37). Los cultivos deben almacenarse
liofilizados. Los cultivos activos se incuban normalmente a 37C.
Johnina: Debe demostrarse que el sustrato del cultivo es capaz de proporcionar un producto libre de
sustancias reconocidas que puedan causar reacciones txicas o alrgicas. Un medio adecuado para
cultivar el inculo es el medio de Reid, solidificado con agar al 1,75%, en tubos de tapn de rosca. Los
cultivos tambin pueden almacenarse liofilizados.
c)

Vacuna: Las pruebas de pureza deben realizarse en los cultivos del inculo y la masa microbiana final
mediante frotis teidos.
La vacuna debera ser utilizada como una parte del programa de control y no proporcionar por ella misma
una proteccin completa evitando la enfermedad causada por M. paratuberculosis (41). Normalmente hay
un buen control de la enfermedad clnica pero la infeccin subclnica persiste en los ganados vacunados
aunque a un nivel reducido. La vacuna debe ser administrada a los animales slo en etapas tempranas de
la vida, p. ej. terneros en su primer mes de vida. Debe inocularse subcutneamente y causa una pequea
inflamacin. Gradualmente se sustituye por un ndulo fibro-caseificado, indoloro y fro, que vara en su
tamao y podr persistir a lo largo de los aos. Se ha empleado la vacunacin para controlar la
enfermedad en ovejas y cabras, incluyendo animales de mayor edad. Con el objeto de conseguir los
mejores resultados de la vacunacin, son tambin oportunas las prcticas de manipulacin para el control
de la enfermedad.
El uso de vacunas puede interferir con el resultado de las pruebas diagnsticas cutneas para la
tuberculosis. Esto debera tenerse en cuenta cuando se planifica un programa de control (11).
Johnina: Deben examinarse los cultivos mediante frotis teidos para detectar la presencia de organismos
contaminantes.
Para probar la falta de efecto sensibilizador, a tres cobayas que no hayan sido tratados previamente con
ningn material que pueda interferir en la prueba, se les aplican inyecciones intradrmicas en tres
ocasiones a intervalos de 5 das, con 0,01 mg de la preparacin que se est probando en un volumen de
0,1 ml. Cada cobaya, junto con cada uno de los tres cobayas control que no ha sido inyectado
previamente, es inyectado intradrmicamente 1521 das despus de la tercera inyeccin con la misma
dosis de la misma johnina. Las reacciones de los dos grupos de cobayas deben ser significativamente
distintas al medirlas 2448 horas ms tarde.
L-Asparragina, 5,0 g
Fosfato monopotsico (KH2PO4, anhidro), 2,0 g
Sulfato magnsico (MgSO4-7H2O), 1,0 g
Citrato amnico ([NH4]3 C6H5O7), 2,0 g
Cloruro sdico, 2,0 g
Citrato de hierro y amonio, 0,075 g
Dextrosa monohidrato B.P., 10 g
Glicerol B.P. (48 ml), 60 g
Agua destilada hasta 1.000 ml
pH (no ajustado) 5,65,8
Cuando sea necesario, este medio se solidifica adicionando agar granulado al 1,5% (Difco). Se esteriliza a 121C
durante 15 minutos.
385
2.
Mtodo de produccin
Vacuna: Para los lotes de vacunas, los organismos pueden crecerse en un medio sinttico lquido como el
medio sinttico de Reid. Los organismos crecen formando una pelcula en la superficie del lquido. Para
asegurar una correcta rea de superficie, conviene usar recipientes tales como frascos cnicos conteniendo un
tercio de su volumen nominal de medio lquido. Estos frascos pueden inocularse directamente a partir de
cultivos en cortes de patata, pero con algunas cepas, pueden necesitarse uno o ms pases en medio lquido
para asegurar el adecuado crecimiento formando pelcula hasta el pase final del lote de vacuna. Tales
resiembras se deberan realizar, habitualmente, a lo largo de dos semanas puesto que periodos ms largos
pueden derivar en un envejecimiento y hundimiento de la pelcula. La incubacin se realiza a 37C.
Para preparar la vacuna, la pelcula procedente de cultivos crecidos 2 semanas de cada cepa a probar debe
separarse del medio lquido por decantacin, filtracin y presin entre bloques de papel de filtro. El cultivo
hmedo de M. paratuberculosis se mezcla con un adyuvante, como parafina lquida, aceite de oliva y piedra
pmez (7).
Johnina: La johnina para las pruebas diagnsticas cutneas es un PPD preparado a partir de una o ms cepas
de M. paratuberculosis (disponible a partir de VLA Weybridge o CDI, Lelystad, Pases Bajos). Puede prepararse
segn el mtodo siguiente.
Las cepas de Mycobacterium paratuberculosis se crecen en medio lquido de Reid hasta formar una pelcula.
Los cultivos de produccin se inoculan habitualmente a partir de cultivos lquidos del inculo en lugar de inculo
directamente recogido de medio slido (medio sinttico de Reid). Los cultivos de produccin se incuban a 37C
durante 10 semanas.
Al final del periodo de incubacin, el medio de cultivo tiene un pH aproximado de 5 y slo se podr obtener poca
o no se obtendr ninguna johnina a menos que aumente el pH, usando hidrxido sdico, hasta
aproximadamente 7,3 antes de calentar al vapor. Despus de una mezcla minuciosa, los cultivos se mantienen
en ebullicin durante 3 horas. La mayor parte de los organismos muertos se elimina mediante una tamizacin y
el filtrado se clarifica con una posterior filtracin. La protena del filtrado se precipita qumicamente con cido
tricloroactico al 40%, se lava y se resuspende (disolvente alcalino). El producto se esteriliza por filtracin.
Puede adicionarse un conservante antimicrobiano que no provoque reacciones falso-positivas, como el fenol (no
ms del 0,5% [w/v]). Como estabilizador se puede aadir glicerol (no ms del 10% [w/v]). El producto se
distribuye aspticamente en contenedores estriles de vidrio, que posteriormente se sellan.
3.
Control interno
Vacuna: Debe comprobarse tanto el crecimiento adecuado de los cultivos como la pureza de los mismos. La
presencia de organismos contaminantes se puede detectar mediante pruebas de esterilidad de las colecciones.
Las pruebas de micobacterias patgenas se realizan mediante la inyeccin de cultivo hmedo, previamente
mezclado con adyuvante y diluido diez veces en solucin salina, en dos cobayas, recibiendo cada uno 1 ml. Se
observan durante 8 semanas, se sacrifican de forma indolora, y se examinan para encontrar lesiones
anormales.
Johnina: Despus de la filtracin final se comprueba la esterilidad de cada filtrado de la solucin de PPD.
Se determina el contenido de protenas de los filtrados estriles mediante el mtodo de Kjeldahl (1). El
contenido de protenas se ajusta para que el producto final contenga entre 0,475 y 0,525 mg/ml de protena. El
pH se ajusta hasta el rango 6,57,5.
4.
Control de lotes
a)
Esterilidad
En el Captulo I.1.5. se pueden encontrar pruebas de control de esterilidad y de ausencia de
contaminacin. El organismo de la vacuna normalmente no crecer a un nivel apreciable en las pruebas
convencionales de esterilidad.
b)
Inocuidad
Vacuna: Estas pruebas se realizan normalmente con animales de laboratorio, aunque tambin resultan
satisfactorias las pruebas de multidosis en los animales diana a los que va dirigida la vacuna. Una tpica
prueba con un animal de laboratorio sera como se indica a continuacin. Dos cobayas se inoculan,
subcutneamente, con un lote aceptable de vacuna a una fraccin de la dosis previamente determinada
que empleada en vacas produce un ndulo pero no una necrosis manifiesta en la zona de la inyeccin. Los
386
animales se observan durante 8 semanas, se sacrifican de forma indolora y se examinan para encontrar
lesiones anormales.
Johnina: Dos cobayas se inyectarn subcutneamente con 0,5 ml de la johnina a probar. No se deben
apreciar lesiones locales significativas o sistmicas durante 7 das (1).
Las pruebas de johnina para micobacterias vivas pueden llevarse a cabo empleando el material
inmediatamente antes de ser introducido en los contenedores finales o con muestras procedentes de los
propios contenedores finales. Se debe tomar una muestra de al menos 10 ml, e inyectarla va
intraperitoneal o subcutnea en al menos dos cobayas, dividiendo a partes iguales el volumen a probar
entre las cobayas. Es aconsejable tomar una muestra mayor, por ejemplo 50 ml, y concentrar cualquier
micobacteria residual mediante centrifugacin o filtracin de membrana. Las cobayas se observarn
durante al menos 42 das y tambin se realizarn exmenes post-mortem. Cualquier lesin macroscpica
se examinar tanto al microscopio como mediante cultivo.
c)
Potencia
Vacuna: Como las pruebas de proteccin parecen ser impracticables, se puede emplear una prueba de la
capacidad sensibilizadora. Esto podra entonces relacionarse con el contenido bacteriano basado en el
peso. Una prueba tpica podra ser como sigue: los cobayas se sensibilizan mediante una inyeccin
intramuscular de 0,5 ml de la vacuna a probar diluida 100 veces en parafina lquida. Las pruebas cutneas
se realizan seis semanas despus de la sensibilizacin usando inoculaciones intradrmicas de 0,2 ml de al
menos tres diluciones seriadas de un antgeno de M. paratuberculosis, tal como la PPD johnina, Las
diluciones se elegirn para que produzcan reacciones cutneas esperadas de 8 mm a 25 mm de dimetro.
Cada cobaya recibe varias diluciones por cada costado, eligindose un diseo en cuadrado latino para su
distribucin. Despus de 2448 horas, se miden las reacciones cutneas. Todava no se ha establecido
totalmente una preparacin de referencia para las pruebas de este tipo. La tuberculina PPD aviar, calibrada
en unidades internacionales, puede usarse como antgeno de la prueba cutnea en las pruebas de este
tipo para asegurar que la vacuna es capaz de producir una sensibilizacin adecuada (correspondiendo a la
vacunacin).
Johnina: La potencia de la johnina se determina actualmente mediante ensayo qumico del contenido de
protenas empleando el mtodo de Kjeldahl. Se recomienda un contenido de PPD de 0,5 0,025 mg/ml en
el producto final (1).
La identidad del material debera confirmarse mediante inyeccin intradrmica de cobayas sensibilizadas
mediante inyecciones de M. paratuberculosis (100 mg de micobacteria en polvo 25 ml de vaselina
100 mg de piedra pmez) muertos 6 semanas antes.
Es posible realizar una prueba de potencia empleando diluciones de johnina en cobayas sensibilizados con
M. paratuberculosis, de forma similar a las pruebas de potencia de la tuberculina bovina y aviar, pero
todava no ha sido totalmente establecida una preparacin estndar para este tipo de prueba.
d)
Vacuna: Despus de la vacunacin a la edad de 1430 das el efecto de la vacunacin se expresa como la
reduccin en la tasa de excretores entre los animales vacunados en comparacin con los bovinos no
vacunados (14).
Normalmente hay un buen control de la enfermedad clnica pero persiste un nivel reducido de la infeccin
subclnica. Los resultados favorables probablemente reflejan una menor exposicin a la infeccin como
consecuencia de la reduccin del nmero de fuertes excretores en el rebao.
e)
Estabilidad
Vacuna: La vacuna debe almacenarse a 28C durante 912 meses sin prdida de potencia. No se debe
congelar.
Johnina: La johnina debe estar protegida de la luz y almacenarse a 28C. Bajo estas condiciones retendr
su potencia durante al menos cinco aos.
f)
Conservantes
Normalmente se incluye un conservante de vacunas en los contenedores multidosis. Para el caso de la
johnina el fenol empleado no sobrepasa el 0,5% (w/v). Se debe comprobar la concentracin del
conservante en el producto final y su persistencia a lo largo del periodo de validez.
387
g)
Vacuna La vacuna causa algunos efectos colaterales, formacin de ndulos y sensibilizacin de los
animales a la prueba de la tuberculina (11). En humanos, la inyeccin accidental de la vacuna provoca
reacciones inflamatorias crnicas que requieren tratamiento quirrgico (14).
5.
a)
Inocuidad
Ver Seccin C.4.b.
b)
Potencia
Ver Seccin C.4.c.
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*
* *
NB: Existen laboratorios de referencia de la OIE para la Paratuberculosis (ver Cuadro en Parte 3 de este
Manual de animales terrestres o consultar la pgina Web de la OIE para una lista ms actualizada:
www.oie.int).
390
CAPTULO 2.2.7.
COWDRIOSIS (HIDROCARDITIS)
RESUMEN
La cowdriosis (tambin conocida como heartwater) es una enfermedad producida por rickettsias en
los rumiantes, causada por Ehrlichia ruminantium (anteriormente Cowdria ruminantium) y
transmitida por garrapatas Amblyomma. Tiene lugar en casi todos los pases de Africa y en
Madagascar, y tambin en el Caribe, amenazando al continente americano.
Desde el punto de vista clnico, la enfermedad se caracteriza por fiebre alta repentina, frecuente
hidropericardio, edema pulmonar y, en las formas agudas e hiperagudas, por trastornos nerviosos
y alta mortalidad. Tambin se produce la cowdriosis subaguda, con una tasa alta de
recuperaciones.
Los animales salvajes pueden jugar un papel importante ya que son el reservorio de la
enfermedad. El ciervo tipo Rusa parece ser el nico rumiante en el cual la cowdriosis tiene impacto
econmico.
Identificacin del agente: El diagnstico especfico de la cowdriosis se basa en la observacin de
colonias de E. ruminantium en clulas endoteliales de los capilares del cerebro. En ausencia de
herramientas adecuadas, se puede retirar un trozo del cerebelo con una cucharilla a travs del
foramen magnum despus de cortar la cabeza. Se puede obtener una muestra de la corteza
cerebral a travs de un agujero hecho en el crneo con un martillo y un clavo largo. Se preparan
frotis del cerebro aplastando un trozo pequeo de la corteza del cerebro o del cerebelo entre dos
portas de microscopio. Los capilares se extienden en monocapa pasando un porta a lo largo del
otro. Los frotis se secan al aire, se fijan con metanol y se tien con Giemsa. Con colorantes
rpidos, los frotis pueden fijarse y teirse en un minuto. El color de las colonias (agrupaciones)
vara de morado rojizo a azul, y a menudo estn prximas al ncleo de las clulas endoteliales
infectadas. Pueden ser escasas y difciles de encontrar, especialmente en casos hiperagudos, pero
estn siempre presentes en el cerebro de los rumiantes que mueren de cowdriosis, si no se han
tratado con frmacos. Las colonias pueden verse dos das despus de la muerte en un cerebro
mantenido a temperatura ambiente y hasta 34 das despus en un cerebro almacenado en un
refrigerador.
La sangre fresca recogida de animales sospechosos puede inocurlarse intravenosamente en
cabras u ovejas susceptibles. El desarrollo de sntomas clnicos y la presencia de Ehrlichia en el
cerebro de los animales inoculados son claves para el diagnstico de la cowdriosis.
Ehrlichia ruminantium puede aislarse de la sangre de un hospedador infectado utilizando cultivos
con clulas endoteliales de rumiantes. Cuando se produce un efecto citoptico que consiste en la
formacin de placas de lisis celular, se confirma la presencia de mrulas caractersticas por tincin
de la monocapa celular con azul de metileno y eosina o mediante tcnicas de immunoflorescencia
o immunoperoxidasa usando un antisuero especfico.
Se dispone de sondas de ADN y especialmente de tcnicas ms sensibles basadas en la reaccin
en cadena de la polimerasa para revelar la presencia de E. ruminantium en la sangre de animales
infectados activamente y en menor grado en la sangre o mdula sea de animales portadores y en
las garrapatas que actan como vector. La tcnica de PCR tiene un amplio uso en la investigacin
del genoma de Ehrlichia y en estudios epidemiolgicos, adems de su uso diagnstico.
Pruebas serolgicas: Las pruebas serolgicas incluyen pruebas de inmunofluorescencia
indirecta, enzimoinmunoensayos (ELISA) e inmunotransferencia (Western blotting. Sin embargo,
391
Captulo 2.2.7. Cowdriosis
cuando se usan clulas completas de Ehrlichia como antgeno, se producen reacciones cruzadas
con otras especies de Ehrlichia en todas las pruebas.
Dos enzimoinmunoensayos desarrollados recientemente, que utilizan como antgenos la principal
protena antignica 1 recombinante (MAP1)- el ensayo ELISA MAP1B y el ensayo ELISA
competitivo MAP1- presentan una notable mejora en especificidad en comparacin con las
pruebas previas, lo que hace ms fiable la interpretacin de los resultados serolgicos en regiones
donde se producen infecciones por Ehrlichia en rumiantes. Estas pruebas pueden ser tiles para
controlar las infecciones experimentales, examinar el estado inmunolgico de animales
inmunizados, y analizar el estado de los animales antes de la importacin.
Requisitos para las vacunas y los materiales de diagnstico: an se lleva a cabo en algunos
pases la inmunizacin contra la cowdriosis por el mtodo de "infeccin y tratamiento" usando
garrapatas de Amblyomma pre-alimentadas con sangre infectada u homogeneizada. Una vacuna
de primera generacin que consiste en cuerpos elementales de E. ruminantium purificados e
inactivados, emulsionados en adyuvante Montanide ISA 50 ha dado resultados prometedores en
condiciones experimentales controladas, y se est evaluando en reas endmicas. En un futuro
prximo, podra reemplazar al mtodo de infeccin y tratamiento, que presenta dificultades
prcticas.
A. INTRODUCCIN
La cowdriosis (heartwater) es una enfermedad de rumiantes salvajes y domsticos producida por rickettsias,
causada por Ehrlichia ruminantium (anteriormente Cowdria ruminantium) y transmitida por garrapatas
Amblyomma (2, 6, 23). Tambin se la conoce con los sinnimos malkopsiekte (Africa), pericarditis exudativa
infecciosa (Francia), hidrocarditis infecciosa (Portugal), hidropericarditis de los rumiantes (Italia), y una gran
variedad de nombres en diferentes lenguas africanas (5). Ehrlichia ruminantium se clasifica en el orden
Rickettsiales, tribu Ehrlichieae, junto con el gnero Anaplasma.
La cowdriosis se da en casi todos los pases subsaharianos de frica donde las garrapatas Amblyomma estn
presentes y en las islas circundantes: Madagascar, Reunin, Mauricio, Zanzbar, las Islas Comoro y Santo Tom.
La enfermedad ha sido tambin descrita en el Caribe (Guadalupe, Maria Galante y Antigua) (21), desde donde
amenaza al continente americano. Todos los rumiantes domsticos y salvajes pueden resultar infectados, pero
los primeros parecen ser ms susceptibles. Los rumiantes domsticos indgenas son generalmente ms
resistentes a la enfermedad. Los animales salvajes podran jugar un papel importante como reservorio, pero el
ciervo Rusa parece ser el nico rumiante salvaje en el cual la cowdriosis tiene un impacto econmico.
El periodo de incubacin natural medio es de 2 semanas, pero puede variar de 10 das a 1 mes. En la mayora
de los casos, la cowdriosis es una enfermedad febril aguda, con un rpido aumento en la temperatura corporal,
que puede pasar de los 41C entre 1 y 2 das despus del comienzo de la fiebre. Se mantiene alta con pequeas
fluctuaciones y baja inmediatamente antes de la muerte.
La fiebre va seguida de inapetencia, algunas veces apata, diarrea, particularmente en el ganado vacuno (3), y
disnea, indicativa de edema pulmonar. Los trastornos nerviosos se desarrollan gradualmente. El animal est
inquieto, camina en crculos, hace movimientos de succin y est de pie muy rgido con temblores en los
msculos superficiales. El ganado vacuno puede empujar su cabeza contra una pared o presentar
comportamiento agresivo o ansioso. Finalmente, el animal cae al suelo, moviendo sus patas como en pedaleo y
mostrando opisttonos, nistagmos y movimientos de masticacin. El animal muere generalmente durante un
ataque nervioso o inmediatamente despus.
La manifestacin subaguda de cowdriosis con sntomas menos pronunciados y la hiperaguda con muerte
repentina, se pueden dar tambin dependiendo de la raza del rumiante y de la cepa de Ehrlichia.
Las lesiones macroscpicas ms comunes son hidropericardio, hidrotorax, edema pulmonar, congestin
intestinal, edema de los ndulos linfticos mediastnicos y bronquiales (3), petequia del epicardio y endocardio,
congestin del cerebro y esplenomegalia moderada.
Un diagnstico provisional de cowdriosis se basa en la presencia de vectores de Amblyomma, de trastornos
nerviosos clnicos, y de transudados en el pericardio y en el trax en el examen post-mortem. Debera hacerse
un diagnstico clnico diferencial con la babesiosis cerebral bovina y la teileriosis, la anaplasmosis, botulismo e
infeccin por nemtodos (haemonchiosis) de los pequeos rumiantes.
392
1.
Se pueden observar colonias tpicas de E. ruminantium en frotis del cerebro despus de la muerte.
No es necesario llevar a cabo la tediosa labor de abrir el crneo. Un mtodo alternativo (26) consiste en cortar la
cabeza por la primera vrtebra cervical. Despus se introduce una cucharilla a travs del foramen magnum, entre
la mdula y las meninges. Se vuelve la cucharilla hacia el cerebro y se retira con un trozo de cerebelo. Otro
mtodo sencillo consiste en hacer un agujero en el crneo con un martillo y un clavo largo y aspirar una muestra
de corteza cerebral con una aguja unida a una jeringa. Estos mtodos tambin disminuyen el riesgo para el
operador en los casos en los que los trastornos nerviosos han sido producidos por rabia.
En los animales vivos, se puede obtener una biopsia del cerebro asptica e inofensivamente despus de
anestesia local, aunque con dificultad y ciertas restricciones en animales grandes y especialmente en aquellos
con cuernos. Las colonias de Ehrlichia se observan durante el periodo febril. Este mtodo es til para estudios
experimentales, pero no es adecuado para diagnsticos rutinarios.
Las colonias de Ehrlichia an estn presentes 48 horas despus de la muerte en un cerebro mantenido a
temperatura ambiente y hasta 34 das en un cerebro almacenado en un refrigerador (4).
Se coloca un fragmento pequeo de materia gris (de tamao aproximado a una cabeza de cerilla) en un porta de
microscopio, aplastado por otro porta y, mientras se mantiene la presin, los portas se deslizan a lo largo uno
sobre otro para producir una monocapa celular. Los portas se secan al aire, se fijan en metanol, se tien con
Giemsa diluida con tampn Srensen (2,54 g KH2PO4; 8,55 g Na2 HPO4.H2O; cantidad suficiente para 5 litros
con agua destilada), pH 7,2, y lavado con agua del grifo. Tinciones rpidas Giemsa (DiffQuick, RAL555, tincin
de Field, tincin rpida de CAM) proporcionan resultados ms rpidos, pero el contraste de color es
generalmente ms pobre. Algunas tinciones "rpidas" proporcionan un contraste excelente, por ejemplo la tincin
Hema 3.
Los portas se examinan al microscopio con un aumento bajo (objetivo x10) para localizar los capilares
cerebrales. Para identificar las colonias de rickettsias resulta til una lente para aceite de inmersin con un
aumento de al menos x50. Se necesita experiencia para identificar colonias de Ehrlichia y para diferenciarlas de
otros parsitos de la sangre (Babesia bovis), de ciertas clulas sanguneas (trombocitos, granulocitos), de
estructuras subcelulares normales (mitocondrias, grnulos de mastocitos), o artefactos de la tincin (precipitados
del colorante), etc. Se puede mejorar la especificidad de la lectura tiendo secciones del cerebro fijadas con
formalina utilizando tcnicas de inmunoperoxidasa.
Las colonias de Ehrlichia estn formadas por agrupaciones de grnulos (0,2-0,5 m), organizados a veces
formando un anillo o una herradura (1-3 m), situados cerca del ncleo dentro de la clula endotelial. Los
grnulos pueden ser escasos, particulamente en casos hiperagudos, pero se encuentran siempre en el cerebro
de los animales que han muerto de cowdriosis. Sin embargo, si el animal fue tratado con frmacos 24 horas
antes, los grnulos de Ehrlichia tienden fundirse, lo que hace que el diagnstico sea muy difcil, y a veces
imposible.
La sangre fresca completa recogida de animales sospechosos puede inocularse intravenosamente a una oveja o
cabra susceptible. El desarrollo de sntomas clnicos y la evidencia de Ehrlichia en el cerebro del rumiante
inoculado constituyen un diagnstico de la cowdriosis.
Se ha utilizado microscopa electrnica de transmisin para demostrar que los organismos de Ehrlichia se
desarrollan dentro de una estructura vacuolar, rodeada de una membrana en el citoplasma de la clula endotelial
(25). Cada organismo est rodeado por en una membrana doble. Dentro de la estructura vacuolar, se identifican
formas de Ehrlichia densas a los electrones (cuerpos elementales), as como formas reticuladas intermedias.
a)
Aislamiento de Ehrlichia ruminantium usando cultivos in-vitro

El aislamiento de E. ruminantium en cultivos celulares no es la prueba elegida para confirmar el diagnstico
de cowdriosis, ya que el procedimiento de laboratorio es largo, aunque muchas lneas celulares permiten su
crecimiento. Sin embargo, el aislamiento de Ehrlichia es necesario para tipificar las cepas presentes en una
regin a efectos de los programas de vacunacin. Se puede aislar Ehrlichia de la sangre de los animales
infectados por cultivo sobre clulas endoteliales de rumiantes. Las clulas endoteliales del cordn umbilical,
la aorta o la arteria pulmonar de diferentes especies de rumiantes (ganado vacuno, cabras, ovejas) se
utilizan a menudo para el aislamiento, aunque se han descrito otros tipos de clulas endoteliales (capilares
del cerebro, clulas endoteliales circulantes, etc.) para el cultivo rutinario de microorganismos. Lneas
393
celulares endoteliales de marta, antlope orix, bfalo, kudo, y el cerdo salvaje se pueden utilizar tambin
para cultivar E. ruminantium. No se han designado an lneas celulares estndar para aislamiento.
Procedimiento de aislamiento
i)
La sangre del animal infectado se recoge en anticoagulante (heparina o citrato sdico) y se diluye a
1/2 en el medio de cultivo que consiste en el medio mnimo esencial de Glasgow (MEM) suplementado
con 10% de suero bovino fetal inactivado, 2,95 mg/ml de caldo de triptosa y fosfato, 200 mM de Lglutamina, y antibiticos si es preciso (penicilina 100 unidades internacionales/ml, estreptomicina 100
g/ml).
ii)
El medio de cultivo se elimina de la monocapa celular endotelial y se aade sangre infectada

(aproximadamente 2 ml para una botella de 25 cm2 ). La botella se incuba a 37C en una agitador
rotatorio durante 2 horas.
iii)
Despus de la incubacin, se elimina la sangre y la monocapa se lava cuidadosamente tres veces con
medio de cultivo precalentado. Se aade medio de cultivo fresco y la botella se incuba a 37C. El
medio se cambia dos veces por semana.
(El uso de plasma en lugar de sangre es ms eficaz cuando se toma de un animal con una reaccin
febril >41C. En este caso, los pasos (ii) y (iii) mencionados anteriormente pueden reemplazarse por lo
siguiente:
iv)
b)
Se siembran 4 ml de plasma sobre un cultivo celular endotelial susceptible y se incuban durante

1 hora a 37C en un agitador rotatorio.
Se retira el plasma lavndolo con medio de cultivo y se aaden 5 ml de medio de crecimiento

(por botella de 25 cm2 ) y se observa el desarrollo del efecto citoptico.
La monocapa se inspecciona regularmente para observar la aparicin de pequeas placas de lisis

celular. Las primeras placas aparecen generalmente despus de dos semanas. El pase a monocapas
celulares sin infectar se lleva a cabo cuando la lisis alcanza el 80% de la capa celular. Las clulas
restantes se tien con azul de metileno y eosina y se examinan microscpicamente para detectar la
presencia de mrulas de E. ruminantium. Alternativamente, se pueden teir las clulas mediante una
prueba de inmunofluorescencia indirecta (IFI) o mediante una prueba con inmunoperoxidasa,
utilizando un antisuero especfico de Ehrlichia.
Aislamiento de Ehrlichia ruminantium utilizando cultivos in-vivo.

Es posible evaluar la presencia de cowdriosis en una manada, regin o pas, o aislar una cepa de Ehrlichia
inoculando sangre o un homogenado de garrapata en un animal susceptible. La sangre de animales
individuales, o sangre del colectivo, se inyecta lentamente a una dosis de 10-100 ml por va intravenosa a
un oveja o cabra susceptible. Otro mtodo consiste en recoger y homogeneizar garrapatas Amblyomma
adultas, y despus de centrifugar el homogenado, inocular el sobrenadante resultante. El ltimo mtodo es
muy sensible porque la concentracin de Ehrlichia es ms alta en las garrapatas que en la sangre. Sin
embargo, la tasa de infeccin de garrapatas es variable y a veces tan baja como el 1% (5). En este caso,
para detectar una infeccin, se necesitan al menos 100 garrapatas y se deben utilizan tantas como sea
posible. En ambos casos, el inculo se puede almacenar con 10% de dimetil sulfxido en nitrgeno lquido
durante varios aos. Hay que tener en cuenta que la inoculacin de homogenados de garrapatas en
animales susceptibles puede causar anafilaxia, lo que se puede evitar mediante la administracin
simultnea de adrenalina. El desarrollo de sntomas clnicos y la deteccin de bacterias circulantes
mediante mtodos moleculares y/o la existencia de Ehrlichia en el cerebro del rumiante inoculado son
diagnsticos de cowdriosis.
2.
Mtodos moleculares
a)
Deteccin de Ehrlichia ruminantium utilizando sondas de ADN

Se ha clonado un fragmento especfico de ADN genmico para E. ruminantium y se ha utilizado como
sonda de cido nucleico (29). Reconoce todas las cepas de E. ruminantium probadas hasta ahora. Esta
sonda, llamada pCS20, detecta fcilmente la infeccin en animales clnicamente enfermos y garrapatas
Amblyomma infectadas experimentalmente. Sin embargo, no es suficientemente sensible para detectar a la
mayora de los animales portadores y/o infecciones de bajo nivel en garrapatas. Sin embargo, se ha
demostrado que la sonda pCS20 es ms sensible que las sondas 16S y MAP1 (protena 1 antignica ms
importante) para la deteccin de E. ruminantium en garrapatas cuando hibridan sobre el producto del
fragmento de ADN homlogo amplificado por una reaccin en cadena de la polimerasa (PCR) (1).
b)
Deteccin de Ehrlichia ruminantium utilizando PCR y PCR anidada

A partir de la secuencia de ADN de la sonda pCS20 (15) se han diseado dos cebadores -AB128 y AB129para uso en PCR. Una modificacin del mtodo PCR consiste en la transferencia de la sonda pCS20 sobre
394
el fragmento de amplificacin en un paso adicional, que origina un aumento de 10 veces en la sensibilidad

(24). Se ha demostrado que esta ltima tcnica (PCR/hibridacin) es 350 veces ms sensible que la sonda
de cido nucleico sola. Se han detectado por PCR niveles bajos de infeccin en animales y en garrapatas
alimentadas de animales portadores, mientras que una reaccin de hibridacin con la sonda de pCS20 sola
resulta generalmente negativa (24). Desde el punto de vista experimental, se encontr que el lmite de
deteccin del ensayo convencional de PCR estaba entre 10 y 102 organismos, mientras que despus de la
PCR/hibridacin estaba entre 1 y 10 organismos. Se ha demostrado la utilidad de la tcnica
PCR/hibridacin para detectar 37 cepas de todas las reas endmicas con una especificidad del 98%. Sin
embargo, la sensibilidad del ensayo PCR es variable, oscilando entre 97 a 88% con muestras de garrapatas
que contienen 107a 104 organismos, y cayendo hasta 61% y 28% con muestras que contienen 103 y 102
organismos, respectivamente (22). Consecuentemente, la tasa de 86% de garrapatas que dan positivo en
las pruebas cuando se alimentan de animales infectados cay al 21% cuando se alimentan de animales
portadores debido a una rickettsemia ms baja en tales animales.
Tambin se ha desarrollado una PCR anidada dirigida al mismo fragmento de ADN pCS20 (18). El par de
cebadores externos incluye el cebador AB128 con sentido junto con un cebador llamado AB130 anti
sentido. Estos amplifican un fragmento de 413 bp usado como matriz en una segunda vuelta de PCR
utilizando AB128 y AB129 como cebadores internos. El uso de los cebadores AB128 y AB129 evita la
necesidad de repetir una evaluacin completa de la especificidad de la prueba. La PCR anidada muestra
una mejora en sensibilidad de 2 log 10 si se la compara con una simple PCR, y un lmite de deteccin
promedio de 6 organismos. La implicacin directa de esto fue un aumento en el ndice de deteccin en
garrapatas salvajes del 1,7% al 36% en un estudio epidemiolgico en el Caribe. El lmite de deteccin es
comparable al del mtodo de PCR/hibridacin que, sin embargo, es mucho ms complejo y largo de
realizar. La PCR anidada con pCS20 permiti la deteccin regular de organismos de E. ruminantium en
garrapatas, sangre, cerebro y pulmones de animales infectados, tanto si las muestras fueron procesadas
frescas o despus de la congelacin o conservacin en etanol al 70%.
Se ha desarrollado una PCR anidada dirigida al gen polimrfico map1 completo en paralelo para tipificar las
cepas por el polimorfismo de los fragmentos de restriccin o secuenciando el fragmento de amplificacin
directamente de las muestras patolgicas que dan positivo en la PCR anidada con pCS20 (18). Se observa
una gran diversidad gentica de E. ruminantium en el campo que influye en la formulacin de vacunas y ha
de ser investigado con ms detenimiento. La PCR anidada con map1 funciona bien aunque con una
sensibilidad ligeramente ms baja que la PCR anidada con pCS20. Su lmite de deteccin se evalu en
alrededor de 60 organismos y solamente el 91% de las muestras que resultaron positivas en la PCR
anidada con pCS20 tambin dieron positivo en la PCR anidada con map1; algunos positivos de baja
intensidad encontrados usando la PCR anidada con pCS20 resultaron negativos en la PCR con map1.
Aunque los mtodos PCR han resultado ser muy efectivos para detectar infeccin en garrapatas o en
muestras de animales durante la fase clnica de la enfermedad o despus de la muerte, solamente se han
llevado a cabo estudios limitados para evaluar su valor en rumiantes sanos portadores. Ehrlichia
ruminantium se puede encontrar fcilmente en la sangre de animales infectados inmediatamente antes del
comienzo del periodo febril o unos cuantos das despus de la recuperacin, pero despus de esto parece
ausente de la circulacin a un nivel detectable durante periodos largos. En un estudio en Zimbabwe solo
dieron positivos entre 3,3 y 26,7% del ganado vacuno, y 23,3% de las cabras mientras que casi 100% de
ellos haban sido infectados con Ehrlichia (13). No se sabe si la falta de deteccin de la enfermedad en la
mayora de los animales portadores se debe a una sensibilidad insuficiente de los mtodos PCR para
detectar rickettsemia muy baja, o se debe a una liberacin intermitente de organismos en la circulacin. Una
tcnica til para confirmar el estado de un animal portador sospechoso, cuya sangre es negativa por PCR,
es alimentar lotes de garrapatas sobre el animal y despus probar las garrapatas mediante PCR. No se
sabe si las garrapatas actan simplemente concentrando organismos circulantes o tambin amplificando su
nmero o incluso induciendo la liberacin de microorganismos en la circulacin durante la alimentacin.
Los cebadores 32F1 y 32R1 diseados de la secuencia del gen MAP1 de E. ruminantium se usaron con
xito en una PCR para detectar el patgeno en la sangre y en la mdula sea de ovejas portadoras y
ungulados salvajes africanos, pero el mtodo no ha sido evaluado ni utilizado con amplitud.
c)
Deteccin de Ehrlichia ruminantium utilizando la tcnica de transferencia lineal inversa

La tnica de transferencia lineal inversa (RLB) se ha utilizado para la deteccin e identificacin simultneas
de las especies de Anaplasma y Ehrlichia que se sabe que existen en rumiantes sobre la base de las
diferencias en el gen de la subunidad pequea del ARNr (2). Los cebadores 16S8FE y B-GA1B-nuevo se
disearon a partir de dominios conservados y se utilizaron para amplificar un fragmento de 492-498 bp del
gen del ARNr 16S atravesando la regin V1 variable. Se disearon sondas de oligonucletidos con
especificidad de especie en este asa V1 para permitir la deteccin especfica de E. ruminantium, E. ovina,
E. sp. Cepa Omatjenne, Anaplasma marginales, A. centrale, A. bovis, A. ovis y A. phagocytophilum.
Tambin se diseo una sonda de oligonucletido de reaccin cruzada con todas las especies (sonda
395
general) para que sirviera como control en el caso de que un producto PCR no hibridar con ninguna de las
sondas con especificidad de especie. En el mtodo, las sondas con especificidad de especie se unen
covalentemente a la membrana de hibridacin, que se hibrida con el producto de la PCR obtenido utilizando
los cebadores 16S8FE y B-GA1B-nuevo. Se demostr que los productos PCR obtenidos de los
microorganismos mencionados anteriormente se unan solo con sondas de oligonucletidos especficos. No
se detect ningn producto PCR ni se produjo ninguna hibridacin cuando se aplico PCR-RLB a Theileria
annulata, Babesia bigemina o ADN de mamfero. De forma similar, las garrapatas control negativas fueron
siempre negativas en la prueba RLB mientras que se pudo detectar infeccin por Ehrlichia ruminantium en
15-70% de las garrapatas alimentadas de ovejas infectadas experimentalmente o portadoras crnicas. En
Mozambique, se pudo detectar E. ruminantium en la sangre de 12 pequeos rumiantes colocados en el
campo con los animales infectados; se detect infeccin mixta en cinco de los animales centinela
infectados, demostrando de esa forma la utilidad del mtodo para detectar mltiples infecciones. Sin
embargo, no se ha determinado an la sensibilidad del ensayo y se necesita validar esta tcnica en
estudios epidemiolgicos amplios.
Lectura de los resultados

Teniendo en cuenta que E. ruminantium es una bacteria intracelular obligada que no puede cultivarse en
medios acelulares y que su aislamiento es complejo y dura varias semanas, las tcnicas de deteccin
molecular son los mtodos mejores para el diagnstico de cowdriosis. La PCR es ms fcil de llevar a cabo
y ms sensible que las sondas de ADN. Sin embargo, en las pruebas PCR hay que tener cuidado de
asegurar que no se produzca contaminacin cruzada entre las muestras. Se deben incluir controles
positivos y negativos en cada prueba. Considerando que la serologa de la cowdriosis tiene muchas
limitaciones (ver Seccin B.3.), la PCR podra utilizarse para confirmar los resultados serolgicos cuando,
por ejemplo, animales seronegativos de un rea endmica deben llevarse a un rea de riesgo (con
presencia de vectores potenciales) libre de cowdriosis. Sin embargo, a pesar de los interesantes resultados
experimentales para detectar portadores subclnicos, no hay suficiente informacin disponible sobre la
fiabilidad de la deteccin de portadores por PCR, y se necesita ms investigacin antes de disear una
prueba estndar de sensibilidad conocida. Los resultados actuales obtenidos con la PCR, la PCR anidada o
la prueba RLB, muestran que la deteccin directa de E. ruminantium en la sangre solo es fiable durante y
alrededor de la fase febril de la enfermedad. Los mtodos basados en la PCR parecen ser ms fiables para
detectar la infeccin en garrapatas, y esto podra tener cierto valor epidemiolgico para determinar la
distribucin geogrfica de Ehrlichia. Adems, cuando es necesario en reas endmicas, la inclusin de
garrapatas de prueba (originalmente sin infectar) alimentadas sobre un animal sospechoso mejorara la
sensibilidad de la deteccin de portadores cuando han fallado la serologa y la PCR con sangre. Sin
embargo, este procedimiento no es conveniente para laboratorios de diagnstico rutinario ya que requiere
el mantenimiento de colonias de garrapatas y la capacidad para infectar animales experimentalmente.
3.
Pruebas serolgicas
Se han descrito varias pruebas serolgicas para diagnosticar cowdriosis: una prueba IFI con cultivo de clulas
endoteliales infectadas de E.ruminantium como antgeno (prueba CIFA), ELISA indirecto, un ELISA competitivo
(C-ELISA), y una inmunotransferencia (Western blot). La prueba IFI que utiliza macrfagos del peritoneo de ratn
infectado con E. ruminantium (MIFA) se utiliza raramente en la actualidad.
Un inconveniente de todas estas pruebas es la deteccin de reacciones positivas falsas debido a determinantes
antignicos comunes entre E. ruminantium MAP1 y la presencia de protenas similares en varias especies de
Ehrlichia. Casi todas estas pruebas ya no se usan para epidemiologa o diagnstico. La prueba CIFA se usa an
en algunos lugares, pero hay que tener cuidado cuando se interpretan los resultados por el problema de las
reacciones positivas falsas.
Para superar el problema de las reacciones cruzadas con Ehrlichia, se han desarrollado dos ELISAs sobre un
antgeno MAP1 recombinante. El primero es un ELISA indirecto que utiliza una regin inmunognica de la
protena MAP1 (llamada MAP1-B) y produce muchas menos reacciones cruzadas con Ehrlichia spp. (ELISA con
MAP1-B) (28). El segundo es un ELISA competitivo que utiliza el gen MAP-1 clonado en un baculovirus y
anticuerpos monoclonales (MAbs) producidos contra la protena MAP1 (C-ELISA con MAP1) (10). Ambas
pruebas han mejorado la especificidad notablemente, pero an muestran alguna reactividad con sueros de ttulo
alto contra E. canis, E. chaffeensis y un agente no clasificado del ciervo de cola blanca.
Hasta ahora, el ELISA con MAP 1-B ha sido el de utilizacin ms amplia y se describir con ms detalles.
a)
Prueba de inmunofluorescencia indirecta con cultivo de tejido celular endotelial como antgeno
(prueba CIFA) (17)
Para preparar el antgeno, se cultiva una cepa de E. ruminantium en cultivos de clulas endoteliales de
rumiantes. Cuando la mayora de las clulas se lisan, se recogen las clulas adherentes restantes y se
396
mezclan con el sobrenadante. Las clulas se centrifugan tres veces con solucin salina tamponada con
fosfato (PBS) a 200 g durante 10 minutos. En cada pocillo de un porta para inmunofluorescencia se colocan
10 l de la suspensin celular lavada. Los portas con antgeno se secan, se fijan en acetona y se
almacenan a -20C.
b)
i)
Los sueros problema se diluyen 1/20 en PBS, se aaden a los pocillos con antgeno y se incuban
durante 30 minutos en una cmara hmeda a 37C.
ii)
Se lavan las placas en tampn durante 15 minutos.
iii)
Para cubrir los pocillos se aaden los conjugados anti-especies apropiados, diluidos generalmente
1/60. Las portas se incuban de nuevo durante 30 minutos a 37C.
iv)
Despus de un segundo lavado, los portas se ponen en glicerina tamponada bajo un cubre y se
examinan con un microscopio de fluorescencia.
v)
Se incluyen sueros control positivos y negativos en cada porta.
Prueba de inmunofluorescencia indirecta con macrfagos del peritoneo de ratn infectado como
antgeno ( prueba MIFA) (8)
Se inyectan intraperitonealmente ratones con 0,2 ml de estabilizado de la cepa de Kmm despus de
recuperarlo del almacenamiento en nitrgeno lquido. Los sntomas clnicos pelo erizado y aletargamientoaparecen 12 das despus, y pueden morir varios ratones. Los ratones supervivientes son sacrificados. Las
clulas peritoneales que contienen algunos macrfagos con colonias de mrulas se extraen inyectando 2 ml
de PBS en la cavidad peritoneal y recuperando el lquido. El lquido peritoneal recuperado se centrifuga
durante 5 minutos a 2.000 g y el precipitado se resuspende en 0,3 ml de tampn.
Se coloca una gotita de la suspensin de clulas en cada pocillo de un porta para inmunofluorescencia para
formar una monocapa de clulas. Las placas con antgeno se secan al aire, se envuelven en tejido y papel
de estao y se almacenan a 4C durante 21 das, a 18C durante 6-9 meses, o por debajo de 70 durante
ms de 1 ao.
Inmediatamente antes de utiliziarlas, los portas con antgeno se sumergen en metanol fri durante 1-3
egundos. Se utiliza un instrumento para separar los pocillos a fin de evitar la confluencia de suero entre los
pocillos.
El procedimiento IFI es el mismo que en la prueba anterior, pero la dilucin inicial del suero es 1/80.
c)
Enzimoinmunoensayo con MAP1-B (28)

Utilizando el vector pQE9, el fragmento de PCR MAP1-F2R2, que codifica los aminocidos 47-152 de la
protena MAP1 que incluye la regin inmunognica MAP1-B, se expresa en Escherichia coli M15[pREP4]
como una protena de fusin que contiene seis residuos adicionales de histidina. La MAP1-B recombinante
se purifica utilizando Ni2+-NTA agarosa (cido nitrilotriactico-agarosa) bajo condiciones desnaturalizantes
como lo describe el fabricante1. El antgeno se conserva a 4C y se titula cada lote.
El antgeno se diluye a 0,5 g/ml en tampn carbonato sdico 0,05 M, pH 9,6, y se inmoviliza sobre placas
de poliestireno mediante incubacin durante 1 hora a 37C, y se guarda a 4C hasta su uso.
i)
Las placas se bloquean durante 30 minutos aadiendo 100 l por pocillo de PBS 0,1M, pH 7,2,
suplementado con Tween 20 al 0,1% y leche desnatada seca al 3% (PBSTM).
ii)
Se lavan las placas tres veces con PBS suplementado con Tween 20 al 0,1 % (PBST) y dos veces con
agua destilada.
iii)
Se aaden en pocillos duplicados 100 l de suero de la prueba diluidos al 1/100 en PBSTM, y se

incuba durante 1 hora a 37C.
iv)
Se lavan las placas tres veces en PBST y dos veces en agua destilada
v)
Se aaden 100 l por pocillo de IgG anti-especie conjugada con peroxidasa de rbano diluida
ptimamente y la placa se incuba durante 1 hora a 37C.
Qiagen, Max-Volmer-Strasse 4, 40724 Hilden, Alemania.
397
d)
vi)
Despus de lavar como en el paso iv, cada pocillo se llena con 100 l con tampn citrato 0,1M, pH 5,5,
que contiene 0,5 mg/ml de ortofeniln-diamina y 3 l/ml de 9% de H2O2.
vii)
La reaccin se para despus de 30 minutos de incubacin a temperatura ambiente aadiendo 50 l de

H2SO4 2N. La absorbancia se lee a 495 nm. Se incluyen controles positivos y negativos en cada placa.
Enzimoinmunoensayo competitivo con MAP1 (20)

El antgeno recombinante MAP1 se prepara de la siguiente forma: se infectan larvas del insecto
Trichoplusia ni de 8 das por un baculovirus que expresa el gen map1 y se homogenizan las larvas
moribundas (10% [p/v] en PBS suplementado con 0,001% (v/v) de Triton X-100.
El anti-MAP1 MAb se prepara de la siguiente forma: clulas de bazo de ratn BALB/C previamente
inoculadas con homogenado de larvas se funden con clulas SP2/0. Se analizan los sobrenadantes
lquidos del cultivo celular del hibridoma para detectar la reactividad con MAP1 por mtodos de
inmunotransferencia (immnunoblotting) (e inmunoperoxidasa. Se subclona un cultivo celular reactivo, se
isotipa y posteriormente se utiliza para la produccin de ascites.
Despus de una dilucin posterior en PBS 1/800 (v/v), se inmoviliza el antgeno sobre placas de
poliestireno (Placas polySorp Nunc-Inmuno) mediante incubacin durante la noche a 4C, y se guardan a
70C.
i)
Antes de su utilizacin, las placas se bloquean durante 30 minutos aadiendo 100 l por pocillo de
PBS, pH 7,2, suplementado con 0,05% de Tween 20 y 5% de leche seca desnatada.
ii)
Las placas se lavan tres veces con PBS/Tween, se aaden 50 l/pocillo de suero problema diluido
1/50 en PBS suplementado con 0,05% de Tween 20 y 1% de leche seca desnatada (PBSTM) por
duplicado y las placas se incuban durante 30 minutos a 37C.
iii)
Sin ningn paso intermedio, se aaden 75 l /pocillo de MAb diluido 1/4.000 (v/v) en PBSTM y se
incuban las placas durante otros 30 minutos a 37C.
iv)
Se lavan las placas tres veces en PBS/Tween y se aaden 50 l por pocillo de IgG anti- ratn
conjugada con peroxidasa de rbano diluida de forma ptima en PBSTM. La placa se incuba durante
1 hora a 37C.
v)
Despus de tres lavados como se describi anteriormente, se aaden a cada pocillo 100 l de tampn
citrato 0,1 M, pH 5,5, que contienen 0,5 mg/ml de O-feniln diamina y 3 l/ml de 9% de H2O2.
Despus de 30 minutos de incubacin a temperatura ambiente en la oscuridad, se detiene la reaccin
aadiendo 50 l de H2SO4 2 N y se lee la absorbancia a 495 nm. En cada placa se incluyen controles
positivos y negativos.
Lectura de resultados
Todas las pruebas serolgicas basadas en antgenos de Ehrlichia no recombinantes, tales como CIFA,
ELISAs e inmunotransferencia, se utilizan an para estudios experimentales, pero no para estudios seroepidemiolgicos. Las pruebas se han comparado y aplicado a sueros positivos y negativos conocidos para
E. ruminantium (7). No se observaron reacciones positivas falsas en ninguna de las pruebas con sueros
negativos conocidos. Existe una buena correlacin entre las pruebas, pero la especificidad de las cinco
pruebas es baja porque se producen reacciones cruzadas con algunas Ehrlichia spp.
La interpretacin de los resultados de varias pruebas aplicadas a estudios de campo es, por tanto, difcil en
reas donde se producen infecciones por Ehrlichia en rumiantes, que es probablemente el caso en la
mayora de las regiones de Africa donde la cowdriosis es endmica. Esta situacin tambin se ha visto en
granjas sin Amblyomma pero infectadas con especies de garrapatas que no se ha demostrado que sean
vectores de E. ruminantium.
Tanto el ELISA con MAP1-B como el C-ELISA con MAP1 han mostrado una gran especificidad despus de
su evaluacin en el suero de 3000 rumiantes (cabra, oveja y ganado vacuno) recogidos de 14 islas de las
Antillas Menores infectadas con A.-variegatum, de las que solamente tres se sabe que estn infectadas por
E. ruminantium (20). La especificidad total calculada de las 11 islas sin cowdriosis fue 98,5% y 99,4% para
el C-ELISA con MAP1 y el ELISA con MAP1-B, respectivamente. Aunque an se encuentran unos cuantos
sueros positivos falsos, es probable que estas pruebas resuelvan muchos de los problemas de
especificidad de las anteriores pruebas serolgicas.
La evaluacin de la sensibilidad de las pruebas es ms problemtica ya que requiere el conocimiento de la
situacin exacta de un nmero alto de animales muestreados en el campo. Como se mencion
398
anteriormente, en la actualidad no hay ninguna tcnica sencilla disponible para confirmar si un animal est
infectado. Desde el punto de vista experimental, se describi que la sensibilidad de C-ELISA en cabras era
de 91,6-95,4% para el ELISA con MAP1-B, y de 96,3-96,9% para el C-ELISA con MAP1 (20). Sin embargo,
en otro estudio la sensibilidad media era de 95% para valores de corte establecidos al 31% y 26,6% del
suero control positivo para sueros de ovejas y cabras, respectivamente (19). De hecho, los clculos se
basan en un nmero limitado de animales inoculados experimentalmente en un periodo de tiempo
inmediatamente despus de la inoculacin, cuando casi todos los animales son an positivos. La
sensibilidad en el ganado vacuno es incluso ms baja y hay varios informes que demuestran que, despus
de la infeccin, la mayora de los animales se convierten de nuevo en seronegativos en menos de 6 meses
y algunos animales incluso nunca presentan seroconversin. Esta observacin coincide con la diferencia en
la prevalencia de anticuerpos observada entre rumiantes pequeos y ganado vacuno en inspecciones
epidemiolgicas que no se pueden explicar por un menor riesgo de infeccin de los ltimos. Por ejemplo, en
las granjas de Zimbabwe situadas en reas endmicas, ms del 90% de las cabras presentaban
anticuerpos en su suero en comparacin con el 33% del ganado vacuno mantenido en las mismas
condiciones (14). Se han hecho observaciones similares en el Caribe.
Las pruebas serolgicas son tiles para la evaluacin de la infeccin de cowdriosis en animales vacunados.
Las pruebas se pueden utilizar tambin para analizar animales antes de su importacin a reas libres de
cowdriosis, teniendo en cuenta que los anticuerpos se mantienen a niveles detectables en rumiantes
domsticos infectados naturalmente durante slo unos pocos meses, y que los anticuerpos circulantes
desaparecen ms rpidamente en ganado vacuno que en rumiantes pequeos. Por tanto, es posible que
los animales que dan negativo en las pruebas serolgicas puedan ser portadores de infeccin. La serologa
debera considerarse, por tanto, como un mtodo de diagnstico aplicable a nivel de manada, no a nivel
individual.
Los mtodos moleculares, tales como pruebas de PCR, podran ayudar potencialmente a detectar animales
portadores sin anticuerpos detectables, pero esta posibilidad presenta an inconvenientes importantes (ver
seccin B.2. Mtodos moleculares).

Aunque se han obtenido resultados prometedores con organismos inactivados o atenuados, no existen
actualmente vacunas comerciales. El nico mtodo de inmunizacin contra la cowdriosis es el mtodo de
"infeccin y tratamiento" utilizando sangre infectada o con homogenados de garrapatas infectadas pre
alimentadas seguido por tratamiento de los animales infectados con tetraciclina. Este mtodo se usa an en
varias zonas. Sin embargo, es probable que sea reemplazado pronto por la vacunacin con preparados de
cuerpos elementales de E. ruminantium inactivados emulsionados en adyuvantes lipdicos, despus de la
demostracin de que las cabras susceptibles pueden protegerse con Ehrlichia inactivada en adyuvante de
Freund (16). Esta vacuna tambin protega contra inoculacin de desafio en ovejas (11) utilizando diferentes
cepas de E. ruminantium, y en ganado vacuno (27) utilizando la misma cepa que en cabras. Se ha demostrado
que una preparacin de vacunas de primera generacin de Ehrlichia inactivada en adyuvante lipdico Montanide
ISA 50 (adyuvante autorizado para uso en animales) era tan efectiva como la preparacin con adyuvante de
Freund en inoculaciones experimentales de laboratorio en cabras inmunizadas.
Los animales se pueden inmunizar con dos inyecciones subcutneas de 250 g de antgeno emulsionado (50/50)
en adyuvante Montanide ISA 50 en un volumen de 2 ml. En la actualidad se estn llevando a cabo estudios
adicionales sobre la optimizacin de produccin de vacunas, control de calidad y eficacia en las diferentes
especies a las que van dirigidas. En condiciones experimentales, se ha demostrado en cabras que la dosis de
vacuna puede bajarse hasta 32 g del antgeno sin disminuir el efecto de proteccin.
La evaluacin de una vacuna inactivada con adyuvante ISA 50 ha puesto de manifiesto que protege a las ovejas
contra la exposicin natural en Zimbabwe (12). Adems, se estn llevando a cabo en la actualidad muchos
intentos de evaluacin en condiciones de campo en varias granjas de frica. Un desafo importante es la
caracterizacin de la amplitud de la diversidad de cepas en una regin que va a ser cubierta por una vacuna
adecuada. Este conocimiento resultar esencial para la generacin de nuevas vacunas que se desarrollen en el
futuro.
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*
* *
NB: Existe un laboratorio de referencia de la OIE para Cowdriosis (ver Cuadro en la Parte 3 de este Manual de
animales terrestres o consulte el sitio Web de la OIE para una lista ms actualizada: www.oie. int).
401
CAPTULO 2.2.8.
LARVA PERFORADORA DEL NUEVO MUNDO

(COCHLIOMYIA HOMINIVORAX)
Y DEL VIEJO MUNDO (CHRYSOMYA BEZZIANA)
RESUMEN
1
La larva perforadora del Nuevo Mundo (LPNM), Cochliomyia hominivorax (Coquerel), y la larva
1
perforadora del Viejo Mundo (LPVM), Chrysomya bezziana Villeneuve, son parsitos estrictos de
los mamferos durante sus estados larvarios. Ambas especies se incluyen en la subfamilia
Chrysomyinae de la familia Calliphoridae del orden Diptera (moscas verdaderas). Las larvas que
se alimentan de la piel y de los tejidos subyacentes del hospedador originan heridas y una
condicin denominada miasis traumtica que puede ser mortal. La infestacin se suele adquirir en
sitios con lesiones previas, debidas a causas naturales o a las prcticas ganaderas, pero tambin
pueden ocurrir en las membranas mucosas de los orificios corporales.
Las moscas hembras son atradas por las heridas, en cuyos bordes cada hembra deposita una
media de 175 huevos (en el caso de LA LPVM) o 340 (en el caso de la LPNM). Las larvas emergen
al cabo de 1224 horas e inmediatamente comienzan a alimentarse, perforando cabeza abajo en
la herida. Despus de un crecimiento que incluye dos fases de muda, las larvas abandonan la
herida y se dejan caer al suelo al que perforan para realizar la fase de pupacin. La duracin del
ciclo de vida fuera del hospedador depende de la temperatura, siendo ms corta cuanto mayor es
la temperatura, y en los trpicos el ciclo completo puede completarse en menos de 3 semanas.
En general, se efecta un tratamiento a base de aplicar insecticidas organofosforados en las
heridas con infestacin, tanto para matar a las larvas como para suministrar una proteccin
residual frente a la reinfestacin. Las medidas preventivas incluyen la pulverizacin o el bao del
ganado susceptible con compuestos organofosforados y, ms recientemente, el uso de
avermectinas en inyecciones subcutneas a animales "con riesgo". Tambin es una medida
preventiva el control estricto del movimiento de animales fuera de las reas afectadas.
Identificacin del agente: Las larvas de LPNM y DE LPVM se pueden confundir fcilmente entre
s y con las larvas de otros agentes de miasis. Un diagnstico ajustado implica la identificacin de
las larvas extradas de la parte ms profunda de las heridas infestadas. Las larvas maduras del
tercer estadio larvario son las ms adecuadas para este fin y las de LPNM se pueden identificar
por sus troncos traqueales dorsales de pigmentacin obscura que se extienden desde el segmento
duodcimo hasta el dcimo o el noveno. Esta pigmentacin es peculiar de las larvas de LPNM
entre las especies que se pueden encontrar relacionadas con la miasis de heridas. La confirmacin
de LA LPVM descansa en el reconocimiento de una combinacin caracterstica en la espinulacin,
en el nmero de lbulos del espirculo anterior (46), y en la pigmentacin de los troncos
traqueales secundarios.
En la fase adulta, las especies del gnero Cochliomyia se pueden distinguir de otros gneros
relacionados con la miasis de las heridas confirmando el color del cuerpo, que normalmente es
azul/verdoso metlico y con tres rayas longitudinales obscuras presentes siempre en el trax. En
este captulo se presenta la separacin de LPNM de la muy similar C. macellaria y la identificacin
de la LPVM adulta.
402
En este captulo, el trmino "Nuevo Mundo" se refiere a Amrica del Norte, Central y del Sur, y el trmino "Viejo Mundo"
se refiere a Europa, frica y Asia.
Captulo 2.2.8. Larvas perforadoras (Cochliomyia hominivorax y Chrysomya bezziana)
Pruebas serolgicas: En la actualidad no hay pruebas serolgicas aplicables, ni resultan

apropiadas para la identificacin de la enfermedad. No obstante, la serologa puede tener un papel
en el futuro en estudios sobre la prevalencia de la miasis.
Requisitos para las vacunas y los materiales de diagnstico: No hay vacunas disponibles ni
materiales de diagnstico excepto el uso de moscas macho esterilizadas en la tcnica del insecto
estril (SIT). En esta tcnica, se liberan al medio de forma secuencial un gran nmero de moscas
macho estriles cuyo acoplamiento con hembras produce huevos no fertilizados que conduce a
una reduccin inicial de la poblacin y, progresivamente, a la erradicacin.
A. INTRODUCCIN
La mosca de la larva perforadora del Nuevo Mundo (LPNM), Cochliomyia hominivorax (Coquerel), y la del Viejo
Mundo, Chrysomya bezziana Villeneuve, pertenecen a dos gneros de la subfamilia Chrysomyinae de la familia
de dpteros Calliphoridae (moscardas o moscas azules). Ambas especies son parsitas obligadas de mamferos
y, ms raramente, de aves. Pese a ser de diferentes gneros y estar geogrficamente separadas, ambas
especies han evolucionado de forma notablemente paralela. Tienen ciclos vitales casi idnticos porque ocupan
nichos idnticos de parasitismo en sus respectivas zonas geogrficas. La siguiente exposicin se refiere a ambas
especies, excepto cuando se indique lo contrario.
A diferencia de otras especies de moscardas azules, la hembra adulta de las larvas perforadoras no deposita sus
huevos en inmundicias. En vez de eso, deposita los huevos en el borde de las heridas de mamferos vivos con
lesiones o en sus orificios corporales. Prcticamente cualquier herida resulta atractiva, bien sea natural (de
luchas, depredadores, espinas, enfermedad, y/o mordeduras por garrapatas e insectos) o producida por el
hombre (en el esquileo, marcaje, castracin, corte de cuernos, corte de rabo, y/o marcaje en las orejas). Las
heridas naturales ms frecuentemente infestadas son los ombligos de los animales recin nacidos y las regiones
vulvares o perianales de sus madres, especialmente si muestran traumatismo. Si los huevos se depositan en las
membranas mucosas, las larvas pueden invadir las aberturas naturales del cuerpo como los orificios nasales y
los senos asociados, las rbitas de los ojos, la boca, el odo y los genitales.
A las 1224 horas de la deposicin de los huevos, las larvas emergen y comienzan a alimentarse de inmediato
de los fluidos de las heridas y los tejidos subyacentes, penetrando de forma gregaria en las heridas con la
cabeza hacia debajo de una manera tpicamente perforadora. A medida que se alimentan rompiendo los tejidos
con sus partes bucales en forma de gancho, la herida se agranda y se hace ms profunda, originando una
amplia destruccin tisular. A menudo, las heridas infestadas emiten un olor caracterstico, que puede ser la
primera indicacin de que al menos un animal est infestado dentro de un grupo. Aunque el olor no es siempre
percibido por los humanos, parece resultar muy atractivo para las hembras grvidas (18), que depositan ms
lotes de huevos incrementando as la extensin de la infestacin. Una infestacin grave sin tratamiento puede
ocasionar la muerte del hospedador.
A los 57 das de la eclosin de los huevos, las larvas alcanzan la madurez despus de dos mudas. Detienen su
alimentacin y abandonan la herida, cayendo al suelo donde penetran para la pupacin. La pupa se desarrolla
dentro de un pupario, una estructura protectora en forma de tonel que se forma por endurecimiento y
oscurecimiento de la cutcula de la larva madura. Despus de completar el desarrollo, la mosca adulta suele
emerger del pupario por la maana y consigue subir a la superficie del suelo, donde extiende sus alas para
endurecerlas antes de volar. Los machos alcanzan la madurez sexual y son capaces de acoplarse a las
24 horas, pero las hembras solo maduran sus ovarios, responden a los machos y se acoplan a los 3 das. A los
4 das del acoplamiento, la mosca hembra est dispuesta para la ovoposicin. Busca un hospedador adecuado y
deposita los huevos, todos orientados en la misma direccin, y firmemente unidos entre s y al substrato en que
se depositan. El nmero de huevos por puesta depende de muchos factores (por ejemplo, de la cepa de mosca,
de molestias durante la ovoposicin), pero la media de la primera puesta es del orden de 175 huevos para la
LPVM y de 340 para la LPNM (38). Despus de la primera puesta, siguen otras a intervalos de 34 das (46). Las
moscas adultas viven un promedio de 23 semanas en el campo alimentndose en las flores, y las hembras
tambin toman protenas, por ejemplo de los fluidos serosos de las heridas animales.
La velocidad de desarrollo de los estados inmaduros est influenciada por la temperatura ambiental y la de las
heridas, siendo menor a bajas temperaturas, aunque no ocurre una verdadera diapausia. Este efecto es ms
pronunciado en la fase de pupa fuera del hospedador, cuya duracin puede variar de 1 semana a 2 meses
dependiendo de la estacin (23). As, el ciclo de vida completo de la LPNM puede ser de 23 meses en tiempo
403
fro (33), mientras que en condiciones templadas con una temperatura media del aire de 22C, se completa en
24 das (23), y en condiciones tropicales a 29C se completa en unos 18 das (46).
El grado de fro que pueden tolerar la LPNM y la LPVM tiene una influencia notable en sus distribuciones, lo que
est mejor documentado en el caso de la LPNM. Histricamente, el alcance de la LPNM se extenda desde los
estados del sur de los Estados Unidos de Amrica (EE.UU.), a travs de Mxico, Amrica Central, las islas del
Caribe y los pases del norte de Amrica del Sur hasta Uruguay, el norte de Chile y el de Argentina (21). Esta
distribucin se contraa durante los meses de invierno y se expanda durante los meses de verano, produciendo
una estacionalidad anual en sus bordes alrededor de las poblaciones de las reas centrales los trpicos del
Nuevo Mundo. La utilizacin de la tcnica del insecto estril (SIT) en programas importantes ha conducido a la
erradicacin de la LPNM de EE.UU. (6), Mxico (16), Curaao, Puerto Rico, y las islas Virgin, y en Amrica
Central, de Guatemala, Belize, El Salvador, Honduras, Nicaragua, y en el ao 2000, de Costa Rica (49). El
programa de erradicacin en Amrica Central contina en Panam, donde se liberaron moscas estriles por
primera vez en Julio de 1998. El objetivo final es establecer una barrera en Panam que suponga el futuro lmite
norte de la LPNM en Amrica. Tambin se inici oficialmente un programa de erradicacin de la LPNM en
Jamaica en Julio de 1998, como parte de un plan para eliminar la especie de todo el Caribe. Aunque la LPNM es
una especie del Nuevo Mundo, en 1988 se detect en el norte de frica en Libia, donde amenaz con
establecerse firmemente. Sin embargo fue erradicada en 1991 con una campaa intensiva de SIT (13, 24). La
amenaza de extensin de las larvas perforadoras, favorecida por los rpidos sistemas de transporte moderno,
siempre est presente, y requiere una vigilancia constante de cuarentena y otras medidas frontales de sanidad
animal y humana en las reas no afectadas. Se han descrito recientemente casos de LPNM en Mxico, EE.UU. e
incluso en el Reino Unido (28).
La distribucin de la LPVM est limitada al Viejo Mundo, como sugiere su nombre, principalmente a travs de
frica (desde Etiopa y los pases subsaharianos hasta el norte de Sudfrica), los pases del Golfo, el
subcontinente indio, y el sudeste asitico (desde el sur de la Repblica Popular China a travs de la pennsula de
Malasia y las islas de Indonesia y Filipinas hasta Papa Nueva Guinea) (21, 38, 42, 50). Tambin se ha descrito
la miasis por la LPVM en Argelia (1), por un pastor local, pero la ausencia de otros casos descritos, en particular
casos en animales, sugiere que es improbable su presencia continuada. La situacin en el rea del Golfo es
dinmica, con casos recientes confirmados en Irn (32) e Irak (2). Las necesidades climticas de las dos
especies de larvas perforadoras son muy similares y su distribucin potencial, si no se limitara, se superpondra
en gran medida (42).
Los insecticidas organofosforados como el diclofention, fenclorfos, y en particular, el coumafos son
recomendables para el tratamiento de las heridas infestadas con la LPVM y la LPNM (15, 34, 40). Tiene el efecto
de expulsar las larvas, que caen al suelo. Para favorecer una proteccin residual contra la reinfestacin, deben
aplicarse a intervalos de 23 das hasta que la herida sane. Los contenidos de bolsitas individuales para el
tratamiento de las heridas, como por ejemplo 5 g de coumafos en polvo mojable al 5%, deben espolvorearse
directamente sobre una herida o, para mayor eficacia, extendidos sobre la herida como una pasta despus de
mezclar con aceite ordinario de cocina (33 ml). Los compuestos organofosforados tambin se pueden aplicar
como aerosoles pulverizados, con colorantes marcadores y bacteriostticos incorporados, o como polvos
aplicados a la herida mediante opresin de botellas de plstico. El diclorodifention se utiliza en Sudamrica en
aerosol al 1% para tratar casos de LPNM y es tambin eficaz contra la LPVM (34). Para evitar la sepsis, debe
eliminarse de la herida cualquier larva muerta. Siempre se debe prestar atencin a las instrucciones de seguridad
de los fabricantes.
Se puede obtener una prevencin directa de la infestacin por larvas perforadoras mediante pulverizacin o
inmersin del ganado con coumafos (suspensin acuosa al 0.25% de polvo mojable al 50%) o con otros
insecticidas organofosforados a la concentracin mxima ordenada para el control de parsitos externos. Los
efectos de tales tratamientos son dobles: primero, el tratamiento mata directamente las larvas y proporciona
proteccin residual; segundo, el tratamiento mata garrapatas y otros parsitos externos, lo que implica que habr
menos heridas disponibles como sitios de ovoposicin. Potencialmente, los piretroides sintticos pueden
controlar las larvas perforadoras en las heridas, pero ha habido pocos ensayos descritos sobre su efecto en las
larvas (por ejemplo, Permetrin contra la LPNM, 35). La inmersin o pulverizacin de un grupo de animales est
indicada cuando algn miembro del grupo est infestado, o cuando el animal atraviesa o abandona un rea
infestada, o despus de prcticas ganaderas que pueden inducir heridas en los animales, como el esquileo.
Para evitar la presencia de la LPVM en los cortes umbilicales de terneros recin nacidos (34) y en los cortes
escrotales de terneros castrados (39) result eficaz una nica inyeccin subcutnea de ivermectin (200 g/kilo).
El ivermectin tambin evita la reapertura de cortes de heridas tratadas en ganado adulto. El tratamiento del
ganado con cpsulas de liberacin sostenida de ivermectin no desarroll miasis entre los 14 y los 102 das
despus del tratamiento. Sin embargo, debido a los efectos negativos sobre la fauna del estircol, se recomienda
404
que las cpsulas se reserven para utilizacin en casos de epidemias de LPVM. Los resultados iniciales sugirieron
que el ivermectin puede resultar ineficaz contra la LPNM (Mackley & Brown, en ref. 16), pero estudios ms
recientes han demostrado que produce un notable descenso en la incidencia de miasis umbilical y escrotal
debida a la LPNM (7, 26). Aunque los resultados de ensayos con ivermectin muestran variaciones, los resultados
con doramectin son mayoritariamente positivos (17). Se ha registrado un gran nmero de publicaciones que
describen que una inyeccin subcutnea de doramectin (200 g/kilo) fue efectiva al 100% como medida
profilctica contra la LPNM, evitando la infestacin de heridas artificiales, las heridas umbilicales y de castracin
en terneros, y la infestacin de ganado despus del parto, hasta 1214 das despus del tratamiento (4,30,31).
La eficacia depende de factores tales como la raza del ganado y el grado del estmulo. En un ensayo
comparativo de doramectin e ivermectin, inyectados ambos subcutneamente a 200 g/kilo, se obtuvo una
proteccin del 100% y del 50%, respectivamente, frente a miasis por LPNM experimentalmente inducida 2 horas
despus del tratamiento (29). Doramectin tambin produjo una proteccin completa despus de 21 das y parcial
(56%) a los 28 das del tratamiento (29). En otro estudio comparativo ms amplio, doramectin tuvo una eficacia
media de 94.6% (intervalo 53.3100%), en comparacin con el 43.7% (rango 0100%) de ivermectin (10). El
abamectin (por inyeccin subcutnea a 200 g/kilo) dio una buena prevencin, pero no del 100%, contra la
miosis por castracin debida a la LPNM (3). Frmulas mixtas de moxidectin, eprinomectin y doramectin dieron
una proteccin baja contra la miasis por LPVM en comparacin con frmulas inyectables de doramectin contra
LPNM (48). Hay algunas indicaciones de que el fipronil (un fenilpirazol) puede ser eficaz en la prevencin de la
miasis despus de la castracin. De modo similar, la aplicacin tpica de un regulador del crecimiento de los
insectos (IGR), el diciclanil, dio una buena proteccin (>90%) contra la miasis por la LPNM en heridas de ganado
castrado. Los IGRs son muy especficos de los insectos, y por tanto son menos peligrosos para el medio que
muchos otros grupos de insecticidas.
Para la prevencin indirecta de infestacin por moscas con larvas perforadoras se precisa lo siguiente: evitar la
produccin de heridas en la poca del ao en que las larvas son numerosas, el manejo cuidadoso del ganado
para minimizar las heridas, la eliminacin de objetos punzantes (como alambres de espino) de los corrales de
ganado, y la utilizacin de medidas para reducir otros parsitos causantes de heridas, particularmente
garrapatas, como por ejemplo, por inmersin en insecticidas o con marcadores impregnados de insecticida en las
orejas.
Para evitar la extensin de las larvas perforadoras ms all de los lmites actuales, es necesaria la observacin
estricta de los requisitos existentes para el mercado internacional, como se indica en el Cdigo Sanitario de
Animales Terrestres de la OIE.
1.
Resulta difcil la identificacin morfolgica de los huevos y el primer estado larval de los agentes de la miasis y,
debido a que raramente se encuentran estas fases durante la recogida de muestras en heridas infestadas, no se
consideran aqu con ms detalle.
Las larvas recogidas para el diagnstico deben tomarse de la parte ms profunda de la herida para reducir la
posibilidad de tomar especies distintas a las de las larvas perforadoras, que podran infestar las partes ms
superficiales de la herida. Las muestras vivas deben examinarse primero en cuanto a la pigmentacin de los
troncos traqueales dorsales (Figura 1) y luego deben conservarse en etanol al 80% antes de examinarlas en el
laboratorio en un microscopio de diseccin con hasta x50 aumentos (para tcnicas adicionales, ver refs. 12, 20,
37, 50). La conservacin ptima de las larvas en su estado natural extendido se logra matndolas por una breve
inmersin en agua hirviendo (15 segundos) antes de conservarlas en etanol al 80%.
Segunda fase larvaria: En la segunda fase las larvas tienen solo dos hendiduras espiraculares en cada una de
las placas espiraculares posteriores y tres en la tercera fase larvaria (Figuras 2 y 3). Las larvas de LPNM en
segunda fase se pueden diagnosticar por la presencia de pigmentacin obscura en los troncos traqueales
dorsales, sobre casi la mitad de la longitud del ltimo segmento. Otras especies tienen una pigmentacin de los
troncos traqueales dorsales menos extensa, por ejemplo, tales troncos estn pigmentados hasta no ms de un
tercio de su longitud en el segmento duodcimo de LPVM. Los espirculos anteriores de la segunda fase larvaria
de LPNM tienen de siete a nueve ramas en comparacin con las cuatro que presentan en la LPVM (22). Se
puede obtener una identificacin ms positiva criando larvas vivas inmaduras hasta la tercera fase larvaria. Esto
se hace en el medio estndar de carne utilizado para crecimiento a gran escala de LPNM antes de la
405
introduccin de dietas en gel, es decir, para un litro de agua, 1.3 Kg. de carne picada de caballo, 50 g de sangre
bovina seca, y 1.5 ml de formalina (44), mezclado y mantenido a 3538C en una humedad relativa del 70%. En
el caso de crecer larvas simplemente para identificacin, el tipo exacto de carne y de sangre no es esencial, y se
puede utilizar sangre fresca, que es ms fcilmente disponible, en lugar de la sangre seca.
Tercera fase larvaria: Tanto en la LPNM como en la LPVM, las larvas en la tercera fase larvaria tienen un
aspecto robusto tpico de gusano, con un cuerpo cilndrico de 617 mm de largo y 1.13.6 mm de dimetro,
afilado en el extremo anterior (23, 37). Las larvas completamente maduras de LPNM y LPVM desarrollan un
tenue color rosado frente al blanco cremoso de las larvas ms jvenes. Ambas especies de larvas perforadoras
tienen anillos prominentes de espinas alrededor del cuerpo y estas espinas aparecen como largas y llamativas
bajo el microscopio en comparacin con las de especies no perforadoras, siendo las ms largas de 130 m. Las
espinas en la LPNM pueden tener punta sencilla o doble, pero en la LPVM la punta siempre es sencilla. Cada
uno de los espirculos anteriores de LPNM tiene de seis a once ramas bien separadas, normalmente de siete a
nueve (Figura 2). En la LPVM, cada espirculo anterior tiene de tres a siete ramas, normalmente de cuatro a seis
(Figura 2). Este ltimo carcter no debe utilizarse como propio para identificar la LPVM, pues las larvas en la
tercera fase de la especie causante de miasis Wohlfahrtia magnifica (Diptera: Sarcophagidae), cuya distribucin
se superpone con la LPVM en el Oriente Medio, tiene espirculos con ramificacin similar. Por tanto, al utilizar
cualquier clave de identificacin, como la de la Figura 1, es esencial que cada muestra recorra toda la clave para
evitar identificaciones errneas. En la cara posterior del segmento terminal de la LPNM y de la LPVM, las placas
espiraculares posteriores tienen un peritremo incompleto y con pigmentacin obscura que encierra tres aberturas
rectas, con perfil ligeramente ovalado, que apuntan hacia el hueco en el peritremo. Estas caractersticas
diagnsticas se ilustran en la Figura 3. Los troncos traqueales dorsales son de mayor valor diagnstico, que se
extienden hacia delante desde las placas espiraculares posteriores y estn pigmentadas de negro hasta el
segmento dcimo o noveno en la LPNM (Figura 1; ver tambin las refs. 12, 14, 17, 20, 21, 37, 50 para claves de
identificacin). Esta caracterstica se ve ms fcilmente en larvas vivas. Las mantenidas en conservante pueden
requerir diseccin para extraer los tejidos opacos que tapan los troncos. Los troncos traqueales dorsales de la
LPVM solo estn pigmentados en el segmento duodcimo. Sin embargo, en la LPVM las trqueas secundarias
que se ramifican a partir de los troncos traqueales dorsales estn pigmentadas desde el segmento
decimosegundo hacia delante hasta el segmento dcimo al menos (confirmado en muestras de diversa
distribucin, de Malasia, Bahrain y Zimbabue; M.J.R. Hall, datos no publicados). Por el contrario, estas trqueas
secundarias no estn pigmentadas en la LPNM, y solo lo estn las trqueas dorsales. Por tanto, la pigmentacin
traqueal parece invertida en las dos especies de larvas perforadoras.
Adultos: Las moscas adultas necesarias para identificacin se suelen capturar utilizando trampas orientadas al
viento (8) y con trampas pegajosas (37) cebadas con una substancia olorosa sinttica, el swormlure4 (27). Para
fines de investigacin, se han usado sistemas de muestreo alternativos con mallas elctricas o superficies
adherentes en objetivos visuales cebados con olor (18). La identificacin de moscas adultas no suele ser
necesaria para el diagnstico de la miasis, ya que los estados larvarios son los ms aparentes a los propietarios
de ganado y al personal veterinario (4). No obstante, se incluye una breve descripcin.
i)
LPNM: La longitud del cuerpo suele ser de 810 mm y tiene un color metlico fuerte azulado o azul
grisceo, con tres bandas longitudinales obscuras en la superficie dorsal del trax. Esta combinacin de
color y bandeado no es compartida por ninguna otra especie normalmente implicada en las miasis de
heridas a excepcin de la larva secundaria perforadora del Nuevo Mundo, Cochliomyia macellaria
(Fabricius). Estas dos especies de Cochliomyia se pueden distinguir por la presencia de stulas negras en
las placas frontoorbitales de la cabeza de LPNM en comparacin con los escasos pelos amarillos que
presenta en dicha zona C. macellaria. El quinto terguito abdominal de la LPNM (el cuarto visible) tiene un
aspecto lateral muy ligeramente polvoriento mientras que el de C. macellaria presenta una densa carga de
suciedad que produce un par de manchas laterales distinguibles de aspecto blanco plateado. Adems, las
hembras de la LPNM tienen una basicosta obscura de tono negro marrn, que en C. macellaria es amarilla
(Figura 4; ver tambin las refs. 11, 14, 23, 37).
ii)
LPVM: El cuerpo mide hasta 10 mm de largo y tiene color metlico azul, azulverdoso o azulprpura, es
decir, es muy similar a la LPNM, pero sin las bandas torcicas. La escama alar inferior (s, en la Figura 4)
difiere de la de la LPNM en que est cubierta con pelos finos en su parte superior en la LPVM y otras
especies de Chhrysomya, mientras que en la LPNM carece de pelos, excepto en la base. Los adultos de la
LPVM se pueden distinguir de otras Chrysomya en casos de miasis por la combinacin de la presencia de
los espirculos torcicos anteriores que estn coloreados de marrn obscuro o naranja obscuro (en vez de
amarillo plido, color crema o blanco) y las escamas alares inferiores de color blanco creo (en vez de
marrn obscuro o gris sucio) (37, 50).
406
Extraer la larva de la herida y examinar la estructura superficial global
Larva peluda con salientes corporales llamativos
Larva lisa con bandas espinales no llamativas excepto en el

ltimo segmento
Chrysomya albiceps, C. rufifacies, C. varipes
Espirculos posteriores casi escondidos en una cavidad

profunda en la cara posterior del ltimo segmento
Espirculos posteriores no en cavidad sino expuestos en la

cara posterior del ltimo segmento
Sarcophagidae
Peritremo del espirculo posterior cerrado
Peritremo del espirculo posterior abierto
Muscidae y especies de Lucilia/Calliphora
Troncos traqueales dorsales con pigmentacin oscura desde

el segmento 12 al 10 o incluso hasta el 9
Troncos traqueales dorsales sin pigmentacin oscura excepto

posiblemente la mitad posterior del segmento 12
Cochliomyia hominivorax
Espirculo anterior con 46 lbulos, raramente con 7
Espiriculo anterior con 9 o ms lbulos
Chrysomya bezziana
Otras especies de Chrysomya, Cochliomyia, Phormia or

Protophormia
Fig.1. Clave de identificacin para el diagnstico del tercer estado larvario de Cochliomyia hominivorax y de
Chrysomya bezziana de casos de miasis de las heridas. Para evitar errores de clasificacin, es esencial que se use la
clave desde el principio con cada muestra.
407
as
Fig. 2. Cabeza y primeros dos segmentos torcicos del tercer estado larvario de Cochliomyia hominivorax (as =
espirculo anterior; el inserto es el espirculo anterior de Chrysomya bezziana).
Fig.3. caractersticas del tercer estado larvario de Cochliomyia hominivorax : (A) aspecto lateral de la larva completa;
(B) cara posterior del segmento terminal; (C) placa espiracular posterior; a = espirculo anterior; b = botn adyacente
a la abertura del peritremo; p = peritremo; sl = hendidura espiracular; sp = espinas). (Segn Laake et al. [23].)
p
Fig. 4. Caractersticas de Cochliomyia hominivorax en fase adulta; ntense las barras torcicas longitudinales; b =
basicosta; p = placa frontoorbital, vista desde arriba en la Cochliomyia hominivorax completa y lateralmente en la
cabeza de una mosca tpica de la familia Calliphoridae; s = escama alar inferior, con superficie sin pelo excepto en
la base; v = vena mayor con pelos en la superficie dorsal posterior.
408
Adems de las tcnicas morfolgicas estndar comentadas previamente, hay otras ms recientes para la
identificacin de las larvas perforadoras y de su origen geogrfico que incluyen el anlisis hidrocarbonado de la
cutcula (9), el anlisis del ADN mitocondrial (19, 25, 45), y el uso de la reaccin en cadena de la polimerasa para
amplificacin al azar del ADN polimrfico (RAPDPCR) (36). Los problemas de identificacin de larvas o adultos
en casos de miasis se pueden dirigir al Centro de Colaboracin sobre Insectos Causantes de Miasis y Su
2
Identificacin de la Organizacin para la Alimentacin y Agricultura (FAO) de las Naciones Unidas.
2.
Pruebas serolgicas
No existen en la actualidad pruebas serolgicas estandarizadas, ni estn indicadas para el diagnstico de la

enfermedad. Sin embargo, varios estudios experimentales han mostrado que las tcnicas serolgicas tienen un
valor potencial en futuras investigaciones sobre la prevalencia de las infestaciones de las larvas perforadoras en
las poblaciones animales, detectando los anticuerpos correspondientes despus de la infestacin (47).

Actualmente no se dispone de productos tales como vacunas. Sin embargo, estn en marcha investigaciones
sobre el desarrollo de vacunas potenciales (5) (43). El nico mtodo probado de erradicacin de la LPNM se
basa en una tcnica biolgica, la tcnica del insecto estril, SIT (16, 24), que tambin se ha aplicado
experimentalmente en el caso de la LPVM (41). En esta tcnica, se liberan al campo secuencialmente grandes
cantidades de moscas macho en su fase pupal ltima que han sido esterilizados por radiacin gamma. Cualquier
apareamiento con moscas hembra origina solo huevos que no son frtiles, originando una reduccin progresiva
de la poblacin y, eventualmente, su erradicacin. En situaciones operativas, la tcnica SIT se apoya con un
tratamiento con insecticidas de las heridas infestadas en el ganado por las larvas perforadoras, con el control
estricto del movimiento del ganado, con cuarentena de los animales infestados y con una campaa activa de
publicidad. La tcnica SIT resulta muy cara por el coste de la produccin continua y la dispersin area de las
moscas estriles. Histricamente, solo se ha considerado rentable cuando se utiliza como una estrategia de
erradicacin en situaciones donde la geografa puede favorecer tal programa (por ejemplo, referencias 13,24). En
la actualidad, solo existe una instalacin en el Nuevo Mundo para producir larvas perforadoras estriles, en
3
4
Tuxtla Gutierrez al sur de Mxico. Otra ser construida en Panam . En 1998 se abri una instalacin
experimental en Malasia para producir LPVM estriles.
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*
* *
412
CAPITULO 2.2.9.
TRIQUINELOSIS
RESUMEN
La infeccin que causa la Trichinella en los animales destinados a la alimentacin y los de caza es
importante debido al riesgo que dicha infeccin comporta para los humanos que consumen carne
cruda o poco cocinada. Los adultos de las especies de la Trichinella sobreviven menos de dos
meses y se pueden encontrar en el intestino delgado de los humanos, los cerdos, las ratas, los
osos, las morsas, y en cualquier otro mamfero carnvoro y ocasionalmente en caballos. Las larvas
de la mayora de los genotipos de la Trichinella se sitan en los tejidos musculares de sus
hospedadores y la ingestin de tejido que contenga dichas larvas, transmite la infeccin a los
individuos susceptibles.
Las pruebas de diagnstico para la infeccin por Trichinella se agrupan en dos tipos: 1) la
deteccin directa de la primera etapa de la larva enquistada o libre en tejido de msculo estriado,
y 2) la deteccin indirecta de la infeccin mediante pruebas para anticuerpos especficos. La
sensibilidad y especificidad de los mtodos serolgicos estn estrechamente relacionadas con el
tipo y la calidad del antgeno utilizados. En los cerdos se ha alcanzado un buen nivel de
validacin. Sin embargo, una respuesta serolgica en cerdos con indicios de infeccin moderada,
no se detecta comnmente hasta las 3 semanas o ms despus de que las larvas de los
msculos se hacen infectivas. En tales casos se podra obtener un resultado serolgico falso
negativo. Se ha descrito un ndice bajo de resultados falsos positivos en las pruebas serolgicas.
Con el fin de efectuar una inspeccin de la carcasa individual, slo pueden recomendarse los
mtodos directos. Para un seguimiento o verificacin de las manadas o regiones libres de
triquinas, son aceptables los mtodos serolgicos.
Identificacin del agente: Para detectar directamente la infeccin por Trichinella se utilizan dos
mtodos: el mtodo de compresin o el mtodo de digestin del tejido muscular. Ambos mtodos
prueban la presencia de parsitos en los tejidos donde la infeccin es ms fuerte, siendo la
incidencia de los mismos en los cerdos, de mayor a menor: en primer lugar sobre el diafragma,
luego la lengua, y, los msculos maseteros y abdominales, aunque esto depende en parte del
grado de infeccin. En los caballos, los msculos de la lengua y los maseteros hospedan la
mayora de las lombrices seguidos por el diafragma y los msculos del cuello.
El mtodo de compresin consiste en una inspeccin visual de piezas comprimidas de tejido
muscular para comprobar la presencia de las larvas in situ. Este mtodo se puede llevar a cabo
con un estreomicrospcopio, pero generalmente se utiliza un microcopio especializado como el
triquinoscopio que tiene una eficacia estimada de deteccin de como mnimo tres larvas por
gramo de tejido. Este mtodo tiene la desventaja de que requiere mucho tiempo para la
inspeccin de mltiples muestras de cada carcasa. Tambin es muy difcil detectar la larva de
T. pseudospiralis, T. papuae, y T. zimbabwensis de los cocodrilos africanos, que no estn
envueltas en colgeno. Por estas razones, la compresin no est recomendada en una inspeccin
rutinaria, pero es til para detectar medianas a grandes infecciones, cuando se necesita examinar
unos pocos animales y las instalaciones no estn preparadas para una prueba de digestin
artificial.
Los mtodos de digestin artificial incluyen la digestin enzimtica de muestras de tejido muscular
individuales o agrupadas, seguida de procedimientos de revisin selectiva, de filtracin y de
sedimentacin. Las muestras procesadas con estos mtodos se examinan microscpicamente
para comprobar la presencia de larvas. Los mtodos de digestin incluyen homogenizacin y
413
Captulo 2.2.9. Triquinelosis
agitacin mecnica, usndose una muestra de 1 g para cerdos y otra de 10 g para animales de
caza y caballos y tienen una eficacia de aproximadamente 3 larvas por gramo de tejido
examinado. Estos mtodos se recomiendan en la inspeccin individual de carcasas de cerdos,
caballos y animales de caza cuando su carne est destinada al consumo humano.
Pruebas Serolgicas: El enzimoinmunoensayo (ELISA) es el nico mtodo apropiado para la
deteccin antemortem de la infeccin por Trichinella y en los cerdos se han detectado niveles de
1 larva/100 g de tejido. La especificidad de ELISA para detectar la infeccin por Trichinella est
directamente relacionada con el tipo y la calidad del antgeno empleado en la prueba. Los
antgenos secretores que se han recogidos manteniendo in vitro por breve tiempo las larvas
T. spiralis del msculo y los antgenos carbohidratados sintticos, proporcionan actualmente la
fuente ms especfica y econmica, aunque en algunos estudios se han obtenido ndices bajos de
falsos positivos.
Se puede obtener un ndice bajo de resultados falsos negativos en un ELISA con animales
recientemente infectados que tienen un grado de infeccin bajo. Por esta razn se recomienda el
uso de antgenos secretores en un ELISA para programas de seguimiento pero no en pruebas de
carcasas individuales. Se recomienda la digestin de 100 g o ms de tejido como prueba
confirmatoria para animales serolgicamente positivos.
Requisitos para las vacunas y los materiales de diagnstico: La vacuna para la infeccin por
Trichinella no es prctica en animales destinados a la alimentacin. No se requieren reactivos
biolgicos en los mtodos directos de deteccin. En los mtodos indirectos (serolgicos) se deben
usar los antgenos TSL1 para garantizar la especificidad de la prueba. Estos antgenos pueden
obtenerse como productos secretores recuperados a partir del mantenimiento de las larvas del
msculo invitro o como antgenos carbohidratados sintticos producidos comercialmente.
A. INTRODUCCIN
La infeccin por Trichinella en animales destinados a la alimentacin es importante debido al riesgo de
triquinelosis en los humanos que comen carne cruda o poco cocida. Los adultos de Trichinella sp. se pueden
encontrar en el intestino delgado de los humanos, cerdos, ratas, osos, morsas y en cualquier otro mamfero
carnvoro, pero tambin puede afectar a los caballos, los pjaros y los cocodrilos. El parsito tiene un ciclo de
vida directo. Las hembras son ovovivparas. Las larvas se esparcen en las venas mamarias, entran en la
glndula linftica, alcanzan la sangre venosa y entonces muchas mueren, otras sobreviven establecindose en
los msculos estriados, especialmente los del diafragma y la lengua de los cerdos y la lengua y los msculos
maseteros de los caballos. Las larvas se enquistan en el tejido muscular y la ingestin del tejido que contiene
estas larvas transmite la infeccin a otro hospedador.
Se reconocen 8 especies de Trichinella (19, 23, 24). La Trichinella spiralis (tambin llamada T1) que se
distribuye en zonas templadas de todo el mundo y se asocia comnmente con cerdos domsticos. Es muy
infecciosa para los cerdos, ratones y ratas. La Trichinella nativa (T2) y sus subespecies, la Trichinella T6
encontrada en Norteamrica, es una especie adaptada a los climas fros. Es moderadamente infecciosa para los
cerdos, pero se encuentra comnmente en cnidos, osos y morsas. Adems se distingue por su resistencia a la
congelacin. La Trichinella britovi (T3) se encuentra principalmente en animales salvajes, aunque
ocasionalmente se pueda encontrar en cerdos o caballos. Se da en regiones templadas de Europa y Asia. La
Trichinella britovi y los genotipos con ella relacionados, Trichinella T8 de Sudfrica y Trichinella T9 de Japn,
tienen algunas caractersticas intermedias de otras especies, incluyendo una cierta resistencia a la congelacin,
infectividad moderada en los cerdos y formacin lenta de cpsulas (en algunos casos las larvas han sido
confundidas con especies no encapsuladas). La Trichinella murrelli (T5) es una especie de Norteamrica
encontrada en la fauna silvestre y ocasionalmente en caballos y en humanos. Es muy poco infectiva para los
cerdos domsticos, pero representa un riesgo para los humanos que comen carne de caza. Se ha aislado
Trichinella nelsoni (T7) espordicamente de la fauna silvestre de frica. Se caracteriza por su gran resistencia
a temperaturas elevadas comparada con otras especies de Trichinella. Tres especies de Trichinella no forman
cpsula de colgeno en el msculo. La Trichinella pseudospiralis (T4) tiene una distribucin cosmopolita y ha
sido recuperada de las aves de rapia, de los carnvoros salvajes y de los omnvoros, ratas y marsupiales, en
Asia, Norteamrica, Europa y el subcontinente Australiano. La Trichinella papuae (T10) es una segunda
especie que no forma cpsula. Hasta la fecha slo se ha descubierto en cerdos salvajes y en humanos de
Papua en Nueva Guinea. Es resistente a la congelacin, tiene poca infectividad para los cerdos y se encuentra
en una gran variedad de animales mamferos salvajes y ha sido sealada como causante de enfermedad en los
humanos. Recientemente se ha descubierto la Trichinella zimbabwensis (T11) en cocodrilos de granjas de
Zimbabwe. Las especies pueden infectar a los cerdos y a las ratas. Todas las especies y los genotipos de
Trichinella causan enfermedad en los humanos.
414
La triquinelosis en los humanos es una enfermedad seria que puede causar mucho sufrimiento y ocasionar la
muerte. Las lombrices pueden tener poco efecto en los intestinos, pero pueden ocurrir seales y sntomas
severos como resultado de la migracin de las larvas y su presencia en los msculos estriados. La enfermedad
se transmite por comer carne infectada que no ha sido suficientemente cocinada (o que sea segura por
cualquier otro procedimiento). Para prevenir la infeccin en los humanos es necesario inspeccionar la carne
procesndola (bien sea cocinndola, congelndola o curndola) y evitando el contacto de los animales
comestibles con carne infectada, incluyendo desperdicios de comida sin cocinar, con roedores y con otros
animales salvajes. La carne procedente de la caza debera considerarse siempre como una fuente potencial de
infeccin y, por tanto, dicha carne debe ser controlada o cocinada cuidadosamente. La Trichinella que se
encuentra en la carne procedente de la caza (principalmente la T. nativa, la T6 y, en menor grado, la T. britovi)
puede ser resistente a la congelacin y, por lo tanto, la carne congelada puede tambin representar un riesgo
para la salud pblica.
Los mtodos para detectar la infeccin por Trichinella en los cerdos y en otras especies pueden agruparse
segn dos tipos de resultado: (a) la demostracin directa del parsito en muestras de tejido o digesto; (b) la
demostracin indirecta del parsito mediante la deteccin de anticuerpos especficos usando los mtodos
serolgicos.
1.
Identificacin del agente (prueba prescrita para el comercio internacional)
La demostracin directa de los parsitos se limita a la inspeccin postmortem de las carcasas. La sensibilidad
de los mtodos de prueba directos depende de la cantidad de tejido examinado y del lugar del que se ha
obtenido la muestra. Los mtodos de prueba actuales mediante la digestin artificial en los que se utiliza una
muestra de 1 g (2, 3), tienen una sensibilidad de aproximadamente 3 larvas por gramo de tejido (9, 13);
utilizando una muestra de 5 g aumenta la sensibilidad a 1 larva por gramo de tejido. Los mtodos directos
permitirn la identificacin de cerdos, caballos u otros animales infectados en un plazo mnimo de 17 das
despus de la exposicin al parsito, intervalo que coincide con el tiempo necesario para que las larvas alojadas
en los msculos, adquieran la capacidad de infectar a un nuevo hospedador. Los mtodos directos continan
siendo efectivos siempre y cuando las larvas permanezcan viables. La sensibilidad de esta prueba aumenta
considerablemente cuando grandes cantidades de tejido (hasta 100 g) estn disponibles para la digestin. El
inconveniente de los mtodos de deteccin directa, en especial la triquinoscopia, radica en su larga y laboriosa
ejecucin.
Generalmente se utilizan dos mtodos para el diagnstico directo de la triquinelosis.
a)
Mtodo del triquinoscopio o de compresin.

El uso de la triquinoscopa para el examen de carne de cerdo ha sido descrito con anterioridad en otras
fuentes. (2, 3). Las muestras para esta prueba se toman de los pilares del diafragma y se trocean en al
menos 28 pedazos, de un tamao aproximado de 2 x 10 mm. cada uno. La lengua, los msculos
maseteros y los msculos abdominales son zonas alternativas para la extraccin del tejido, aunque se
necesitan muestras ms grandes para obtener una sensibilidad comparable. (Los sitios del msculo
preferidos por las larvas varan en funcin de las especies hospedadoras y slo se han establecido con
certeza en los cerdos y en los caballos. Por regla general, la lengua es uno de los msculos ms
infectados). Los tejidos se comprimen entre placas de vidrio (compresor de Hauptner Herberholz, Solingen,
Alemania) hasta que se vuelven translcidos. Es entonces cuando se pueden examinar en busca de larvas
utilizando un microscopio de proyeccin diseado especialmente a tal efecto, el triquinoscopio, aunque
tambin cabe usar un estreomicroscopio convencional a 1540 aumentos. La mayora de las larvas
aparecern enroscadas dentro de una fibra de msculo individual y la clula muscular tiene casi siempre
una forma ovalada debido a la formacin de la cpsula. En el caso de infecciones graves pueden
observarse mltiples larvas dentro de una sola clula.
Las Trichinella no encapsulada como la T. pseudospiralis, la T. papuae y la T. zimbabwensis de los
cocodrilos puede observarse fuera de las clulas musculares, que por lo general no estn enroscadas,
siendo muy difcil la identificacin de estas especies mediante la triquinoscopa. Debido a esta limitacin y
a su baja sensibilidad comparada con los mtodos de digestin artificiales, la triquinoscopa y los mtodos
de compresin similares no se recomiendan para el examen rutinario de la carne de animales destinados a
la alimentacin y de animales de caza.
415
b)
El mtodo de la digestin
El tejido muscular puede digerirse con fluido gstrico artificial liberando las triquinas vivas de los msculos.
En la Unin Europea (2, 3) se recomiendan los procedimientos digestivos, y pueden consultarse las
Directivas de la UE para ms detalles. Muchos otros pases tienen una legislacin similar para la
inspeccin postmortem de la carne de cerdo (8) y de caballo (4). La Comisin Internacional para la
Triquinelosis (ICT) tambin proporciona directrices generales sobre la aplicacin de los mtodos artificiales
de digestin.
El mtodo del agitador magntico para muestras agrupadas, ampliamente usado, puede emplearse en
gran nmero de circunstancias con un equipamiento mnimo. He aqu un esbozo general de los principios
de este mtodo:
Toma de muestras
Las muestras de msculo se toman de los pilares del diafragma o de la lengua de los cerdos, o de la
lengua o msculos maseteros de los caballos; por regla general, la lengua es uno de los msculos ms
infectados. Otras zonas tienen, por lo general, un nmero inferior de larvas. El tamao de las muestras
puede variar. Pueden tomarse muestras individuales de 100 g de un animal o se pueden recoger mltiples
muestras de varios animales para hacer un agrupamiento de 100 g. El tamao de las muestras que
componen este ltimo agrupamiento determinar la sensibilidad el mtodo. Las directivas de la UE exigen
muestras de 1g en agrupamientos de 100g para los ensayos con carcasas de cerdos. En los Estados
Unidos de Amrica (EE.UU.) se requieren muestras de 5g para los cerdos, y en Canad se ensayan 10 g
por cerdo. En el caso de zonas endmicas, la ICT recomienda utilizar un mnimo de 5g. Para pruebas con
carne de caballo, la UE exige muestras de un mnimo de 5 g. Para la carne de los caballos originarios de
zonas endmicas, se recomiendan muestras de 10 g. Para facilitar la digestin de las muestras es
necesario triturarlas, desmenuzarlas o cortarlas en dados antes de la prueba.
Digestin y recuperacin
Cada unidad de 100 g de tejido se digiere en 1 a 2 litros de fluido gstrico artificial, que contenga pepsina
al 1% (w/v) (concentracin 1/10.000 formulada por estndares nacionales) y cido clorhdrico al 1% (v/v)
(0,12 N final). Se introduce la muestra troceada o triturada en el fluido digestivo y se remueve la mezcla
con un agitador magntico a 37C durante 3 horas (o durante menos tiempo a temperatura superior (por
ejemplo, 3060 minutos a 4446C)). Al finalizar la digestin se deja sedimentar el producto de la digestin
durante 1520 minutos y a continuacin se decantan los dos tercios superiores del fluido. Se transfieren el
lquido restante y el sedimento a un vaso cnico de sedimentacin hacindolos pasar por una malla de
filtro de 355 m (177180 m tambin es aceptable) y se deja sedimentar durante otros 1520 minutos.
Transcurrido este tiempo se aspira el mximo volumen posible de sobrenadante, sin remover el sedimento:
se lava este ltimo con agua caliente del grifo a (37C) y se deja reposar por otros 1520 minutos. Esta
operacin de lavado se repite tantas veces como sea necesario hasta que el sobrenadante no muestre la
menor turbidez. Se transfiere entonces el sedimento lavado a un tubo de 50ml, se deja reposar y se
aspira el contenido hasta alcanzar un volumen final de 10 ml. Los 10 ml se vierten en una placa de Petri
con rejilla y se examinan para larvas Trichinella con un microscopio de diseccin (a 1540 aumentos).
Alternativamente, tras preparar la digestin en 3 litros de fluido gstrico artificial, se puede colar la
suspensin digestiva en un embudo de separacin con un tamiz (de 177180 m). Se enjuaga bien el
tamiz dentro del embudo de separacin con agua del grifo y se deja reposar la suspensin durante
30 minutos (5). Luego se cuelan 125 ml dentro del embudo de separacin de 500 ml, se le aaden 375 ml
de agua del grifo y se deja reposar la suspensin durante 10 minutos ms. Finalmente, se liberan de 22 a
27 ml de sedimento en una placa de Petri y se hace el recuento como se describi anteriormente. Este
mtodo tiene menos etapas, requiere menos tiempo y raras veces necesita fases posteriores de
clarificacin.
Una vez separadas por digestin de la clula muscular, las larvas de la primera fase del ciclo tienen aprox.
1 mm. de largo y 0,03 mm. de ancho. El rasgo ms caracterstico de las larvas de Trichinella es el
esticosoma, formado por una serie de clulas discoides que, dispuestas a lo largo del esfago, ocupan la
mitad anterior del cuerpo de la lombriz. Las larvas de Trichinella pueden aparecer enroscadas (a baja
temperatura), mviles (a temperatura templada) o en forma de una C (media luna) (cuando estn muertas).
En caso de duda, las lombrices deberan observarse con un mayor aumento y deberan examinarse ms
tejidos. Si el recuento es elevado, deber repetirse la prueba llevando antes la muestra a una dilucin
apropiada. Cuando se detecten larvas en muestras de digestin agrupadas, debe aplicarse el
procedimiento completo de digestin a cada una de las muestras individuales que integran la agrupacin
con el fin de identificar infecciones en las carcasas individuales.
El uso de una trituradora de tejido con control termosttico (Stomacher) reduce el tiempo de digestin a
unos 1215 minutos. Se han descrito (3) los detalles de otros mtodos que utilizan el Stomacher Lab
Blender 3500T (Seward Londres, Reino Unido) o los embudos separadores dobles (8), y tambin puede
416
recomendarse un protocolo alternativo para aplicar el mtodo del agitador magntico para muestras
agrupadas, aprobado por la Unin Europea (84/319/EEC).
Garanta de calidad en la prueba de digestin
Los laboratorios que utilicen mtodos de digestin artificial deben mantener un sistema de garanta de
calidad apropiado para garantizar la sensibilidad de la prueba. Los componentes de un sistema de garanta
de calidad para la prueba de digestin estn descritos por la Comisin Internacional para la Triquinelosis
(12) y en otros lugares, y deben incluir el uso regular de paneles de suficiencia.
c)

La identificacin de las especies o tipos de Trichinella recuperadas del tejido muscular puede ser til para
entender la epidemiologa de los parsitos en animales y para evaluar el riesgo relativo de la exposicin
humana. Se han desarrollado sondas genmicas (cebadores) especfico(a)s que permiten la diferenciacin
de todas las especies conocidas y genomas de la Trichinella por medio de la reaccin en cadena de la
polimerasa (PCR) (1, 25). La solicitud para aislar un tipo especial de la Trichinella puede hacerse a travs
del Laboratorio de Referencias de la OIE en Roma, Italia, y en Saskatoon, Canad (vase cuadro en la
Parte 3 del Manual Terrestre).
Algunos estudios de alcance limitado han demostrado que la PCR puede usarse para detectar larvas en la
musculatura de los animales infectados (26). Sin embargo, esta tecnologa, en su forma actual, no es un
mtodo prctico para las pruebas rutinarias con animales destinados al consumo humano.
2.
Pruebas serolgicas
El uso del enzimoinmunoensayo (ELISA) para detectar la presencia de los anticuerpos especficos de parsitos
es un mtodo rpido que puede realizarse en sangre o en suero recogido antes o despus del sacrificio. Se han
detectado en cerdos (11) niveles de infeccin muy bajos, de una larva por 100 g de tejido, mediante ensayos
ELISA. Este alto nivel de sensibilidad hace de la prueba serolgica mediante el ensayo ELISA un mtodo til
para la deteccin de la transmisin de la infeccin por Trichinella en las granjas o para los programas de
seguimiento ms amplios.
Una desventaja de la serologa en la deteccin de la infeccin por Trichinella es la incidencia de una tasa baja
de resultados negativos falsos en el caso de animales infectados. Tales resultados se deben a un desfase en la
cintica de las respuestas de los anticuerpos en los animales ligera o moderadamente infectados por la
T. spiralis o por las especies de la Trichinella silvestre. Esta baja tasa de produccin de anticuerpos significa que
los animales infectados no pueden detectarse hasta 35 semanas despus de la exposicin (9, 13). Por esta
razn, las pruebas serolgicas no son recomendables en las pruebas con carcasas individuales.
Las respuestas serolgicas persisten en los cerdos durante al menos 6 meses despus de la infeccin sin
interrupcin o disminucin (9); sin embargo, se han detectado la disminucin de anticuerpos en los caballos a
los pocos meses de la infeccin, coincidiendo con una disminucin de las larvas en los msculos (20). De este
modo, la evaluacin serolgica de la Trichinella en caballos puede no tener valor dado que los caballos que
hospeden cientos de larvas por gramo de tejido muscular pueden mostrar una serologa negativa. Es poco lo
que conoce acerca de las respuestas de los anticuerpos a la infeccin por Trichinella en especies de caza. La
calidad de las muestras de suero de los animales de caza es de gran importancia para evitar reacciones
positivas falsas.
Se han desarrollado varias preparaciones de antgenos que proporcionan un alto grado de especificidad para la
infeccin por Trichinella en cerdos y caballos (11, 16, 24). En las pruebas de matadero, el ensayo ELISA arroj
menos de un 0.3% de resultados positivos falsos y cerca de un 100% de sensibilidad en la deteccin de cerdos
infectados con ms de 1 larva por gramo de tejido. (21). Los antgenos secretores (ES) de la T. spiralis usados
en el ensayo ELISA se conservan en todos los tipos de la Trichinella (22) y, por tanto, la infeccin puede
detectarse en cerdos o en otros animales que hospedan alguna de las ocho especies. Otras pruebas
serolgicas distintas al ensayo ELISA (por ejemplo, las pruebas de inmunoflorescencia) carecen de
especificidad y no son adecuadas para la deteccin de la infeccin por Trichinella.
Enzimoinmunoensayo
La diagnosis de la infeccin por Trichinella mediante el ensayo ELISA puede realizarse usando antgenos
de esticosomas secretados que se han tomados de las larvas de T. spiralis (11). Los antgenos
reconocidos en las secreciones de las lombrices constan de un grupo de glicoprotenas estructuralmente
417
relacionadas con pesos moleculares de 4555 kDa (14, 22). En el ensayo ELISA tambin se ha utilizado
un antgeno de carbohidrato sinttico (antgeno sinttico carbohidratado), pero este antgeno no est
disponible fcilmente y ha demostrado una sensibilidad ms baja.
Produccin de antgeno
La especificidad y sensibilidad del ensayo ELISA depende en gran medida de la calidad del antgeno
utilizado en la prueba. Los antgenos reconocidos por los animales infectados por Trichinella son los
especficamente secretados de las clulas de esticocitos de las larvas vivas L1 y sostienen (soportan) el
eptopo carbohidratado TSL1. Las especies de Trichinella normalmente usadas en las preparaciones de
antgeno son la T. spiralis o la T1. A efectos de estandarizacin, es recomendable que estas especies
sean utilizadas en los ensayos ELISA aplicados a la carne de animales destinada al consumo. Sin
embargo, se ha demostrado que el antgeno preparado de cualquier otra especie de la Trichinella puede
usarse para la deteccin de anticuerpos en animales infectados independientemente cul sea la especie
que produce la infeccin (18). Los parsitos que van a usarse en la preparacin de antgeno deben ser
mantenidos por pases en serie en ratones y ratas
Para preparar el antgeno que va a ser usado en ensayos ELISA (16), se recuperan las larvas de T. spiralis
(T1) en estadio muscular de las carcasas de ratones de campo o ratas sin piel ni vsceras mediante
digestin en pepsina al 1% con HCI al 1% a 37oC durante 3 horas (como se describe arriba). Se lavan las
larvas (3 veces durante 20 minutos cada vez) en medio Eagle modificado por Dulbecco (DMEM) con
penicilina (500 units/ml) y estreptomicina (500 unidades/ml). Luego se colocan (a una densidad de
5.000 L1/ml) en DMEM suplementado con HEPES (hidroxietilpiperazina N2, cido etanesulfnico N2)
(10mM), glutamina (2mM), piruvato (1mM) y penicilina (250 unidades/ml) / estreptomicina (250 g/ml)
(DMEM completo) a 37C en 10% CO2 en aire. El medio de cultivo se recupera despus de 1820 horas,
se retiran las lombrices por filtracin y el fluido se concentra a presin mediante una membrana de
retencin de un peso molecular de 5.000 Da. Los antgenos secretores (ES) as recuperados pueden
almacenarse congelados por cortos perodos a 20C o por ms tiempo a 70C; estos antgenos
contienen aproximadamente 25 componentes proteicos segn SDS/PAGE (sulfato dodecil de sodio /
electroforesis en gel de poliacrilamida), muchos de los cuales admiten la diagnosis del eptopo de antgeno
de carbohidrato TSL1.
La calidad del antgeno es fundamental para la especificidad del ensayo ELISA. Deben seguirse varios
pasos para monitorizar el crecimiento de las bacterias, bien sea de forma visual con el microscopio o
recubriendo una muestra de medio. Los cultivos que muestren cualquier crecimiento bacteriano deben ser
desechados. Las larvas no deberan mantenerse ms all de 20 horas; el deterioro de las lombrices
despus de este tiempo contribuye al escape de antgenos somticos que reducen la especificidad de la
prueba. Los antgenos producidos en la forma descrita deberan tener una gama (ratio) de absorbancia
280:260 nm de >1.0. Los antgenos obtenidos a partir del mantenimiento invitro de las larvas de la
Trichinella deben ensayarse frente a un panel de sueros positivos y negativos conocidos.
Ms adelante se da un ejemplo de un ensayo ELISA para detectar la infeccin por Trichinella en cerdos. Es
esencial que todos los reactivos usados en el ensayo estn estandarizados para una concentracin ptima
con el fin de obtener resultados fiables. Los valores tpicos se indican en el ejemplo.
418
i)
Se cubre la placa de microtitulacin de 96 pocillos con 100 l de antgenos ES de T. spiralis diluidos a

5 g/ml en agua tamponada (50 mM de carbonato/bicarbonato tamponado, pH 9,6). Se realiza la
cobertura durante 60 minutos a 37C o toda la noche a 4C.
ii)
Se lavan tres veces los pocillos cubiertos con antgeno en tampn de lavado que contenga 50 mM
Tris, pH 7.4, 150 mM NaCl, 5% de leche en polvo desnatada y 1,0% de Triton X100. Despus de
cada lavado, las placas se deben secar.
iii)
Diluir a 1/10 o 1/100 suero de cerdo en tampn de lavado. Las fuentes alternativas de anticuerpos
que pueden usarse en lugar de los sueros son, entre otros, la sangre total o los fluidos de tejidos.
Agregar 100 l de suero diluido a los pocillos cubiertos con antgeno. Debe usarse en cada placa una
muestra de suero positivo conocida y una muestra de suero negativo conocida con una dilucin
idntica a la de los sueros de la prueba. Se incuban a temperatura ambiente durante 30 minutos.
iv)
Lavar tres veces los pocillos como en el apartado ii.
v)
Aadir a cada pocillo 100 microlitros de una IgG (inmunoglobulina G) contra cerdo obtenida en
conejo, purificada por afinidad y conjugada con peroxidasa a una dilucin apropiada en tampn de
lavado, por ejemplo, una dilucin 1/1.000 de IgG de conejo contra cerdo (0,1 mg/ml) producido por
Kirkegaard and Perry Laboratories, Gaithersburg, Maryland, EE.UU. Tras aadir el segundo
anticuerpo, incubar las placas durante 30 minutos a temperatura ambiente.
vi)
Lavar tres veces los pocillos como en el apartado ii. y enjuagarlos una vez con agua destilada.
vii)
Aadir 100 l de un sustrato de peroxidasa apropiado (por ejemplo, cido aminosaliclico5 [0,8
mg/ml] con 0,005% de hidrgeno de perxido, pH 5,66,0).
viii) Despus de 515 minutos, leer las placas para ver la densidad del color a 450 nm en un lector de
microtitulacin automtico. Los valores obtenidos de los ensayos ELISA, que son cuatro veces
superiores a los de los controles agrupados de suero normal, se consideran positivos. Los valores
tres veces mayores que los normales se consideran sospechosos. Sin embargo el valor de corte est
determinado por la raza del cerdo.
Existen adaptaciones comerciales del ensayo ELISA en formato ms corto, necesitndose menos de una
hora para su realizacin.

No es prctica una vacuna para la infeccin por Trichinella en animales destinados al consumo. No existen
productos biolgicos establecidos para mtodos de deteccin directa. Para mtodos indirectos (serolgicos)
debe usarse antgenos TSL1 para garantizar la especificidad de la prueba. Estos antgenos pueden obtenerse
como productos secretores recuperados mediante el mantenimiento de las larvas del msculo invitro (las
larvas del msculo se obtienen inicialmente ex vivo) o como antgenos de carbohidrato sintticos producidos
comercialmente.
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*
* *
NB: Existen laboratorios de referencia de la OIE para la Trinquinelosis (vase Cuadro en la Parte 3 de este
Manual de animales terrestres o consulte la pgina Web de la OIE para una lista ms actualizada: www.oie.int).
420
CAPTULO 2.2.10.
FIEBRE Q
RESUMEN
La fiebre Q (del ingls Query, interrogante) es una zoonosis presente en la mayora de los pases.
El hombre adquiere la infeccin a partir de los animales, en especial de los rumiantes domsticos.
La fiebre Q es una enfermedad muy infecciosa debida a la multiplicacin de Coxiella burnetii, una
bacteria pequea y pleomrfica que mide 0.3-1.5 m de largo por 0.2-0.4 m de ancho. Como se
trata de una bacteria estrictamente intracelular, C. burnetii slo puede crecer en huevos
embrionados o cultivos celulares o, cuando resulta necesario, en animales de laboratorio
inoculados. Se presenta en dos formas antignicas: la fase patgena I, que se encuentra en
animales infectados o en el hombre, y la fase avirulenta II, que se obtiene por pases repetidos en
huevos embrionados o en cultivos celulares. Debido a que este microorganismo es
extremadamente peligroso, el manejo de C. burnetii viable debe llevarse a cabo en servicios que
cumplan los requisitos de la OIE para patgenos del Grupo 3 de Contencin.
En el hombre, la fiebre Q se presenta como una forma aguda (episodio febril autolimitado,
neumona, hepatitis) o como una forma crnica grave (endocarditis) despus de una infeccin
inicial que puede pasar desapercibida. La forma aguda se resuelve rpidamente despus de una
terapia antibitica adecuada, pero la manifestacin crnica requiere una terapia antibitica
prolongada (durante 2 aos o ms), junto a un seguimiento serolgico. En algunos pases, se
dispone de vacuna para grupos de poblacin potencialmente expuestos por motivos profesionales.
En el ganado, los sntomas de la fiebre Q incluyen aborto, descendencia muerta o debilitada,
retencin placentaria, metritis e infertilidad. En los pequeos rumiantes, la fiebre Q est a menudo
asociada a abortos espordicos o a brotes de abortos seguidos de una recuperacin sin
complicaciones. La infeccin por Coxiella burnetii persiste durante varios aos, y probablemente
dura toda la vida. Las ovejas, cabras y vacas son mayoritariamente portadores asintomticos, pero
pueden liberar cantidades masivas de bacterias en el parto, y de forma intermitente en varias
secreciones y excreciones. Algunos animales domsticos, como gatos, conejos, pjaros, etc.,
tambin son susceptibles a la infeccin y deben considerarse como fuentes potenciales de
infeccin para los animales y el hombre.
Identificacin del agente: Para el diagnstico laboratorial, se pueden tomar muestras de la
placenta, de descargas vaginales y del hgado, pulmones o contenido del estmago de fetos
abortados, o de la leche, calostro o heces.
La bacteria se puede visualizar por tincin en frotis de tejidos mediante un microscopio con objetivo
de inmersin. Debido a que es alcohol-cido resistente, se puede teir por diversos mtodos: el de
Stamp, el mtodo modificado de Ziehl-Neelsen, el de Gimenez, el mtodo de Giemsa, o el mtodo
de Koster modificado. Esta deteccin constituye una evidencia presuntiva de fiebre Q, pero unida
con pruebas serolgicas, datos clnicos, y otros agentes infecciosos abortivos, puede ser suficiente
para establecer un diagnstico de la enfermedad a nivel del rebao o de la explotacin.
En la actualidad, se considera que la demostracin del agente por inmunohistologa usando
anticuerpos especficos o por la reaccin en cadena de la polimerasa (PCR) resulta ms especfica
y sensible que los mtodos clsicos de tincin. Sin embargo, no existen anticuerpos especficos
para inmunoqumica que estn disponibles a nivel comercial, y la tcnica de PCR requiere
laboratorios convenientemente equipados. La PCR constituye una prueba til para diagnosticar
gran nmero de muestras y varios tipos de muestras. Adems, las muestras se pueden inactivar
por calor, con la consiguiente seguridad para el personal de laboratorio.
421
Captulo 2.2.10. Fiebre Q
Coxiella burnetii se puede aislar por inoculacin de muestras en cultivos celulares convencionales
o en le saco vitelnico de huevos embrionados o en animales de laboratorio. La inoculacin en
animales de laboratorio (cobaya, ratn, hmster) es til en casos en que se requiere el aislamiento
a partir de tejidos contaminados con varios microorganismos o para obtener los antgenos de
Coxiella en fase I.
Pruebas serolgicas: A menudo el diagnstico de la fiebre Q se apoya en la serologa. Se
pueden usar varias pruebas, en particular la prueba de inmunofluoresecencia indirecta, el
enzimoinmunoensayo, y la prueba de fijacin de complemento. Actualmente, hay pruebas
comerciales disponibles que permiten la deteccin de anticuerpos anti-C. burnetii en fase II. La
presencia de anticuerpos IgG especficos representa una evidencia de una exposicin a C. burnetii
reciente o pasada.
Requisitos para las vacunas y los materiales de diagnstico: Se han
vacunas inactivadas contra la fiebre Q, pero slo aquellas que contengan C.
estn preparadas a partir de ella deben considerarse protectoras. En
infectadas, se recomienda una vacunacin anual repetida, particularmente
animales jvenes.
desarrollado varias
burnetii en fase I o
reas densamente
en el caso de los
En Eslovaquia hay una vacuna inactivada de fase I que est disponible comercialmente. Un
estudio reciente ha demostrado su eficacia respecto al aborto y a la diseminacin de C. burnetii en
cabras gestantes que fueron vacunadas experimentalmente y luego infectadas, pero no existe
informacin sobre su seguridad.
A. INTRODUCCIN
La fiebre Q tiene una amplia distribucin por todo el mundo excepto Nueva Zelanda. Aunque la fiebre Q est
prcticamente presente en todo el reino animal, incluyendo los artrpodos, la enfermedad afecta sobre todo al
hombre, al ganado bovino, ovino y caprino (18, 21). El agente etiolgico, Coxiella burnetii, es una bacteria gramnegativa estrictamente intracelular, adaptada para desarrollarse en el interior del fagolisosoma del fagocito.
Histricamente se ha clasificado dentro de la familia Rickettsiaceae; sin embargo, investigaciones filogenticas
basadas principalmente en el anlisis de la secuencia del ARN ribosomal 16S indican que el gnero Coxiella est
distante del gnero Rickettsia en la subdivisin alfa de las Proteobacterias (49). Ahora Coxiella burnetii se sita
en la familia Coxiellaceae en el orden Legionellales de la subdivisin gamma de las Proteobacterias (17).
Recientemente se ha logrado la secuenciacin completa del genoma de C. burnetii y se confirma su posicin
sistemtica (38). A diferencia de las rickettsias, C. burnetii origina una forma semejante al esporo, pequea,
densa y muy resistente, que es muy estable en el medio ambiente, una caracterstica importante para su
transmisin (22). Esta capacidad se ha atribuido a la existencia de variantes en el ciclo de desarrollo de C.
burnetii: variantes con clulas grandes (LCV), variantes con clulas pequeas (SCV) y clulas pequeas densas
(SDC) (10,39). Las variantes SDC y SDV representan las formas de la bacteria con mayores posibilidades para
sobrevivir extracelularmente como partculas infecciosas. Otra caracterstica esencial es que C. burnetii tiene dos
formas antignicas: la fase I patgena, aislada de animales o humanos infectados, y la fase II avirulenta,
obtenida in ovo o in vitro. Durante los pases en serie ocurre un cambio en el LPS (lipopolisacrido): las clulas en
fase I, que contienen cadenas O de una longitud completa en el LPS, cambian a fases intermedias disminuyendo
la longitud de las cadenas O del LPS y luego a fase II, con un LPS incompleto. La variacin de fase del LPS se
acompaa de una deleccin cromosmica permanente que hace imposible la reversin celular de fase II a fase I.
La fiebre Q es una zoonosis. En humanos la infeccin presenta una forma aguda y una forma crnica (29). En
general, las formas agudas incluyen un episodio febril autolimitado, neumona y hepatitis granulomatosa. La
manifestacin clnica principal de la fiebre Q crnica es una endocarditis en pacientes con valvulopatas. Las
complicaciones de la forma aguda pueden ser graves o fatales en ausencia de un tratamiento adecuado con
antibiticos (6). Adems, la infeccin por C. burnetii puede provocar inflamacin de la placenta y a menudo
acarrea nacimientos prematuros, limitaciones del crecimiento, aborto espontneo o muerte fetal en las mujeres
embarazadas (27). La infeccin es endmica en muchas reas originando casos espordicos o epidemias
explosivas. Su incidencia es posiblemente mayor que la descrita. La epidemiologa de la fiebre Q sugiere que la
infeccin probablemente se transmite por la inhalacin de partculas desecadas de aerosol, y a travs del
contacto con animales infectados y sus tejidos reproductores (20, 21). A menudo se ha sugerido la ingestin, en
particular a travs del consumo de productos lcteos derivados de leche sin procesar, e incluso posiblemente
despus de ser pasteurizada (9, 29, 44). La fiebre Q se transmite muy raramente de persona a persona; sin
embargo, esto es posible por contagio durante el nacimiento, a travs de transmisin sexual o por transfusin
sangunea (23). En los animales puede ocurrir una transmisin vertical y sexual, adems de a travs de las rutas
respiratorias y digestivas (16,47). Los artrpodos, sobre todo garrapatas, pueden estar implicados en la
transmisin de la fiebre Q.
422
En vacas, ovejas y cabras, la fiebre Q se ha asociado fundamentalmente con abortos tardos y con desrdenes
tales como nacimientos prematuros, muerte o debilidad de las cras, metritis e infertilidad (18). Sin embargo, las
respuestas serolgicas en una especie determinada o incluso el aislamiento de C. burnetii no se correlacionan
necesariamente con la expresin de la enfermedad clnica (11, 18, 35). El agente puede persistir en los animales
infectados, eliminarse intermitentemente a travs de la leche, las heces y la orina, y estar presente en la sangre.
Puede recuperarse en grandes cantidades en los productos del parto (placenta, lquido amnitico y feto), y los
animales no grvidos representan menor riesgo. Se considera que los reservorios principales de C. burnetii son
los rumiantes domsticos, pero tambin se ha descrito que los gatos, perros, conejos, pjaros, etc., pueden
eliminar el germen involucrndose en la contaminacin humana (14, 20, 21, 42). Por tanto, los animales
domsticos y silvestres infectados normalmente liberan el agente sin signos visibles de enfermedad, y deberan
considerarse como posibles fuentes de infeccin para el hombre.
Con frecuencia, se ha investigado el aborto en rumiantes para determinar si se trata de fiebre Q, ya que puede
afectar a la salud humana y a la de otros animales. A estos efectos, el diagnstico de la fiebre Q, y de otras
enfermedades abortivas, cuando se realiza sobre datos de microscopa de muestras clnicas, y se complementa
con resultados serolgicos positivos, suele ser normalmente adecuado (18, 32, 34). El diagnstico de la fiebre Q
tambin resulta necesario para anlisis epidemiolgicos de poblaciones "de riesgo" o sospechosas en reas
limitadas (despus de brotes recientes en el hombre o en animales), o con fines comerciales de exportacin. No
obstante, en la actualidad no se lleva a cabo la identificacin de eliminadores de C. burnetii ni de portadores
asintomticos (2).
Cuando varios animales resultan seropositivos, se recomienda por lo general una intervencin adecuada. Las
medidas se pueden adaptar al contexto epidemiolgico y de seroprevalencia concreto. Se debe asegurar una
pasteurizacin correcta de los productos lcteos (44). Usando leja al 10%, se puede reducir la cantidad de
agente en el medio con una limpieza regular y la desinfeccin de las instalaciones animales, teniendo un cuidado
particular en las reas de parto. Los animales gestantes deben mantenerse en corrales separados, y las
placentas y fetos abortados deben retirarse rpidamente y eliminarse de modo apropiado para evitar su ingestin
por perros, gatos o animales silvestres. Debe evitarse la dispersin del estircol de granjas contaminadas por
reas suburbanas y por jardines. Aunque no est evaluada la eficacia de la inactivacin de C. burnetii mediante
fermentacin por compostaje o por descontaminacin mediante tratamiento qumico (como por ejemplo con 0,4%
de cianamida clcica o con cal), estos mtodos son todava recomendables. Para adquirir y mantener una
poblacin de animales libres de fiebre Q, se debe reducir la introduccin de animales, el reagrupamiento de
rebaos, el contacto con animales silvestres y la infestacin por garrapatas. Aunque se han desarrollado vacunas
contra la fiebre Q animal, en la mayora de los pases no estn disponibles comercialmente.
Finalmente, es importante recordar que C. burnetii es muy peligrosa para el hombre, y que las infecciones en el
laboratorio son frecuentes. Debido a su baja dosis infectiva, su resistencia ambiental, y la ruta de transmisin por
aerosoles, se considera a C. burnetii como un agente potencial de bioterrorismo (5). Deben tomarse
precauciones adecuadas con este agente de grupo de riesgo 3. Los cultivos vivos o el material contaminado de
animales infectados deben manejarse solamente en instalaciones que cumplan los requisitos para patgenos del
Grupo de Contencin 3 que se indican en el Apndice I.1.6.1. del Captulo I.1.6. Seguridad humana en los
laboratorios veterinarios de microbiologa.
1.
Se puede evidenciar Coxiella burnetii de varios modos, dependiendo del tipo de muestra y el propsito del
diagnstico (6, 32, 34). Las muestras deben tomarse tan pronto como se pueda de los fetos abortados, de la
placenta, y de las descargas vaginales, despus del parto o del aborto. Tambin se pueden tomar muestras de
los tanques de leche, de la leche individualizada o del calostro, y de las heces.
a)
Tincin
En caso de sospechar que un aborto est causado por infeccin, se preparan frotis del cotiledn de la
placenta sobre portas para microscopa (33). Del mismo modo puede usarse el contenido del pulmn,
hgado o rumen de los fetos abortados o las descargas vaginales. Estas muestras se tien siguiendo
mtodos rpidos: el de Stamp, el mtodo modificado de Ziehl-Neelsen, el de Gimenez, el de Giemsa, el de
Machiavello y el mtodo de Koster modificado (8, 26, 32, 33, 35). Por ejemplo, el mtodo de tincin de
Stamp, que es muy similar al de Ziehl-Neelsen modificado, se realiza con una solucin de fucsina bsica al
2%, seguida de una decoloracin rpida con una solucin de cido actico al 0,5%, y haciendo una tincin
de contraste con una solucin de azul de metileno o de verde malaquita al 1%. Los frotis se examinan
microscpicamente con objetivo de inmersin (x500 o ms aumento). Coxiella burnetii se caracteriza por la
presencia de un nmero muy grande de pequeas bacterias teidas de rosa en forma de cocobacilos
423
destacando sobre un fondo azul o verde. A veces son difciles de detectar debido a su pequeo tamao
(0,3-1,5 m de largo x 0,2-0,4 m de ancho), pero esto se compensa por su gran nmero; a veces aparecen
dentro de la clula hospedadora inclusiones como manchas rojizas en un fondo azul o verde. Se debe tener
cuidado en la interpretacin de los resultados, ya que se puede confundir microscpicamente C. burnetii
con Chlamydophila abortus o con Brucella spp. Sin embargo, usando el mismo proceso de tincin,
Chamydophila tiene perfiles ms definidos, son clulas ovales, pequeas y pueden parecer glbulos. Las
clulas de Brucella son ms grandes (0,6-1,5 m de largo x 0,5-0,7m de ancho), ms claramente definidas
y se tien ms intensamente. Se deben de usar portas con controles positivos de C. burnetii, Chlamydophila
abortus y Brucella para comparacin. El diagnstico realizado por microscopa, junto a resultados
serolgicos positivos, suele ser adecuado a efectos rutinarios (34). Cuando la tincin biolgica no resulta
concluyente, se debe usar algn otro mtodo (ver ms adelante) como prueba confirmativa.
b)
Mtodos de deteccin especfica

Tambin se puede realizar la deteccin de C. burnetii en muestras por inmunodeteccin especfica
(enzimoinmunoensayo de captura [ELISA], inmunohistoqumica) o por amplificacin del ADN (4, 6, 45). La
inmunohistologa se puede hacer con tejidos incluidos en parafina o en frotis fijados con acetona (28). El
mtodo consiste en una inmunofluorescencia indirecta o en un ensayo con inmunoperoxidasa usando
anticuerpos policlonales frente a C. burnetii, procedentes de un antisuero bien caracterizado de origen
humano o de un antisuero especfico producido en animales de laboratorio (conejo o cobaya). Para
visualizar la bacteria se usa luego un conjugado anti-IgG obtenido en otra especie (hombre, conejo o
cobaya), que est marcado con isotiocianato de fluorescena (FITC) o con peroxidasa. Se debe disponer
para comparacin de portas con preparaciones positivas de antgeno de C. burnetii. No existen anticuerpos
especficos para inmunoqumica a nivel comercial. En la actualidad se estn desarrollando varios mtodos
basados en la reaccin en cadena de la polimerasa (PCR), y la PCR se ha usado con xito para detectar
ADN de C. burnetii en cultivos celulares y en muestras biolgicas. Como es probable que el nmero de
clulas de C. burnetii sea menor en la leche, en el calostro o en las heces que en el material derivado de
abortos, la PCR se puede usar para analizar esta gran diversidad de muestras (2). Esta tcnica puede
realizarse en laboratorios con equipamiento adecuado utilizando cebadores derivados del gen IS1111, el
ms ampliamente usado, que codifica una transposasa (nmero de acceso M80806) (2). En el genoma
estn presentes al menos 19 copias de este gen (12). Los otros genes que pueden ser usados como diana
en la PCR especfica para C. burnetii son: el gen de la superxido dismutasa (sodB) (nmero de acceso
M74242); el gen com1, que codifica una protena de 27 kDa de la membrana externa (nmero de acceso
AB004712); y el opern de choque trmico que codifica dos protenas de choque trmico (htpA y htpB)
(nmero de acceso M20482). La PCR en tiempo real, de reciente desarrollo, supone un medio adicional de
deteccin y cuantificacin (43). Existe una necesidad urgente de desarrollar un mtodo molecular para
determinar la viabilidad bacteriana, especialmente en muestras de leche. El desarrollo de una PCR mltiple
constituye otro autntico desafo para ensayar todos los agentes infecciosos abortivos.
c)
Aislamiento del agente

Para determinadas investigaciones de laboratorio, puede ser necesario aislar el agente. Cuando el examen
microscpico revela un gran nmero de clulas de C. burnetii y un bajo nivel de contaminacin con otras
bacterias, es posible el aislamiento directo por inoculacin de huevos de gallina embrionados o de cultivos
celulares (11). Por ejemplo, se homogeniza una porcin de la placenta en solucin salina tamponada con
fosfato (PBS) que contenga antibiticos (100-200 g/ml de estreptomicina y 50-100 g/ml de penicilina o
gentamicina). Despus de centrifugar a baja velocidad, se inoculan diluciones del sobrenadante en huevos
de gallina embrionados de 5 das a travs del saco vitelino. Preferiblemente, los huevos deben ser de
gallinas libres de patgenos especficos (SPF). Los embriones que mueren durante los primeros 5 das
despus de la inoculacin se desechan. Los sacos vitelinos se recogen despus de 10-15 das de
incubacin. Los frotis del saco vitelino teidos se examinan para comprobar la ausencia de contaminacin
bacteriana y determinar la presencia de C. burnetii. Para confirmar la presencia de C. burnetii se puede usar
un anlisis por PCR. Se pueden necesitar varios pases para obtener un aislamiento en cultivo puro.
Para aislar bacterias estrictamente intracelulares, o intracelulares facultativas, incluyendo a C. burnetii, se
ha adaptado un sistema de microcultivo celular disponible comercialmente para el cultivo de virus, el vial
cerrado de cultivo celular1.Tal mtodo se describi en 1990 para C. burnetii (6, 30). Se inoculan
suspensiones de la muestra en fibroblastos de pulmn de embrin humano (clulas HEL) que se cultivan
sobre un cubre de 1 cm2 dentro de un vial cerrado. La centrifugacin a 700 g durante 1 hora favorece la
fijacin y la penetracin de la bacteria en las clulas. Para la misma muestra se usan tres viales cerrados, y
los das 3, 10 y 21 se examina el efecto citoptico (ECP) -es decir, las caractersticas vacuolas de
C. burnetii en las clulas HEL- mediante un microscopio invertido. En el cubre dentro del vial cerrado se
puede realizar directamente a los 10 das la deteccin de C. burnetii creciendo dentro de las clulas, por
medio de un ensayo de inmunofluoresencia directa con anticuerpos policlonales anti-C. burnetii y un
424
Sterilin, Bibby Sterilin Ltd, Stone, Staffordshire ST15 O5A, Reino Unido.
anticuerpo apropiado anti-especie conjugado con FITC. Las clulas del ltimo vial cerrado se recogen y se
transfieren a un recipiente de cultivo de 25 cm2. Se puede incubar durante 3 meses, cambiando el medio de
cultivo una vez a la semana. La infeccin puede seguirse por microscopa de las clulas centrifugadas de
un sobrenadante del cultivo y teidas por la tincin de Gimenez y mediante anlisis por PCR del
sobrenadante del cultivo. Cuando las observaciones de ECP y las de la tincin de Gimenez, o los
resultados de la PCR, son positivos, se realiza un pase a un recipiente de cultivo de 75 cm2. El
sobrenadante se inocula luego en capas confluentes de clulas Vero o de clulas L929 de fibroblastos de
ratn en un recipiente de cultivo de 150 cm2 para establecer un aislamiento de C. burnetii. Este mtodo fue
desarrollado para el caso de humanos pero podra adaptarse a animales (41).
Con muestras muy multi-contaminadas, como las derivadas de placentas, descargas vaginales, heces o
leche, puede ser necesaria la inoculacin en animales de laboratorio. Los animales ms apropiados a este
respecto son los ratones y cobayas (36). Se controla la temperatura corporal y el estado de anticuerpos
despus de la inoculacin intraperitoneal de una dosis de 0,5 ml por animal. Este mtodo debera realizarse
siempre en paralelo con pruebas serolgicas en otros cobayas o ratones que se hayan inoculado con las
mismas muestras. Si aparece fiebre, se sacrifica el animal y se recoge el bazo para aislar el agente por
inoculacin en huevos de gallina embrionados o en cultivos celulares. El examen microscpico de
C. burnetii se lleva a cabo usando frotis y tinciones de los bazos recogidos. Alternativamente, se puede
realizar PCR en los bazos recogidos sistemticamente a los 7-9 das despus de la inoculacin (4).
Aunque la caracterizacin de los aislamientos parece necesaria para comprender la variable epidemiologa
de la fiebre Q en diferentes reas geogrficas, no existen en la actualidad mtodos diferenciadores de tipos.
A este respecto, los esfuerzos deberan ir dirigidos al desarrollo de mtodos para tipificacin gentica.
2.
Pruebas serolgicas
Entre las diversas tcnicas que pueden emplearse, las tres ms usadas son: la tcnica de inmunofluorescencia
indirecta (IFI), el mtodo ELISA y la prueba de fijacin de complemento (FC) (6). En el diagnstico rutinario ya no
se emplean tres pruebas serolgicas ms antiguas: la tcnica de microaglutinacin, la prueba de aglutinacin
capilar y la prueba de hemlisis indirecta. Se ha evaluado tambin una prueba de aglutinacin con partculas de
alta densidad (HDPA) (24). Los ensayos serolgicos son adecuados para analizar poblaciones, pero la
interpretacin a nivel del animal individual puede resultar difcil. Los animales pueden permanecer seropositivos
durante varios aos despus de una infeccin aguda, algunos pueden liberar C. burnetii y suponer un riesgo de
infeccin antes de desarrollar anticuerpos, y otros animales infectados no parecen sufrir seroconversin (1, 3, 4).
Los ttulos serolgicos de corte se indican ms adelante; la interpretacin de los resultados requiere el uso de al
menos diez animales (abortados o no). Para establecer la presencia de infeccin se necesita tanto la respuesta
serolgica como la evidencia de las bacterias.
a)
Prueba de la inmunofluorescencia indirecta

En medicina humana, el mtodo de referencia para el serodiagnstico de la fiebre Q es la prueba IFI
adaptada como una tcnica de microinmunofluorescencia (6, 46). El procedimiento se puede adaptar para
realizar un ensayo de inmunoperoxidasa. Se dispone de algunos antgenos comerciales adecuados para
uso en FC, pero son preferibles los antgenos preparados para diagnstico en humanos (6). Se ha
demostrado que este mtodo de preparacin suministra antgenos con la sensibilidad ms alta para
detectar anticuerpos frente a C. burnetii. En resumen, se utilizan antgenos de C. burnetii tanto de la fase I
como de la fase II; el antgeno de la fase II se obtiene creciendo la cepa de referencia C. burnetii Nine Mile
(ATCC VR 615) en cultivo celular, mientras que el antgeno de la fase I se obtiene del bazo de animales de
laboratorio inoculados con C. burnetii en fase II en cultivos celulares. En la poblacin en fase II an pueden
estar presentes unas cuantas clulas en fase I y pueden ser seleccionadas y propagadas dentro de los
animales. El antgeno se diluye, se gotea en pocillos de un porta de vidrio para microscopio, se deja secar y
se fija con acetona. Las dos formas de la infeccin, aguda y crnica, presentan perfiles serolgicos
distintos: durante la fiebre Q aguda, los anticuerpos IgG aumentan slo contra la fase II, mientras que
durante la fiebre Q crnica se observan niveles elevados de anticuerpos IgG contra la fase I y II de la
bacteria (46). Adems, se pueden comprar a suministradores portas con pocillos antigenados con antgeno
de fase II2, o de fases I y II de C. burnetii3. Estos se pueden adaptar cambiando el conjugado humano por
un conjugado adaptado a la especie animal.
Se colocan diluciones dobles del suero a ensayar en un porta para inmunofluorescencia que contenga
previamente uno o los dos antgenos. Si existen anticuerpos especficos, se fijan al antgeno en el porta. La
2
3
Coxiella burnetii-Spot IF, bioMrieux sa, Marcy-lEtoile, Francia

Q fever IFA Test Kits, MRL Diagnostics, Cypress, California, EE.UU.
425
formacin de este complejo se detecta luego en un microscopio de fluorescencia despus de la adicin del
conjugado fluorescente que reconoce las inmunoglobulinas de esa especie.
El antgeno debe prepararse en dependencias que cumplan los requisitos para patgenos del Grupo de
Contencin 3, como se describe en el Apndice I.1.6.1. del Captulo I.1.6. de este Manual.
C. burnetii Nine Mile (ATCC VR 615) en fase II se cultiva en monocapas confluentes de clulas Vero o L929
en recipientes de cultivo de 150 cm2 con medio mnimo esencial (MEM) al que se adiciona glutamina 2mM y
4% de suero fetal bovino. La infeccin se sigue mediante examen microscpico de las clulas que se
recogen de la parte inferior de los recipientes despus de teirlas por el mtodo de Gimenez. Cuando se
observa una gran infeccin por C. burnetii, se centrifugan individualmente los sobrenadantes de
15 recipientes (5.000 g, 15 minutos), se resuspenden en 1 ml de PBS con formaldehdo al 0.1% y se
mantienen 24 horas a 4C. Despus de juntar los sedimentos, se lisan por sonicacin las clulas que
queden. Los restos celulares se eliminan por dos centrifugaciones sucesivas (cada una a 100 g,
10 minutos). A continuacin, la suspensin de 15 ml se centrifuga en 20 ml de PBS con 25% de sacarosa
(6.000 g, 30 minutos sin interrupcin). El sedimento que resulta se lava tres veces en PBS (6.000 g,
10 minutos), se resuspende en el menor volumen posible de agua destilada estril y se ajusta por
espectroscopa de luz UV a 2 mg/ml. Se aade azida sdica a una concentracin final de 0,1% como
conservante antibacteriano. El antgeno preparado de este modo se congela a 20C.
Para obtener antgeno correspondiente a la fase I, se inoculan ratones con la cepa de C. burnetii Nine Mile
crecida en clulas (principalmente en fase II). Nueve das despus se extraen los bazos. Cada uno se
disgrega en 7,5 ml de MEM y se inocula en tres recipientes de cultivo de 75 cm2 con monocapas de clulas
L929 o Vero (2,5 ml por recipiente). La amplificacin de la fase I de C. burnetii se lleva acabo durante
4 semanas, cambiando el medio de cultivo una vez por semana. Despus se recogen las clulas infectadas
y se purifican las bacterias como se describe anteriormente (principalmente en fase I).
La produccin de antgeno tambin puede hacerse cultivando C. burnetii en huevos embrionados SPF. El
microorganismo se inocula en el saco vitelnico de huevos embrionados de 5-6 das de edad, y se recogen
luego a los 12-15 das despus de la muerte del embrin. Los sacos vitelnicos infectados tienen un color
amarillento pajizo caracterstico. Los no infectados son de color naranja y presentan una consistencia
viscosa. Cualquier embrin que muera entre los 5 y 10 das de incubacin se elimina. La cepa usada en la
inoculacin de los huevos es una dilucin al 1/100 de un homogenado de saco vitelnico en PBS con
penicilina (500 Unidades Internacionales/ml) y estreptomicina (0,5 mg/ml). Los sacos vitelnicos se juntan y
se homogenizan con tres partes de PBS. La suspensin se inactiva durante 24 horas a 37C con
formaldehdo al 1,6%. El sobrenadante lipdico se desecha. La suspensin se centrifuga luego a una
velocidad moderada (unas 500 g) durante 30 minutos. Se elimina el sobrenadante, se aade ms PBS y se
repite la centrifugacin. La suspensin final se diluye con PBS. Se aade thiomersal a una dilucin final de
1/10.000 como conservante antibacteriano. En los homogenados de los sacos vitelnicos suspendidos en
PBS, se comprueba la abundancia de C. burnetii y la ausencia de contaminantes bacterianos por examen
microscpico de un frotis sobre un porta y tincin por el mtodo de Stamp. Para obtener antgeno de fase I,
se puede propagar C. burnetii recogida de material del bazo de animales de laboratorio infectados, ya que
estos extractos se transfieren a continuacin a sacos vitelinos, pues la cantidad de clulas en fase I es
todava alta hasta el sexto pase en el vitelo (EP6).
Es suficiente realizar la titulacin del antgeno con al menos tres sueros diferentes conocidos (con ttulo alto,
moderado y bajo, respectivamente) para disponer de la dilucin apropiada para otros ensayos de
inmunofluorescencia.
Materiales y reactivos
Microscopio equipado con fluorescencia, incubador con humidificador, pila de lavado.

Se necesitan portas adecuados para el antgeno. ste puede prepararse en el laboratorio o comprarse a un
proveedor (vase ms arriba). El mtodo descrito est adaptado de la preparacin comercial de BioMrieux
a ttulo de ejemplo. Los portas preparados contienen 12 pocillos por porta, cada uno de 7 mm de
dimetro, recubiertos con antgeno de fase II obtenido de cultivos en clulas Vero y pueden guardarse a
4C o a 20C.
Conjugado fluorescente concentrado, para ser diluido cuando sea necesario con PBS + azul de Evans al
1%, a las diluciones recomendadas por la casa comercial.
PBS, glicerina tamponada, colorante azul de Evans en solucin al 1%.
426
i)
Inactivar el suero problema durante 30 minutos a 56C, luego diluir en PBS de 1/40 a 1/640.
ii)
Dejar que los portas recubiertos con el antgeno tomen la temperatura ambiental. No tocar los pocillos.
iii)
Aadir a los pocillos 20 l de cada dilucin de suero. Aadir sueros de control positivo y negativo. A un
pocillo, aadir como control de antgeno 20 l de PBS.
iv)
Incubar en una cmara hmeda 30 minutos a 37C. Lavar el porta dos veces con PBS durante
10 minutos cada vez. Lavar con agua destilada y dejar secar al aire.
v)
Aadir a los pocillos, incluyendo los de los controles, 20 l de conjugado dirigido contra la especie
apropiada (por ejemplo, anticuerpos obtenidos en conejo contra IgG [H+L] de cabra u oveja marcados
con FITC), diluidos en el momento en PBS + azul de Evans. Incubar en una cmara hmeda
30 minutos a 37C. lavar con agua destilada y secar al aire. Aadir unas cuantas gotas de
glicerina tamponada y tapar con un cubre. Examinar en un microscopio de fluorescencia con
aumentos de x40 o ms.
Interpretacin de los resultados
Una reaccin positiva se manifiesta por la presencia de pequeos puntos brillantes en un fondo oscuro. Hay
que comprobar que el conjugado solo y el control de suero negativo dan un resultado negativo (ausencia de
los pequeos puntos brillantes). La fluorescencia inespecfica suele tomar forma de manchas de tamao
irregular. El control positivo debe corresponder al ttulo conocido + un orden de dilucin.
La reaccin se considera positiva si aparece inmunofluorescencia a dilucin 1/160 o mayor. En medicina
humana, este mtodo se usa para determinar anticuerpos contra las fases I y II en las fracciones de IgG,
IgM e IgA, lo que permite la diferenciacin entre la forma aguda y la crnica de la fiebre Q. Para eliminar las
IgG antes de determinar las IgM e IgA se usa absorbente de factor reumatoide. El anlisis de los sueros se
realiza con antgeno de la fase II, y los sueros positivos se ensayan despus para detectar la presencia de
las diferentes clases de Ig dirigidas contra los antgenos de la fase I y la II. No obstante, ni las respuestas
de anticuerpos a las fases I y II ni las respuestas de las clases de Ig implicadas se han estudiado con
detalle en los animales domsticos.
b)

Este micromtodo de fijacin en fro, de tipo semejante al desarrollado por Kolmer, se realiza en placas de
microtitulacin con 96 pocillos de fondo cncavo. La prueba detecta la presencia en el suero de anticuerpos
fijadores de complemento. Esta prueba FC es especfica, pero menos sensible que la IFI o ELISA (6, 25).
La seroconversin se detecta por la prueba FC ms tarde que por la prueba IFI o ELISA, aunque los
anticuerpos FC pueden persistir durante largos perodos despus de la enfermedad y esta prueba da
resultados excelentes para diagnstico rutinario de enfermedades abortivas a nivel de poblaciones (32, 34).
En muchos pases la prueba FC es an muy usada por muchos laboratorios. Con frecuencia en este
mtodo se utiliza antgeno en fase II preparado a partir de una mezcla de dos cepas (Nine Mile y
Henzerling)4. En Francia, este mtodo est estandarizado (AFNOR-NFU47-006).
La reaccin se hace en dos etapas. Primero se mezcla el antgeno con los anticuerpos fijadores de
complemento, y se aaden eritrocitos de oveja que estn sensibilizados por suero anti eritrocitos de oveja.
Durante el primer paso, la fijacin del complemento por el complejo antgeno/anticuerpo no permite la lisis
de los eritrocitos; por el contrario, si no existen anticuerpos fijadores de complemento, el complemento
induce entonces la lisis de los eritrocitos sensibilizados, Por consiguiente, la velocidad de hemolisis es
inversamente proporcional al nivel de anticuerpos especficos que estn presentes en la muestra de suero.
Reactivos
Tampn Veronal/calcio/magnesio (VB), pH 7.2

El sistema hemoltico: una mezcla a partes iguales de una suspensin de eritrocitos de oveja al 2% en VB y
de suero hemoltico diluido en VB segn su ttulo especfico.
Complemento: preparacin comercial liofilizada de suero fresco de cobaya.
Antgeno: Usar antgenos comerciales al ttulo recomendado por el fabricante, si la titulacin del antgeno se
realiza por este mtodo. Los resultados pueden variar de un antgeno a otro, y son preferibles los antgenos
preparados de varias cepas (ovinas, bovinas y humanas) o de cepas autctonas.
Dade Behring, Marburg, Alemania
427
Controles de suero positivo y negativo.
Pre-titulaciones
i)
Diluir los etritrocitos de oveja a una concentracin final de 2% en VB.
ii)
Titular el suero hemoltico en una microplaca: 25 l de complemento a una concentracin hemoltica

conocida (por ejemplo, 1/30); 25 l de diluciones crecientes de suero hemoltico + eritrocitos de oveja
al 2%. Incluir controles sin complemento. Incubar 30 minutos a 37C. Establecer la dilucin
equivalente a 2 unidades hemolticas.
iii)
Diluir el antgeno como recomienda el fabricante. El antgeno puede tambin titularse: hacer diluciones
crecientes de antgeno (25 l horizontalmente) y un suero positivo de ttulo conocido (25 l
verticalmente). Aadir 25 l de la suspensin de eritrocitos sensibilizados e incubar 30 minutos a 37C.
El ttulo del antgeno es la dilucin ms alta que produce una reaccin positiva con la dilucin ms alta
del suero. Comprobar a diferentes diluciones la ausencia de actividad anti-complementaria del
antgeno.
iv)
Titular el complemento en una microplaca: hacer diluciones seriadas del complemento o del suero de
cobaya en VB, por ejemplo de 1/15 a 1/200. A cada pocillo con 25 l de esta dilucin, aadir 25 l de
antgeno y 25 l del sistema hemoltico. Incubar 30 minutos a 37C y establecer la dilucin equivalente
a 2 unidades hemolticas de complemento.
i)
En seis pocillos hacer diluciones dobles de 1/10 a 1/320 del suero problema inactivado (con el
complemento eliminado) y en otros cuatro pocillos a diluciones de 1/10 a 1/80 para detectar actividad
anti-complementaria (25 l por pocillo) (pocillos control de suero).
ii)
Aadir 25 l de antgeno diluido o 25 l de VB a los pocillos de control de suero.
iii)
Aadir 25 l de complemento a todos los pocillos. Cubrir la placa con una lmina de plstico adhesivo
e incubar 18 horas a 4C.
iv)
Sacar las placas del refrigerador, dejarlas que alcancen la temperatura ambiente, y aadir 25 l de
sistema hemoltico recin preparado. Incubar a 37C durante 30 minutos. Centrifugar las placas a
500 g durante 5 minutos a 4C. Examinar los controles y leer los resultados.
Los ttulos comprendidos entre 1/10 y 1/40 son caractersticos de una infeccin latente. Los ttulos de 1/80 o
ms, en uno o ms sueros de un grupo de cinco a diez animales, revelan una fase evolutiva de la infeccin.
c)
Enzimoinmunoensayo
Esta tcnica presenta una alta sensibilidad y una buena especificidad (6, 31, 48). Es fcil de realizar en
laboratorios que tienen el equipo necesario (un espectrofotmetro) y reactivos. Las pruebas ELISA tienden
a reemplazar a las pruebas IFI y FC como tcnicas de eleccin porque son adecuadas para anlisis a gran
escala y, en particular, para los diagnsticos en Veterinaria, ya que es una tcnica fiable para demostrar
anticuerpos contra C. burnetii en varias especies animales (13,40). Requiere un antgeno relativamente
puro. Para recubrir las placas pueden usarse los antgenos preparados para la prueba FC. Existen
preparaciones comerciales disponibles que pueden detectar anticuerpos contra la fase II o contra la fase I y
II5,6. Est en fase de desarrollo la obtencin de preparaciones de ELISA capaces de distinguir entre los
anticuerpos contra la fase I y contra la fase II.
Los pocillos de la microplaca se recubren con el antgeno de clulas enteras de C. burnetii inactivado. Se
aaden a los pocillos muestras de suero diluido que reacciona con los antgenos unidos al soporte slido. El
material no unido se elimina mediante lavado despus de un perodo adecuado de incubacin. El
conjugado (Ig anti-rumiante marcada con peroxidasa de rbano) reacciona con los anticuerpos especficos
unidos al antgeno. El exceso de conjugado que no reacciona se elimina mediante lavado despus de un
perodo adecuado de incubacin. Se aade el substrato del enzima. La velocidad de conversin del
substrato es proporcional a la cantidad de anticuerpos unidos. La reaccin se termina despus de un
perodo adecuado de tiempo y el color desarrollado se mide espectrofotomtricamente.
Materiales y reactivos
Placas de microtitulacin con 96 pocillos de fondo plano, recin recubiertas o recubiertas de antemano con
antgeno de la fiebre Q; lector de microplacas (espectrofotmetro; filtros de 405 y/o 492 nm); incubador con
5
6
428
CHEKIT-Q-Fever EIA kit, Intervet (Bommeli Diagnostics), Liebefeld-Bern, Suiza

Q fever IgG o IgM ELISA kits, PanBio Pty Ltd, Brisbane, Australia.
humidificador a 37C; pipetas de 8 y 12 canales con puntas desechables de plstico; agitador de

microplacas (opcional).
Sueros control positivos y negativos; conjugado (inmunoglobulina anti-rumiante marcada con peroxidasa);
diluyente diez veces concentrado (PBS-Tween); agua destilada; substrato o cromgeno (OPD [ortofeniln
diamina], ABTS [2,2-azino-bis-(3-etilbenzotiazolina-6-cido sulfnico] para la peroxidasa); perxido de
hidrgeno.
i)
Diluir las muestras de suero, incluyendo los sueros control, a una dilucin apropiada (normalmente
1/100) y distribuir por duplicado 0,1 ml por pocillo. Los sueros control son sueros positivos y negativos
suministrados por el fabricante y un suero positivo de referencia interna del laboratorio para comparar
los ttulos en ensayos diferentes.
ii)
Cubrir la placa con tapa e incubar a temperatura ambiente durante 30-90 minutos. Vaciar el contenido
y lavar tres veces a temperatura ambiente con solucin de lavado.
iii)
Aadir a los pocillos la dilucin adecuada de conjugado recin preparado (0,1 ml por pocillo).
iv)
Cubrir cada placa e incubar como en el paso ii. Lavar de nuevo tres veces.
v)
Aadir a cada pocillo 0,1 ml de substrato cromognico recin preparado (por ejemplo: OPD
[0.1 mg/ml] en cido actico 0,1 M, PO4HNa2 0,2 M, pH 4,8, y solucin de H2O2 al 30% [0,2 l/ml]; o
ABTS 0,25 mM en tampn citrato fosfato, pH 5,0, y solucin de H2O2 al 30% [0,1 l/ml]).
vi)
Agitar la placa; despus de incubar, detener la reaccin aadiendo a cada pocillo solucin de parada,
por ejemplo, 0,05 ml de cido sulfrico 3M para la peroxidasa o 10% de dodecilsulfato sdico para
ABTS.
vii)
Leer la absorbancia de cada pocillo con el lector de microplacas a 405 nm (ABTS) o a 492 nm (OPD).
Los valores de absorbancia se usan para calcular los resultados.
En el caso de preparaciones comercializadas, las interpretaciones y los valores se suministran con la

preparacin.
Por ejemplo: calcular la absorbancia media (Ab) de la muestra de suero y de los sueros control positivos
(Abpos) y negativos (Abneg), y calcular el porcentaje para cada suero:
Ab - Ab neg x 100
Abpos - Abneg
Intrepretar los resultados del siguiente modo:
Ab <30%
suero negativo
Ab 30-40%
suero dudoso
Ab >40%
suero positivo
C. REQUISITOS PARA LAS VACUNAS Y LOS MATERIALES DE DIAGNSTICO.

1.
Vacuna
La vacunacin es la estrategia ms lgica para evitar la fiebre Q en sujetos y en ganados expuestos. Slo se
puede preparar una vacuna contra C. burnetii cuando lo hace una plantilla entrenada y en condiciones
adecuadas de proteccin (como mnimo en un laboratorio de nivel 3 de bioseguridad). Se recomienda obtener la
vacuna de fabricantes capaces de completar y certificar pruebas sobre seguridad, inactivacin y esterilidad.
produccin de vacunas veterinarias. Las normas dadas aqu y en el Captulo I.1.7 intentan ser de naturaleza
general y se pueden suplementar con requisitos nacionales y regionales.
En algunos pases, se practica la vacunacin para personal sujeto a exposicin ocupacional, como trabajadores
de mataderos, veterinarios y personal de laboratorio. En 1989 las autoridades australianas aprobaron una
vacuna inactivada con formaldehdo (Q-VAX, CSL Ltd, Australia) preparada a partir de la cepa Henzerling de C.
429
burnetii en fase I (19). Las vacunas de fase I son ms eficaces, pero est contraindicada la vacunacin de
individuos con seroconversin o expuestos a C. burnetii antes de la inmunizacin.
Se han desarrollado varias vacunas contra la fiebre Q animal. Hasta la fecha, los resultados son ms favorables
hacia el uso de una vacuna de fase I, ya que las vacunas de fase II son 100 veces menos eficaces que las de
fase I en evitar la colonizacin del bazo de ratn (7). En Eslovaquia existe una vacuna comercial inactivada de
fase I para la vacunacin del ganado. Un estudio sobre la fiebre Q en Eslovaquia sugiere que el descenso en los
casos de fiebre Q en el hombre y en los animales podra deberse a la vacunacin a gran escala realizada all en
el ganado durante 10 aos, y a las mejoras en el control veterinario del transporte de animales dentro del pas
(37).
La vacuna contiene un antgeno muy purificado de la cepa Nine Mile en fase I (pases de cultivo 2 a 6 en huevo) e
inactivado con formaldehdo. Recientemente, un estudio ha demostrado la eficacia de esta vacuna en Francia
mediante vacunacin y posterior infeccin experimental de cabras gestantes: la vacuna evit el aborto y la
liberacin del agente en la leche, disminuyendo considerablemente la liberacin en las secreciones vaginales y
en las heces (4). En teora, la eficacia de la vacuna se debe demostrar por pruebas en todas las especies a las
que puede ir dirigida.
En el caso de vacunacin de animales ya infectados, no se dispone de informacin sobre posibles efectos
adversos ni sobre la liberacin del agente de la fiebre Q. Por consiguiente, algunos autores piensan que resulta
preferible seleccionar para la inmunizacin las explotaciones o los animales seronegativos, y continuar en los
animales jvenes la vacunacin durante varios aos (15). Hasta ahora, no existen datos comparativos de costebeneficio de esta estrategia respecto a una estrategia no selectiva en el control de la fiebre Q.
2.
Materiales de diagnstico
Ver Seccin B.2.a. (Preparacin de antgeno).
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*
* *
432
CAPTULO 2.2.11.
LEISHMANIOSIS
RESUMEN
La leishmaniosis no es una entidad nica y comprende una variedad de sndromes debidos
fundamentalmente a por lo menos 16 especies y subespecies de Leishmania. Los perros son
afectados generalmente por L. infantum y L. chagasi (que ahora se consideran sinnimos), pero se
han descrito infecciones por L. tropica, L. major y L. braziliensis. En el hombre, el espectro clnico
vara desde infecciones asintomticas a otras con elevada mortalidad, con tres formas clsicas
descritas: visceral (LV), cutnea (LC) y mucocutnea (LMC). Los vectores de estas enfermedades
son moscas flebotomicas que pertenecen a los gneros Phlebotomus y Lutzomyia.
Identificacin del agente: Cuando en el hombre y en los animales afectados se presentan los
sntomas clnicos y las lesiones caractersticas, la demostracin del parsito en frotis teidos de
aspirados esplnicos, de mdula sea y de ndulos linfticos, o en raspados cutneos y en
biopsias tisulares, constituye un diagnstico positivo. Si la infeccin es de un grado bajo, la
deteccin del parsito es solo posible mediante intentos de aislamiento in vitro o in vivo o por la
reaccin en cadena de la polimerasa (PCR). Como existen pocas diferencias entre las distintas
especies, cualquier Leishmania aislada debe identificarse por mtodos moleculares, bioqumicos e
inmunolgicos. Varios centros en el mundo utilizan en la actualidad la caracterizacin de isozimas,
ADN y antgenos para identificar el agente.
Pruebas serolgicas: La serologa es el mtodo de diagnstico preferido para la leishmaniosis
canina y la LV, incluso durante las primeras fases de la enfermedad. En las formas subclnicas, los
casos seropositivos se confirman por diagnstico parasitolgico o por PCR. La serologa tiene
menos valor en la LC y LMC. De entre las diversas tcnicas inmunolgicas disponibles, la prueba
de inmunofluorescencia indirecta y el enzimoinmunoensayo son las ms adecuadas. Los antgenos
para serodiagnstico deben prepararse en el laboratorio, aunque actualmente se estn evaluando
algunos productos comercializados.
Prueba de hipersensibilidad retardada: La prueba cutnea de la leishmanina es til para
determinar la distribucin de las infecciones humanas, y sirve para distinguir casos inmunes o no
inmunes. La prueba es positiva en LC, LMC y LV curada, pero es negativa en la LV activa.
Requisitos para las vacunas y los materiales de diagnstico: No hay en la actualidad ninguna
vacuna eficaz disponible para uso en humanos y perros. La leishmanina, que ya no est disponible
comercialmente, precisa estandarizacin.
A. INTRODUCCIN
La lesihmaniosis est causada por el protozoo parsito Leishmania, que es transmitido por vectores. Se han
descrito varias formas de manifestaciones clnicas de la leishmaniosis humana (33), que se han dividido en tres
entidades: leishmaniosis visceral (LV, kala azar), lesihmaniosis cutnea (LC, llaga de oriente, uta, pian bois,
lcera de chiclero) y leishmaniosis mucocutnea (LMC, espundia). En el Nuevo Mundo1, la leishmaniosis est
causada por el complejo de L. braziliensis (LMC y LC), el complejo de L. mexicana (LC), L. peruviana (LC) y
L. chagasi (LV y LC); en el Viejo Mundo la leishmaniosis est causada por L. donovani (LV), L. infantum (LV y
LC), L. tropica (LC), L. major (LC) y L. aethiopica (LC). Leishmania infantum y L. chagasi son idnticas en
1
En este captulo, el trmino "Nuevo Mundo" indica Amrica del Norte, Central y del Sur, y el trmino "Viejo Mundo" se
refiere a Europa, frica y Asia.
433
Captulo 2.2.11. Leishmaniosis
genotipado bioqumico y deberan considerarse como sinnimas (20). Con escasa excepciones, las
enfermedades son zoonosis. La lesihmaniosis canina (CanL) es una enfermedad crnica vscerocutnea
causada por L. infantum (= L. chagasi), donde el perro acta como reservorio. En algunos casos, los parsitos
del complejo L. braziliensis, L. major y L. tropica se han aislado de este hospedador (27). Los vectores de la
leishmaniosis son moscas flebotmicas que pertenecen a los gneros Lutzomyia (Nuevo Mundo) y Phlebotomus
(Viejo Mundo).
1.
Los mtodos de rutina disponibles para el diagnstico de la leishmaniosis son el examen clnico de casos
sospechosos, el diagnstico parasitolgico y el inmunodiagnstico. Sin embargo, la demostracin del parsito es
el nico medio de confirmar la enfermedad de modo concluyente (23). En LV y CanL se recomienda el
aislamiento e identificacin del parsito de las biopsias (ndulos linfticos, mdula sea, y aspirados del bazo)
junto a pruebas moleculares y de inmunodiagnstico. Para la confirmacin de LC (mediante raspado de las
lesiones o aspiracin con aguja del borde de la lesin) es necesario el diagnstico parasitolgico, ya que ni el
examen clnico ni la serologa resultan adecuados. Los frotis del material de las biopsias se tien con tincin de
Giemsa y se examinan al microscopio a x6001.000 aumentos. El material tambin debe cultivarse en medios
apropiados a 2226C.
Las caractersticas morfolgicas de los amastigotes (en hospedadores humanos y mamferos) y de los
promastigotes (hospedadores invertebrados y en cultivo) son las siguientes:
Amastigote: pequeo cuerpo intracelular redondeado u oval, de 1,53 x 2,56,5 m, localizado en las
vacuolas del citoplasma de los macrfagos. No existen flagelos libres. El organismo tiene un ncleo
relativamente grande y un cinetoplasto que consiste en un cuerpo alargado y un cuerpo basal puntual.
Promastigote: organismo extracelular alargado, de 1520 x 1,53,5 m con un nico flagelo de 1528 m
de longitud, que sale de las proximidades del cinetoplasto en la parte anterior. El ncleo se sita
centralmente.
La eleccin de los mtodos de aislamiento y de cultivo depender de las circunstancias inmediatas y de la

capacidad tcnica y la experiencia del personal de laboratorio (34). El aislamiento in vitro presenta ciertas
ventajas respecto a los mtodos in vivo: los cultivos son positivos ms rpidamente (530 das en comparacin
con los meses que tardan las lesiones en aparecer en un animal y los materiales son menos costosos. Sin
embargo, para el aislamiento in vitro, las tcnicas utilizadas deben llevarse a cabo en condiciones estriles
estrictas; por tanto, no es siempre realizable en condiciones de campo. Por desgracia, no existe todava un
medio de cultivo universal en que crezcan con facilidad todas las leishmanias y es casi imposible predecir qu
medio ser el ms apropiado para el crecimiento de un aislamiento particular de Leishmania. Cada laboratorio
tiene que encontrar el medio ms adecuado entre los medios bifsicos de agar sangre y los medios de cultivo de
tejidos suplementados con suero fetal bovino (7). Cuando se intenta el aislamiento primario de organismos
desconocidos, se debe utilizar un medio con agar sangre con preferencia el medio NNN (Novy, McNeil y
Nicolle) o, en su defecto, medio slido de infusin de cerebro y corazn (BHI) o medio EMTM (medio de Tobie
modificado por Evans). En la Seccin B.1.a. se describen medios adecuados para el cultivo en masa de
aislamientos establecidos, (ver ref. 7 para la composicin de los medios). Los organismos de pacientes con LV y
LMC pueden ser muy difciles de cultivar. A veces, incluso cuando el aislamiento inicial tiene xito, los parsitos
pueden morir cuando se subcultivan. Esto parece especialmente frecuente cuando el aislamiento inicial se hace
en medio rico. A menudo esto se puede superar si los subcultivos se realizan en medios nutritivos menos ricos,
como el NNN, o unos de los medios semislidos, como el Evans mojado o el agar sangre semislido de Locke.
El hmster (Misocricetus auratus) es el animal ms utilizado para aislamientos in vivo (27). En caso de detectar
parsitos dermatotrpicos, las suspensiones de tejidos o los aspirados se inoculan intradrmicamente en la nariz
y/o los pies. Cuando se sospecha que el material est infectado con parsitos que causan LV, se debe hacer la
inoculacin preferiblemente por la ruta intraperitoneal. La infeccin que resulta se hace aparente semanas o
meses despus por el desarrollo de un ndulo o lcera en el sitio de la inoculacin, y en el caso de parsitos
viscerotrpicos la infeccin se evidencia meses despus por la infeccin masiva de los rganos internos. El
examen de frotis de suspensiones de tejidos/aspirados de hmster mostrar amastigotes con tincin de Giemsa.
Para el diagnstico de L. major se usan generalmente ratones BALB/c.
En muchos centros se estn utilizando varias tcnicas para identificar las diferentes especies, subespecies y
cepas de Leishmania.
a)
434
La caracterizacin de isozimas es el mtodo ms comn (1, 13, 27, 34). Esta tcnica requiere un gran
nmero de parsitos (5 x 1091 x 1010). Los principios de la electroforesis de enzimas son los siguientes: se
extraen los enzimas solubles de los organismos crecidos en medio para cultivo en masa (medio BHI, medio
MEM/FCS/EBLB [medio mnimo esencial/suero fetal bovino/caldo de Evans con sangre lisada], medio
Drosophila de Schneider). Se coloca despus una pequea cantidad del extracto en una substancia inerte
de soporte, la matriz, que contiene un tampn a un pH determinado. Generalmente la matriz es gel de
almidn, pero puede ser tambin absorbente, acetato de celulosa, acrilamida o agarosa. Normalmente se
escoge el pH del tampn de la matriz de modo que los isozimas estn cargados negativamente. A travs de
la matriz se pasa una corriente directa llevada por los iones del tampn. Cuando se completa la
electroforesis, la mayora de las protenas se habrn desplazado hacia el nodo en la matriz, dependiendo
de la carga negativa. Si se tien en esta fase con un colorante general de protenas, se vern muchas
bandas. No obstante, la elevada especificidad de substrato y de cofactor de los enzimas hace posible teir
solo estas protenas. Por tanto, se puede comparar la movilidad electrofortica de un enzima particular en
varios organismos. La matriz con el conjunto de bandas de isozimas teidas se denomina un zimograma.
Por lo general, para ayudar a la interpretacin de los resultados, se incluyen en el gel uno o ms extractos
de organismos de referencia cuyo modelo de bandas de enzimas est bien documentado. La mayora de
los enzimas utilizados para fines de caracterizacin se tien por mtodos que incorporan una reaccin de
deshidrogenacin. Se deberan examinar por lo menos 12 enzimas.
b)
La tcnica del anticuerpo monoclonal (MAb) se aplica al anlisis y clasificacin de especies y subespecies
de Leishmania tanto del Nuevo como del Viejo Mundo (13, 27, 34). Para la produccin de anticuerpos, se
inmunizan ratones BALB/c con preparaciones de membranas de promastigotes o amastigotes. Despus se
seleccionan y se clonan por diluciones limitantes los cultivos de hibridoma que secretan anticuerpo. La
especificidad para las cepas de Leishmania se determina por inmunofluorescencia o por pruebas
inmunoradiomtricas. Estos anlisis deben ser cuantitativos, pues la cantidad de un mismo antgeno
superficial puede variar entre distintas especies de Leishmania. Se han utilizado tambin anticuerpos
monoclonales en tcnicas inmunohistoqumicas con aplicacin a los tejidos de las biopsias.
c)
El anlisis del ADN del cinetoplasto con enzimas de restriccin se basa en el anlisis, mediante
electroforesis en gel, de los fragmentos que generan las endonucleasas en el abundante ADN mitocondrial
que constituye el cinetoplasto (10, 13, 15, 27, 32). El patrn electrofortico que se obtiene, conocido como
huellas de restriccin, es un marcador del orgnulo a nivel genotpico que permite la identificacin y
clasificacin de las cepas de Leishmania en esquizodemos poblaciones que tienen secuencias similares en
el ADN del cinetoplasto. Esta tcnica tambin requiere un gran nmero de parsitos (1 x 1010).
d)
Las sondas de hibridacin de ADN son un instrumento prometedor cuyo principio es permitir que las
secuencias marcadas del ADN nuclear o del cinetoplasto, de una sola cadena, procedentes de cepas
estndar bien caracterizadas, se encuentren e hibriden con secuencias de ADN homlogas de un aislado de
Leishmania desconocido (13, 33). Solo las secuencias de ADN complementario formarn ADN de cadena
doble, que se puede detectar por autoradiografa si la sonda est marcada radiactivamente, o por una
reaccin inmunoenzimtica. Estas tcnicas son lo suficientemente sensibles como para identificar 102103
organismos depositados en filtros de nylon. Se necesitan muchos menos parsitos (<10) para la
identificacin por la tcnica de hibridacin in situ.
e)
En la actualidad se utilizan los mtodos basados en la reaccin en cadena de la polimerasa (PCR) para
diagnosticar y/o identificar Leishmania en muestras procedentes de humanos o de perros. En esencia, las
tcnicas desarrolladas para detectar organismos en biopsias recientes o congeladas, o para identificar
aislamientos de Leishmania, comprenden: (a) digestin del material con proteinasa K y extraccin de ADN;
(b) amplificacin del estndar por PCR utilizando secuencias oligonucleotdicas seleccionadas del gen del
ARNr de la subunidad pequea como molde (19), minicrculos del ADN del cinetoplasto (16) u otras
secuencias altamente repetitivas del ADN genmico (25); (c) anlisis de los productos de amplificacin en
geles de agarosa al 12%. Se puede realizar una PCR anidada o semianidada utilizando cebadores internos
de las secuencias anteriores para aumentar la sensibilidad. En la LV humana, la PCR tiene una sensibilidad
comparable a la de los mtodos de cultivo, pero suministra resultados mucho ms deprisa. En la CanL, la
eficacia diagnstica de la PCR en comparacin con la serologa depende del curso natural de la
enfermedad, siendo la sensibilidad mayor poco despus de la infeccin (88%) y decayendo despus (50%)
(26). En la LC y LMC americana, la PCR parece ser ms sensible que cualquier otro mtodo de diagnstico
recomendado previamente (5).
2.
Pruebas serolgicas
Actualmente se usan varias pruebas serolgicas para detectar anticuerpos antileishmania (2, 12, 13, 29). Los
valores de sensibilidad indicados abajo para cada prueba se aplican, no obstante, a individuos que no estn
inmunocomprometidos. Se ha descrito un alto porcentaje de pacientes con LV que estn coinfectados con el
virus de la inmunodeficiencia humana (HIV) y que son seronegativos para anticuerpos contra leishmanias (9).
a)

La prueba de inmunofluorescencia indirecta (IFI) es de amplio uso por su facilidad. La prueba es especfica
de gnero, aunque se han descrito reacciones cruzadas significativas en individuos infectados con
435
Tripanosoma cruzi. Para estos casos, seran ms apropiadas pruebas serolgicas basadas en antgenos
especficos recombinantes de Leishmania (ver Seccin B.3. ms adelante). En reas libres de la
enfermedad de Chagas, la prueba IFI para el diagnstico clnico de LV o CanL tiene una sensibilidad del
96% y una especificidad del 98%, lo que es similar a la del enzimoinmunoensayo (ELISA). Aunque se
pueden usar como antgenos los amastigotes de cortes congelados o frotis de rganos infectados, los
promastigotes cultivados representan la fuente de antgeno ms comn.
Preparacin de antgeno
i)
Recoger 34 ml del medio lquido de un cultivo de 3 das que muestre un buen crecimiento de
promastigotes (ver Seccin B.1. para medios de cultivo).
ii)
Lavar los organismos tres veces con solucin salina tamponada con fosfato (PBS), pH 7,27,4,
mediante centrifugacin a 350 g durante 15 minutos a temperatura ambiente.
iii)
Resuspender el sedimento final en PBS y con ayuda de un hemocitmetro ajustar la concentracin de

promastigote a aproximadamente 4 x 106/ml.
iv)
Distribuir 30 l de la suspensin de promatigotes en cada crculo de un porta de muestra mltiple y

dejar secar a temperatura ambiente.
v)
Fijar los promastigotes con acetona fra durante 10 minutos, luego se pasan los portas a una caja de
plstico y se guardan en un congelador (35C) por menos de 23 meses.
i)
Lavar con PBS los portas congelados recubiertos con el antgeno y dejar secar a temperatura
ambiente.
ii)
Inactivar los sueros 30 minutos en un bao de agua a 56C.
iii)
Hacer diluciones dobles de los sueros de ensayo desde 1/80 a 1/10.240 para la LV en humanos y
desde 1/40 a 1/5.120 para CanL. Se incluyen tambin en la prueba sueros control positivos y
negativos a diluciones de 1/80 y 1/160 para la LV en humanos y de 1/40 y 1/80 para CanL. No hay
sueros estndar disponibles, pero se deben preparar y titular estndares internos.
iv)
Distribuir 30 l de muestras de suero diluido en cada crculo del porta e incubar durante 30 minutos a
37C.
v)
Eliminar las muestras de suero por lavado vigoroso con PBS y sumergir los portas en PBS durante
10 minutos. Dejar que se sequen los portas.
vi)
Distribuir 30 l de solucin diluida de antinmunoglobulina conjugada a isotiocianato de fluorescena

(FITC) en cada crculo del porta e incubar 30 minutos a 37C. Existen inmunoglobulinas
comercializadas antiperro y antihumanos conjugadas a FITC. Para las diluciones apropiadas, seguir
las instrucciones.
vii)
Repetir el paso (v) y montar con un cubre en unas cuantas gotas de PBS/glicerol (50% [v/v] de cada
componente).
viii) Observar los portas en un microscopio de fluorescencia. El ttulo de anticuerpo es la mayor dilucin
que muestra promastigotes fluorescentes. En la LV humana, el ttulo umbral normalmente vara de
1/80 a 1/160; en la CanL vara de 1/40 a 1/60. Como la realizacin de la prueba IFI puede variar en
distintos laboratorios, es mejor que cada laboratorio defina su propio ttulo umbral utilizando sueros
definidos de referencia positivos y negativos.
b)
Enzimoinmunoensayo
Los ensayos ELISA se pueden hacer con suero o con un volumen medido de sangre. La sangre se recoge
por puncin con aguja en tiras de papel absorbente adecuado y se deja secar. La muestra se eluye y se
prueba a una dilucin nica determinada previamente para dar una especificidad y sensibilidad aceptables.
Esta prueba se puede utilizar para estudios epidemiolgicos en condiciones de campo.
En el mtodo clsico, el antgeno se prepara como sigue: los promastigotes recogidos del cultivo se lavan
cuatro veces con PBS, pH 7,2, a 1.000 g durante 15 minutos. El paquete de promastigotes se resuspenden
al doble de su volumen en agua destilada y se sonican a amplitud media en un bao de hielo. La
suspensin se deja toda la noche a 4C para dejar que las protenas pasen a la solucin. Despus de una
centrifugacin final a 4.000 g durante 10 minutos para eliminar los restos celulares, la capa superior, que
contiene el antgeno soluble concentrado, se distribuye en viales y se guarda a 20C hasta su utilizacin.
Para su utilizacin en la prueba, se reconstituye con PBS a la concentracin de protena ptima
predeterminada (aproximadamente 20 g/ml) medida por el mtodo de Lowry. El mtodo ELISA es til para
diagnosticar la leishmaniosis del Viejo y del Nuevo Mundo. No existe o hay poca reaccin cruzada con otras
enfermedades y, dependiendo de la cepa de Leishmania utilizada, la sensibilidad vara del 86% al 99%.
436
Se considera que una versin de ELISA, llamada prueba de anlisis por ensayos Falcon y
enzimoinmunoensayo (FASTELISA), que utiliza bolas recubiertas de antgeno, es una prueba sensible,
especfica y adaptable a las condiciones de campo para la CanL visceral, con sensibilidad y especificidad
que son comparables a las de las pruebas IFI y ELISA. La sangre completa o el plasma se pueden evaluar
rpidamente sin el uso de un microscopio o de un espectrofotmetro (2).
Para el diagnstico en ELISA de la CanL, se ha utilizado un antgeno del promastigote soluble en
detergente en vez de lisados totales. El detergente fue Tritn X100 y extracto proteico se protegi con
inhibidores de proteasas. Utilizando este mtodo, la sensibilidad del ELISA aument hasta el 99,5%,
mientras que su especificidad fue comparable con la de la prueba IFI (97%) (17).
Los mtodos ELISA descritos anteriormente se basan en preparaciones antignicas crudas. Ms
recientemente, se ha descrito un antgeno recombinante de una protena clonada de L. chagasi, llamada
rK39, que es muy reactiva con sueros de casos de leishmaniosis visceral humana y canina cuando se
emplea en un formato ELISA. Utilizando 2550 ng del antgeno, se detect un 99% de especificidad y de
sensibilidad para pacientes humanos inmunocompetentes con LV clnica y para perros con enfermedad
parasitolgica demostrada (3, 28). En pacientes positivos para HIV el ELISAK39 mostr mayor sensibilidad
(82%) que la prueba IFI (54%) (14). El antgeno K39, que posee una estabilidad y reproducibilidad notables,
se produce ahora comercialmente.
c)
Prueba de aglutinacin directa

Para el diagnstico de la LV y la CanL se ha descrito la prueba de la aglutinacin directa (DAT). Despus
de mejoras, la DAT se ha validado como una prueba especfica y sensible para investigaciones de campo
(4, 24). El antgeno consiste en promastigotes recogidos de cultivos, lavados con PBS, pH 7.2, tratados con
0,4% de tripsina (durante 45 minutos a 37C y luego lavados de nuevo), y teidos con 0,02% de azul
brillante Coomassie. En pocillos con fondo en V de placas de microtitulacin se preparan diluciones dobles
seriadas de suero en PBS; se aade a cada pocillo 50 l de preparacin de antgeno y la placa se agita
cuidadosamente con la mano y se deja 18 horas a temperatura ambiente. La prueba se estima visualmente
contra un fondo blanco. Las reacciones positivas indican un botn azul de bordes limpios.
Una prueba DAT modificada para la deteccin de anticuerpos especficos contra leishmanias en
hospedadores caninos resulta muy adecuada para trabajos epidemiolgicos y ecolgicos de campo a gran
escala y para el diagnstico de CanL, mostrando una sensibilidad del 100% y una especificidad del 98,9%
(11, 12). La fiabilidad de esta prueba se ha mejorado tratando los sueros de ensayo con 0,2 M de 2
mercaptoetanol e incubndolos a 37C.
d)
Contrainmunoelectroforesis (CIEP)
El principio general de esta prueba es que el movimiento de la mayora de las molculas de protena es
hacia el nodo, excepto las gammaglobulinas, que se mueven hacia el ctodo. Esta propiedad se utiliza
en la prueba de contrainmunoelectroforesis (CIEP). El anticuerpo se mueve hacia el ctodo bajo el flujo
electrosmtico y los antgenos cargados negativamente se mueven hacia el nodo y precipitan en contacto
con el antisuero. El procedimiento es el siguiente: se vierten en portas 35 ml de agarosa y se preparan
pocillos cuando la agarosa solidifica. El suero se coloca en el pocillo del nodo y el antgeno de leishmania,
preparado como si fuera para ELISA, en el pocillo del ctodo. El porta se coloca en una cubeta de
electroforesis con tampn barbitona, pH 8,2, y se conecta a las cmaras de tampn con tiras de papel de
filtro. Se aplica una corriente de aproximadamente 8 mAmp (miliamperios) y despus de 23 horas se
examina el porta para lneas de precipitacin. La prueba CIEP es un diagnstico fiable y en el caso de CanL
ha dado mejores resultados que el ELISA.
3.
Prueba de hirpersensibilidad retardada
La hipersensibilidad retardada es una caracterstica importante de todas las formas de leishmaniosis humanas y
se puede medir por la prueba de la leishmanina, tambin conocida como la reaccin de Montenegro (18). La
prueba cutnea de la leishmanina no tiene valor diagnstico para la CanL. La leishmanina es una suspensin de
promastigotes muertos y completos (0,51 x 107/ml) o desintegrados (250 g de protena/ml) en una
solucin salina libre de pirgenos que contiene fenol. Se desarrolla una reaccin retardada que aparece a las
4872 horas.
La tasa de reacciones positivas falsas en gente sana es de aproximadamente el 1%, pero puede ser mayor en
reas donde existe un fondo de leishmaniosis, pues mucha poblacin sana puede mostrar una elevada
sensibilidad a la leishmanina. Existe una reaccin cruzada completa entre todas las cepas de Leishmania,
aunque a menudo los antgenos heterlogos dan una reaccin menor, pero esto puede estar originado por
dificultades de estandarizacin. Se utiliza en el diagnstico clnico de LC y LMC. Solo indica infecciones pasadas
porque durante la enfermedad activa se produce una anergia completa. Las leishmaninas ya no estn
disponibles en el mercado.
437

1.
Vacuna
No hay una vacuna efectiva disponible para la inmunizacin profilctica contra la leishmaniosis. Hasta ahora, la
nica vacunacin segura contra Leishmania se ha limitado a la proteccin de los humanos contra L. tropica y
L. major por infeccin previa inducida por inyeccin de organismos de L. major. Los promastigotes se inyectan en
el brazo y otras partes del cuerpo. Los promastigotes vivos que se utilizan deben proceder de cultivos recientes o
estar conservados en nitrgeno lquido. Se deja que la infeccin prosiga su curso normal y, despus de la
recuperacin, el individuo queda inmune frente a una infeccin subsecuente con ambas leishmanias. Este tipo de
inmunizacin se ha practicado a escala limitada en reas hiperendmicas de LC (causada por L. major) en Israel,
Irn y la antigua URSS (31). Las preparaciones inmunizantes contenan promastigotes vivos, infecciosos y
virulentos. Sin embargo, en Irn se han realizado ensayos controlados al azar con una vacuna de L. major
muerta ms el bacilo de Calmette y Guerin contra la leishmaniosis cutnea animal y humana (22, 30), pero los
resultados han sido decepcionantes.
Leishmania major origina proteccin cruzada contra L. tropica, pero lo inverso no sucede. No obstante, esta
especie no puede considerarse segura por completo y puede convertir al hospedador inmunizado en un
reservorio que ser una fuente potencial de infeccin mientras la lesin quede sin curar. Por tanto, este tipo de
inmunizacin debe utilizarse solo en humanos que se desenvuelvan en reas de alto riesgo. Adems, no resulta
beneficioso en reas muy endmicas porque los individuos contraen la infeccin mucho antes de que este tipo
de preparacin confiera proteccin. Se tarda aproximadamente 3 meses antes de que se adquiera inmunidad. La
estandarizacin y el control de calidad de tales vacunas, que no estn disponibles en la actualidad, constituye
una necesidad urgente. En el momento presente, estn en fase de desarrollo varias vacunas prometedoras
contra las leishmanias (8). Las vacunas de primera generacin consisten en organismos muertos de Leishmania
mezclados con una baja concentracin de BCG como adyuvante. Varias preparaciones que utilizan
promastigotes enteros (autoclavados) o desintegrados por ultrasonicacin estn actualmente en ensayos en fase
III y en fase III para inmunizar contra los agentes de la LC en humanos y contra los de la LV en humanos y en
perros (6, 21). Recientemente se han utilizado en Brasil vacunas de subunidades como candidatos teraputicos,
con varios antgenos clonados, uno de los cuales es un poderoso adyuvante, para tratar en humanos
L. braziliensis resistente a drogas en las mucosas.
Las vacunas de segunda generacin, que estn en fase de predesarrollo, consisten en parsitos de Leishmania
genticamente reconstruidos e incapaces de producir la enfermedad, en molculas recombinantes de sus ADNs
correspondientes, o en organismos recombinantes que llevan genes de leishmanias y expresan antgenos del
parsito.
2.
Antgenos de inmunodiagnstico
Ni la leishmanina utilizada para pruebas cutneas ni los antgenos empleados en el serodiagnstico de la

leishmaniosis estn estandarizados internacionalmente. La prueba de la leishmanina es especfica de grupo, no
de especie, y la leishmanina preparada a partir de un tipo clnico de leishmaniosis causar el desarrollo de
hipersensibilidad retardada al mismo o a otros tipos clnicos. De modo similar, las reacciones serolgicas
cruzadas son comunes entre las especies de leishmanias.
a)
Leishmanina
La prueba de la leishmanina se describe en la Seccin B.3. Para las preparaciones de leishmanina se
requieren pruebas de esterilidad, inocuidad y potencia.
b)
Antgenos para pruebas serolgicas

Los antgenos comerciales que se han producido para las pruebas IFI y ELISAs estn an bajo evaluacin.
La principal razn de los resultados poco satisfactorios con estos antgenos es su baja estabilidad. Se
pueden obtener en el laboratorio creciendo una cepa de Leishmania en un medio de cultivo adecuado. Para
la prueba IFI y la DAT, se necesitan antgenos crudos particulados, es decir, promastigotes intactos,
mientras que para las pruebas ELISAs y CIEP se necesita una forma soluble del antgeno.
3.
Control del inculo
a)

Las cepas de especies de Leishmania que se usan para preparar productos biolgicos deben identificarse a
nivel de especie y subespecie mediante las pruebas de identificacin pertinentes dadas en la seccin B.1.
Una vez que los organismos se han aislado y establecido en el laboratorio, se les debe asignar un Cdigo
Internacional (27, 34, 38). Este cdigo consta de cuatro elementos separados por barras oblicuas: (a) el tipo
438
de hospedador del que la cepa se asla (M para mamferos e I para insectos, seguido de tres letras que
indican el nombre genrico del hospedador); (b) el pas donde se asla , indicado por un cdigo de dos
letras; (c) el ao del aislamiento indicado por los dos ltimos dgitos, y (d) el cdigo original del laboratorio
dado al aislamiento (por ejemplo, MHOM/IN/80/DD8). Los parsitos deben estar libres de organismos
contaminantes y ser capaces de originar un producto adaptado a las normas. Las cepas estndar estn
disponibles previa peticin a la los Centros Colaboradores de la Organizacin Mundial de la Salud (OMS)
en Londres, Reino Unido, Montpellier, Francia y Jerusaln, Israel. La OMS ha publicado una lista de
Centros de Identificacin (38).
b)
Mtodo de cultivo
La cepa de parsito utilizada para preparar leishmanina debe ser capaz de producir un producto que se
adapte a las normas nacionales/internacionales. Debe carecer de ingredientes que causen reacciones
txicas o alrgicas. No hay un antgeno nico estandarizado para utilizacin en las pruebas
serodiagnsticas, pero cuando estos antgenos se preparan en el laboratorio deben estandarizarse en
cuanto a sensibilidad dependiendo de las necesidades. Tanto para la preparacin de leishmanina como
para la de antgenos de serodiagnstico, los organismos deben crecerse en un medio de cultivo adecuado
(como los recomendados en la Seccin B.1. para aislamiento y crecimiento en masa de Leishmania).
Normalmente, se obtiene un buen crecimiento de los parsitos a los 7 das de la inoculacin y se debe
tener cuidado de que los stocks de leishmanias no se pierdan por sobrecrecimiento de los flagelados, lo
que puede ocurrir despus de aproximadamente 10 das.
c)
Crioconservacin
Los cultivos de promastigotes y los tejidos infectados con amastigotes se pueden conservar fcilmente en
estado vivo a bajas temperaturas. Ambas formas se pueden crioconservar durante aos a temperaturas
bajas en congeladores mecnicos (70C), en contenedores de dixido de carbono slido (76C) o en
recipientes de nitrgeno lquido (196C) (34). Se necesita un agente crioprotector - glicerol, a una
concentracin final de 7,510%, o dimetil sulfxido (DMSO) a una concentracin final de 57,5%.
Las muestras se transfieren a los contenedores estriles en los que van a ser congeladas. Estos pueden
ser tubos de plstico de 2 ml para congelacin con tapn de rosca ajustado, vidrio duro, ampollas cerradas
al fuego, o capilares de vidrio/plstico. Para la crioconservacin de Leishmania es esencial una velocidad
de enfriamiento lenta (aproximadamente 1C/minuto). Esto se puede conseguir enfriando las muestras a
4C y mantenindolas a esta temperatura por un tiempo mnimo de 1 hora; luego se pasan a un congelador
a 20C y se dejan durante 24 horas, a continuacin se llevan a un congelador a 70C y se dejan por lo
menos 24 horas. Pueden guardarse de modo permanente a esta temperatura o transferirse a nitrgeno
lquido o a dixido de carbono slido. Si es posible, se debe utilizar una unidad congeladora con
programacin. Cuando se necesita el material crioconservado, se saca la muestra y se descongela
rpidamente en un bao a 37C.
d)
Validacin
Antes de su utilizacin, los cultivos para leishmanina o antgenos de serodiagnstico deben examinarse
para esterilidad. La leishmanina se guarda a 4C y los antgenos de serodiagnstico a 20C o 70C hasta
que se necesiten. Los ltimos se deben reconstituir con PBS, pH 7,2, antes de su utilizacin. Los cultivos
viables de Leishmania se pueden mantener a 70C durante 34 aos o indefinidamente a 196C. Debido
a la falta de disponibilidad de una vacuna adecuada, no ha sido posible validar los agentes inmunizantes
actualmente desarrollados. Los promastigotes vivos o atenuados de L. major que se utilizan en algunas
reas estn lejos de resultar satisfactorios. La lesihmanina debe ser probada para su capacidad alrgica en
cobayas antes de utilizacin. Los antgenos de serodiagnstico deben probarse para eficacia y sensibilidad
mediante estandarizacin propia para cada prueba particular. Si un lote de antgeno no se ha utilizado
desde hace mucho tiempo, debe volverse a comprobar antes de utilizarlo en una prueba.
4.
Mtodo de produccin
Como no hay antgenos estandarizados para inmunodiagnstico, es necesario prepararlos en el laboratorio. El

personal de laboratorio corre el riesgo de adquirir la infeccin, especialmente por inyeccin. Por consiguiente son
esenciales unas precauciones apropiadas de bioseguridad para reducir los riesgos (ver Captulo I.1.6. Seguridad
humana en los laboratorios veterinarios de microbiologa).
a)
Leishmanina
Las especies de Leishmania se crecen preferiblemente en medio lquido libre de sangre como el medio
Drosophila de Schneider y el medio RPMI (Rosewell Park Memorial Institute), para evitar contaminacin con
antgenos de la sangre. Los promastigotes se recogen durante la fase logartmica, se lavan cuatro veces
con solucin salina libre de pirgenos a 1.000 g durante 15 minutos, y se resuspenden en solucin salina
libre de pirgenos que contenga 0,5% de fenol (p/v) hasta obtener una concentracin final de 0,51 x 107
439
/ml. La leishmanina tambin se puede obtener de promastigotes lisados obtenidos de modo similar y
sonicados. El filtrado se ajusta a una concentracin final de protena de 250 g/ml con solucin salina libre
de pirgenos que contenga Tween 80 (0,0005% [v/v]) y fenol (0,28% [p/v]).
b)
Antgenos para pruebas serolgicas

Los mtodos de preparacin de antgeno para diversas pruebas se presentan en la Seccin B.2.
5.
Control del proceso
Deben probarse en cobayas uno o ms lotes de leishmanina para pruebas de alergia. La sensibilidad y la
especificidad de la leishmanina deben determinarse preferentemente realizando la prueba en modelos animales
apropiados (diferentes razas de ratones de acuerdo con las especies de Leishmania) o en pacientes que se han
recuperado de infecciones por leishmania, y en una poblacin control no expuesta al agente infeccioso.
6.
Control de lotes
La OMS ha sugerido normas para la produccin de leishmanina (36, 37). Se recomienda que el material de
origen se controle mediante anlisis de isozimas para tipificar las cepas de Leishmania utilizadas en la
preparacin de leishmanina.
a)
Esterilidad
Cada lote completado debe probarse para esterilidad bacteriana y mictica de acuerdo con la OMS (35). La
ausencia de leishmanias vivas se comprueba inoculando una muestra de cada lote en un medio de agar
sangre adecuado, que luego se incuba a 23C por lo menos durante 15 das. Se inyecta en ratones o en
hmsters una muestra intradrmicamente (para leishmanias dermotrpicas) o intraperitonealmente (para
leishmanias viscerotrpicas). Estos animales se observan durante un perodo de 3090 das.
b)
Inocuidad
Las muestras de cada lote completado se deben probar para toxicidad anormal mediante
pruebas adecuadas en cobayas y conejos. Por cada lote, se inyectan subcutnea o intraperitonealmente
con una dosis humana del producto cinco ratones que pesen entre 1722 g y dos cobayas que pesen entre
250350 g. A continuacin se observan los animales para muerte o sntomas de enfermedad por lo menos
durante 7 das.
c)
Potencia
La leishmanina se prueba en modelos animales (de acuerdo con las especies de Leishmania implicadas)
que se han infectado previamente con la misma cepa que la utilizada en la produccin de leishmanina. Se
inyectan intradrmicamente grupos de al menos cinco animales infectados y animales control con 50 l de
leishmanina en una de las patas posteriores. A los 23 das, todos los animales infectados deben mostrar
un notable ensanchamiento de la pata en comparacin con los animales control.
Todava tiene que establecerse una preparacin estndar internacional. La Seccin de Leishmaniosis del
Programa de Investigacin de Enfermedades Tropicales de la OMS financia programas dirigidos a lograr
una estandarizacin satisfactoria de la produccin de leishmanina.
7.
a)
Inocuidad
Ver Seccin C.6.b.
b)
Potencia
Ver Seccin C.6.c.
440
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*
* *
443
SECCIN 2.3.
ENFERMEDADES DE LOS BVIDOS DE LA LISTA B
CAPTULO 2.3.1.
BRUCELOSIS BOVINA
RESUMEN
La brucelosis bovina suele estar causada por Brucella abortus, menos frecuentemente por
B. melitensis y ms raramente por B. suis. La infeccin est globalmente muy extendida. Algunos
pases del norte y del centro de Europa, Canad, Japn, Australia y Nueva Zelanda se consideran
libres del agente.
Clnicamente, la enfermedad se caracteriza por uno o ms de los sntomas siguientes: aborto,
retencin de placenta, orquitis, epididimitis y, raramente artritis, con excrecin de los
microorganismos en las descargas uterinas y en la leche. El diagnstico depende del aislamiento
de Brucella del material de los abortos, de las secreciones de la ubre y de tejidos analizados postmortem. Se puede realizar un diagnstico preliminar determinando la respuesta especfica
mediada por clulas o la serolgica frente a los antgenos de Brucella.
Brucella abortus, B. melitensis y B. suis son muy patgenos para los humanos y tanto todos los
tejidos infectados, como los cultivos y el material potencialmente contaminado deben manejarse
bajo condiciones apropiadas de contencin.
Identificacin del agente: La evidencia preliminar de Brucella la suministra la observacin de la
morfologa de Brucella, por tincin modificada de cido-alcohol resistentes, en los materiales de
abortos o descargas vaginales, especialmente si est apoyada por pruebas serolgicas. La
reaccin en cadena de la polimerasa recientemente desarrollada proporciona medios adicionales
de deteccin. Cuando sea posible, se debe aislar Brucella en medios normales o selectivos
cultivando las descargas uterinas, los fetos abortados, las secreciones de las ubres o tejidos
seleccionados, como los ganglios linfticos, los testis o el epididimo. Las especies y biotipos
deberan identificarse por lisis fgica y por criterios de cultivo, bioqumicos y serolgicos. Ms
recientemente, se han introducido tcnicas moleculares como mtodos adicionales de biotipado.
Pruebas serolgicas y alrgicas cutneas: Las pruebas con antgeno tamponado de Brucella,
es decir la prueba con rosa de bengala y la prueba de aglutinacin tamponada en placa, as como
la fijacin de complemento, el enzimoinmunoensayo (ELISA) o el ensayo de polarizacin de
fluorescencia, son pruebas adecuadas para analizar rebaos y animales individuales. Sin
embargo, ninguna prueba serolgica aislada es adecuada para todas y cada una de las
situaciones epidemiolgicas. Por tanto, la reactividad de las muestras que son positivas en
pruebas de anlisis deben confirmarse utilizando una estrategia confirmativa establecida. La
prueba ELISA indirecta o la del anillo de leche, realizadas con muestras de leche completa, son
eficaces para analizar y controlar la brucelosis en vacas lecheras, pero la prueba del anillo de
leche es menos fiable en grandes rebaos. Otra prueba inmunolgica es la prueba cutnea de la
brucelina, que puede utilizarse en anlisis o como una prueba confirmativa en rebaos cuando
existe reaccin serolgica positiva en ausencia de factores de riesgo obvios en rebaos no
vacunados.
Requisitos para las vacunas y los materiales de diagnstico: La cepa 19 de Brucella abortus
contina siendo la vacuna de referencia con la que se comparan otras vacunas. Debe prepararse a
445
Captulo 2.3.1. Brucelosis bovina
partir de inculos de siembra derivados de EE.UU. y cada lote debe cumplir un mnimo de
condiciones respecto a viabilidad, ligereza, virulencia residual y capacidad para inmunizar ratones
frente a un desafo con una cepa virulenta de B. abortus. La vacuna con la cepa RB51 de Brucella
abortus se obtuvo de una cepa mutante, rugosa, de laboratorio, derivada de la cepa lisa 2308 de
B. abortus. Sin embargo, su eficacia en el ganado bovino y su falta de inocuidad son objeto de
debate. Las preparaciones de brucelina para la prueba intradrmica deben estar libres de
lipopolisacrido liso y no deben producir reacciones inflamatorias inespecficas ni interferir con las
pruebas serolgicas. Los antgenos para el diagnstico deben prepararse de cepas lisas de
B. abortus, las cepas 1119-3 99, y deben cumplir un estndar mnimo de pureza, sensibilidad y
especificidad.
A. INTRODUCCIN
En el ganado bovino la brucelosis suele estar causada por biotipos de Brucella abortus. En algunos pases,
particularmente en el sur de Europa y en el oeste de Asia, donde el ganado se asocia con ovejas o cabras, la
infeccin puede ser tambin debida a B. melitensis. En ocasiones, B. suis puede causar una infeccin de las
mamas en el ganado bovino pero no se ha descrito que origine abortos (16). Normalmente la enfermedad es
asintomtica en hembras no gestantes. Despus de la infeccin por B. abortus o por B. melitensis, las hembras
adultas en gestacin desarrollan una placentitis que por lo general conduce al aborto entre el quinto y el noveno
mes de gestacin. Incluso en ausencia de aborto se produce gran excrecin de microorganismos a travs de la
placenta, los lquidos fetales y las descargas vaginales. Las mamas y los ganglios linfticos asociados tambin
pueden infectarse y los microorganismos pueden aparecer en la leche. Las gestaciones posteriores llegan por lo
general a trmino, pero la infeccin uterina y la mamaria se repite, con un nmero reducido de microorganismos
en los productos del parto y en la leche. En las infecciones agudas, el microorganismo est presente en la
mayora de los ganglios linfticos. Los machos adultos pueden desarrollar orquitis, y la brucelosis puede causar
esterilidad en ambos sexos. Una manifestacin corriente de la brucelosis en algunos pases tropicales son los
higromas, por lo general en las articulaciones de las patas, que pueden representar el nico indicador de la
infeccin; con frecuencia, el lquido de los higromas est infectado por Brucella.
La brucelosis se ha descrito tambin en el camello de una joroba (Camelus dromedarius) y en el de dos jorobas
(C. bactrianus) como consecuencia de contactos con rumiantes infectados con B. abortus o B. melitensis.
Adems, se ha observado en el bfalo domstico (Bubalus bubalus), bisonte americano y europeo (Bison bison,
Bison bonasus), yak (Bos grunniens), elk/wapiti (Cervus elaphus), as como en el bfalo africano (Syncerus
caffer) y en varias especies de antlopes africanos. Las manifestaciones de la brucelosis en estos animales son
similares a las del ganado bovino.
El manual de bioseguridad para laboratorios elaborado por la Organizacin Mundial de la Salud (OMS) clasifica a
los microorganismos del gnero Brucella en el Grupo de Riesgo III. La brucelosis se transmite fcilmente al
hombre y causa una enfermedad febril aguda la fiebre ondulante- que puede convertirse en crnica y producir
complicaciones graves que afectan a los msculos esquelticos, al sistema cardiovascular y al sistema nervioso
central. A menudo la infeccin se debe a una exposicin profesional y se adquiere por va oral, respiratoria o
conjuntival, pero el riesgo mayor para la poblacin general es la ingestin de productos lcteos contaminados.
Los veterinarios y granjeros que manejan animales infectados, fetos abortados o placentas, estn expuestos a
riesgo laboral. La brucelosis es una de las enfermedades de ms fcil adquisicin en el laboratorio, y se deben
observar precauciones de seguridad muy estrictas cuando se manejen cultivos y muestras infectadas, como los
productos del aborto. Existen recomendaciones especficas que han de seguirse con materiales infectados por
Brucella (para ms detalles ver las referencias 1, 28, 67, 68 y el Captulo I.1.6. Seguridad humana en el
laboratorio veterinario de microbiologa). La manipulacin en el laboratorio de cultivos vivos o de material animal
contaminado es peligrosa y debe realizarse en un nivel de contencin 3 o superior, como se indica en el Captulo
I. 1. 6, para reducir la exposicin ocupacional. Para manejar grandes cantidades de Brucella se recomienda
tambin un nivel de contencin 3, como mnimo.
La evidencia gentica e inmunolgica indica que todos los miembros del gnero Brucella estn estrechamente
relacionados, y se ha propuesto (aunque an no est aceptado por el Subcomit de Taxonoma) que el gnero
contenga una sola especie de la que las especies clsicas (abortus, melitensis, etc.), que seran entonces meros
biotipos (para una revisin, ver la referencia 36). Sin embargo existen diferencias reales entre las principales
variantes en cuanto a preferencia de hospedadores y a la epidemiologa, as como evidencias moleculares de
variaciones genmicas. Desde el punto de vista prctico resulta conveniente mantener la clasificacin de las seis
especies clsicas: Brucella abortus, B. melitensis, B. suis, B. neotomae, B. ovis y B. canis. Las tres primeras se
subdividen en biotipos por propiedades de cultivo y serolgicas (ver Cuadros 1 y 2 al final de este captulo). En la
ltima dcada se han aislado cepas de Brucella de mamferos marinos que no pueden adscribirse a ninguna de
las anteriores especies reconocidas. Hay investigaciones en curso para establecer su posicin correcta en la
taxonoma del gnero y se ha propuesto que podran clasificarse en dos nuevas especies, B. cetaceae y
446
B. pinnipediae (10, 18). Por ltimo, Brucella muestra una estrecha relacin gentica con patgenos y simbiontes
de plantas de los gneros Agrobacterium y Rhizobium, as como con patgenos animales (Bartonella) y con
bacterias oportunistas o del suelo (Ochrobactrum).
Todos los abortos en el ganado bovino deben considerarse como casos sospechosos de brucelosis y deberan
investigarse. El cuadro clnico no es patognomnico, aunque la historia del rebao puede servir de ayuda. El
diagnstico inequvoco de infecciones por Brucella solo puede hacerse por aislamiento e identificacin de
Brucella, pero en situaciones en las que no es posible el anlisis bacteriolgico, el diagnstico puede basarse en
mtodos serolgicos. No existe una prueba nica que permita la identificacin de Brucella. Normalmente se
necesita una combinacin de las caractersticas de crecimiento y mtodos serolgicos y bacteriolgicos.
1.
Identificacin del agente (1, 28)
a)
Mtodos de tincin
El gnero Brucella est formado por cocobacilos o bacilos cortos que miden 0,6-1,5 m de largo por 0,50,7 m de ancho. Normalmente aparecen aislados, y con menos frecuencia en pares o en grupos
pequeos. La morfologa de los microorganismos del gnero Brucella es bastante constante aunque en
cultivos viejos se observan formas pleomrficas. No es una bacteria mvil. No forma esporas ni flagelos, ni
fimbrias o cpsulas verdaderas. Los microorganismos del gnero Brucella son Gram negativos y no suelen
mostrar tincin bipolar. No son verdaderamente bacterias cido-alcohol resistentes, pero resisten a la
decoloracin por cidos dbiles y se tien de rojo por la modificacin de Stamp del mtodo de ZiehlNeelsen. ste mtodo constituye el procedimiento normal para el examen de frotis de rganos o lquidos
biolgicos, que se fijan previamente con calor o etanol, y por este mtodo los microorganismos se tien de
rojo frente a un fondo azul. Tambin puede utilizarse una tcnica basada en un anticuerpo conjugado a un
fluorocromo o marcado con peroxidasa (53). La presencia de microoorganismos intracelulares con
morfologa de Brucella, dbilmente resistentes a cidos, o inmunoespecficamente teidos, es una
evidencia preliminar de brucelosis. Sin embargo, estos mtodos presentan una baja sensibilidad en la leche
y en productos lcteos donde los microorganismos del gnero Brucella se presentan a menudo en nmero
bajo, y donde la presencia de glbulos de grasa impide frecuentemente una interpretacin correcta. En la
interpretacin de los resultados positivos por el mtodo de Stamp tambin debe tenerse en cuenta que
otros microorganismos que causan aborto son difciles de diferenciar de Brucella, como Chlamydophila
abortus (antes Chlamydia psittaci) o Coxiella burnetii. Los resultados, tanto positivos como negativos, deben
confirmarse por cultivo.
Para demostrar el agente en diversas muestras biolgicas se pueden utilizar mtodos en desarrollo
basados en sondas de ADN o en la reaccin en cadena de la polimerasa (PCR) (8).
b)
Cultivo
i)
Medio basal
El aislamiento y cultivo directo de Brucella se realiza normalmente en medio slido. En general, ste
representa el mtodo ms satisfactorio porque permite el desarrollo de colonias aisladas fcilmente
reconocibles. Los medios slidos tambin limitan el establecimiento de mutantes no lisos y el
desarrollo excesivo de contaminantes. Sin embargo, el empleo de medios lquidos puede
recomendarse para muestras voluminosas o con fines de enriquecimiento. Se dispone de un amplio
rango de medios basales comercializados en forma deshidratada, por ejemplo el medio base para
Brucella, agar tripcasa (o triptona)-soja (TSA). Es necesario aadir 2-5% de suero bovino o equino
para el crecimiento de algunas cepas como el biotipo 2 de B. abortus, y muchos laboratorios lo aaden
sistemticamente al medio basal con resultados excelentes, como en el caso del agar sangre (Oxoid)
o agar Columbia (BioMrieux). Se pueden utilizar otros medios satisfactorios como el agar suerodextrosa (SDA) o el agar glicerol-dextrosa (1). El medio SDA es normalmente el preferido para la
observacin de la morfologa colonial. Para el aislamiento de Brucella de la sangre o de la leche, y de
otros lquidos del cuerpo, donde se aconseja un cultivo de enriquecimiento, se recomienda un medio
bifsico no selectivo conocido como medio de Castaeda. Este medio se emplea porque las brucelas
tienden a disociarse en medio lquido y esto interfiere con la biotipificacin por tcnicas bacteriolgicas
convencionales.
ii)
Medios selectivos
Todos los medios basales indicados antes se pueden emplear para la preparacin de medios
selectivos. Se aaden antibiticos apropiados para evitar el crecimiento de organismos distintos a
Brucella. El medio selectivo ms difundido es el de Farrell (17), que se prepara aadiendo seis
447
antibiticos a un medio basal. Se aaden las siguientes cantidades por 1 litro de medio: sulfato de
polimixina B (5.000 unidades = 5 mg); bacitracina (25.000 unidades = 25 mg); natamicina (50 mg);
cido nalidxico (5 mg); nistatina (100.000 unidades); vancomicina (20 mg).
Se ha comercializado un suplemento de antibiticos liofilizado (Oxoid). Sin embargo, a las
concentraciones utilizadas en el medio de Farrell, el cido nalidxico y la bacitracina pueden tener
efectos inhibidores sobre algunas cepas de B. melitensis (34). Por ello, la sensibilidad del aislamiento
de B. melitensis aumenta cuando se utilizan tanto el medio de Farrell como el medio de Thayer-Martin.
En esencia, el medio modificado de Thayer-Martin se puede preparar con medio base GC (38 g/litro;
Biolife Laboratories, Milan, Italia) suplementado con hemoglobina (10 g/litro; Difco) y metanosulfonato
de colistina (7,5 mg/litro), vancomicina (3 mg/litro), nitrofurantona (10 mg/litro), nistatina (100.000
Unidades Internacionales [UI]/litro = 17,7 mg) y anfotericina B (2,5 mg/litro) (todos los productos de
Sigma Chemical, St Louis, EE. UU) (34). A diferencia de otros biotipos de B. abortus, el crecimiento de
B. melitensis no es dependiente de la presencia de una atmsfera con 5-10% de CO2 (Cuadro 2).
Como el nmero de microorganismos de Brucella en la leche, en el calostro y en algunas muestras
tisulares, es probablemente menor que en material de abortos, se recomienda un enriquecimiento. En
el caso de la leche, los resultados tambin mejoran por centrifugacin y cultivo de la capa cremosa y
del precipitado. El enriquecimiento se puede realizar en medio lquido con suero-dextrosa, con caldo
de tripticasa (o triptona)-soja o con caldo para Brucella suplementado con una mezcla de antibiticos
que lleve al menos anfotericina B (1 g/ml) y vancomicina (20 g/ml) (concentraciones finales). El
medio de enriquecimiento debe incubarse a 37C en atmsfera aerobia con 5-10% (v/v) de CO2 hasta
6 semanas, con subcultivos semanales a un medio slido selectivo. Si se prefiere, se puede utilizar un
sistema bifsico con medio selectivo lquido y slido en la misma botella (tcnica de Castaeda) para
reducir el subcultivo. Para el aislamiento de Brucella de la leche se recomienda a veces un medio
selectivo bifsico que se compone del medio basal de Castaeda al que se aaden los siguientes
antibiticos en la fase lquida (las cantidades que se indican son por litro de medio): sulfato de
polimixina B (6000 unidades = 6 mh); bacitracina (25.000 unidades = 25 mg); natamicina (50 mg);
cido nalidxico (5 mg); anfotericina B (1 mg); vancomicina (20 mg); D-cicloserina (100 mg).
Todos los medios de cultivo deben someterse a controles de calidad y permitir el crecimiento de cepas
difciles de cultivar, como el biotipo 2 de B. abortus, a partir de inculos pequeos.
En medios slidos adecuados, las colonias de Brucella son visibles despus de 2 das de incubacin.
A los 4 das las colonias son redondas, de 1-2 mm de dimetro, con bordes lisos. Son translcidas y
de color miel plido a la luz del da en medio transparente. Vistas desde arriba son convexas y de
color blanco perla. Posteriormente las colonias se hacen ms grandes y ligeramente ms oscuras.
Los cultivos lisos de Brucella (S) presentan tendencia a sufrir variaciones durante el crecimiento,
especialmente con subcultivos, y aparecen formas rugosas (R). Las colonias son entonces mucho
menos transparentes, presentan una superficie mate ms granular y el color vara de blanco mate a
marrn con luz reflejada o trasmitida. La comprobacin de esta transicin se realiza fcilmente por
tincin con cristal violeta: las colonias rugosas aparecen rojas y las lisas de color amarillo plido. Si las
colonias son lisas deben probarse con antisuero contra B. abortus lisa, o preferiblemente con
antisueros monoespecficos contra los antgenos de superficie A y M. En el caso de colonias rugosas,
las colonias deben probarse con antisuero contra el antgeno R de Brucella. Por lo general, los
cambios de morfologa colonial se asocian con cambios en la virulencia, en las propiedades
serolgicas y/o en la sensibilidad a los fagos. La aglutinacin positiva con un antisuero anti-Brucella es
una identificacin preliminar de que el aislado corresponde a Brucella. La identificacin posterior
completa se realiza mejor en un laboratorio de referencia.
iii)
Toma y cultivo de muestras

Para el diagnstico de la brucelosis animal mediante cultivo, la eleccin de las muestras depende en
general de los sntomas clnicos observados. Las muestras ms adecuadas incluyen fetos abortados
(contenido estomacal, bazo y pulmones), membranas fetales, descargas vaginales (frotis), leche,
semen y lquidos artrticos o de los higromas. Los tejidos preferidos para cultivo de las canales
animales son los del sistema retculo-endotelial (ganglios linfticos de la cabeza, mamarios y
genitales, y el bazo), el tero inmediatamente antes o despus del parto, y las ubres. El crecimiento
aparece generalmente despus de 2-3 das, pero no se deben desechar los cultivos como negativos
hasta despus de 810 das.
Tejidos: Las muestras se toman aspticamente con instrumentos estriles y se maceran con un
Stomacher o en un homogenizador de tejidos con una pequea cantidad de solucin salina estril
tamponada con fostato (PBS), antes de inocularlas en medios slidos.
Descargas vaginales: Una fuente excelente para recoger Brucella es un frotis vaginal tomado despus
del aborto o del parto, y es menos arriesgado para el personal que el material del aborto. El frotis se
extiende sobre los medios slidos.
Leche: Las muestras de leche deben recogerse con limpieza despus de lavar y secar toda la ubre y
desinfectar los pezones. Es esencial que las muestras contengan leche de todas las partes, y se
deben tomar 10-20 ml de cada cuartern. Los primeros chorros se desechan y la muestra se recoge
directamente en un recipiente estril. Debe tenerse cuidado en evitar el contacto entre la leche y las
448
manos del ordeador. La leche se centrifuga a 2.000 g durante 15 minutos en tubos cerrados (para
evitar el riesgo de formacin de aerosoles que contaminen al personal), y se extienden la capa
cremosa y el precipitado sobre los medios slidos, por separado o conjuntamente. Si las brucelas
estn presentes en la leche completa, su nmero suele ser muy bajo y es improbable el aislamiento a
partir de tales muestras.
Derivados lcteos: Los productos lcteos, como los quesos, deben cultivarse en los medios descritos
arriba. Como es probable que estos materiales contengan un nmero pequeo de microorganismos,
se recomiendan cultivos de enriquecimiento. Se necesita que las muestras estn homogenizadas
cuidadosamente antes del cultivo, despus de haberlas sometido a un triturador de tejidos, a un
Stomacher o a una batidora elctrica con un volumen adecuado de PBS estril. Deben cultivarse las
capas superficiales (corteza y regin adyacente) y el interior del producto. Como las brucelas viven,
crecen y desaparecen rpidamente, su distribucin por las diferentes partes del producto vara en
funcin de las condiciones fsico-qumicas locales relacionadas con la tecnologa especfica del
proceso.
Despus de la toma, todas las muestras deben enfriarse rpidamente y transportarse al laboratorio por
el mtodo ms rpido. A su llegada, la leche y las muestras de tejido deben congelarse si no se
cultivan de inmediato.
El empleo de animales de laboratorio debe evitarse a menos que sean absolutamente necesarios,
aunque a veces constituyen el nico medio para detectar la presencia de Brucella, sobre todo cuando
las muestras estn muy contaminadas o contienen un nmero bajo de microorganismos del gnero
Brucella. La inoculacin animal puede ser subcutnea o a travs de la piel afeitada de cobayas o, con
preferencia, intravenosa en ratones. Este trabajo debe realizarse en condiciones de bioseguridad
como se indica en el Captulo I.1.6. Los bazos de los ratones se cultivan 7 das despus de la
inoculacin y, en el caso de los cobayas, se somete una muestra de suero a pruebas especficas a las
3 y 6 semanas de la inoculacin, y a continuacin se cultivan los bazos.
c)
Identificacin y tipificacin
Cualquier colonia con la morfologa similar a las de Brucella debe analizarse por la tincin de Gram (o por la
coloracin de Stamp). Como en las fases no lisas se alteran las propiedades serolgicas, tintoriales y de
sensibilidad a los fagos, la morfologa colonial resulta esencial para las pruebas de tipificacin que se
describen ms abajo. Los mtodos recomendados para observar la morfologa de las colonias son el
mtodo de Henry mediante luz reflejada oblicua, la prueba de la acriflavina descrita por Braun & Bonestell, o
el mtodo de White & Wilson de tincin de colonias con cristal violeta (1).
La identificacin de los microorganismos se puede realizar mediante una combinacin de las siguientes
pruebas: morfologa celular y tincin de Gram o de Stamp, propiedades de crecimiento, pruebas de ureasa,
oxidasa y catalasa, y la prueba de aglutinacin en porta con un suero policlonal anti-Brucella. La
identificacin de especies y de biotipos requiere pruebas ms elaboradas (como la lisis por fagos y la
aglutinacin con sueros monoespecficos anti-A, anti-N anti-R), cuya realizacin se lleva a cabo en
laboratorios de referencia con experiencia en estos mtodos. La utilizacin simultnea de varios fagos, es
decir, el Tbilissi (Tb), Weybridge (Wb), Izatnagar (Iz) y RC, representa un sistema de tipificacin fgica que,
con suficiente experiencia, permite identificar especies lisas y rugosas de Brucella. No obstante, algunas
propiedades, como el requerimiento de CO2 para crecer, la produccin de H2S (detectada por papeles con
acetato de plomo) y el crecimiento en presencia de fucsina bsica y tionina a concentraciones finales de
20 g/ml, se detectan por pruebas rutinarias que pueden realizarse en laboratorios no especializados
moderadamente equipados (ver Cuadros 1 y 2 al final de este captulo).
Cuando se envan cepas de Brucella a un laboratorio de referencia para tipificacin, es esencial seleccionar
cepas lisas. Los cultivos se liofilizan y se cierran en ampollas dentro de tubos con tampn de rosca o se
subcultivan en agar inclinado contenido en tubos con tapn de rosca. Tambin deben enviarse cepas
suspendidas en medio lquido (por ejemplo en el medio de transporte de Ames) pero esto puede suponer
una oportunidad para el establecimiento de mutantes rugosos.
i)
Brucella est situada entre las bacterias ms peligrosas con las que se trabaja, por el riesgo que
presenta de producir infecciones adquiridas en el laboratorio. Para transportar cultivos de Brucella, las
tapas de los recipientes deben estar bien cerradas y selladas con tapones de PVC. Deben envolverse
con papel adsorbente o con lana de algodn, sellarse en bolsas de polietileno y empaquetarse en un
contenedor rgido de acuerdo con las exigencias de la Asociacin para el Transporte Areo (IATA)
para el envo de muestras peligrosas (25). Estas regulaciones se resumen en el Captulo I.1.1.
Tcnicas de muestreo. Como los cultivos de Brucella son infecciosos, se designan UN2814 y se debe
realizar una Declaracin de Muestras Peligrosas. Los requisitos para enviar muestras sospechosas
son similares y se deben repasar las regulaciones de la IATA antes del envo. Tambin deben
seguirse otras directrices nacionales e internacionales (1, 28, 67, 68).
ii)
Antes de enviar cultivos o muestras de diagnstico para cultivo, debe de contactarse con el laboratorio
receptor para determinar si se necesita algn permiso especial y si el laboratorio tiene la capacidad de
449
realizar las pruebas solicitadas. Si las muestras atraviesan las fronteras nacionales, probablemente se
necesitar un permiso de importacin que debe obtenerse antes de despachar la muestra (ver
Apndice I.1.6.1 del Captulo I.1.6. Transferencia internacional y contencin de patgenos de origen
animale en el laboratorio).
d)

La PCR desarrollada recientemente supone un mtodo adicional de deteccin e identificacin de especies
de Brucella (8). Pese al alto grado de homologa del ADN dentro del gnero Brucella, se han desarrollado
varios mtodos que permiten, hasta cierto punto, la diferenciacin entre especies y algunos de sus biotipos,
como la PCR, el anlisis del polimorfismo de fragmentos de restriccin (RFLP) y la hibridacin tipo Southern
(para una revisin, ver las referencias 8 y 36). Se ha desarrollado tambin una electroforesis en campo
pulsante que permite la diferenciacin entre varias especies de Brucella (26, 35). Sin embargo, ninguno de
estos mtodos se ha evaluado y estandarizado por completo y no son de distribucin amplia.
e)
Identificacin de cepas vacunales

La identificacin de las cepas vacunales B. abortus S19, B. abortus RB51 y B. melitensis cepa Rev.1,
depende de pruebas adicionales.
Brucella abortus S19 presenta las propiedades normales de un biotipo 1 pero no requiere CO2 para crecer,
ni crece en presencia de bencilpenicilina (3 g/ml = 5 UI/ml), azul tionina (2 g/ml) o i-eritritol (1mg/ml)
(concentraciones finales), y presenta una elevada utilizacin de L-glutamato (1).
Brucella melitensis cepa Rev.1 tiene las propiedades normales de un biotipo 1 de dicha especie pero crece
mucho ms lentamente en medios ordinarios, no crece en presencia de fucsina bsica, ni con tionina
(2 g/ml) o bencilpenicilina (3 g/ml) (concentraciones finales), pero crece en presencia de de
estreptomicina a 2,5 o 5 g/ml (5 UI/ml) (1, 11, 12).
Brucella abortus cepa RB51 se identifica por varias propiedades: morfologa rugosa, crecimiento en
presencia de rifampicina (250 g por ml de medio), e incapacidad para producir el polisacrido O (OPS)
(56). La incapacidad para producir OPS se puede demostrar haciendo reaccionar colonias RB51 con
anticuerpos monoclonales (MAbs) especficos contra OPS, en ensayos puntuales o por inmunotransferencia
(53, 56). Un modo indirecto de demostrar la ausencia de OPS es inyectar 4 x 108 microorganismos RB51
viables en ratones BALB/c y determinar la induccin de anticuerpos anti-OPS; la serologa ser negativa
(56).
Las cepas vacunales S19, Rev.1 y RB51 se pueden identificar utilizando PCRs especficas (8, 9, 55, 63).
2.
Pruebas serolgicas
Ninguna prueba serolgica aislada es adecuada en todas y cada una de las situaciones epidemiolgicas,
presentando limitaciones en el anlisis de animales individuales (22, 42). Se deben considerar todos los factores
que influyen en la relevancia del mtodo de prueba y de sus resultados para una aplicacin o interpretacin
diagnstica especfica. Los mtodos serolgicos que se describen en esta captulo son mtodos estandarizados
y validados, con caractersticas de realizacin adecuadas para ser consideradas pruebas obligadas o alternativas
en el comercio internacional. Esto no impide el uso de pruebas modificadas o similares o la utilizacin de
reactivos diferentes. Sin embargo, los mtodos y reactivos descritos en este captulo suponen un estndar de
comparacin respecto a la realizacin esperada del diagnstico.
Debe resaltarse que la prueba de sueroaglutinacin lenta en tubo (SAT) se considera inadecuada a efectos del
comercio internacional. La prueba de fijacin de complemento (FC) es ms especfica que la SAT para el
diagnstico y adems posee un sistema estandarizado de unidades. Las caractersticas diagnsticas de algunos
inmunoenzimoensayos (ELISAs) y la prueba de polarizacin de fluorescencia (FPA) son similares o superiores a
la FC y, como son ms fciles de realizar tcnicamente y ms consistentes, es preferible su utilizacin (44, 69).
Se ha comparado el rendimiento de algunas de estas pruebas.
Para el control de la brucelosis a nivel nacional o local, son adecuadas para el anlisis las pruebas con antgeno
tamponado de Brucella, es decir, la prueba con rosa de bengala (RBT) y la prueba de aglutinacin tamponada en
placa (BPAT), as como ELISA y FPA. Las reacciones positivas deben volverse a probar utilizando una estrategia
confirmativa adecuada.
En otras especies, como por ejemplo en bfalos (Bubalus bubalus), bisonte americano y europeo (Bison bison,
Bison bonasus), yak (Bos grunniens), elk/wapiti (Cervus elaphus), y camellos (Camelus dromedarius,
C. bactrianus) la infeccin por Brucella sigue un curso similar al del ganado bovino. Para estos animales pueden
450
utilizarse los mismos procedimientos serolgicos (40), pero cada uno debe ser validado en el animal estudiado
(19, 20).
Sueros de Referencia
Los estndares primarios de referencia bovina son aquellos frente a los que se comparan y calibran todos
los dems estndares. Estos estndares de referencia estn a disposicin de los laboratorios nacionales de
referencia y deben emplearse para establecer estndares secundarios o nacionales frente a los que pueden
prepararse otros de trabajo para utilizacin en el diagnstico diario rutinario de laboratorio.
Estos sueros se han desarrollado y designado por la OIE como Sueros Estndar Internacionales1. Su
empleo favorece la armonizacin internacional de las pruebas de diagnstico y la estandarizacin de
antgenos (69):
Para RBT y FC se emplea el suero estndar internacional de la OIE (OIEISS, antes designado Segundo
suero anti-Brucella abortus de la OMS) que contiene 1000 UI y UIFC (unidades internacionales para la
prueba de fijacin del complemento).
Adems, se dispone de tres sueros estndar de la OIE para ELISA. Son tambin de origen bovino y
comprenden un estndar fuertemente positivo (OIEELISASPSS), otro dbilmente positivo
(OIEELISAWPSS) y otro negativo (OIEELISANSS).
Produccin de clulas
En la produccin de antgenos para diagnstico debe utilizarse siempre la cepa 99 de Brucella abortus
(Weybridge) (S99) (ver direccin en la nota 1 a pie de pgina) o la cepa 1119-3 (USDA) (S-1119-3)2. Debe
destacarse que el antgeno preparado de una de estas cepas tambin se utiliza en las pruebas para
infeccin por B. melitensis o B. suis. Las cepas deben ser lisas y no autoaglutinables en solucin salina con
0,1% (p/v) de acriflavina. Tienen que ser cultivos puros y cumplir las propiedades de las cepas de
B. abortus biotipo 1 que son independientes de CO2. Los cultivos originales de siembra se cultivan para
producir un lote de inculo que debe tener las propiedades de estas cepas, y se conservan por liofilizacin o
por congelacin en nitrgeno lquido.
Para la produccin de antgeno, el inculo de siembra se utiliza para inocular varios tubos de agar inclinado
con medio de infusin de patata que se incuban a 37C durante 48 horas. Los medios slidos SDA y TSA,
con adicin de 5% de suero equino o suero de ternero neonato y 0,1% de extracto de levadura, son
satisfactorios con tal de que se utilice un inculo adecuado como se recomienda arriba. El crecimiento se
comprueba respecto a pureza, se resuspende en PBS estril, pH 6,4, y se utiliza para sembrar frascos
Roux con medio slido de infusin de patata o con glicerol-dextrosa. stos se incuban luego a 37C durante
72 horas con la superficie inoculada hacia abajo. Se prueban muestras del crecimiento de cada frasco para
pureza por la tincin de Gram, y los microorganismos se recogen aadiendo a cada frasco 50-60 ml de
solucin salina con fenol (0,5% de fenol en una solucin de cloruro sdico al 0,85%). Los frascos se
agitan, se decanta la suspensin, y los microorganismos se inactivan por calentamiento a 80C durante
90 minutos. Despus de una prueba de viabilidad, el antgeno se conserva a 4C.
Alternativamente, las clulas se pueden producir en medio lquido o por cultivo continuo en un fermentador
(24), en un medio que contenga (por litro de agua destilada) D-glucosa (30 g), peptona de grado elevado
(30 g), extracto de levadura (Difco) (10 g), fosfato sdico (9 g) y fosfato bisdico (3,3 g). El pH inicial es
6,6 pero tiende a subir a 7,2-7,4 durante el crecimiento. Debe comprobarse la capacidad de los lotes de
peptona y de extracto de levadura para producir un buen crecimiento sin formacin de clulas anormales o
disociadas. Durante el crecimiento se puede necesitar una aireacin y agitacin vigorosas y el ajuste del pH
a 7,2-7,4 por adicin de HCl 0,1 M. El inculo de siembra se prepara como se describi anteriormente. El
cultivo se incuba a 37C durante 48 horas. El cultivo continuo se puede mantener ms tiempo, pero se
necesita ms experiencia para mantenerlo. Deben realizarse controles del proceso del crecimiento tanto en
medio slido como lquido para confirmar la pureza, un nivel de viables que sea adecuado y la ausencia de
formas rugosas disociadas. En la fase de recogida las clulas para utilizacin como antgeno deben
probarse de nuevo para pureza y formas lisas.
El cultivo se recoge por centrifugacin para precipitar los microorganismos, que se resuspenden en solucin
salina con fenol. Los microorganismos se inactivan por calentamiento a 80C durante 90 minutos y se
guardan a 4C. Deben formar suspensiones estables en solucin salina fisiolgica sin evidencias de
1
2
Disponibles en el Laboratorio de Referencia de la OIE para Brucelosis en la Veterinary Laboratories Agency (VLA)
Weybridge, New Haw, Addlestone, Surrey KT15 3NB, Inglaterra.
Disponible en el Departamento de Agricultura de los EE.UU. (USDA), National Veterinary Services Laboratories (NVSL),
1800 Dayton Road, Ames, Iowa 50010, EE. UU.
451
autoaglutinacin. Con las suspensiones se debe de realizar una prueba de viabilidad sin evidenciar
crecimiento despus de una incubacin de 10 das a 37C. El volumen de clulas empaquetadas (PCV)
presentes en las suspensiones inactivadas puede determinarse centrifugando volmenes de 1 ml en tubos
Wintrobe a 3.000 g durante 75 minutos.
a)
Pruebas de antgeno tamponado de Brucella (Prueba prescrita para el comercio internacional)
Prueba del rosa de bengala

Esta prueba es una prueba sencilla de aglutinacin puntual que utiliza antgeno coloreado con rosa de
bengala y tamponado a bajo pH, normalmente 3,65 + 0,05 (37).
El antgeno para la RBT se prepara depositando clulas muertas de B. abortus S99 o S1119-3, recogidas
por centrifugacin a 23.000 g durante 10 minutos a 4C, y resuspendindolas uniformemente en solucin
salina fenicada a razn de 1 g por cada 22,5 ml.(Nota: si se utiliza carboximetil celulosa sdica como agente
sedimentante durante la preparacin del concentrado celular, los residuos insolubles deben eliminarse
antes de la tincin filtrando la suspensin por un prefiltro AMF-CUNO Zeta-plus [Tipo CPR 01A]). A cada
35 ml de esta suspensin se aade 1 ml de rosa de bengala (CI No. 45440) al 1% (p/v) en agua destilada, y
la mezcla se agita 2 horas a temperatura ambiente. La mezcla se filtra por lana de algodn y se centrifuga a
10.000 g para depositar las clulas teidas, que a continuacin se resuspenden uniformemente a razn de
1 g de clulas por 7 ml de diluyente (21,1 g de hidrxido sdico disueltos en 353 ml de solucin salina con
fenol ms 95 ml de cido lctico, que se ajusta a 1.056 ml con solucin salina fenicada). El color de esta
suspensin debe ser rojo intenso y el sobrenadante de una muestra centrifugada debe carecer de
colorante; el pH debe ser 3,65 + 0,05. Despus de la filtracin por lana de algodn, la suspensin se filtra
dos veces a travs de un prefiltro de fibra de vidrio Sartorius No. 13430, se ajusta a un PCV de
aproximadamente 8%, dependiendo de la estandarizacin final frente a un suero calibrado contra el
OIEISS, y se guarda a 4C en la oscuridad. El antgeno nunca debe congelarse.
Cuando se utiliza en la prueba estndar, el antgeno RBT debe dar una reaccin positiva clara con dilucin
1/45 del OIEISS diluido en 0,5% de solucin salina con fenol, pero no a una dilucin de 1/55. Tambin es
conveniente comparar la reaccin de antgeno nuevo y de lotes previamente estandarizados utilizando un
conjunto de sueros definidos.
i)
Llevar las muestras de suero y de antgeno a temperatura ambiente (22 + 4C); solo debe sacarse del
refrigerador el antgeno suficiente para las pruebas del da.
ii)
Colocar 25-30 l de cada muestra de suero en una baldosa blanca, placa esmaltada o de plstico, o
en una placa para hemaglutinacin de la OMS.
iii)
Agitar bien la botella de antgeno, pero suavemente, y colocar el mismo volumen de antgeno prximo
a la gota de suero.
iv)
Inmediatamente despus de aadir la ltima gota de antgeno en la placa, mezclar cuidadosamente el

suero y el antgeno (usando un porta limpio o una varilla de plstico para cada prueba) hasta producir
una zona circular u oval de aproximadamente 2 cm de dimetro.
v)
La mezcla se agita suavemente durante 4 minutos a temperatura ambiente en un agitador circular o

tridimensional (si la zona de reaccin es oval o circular, respectivamente)
vi)
Comprobar la aglutinacin tan pronto como se completa el perodo de 4 minutos. Cualquier reaccin
visible se considera positiva. Antes de las pruebas de cada da se debe probar un suero control que
origine una reaccin positiva mnima para comprobar la sensibilidad de las condiciones de la prueba.
La RBT es muy sensible. Sin embargo, como toda prueba serolgica, a veces origina una reaccin positiva
debido a vacunacin con S19 o a reacciones positivas falsas (FPSR). Por tanto, las reacciones positivas
deben confirmarse con estrategias confirmativas (que incluyan tanto la realizacin de otras pruebas como la
investigacin epidemiolgica). Las reacciones negativas falsas se producen muy raramente, sobre todo
debido a fenmenos de prozona y en ocasiones se pueden detectar diluyendo la muestra de suero o
volviendo a probarla despus de un cierto tiempo. Sin embargo, la RBT parece adecuada como una prueba
de anlisis para detectar rebaos infectados o para garantizar la ausencia de infeccin en rebaos libres de
brucelosis.
452
Prueba de aglutinacin tamponada en placa
El antgeno para la BPAT se prepara a partir de B. abortus S1119-3 siguiendo el procedimiento descrito por
Angus & Barton (2).
Se requieren dos soluciones de colorante: verde brillante (2 g/100 ml) y cristal violeta (1 g/100 ml) de
calidad garantizada disueltos en agua destilada. Una vez preparadas, las dos soluciones se almacenan por
separado durante 24 horas, y luego se mezclan en volmenes iguales en una botella opaca y se guardan
en un refrigerador durante ms de 6 meses antes de uso. La mezcla de colorantes slo puede usarse entre
6 y 12 meses despus de la preparacin inicial.
El diluyente tamponado se prepara disolviendo lentamente hidrxido sdico (150 g) en 3-4 litros de solucin
salina estril con fenol. A esta solucin se aade cido lctico (675 ml) y el volumen final se ajusta a 6 litros
aadiendo solucin salina estril con fenol. El pH de la solucin debe estar entre 3,63 y 3,67.
Las clulas empaquetadas de Brucella abortus S1119-3 se diluyen a una concentracin de 250 g/litro en
solucin salina con fenol; se aaden 6 ml de colorante por litro de suspensin celular, y la mezcla se agita
antes de filtrar por algodn absorbente estril. Las clulas se centrifugan a 10.000 g a 4C y las clulas
precipitadas se resuspenden a continuacin a una concentracin de 50 g/100 ml en diluyente tamponado
(como se describe antes). La mezcla se agita vigorosamente durante 2 horas y despus se diluye
aadiendo 300 ml de diluyente tamponado por cada 100 ml de clulas resuspendidas (es decir, a una
concentracin final de 50 g de clulas empaquetadas/400 ml de diluyente tamponado). La mezcla se agita a
temperatura ambiente durante 20-24 horas antes de que la concentracin celular se ajuste al 11% (p/v) con
diluyente tamponado. Esta suspensin se agita durante toda la noche antes de uso. Pendientes de pruebas
sobre el control final de calidad, el antgeno se guarda a 4C hasta su empleo. El antgeno tiene una
caducidad de 1 ao y no se debe congelar.
El pH del antgeno tamponado en placa debe ser 3,70 + 0,03 y el pH de una mezcla suero-antgeno a una
proporcin 8:3 debe ser 4,02 + 0,04. La suspensin al 11% de clulas teidas debe ser azul-verdosa. Cada
lote de antgeno tamponado en placa debe probarse con al menos 10 sueros de reactividad dbil y
comparar los resultados con uno o ms lotes previos de antgeno. Si es posible, los lotes de antgeno deben
compararse con el antgeno estndar preparado por el NVSL, USDA (ver nota 2 a pie de pgina para
direccin). No hay sin embargo establecido un procedimiento de estandarizacin internacional para uso con
el OIEISS.
Se mezcla suero (80 l) con 30 l de antgeno en una placa de vidrio marcada con cuadros de 4 x 4 cm.
Despus de la mezcla inicial, la placa se mueve tres veces para asegurar la dispersin homognea de los
reactivos y se incuba 4 minutos a temperatura ambiente en una cmara hmeda. Se extrae la placa y se
mueve como antes, incubando otros 4 minutos. Despus, se extrae la placa, se mueve y se observa la
aglutinacin (1). Cualquier reaccin visible se considera positiva. Como la RBT, esta prueba es muy
sensible, especialmente para la deteccin de anticuerpo inducido por la vacuna, y las muestras positivas
deben volverse a probar con pruebas confirmativas. Pueden producirse reacciones negativas falsas,
debidas por lo general a fenmenos de prozona, la cual puede eliminarse diluyendo el suero o volviendo a
probar despus de cierto tiempo.
b)
Prueba de fijacin de complemento (prueba prescrita para el comercio internacional)

La FC es una prueba confirmativa ampliamente usada y aceptada pese a la complejidad de su realizacin y
a la necesidad de buenas instalaciones y personal entrenado para titular y mantener los reactivos
adecuadamente. Existen muchas variaciones de FC, pero la prueba ms adecuada se realiza en formato de
microtitulacin. Para la incubacin de suero, antgeno y complemento, se puede utilizar fijacin en caliente o
en fro: 37C durante 30 minutos o 4C durante 14-18 horas. Varios factores influyen en la eleccin del
mtodo: la actividad anticomplementaria de muestras de suero de baja calidad es ms evidente con la
fijacin en fro, mientras que a 37C aumenta la frecuencia e intensidad de las prozonas, y se deben probar
varias diluciones para cada muestra.
Se han propuesto varios mtodos para FC que utilizan diferentes concentraciones de eritrocitos de oveja
(SRBCs) frescos o conservados (normalmente se recomienda una suspensin al 2,5% o al 3%). Los
SRBCs estn sensibilizados con un volumen igual de suero anti-SRBC de conejo diluido hasta contener
varias veces (en general de dos a cinco veces) la concentracin mnima necesaria para producir un 100%
de lisis de SRBCs en presencia de una solucin titulada de complemento de cobaya. El ltimo se titula
independientemente (en presencia o ausencia de antgeno, segn el mtodo) para determinar la cantidad
de complemento necesaria para producir el 50% o el 100% de lisis de SRBCs sensibilizados por unidad de
453
volumen de una suspensin estndar; stas se definen como la unidad hemoltica de complemento al 50%
o al 100%/ dosis hemoltica mnima (CH MHD50 CH MHD100), respectivamente. Se suele
recomendar titular el complemento antes de cada serie de pruebas, siendo preferible un micromtodo para
la determinacin ptima de CH50. Normalmente se utilizan en la prueba 1,25-2 CH100 o 5-6 CH50.
El diluyente estndar para la FC es solucin salina tamponada con barbital (veronal). Se prepara con
tabletas comerciales; alternativamente puede prepararse a partir de una solucin stock de cloruro sdico
(42,5 g), cido barbitrico (2,875 g), dietil barbiturato sdico (1,875 g), sulfato magnsico (1,018 g) y cloruro
clcico (0,147 g) en 1 litro de agua destilada y se diluye antes de uso aadiendo cuatro volmenes de una
solucin de gelatina al 0.04%.
Existen numerosas variaciones de la prueba pero, cualquiera que sea el procedimiento, debe emplearse un
antgeno preparado de una cepa lisa aprobada de B. abortus, como la S99 o la S1119-3, y que est
estandarizado frente al OIEISS. El antgeno para FC puede preparase por mtodos especiales (1, 24) o
utilizar clulas enteras diluyendo la suspensin stock de modo que la PCV de la suspensin de antgeno
concentrado para FC sea aproximadamente del 2% antes de la estandarizacin frente al OIEISS. El
antgeno debe estandarizarse para dar una fijacin del 50% a una dilucin 1/200 del OIEISS y debe mostrar
tambin una fijacin completa a diluciones ms bajas de suero, porque una concentracin demasiado baja
(o demasiado alta) de antgeno puede no producir un 100% de fijacin a diluciones ms bajas de suero.
Cuando son adecuadas dos diluciones de antgeno, debe escogerse la suspensin de antgeno ms
concentrada para evitar el fenmeno de prozona.
La apariencia del antgeno a dilucin 1/100 debe ser la de una suspensin blanca, uniforme y densa, sin
agregacin visible ni formacin de depsito despus de incubar a 37C durante 18 horas. No debe producir
efectos anticomplementarios en las condiciones de la prueba. El antgeno se guarda a 4C y no debe
congelarse.
Procedimiento de la prueba (ejemplo)
Los sueros problema sin diluir y los estndar adecuados de trabajo se inactivan durante 30 minutos en una
bao de agua a 60C + 2C. Si previamente se han diluido a la mitad con solucin salina tamponada con
veronal, se pueden inactivar a 58C + 2C durante 50 minutos. En general slo se prueba rutinariamente
una dilucin del suero (1/4 o 1/5, dependiendo del procedimiento escogido de FC), pero se recomiendan
diluciones seriadas a efectos de detectar la existencia de prozona.
Con el empleo de placas de microtitulacin estndar de 96 pocillos de fondo redondeado (en U), la tcnica
se realiza normalmente del modo siguiente:
454
i)
En el pocillo de la primera, segunda y tercera filas, se colocan 25 l de suero problema inactivado

diluido. La segunda fila es un control anticomplemento para cada suero. Se aade a los pocillos de la
primera fila 25 l de tampn FC (controles anticomplemento) para compensar la falta de antgeno. A
todos los otros pocillos se aade 25 l de tampn FC excepto a los de la segunda fila. A continuacin
se hacen diluciones dobles seriadas transfiriendo volmenes de 25 l de suero de la tercera fila en
adelante.
ii)
A cada pocillo, excepto en la primera fila, se aade 25 l de antgeno, diluido a la concentracin de

trabajo, y 25 l de complemento, diluido al nmero de unidades requerido.
iii)
Se establecen controles con diluyente slo, suero + complemento + diluyente, antgeno +

complemento + diluyente, y complemento + diluyente, que contengan en cada caso 75 l de volumen
total. En cada serie de pruebas debe probarse un suero control que d una reaccin positiva mnima
para comprobar la sensibilidad en las condiciones de la prueba.
iv)
Las placas se incuban a 37C durante 30 minutos o durante toda la noche a 4C y se aade a cada
pocillo un volumen de SRBCs sensibilizados (25 o 50 l dependiendo de la tcnica). Las placas se
reincuban a 37C durante 30 minutos.
v)
Los resultados se leen despus de centrifugar las placas a 1.000 g durante 10 minutos a 4C y
despus dejarlas en reposo a 4C durante 2-3 horas para permitir que sedimenten las clulas no
lisadas. El grado de hemolisis se compara con estndares que correspondan a una lisis del 0, 25, 50,
75 y 100% de lisis. La ausencia de actividad anticomplementaria se comprueba en la primera fila para
cada suero.
vi)
Estandarizacin de los resultados de la FC:

Existe un sistema de unidades basado en el OIEISS. Este suero contiene 1000 UIFC (unidades
internacionales de la prueba de fijacin de complemento) por ml. Si este suero se prueba por un
mtodo determinado y origina un ttulo de, por ejemplo, 200 (50% de hemolisis), entonces el factor de
un suero problema probado por el mismo mtodo se deduce de la frmula: 1000 x 1/200 x ttulo del
suero problema = nmero de UIFC de anticuerpo en el suero problema por ml. El OIEISS contiene IgG
especfica; los sueros estndar nacionales tambin deben depender de este isotipo para su actividad
especfica de fijacin de complemento. Surgen dificultades en la estandarizacin porque diferentes
tcnicas favorecen selectivamente la FC por diferentes isotipos de inmunoglobulinas. Se recomienda
que cualquier pas que use FC a escala nacional acuerde entre los diversos laboratorios que realizan
la prueba el mismo mtodo para obtener el mismo nivel de sensibilidad. Para facilitar la comparacin
entre pases, los resultados deben expresarse siempre en UIFC, calculadas en relacin con las
obtenidas en una titulacin paralela con un suero estndar, que a su vez se calibra frente al OIEISS.
vii)
Interpretacin de los resultados: Los sueros con un ttulo equivalente a 20 UIFC/ml o ms, se
consideran positivos.
Este procedimiento es un ejemplo y se pueden escoger otros volmenes y cantidades de reactivos con tal
de que la prueba se calibre frente al OIEISS como se describe antes y que los resultados se expresen en
UIFC/ml.
La prueba FC es muy especfica. Sin embargo, como todas las pruebas serolgicas, a veces da un
resultado positivo debido a vacunacin con S19 o a consecuencia de FPSR. En consecuencia, las
reacciones positivas deben investigarse por estrategias confirmativas. Las hembras que se han vacunado
con Brucella abortus S19 entre los 3 y 6 meses se consideran generalmente positivas si los sueros dan una
fijacin positiva con un ttulo de 30 o ms UIFC/ml cuando los animales se prueban a una edad de
18 meses o superior.
c)
Enzimoinmunoensayos (pruebas prescritas para el comercio internacional)
ELISA indirecto
Se han descrito muchas variaciones de ELISA indirecto (I-ELISA) utilizando diferentes preparaciones
antignicas, diversos conjugados de antiglobulina con enzimas, y varios substratos/cromgenos. Algunos IELISAs validados en ensayos amplios de campo se han comercializado y son muy utilizados. Para una
homologacin internacional se deben usar los tres Sueros Estndar para ELISA de la OIE en los
laboratorios nacionales de referencia para comprobar o calibrar el mtodo de la prueba en particular.
La prueba debe calibrarse de modo que la densidad ptica (OD) del Suero Estndar de la OIE fuertemente
positivo represente un punto de la porcin lineal de una curva tpica de dosis-respuesta, justo por debajo de
la meseta. El Suero Estndar dbilmente positivo de la OIE para ELISA debe dar siempre una reaccin
positiva que est situado en la porcin lineal de la misma curva dosis-respuesta, justo por encima del
umbral positivo/negativo. El suero negativo y el control de tampn deben originar reacciones que estn por
debajo del umbral positivo/negativo (70). El umbral debe establecerse en la prueba con tcnicas adecuadas
de validacin (ver Captulo I.1.3. Principios de validacin para las pruebas de diagnstico de enfermedades
infecciosas).
La prueba I-ELISA es muy sensible, pero a veces no es capaz de distinguir entre anticuerpos debidos a
vacunacin por S19 u otros problemas de FPSR y los inducidos por cepas patgenas de Brucella. Por
consiguiente, la prueba I-ELISA debe considerarse como una prueba de anlisis ms que como una prueba
confirmativa con ganado vacunado o en rebaos afectados con problemas de FPSR.
Respecto al antgeno, se deben utilizar preparaciones ricas en lipopolisacrido liso (sLPS). Existen varios
mtodos para preparar un antgeno adecuado.
En funcin de la disponibilidad y de las necesidades concretas se pueden emplear antiglobulinas mono o
policlonales conjugadas con enzimas. Un MAb especfico para la cadena pesada de la IgG1 bovina puede
mejorar la especificidad an a costa de perder sensibilidad.
El mtodo de la prueba que se describe a continuacin es un ejemplo que ha sido validado
internacionalmente y utilizado por todo el mundo en proyectos financiados a nivel internacional de
cooperacin tcnica e investigacin cientfica.
El tampn para antigenizar es carbonato/bicarbonato 0,05 M, pH 9,6, que contiene carbonato monosdico
(2,93 g) y carbonato bisdico (1,59 g) en 1 litro de agua (la azida sdica [0,2 g/litro] es opcional). El tampn
de dilucin del conjugado y de los sueros problema es PBS 0,01 M, pH 7,2, que contiene ortofosfato
455
bisdico (1,4 g), fosfato monopotsico (0,20 g), cloruro sdico (8,50 g) y Tween 20 al 0,05% disuelto en 1
litro de agua destilada (PBST). Este tampn tambin se usa como tampn de lavado.
El conjugado utilizado en este ejemplo es un MAb especfico para la cadena pesada de la IgG1 conjugado
con peroxidasa de rbano (HRPO). La solucin base de substrato es perxido de hidrgeno al 3%. La
solucin base de cromgeno es 0,16 M de 2,2-azino-bis-(3-etilbenzotiazolina-6-sulfonato) (ABTS) en agua
destilada. El tampn del substrato es tampn citrato, pH 4,5, compuesto por citrato trisdico hidratado (7.6
g) y cido ctrico (4,6 g) disueltos en 1 litro de agua destilada. La solucin para detener la reaccin
enzimtica es 4% de dodecil sulfato sdico (SDS).
Produccin de antgeno (ejemplo)
El sLPS de B. abortus S1119-3 S99 se prepara calentando 5 g de peso seco (o 50 g de peso hmedo) de
clulas suspendidas a 66C en 170 ml de agua destilada y aadiendo 190 ml de fenol al 90% (v/v) a 66C.
La mezcla se agita continuamente a 66C durante 15 minutos, se enfra y se centrifuga a 10.000 g durante
15 minutos a 4C. El fenol parduzco de la capa inferior se extrae con una cnula larga y si es necesario los
restos celulares se eliminan por filtracin (utilizando un filtro de papel Whatman No.1).
El LPS se precipita aadiendo 500 ml de metanol fro que contenga 5 ml de metanol saturado con acetato
sdico. Despus de 2 horas de incubacin a 4C, el precipitado se recoge por centrifugacin a 10.000 g
durante 10 minutos. El precipitado se agita con 80 ml de agua destilada durante 18 horas y se centrifuga a
10.000 g durante 10 minutos. El sobrenadante se mantiene a 4C. El precipitado se resuspende en 80 ml
de agua destilada y se agita otras 2 horas a 4C. El sobrenadante se recoge por centrifugacin como antes
y se mezcla con el sobrenadante recogido previamente.
A continuacin, se aaden 8 g de cido tricloroactico a los 160 ml del LPS crudo. Despus de agitar
durante 10 minutos, el precipitado se elimina por centrifugacin y la solucin traslcida que constituye el
sobrenadante se dializa frente a agua destilada (como mnimo, dos cambios de 400 ml cada uno) y luego se
liofiliza.
El LPS liofilizado se pesa, se reconstituye a una concentracin de 1 mg/ml en tampn carbonato 0,05 M, pH
9,6, y se sonica en un bao de hielo utilizando tres sonicaciones de 6 vatios durante 1 minuto cada vez. A
continuacin, el LPS se liofiliza en fracciones de 1 ml y se guarda a temperatura ambiente.
Procedimiento de la prueba (ejemplo)
i)
El sLPS liofilizado se reconstituye con 1 ml de agua destilada y se diluye a 1/1000 con tampn
carbonato 0,05 M, pH 9,6 (o a una dilucin predeterminada por titulacin frente al suero estndar de la
OIE para ELISA). Para antigenizar las microplacas, se aade a todos los pocillos 100 l de la solucin
de LPS, se cubren las placas y se incuba durante 18 horas a 4C. Despus de la incubacin, las
placas se pueden usar o se mantienen selladas y congeladas a 20C hasta un ao. Las placas
congeladas se descongelan antes de uso durante 30-45 minutos a 37C.
ii)
El antgeno no unido se elimina lavando todos los pocillos cuatro veces con PBST. A los pocillos
especificados se aaden 100 l de suero diluido de 1/50 a 1/200 con PBST, pH 6,3, que contiene 7,5
mM de cido etiln diamino tetra-actico (EDTA) y 7,5 mM de cido etiln glicol tetra-actico (EGTA)
(PBST/EDTA) y se incuba a temperatura ambiente durante 30 minutos.
iii)
Se aaden a las placas los sueros problema y se ensayan por separado o en duplicado. Los controles,
calibrados con Sueros Estndar de la OIE para ELISA, se disponen en pocillos duplicados e incluyen
un suero control fuertemente positivo, otro dbilmente positivo, un suero control negativo y un control
del tampn.
iv)
El suero no unido se elimina lavando cuatro veces con PBST (no debe usarse PBS que contenga
EDTA/EGTA con HRPO ya que inactiva el enzima). A cada pocillo se aade 100 l de conjugado
(MAb M23) especfico para un eptopo de la cadena pesada de la IgG1 bovina unido a HRPO y diluido
en PBST y las placas se incuban a temperatura ambiente durante 30 minutos.
v)
El exceso de conjugado se elimina por cuatro lavados. A cada pocillo se aade 100 l de
sustrato/cromgeno (1,0 mM de H2O2 [100 l/20 ml de tampn citrato] y 4,0 mM de ABTS [500 l/
20 ml de tampn citrato]), las placas se agitan durante 10 minutos y el color desarrollado se determina
en un espectrofotmetro a 414 o 405 nm. Si se desea, se puede aadir directamente a todos los
pocillos 100 l de SDS al 4% como agente de parada de la reaccin.
vi)
Los pocillos control que contienen el suero fuertemente positivo se consideran como un 100% de
positividad y todos los datos se calculan de estas lecturas de absorbancia (entre 1,000 y 1,800)
empleando la ecuacin:
Porcentaje de positividad (%P) = absorbancia (muestra problema)/absorbancia (control fuertemente
positivo) x 100.
456
Con fines de estandarizacin y de investigacin se encuentran disponibles3 el antgeno sLPS, pequeas

cantidades del MAb especfico para la cadena pesada del la IgG1 bovina, programas para la generacin de
datos empleando espectrofotmetros particulares y un protocolo estandarizado para la prueba I-ELISA.
Mediante este protocolo descrito para I-ELISA, u otro similar calibrado frente a los Sueros Estndar de la
OIE para ELISA, la sensibilidad diagnstica debe ser igual o mayor que los BBATs en pruebas con ganado
infectado, y la especificidad diagnstica debe ser equivalente a la prueba FC en pruebas con ganado sin
vacunar (22). Puede esperarse que la sensibilidad diagnstica en pruebas de ganado vacunado con S19 o
en el caso de FPSR sea notablemente inferior a la prueba FC dependiendo de dnde se establezca el
umbral de positividad/negatividad en el I-ELISA.
ELISA competitivo
El ELISA competitivo (C-ELISA) que emplea un MAb especfico para uno de los eptopos de la Brucella
OPS parece tener mayor especificidad que el I-ELISA (33, 45, 58). Se realiza seleccionando un MAb con
mayor afinidad que el anticuerpo con reaccin cruzada. No obstante, se ha comprobado que el C-ELISA
elimina algunas, pero no todas, las reacciones (FPSR) debidas a bacterias con reaccin cruzada (41, 66).
El C-ELISA es tambin capaz de eliminar la mayora de las reacciones debidas a anticuerpo residual que se
producen en respuesta a la vacunacin con S19. La eleccin del MAb y su singular especificidad y afinidad
influencian las propiedades diagnsticas de la prueba. Como en cualquier prueba basada en MAb, se debe
considerar la disponibilidad general del MAb o del hibridoma para su aceptacin internacional y su
utilizacin generalizada.
Se han descrito algunas variaciones de C-ELISA. Para una homogenizacin internacional, los laboratorios
nacionales de referencia deben utilizar los tres Sueros Estndar de la OIE para ELISA para comprobar o
calibrar el mtodo concreto.
La prueba debe calibrarse de tal modo que la densidad ptica del Suero Estndar de la OIE fuertemente
positivo represente un punto en la zona lineal de una curva tpica de dosis-respuesta justo por encima de la
meseta (es decir, prximo a la mxima inhibicin). El Suero Estndar de la OIE dbilmente positivo debe
dar una reaccin que caiga en la porcin lineal de la misma curva de dosis-respuesta justo por encima del
umbral positivo/negativo (es decir, inhibicin moderada). El suero negativo y el control de tampn/MAb
deben dar reacciones siempre menores que el umbral positivo/negativo (es decir, inhibicin mnima).
El mtodo que se describe a continuacin es un ejemplo de prueba que se ha validado internacionalmente y
utilizado con amplitud a nivel mundial en proyectos de cooperacin tcnica y colaboracin cientfica con
financiacin internacional.
Los sistemas de tampn son los mismos que los descritos para la prueba I-ELISA.
El sLPS de B. abortus S1119-3 se prepara y se utiliza como para el I-ELISA.
i)
El sLPS liofilizado se reconstituye con 1 ml de agua destilada y se diluye a 1/1000 con tampn
carbonato 0,05 M, pH 9,6. Para antigenizar las microplacas, se aade a todos los pocillos 100 l de la
solucin de LPS, se cubren las placas y se incuban durante 18 horas a 4C. Despus de la
incubacin, las placas se pueden usar o mantenerlas selladas y congeladas a 20C hasta un ao.
Las placas congeladas se descongelan antes de uso durante 30-45 minutos a 37C.
ii)
El antgeno no unido se elimina lavando todos los pocillos cuatro veces con PBST. A cada pocillo se
aaden 50 l de de MAb (M84 en este caso) convenientemente diluido en PBST/EDTA e
inmediatamente otros 50 l de suero diluido 1/10 en PBST/EDTA. Las placas se incuban a
temperatura ambiente durante 30 minutos con agitacin, por lo menos durante los 3 minutos iniciales.
iii)
Se aaden a las placas los sueros problema y se ensayan por separado o en duplicado. Los controles,
calibrados con Sueros Estndar de la OIE para ELISA, se disponen en pocillos duplicados e incluyen
un suero control fuertemente positivo, otro dbilmente positivo, un suero control negativo y un control
del tampn.
iv)
El suero no unido se elimina lavando cuatro veces con PBST. A cada pocillo se aade 100 l de
conjugado comercial de IgG anti-ratn de cabra (cadena H y L) unida a HRPO y diluida en PBST y las
placas se incuban a temperatura ambiente durante 30 minutos.
Laboratorio de Referencia de la OIE para Brucelosis, Animal Diseases Research Institute, 3851 Fallowfield Road,
Nepean, Ontario K2H 8P9, Canada.
457
v)
El exceso de conjugado se elimina por cuatro lavados. A cada pocillo se aade 100 l de
substrato/cromgeno (1,0 mM de H2O2 y 4,0 mM de ABTS), se agitan las placas durante 10 minutos y
el color desarrollado se determina en un espectrofotmetro a 414 o 405 nm. Si se desea, se puede
aadir directamente a todos los pocillos 100 l de SDS al 4% como agente de parada de la reaccin.
vi)
Los pocillos control que contienen el suero fuertemente positivo se consideran como una inhibicin del
0% y todos los datos se calculan de estas lecturas de absorbancia (entre 1.000 y 1.800) empleando la
ecuacin:
Porcentaje de inhibicin (%I) = 100 (absorbancia [muestra problema]/absorbancia [control de
tampn] x 100).
Con fines de estandarizacin y de investigacin se encuentran disponibles el antgeno sLPS, pequeas

cantidades del MAb especfico para la cadena pesada del la IgG1 bovina, programas para la generacin de
datos empleando espectrofotmetros particulares y un protocolo estandarizado para la prueba C-ELISA (ver
direccin en nota 3 a pie de pgina).
Mediante este protocolo descrito para C-ELISA, u otro similar calibrado frente a los Sueros Estndar de la
OIE para ELISA, la sensibilidad diagnstica debe ser equivalente a los BBATs y el I-ELISA en pruebas con
ganado infectado (22, 43-45). La especificidad diagnstica del C-ELISA debe ser equivalente o superior a la
de FC e I-ELISA en pruebas con ganado sin vacunar o en el caso de FPSR. La especificidad diagnstica de
C-ELISA es mayor que la de FC e I-ELISA en pruebas con ganado vacunado con S19.
d)
Prueba de polarizacin de fluorescencia (prueba prescrita para el comercio internacional)

La FPA es una tcnica sencilla para determinar la interaccin antgeno/anticuerpo y puede realizarse en
instalaciones de laboratorio o en el campo. Es una prueba homognea que no requiere la separacin de los
compuestos analizados y que por tanto es muy rpida. En la fecha de publicacin, la FPA se ha propuesto
como una prueba obligada para el comercio internacional.
El mecanismo de la prueba se basa en la rotacin aleatoria de las molculas en solucin. El tamao
molecular es el principal factor que influencia la velocidad de rotacin, con una relacin de proporcionalidad
inversa. As, una molcula pequea gira ms deprisa que una grande. Si una molcula se marca con un
fluorocromo, se puede determinar el tiempo de rotacin a travs de un ngulo de 68,5C midiendo la
intensidad de la luz polarizada en planos verticales y horizontales. Una molcula grande emite ms luz en
un nico plano (ms polarizada) que una pequea que gira ms deprisa y emite luz ms despolarizada.
En la mayora de las FPAs, se marca con un fluorocromo un antgeno de pequeo peso molecular, inferior a
50 kD, y se aade suero u otro lquido problema para detectar la presencia de anticuerpo. Si estn
presentes anticuerpos, la unin con el antgeno marcado provoca un descenso en su velocidad rotacional
que puede medirse.
Para el diagnstico de la brucelosis, se emplea como antgeno un fragmento de bajo peso molecular (media
de 22 kD) del OPS del sLPS de B. abortus y se marca con isotiocianato de fluorescena. Este antgeno se
aade a suero diluido o a sangre completa y en 2 minutos (para suero) o 15 segundos (para sangre) se
obtiene una medida del contenido de anticuerpos mediante un analizador de polarizacin de fluorescencia
(43).
La FPA se puede realizar en tubos de vidrio o en formato de placa de 96 pocillos. El suero bovino se diluye
1/100 o, si se emplea sangre tratada con EDTA, a 1/50 (la sangre tratada con heparina aumenta la
variabilidad de la prueba). El diluyente utilizado es Tris 0,01 M (1,21 g) que contiene cloruro sdico 0,15 M
(8,5 g), 0,05% de Igepal CA630 (500 l) (antes denominado NP40) y 10 mM de EDTA (3,73 g) por litro de
agua destilada, pH 7,2 (tampn Tris). Despus de mezclar, se obtiene una lectura inicial para determinar la
dispersin de la luz con un analizador de polarizacin de fluorescencia (FPM). Se aade un antgeno
titulado marcado adecuadamente (que por lo general origine una intensidad de 250.000-300.000), se
mezcla y se obtiene con el FPM una segunda lectura a los 2 minutos para suero y a los 15 segundos para
sangre. Una lectura superior al nivel umbral establecido (en miliunidades de polarizacin, mP) indica una
reaccin positiva. Un nivel umbral tpico es 90-100 mP, aunque la prueba debe calibrarse localmente con un
Suero Estndar de Referencia Internacional. Deben incluirse controles de suero fuertemente positivo,
dbilmente positivo, y negativo, as como suero de animal vacunado con S19.
El OPS se prepara a partir de 5 g de peso seco (o 50 g de peso hmedo) de B. abortus S1119-3 aadiendo
400 ml de cido actico al 2% (v/v), autoclavando la suspensim durante 15 minutos a 121C y eliminando
los restos celulares por centrifugacin a 10.000 g durante 10 minutos a 4C. A continuacin, el
sobrenadante se trata con 20 g de cido tricloroactico para precipitar protenas y cidos nucleicos. El
458
precipitado se elimina de nuevo por centrifugacin a 10.000 g durante 10 minutos a 4C. El sobrenadante
se dializa frente, al menos, 100 volmenes de agua destilada y se liofiliza.
Se disuelven 3 mg de OPS en 0,6 ml de hidrxido sdico 0,1 M (4 g NaOH/litro) y se incuba a 37C durante
1 hora. Despus se aade 0,3 ml de ismero 1 de FICT a una concentracin de 100 mg/ml en dimetil
sulfxido y se incuba otra vez durante 1 hora a 37C. El OPS conjugado se aplica a una columna de 1 x 10
cm de DEAE (dietilaminoetil) Sephadex A 25 equilibrada con tampn fosfato 0,01 M, pH 7,4. La primera
fraccin (despus de 10-15 ml de elucin con tampn) es verde fuerte, y despus se cambia el tampn a
fosfato 0,1 M, pH 7,4. Se eluyen 10-15 ml de buffer seguidos luego de 20-40 ml donde se obtiene el
material verde fluorescente. Este ltimo material es el antgeno utilizado en FPA. La preparacin de
antgeno se puede aumentar proporcionalmente.
La cantidad de antgeno utilizada por prueba se determina diluyendo el material antes obtenido hasta lograr
una intensidad de fluorescencia de 250.000-300.000 en el FPM.
El antgeno se guarda como un lquido durante varios aos a 4C en una botella opaca o se puede liofilizar
en botellas opacas.
Se puede disponer de pequeas cantidades de antgeno marcado para la investigacin y estandarizacin
de procedimientos operativos relacionados con la obtencin de antgeno y la realizacin de FPA (para
direccin, ver nota 3 a pie de pgina).
i)
Se aade 1 ml de tampn Tris a tubos de vidrio de borosilicato de 10 x 75 mm y despus 10 l de

suero o 20 l de sangre tratada con EDTA. Es importante mezclar bien. Se obtiene una lectura en el
FPM para determinar la dispersin de la luz.
ii)
Se aade al tubo un volumen de antgeno que corresponda a una intensidad total de fluorescencia de
250-300 x 103 y se mezcla bien. Este volumen puede variar de lote a lote, pero en general es de unos
10 l. Se obtiene una segunda lectura en el FPM despus de una incubacin a temperatura ambiente
de 2 minutos para suero y de 15 segundos para sangre tratada con EDTA.
iii)
Una lectura superior al umbral predeterminado indica una reaccin positiva.
iv)
En cada serie de pruebas se incluye un suero estndar de trabajo fuertemente positivo, otro
dbilmente positivo y un suero negativo (calibrados frente a los Sueros Estndar de la OIE).
La sensibilidad y especificidad diagnstica de la FPA en la brucelosis bovina es casi idntica a las de CELISA. La especificidad diagnstica en ganado recientemente vacunado con S19 supera el 99% (19, 20,
43). Sin embargo se desconoce en la actualidad la especificidad de la FPA en condiciones de FPSR. La
FPA debe estandarizarse de modo que los sueros positivos fuertes y dbiles de la OIE suministren
resultados positivos repetitivos.
3.
Otras pruebas
a)
Prueba cutnea de la brucelina

Una prueba inmunolgica alternativa es la prueba cutnea de la brucelina, que puede utilizarse para
analizar rebaos no vacunados siempre que se emplee una preparacin antignica purificada (libre de LPS)
y estandarizada (por ejemplo, brucelina INRA).
La prueba cutnea de la brucelina tiene una especificidad muy elevada, de modo que los animales sin
vacunar que son serolgicamente negativos y reaccionan positivamente en la prueba de la brucelina deben
considerarse animales infectados (15, 51). Adems, los resultados de esta prueba pueden ayudar a
interpretar reacciones serolgicas que se consideran como FPSR debidas a infeccin por bacterias con
reaccin cruzada, especialmente en reas libres de brucelosis (51, 54).
Sin embargo, no todos los animales infectados reaccionan, por lo que esta prueba sola no es recomendable
como prueba nica a efectos del comercio internacional.
Es esencial utilizar una preparacin estandarizada y definida de brucelina que no contenga antgeno sLPS,
ya que ste puede producir reacciones inflamatorias inespecficas o interferir con pruebas serolgicas
459
posteriores. Una preparacin de ese tipo es la brucelina INRA preparada de una cepa rugosa de
B. melitensis que est comercializada4.
i)
Se inyecta intradrmicamente 0,1 ml de brucelina en el repliegue caudal, en la piel del costado lateral,
o de un lado del cuello.
ii)
La prueba se lee despus de 48-72 horas.
iii)
El grosor de la piel en el sitio de la inyeccin se mide con un calibrador vernier antes y despus de la
inyeccin.
iv)
Una reaccin positiva fuerte se reconoce fcilmente como un hinchamiento local e induracin. No
obstante, las reacciones dudosas requieren una interpretacin cuidadosa. Un engrosamiento de la piel
de 1,5-2 mm debe considerarse como una reaccin positiva.
Aunque la prueba intradrmica de la brucelina es una de las ms especficas de la brucelosis (en animales
no vacunados) el diagnstico no puede hacerse basndose solamente en reacciones intradrmicas
positivas en unos cuantos animales de la manada, y debe apoyarse en una prueba serolgica fiable. La
inoculacin intradrmica de brucelina puede originar una anergia temporal de la respuesta inmune celular.
Por tanto, en general se recomienda un intervalo de 6 semanas entre dos pruebas realizadas sobre el
mismo animal.
b)
Prueba de aglutinacin del suero

Aunque no se considera una prueba obligada o alternativa, la SAT se ha utilizado con eficacia durante
muchos aos en programas de vigilancia y control de la brucelosis bovina. Su especificidad mejora
notablemente si se aade EDTA al antgeno (21, 32, 46).
El antgeno es una suspensin bacteriana en solucin salina con fenol (NaCl al 0,85% [p/v] y fenol al 0,5%
[v/v]). No debe usarse formaldehdo. Los antgenos pueden presentarse en forma concentrada siempre que
el factor de dilucin para uso se indique en la etiqueta de la botella. Para reducir el nivel de resultados
positivos falsos se puede aadir EDTA a la suspensin antignica a una concentracin final en la prueba de
5 mM. En consecuencia, el pH de 7,2 debe reajustarse en la suspensin de antgeno.
El OIEISS contiene 1000 UIs de aglutinacin. El antgeno se prepara sin referencia a la concentracin
celular, pero su sensibilidad debe estandarizarse con relacin al OIEISS de modo que el antgeno produzca
el 50% de aglutinacin con una dilucin srica final de 1/600 a 1/1.000, o el 75% con una dilucin srica
final de 1/500 a 1/750. Tambin se aconseja comparar la reactividad de lotes de antgenos nuevos con los
estandarizados previamente utilizando un juego de sueros definidos.
La prueba se realiza en tubo o en microplaca. La mezcla de antgeno con las diluciones de suero debe
incubarse 16-24 horas a 37C. Si la prueba se realiza en microplaca, el tiempo de incubacin puede
acortarse a 6 horas. Para cada suero debe prepararse un mnimo de tres diluciones para evitar respuestas
negativas debidas a fenmenos de prozona. La dilucin de sueros sospechosos debe llevarse a cabo de
modo que la lectura de la reaccin al lmite de positividad se haga en un tubo medio (o pocillo en el mtodo
de microplaca).
Interpretacin de los resultados: El grado de aglutinacin de Brucella por un suero debe expresarse en UI
por ml. Un suero con 30 UI o ms, se considera positivo.
c)
Pruebas de hapteno nativo y poliB

Las pruebas de hapteno nativo y poliB son pruebas confirmativas5 usadas con xito en un programa de
erradicacin en combinacin con RBT como prueba de anlisis (3). La sensibilidad ptima se obtiene por un
sistema de inmunodifusin radial inversa donde el suero difunde en un gel hipertnico que contiene el
polisacrido (14). No obstante, el procedimiento de doble difusin en gel tambin resulta til (30, 31). Los
terneros vacunados subcutneamente con la dosis estndar de S19 a los 35 meses de edad son
negativos a los 2 meses de la vacunacin, y el ganado adulto vacunado subcutneamente 45 meses antes
con dosis reducida de S19 no da reacciones positivas a menos que resulten infectados y excreten la vacuna
en la leche (29). La vacunacin conjuntival (tanto en jvenes como en adultos) reduce el tiempo de
obtencin de una respuesta negativa en las pruebas con hapteno nativo y poliB. Una caracterstica notable
4
5
460
Brucellergne OCB, Synbiotics Europe, 2 rue Alexander Fleming, 69007 Lyon, Francia.
El procedimiento detallado puede obtenerse del Departamento de Sanidad Animal, Servicio de Investigacin
Agraria/DGA, Apartado 727, 50080 Zaragoza, Espaa.
de la prueba RID es que un resultado positivo se correlaciona con la excrecin de Brucella, como se ha
demostrado en ganado infectado experimentalmente (29) y en ganado con infeccin natural sometido a
tratamiento antibitico (27).
d)
Pruebas en la leche
Un medio eficaz de analizar vacas lecheras es probar la leche de los tanques de recogida. De estas fuentes
se puede obtener leche de forma ms barata y frecuente que las muestras de sangre, y habitualmente
estn disponibles en las centrales lecheras. Cuando se obtiene un resultado positivo, todas las vacas que
aportan leche deben probarse individualmente a partir de muestras de sangre. La prueba I-ELISA en leche
es sensible y especfica, y resulta particularmente til para probar grandes poblaciones de animales. La
prueba del anillo de leche (MRT) es una alternativa adecuada cuando no se dispone de ELISA.
I-ELISA en leche
Como con el I-ELISA para suero, se utilizan numerosas variaciones del I-ELISA para leche. Se han
comercializado varios I-ELISAs que se han validado en ensayos de campo y son de uso amplio. A efectos
de una armonizacin internacional, los laboratorios nacionales de referencia deben utilizar los tres Sueros
Estndar de la OIE para ELISA con el fin de comprobar o calibrar el mtodo particular de la prueba en
cuestin. El I-ELISA debe estandarizarse de modo que el estndar fuertemente positivo de la OIE para
ELISA diluido a 1/125 en suero negativo y diluido despus a 1/10 en leche negativa se comporte
repetidamente como positivo. Las muestras de leche completa se prueban generalmente a diluciones
mucho ms bajas que el suero, es decir, de 1/2 a 1/10 en tampn de dilucin, y el resto de la prueba es
similar a lo descrito para suero. La prueba C-ELISA no debe utilizarse con leche completa pero puede
usarse con muestras de suero.
Prueba del anillo de leche
En animales lactantes, la prueba MRT puede emplearse para analizar brucelosis en rebaos. En
poblaciones grandes (>100 terneros lactantes) la sensibilidad de la prueba tiene menos fiabilidad. Pueden
presentarse reacciones positivas falsas en animales vacunados 4 meses antes de la prueba, en muestras
de leche anormal (como el calostro) o en casos de mastitis. Por tanto, no se recomienda la utilizacin de
esta prueba en granjas muy pequeas, donde estos problemas presentan un mayor impacto en los
resultados de la prueba.
El antgeno para MRT se prepara de suspensiones concentradas de bacterias muertas de B. abortus S99 o
S1119-3, cultivadas como se ha descrito con anterioridad. Se centrifugan a 23.000 g durante 10 minutos a
4C y se resuspenden en solucin de colorante hematoxilina. Se emplean varios mtodos satisfactorios; un
ejemplo es el siguiente: se aaden 100 ml de hematoxilina al 4% (p/v) (Cl No. 75290), disuelta en 95% de
etanol, a una solucin de sulfato amnico alumnico (5 g) en 100 ml de agua destilada y 48 ml de glicerol. A
la solucin se aaden 2 ml de iodato sdico al 10% (p/v) recin preparado. Despus de 30 minutos a
temperatura ambiente, la solucin de color prpura oscuro se aade a 940 ml de sulfato amnico alumnico
al 10% (p/v) en agua destilada. El pH de la mezcla se ajusta a 3,1 y la solucin se deja envejecer
mantenindola a temperatura ambiente durante 45-90 das en la oscuridad.
Antes de uso, la solucin de colorante se agita y se filtra por lana de algodn. Las clulas empaquetadas se
suspenden en la solucin de colorante a razn de 1 g por 30 ml de colorante y se mantienen a temperatura
ambiente durante 48 horas (en vez de esto, algunos laboratorios prefieren calentar 80C durante
10 minutos). Las clulas teidas se depositan por centrifugacin y se lavan tres veces con una solucin de
cloruro sdico (6,4 g), cido lctico al 85% (1,5 ml) e hidrxido sdico al 10% (4,4 ml) en 1,6 litros de agua
destilada, a pH final de 3,0. Las clulas lavadas se resuspenden a razn de 1 g en 27 ml de un diluyente
que consiste en solucin salina con fenol al 0,5%, ajustada a pH 4,0 por adicin de cido ctrico 0,1 M
(aproximadamente 2, 5 ml) y fosfato bisdico 0,5 M (aproximadamente 1 ml), y se mantiene a 4C durante
24 horas. La mezcla se filtra por lana de algodn, se comprueba el pH, y se determina el PCV ajustndolo
aproximadamente al 4%.
La sensibilidad del lote nuevo debe compararse con la de un lote previamente estandarizado utilizando un
juego de muestras de varios grados de reaccin preparado diluyendo un suero positivo en leche. El
antgeno debe estandarizarse frente al OIEISS de modo que una dilucin 1/500 sea positiva y una dilucin
1/1.000 sea negativa. El antgeno se guarda a 4C sin congelar.
El pH del antgeno debe estar entre 3,3 y 3,7 y su color debe ser azul oscuro. Se permite la existencia de un
poco de colorante libre en el sobrenadante de una muestra centrifugada. Cuando se diluye en leche de un
animal sin brucelosis, el antgeno debe producir una coloracin uniforme de la capa de leche sin formar
depsitos ni coloracin en la capa cremosa.
461
La prueba se lleva a cabo sobre muestras del tanque de leche entera. Si es necesario, las muestras se
pueden pretratar con un conservante (formalina al 0,1% o bronopol al 0,02%) durante 2-3 das a 4C antes
de uso. La prueba se lleva a cabo aadiendo 30-50 l de antgeno a 1-2 ml de leche completa (el volumen
de leche puede aumentarse para muestras de poblaciones grandes). La altura de la columna de leche en el
tubo debe ser como mnimo de 25 mm. Las muestras de leche no deben haber sido congeladas,
calentadas, sometidas a agitacin violenta o guardadas por ms de 72 horas. Normalmente, las mezclas de
leche/antgeno se incuban a 37C durante 1 hora junto con estndares de trabajo positivos y negativos. Sin
embargo, la incubacin durante la noche a 4C aumenta la sensibilidad de la prueba y permite una
interpretacin ms fcil. Una reaccin fuertemente positiva se indica por la formacin de un anillo azul
oscuro por encima de la columna blanca de leche. Cualquier anillo azul en la interfase de leche y de crema
debe considerarse positivo y podra ser significativo, especialmente en el caso de grandes poblaciones. La
prueba es negativa si el color de la leche supera al de la capa cremosa.

C1. Brucelina
La brucelina INRA es un extracto libre de LPS de B. melitensis B115 rugosa. Esta preparacin no provoca la
formacin de anticuerpos reactivos en BBAT, FC o ELISA.
1.
Control de inculos
a)

La produccin de brucelina INRA se basa en un sistema de lotes de siembra como se describe para los
antgenos y las vacunas. El inculo original de la cepa B115 de B. melitensis para produccin de brucelina6
debe cultivarse para producir un lote de siembra que debe conservarse por liofilizacin o congelacin en
nitrgeno lquido. Debe presentar las propiedades de un cultivo puro de una cepa rugosa de B. melitensis y
no producir LPS liso de Brucella. Debe producir cantidades razonables de una mezcla de antgenos
proteicos reactivos frente a antisueros contra cepas rugosas y lisas de Brucella.
b)
Mtodo de cultivo (1)

La cepa B115 de Brucella melitensis crece mejor en el medio de cultivo descrito antes para cultivo en
fermentador. Puede crecer en fermentador por el mtodo continuo o discontinuo o en matraces colocados
en un agitador. Deben realizarse comprobaciones de pureza en cada recogida aislada y el organismo debe
encontrase en la fase rugosa.
c)
Validacin como un reactivo de diagnstico in vivo

Estudios de laboratorio y de campo realizados en Francia, han confirmado que la brucelina INRA es segura,
no txica y de accin especfica. La preparacin contiene un 50-75% de protenas, principalmente de bajo
peso molecular, y un 15-30% de carbohidratos. No contiene antgenos LPS. La brucelina INRA no provoca
repuestas inflamatorias en animales no sensibilizados, y no es por s misma un agente sensibilizante. No
provoca anticuerpos reactivos en las pruebas serolgicas estndar para brucelosis. Ms del 90% de los
pequeos rumiantes infectados por B. melitensis manifiestan hipersensibilidad retardada a la brucelina
INRA en alguna fase. La preparacin no es recomendable como un agente de diagnstico para animales
individuales, pero puede ser til para el anlisis de poblaciones. Se suministra a los pequeos rumiantes en
dosis de 100 g por va intradrmica e induce una reaccin local de hipersensibilidad retardada que es
visible a las 48-72 horas en animales sensibilizados. Tanto los animales vacunados como los infectados
dan reaccin positiva.
2.
Mtodo de produccin (1)
Las clulas de Brucella melitensis B115 se inactivan despus del cultivo elevando la temperatura a 70C durante
90 minutos, se enfran a 4C, y se recogen por centrifugacin a 9.000 g durante 15 minutos a 4C. Las clulas se
lavan con agua destilada estril y fra y se deshidratan precipitndolas con tres volmenes de acetona a 20C, y
luego se deja reposar a 20C durante 24-48 horas. Despus de lavados repetidos con acetona fra y de un
lavado final con dietil ter, las clulas se secan sobre cloruro clcico y se mantienen a 4C. Las clulas secas se
someten a una prueba de viabilidad. Se resuspenden en cloruro sdico estril al 2,5% hasta una concentracin
462
Se puede obtener del Institut National de la Recherche Agronomique (INRA), Laboratoire de Pathologie Infectieuse et
Immunologie, 37380 Nouzilly, Francia.
final del 5% (p/v) y se agitan durante 3 das a 4C. Las clulas bacterianas se eliminan por centrifugacin como
antes y el sobrenadante se concentra a un cuarto de su volumen por ultrafiltracin con una membrana Diaflo
PM10 (Amicon) y se precipita aadiendo tres volmenes de etanol fro. La mezcla se mantiene a 4C durante
24 horas y el precipitado se recoge por centrifugacin, se redisuelve en agua destilada y se dializa para eliminar
el etanol. Despus de centrifugar a 105.000 g durante 6 horas a 4C, el sobrenadante, que es la brucelina sin
estandarizar, se analiza en cuanto a protenas y carbohidratos. Puede liofilizarse como material global o despus
de distribuirla en sus recipientes finales.
3.
Control del proceso
El extracto crudo de brucelina debe probarse para esterilidad despus de la extraccin con acetona para
comprobar la inactivacin de las clulas de Brucella, y de nuevo al final del proceso para comprobar alguna
posible contaminacin. Deben determinarse el pH y la concentracin de protena y realizarse pruebas de
identidad sobre el material global antes del llenado de los recipientes finales.
4.
Control de lotes
a)
Esterilidad
Las preparaciones de alrgenos deben probarse para esterilidad como se describe en el Captulo I.1.5.
b)
Inocuidad
Las muestras de brucelina en sus recipientes finales deben someterse a la prueba estndar de esterilidad y
tambin deben probarse las preparaciones para toxicidad anormal. Se inyectan intraperitonealmente dosis
equivalentes a 20 dosis de ganado (2 ml) en un par de cobayas normales que no se hayan expuesto con
anterioridad a Brucella o a sus antgenos. Tambin se inyectan subcutneamente cinco ratones normales
con 0, 5 ml de brucelina examinada. Los animales se observan durante 7 das y no debe haber reaccin
local o generalizada a la inyeccin.
La capacidad dermonecrtica se examina por inoculacin intradrmica de 0,1 ml del producto examinado en
el costado previamente afeitado y desinfectado de tres cobayas albinos normales que no se hayan
expuesto con anterioridad a Brucella o a sus antgenos. No debe observarse reaccin cutnea. La ausencia
de sensibilizacin alrgica o serolgica se comprueba por inoculacin intradrmica de tres cobayas albinos
normales, tres veces cada 5 das, con 0,1 ml de una dilucin 1/10 de la preparacin examinada. Se
suministra una inyeccin similar 15 das despus a los mismos tres animales y a un lote control de tres
cobayas del mismo peso que no se han inyectado previamente. Los animales no deben convertirse en
seropositivos cuando se analizan 24 horas despus de la ltima inyeccin por las pruebas estndar de
brucelosis (RBT, FC) ni deben desarrollar respuestas de hipersensibilidad retardada.
c)
Potencia
La potencia de las preparaciones de brucelina se determina por inyeccin intradrmica de dosis graduales
de brucelina en cobayas que se han sensibilizado por inoculacin subcutnea con 0,5 ml de brucelina de
referencia7 con adyuvante completo de Freund de 1 a 6 meses antes. Se determina y mide la reaccin
eritematosa a las 24 horas y se calcula el ttulo por comparacin con una brucelina de referencia8. Este
mtodo solo es vlido para comparar preparaciones de brucelina obtenidas por el mismo protocolo que el
alrgeno sensibilizante. Se ha descrito la estandarizacin inicial de un lote de alrgeno y la sensibilizacin y
titulacin en rumiantes (1).
d)
Duracin de la sensibilidad
La duracin de la sensibilidad es dudosa. Los animales varan considerablemente a nivel individual en
cuanto al grado de hipersensibilidad manifestado a la brucelina. Los animales en fases muy tempranas de
la infeccin, o con infecciones de larga duracin, pueden no manifestar hipersensibilidad a la inyeccin
intradrmica.
Se ha producido por el INRA-PII (F-37380 Nouzilly, Francia) una brucelina de referencia nacional que puede obtenerse
del Laboratorio de Referencia de la OIE para Brucelosis, AFSSA, 23 avenue du Gnral-de-Gaulle, 94706 Maisons-Alfort
Cedex, France.
El procedimiento estadstico puede obtenerse del Laboratorio de Referencia de la OIE para Brucelosis, AFSSA, BP67,
94706 Maisons-Alfort Cedex, France.
463
e)
Estabilidad
La preparacin liofilizada retiene una actividad completa durante varios aos. La preparacin comercial
lquida debe retener la potencia durante la caducidad recomendada.
f)
Conservantes
No se recomienda el uso de conservantes en preparaciones liofilizadas. En la forma lquida, se puede
utilizar mertiolato sdico como conservante (mximo 0,1 mg/ml). Si la preparacin est liofilizada no debe
reconstituirse hasta inmediatamente antes de su uso.
g)
La brucelina no es txica. Sin embargo, puede provocar reacciones graves de hipersensibilidad en
individuos sensibilizados que se exponen accidentalmente a ella. Debe tenerse cuidado en evitar la
inyeccin accidental o la contaminacin por las mucosas. El equipo de inyeccin utilizado y los recipientes
deben descontaminarse cuidadosamente o eliminarse por incineracin en contenedores adecuados de
desecho.
5.
a)
Inocuidad
Se debe realizar una prueba de esterilidad por el mtodo recomendado. Las pruebas de seguridad in vivo
son las descritas para el control de lotes (ver seccin C1.4.b.). Estas pruebas pueden omitirse en el lote si
se realiza la prueba completa en los lotes finales de llenado.
b)
Potencia
Se realiza por inyeccin de una nica dosis en cobayas segn el procedimiento descrito en la seccin
C1.4.c.
C2. Vacunas
Vacuna con la cepa 19 de Brucella abortus
La vacuna ms ampliamente utilizada para prevenir la brucelosis en el ganado bovino es la vacuna con Brucella
abortus S19, que contina siendo la vacuna de referencia con la que se compara el resto de vacunas. Se utiliza
como una vacuna viva que por lo general se suministra a terneras entre 3 y 6 meses como una dosis nica
subcutnea de 5-8 x 1010 microorganismos viables. Se puede administrar al ganado adulto una dosis reducida
de 3 x 108 a 3 x109 microorganismos, pero algunos animales desarrollan ttulos duraderos de anticuerpos y
pueden abortar y excretar la cepa vacunal por la leche. Alternativamente, se puede administrar a ganado de
cualquier edad en dos dosis de 5-10 x 109 microorganismos viables por va conjuntival; esto produce proteccin
sin una respuesta duradera de anticuerpos y reduce los riesgos de aborto y de excrecin en la leche.
La vacuna con Brucella abortus S19 induce una buena inmunidad frente a desafos moderados por
microorganismos virulentos. La vacuna debe prepararse de inculos derivados del USDA (para direccin, ver
nota 2 a pie de pgina) y cada lote ha de probarse para pureza (ausencia de microorganismos extraos),
viabilidad (bacterias vivas por dosis) y homogeneidad (determinacin de la fase de disociacin). Los lotes de
inculo para la produccin de vacuna S19 deben comprobarse regularmente en ratones para virulencia residual e
inmunogenicidad.
Los procedimientos de control para esta vacuna se indican ms adelante.
Vacuna con la cepa RB51 de Brucella abortus

Desde 1996 la cepa RB51 de Brucella abortus es la vacuna oficial en muchos pases para la prevencin de la
brucelosis en el ganado vacuno. Sin embargo, su eficacia e inocuidad en comparacin con la S19 son motivo de
controversia (38, 39, 57). Cada pas utiliza mtodos ligeramente diferentes de administrar la vacuna. En EE.UU.
los terneros se vacunan subcutneamente entre los 4 y 12 meses con 1-3,4 x 1010 microorganismos viables de la
cepa RB51. La vacunacin de ganado de mayor edad solo se hace bajo autorizacin de organizaciones estatales
o federales de salud animal y la dosis recomendada es de 1 x 109 microorganismos viables. En otros pases se
recomienda la vacunacin de terneros (4-12 meses) con dosis de 1-3,4 x 1010, y la revacunacin de 12 meses en
adelante con una dosis similar para inducir un efecto de recuerdo y aumentar la inmunidad.
464
Se ha descrito que cuando se administran intravenosamente al ganado dosis completas de RB51 se induce
placentitis grave e infecciones placentarias en la mayora del ganado vacunado (49) y que un nmero notable de
stos excreta microorganismos en la leche. Las experiencias de campo tambin indican que en algunos casos
puede provocar aborto si se aplica a vacas grvidas. Debido a estas observaciones se debe evitar la vacunacin
de vacas grvidas. Un modo de reducir los efectos colaterales de RB51 es reducir la dosis. Con la dosis reducida
de esta vacuna (1 x 109 unidades formadoras de colonias [CFU]) no se producen abortos ni lesiones placentarias
en el ganado vacunado subcutneamente (50), aunque un porcentaje significativo de estos animales excreta la
cepa vacunal (61). Sin embargo, esta dosis reducida no protege contra B. abortus cuando se usa en la
vacunacin de terneros (47), aunque lo hace cuando se aplica a adultos (48).
Debe destacarse que, como la S19, la cepa RB51 puede infectar a humanos (65). La cepa RB51 es muy
resistente a rifampicina, uno de los antibiticos de eleccin en el tratamiento de la brucelosis humana. Adems,
el diagnstico de la infeccin por RB51 requiere pruebas especiales que no estn disponibles en la mayora de
los hospitales. Los Centros para el Control de Enfermedades, del Departamento de Salud y Servicios Humanos,
en Atlanta, Georgia, EE.UU. (CDC), establecieron una vigilancia pasiva sobre la inoculacin accidental con la
vacuna RB51 en EE.UU. para determinar si la vacuna produce enfermedad en humanos. Este estudio incluy
26 participantes expuestos a la vacuna durante la vacunacin de animales. La exposicin accidental origin
efectos indeseables tanto locales como sistmicos; sin embargo, no ha quedado claro si la cepa vacunal RB51
puede causar brucelosis sistmica en el hombre. El nmero de casos descritos de pacientes en este estudio
(veinte y seis) es pequeo comparado con el nmero de vacunaciones (varios millones de terneros vacunados) y
con las predicciones estimadas de inoculaciones fortuitas con RB51 (8 por 11.000). El estudio indicaba que un
uso apropiado de antibiticos protega contra la infeccin pero no ha quedado determinado hasta qu punto otros
componentes de la vacuna contribuyan a los efectos adversos (60). Esto contrasta con la cepa 19, donde est
bien documentado que se desarrolla la fiebre ondulante por exposicin accidental sin tratamiento preventivo.
Los procedimientos de control para esta vacuna se indican ms adelante.
Vacuna con la cepa Rev.1 de Brucella melitensis

Es frecuente aislar B. melitensis en ganado vacuno en pases con una elevada prevalencia de esta infeccin en
pequeos rumiantes (64). Ha habido cierto debate sobre la eficacia protectora de S19 en infecciones por
B. melitensis en el ganado vacuno y se ha supuesto que la Rev.1 debera ser una vacuna ms eficaz en estas
condiciones. Sin embargo solo hay un trabajo sobre esta materia que demuestra que S19 es capaz de controlar
B. melitensis en condiciones de campo (27). En contraste, no se han realizado experimentos sobre la eficacia de
Rev.1 en la infeccin del ganado por B. melitensis. Adems, la seguridad de esta vacuna es prcticamente
desconocida en el ganado (62).
Hasta que se realicen estudios sobre la seguridad y eficacia de Rev.1 contra B. melitensis en el ganado a
diferentes condiciones fisiolgicas y bajo situaciones estrictamente controladas, esta vacuna no debera
recomendarse para el ganado vacuno.
1.
Control de inculos
a)

El inculo original de Brucella abortus S19 para producir vacunas debe obtenerse del USDA (para direccin,
ver nota 2 a pie de pgina) y utilizarse para producir un lote de inculos conservado por liofilizacin o por
congelacin en nitrgeno lquido. Las propiedades de este lote de inculos deben ser las de un cultivo puro
de B. abortus biotipo 1 no dependiente de CO2, que sea sensible a la bencilpenicilina, azul de tionina e ieritritol a las concentraciones recomendadas, y que tenga una patogenicidad mnima en cobayas.
El inculo original de Brucella abortus RB51 est comercializado9. Estas compaas tienen los derechos
legales de la vacuna.
b)
Mtodo de cultivo
Para producir la vacuna, Brucella abortus S19 se cultiva en un medio libre de suero o de otros productos
animales, bajo condiciones similares a las descritas antes para B. abortus S99 S1119-3 (1).
La cepa RB51 de Brucella abortus sigue mtodos similares de cultivo.
Colorado Serum Company, 4950 York Street, P.O. Box 16428, Denver, Colorado 80216-0428, EE.UU.; o Veterinary
Technologies Corporation, 1872 Pratt Drive, Suite 1100B, Blacksburg, Virginia 24060, EE.UU.
465
c)

Muchos estudios independientes han confirmado el valor de S19 como vacuna que protege al ganado de la
brucelosis. El microorganismo se comporta como una cepa atenuada cuando se suministra a ganado
sexualmente inmaduro. En casos raros puede producir una infeccin localizada en el tracto genital. Con
adultos, es probable que se produzca una respuesta persistente de anticuerpos durante 6 meses o ms en
una proporcin notable del ganado vacunado subcutneamente con la dosis estndar. Parte del ganado
vacunado como terneros puede desarrollar ms tarde artropata, particularmente en las articulaciones de la
tibia y el fmur (7, 13). La vacuna es segura para la mayora de los animales si se administra a terneros
entre 3 y 8 meses de edad. Puede emplearse tambin en animales adultos a dosis reducida. Produce una
inmunidad duradera para un desafo moderado con cepas virulentas de B. abortus, pero su duracin exacta
es desconocida. La duracin de la proteccin frente a B. melitensis es tambin desconocida. La cepa
vacunal es estable y su reversin a la forma virulenta es extremadamente rara. Cuando se administra
involuntariamente a animales grvidos se ha asociado con la aparicin de cepas que utilizan i-eritritol. El
microorganismo se comporta como una cepa atenuada para ratones, e incluso grandes inculos
desaparecen rpidamente de los tejidos.
Estudios sobre desafos experimentales y desafos realizados en condiciones de campo destacan el valor
de la cepa RB51 de B. abortus en la proteccin del ganado frente a la brucelosis. El microorganismo es
atenuado en terneros y en adultos. Como esta cepa expresa niveles mnimos de sLPS no se produce
seroconversin frente a sLPS en animales vacunados. Adems, RB51 no induce anticuerpos detectables
contra el antgeno OPS utilizando los procedimientos actuales de prueba (59). Produce inmunidad a
desafos moderados de cepas virulentas, pero se desconoce su duracin exacta. La vacuna es estable y no
revierte de fase in vivo ni in vitro. El microorganismo se comporta como una cepa atenuada en varios tipos
de animales, como en ratones, y desaparece rpidamente de los tejidos.
Las vacunas S19 y RB51 tienen cierta virulencia para el hombre, y pueden producirse infecciones
accidentales. Se debe tener cuidado en su preparacin y manejo, as como incluir un aviso de riesgo en la
etiqueta de los recipientes finales. En cualquier caso, las inoculaciones accidentales deben tratarse con
antibiticos apropiados (ver Seccin C2.4.g.).
2.
Mtodo de produccin
Para la produccin de la vacuna S19 se pueden utilizar los procedimientos descritos anteriormente, excepto que
las clulas se recogen en PBS, pH 6,3, y se depositan por centrifugacin o aadiendo carboximetil celulosa
sdica a una concentracin final de 1,5 g/litro. El producto obtenido de un fermentador o las clulas agrupadas
de un lote de cultivos en botellas Roux que se hayan inoculado al mismo tiempo y con el mismo lote de inculo
constituye una cosecha individual. Se puede juntar ms de una cosecha para formar la masa final que se utiliza
para llenar los recipientes terminales de un lote de vacuna. Antes de mezclarlas, cada cosecha individual se
prueba para pureza, concentracin celular, disociacin e identidad. Deben hacerse las mismas pruebas sobre la
masa final, que debe tener un nmero de viables entre 8 y 24 x 109 CFU/ml. Los ajustes de concentracin se
hacen aadiendo PBS a la vacuna presentada en forma lquida o estabilizador a la forma liofilizada. Si se emplea
estabilizador debe tenerse en cuenta la prdida de viabilidad en la liofilizacin, y no debe superar el 50%. El
producto final desecado no debe someterse a temperaturas superiores a 35C durante el secado y el contenido
en humedad residual debe ser 1-2%. Los envases deben cerrarse al vaco o en nitrgeno seco inmediatamente
despus del secado, y han de mantenerse a 4C.
El proceso de produccin para la cepa BR51 de B. abortus es muy similar al utilizado para la S19.
3.
Control del proceso
La vacuna con Brucella abortus S19 debe probarse para pureza y estado de fase lisa durante la preparacin de
cada cosecha individual. Tambin debe comprobarse la concentracin celular, que puede realizarse por medidas
de opacidad, pero en los lotes finales de llenado debe realizarse una determinacin de viables. Tambin debe
probarse la identidad mediante pruebas de aglutinacin con antisuero contra el antgeno A de Brucella. La
concentracin de viables en los recipientes finales no debe ser inferior a 50 x 109 por cada dosis estndar
despus de la liofilizacin y al menos el 95% de las clulas deben estar en la fase lisa.
La vacuna con Brucella abortus RB51 debe probarse para pureza y estado de fase rugosa durante la preparacin
de cada cosecha individual. Tambin debe comprobarse la concentracin celular. En los lotes finales de llenado
debe realizarse una determinacin de viables. La concentracin de viables en los recipientes finales debe ser de
1-3,4 x 1010 CFU por dosis (dosis de 2 ml aplicadas subcutneamente) y el 100% de las clulas deben estar en
fase rugosa. Todas las colonias deben ser negativas en pruebas puntuales con MAbs especficos para el
antgeno OPS.
466
4.
Control de lotes
a)
Esterilidad
Las pruebas para esterilidad y ausencia de contaminacin en los materiales biolgicos se encuentran en el
Captulo I.1.5.
b)
Inocuidad
La vacuna S19 es per se un producto virulento y debe mantenerse con mnima virulencia para que sea
eficaz (ver seccin C2.4.c.). Sin embargo, no se realiza rutinariamente una prueba de inocuidad. Si se
desea, puede realizarse en ganado cuando se inicia un nuevo proceso de fabricacin o cuando se espera
alguna modificacin de la seguridad de la vacuna. Este control debe realizarse como sigue: la prueba utiliza
12 terneras de 4-6 meses. Seis de las hembras se inyectan con una o con tres dosis recomendadas. Cada
lote de seis terneras se mantiene por separado y se observan durante 21 das. No deben producirse
lesiones locales o sistmicas significativas. Si para una dosis y una ruta de administracin dadas la prueba
da buenos resultados para un lote representativo de vacuna, no tiene que repetirse con lotes de inculo o
de vacuna preparados con el mismo inculo original y con el mismo proceso de fabricacin. Tambin debe
realizarse una prueba de seguridad de la vacuna S19 en cobayas. A grupos de 10 animales como mnimo
se inyectan por va intramuscular dosis de vacuna diluida en PBS, pH 7,2, que contengan 5 x 109
microorganismos viables. Los animales no deben mostrar signos nocivos ni debe haber mortalidad.
Normalmente, no se realizan pruebas de inocuidad con la vacuna de la cepa RB51 de B. abortus. Si se
desea, se pueden inyectar intraperitonealmente ratones Balb/c hembras de 8-10 semanas con 1 x 108
CFUs y se cultivan los bazos a las 6 semanas post-inoculacin. Los bazos deben estar libres de RB51 y los
ratones no deben desarrollar anticuerpos anti-OPS.
c)
Potencia
Vacuna S19
Una vacuna S19 es eficaz si posee las caractersticas de la cepa original S19, es decir, si es satisfactoria
respecto a identidad, fase lisa, inmunogenicidad y virulencia residual (6). Los lotes deben probarse tambin
respecto al nmero de microorganismos viables.
Identidad
La vacuna S19 reconstituida no debe contener microorganismos exgenos. La Brucella abortus
presente en la vacuna se identifica por pruebas morfolgicas, serolgicas y bioqumicas adecuadas y
por cultivo: Brucella abortus S19 tiene las propiedades normales de una cepa de B. abortus biotipo 1
pero no requiere CO2 para crecer ni crece en presencia de bencilpenicilina (3 g/ml = 5 UI/ml), azul de
tionina (2g/ml) o i-eritritol (1 mg/ml) (concentraciones finales).
Fase lisa (determinacin de la fase de disociacin)

La vacuna S19 reconstituida en agua destilada se siembra en estra en seis placas con medio slido
(agar suero-dextrosa o agar tripticasa-soja (TSA) con 5% [v/v] de suero o 0,1% [p/v] de extracto de
levadura) de modo que las colonias estn juntas en algunas reas mientras que en otras estn
semiseparadas y en otras separadas. Las pequeas diferencias son ms obvias en las colonias
adyacentes que en las separadas. Las placas se incuban a 37C durante 5 das y se examinan con luz
reflejada oblicua (mtodo de Henry) antes y despus de teir (tres placas) con cristal violeta (mtodo
de tincin de White & Wilson).
Apariencia de las colonias antes de teir: Las colonias de tipo S aparecen redondas, brillantes y de
color azul a verde-azulado. Las colonias R tienen un aspecto seco, granular y son de color blanco
amarillento. Las colonias mucoides (M) son transparentes y grisceas y pueden distinguirse por su
consistencia pegajosa cuando se las toca con un asa de siembra. Las colonias intermedias (I) son las
ms difciles de clasificar y tienen una apariencia intermedia entre las formas S y R: son ligeramente
opacas y ms granulares que las colonias S.
Apariencia de las colonias despus de teir con cristal violeta: Las colonias S no toman el colorante.
Las colonias disociadas (I, M o R) se tien en varios tonos de rojizo a prpura y su superficie puede
mostrar grietas radiales. A veces se observa un film superficial teido que se despega de una colonia
disociada y aparece adyacente a ella.
La fase colonial puede confirmarse por la prueba de aglutinacin con acriflavina (1): Las colonias S
quedan en suspensin mientras que las R aglutinan rpidamente y, si son mucoides, forman tiras. Las
colonias intermedias pueden quedar en suspensin o formar una aglutinacin muy fina.
467
Determinacin de bacterias vivas

Se inoculan al menos cinco placas de agar triptosa, de agar suero-dextrosa o de cualquier otro medio
slido adecuado con 0,1 ml de diluciones apropiadas de la vacuna que se extienden con un asa de
vidrio, metal o plstico. Se cuentan las CFU por unidad de volumen de la vacuna.
Virulencia residual (tiempo de persistencia al 50% o tiempo de recuperacin al 50%) (6, 23)
i)
Preparar suspensiones adecuadas del lote de siembra o de vacuna de B. abortus S19 que se vaya a
probar (vacuna problema) y del cultivo original de inculo de S19 (como cepa de referencia). Para
esto, se recoge un cultivo de 24-48 horas de cada cepa en solucin salina estril tamponada (BSS:
NaCl 8,5 g; KH2PO4 1,0 g; K2HPO4 2,0 g; agua destilada 1000 ml; pH 6,8) y se ajusta la suspensin
con BSS a 109 CFU/ml con un espectrofotmetro (OD = 0,170 cuando se lee a 600 nm). El nmero
exacto de CFU/ml se determina despus por siembra en placa de diluciones decimales sobre un
medio adecuado (se recomienda agar sangre o TSA).
ii)
Inyectar subcutneamente 0,1 ml (108 CFU/ratn) de la suspensin de la vacuna problema en cada

una de 32 hembras de ratn CD1 de 5-6 semanas. En paralelo se realiza una inoculacin similar en
otros 32 ratones con la suspensin que contiene la cepa de referencia S19. La cepa S19 original de
siembra, que es satisfactoria respecto a inmunogenicidad y virulencia residual, se puede obtener del
USDA (para direccin ver nota 2 a pie de pgina).
iii)
A las 3, 6, 9 y 12 semanas, sacrificar los ratones por dislocacin cervical, en grupos de ocho elegidos
al azar.
iv)
Extraer los bazos y homogenizarlos asptica e individualmente en 1 ml de BSS estril con un

desintegrador de vidrio (o con un Stomacher en bolsas estriles adecuadas).
v)
Extender en cada caso toda la suspensin completa de bazo sobre varias placas con un medio
apropiado de cultivo e incubar en condiciones estndar para Brucella durante 5-7 das (lmite inferior
de deteccin: 1 bacteria por bazo). Un animal se considera infectado cuando se asla al menos 1 CFU
del bazo.
vi)
Calcular el tiempo de persistencia al 50% o el tiempo de recuperacin al 50% (RT50) por el mtodo
estadstico SAS, desarrollado especficamente para calcular RT50 (para obtener el SAS especfico,
ver la direccin en la nota 5 a pie de pgina) (23). Para esto se determina el nmero de ratones
curados (sin colonias aisladas del bazo) a cada punto temporal de sacrificio (ocho ratones por punto) y
se calcula el porcentaje acumulado de ratones curados con el tiempo por el mtodo de Reed y
Muench (descrito en la ref. 4). La funcin de distribucin de este porcentaje describe una curva
sigmoidal que debe linearizarse para calcular los valores RT50, mediante el procedimiento
computarizado PROBIT en el sistema estadstico SAS.
vii)
Comparar estadsticamente el paralelismo (corte y pendiente) entre las lneas de distribucin

obtenidas para la cepa problema y para la S19 de referencia, utilizando el SAS diseado para este
propsito. Se pueden comparar estadsticamente dos valores RT50 solo cuando derivan de lneas de
distribucin paralelas. Si no existe paralelismo, la virulencia residual de la cepa problema se considera
inadecuada y se elimina para produccin de vacunas.
viii) Si se confirma el paralelismo, comparar estadsticamente los valores RT50 obtenidos para la cepa
problema y de referencia utilizando el SAS diseado para este propsito. Para ser aceptable para la
produccin de vacunas, el RT50 obtenido con la cepa problema no debe diferir significativamente del
obtenido con la cepa de referencia S19 (RT50 y los lmites de confidencia son normalmente 7,0 + 1,3
semanas).
Las bases del procedimiento estadstico para el clculo anterior de la virulencia residual se han descrito
recientemente con detalle (52). Alternativamente, los clculos estadsticos descritos en los pasos vi) a viii)
se pueden evitar con un programa especfico de fcil empleo HTML-JAVA (Rev2) recientemente
desarrollado y disponible sin coste alguno en la direccin: http://www.afssa.fr/interne/Rev2.html.
Si la prueba se realiza con buenos resultados en un lote representativo de inculo o de vacuna problema,
no tiene que repetirse rutinariamente con otros lotes de vacuna preparados del mismo lote de inculo y
utilizando el mismo proceso de produccin.
Inmunogenicidad en ratn (5, 6)
Esta prueba utiliza tres grupos de seis ratones CD1 hembras, de 5-7 semanas, que se eligen al azar.
i)
468
Preparar y ajustar espectrofotomtricamente las suspensiones de vacuna como se indic

anteriormente.
ii)
Inyectar subcutneamente una suspensin de la vacuna examinada (vacuna problema) que contenga
105 CFU (en un volumen de 0,1 ml/ratn) a cada uno de los seis ratones del primer grupo.
iii)
Inyectar subcutneamente una suspensin de la vacuna de referencia S19 que contenga 105 CFU de
bacterias vivas en cada uno de los seis ratones del segundo grupo. El tercer grupo sirve como grupo
control sin vacunar y se inocula subcutneamente con 0,1 ml de BSS.
iv)
El nmero exacto de CFU inoculado se comprueba despus por siembra en placa de diluciones
decimales sobre un medio adecuado (se recomienda agar sangre o TSA).
v)
30 das despus de la vacunacin (e inmediatamente despus de 16 horas de ayuno) todos los

ratones se someten a una inoculacin intraperitoneal de desafo con una suspensin (0,1 ml/ratn)
que contenga 2 x 105 CFU de la cepa 544 de B. abortus (dependiente de CO2), preparada, ajustada y
comprobada como antes.
vi)
Sacrificar los ratones 15 das ms tarde por dislocacin cervical.
vii)
Cada bazo se corta aspticamente, se elimina la grasa, y se pesa y homogeniza. Alternativamente, los
bazos pueden congelarse y mantenerse a 20C de 24 horas a 7 semanas.
viii) Cada bazo se homogeniza aspticamente con un desintegrador de vidrio (o con un Stomacher en
sacos estriles adecuados) en nueve veces su peso con BSS, pH 6,8, y de cada homogenizado se
hacen tres diluciones decimales seriadas (1/10, 1/100 y 1/1.000) en el mismo diluyente. Por
cuadruplicado, se extienden 0,2 ml en placas con medio slido y se incuban dos placas a 37C
durante 5 das en atmsfera con 10% de CO2 (permite el crecimiento de la cepa vacunal y de la
desafo) y otras dos placas en aire (se inhibe el crecimiento de la cepa de desafo B. abortus 544 que
es dependiente de CO2).
ix)
Las colonias de Brucella se cuentan en las diluciones que corresponden a placas con menos de
300 CFU. Cuando no se cuentan colonias en la placa de la dilucin 1/10, se considera que el bazo
est infectado con cinco bacterias. Este nmero de Brucella por bazo se anota como X y se expresa
como Y, despus de hacer la siguiente transformacin: Y = log (X/log X). Se calcula la respuesta de
cada grupo de seis ratones como media y desviacin estndar.
x)
Las condiciones del experimento son adecuadas cuando: i) la respuesta de los ratones no vacunados
(media de Y) es por lo menos 4,5; ii) la respuesta de los ratones vacunados con la vacuna S19 de
referencia es menor de 2,5; y iii) la desviacin estndar calculada en cada lote de seis ratones es
inferior a 0,8.
xi)
Realizar comparaciones estadsticas (se recomienda la prueba de diferencias menos significativas

[LSD]) de los valores de inmunogenicidad obtenidos en los ratones vacunados con la cepa S19 que se
prueba respecto a los obtenidos en ratones vacunados con la vacuna de referencia y el grupo control
no vacunado. La vacuna problema es satisfactoria si el valor de inmunogenicidad obtenido en ratones
vacunados es notablemente inferior al obtenido en los controles sin vacunar y si, adems, no difiere
significativamente del obtenido en ratones vacunados con la vacuna de referencia. (Para una
informacin detallada de este procedimiento, ver la nota 5 a pie de pgina con la direccin de
contacto).
Si esta prueba se realiza con buenos resultados en un lote representativo de vacuna problema, no tiene que
repetirse rutinariamente con otros lotes de vacuna preparados del mismo lote de inculo y utilizando el
mismo proceso de produccin.
Vacuna RB51
No existe prueba de potencia estandarizada para la vacuna con la cepa RB51 de B. abortus y no se realiza
rutinariamente. Se ha propuesto una prueba con ratones Balb/c hembras utilizando 1 x 104
microorganismos de la cepa 2308 de B. abortus como cepa de desafo, pero la utilidad de la prueba para
predecir la proteccin en el ganado vacuno es dudosa. En EE.UU. se ha aprobado y utilizado la
determinacin en placa de microorganismos viables.
d)
Se considera que la vacunacin de terneros con una dosis completa de vacuna S19 confiere inmunidad
duradera, y no se recomiendan dosis posteriores. Sin embargo no existe evidencia probada de esto y en
reas endmicas puede ser aconsejable la revacunacin.
La vacunacin de terneros con la cepa RB51 de B. abortus parece estimular una inmunidad que dura un
perodo similar al inducido con la S19, aunque no existen estudios especficos que lo demuestren
469
e)
Estabilidad
La vacuna S19 de B. abortus preparada de inculos de orgenes apropiados muestra caractersticas
estables siempre que se cumplan los requisitos descritos arriba sobre el control del proceso y de los lotes, y
no tiene tendencia a revertir a virulenta. La vacuna liofilizada muestra una prdida gradual de viables pero
debe retener su potencia hasta el perodo de caducidad recomendado. En funcin de este fenmeno se
establece un cierto margen de seguridad, asegurando que el nmero de viables antes de la liofilizacin est
en exceso sobre el mnimo requerido. El mantenimiento de la cadena de fro durante la distribucin de la
vacuna asegura su viabilidad.
La cepa RB51 de B. abortus no muestra tendencia a revertir a microorganismos lisos virulentos despus de
muchos pases in vivo o in vitro. Esto se debe probablemente a la naturaleza y localizacin de las
mutaciones en esta cepa. La cepa RB51 de B. abortus tiene una disrupcin en el gen wboA debida a un
elemento IS711 que impide la sntesis de OPS. Datos no publicados indican que tambin contiene una
segunda mutacin que afecta al transporte de OPS a la superficie externa bacteriana o al acoplamiento de
OPS con el ncleo del LPS, o a ambos procesos.
f)
Conservantes
En las vacunas vivas S19 o con la cepa RB51 de B. abortus no deben utilizarse conservantes
antimicrobianos. Para la preparacin de la vacuna liofilizada se recomienda un estabilizador que contenga
2,5% de hidrolizado de casena, por ejemplo Triptona (Oxoid), 5% de sacarosa y 1% de glutamato sdico,
disuelto en agua y esterilizado por filtracin.
g)
Aunque son cepas atenuadas, Brucella abortus S19 y RB51 son an capaces de causar enfermedad en
humanos. Los cultivos celulares y las suspensiones deben manejarse bajo condiciones apropiadas de
contencin para bioseguridad. La reconstitucin y el posterior manejo de las vacunas deben hacerse con
cuidado para evitar una inyeccin accidental o la contaminacin de los ojos o la piel. Los residuos de
vacuna y el equipo de inoculacin deben descontaminarse con un desinfectante adecuado (de tipo fenlico,
iodforo o aldehdo) a la concentracin adecuada. En caso de exposicin accidental debe requerirse
atencin mdica. En humanos, no se ha establecido adecuadamente la eficacia del tratamiento antibitico
de las infecciones causadas por S19 y RB51; sin embargo, el CDC suministra recomendaciones para el
tratamiento. Si se produce contaminacin por S19, se recomienda un tratamiento combinado con doxiciclina
y rifampicina. En caso de contaminacin con RB51 (que es resistente a rifampicina) debe evitarse el
tratamiento con rifampicina.
5.
a)
Inocuidad
Ver Seccin C2.4.b.
b)
Potencia
Para la vacuna liofilizada, la potencia debe determinarse en el producto final. El procedimiento es como el
descrito en la Seccin C2.4.c.
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*
* *
NB: Existen laboratorios de referencia de la OIE para la Brucelosis bovina (ver Cuadro en la Parte 3 de este
Manual de animales terrestres o consultar la pgina Web de la OIE para una lista actualizada: www.oie.int).
474
Cuadro 1. Caracteres diferenciales de especies del gnero Brucella

Lisis por fagosa
104RTD
RTD
RTD
RTD
Oxidase
Actividad
ureasa
R/C
RTDc
B. abortus
Iz1
Requiere
suero
Especies
Wb
Morfologa
colonialb
Tb
Hospedador
preferido
+e
+f
Vacas y otros bvidos

Biotipo 1: cerdo
Biotipo 2: cerdo, liebre
B. suis
+g
+g
+h
Biotipo 3: cerdo
Biotipo 4: reno
Biotipo 5: roedores salvajes
B. melitensis
+j
Ovejas y cabras
B. neotomae
+h
Rata lanuda del desiertol
B. ovis
Carneros
B. canis
+h
Perros
Tomado de las refs 1, 28.

a
b
c
d
e
f
g
Fagos: Tbilisi (Tb), Weybridge (Wb), Izatnagar1(Iz1) y R/C

Fase normal de presentacin : S: lisa, R: rugosa
RTD: dilucin rutinaria de prueba
Brucella abortus biotipo 2 requiere generalmente suero para crecer en aislamiento primario
Algunos aislamientos africanos de B. abortus biotipo 3 son negativos
Velocidad intermedia, excepto la cepa 544 y algunas cepas de campo que son negativas
Algunos aislamientos de B. suis biotipo 2 no son, o solo parcialmente, lisadas por el fago Wb o Iz1
h
i
j
k
l
Velocidad rpida
Algunos aislamientos se lisan por el fago Wb
Velocidad lenta, excepto algunas cepas que son rpidas
Placas o calvas pequeas
Neotoma lepida
475
Cuadro 2. Caracteres diferenciales de los biotipos de especies de Brucella

Aglutinacin con
sueros monospecficos
Produccin de
H2S
+b
+b
+b
+b
+c
+o
B. neotomae
B. ovis
B. canis
B. melitensis
B. abortus
B. suis
bsica
Fucsina
Requiere
CO2
Especies
Tionina
Biotipo
Crecimiento con colorantesa
Tomado de las refs 1, 28.

a
b
c
d
e
f
476
Concentracin del colorante en medio de dextrosa con suero: 20 g/ml

Normalmente positivo en aislamiento primario
Algunas cepas se inhiben con colorantes
Se han aislado algunas cepas resistentes a la fucsina bsica
Negativo en la mayora de las cepas
Crecimiento a una concentracin de 10 g/ml de tionina
CAPTULO 2.3.2.
CAMPILOBACTERIOSIS GENITAL BOVINA
RESUMEN
La campilobacteriosis genital bovina es una enfermedad venrea caracterizada por infertilidad,
mortalidad embrionaria temprana y aborto. El agente causal de esta enfermedad de transmisin
sexual es Campylobacter fetus subespecie venerealis. El reservorio natural de esta bacteria es el
prepucio de toros sanos portadores. Campylobacter fetus se divide en dos subespecies: C. fetus
subesp. venerealis y C. fetus subesp. fetus.
La campilobacteriosis genital bovina est causada por C. fetus subes. venerealis, que es una
bacteria con un tropismo pronunciado para el sistema genital del ganado bovino. La transmisin
del agente causal se produce normalmente durante el apareamiento natural, pero la presencia de
C. fetus subes. venerealis en el semen de toros portadores crnicos origina el riesgo de extender
la enfermedad por inseminacin artificial. Campylobacter fetus subesp. fetus se puede encontrar
en el tracto intestinal del ganado bovino y de otras especies animales. Su papel patgeno es
comparativamente menor que el de C. fetus subes. venerealis, aunque se asla con frecuencia de
fetos bovinos abortados, lo que demuestra que esta subespecie tiene importancia clnica en el
ganado. Campylobacter fetus subes. fetus persiste en novillas vrgenes despus de la infeccin
experimental durante al menos varias semanas y hasta 10 o ms meses.
La campilobacteriosis genital bovina se diagnostica a partir de muestras obtenidas de toros, vacas
o fetos abortados. El diagnstico se lleva a cabo por demostracin del microorganismo causante, o
de una respuesta inmune especfica contra l. En el caso de los toros, se pueden recoger
muestras de semen o de secreciones del esmegma prepucial. En las vacas, las muestras de
mucus se obtienen por succin, lavado vaginal o mediante el uso de tampones. Se pueden
examinar los rganos internos de los fetos abortados para investigar la presencia de la bacteria
mediante cultivo, y analizar preparaciones en fresco del contenido estomacal para observar al
microorganismo por microscopa de campo oscuro y de contraste de fases.
Identificacin del agente: El microorganismo es un bacilo Gram-negativo curvado en forma de
espirilo, de aproximadamente 1,5 m de largo por 0,5 m de ancho. Se puede cultivar por
incubacin microerfila a 37C por un mnimo de 3 das. La confirmacin del aislamiento y la
diferenciacin entre las subespecies de C. fetus se puede llevar a cabo por mtodos bioqumicos o
moleculares.
Tambin se puede utilizar inmunofluorescencia para identificar al microorganismo, pero esta
prueba no diferencia entre subespecies.
Se han descrito en la literatura pruebas especficas para C. fetus y para cada una de las dos
subespecies basadas en la reaccin en cadena de la polimerasa.
Pruebas serolgicas: La aglutinacin con mucus vaginal constituyen una prueba til para
poblaciones, aunque no son adecuadas para identificar animales individuales infectados. Los
animales deben ser seleccionados cuidadosamente para las pruebas, pues en manadas infectadas
se ven algunos animales libres de la infeccin. Despus de la infeccin, existe una fase adaptativa
antes de que se desarrollen los anticuerpos. Adems, las aglutininas tienden a desaparecer con el
estro.
El enzimoinmunoensayo es una prueba ms sensible, pero debe utilizarse como prueba
poblacional ms bien que para probar individuos.
477
Captulo 2.3.2. Campilobacterioriosis genital bovina
Requisitos para las vacunas y los materiales de diagnstico: Una vacuna puede prepararse
con C. fetus subesp. venerealis o con C. fetus subesp. fetus, que comparte antgenos con C. fetus
subesp. venerealis. Esta vacuna se inactiva con formalina y se puede administrar con una
emulsin de aceite como adyuvante.
A. INTRODUCCIN
El gnero Campylobacter (antes incluido en el gnero Vibrio) (38) comprende muchas especies, de las que C.
fetus, C. sputorum, C. jejuni y C. coli pueden aislarse del ganado bovino. Existen dos subespecies de C. fetus: C.
fetus subesp. venerealis y C. fetus subesp. fetus. La que causa la campilobacteriosis genital bovina es C. fetus
subesp. venerealis (14, 42). Se han descrito y designado como C. fetus subesp. venerealis biotipo intermedius,
algunas variantes de C. fetus subesp. venerealis que toleran la glicina (34).
Utilizando los modelos de bandas de las protenas de clulas enteras, que aparecen mediante electroforesis en
gel de poliacrilamida (PAGE), no pueden distinguirse las dos subespecies de C. fetus (39). Mediante diferencias
antignicas, se han descrito varios serotipos de C. fetus (3, 32).
Los estudios de homologa de ADN no han podido revelar diferencias importantes entre las subespecies
venerealis y fetus (18). Sin embargo, mediante anlisis numrico de los modelos electroforticos en gel de
campo pulsante (PFGE) ha sido posible la separacin de C. fetus en dos subespecies (28). Existe un acuerdo
considerable entre los resultados de la PFGE y la identificacin basada en mtodos fenotpicos o en la reaccin
en cadena de la polimerasa (PCR). El anlisis del polimorfismo de los fragmentos de restriccin amplificados
(AFLP), recientemente desarrollado, tambin diferencia entre ambas subespecies (43), como lo hace un ensayo
de PCR de reciente aparicin (21). No obstante, segn se describe en el trabajo original, por este mtodo de
PCR no se clasifican correctamente en subespecies hasta un 10% de las cepas (21), y esta observacin se ha
confirmado en un estudio posterior (43). La diferenciacin taxonmica de C. fetus en dos subespecies est
justificada debido a las diferencias clnicas y epidemiolgicas entre ellas. Epidemiolgicamente, C. fetus subesp.
venerealis es la ms importante de las dos debido a su tropismo genital. Campylobacter fetus subesp. fetus se
puede recoger del tracto intestinal del ganado bovino y de otros animales. Su papel patognico es menor
comparado con el de C. fetus subesp. venerealis, aunque C. fetus subesp. fetus se asla con frecuencia de fetos
bovinos abortados indicando que esta subespecie tiene relevancia clnica en el ganado. Campylobacter fetus
subesp. fetus persiste en novillas vrgenes despus de infeccin experimental durante al menos varias
semanas y hasta 10 meses o ms (25, 29, 35).
1.
Aislamiento e identificacin del agente (prueba prescrita para el comercio internacional)
La campilobacteriosis genital bovina se diagnostica bacteriolgicamente mediante el aislamiento de C. fetus en

cultivo o por inmunofluorescencia. El cultivo bacteriolgico puede llevarse a cabo directamente a partir de las
muestras, o despus del transporte y/o enriquecimiento de las muestras. La utilizacin de un medio de transporte
es esencial si las muestras no se procesan en el laboratorio en las 6 horas siguientes a la recogida. Para envos
al laboratorio, si las muestras no estn en medio de transporte, deben colocarse en un recipiente con aislamiento
(dentro de un margen de temperatura de 4-18C) y protegidas de la luz.
a)
Toma de muestras
i)
En el macho: mucus prepucial o secrecciones, y semen

En los toros, el esmegma o mucus prepucial puede obtenerse por raspado (36), por succin (con una
pipeta de Bartlett) (2), o por lavados prepuciales (10). Tambin puede tomarse de una vagina artificial
despus de recoger el semen, lavando la vagina artificial con 20-30 ml de solucin salina tamponada
con fosfato (PBS).
Para lavados prepuciales, se introducen en el saco prepucial 20-30 ml de PBS estril de
pH 7,2. Despus de un masaje vigoroso de 15-20 segundos, el lquido se recoge en un recipiente
estril, que se cierra inmediatamente y se enva al laboratorio.
El semen se recoge en condiciones tan aspticas como sea posible. Se transfiere a un tubo que se
cierra inmediatamente. Las muestras de esmegma, obtenidas por raspado o succin, y las de semen,
pueden diluirse con PBS o inocularse directamente en medio de cultivo, de transporte o de
enriquecimiento. Las muestras en medio de transporte se cierran y se envan al laboratorio en un
recipiente con aislamiento (dentro de un margen de temperatura de 4-18C) y protegidas de la luz
(13).
478
ii)
En la hembra: mucus vaginal y crvicovaginal

Las muestras pueden obtenerse por frotis, succin (con pipeta de Bartlett) o por lavados de la cavidad
vaginal. El uso de un espculo estril, preferiblemente desechable, es importante para la obtencin de
muestras de buena calidad (37).
Despus de lavar la regin vulvar, la cavidad vaginal se lava con 20-30 ml de PBS estril mediante
una jeringa unida a un catter estril. El lquido se aspira y se reintroduce cuatro o cinco veces antes
de recogerlo en un recipiente estril, que se cierra inmediatamente y se enva al laboratorio. Tambin
se puede recoger lquido de lavado de la cavidad vaginal con un tampn de gasa estril mantenido en
la vagina durante 5-10 minutos despus de introducir PBS. Las muestras de mucus vaginal obtenidas
por succin pueden diluirse con PBS, o sembrarse directamente en medio de cultivo, de transporte o
de enriquecimiento.
iii)
Fetos abortados, placentas

Cuando se produce un aborto, las mejores muestras son la placenta, el contenido estomacal, los
pulmones y el hgado del feto. Se extraen bajo condiciones lo ms aspticas posibles y se envan al
laboratorio en un contenedor fro y aislado (a 4-8C).
b)
Transporte de muestras
i)
Medios de transporte y de enriquecimiento

Se dispone de varios medios de transporte y de enriquecimiento, como el de Clark (Australia), Lander
(Inglaterra), medio SBL (Francia) o medios de Foley y de Clark (utilizados en EE.UU.) (16, 20, 24).
Recientemente se ha publicado una comparacin de otros medios de transporte y de cultivo (26).
Algunos de los medios de transporte y enriquecimiento mencionados arriba contienen cicloheximida.
Debido a su toxicidad potencial, este agente antifngico no estar disponible pronto. El aislamiento de
C. fetus subesp. fetus es posible en medios con anfotericina B (1).
Medio de Clark
El medio de Clark es un medio excelente, pero su preparacin es larga y difcil, lo que limita su uso
rutinario cuando hay que procesar muchas muestras. Contiene suero bovino estril ms 5-fluorouracilo
(300 g/ml), sulfato de polimixina B (100 UI/ml), verde brillante (50g/ml), cido nalidxico (3 g/ml) y
cicloheximida (100 g/ml). La mezcla se distribuye en botellas de 10 ml con tapn de goma y una
tapadera metlica con un hueco central a travs del cual se puede insertar una aguja en el tapn. Las
botellas llenas se colocan en un bao de agua a 100C. Cuando el medio se solidifica se atraviesa el
tapn de goma con una aguja hipodrmica y se reemplaza el aire interior por una mezcla de 5% de
oxgeno, 5% de dixido de carbono y 90% de nitrgeno. Este paso se realiza dentro de una jarra para
anaerobios. El medio preparado debe mantenerse durante 1 semana en un refrigerador antes de
usarlo. Su duracin es de 3 meses a 4C.
Se inyecta aproximadamente 1 ml de la muestra problema en el medio empleando una jeringa, con la
aguja atravesando el tapn de goma. La botella se mantiene aproximadamente a 18C y se enva al
laboratorio. El tiempo de transporte al laboratorio no debe superar las 48 horas.
Cuando la botella llega al laboratorio, se incuba 4 das a 37C y despus se introducen 3 ml de
solucin salina normal. Despus de agitar vigorosamente el medio se extrae 1 ml de lquido para
pruebas posteriores de aislamiento de Campylobacter en cultivo o por inmunofluoresecencia.
Medio de Lander
Se trata de caldo de Mueller-Hinton con 5 g de carbn vegetal bacteriolgico/litro, aadido antes de la
esterilizacin. Cuando se emplea, se aade a cada litro lo siguiente en condiciones estriles: dos
botellas de "suplemento para crecimiento de Campylobacter" (Oxoid), sangre hemolizada de caballo
(70 ml), vancomicina (40 mg), sulfato de polimixina B (10.00 UI), cicloheximida (100 mg), trimetoprim
(20 mg) y 5-fluorouracilo (500 mg). El medio se distribuye en volmenes de 10 ml en recipientes de
28 ml. Pueden mantenerse por lo menos durante 2 semanas a 4C.
Este medio se inocula con muestras problema despus de pasar stas por filtros de 0,65 m de
tamao de poro. Despus de incubar a 37C durante 3 das el medio se distribuye en medios de
cultivo y de aislamiento.
Medio SBL modificado

El medio SBL, modificado por Clark (9), contiene por cada litro: agar (8 g), tioglicolato sdico (0,5 g),
glicerofosfato sdico (10 g), 1% de cloruro clcico acuoso (10 ml), hidrocloridrato de cistena (250 mg)
y solucin acuosa de azul de metileno al 0,1% (2 ml). Despus de esterilizar en autoclave, el medio se
convierte en selectivo por adicin, por cada ml, de polimixina (1 UI), novobiocina (5 g), bacitracina
(15 unidades), y cicloheximida (20 g). El medio se distribuye a continuacin en condiciones estriles
en tubos anaerbicos completamente llenos.
479
Los frotis de varias muestras se colocan en este medio de transporte y se envan en un recipiente con
aislamiento (a 18-30C) para que lleguen al laboratorio en 24-48 horas.
c)
Tratamiento de muestras
Cuando llegan al laboratorio, las muestras deben inocularse directamente en medio de cultivo o procesarse
si se requiere (por ejemplo, mediante filtracin por membrana para reducir la contaminacin).
i)
Muestras del tracto genital

Como el mucus vaginal puede ser muy viscoso, puede ser necesario licuarlo aadiendo un volumen
igual de solucin de cistena (solucin acuosa de hidrocloruro de cistena a 0,25 g/100 ml, pH 7,2,
esterilizada por filtracin). A los 15-20 minutos, el mucus diluido y licuado puede inocularse en el
medio de aislamiento. Si el mucus no es muy viscoso, se puede inocular directamente o diluir con el
mismo volumen de PBS, pH 7,2.
Los lavados prepuciales pueden centrifugarse a 3.500 g para concentrar la muestra. La muestra final
(reducida a 250 l) puede inocularse en el medio de cultivo (directamente o utilizando el mtodo de
filtracin).
ii)
Fetos abortados, placentas

El contenido del estmago de fetos se inocula directamente en un medio de cultivo adecuado. Los
rganos internos, o trozos de rganos, se flamean para esterilizar la superficie, y luego se
homogenizan. El homogenado se inocula en medio de cultivo.
Despus de lavar las membranas placentarias con solucin salina estril o con PBS estril para
eliminar la mayora de la contaminacin superficial, se raspan las vellosidades corinicas y el raspado
se transfiere a los medios de cultivo.
d)
Aislamiento de Campylobacter fetus

i)
Medio de cultivo para aislamiento

Actualmente hay muchos medios en uso para el diagnstico bacteriolgico de la campilobacteriosis
genital bovina (7). La mayor parte de ellos contienen cicloheximida. Debido a su toxicidad potencial,
este agente antifngico no estar disponible pronto. El aislamiento de C. fetus es posible en medios
con anfotericina B (1).
Los siguientes son ejemplos de medios:
Medio Skirrow con cicloheximida

Este medio contiene como agentes selectivos: sulfato de polimixina B (2,5 UI/ml), trimetoprim (5 g
/ml), vancomicina (10 g/ml), y cicloheximida (50 g/ml). Contiene 5-7% de un lisado de sangre
desfibrinada de caballo. Sin embargo, la adicin de sangre desfibrinada de oveja al 5-7% da buenos
resultados.
Medio selectivo de Clark

Contiene peptona (10 g), cloruro sdico (5 g), extracto de carne (5 g), agar (15 g) y agua destilada
(1000 ml). Disolver los ingredientes en agua, excepto el agar, con agitacin si es necesaria. Ajustar el
pH a 7,4-7,6, despus aadir el agar y calentar a ebullicin. Esterilizar en autoclave (121C durante
15 minutos). Enfriar a 55C y aadir 10% de sangre estril desfibrinada de origen ovino o bovino, y
despus bacitracina (15 UI/ml), sulfato de polimixina B (1 UI/ml), novobiocina (sal sdica) (5 g/ml) y
cicloheximida (10 g/ml).
Medios no selectivos
Se puede utilizar cualquier medio basado en sangre (agar Columbia, agar sangre base No. 2) como
medio no selectivo suplementado con sangre de oveja o de caballo.
ii)
Inoculacin de los medios e incubacin

Cada muestra se inocula directamente en un medio selectivo o, despus de pasar por un filtro de
tamao de poro de 0,65, en un medio selectivo y/o en un medio base. El material se extiende con un
asa de siembra para facilitar el aislamiento de colonias individualizadas.
Las placas se incuban a 37C + 1C. Para el crecimiento ptimo, se requieren atmsferas
microaerbicas con 5-10% de oxgeno y 5-10% de dixido de carbono (y preferiblemente 5-9% de
hidrgeno). Las condiciones microaerbicas de crecimiento se pueden producir por diversos mtodos.
En algunos laboratorios se utiliza la evacuacin repetida de los gases de la jarra de incubacin y su
sustitucin por gases envasados. Los equipos generadores de gases estn comercializados. Los
incubadores de atmsfera variable son ms adecuados si se trata de gran nmero de cultivos.
Las condiciones de cultivo e incubacin se controlan sistemticamente utilizando cepas control de
C. fetus subesp. fetus y C. fetus subesp. venerealis. Tales controles deben incluirse en cada serie de
480
aislamiento. No es necesario incluir ms de un control por da a menos que se utilicen diferentes lotes
de medio, en cuyo caso debe probarse cada lote.
iii)
Lectura de los resultados

Normalmente las colonias de C. fetus aparecen despus de 2-5 das en los medios recomendados.
El crecimiento puede ser lento, particularmente en presencia de otras bacterias contaminantes en las
muestras. Para evitar que el crecimiento de los contaminantes se superponga a colonias especficas,
se recomienda examinar diariamente el medio y subcultivar las colonias que se sospechan que
corresponden a C. fetus. Despus de 3-5 das de incubacin, las colonias miden 1-3 mm de dimetro.
Son ligeramente grisceas-rojizas, redondas, convexas, lisas y brillantes, con un borde regular. Los
cultivos deben incubarse como mnimo 6 das.
e)
f)
Confirmacin del microorganismo

i)
Morfologa microscpica: Campylobacter fetus es mvil, aunque esta propiedad puede desaparecer
despus de subcultivos. A menudo Campylobacter fetus presenta la forma de un bacilo curvado
fino, de 0,3-0,4 m de ancho y 0,5-8,0 m de largo. En estado vivo se pueden observar
simultneamente formas cortas (en forma de coma), medias (en forma de S) y largas (helicoidales con
varias espirales). Las bacterias siempre se presentan aisladas. Los cultivos viejos pueden contener
formas cocoides.
ii)
Pruebas bioqumicas: Campylobacter fetus es oxidasa y catalasa positivo.
iii)
Campylobacter fetus no crece en condiciones aerbicas.
Identificacin de Campylobacter a nivel de especie

Estas pruebas (ver Cuadro 1) deben hacerse con cultivos puros. Idealmente deben realizarse utilizando una
suspensin estandarizada, con una turbidez que no sea superior a la No. 1 de McFarland, o equivalente.
Cuadro 1. Caracteres diferenciales del gnero Campylobacter
Oxidasa
Catalasa
H2S(a)
25C
42C
Glicina 1%
NaCl
3.5%
Cefaloiina
cido
nalidxi-co
C. fetus subesp.
venerealis
V(b)
C. fetus subesp. fetus
V(b)
C. jejuni
C. sputorum biotipo
sputorum
C. sputorum biotipo
faecalis
C. sputorum biotipo
paraureolyticus
(a) = En medio de triple azcar-hierro; (b) = Aunque C. fetus no pertenece a las especies termfilas de
Campylobacter, se ha descrito el crecimiento de esta especie a 42C (12, 41);
() = reaccin o crecimiento positivo; () = reaccin negativa o ausencia de crecimiento de la cepa en medio apropiado en
condiciones especificadas; V = resultados variables; S = sensible; R = resistente.
i)
Prueba de crecimiento en presencia de glicina

La prueba se hace sobre cada cepa que parezca ser C. fetus (cepas sospechosas) preparando una
suspensin en tampn a pH 7,2. sta se inocula en un medio con glicina (15 ml de medio con sangre
+ exactamente 1,65 ml de una solucin acuosa de glicina al 10%), y en medio base con sangre. La
incubacin se realiza bajo las condiciones atmosfricas especificadas. En paralelo se prueban dos
cepas control (de las subespecies venerealis y fetus). Como todas las cepas son "fastidiosas",
pequeos cambios en el medio pueden ser importantes y la falta de crecimiento en glicina debe
considerarse como una prueba preliminar de que se trata de C. fetus subes. venerealis. La
reproducibilidad de la prueba es baja y se han descrito cepas intermedias (34).
ii)
Prueba de crecimiento en presencia de cloruro sdico

Se inocula una suspensin en tampn pH 7,2 de la cepa sospechosa a un medio con sangre que
contenga 3,5% de NaCl (15 ml de medio con sangre + 2,04 ml de una solucin de cloruro sdico 5 M),
481
y a un medio base con sangre. La incubacin se realiza bajo las condiciones atmosfricas
especificadas. En paralelo se prueban dos cepas control.
iii)
Prueba de produccin de sulfhdrico

La prueba de sulfhdrico (H2S) se hace en medio slido de triple azcar-hierro (medio TSI) que
contiene peptona (20 g/litro), extracto de carne (2,5 g/litro), extracto de levadura (3 g/litro), cloruro
sdico (5 g/litro), citrato frrico (0,5 g/litro), tiosulfato sdico (Na2S2O3) (0,5 g/litro), lactosa (10 g/litro),
sacarosa (10 g/litro), glucosa (1 g/litro), rojo fenol (0,0024 g/litro), agar (11 g/litro) y agua destilada
(hasta 1.000 ml). Este medio se esteriliza en el autoclave a 115C durante 15 minutos despus de
distribuir en tubos. Se puede preparar segn se necesita o bien se prepara y se mantiene guardado en
condiciones normales de almacenamiento durante aproximadamente 3 semanas.
Antes de uso, licuar el medio en un bao de agua hirviendo e inclinar los tubos para obtener una
pendiente con una profundidad de 3 cm. Este medio puede guardarse bajo condiciones normales
durante 8-10 das antes de uso.
iv)
Prueba de sensibilidad a cefalotina y a cido nalidxico

La sensibilidad a cefalotina (CN) y cido nalidxico (NA) se prueba por la tcnica del disco (31). Se
preparan en el laboratorio discos conteniendo cada uno CN (30 g) o NA (30 g) empapando discos
de papel de filtro en soluciones de CN (3 mg/ml) y NA (3 mg/ml). Los discos se secan y se guardan
hasta uso.
Para la prueba, se suspenden cultivos de 72 horas de las cepas problema en PBS pH 7,2, a una
concentracin de 109 bacterias/ml. Porciones de 100 l de esta suspensin se colocan como una capa
uniforme sobre el medio base de sangre. Las placas de cultivo se secan antes de depositar el cultivo
sobre la superficie. A continuacin, se colocan encima los discos de sensibilidad, los cultivos se
incuban a 37C en atmsfera apropiada y se examinan despus de 48 y 96 horas. Una zona de
inhibicin alrededor de un disco de al menos 3 mm indica que la cepa problema es sensible a ese
antibitico. Todas las cepas de C. fetus subesp. fetus y la mayora de las de C. fetus subesp.
venerealis son resistentes a NA (27). Todas las cepas de C. fetus son sensibles a CN (27).
g)
Inmunofluorescencia
Esta prueba puede aplicarse para identificar el microorganismo por la tcnica directa o para confirmar la
identificacin de una cepa aislada. No diferencia entre diferentes especies (30).
i)
Preparacin de sueros inmunes

Se crecen cepas de Campylobacter, preferiblemente cepas estndar de colecciones de cultivo
reconocidas (C. fetus subesp. venerealis o C. fetus subesp. fetus), durante 3 das a 37C, por
separado, en medio de agar sangre y en condiciones microaerbicas. Los microorganismos se
recogen en PBS pH 7,2, y se lavan dos veces por centrifugacin. Se inoculan intramuscularmente
conejos de 3 meses con 2 ml de una suspensin de 1011 microorganismos/ml de una subespecie de
C. fetus en PBS y adyuvante incompleto de Freund. El inculo se administra en cuatro sitios, con 0,5
ml en cada sitio. Los animales se sangran antes de la inoculacin y despus a intervalos semanales.
Cuando los ttulos del suero son elevados por pruebas de inmunofluorescencia o de aglutinacin, se
inyectan intravenosamente 0,1-1,0 ml con 1010 microorganismos viables/ml. Los conejos se sangran 7
das despus y se juntan los sueros heterlogos. En un estudio reciente, se ha descrito un conjugado
preparado de IgY de pollo como alternativa a los anticuerpos de conejo (8). Se han descrito
anticuerpos monoclonales que pueden utilizarse para la deteccin inmunodiagnstica de C. fetus (6).
ii)
Preparacin de conjugados
La fraccin de IgG se separa por precipitacin con sulfato sdico. El suero se ajusta a pH 8,0 con PBS
0,1 M y se aaden 18 g de sulfato sdico anhidro por cada 100 ml. El precipitado se recoge por
centrifugacin y se redisuelve en agua destilada a su volumen original. Se re-precipita aadiendo 12 g
de sulfato sdico/100 ml. Se recoge el precipitado, se disuelve en agua destilada a la mitad de su
volumen, y se dializa frente a PBS, pH 7,2, a 4C hasta que est libre de sulfato. Se determina el
contenido en protena y se ajusta la concentracin con PBS a 1,0-1,5 g de protena por 100 ml (por
ejemplo, seroalbmina bovina). Esta solucin se ajusta a pH 9,0 con carbonato sdico 1M. Se aade
el ismero 1 de isotiocianato de fluorescena (FITC) en un volumen mnimo de carbonato sdico 0,1 M
a una concentracin final de 15 mg FITC/1,0 g de protena. Esto se agita durante 18 horas a 4C. La
mezcla se ajusta a pH 7,0 con cido clorhdrico 0,1 M y se dializa frente a PBS a 4C con frecuentes
cambios. Los restos de FITC libre se eliminan por filtracin en gel de Sephadex G25, y el producto
final se guarda a -20C o a temperatura inferior en pequeas alcuotas.
482
La dilucin de trabajo del conjugado se determina probando varias diluciones en PBS con frotis de un
cultivo de C. fetus, y seleccionando el doble de la concentracin ms baja que produce fluorescencia
brillante con estos microorganismos de ensayo. Por microscopa de alta resolucin, los
microorganismos fluorescentes tienen una morfologa tpica y frecuentemente se concentran en los
bordes del frotis.
iii)
Las muestras se fijan a portaobjetos de vidrio, se tien con el antisuero conjugado con FITC, y se
examinan para presencia de microorganismos fluorescentes. La tincin se realiza en una cmara
hmeda a 37C durante 30 minutos. Los portaobjetos se lavan luego hasta eliminacin del conjugado
libre, se someten a dos lavados con PBS (10 minutos cada lavado), y se montan con glicerol
tamponado (80% [v/v] de glicerol: 20% de tampn fosfato 0,1 M, pH 8,0).
Los cubreobjetos se sellan para evitar el secado y los portaobjetos se examinan en un microscopio de
luz ultravioleta.
h)
Identificacin molecular de Campylobacter fetus

Se han descrito en la literatura mtodos basados en PCR para la identificacin especfica de C. fetus (21) y
de cada una de las subespecies (21, 44).
2.
Pruebas serolgicas de deteccin de anticuerpos
Las pruebas para anticuerpos incluyen la prueba de aglutinacin del mucus vaginal y el enzimoinmunoensayo
(ELISA).
a)
Prueba de aglutinacin del mucus vaginal

Esta prueba es til en manadas, pero no para identificar animales individuales infectados por C. fetus. Solo
se identifica alrededor del 50% de los animales infectados. La prueba se realiza mejor con mucus vaginal
tomado 37-70 das despus de la infeccin, pero la presencia de anticuerpos puede retrasarse hasta 3-4
meses. Algunas vacas permanecen positivas durante varios aos mientras que otras se vuelven negativas
en 2 meses. Aproximadamente el 50% de las vacas positivas son negativas a los 6 meses (15).
Las muestras tomadas por lavados vaginales se consideran diluidas 1/5 con el lavado salino. Cuando las
muestras se obtienen con tampones, el mucus vaginal se extrae con 7 ml de solucin salina fisiolgica y
se deja durante la noche a 4C. Se presiona el tampn para obtener el lquido y se utiliza como lquido
problema en la prueba de aglutinacin del mucus vaginal.
En la prueba de aglutinacin del mucus vaginal, el antgeno es un cultivo de 48 horas de C. fetus subes.
venerealis en agar con 7% de sangre fresca (de menos de 2 semanas) de oveja, que contenga
preferentemente 0,1% de cicloheximida. Este cultivo se sub-cultiva en 20-30 placas con agar sangre, o bien
se pipetea una suspensin de la bacteria en PBS estril en frascos Roux con agar sangre y se extiende
sobre la superficie del medio por agitacin suave. Los cultivos se incuban en microaerobiosis durante 2-3
das a 37C con 85% de nitrgeno, 10% de dixido de carbono y 5% de oxgeno. Las clulas se recogen y
se suspenden en suspensin salina con 0,5% de formol. Si se utilizan frascos Roux, se emplean 10 ml de
solucin salina con formol y bolas de vidrio para extraer las clulas. La suspensin se filtra por una gasa
para eliminar restos grandes, se lava tres veces por centrifugacin a 6.000 g durante 20 minutos y el lavado
final se resuspende en 0,25% de formol salino y se guarda durante 1 semana. Para titular el antgeno, se
prepara una serie de diluciones en formol salino. Cada dilucin se titula con diluciones dobles de un
antisuero bovino adecuado contra C. fetus. Cada tubo debe contener 0,5 ml de suero y 0,5 ml de antgeno.
El contenido se mezcla bien antes de incubar a 37C durante 18 horas. El ttulo del antgeno se determina
por la dilucin ms alta que origina al menos un 50% de aglutinacin con la muestra de suero positivo.
Las muestras de mucus vaginal se homogenizan con cuatro volmenes de PBS (o 5% de fenol salino)
utilizando bolas de vidrio. Si se ha practicado un lavado vaginal, las muestras son adecuadas. Una vez
homogenado, se transfieren 2 ml a un tubo de ensayo colocado en un bao de agua a 57C. Se colocan en
el mismo bao 10 ml aproximadamente de agar Oxoid No.1 fundido (20 g/litro). Cuando el contenido de los
dos tubos se ha equilibrado a 57C, se pipetean 2 ml del agar en el homogenado. La mezcla se agita
vigorosamente y se vierte rpidamente en un recipiente con tapn de rosca con una boca de 45 mm de
anchura. Cuando la mezcla se ha solidificado, se depositan 2 ml de fenol salino al 5% sobre el agar antes
de cerrar el tapn. El recipiente se incuba despus durante 18 horas a 37C para extraer el anticuerpo.
El lquido claro se aspira de la superficie del agar y se emplea como muestra de la prueba en un ensayo de
aglutinacin en tres tubos. El primer tubo se deja vaco, y en los otros se pipetean 0,5 ml de 0,5% de fenol
483
salino. Luego se ponen 0,5 ml de la muestra problema en el primer y segundo tubo. Se mezcla el contenido
del segundo tubo y se transfiere 0,5 ml al tercer tubo. Se mezcla el contenido del tercer tubo y se eliminan
0,5 ml. A continuacin, se aade a cada tubo 0,5 ml de una dilucin estandarizada del antgeno y se
mezcla bien. Despus de incubar a 37C durante 18 horas, las pruebas se observan con luz oblicua sobre
un fondo negro. Cada dilucin se valora como sigue:
Agua clara
75% claridad
50% claridad
25% claridad
No claridad
=
=
=
=
=
++++
+++
++
+
-
Se debera realizar al mismo tiempo una titulacin de un control positivo utilizando el mismo mtodo que
para determinar el ttulo de un antgeno frente a un antisuero positivo conocido. El antgeno se utiliza a la
misma dilucin estandarizada frente a diluciones del suero positivo. Los resultados se pueden validar si se
obtiene el ttulo esperado utilizando las muestras de control positivo.
Un resultado positivo es aquel en el que se produce el 50% de aglutinacin en el tercer tubo (dilucin 1/80),
o despus si se usan ms de tres tubos. La reaccin es dudosa si hay menos evidencia de aglutinacin. Se
considera que la prueba del mucus es til para el diagnstico de la campilobacteriosis genital, pero debe
resaltarse que la interpretacin de los resultados ha de hacerse a nivel poblacional. Para utilizar mejor la
prueba es necesario seleccionar con cuidado los animales, ya que incluso en poblaciones con una extensa
infeccin es probable que algunos animales escapen a la infeccin. Hay un perodo variable de adaptacin
entre la infeccin y el desarrollo de una prueba de aglutinacin positiva, y en la fase del estro las aglutininas
tienden a desaparecer del mucus parcialmente o por completo, aunque pueden presentarse a altas
concentraciones en otras fases del ciclo. En cualquier caso, los ttulos de aglutinacin tienden a
desaparecer con el tiempo.
b)
Enzimoinmunoensayo
Se dispone de un ELISA para detectar anticuerpos secretorios IgA especficos de antgeno en el mucus
vaginal despus de el aborto debido a C. fetus subesp. venerealis (17, 19). Estos anticuerpos son
duraderos, y su concentracin permanece constante en el mucus vaginal durante varios meses (22).
El muestreo inicial puede realizarse despus del primer perodo involucional (normalmente 1 semana
despus del aborto) cuando el mucus se hace ms claro.
Se ha descrito recientemente un ELISA para detectar la respuesta srica humoral de IgG despus de la
vacunacin (33).
Preparacin de antgeno y antigenizacin
Se crece Campylobacter fetus subesp. venerealis en agar con 7-10% de sangre en condiciones
microaerbicas a 37C durante 3 das. Las placas se analizan para pureza y se transfieren colonias a 0,5%
de formol salino durante 1 hora, se centrifuga a 17.000 g, se lava dos veces con PBS, pH 7,5, y se
resuspende a continuacin en tampn carbonato 0,05 M, pH 9,6. La absorbancia final se ajusta a 0,21 a
610 nm. Se dejan durante la noche a 4C placas de poliestireno para microtitulacin de fondo plano
antigenizadas con 10 l de antgeno, que se guardan luego a -20C. Antes de uso, las placas se lavan dos
veces con agua destilada y despus se elimina la humedad de ellas con cuidado.
484
i)
Se aade a cada pocillo el mucus vaginal diluido (100l) y la placa se incuba durante 2 horas a 37C.
ii)
Se lavan las placas como antes y se aaden 100 l de IgA anti-bovina de conejo.
iii)
Despus de una incubacin de 2 horas a 37C, se lavan las placas y se aaden a cada pocillo 100 l
de IgG anti-conejo de cabra conjugada a peroxidasa de rbano.
iv)
Despus de otras 2 horas de incubacin a 37C, se lavan las placas y se aaden 100 l de substrato
(cido 5 amino-saliclico [0,8 mg/l], pH 6,0, activado inmediatamente por la adicin de 2% de perxido
de hidrgeno [H2O2]).
v)
Las placas se dejan a temperatura ambiente durante 30 minutos y se detiene la reaccin aadiendo
50 l de hidrxido sdico (NaOH) 3 M. La absorbancia se mide en un lector ELISA a 450 nm.
vi)
Interpretacin de los resultados: cada muestra se prueba en duplicado, y en cada placa se incluye
controles positivos y negativos. Las medidas de absorbancia de las muestras problema se corrigen
para las medidas de absorbancia de los controles positivos y negativos segn la frmula siguiente:
Absorbancia muestra- Absorbancia control negativo
Resultado = ________________________________________________
Absorbancia control positivo - Absorbancia control negativo
100
La prueba se considera positiva si el resultado es superior a 40. Los animales vacunados no

reaccionan al ELISA con IgA ya que su mucus vaginal solo contiene anticuerpos de isotipo IgG.

Las vacunas con Campylobacter fetus subesp. fetus confieren inmunidad contra C. fetus subesp. venerealis
porque ambas cepas comparten antgenos comunes (5). Se reconocen dos grupos de antgenos de C. fetus: los
antgenos flagelares "H" que son termolbiles y los antgenos somticos "O" que son termoestables. Adems,
est presente un antgeno capsular "K" (23). La vacuna debe incorporar estos antgenos. Se trata de vacunas en
emulsin de aceite con una o ms cepas que se han inactivado con formaldehdo. Tambin se han descrito otras
preparaciones de vacunas (11).
La adicin al producto biolgico de una segunda cepa de C. fetus subesp. venerealis es una prctica comn. Es
importante la presencia de cuatro o cinco inmungenos proteicos sensibles al calor que son compartidos por
muchas cepas de C. fetus subesp. venerealis y C. fetus subesp. fetus. Debe confirmarse la presencia de tales
inmungenos (4).
En poblaciones infectadas, todos los animales para reproduccin, incluyendo los toros, vacas y terneras, se
vacunan despus del diagnstico de campilobacteriosis genital bovina. Al tiempo de la segunda vacunacin, se
recomienda un tratamiento adicional con antibiticos para toros infectados, ya que la vacuna no siempre es
eficaz para acabar con infecciones establecidas.
Los toros y novillas del ao siguiente se vacunan, y los toros del tercer ao en adelante se vacunan anualmente.
En poblaciones no infectadas solo se vacunan los toros, una vez al ao.
1.
Control de inculos
a)

El inculo consiste en un lote grande y homogneo de un cultivo de C. fetus subesp. fetus o de C. fetus
subesp. venerealis que se ha caracterizado cuidadosamente e identificado en cuanto a pureza, conservado
en pequeas alcuotas.
b)
Mtodo de cultivo
El crecimiento inicial del inculo tiene lugar en medio slido. ste consiste en un medio basal al que se
aade 0,16% de Bacto agar. El medio basal se compone de 2,8% de caldo de Brucella, 0,5% de extracto de
levadura, 1,2% de succinato sdico, y 0.001% de cloruro clcico. El cultivo inicial se mantiene 3 das a 37C
en una atmsfera de 5% de CO2, 5% de O2 y 90% de N2. El cultivo se pasa a tubos adicionales con medio
semislido y se incuba durante 48 horas. El material resultante se utiliza para produccin de vacuna.
c)

El inculo debe estar libre de organismos contaminantes. La pureza del inculo debe comprobarse por un
mtodo de cultivo apropiado.
No resulta prctico probar la eficacia en condiciones de laboratorio. Se determina en el campo por
observaciones epidemiolgicas.
La vacuna debe mantenerse a 4C.
2.
Mtodo de produccin
El material de siembra se cultiva en medio lquido formado por medio basal al que se aade 0,025% de
tioglicolato sdico. Estos cultivos se incuban durante 24 horas a 37C con agitacin a 80 rpm. Se recogen los
lquidos y se aade formaldehdo a una concentracin final de 0,2%.
485
La vacuna se mezcla con un adyuvante de emulsin de aceite para alargar el perodo de inmunidad.
3.
Control del proceso
Se debe comprobar la identidad del microorganismo por cultivo e identificacin, as como la ausencia de
microorganismos contaminantes.
4.
Control de lotes
a)
Esterilidad
Las pruebas para esterilidad y ausencia de contaminacin del material biolgico se pueden encontrar en el
captulo I.1.5.
b)
Inocuidad
El proceso de inactivacin debe ser completo. Esto se comprueba inoculando el equivalente de una dosis
en el mismo medio y bajo las mismas condiciones que las utilizadas en el proceso de produccin. Este
cultivo se incuba 72 horas en las mismas condiciones, despus de las cuales no debe haber evidencia de
crecimiento bacteriano. El producto final debe estar libre de contaminantes bacterianos y fngicos viables,
utilizando mtodos adecuados de cultivo.
Se inoculan dos cobayas con 2 ml del producto, intramuscular o subcutneamente. No debe haber una
reaccin adversa atribuible a la vacuna durante un perodo de observacin de 7 das despus de la
inoculacin.
c)
Potencia
La potencia de la vacuna puede medirse por seroconversin en conejos. Se miden sus ttulos sricos
mediante inmunofluorescencia o por la prueba de aglutinacin en tubo. Se vacunan subcutneamente, con
la mitad de la dosis utilizada en el ganado bovino, cinco conejos que sean serolgicamente negativos a una
dilucin 1/100 del suero, en dos ocasiones separadas por 14 das. Como mnimo, el suero de cuatro de los
cinco ratones, recogido 14 das despus de la segunda vacunacin, debe mostrar un incremento en el ttulo
de al menos cuatro veces.
5.
a)
Inocuidad
Ver Seccin C.4.b.
b)
Potencia
Ver Seccin C.4.c.
Agradecimiento
Partes de este captulo derivan del captulo sobre campilobacteriosis genital bovina de ediciones previas de este
Material o estn basados en l.
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*
*
488
CAPTULO 2.3.3.
TUBERCULOSIS BOVINA
RESUMEN
La tuberculosis bovina es una enfermedad bacteriana crnica, de animales y del hombre, causada
por Mycobacterium bovis. En muchos pases la tuberculosis bovina es una enfermedad infecciosa
importante en el ganado vacuno, en otros animales domsticos y en algunas poblaciones de
animales salvajes. La transmisin al hombre representa un problema de salud pblica.
Se considera que la ruta ms frecuente de infeccin del ganado es la exposicin a aerosoles de
M. bovis, aunque tambin se produce la infeccin por ingestin de material contaminado. Tras la
infeccin, se pueden desarrollar granulomas nodulares no vascularizados conocidos como
tubrculos. Las lesiones caractersticas de la tuberculosis se presentan con ms frecuencia en los
pulmones y en los ndulos linfticos retrofarngeos, bronquiales y del mediastino. Tambin se
pueden encontrar lesiones en los ganglios linfticos mesentricos, en el hgado, en el bazo, sobre
las membranas serosas, y en otros rganos.
La infeccin del ganado bovino con tuberculosis bovina se diagnostica por lo general en el animal
vivo mediante reacciones de hipersensibilidad retardada. Habitualmente, la infeccin es subclnica;
cuando se presenta, los sntomas clnicos no son especficamente distintivos de esta enfermedad y
pueden incluir debilidad, anorexia, extenuacin, disnea, inflamacin de los ganglios linfticos y tos,
particularmente en casos de tuberculosis avanzada. Tras la muerte, se diagnostica mediante
examen post-mortem y por tcnicas histopatolgicas y bacteriolgicas. Tambin se pueden utilizar
tcnicas con sondas de ADN y la reaccin en cadena de la polimerasa (PCR). stas son tcnicas
exigentes y slo se deben utilizar procedimientos validados. El cultivo bacteriano tradicional
contina siendo el mtodo rutinario de confirmacin de la infeccin.
Identificacin del agente: Los exmenes bacteriolgicos pueden comprender la demostracin por
examen microscpico de bacilos cido-alcohol resistentes (constituye una confirmacin preliminar),
y el aislamiento de micobacterias en medios de cultivo selectivos y su posterior identificacin por
pruebas bioqumicas y de cultivo o con sondas de ADN o tcnicas de PCR. La inoculacin en
animales es ligeramente ms sensible que el cultivo, pero solo se debera utilizar cuando las
lesiones histopatolgicas sean compatibles con la infeccin por micobacterias y resulte negativo el
aislamiento en cultivo.
Prueba de hipersensibilidad retardada: Esta prueba es el mtodo estndar para la deteccin de
la tuberculosis bovina. Supone medir el grosor de la piel, la inyeccin intradrmica de la tuberculina
bovina en el rea medida, y la determinacin de cualquier inflamacin en el sitio de la inyeccin
3 das ms tarde.
La prueba comparativa de la tuberculina intradrmica, con tuberculina bovina y aviar, se utiliza
para diferenciar entre animales infectados con M. bovis y los sensibilizados a la tuberculina por
exposicin a otras micobacterias o gneros relacionados.
La eleccin de cul de las dos pruebas debe utilizarse depende de la prevalencia de la infeccin de
tuberculosis y del nivel de exposicin ambiental a otros microorganismos sensibilizadores.
Debido a su mayor especificidad y ms fcil estandarizacin, los derivados proteicos purificados
(PPD) han reemplazado a las tuberculinas obtenidas a partir de los medios sintticos concentradas
por calor. La dosis recomendada de PPD bovina en el ganado es de al menos 2000 unidades
internacionales (UI) y en la prueba comparativa de la tuberculina la dosis no debe de ser menor de
2000 UI. Las reacciones se interpretan con arreglo a esquemas apropiados.
489
Captulo 2.3.3. Tuberculosis bovina
Pruebas de laboratorio con sangre: Existen nuevas pruebas de diagnstico con sangre, por
ejemplo la prueba de proliferacin de linfocitos, la del interfern gamma y el enzimoinmunoensayo.
La logstica y la realizacin de estas pruebas en el laboratorio puede ser un factor limitante. Se
necesitan ms estudios comparativos de estas pruebas nuevas y ensayos drmicos en diferentes
condiciones de campo. El uso de pruebas basadas en sangre presenta ventajas, en especial con
ganado arisco, con animales del zoo o de tipo salvaje, aunque la interpretacin de estas pruebas
est limitada por la falta de datos en algunas especies.
Requisitos para las vacunas y los materiales de diagnstico: Se estn desarrollando y
probando vacunas, pero en la actualidad no se administran de modo rutinario. Existen mtodos
estndar para la produccin de tuberculinas PPD bovinas. Las PPD utilizadas para realizar las
pruebas especificadas deben prepararse de acuerdo con los requisitos de la Organizacin Mundial
de la Salud y cumplir con ellos respecto al origen de los materiales, mtodos de produccin y
precauciones, substancias aadidas, ausencia de contaminacin, identidad, seguridad, potencia,
especificidad y ausencia de efectos sensibilizantes. Los bioensayos para actividad biolgica son
especialmente importantes, y la potencia se debe expresar en Unidades Internacionales.
A. INTRODUCCIN
Mycobacterium bovis es un microorganismo zoonsico y, durante el examen de diagnstico, debe ser tratado
como un microorganismo del grupo III de riesgo/peligro, con las debidas precauciones, para evitar que se
produzca infeccin en humanos.
La tuberculosis bovina es una enfermedad infecciosa causada por M. bovis, y se caracteriza normalmente por la
formacin de granulomas nodulares conocidos como tubrculos. Aunque se suele definir como una enfermedad
crnica debilitante, la tuberculosis bovina puede presentar en ocasiones un curso agudo, rpido y progresivo.
Cualquier tejido del cuerpo puede resultar afectado, pero las lesiones se observan con ms frecuencia en los
ganglios linfticos (sobre todo de la cabeza y trax), pulmones, intestinos, hgado, bazo, pleura y peritoneo.
En pases con programas de erradicacin de la tuberculosis, raramente se observa evidencia clnica de
tuberculosis en el ganado, porque la prueba intradrmica de la tuberculina posibilita el diagnstico y la
eliminacin de los animales infectados antes de que aparezcan los sntomas. Sin embargo, antes de las
campaas nacionales de erradicacin de la tuberculosis, se observaban con frecuencia los sntomas asociados
con la tuberculosis (6).
Estos sntomas varan segn la distribucin de los tubrculos en el cuerpo pero, con pocas excepciones, el curso
de la enfermedad es crnico. En muchos casos faltan sntomas caractersticos, incluso en fases avanzadas de la
enfermedad cuando estn afectados muchos rganos. La implicacin de los pulmones puede originar tos, que se
puede inducir por cambios de temperatura o por presin manual sobre la trquea.
La disnea y otros sntomas de neumona de grado bajo tambin evidencian la disfuncin pulmonar. En casos
avanzados, los ganglios linfticos a menudo estn muy dilatados y pueden obstruir las vas respiratorias, el tracto
alimentario los vasos sanguneos. Los ganglios linfticos de la cabeza y del cuello pueden llegar a estar
afectados a simple vista y a veces se rompen y drenan. La implicacin del tracto digestivo se manifiesta por la
presencia de diarreas intermitentes y, en algunos casos, por estreimiento. En las fases terminales de la
tuberculosis puede presentarse una extenuacin extrema y dolor respiratorio agudo. Pueden observarse lesiones
en el tracto genital femenino. Los genitales masculinos raramente estn implicados.
En las necropsias, los tubrculos se ven con ms frecuencia en los ganglios linfticos bronquiales, mediastnicos,
craneales y portales, que pueden ser el nico tejido infectado. Adems se suelen ver afectados los pulmones, el
hgado, el bazo y las superficies de las cavidades del cuerpo. Otros lugares anatmicos se pueden considerar
como potencialmente infectables.
En las necropsias, un granuloma tuberculoso suele presentar un aspecto amarillento y consistencia caseosa,
caseo-calcrea o calcificada. Ocasionalmente pueden ser purulentos. Existen algunos granulomas no
tuberculosos en los que el contenido purulento verdoso est reemplazado por tejido granuloso, que pueden tener
similitud con los granulomas tuberculosos. Normalmente, el centro caseoso es seco, firme, y est cubierto con
una cpsula fibrosa conjuntiva de grosor variable. Los tejidos fijados de un tubrculo no se extraen intactos con
facilidad, como ocurre con algunos granulomas no tuberculosos. El tamao de las lesiones vara, desde tan
pequeas que pueden pasar desapercibidas a simple vista, hasta ocupar gran parte de un rgano. El corte
seriado de rganos y tejidos resulta vital para detectar las lesiones contenidas en un tejido.
490
En la mayor parte de los pases donde se han caracterizado las micobacterias aisladas de humanos, se ha
identificado a Mycobacterium bovis en el hombre. La frecuencia de la tuberculosis pulmonar causada por M.
bovis es mayor en trabajadores de granjas y mataderos que en habitantes de zonas urbanas. La transmisin de
M. bovis al hombre por la leche o sus productos se elimina mediante la pasteurizacin de la leche. Uno de los
resultados de los programas de erradicacin de la tuberculosis bovina ha sido un descenso en los casos de
enfermedad y de muerte causados por la tuberculosis bovina en la poblacin humana.
Aunque se considera que el ganado vacuno es el verdadero hospedador de M. bovis, se ha descrito la
enfermedad en muchos animales domsticos y no domsticos. El microorganismo se ha aislado de bfalos,
bisontes, ovejas, cabras, quidos, camellos, palomas, cerdos, jabales, ciervos, antlopes, perros, gatos, zorras,
visones, tejones, hurones, ratas, primates, llamas, kudus, elands, tapires, alces, elefantes, sitatungas, orixes,
addaxes, rinocerontes, opossums, ardillas, nutrias, focas, liebres, topos, mapaches, coyotes y varios
depredadores felinos como leones, tigres, leopardos y linces (7, 21).
La tuberculosis bovina en animales salvajes se describi por primera vez en 1929 en Sudfrica en el kudu
(Tragelaphus strepsiceros) y en el duiker (Sylvicapra grimmi). Durante los 1940s se encontr que el kudu en la
misma regin estaba infectado endmicamente. En Uganda se detect en 1982 una prevalencia del 10% en el
bfalo africano y del 9% en el cerdo verrucoso (Phacochoerus aethiopicus). En Zambia se ha descrito infeccin
por M. bovis del kafue lechue (Kobus leche kafuensis) y de un eland (Traurotragus oryx). En Kenia se ha descrito
un brote de tuberculosis en los babuinos verdosos salvajes (Papio cycocephalus anubis). Tambin se ha
diagnosticado una infeccin por Mycobacterium bovis en el bfalo africano del Parque Nacional Kruger de
Sudfrica (3) y, ms recientemente, se ha encontrado distribuida por otras especies como el babuino chacma
(Papio ursinus), el len (Panthera leo) y el guepardo (Acynonyx jubatus), as como el kudu.
La rigurosa aplicacin de la prueba de la tuberculina y la seleccin del ganado reaccionante ha eliminado de
muchos pases la infeccin por M. bovis de la poblacin bovina estabulada, pero esta estrategia no ha tenido un
xito general. Amplias investigaciones sobre la recurrencia espordica de M. bovis han mostrado que existen
reservorios en los animales salvajes de algunos pases. La deteccin de la infeccin en una poblacin salvaje
requiere investigacin bacteriolgica o el uso de una prueba vlida para la especie en cuestin (la prueba de la
tuberculina no es eficaz en todas las especies) junto con un anlisis epidemiolgico de la informacin. El tejn
(Meles) en el Reino Unido (31) y en la Repblica de Irlanda (27), el opossum de cola de brocha (Trichosurus
vulpecula) en Nueva Zelanda (2) y varias especies salvajes en frica, son capaces de mantener la infeccin de
M. bovis . El control de la transmisin de la poblacin salvaje a las especies de las granjas es complejo y, hasta
la fecha, se ha basado en la erradicacin de las especies salvajes. Se espera ms investigacin sobre el uso de
la vacunacin, para controlar la enfermedad en algunas especies.
Se ha aislado Mycobacterium bovis de crvidos en granjas y en vida libre. La enfermedad puede ser subaguda o
crnica, con una velocidad de progresin variable. Unos cuantos animales pueden afectarse gravemente en
pocos meses, mientras que otros pueden tardar aos en mostrar sntomas clnicos relacionados con las lesiones.
Las lesiones que se producen pueden parecerse a las del ganado vacuno (granuloma proliferativo, caseificacin,
granulacin y calcificacin con la edad) y pueden tomar la forma de abcesos de paredes finas con escasa
calcificacin y que contienen material purulento. En los crvidos, cuando se observan lesiones con abscesos de
etiologa desconocida se debe considerar la posibilidad de tuberculosis. Los ganglios linfticos afectados son, por
lo general, los de la cabeza y el pecho. Pueden estar afectados los ganglios linfticos mesentricos y
encontrarse grandes abscesos en este lugar. La distribucin de las lesiones depende de la dosis infectiva, de la
ruta de infeccin y del perodo de incubacin antes del examen.
La prueba de la tuberculina se puede utilizar en granjas con ciervos. La prueba debe realizarse con mucho
cuidado, con corte de pelo en el sitio de la prueba, inyeccin intradrmica precisa, y medida exacta de la anchura
de la piel pre- y post-inoculacin, utilizando calibradores para obtener resultados que sean vlidos (5).
Mycobacterium bovis puede originar graves prdidas econmicas por sus efectos sobre el ganado domstico y
las infecciones zoonticas. Adems, la presencia de la infeccin en las poblaciones salvajes supone un reto para
la supervivencia de especies salvajes en peligro.
1.
En el ganado vacuno no hay evidencia clnica de la tuberculosis hasta que se han desarrollado lesiones muy
extensas. Por esta razn, no fueron posibles ni su diagnstico en animales individuales ni un programa de
erradicacin antes del desarrollo de la tuberculina por Koch en 1890. La tuberculina, que representa un medio de
detectar la enfermedad, es un concentrado estril de filtrados de cultivo del bacilo tuberculoso cultivados en
caldo de carne con glicerina y, ms recientemente, en medios sintticos.
491
Se estn estudiando las respuestas inmunolgicas a las infecciones del ganado por M. bovis para desarrollar
mtodos de diagnstico mejorados o alternativos, ya que, a veces, las pruebas cutneas presentan
inconvenientes prcticos. Sin embargo, no existe una prueba sangunea para la tuberculosis en el ganado u otros
animales que sea de aceptacin universal.
La presencia de M. bovis en las muestras clnicas y en las obtenidas post-mortem puede demostrarse mediante
el examen de frotis teidos, y tal presencia puede confirmarse cultivando el microorganismo en un medio para el
aislamiento primario. Los recipientes de las muestras deben estar limpios y con preferencia estriles (el uso de
recipientes contaminados con micobacterias ambientales puede ocasionar errores en la identificacin de la
infeccin por M. bovis debido al rpido crecimiento de las micobacterias ambientales); cuando es posible, pueden
usarse recipientes de plstico de un solo uso de 50 ml de capacidad para una gran variedad de tipos de
muestras. Las muestras para enviar al laboratorio deben protegerse y cerrarse para evitar prdidas, y embalarse
adecuadamente para resistir roturas o aplastamientos durante el trnsito. Para el envo de muestras
sospechosas de una enfermedad zoontica deben seguirse las Regulaciones para Productos Peligrosos (DGR)
de la Asociacin Internacional de Transporte Areo (IATA). Los requisitos se resumen en el Captulo I.1.1.
Mtodos de muestreo. La entrega rpida de las muestras al laboratorio aumenta las posibilidades de recuperar
M. bovis en cultivo, pero si se prevn retrasos las muestran se deben refrigerar o congelar para retrasar en
crecimiento de contaminantes y conservar las micobacterias. En condiciones de ambientes clidos, cuando no es
posible la refrigeracin, se puede aadir como agente bacteriosttico cido brico (concentracin final de 0,5%
[p/v]), pero solo por perodos limitados, inferiores a 1 semana.
Deben tomarse precauciones para evitar la infeccin de personal del laboratorio (ver Captulo I.1.6. Seguridad
humana en los laboratorios veterinarios de microbiologa). Todos los procedimientos que supongan cultivos
deben realizarse en una cabina de seguridad biolgica.
a)
Examen microscpico
Mycobacterium bovis se puede demostrar microscpicamente en frotis directos de muestras clnicas y en
materiales tisulares preparados. La resistencia al cido de M. bovis se suele demostrar con la tincin clsica
de Ziehl-Neelsen, aunque tambin puede utilizarse una tincin fluorescente de resistencia al cido.
Tambin pueden dar resultados satisfactorios las tcnicas con inmunoperoxidasa. El diagnstico preliminar
de micobacteriosis se puede hacer si el tejido muestra lesiones histolgicas caractersticas (necrosis
caseosa, mineralizacin, clulas epitelioides, clulas gigantes multinucleadas y macrfagos). La presencia
en secciones histolgicas de microorganismos cido-resistentes puede no detectarse aunque M. bovis se
pueda aislar del cultivo.
b)
Cultivo de Mycobacterium bovis

Al procesar las muestras para cultivo, primero se homogeniza el tejido utilizando un mortero,
homogenizador o batidora y despus se descontamina con un cido o un lcali, como 5% de cido oxlico
o 2-4% de hidrxido sdico. La muestra se agita 10 minutos a temperatura ambiente y, a continuacin, se
neutraliza. Se centrifuga la suspensin, se elimina el sobrenadante, y se utiliza el sedimento para cultivo y
para examen microscpico.
Para el aislamiento primario, el sedimento se inocula por lo general en varios medios slidos con huevo
como el de Lowestein-Jensen, el medio base de Coletsos o el medio de Stonebrinks; estos medios deben
contener piruvato o glicerol, o ambos. Tambin se debera utilizar un medio con agar como el de
Middlebrook 7H10 7H11.
Los cultivos se incuban durante 8 semanas a 37C con y sin CO2. Se deben utilizar los medios en tubos con
cierre hermtico, para evitar la desecacin. Los cultivos se examinan a intervalos durante el perodo de
incubacin para observar el posible crecimiento macroscpico. Cuando el crecimiento es visible, se
preparan frotis y se tien por la tcnica de Ziehl-Neelsen. Generalmente, el crecimiento de M. bovis se
aprecia a las 3-6 semanas de incubacin. Mycobacterium bovis crece en medio de Lowenstein-Jensen sin
piruvato, y crece peor cuando se aade glicerol. Los modelos caractersticos de crecimiento y de morfologa
de las colonias pueden suministrar un diagnstico preliminar de M. bovis , que puede confirmarse por la
reaccin en cadena de la polimerasa (PCR) y por tcnicas de tipado molecular como el tipado por el estudio
de polimorfismos de la regin de repeticiones directas.
Los modelos caractersticos de crecimiento y de morfologa de las colonias pueden suministrar un
diagnstico preliminar de M. bovis; sin embargo, cada aislamiento necesita confirmarse por evaluacin
bioqumica (niacina y nitrato) o con la sonda de ADN Gen Probe TB complex para confirmar que el aislado
pertenece al complejo tuberculosis.
Si se produce una contaminacin fuerte del medio de cultivo, o la muestra presenta un resultado de cultivo
negativo y un resultado macroscpico e histopatolgico positivo, el proceso para el cultivo debe repetirse
492
utilizando el inculo con descontaminacin adicional. A menudo, el factor limitante para el aislamiento es la
baja calidad de las muestras y deben hacerse esfuerzos para asegurar que el laboratorio reciba muestras
de buena calidad.
El crecimiento que se considera debido a micobacterias se subcultiva en un medio con huevo o con agar o
en caldo con Tween y albmina, y se incuba hasta la aparicin de un crecimiento visible. En algunos
laboratorios se utiliza bilis de buey antes de la inoculacin para facilitar la dispersin de la masa microbiana
en pequeas unidades viables.
La identificacin de los aislamientos se realiza normalmente determinando propiedades bioqumicas y de
cultivo. En un medio slido adecuado con piruvato, las colonias de M. bovis son lisas y de color pardusco.
El microorganismo crece lentamente a 37C, pero no crece a 22C ni a 45C. Mycobacterium bovis es
sensible a la hidrazida del tiofen-2-cido carboxlico (TCH) y a la hidrazida del cido isonicotnico (INH).
Esto se puede probar mediante crecimiento en medio slido Middlebrook 7H10/7H11 con agar o en medios
que contengan huevo. El medio con huevo debe prepararse sin piruvato porque inhibe al INH y podra tener
un efecto similar sobre el TCH (que es un anlogo del INH) y dar por tanto resultados positivos falsos
(resistentes). Las cepas de Mycobacterium bovis son tambin sensibles al cido para-amino saliclico y a la
estreptomicina. Las concentraciones efectivas de estos compuestos son diferentes en medios con huevo y
en medios con agar. La produccin de niacina y la reduccin de nitrato dan resultados negativos en
M. bovis .
En la prueba de la amidasa, M. bovis es positivo para ureasa y negativo para nicotaminidasa y
pirazinaminidasa. Es una bacteria microerfila y no cromognica. Se pueden emplear pruebas adicionales
para la identificacin. Varias tcnicas de anlisis de ADN representan un mtodo rpido para determinar la
identidad de los aislados y tambin pueden dar informacin molecular de valor epidemiolgico.
Es necesario distinguir M. bovis de otros miembros del "complejo tuberculosis", es decir, M. tuberculosis (la
principal causa de tuberculosis en humanos), M. africanum (que ocupa una posicin fenotpica intermedia
entre M. tuberculosis y M. bovis ), y M. microti (el "bacilo de ratn", un micro-organismo difcil de encontrar).
Las pruebas mencionadas arriba sirven para separar M. bovis de las otras especies.
A veces se puede aislar M. avium de lesiones del ganado bovino similares a las de la tuberculosis. En tales
casos se necesita una cuidadosa identificacin y se debera excluir la posibilidad de una infeccin mixta con
M. bovis . Mycobacterium tuberculosis puede sensibilizar al ganado para la tuberculina bovina sin causar
lesiones tuberculosas.
En algunos hospitales y laboratorios veterinarios se utilizan rutinariamente sistemas de cultivos lquidos
como Bactec. El crecimiento se determina por mtodos radiomtricos o fluoromtricos. Los fabricantes (BDsistemas diagnsticos) no recomiendan el sistema radiomtrico.
c)
Mtodos de reconocimiento de cido nucleico

La PCR se ha evaluado ampliamente para la deteccin del complejo de M. tuberculosis en muestras
clnicas de pacientes humanos (fundamentalmente esputos) y recientemente se ha utilizado para el
diagnstico de la tuberculosis en animales. Para la deteccin del complejo de M. tuberculosis en tejidos
frescos y fijados se han evaluado varios preparados disponibles comercialmente y diversos procedimientos
"caseros". Se han utilizado varios cebadores, incluyendo los que amplifican secuencias del ARNr 16S-23S,
de las secuencias de insercin IS6110 e IS1081, y de los genes que codifican las protenas especficas del
complejo de M. tuberculosis, como la MPB 70 y el antgeno b de 38 kDa. Se han analizado los productos
amplificados por hibridacin con sondas o por electroforesis en gel. Las preparaciones comerciales y los
procedimientos caseros han mostrado resultados variables y poco satisfactorios en comparaciones entre
laboratorios con tejidos frescos, congelados o conservados en cido brico (25). La fiabilidad de esta
prueba se ha reducido por los resultados falsos positivos y negativos, sobre todo en muestras con un
nmero bajo de bacilos. Se ha atribuido la variabilidad de los resultados a un bajo nmero de copias de la
secuencia amplificada junto al bajo nmero de bacilos. Tambin se cree que es debida a los mtodos de
descontaminacin, a los procedimientos de extraccin del ADN, a las tcnicas para eliminar los inhibidores
de la polimerasa, a controles internos y externos, y a los procedimientos seguidos para evitar
contaminaciones cruzadas. La mejora en la fiabilidad de la PCR como prueba prctica de deteccin del
complejo de M. tuberculosis necesita el desarrollo de procedimientos slidos y estandarizados. La PCR no
se utiliza slo para la deteccin directa en la muestra o para la caracterizacin de la muestra o la
diferenciacin dentro del complejo TB, sino tambin como mtodo de identificacin inicial (la seleccin del
microorganismo se lleva a cabo por morfologa de la colonia y tincin AF). Existen preparaciones
comerciales disponibles que son muy consistentes por ejemplo las del tipo Gen probe. Aunque el nmero
de especies que se pueden identificar con estas preparaciones es limitado, sus cebadores para el complejo
de M. tuberculosis se utilizan mucho tanto en el campo mdico como en el veterinario. Los laboratorios
tambin han desarrollado sus propios mtodos "caseros". El mayor problema de este tipo de aplicaciones
493
es la contaminacin cruzada, por lo que se deben utilizar controles adecuados en cada amplificacin. Este
tipo de aplicacin ha sido ignorada. Normalmente se llevan a cabo algunas pruebas bioqumicas para
confirmar el hallazgo. No obstante, la PCR se utiliza hoy en da de modo rutinario para detectar el grupo
M. tuberculosis y distinguirlo de M. avium en tejidos fijados con formalina e incluidos en parafina (23, 24).
Los mejores resultados se obtienen cuando se emplean tanto la PCR como los mtodos de aislamiento.
Para diferenciar M. bovis de otros miembros del complejo de M. tuberculosis, las tcnicas de anlisis de
ADN pueden ser ms rpidas y fiables que los mtodos bioqumicos. Se ha encontrado una mutacin
especfica de M. bovis en el nucletido en posicin 285 del gen OxyR en todos los aislamientos del
complejo de M. tuberculosis analizados hasta la fecha (10). Tiene importancia prctica el que la sonda
especfica para hibridar con el gen, que se necesita para visualizar el segmento amplificado, se pueda
marcar con biotina o digoxigenina en vez de con istopos.
La determinacin de las huellas genticas permite a los laboratorios distinguir entre cepas diferentes de
M. bovis y harn posible establecer el origen, la transmisin y la distribucin del M. bovis descrito. El
mtodo ms utilizado es el del estudio de polimorfismos de la regin de repeticiones directas
(espoligotipado, del ingls "spacer oligotyping"), que diferencia cepas dentro de cada especie perteneciente
al complejo de M. tuberculosis, que incluye M. bovis , y que puede distinguir tambin M. bovis de M.
tuberculosis (19). Se estan desarrollando otras tcnicas nuevas para diferenciar ms exactamente las
cepas que tienen el mismo espoligotipado. stas incluyen el anlisis del polimorfismo de los fragmentos de
restriccin (RFLP) usando IS6110, la regin de repeticin directa (DR) y la sonda PGRS (secuencia de
repeticin poliG) (30), la RFLP utilizando una combinacin de la DR y sondas de color (26), y la
caracterizacin del perfil VNTR (repeticiones en tndem en nmero variable) (8, 9, 13, 20). En la actualidad
se est secuenciando el genoma de M. bovis , y esta informacin permitir la mejora de los mtodos
basados en las huellas genticas.
2.
Prueba de hipersensibilidad retardada
Prueba de la tuberculina (prueba prescrita para el comercio internacional)

Antes se utilizaba tuberculina de medio sinttico concentrada por calor (HCSM), pero en la mayora de los
pases la tuberculina HCSM se ha reemplazado por tuberculina derivada de protenas purificadas (PPD). La
tuberculina HCSM puede tener una buena potencia si se estandariza de modo correcto en cuanto a
actividad biolgica, pero su especificidad es inferior a las tuberculinas PPD. Adems, se ha visto que las
PPDs bovinas preparadas de la cepa AN5 de produccin de M. bovis son ms especficas para detectar la
tuberculosis bovina que las PPDs humanas preparadas con M. tuberculosis.
El mtodo estndar para la deteccin de la tuberculosis bovina es la prueba de la tuberculina, que
comprende la inyeccin intradrmica de tuberculina PPD bovina y la consiguiente deteccin de hinchazn
(hipersensibilidad retardada) en el sitio de la inoculacin 3 das despus. Esto se puede llevar a cabo
utilizando slo tuberculina bovina o, en una prueba comparativa, con tuberculina aviar y bovina.
Normalmente, la prueba de la tuberculina se realiza en el medio del cuello, pero tambin se puede realizar
en el pliegue caudal de la cola. La piel del cuello es ms sensible a la tuberculina que la de la cola. Para
compensar esta diferencia, se pueden utilizar mayores dosis de tuberculina en la cola.
No se recomienda utilizar esta prueba cuando la epidemiologa sugiere que la poblacin o el animal han
estado en contacto con animales infectados, pues puede originar respuestas negativas falsas y un
descenso en la sensibilidad de la prueba. Si slo se utiliza una prueba de tuberculina, la erradicacin
completa resulta difcil ya que puede haber respuestas falsas negativas en la fase inicial de la enfermedad y
en animales con infeccin grave.
La prueba intradrmica comparativa de la tuberculina se utiliza para diferenciar entre animales infectados
con M. bovis y aquellos sensibilizados a la tuberculina bovina por exposicin a otras micobacterias. Esta
sensibilizacin se debe a la gran reactividad cruzada existente entre especies de micobacterias y gneros
relacionados. La prueba consta de la inyeccin intradrmica de tuberculina bovina y de tuberculina aviar en
sitios diferentes, por lo general, en el mismo lado del cuello, y la medida de la respuesta 3 das despus.
La potencia de las tuberculinas debe estimarse por mtodos biolgicos mediante comparacin con
tuberculinas estndar y debe expresarse en unidades internacionales (UI). En varios pases se considera
que la tuberculina tiene una potencia adecuada si garantiza al menos 2000 UI (+ 25%) por dosis en el
ganado bovino. En los animales con una sensibilidad alrgica reducida se necesita una dosis mayor de
tuberculina, y en campaas nacionales de erradicacin se recomiendan dosis de hasta 5.000 UI. El
volumen de cada inyeccin no debe superar los 0,2 ml.
494
3.
i)
Es importante una tcnica de inyeccin correcta. Deben afeitarse y limpiarse los sitios de inyeccin.
Dentro de cada rea afeitada se mide un pliegue de la piel con calibradores y se marca el sitio antes
de la inyeccin. Se inserta oblicuamente en las capas ms profundas de la piel una aguja corta con el
bisel hacia fuera y una jeringuilla graduada cargada con tuberculina. Se inyecta la dosis de
tuberculina, que no debe contener menos de 2.000 UI de tuberculina bovina o aviar. Una inyeccin
correcta se confirma palpando una pequea hinchazn como un guisante en el lugar de la inyeccin.
La distancia entre dos inyecciones debe ser aproximadamente de 12-15 cm. En animales jvenes
donde no hay espacio para separar suficientemente los sitios en un lado del cuello, se debe hacer una
inyeccin a cada lado en zonas idnticas del centro del tercio medio del cuello. Setenta y dos horas
despus se mide el grosor de la piel doblada en cada sitio de inyeccin. La medida de la piel, antes de
la inyeccin y cuando se lee la prueba, debera efectuarse por la misma persona.
ii)
La interpretacin se basa en la observacin y en los incrementos en el grosor de la piel anotados. En

la prueba intradrmica simple (que implica una sola inyeccin de tuberculina bovina), se considera que
la prueba es negativa si slo se observa una inflamacin limitada, con un incremento menor de 2 mm
y sin sntomas clnicos, del tipo de edema difuso o extendido, exudado, necrosis, dolor o inflamacin
de los vasos linfticos de esa regin o de los ganglios linfticos. La reaccin no es concluyente si no
se observa ninguno de estos sntomas y, si el incremento en el pliegue de la piel oscila entre 2 y
4 mm. La reaccin es positiva si se observan los sntomas clnicos descritos arriba o si hay un
aumento de 4 mm o ms en el grosor de la piel. Sin embargo, en poblaciones infectadas por M. bovis ,
cualquier inflamacin palpable o visible debe considerarse positiva. A veces se emplea una
interpretacin ms rigurosa, en particular en poblaciones de alto riesgo o en animales en contacto. Los
animales con resultados no concluyentes por una prueba intradrmica sencilla deben someterse a otra
prueba tras un intervalo de 42 das. Los animales que no son negativos en esta segunda prueba
deben ser considerados positivos. Los animales positivos en la prueba intradrmica sencilla pueden
someterse a una prueba intradrmica comparativa. La repeticin de las pruebas se puede realizar
conforme a los programas nacionales o locales de control.
iii)
En la interpretacin de la prueba intradrmica comparativa, se considera positiva la reaccin, si el

aumento del grosor de la piel en el sitio de la inyeccin bovina supera en 4 mm o ms la reaccin en el
sitio de la inyeccin aviar. La reaccin no es concluyente, si el incremento comparativo est entre 1 y
4 mm, y se considera negativa, si el incremento del grosor de la piel en el sitio de la inyeccin bovina
es menor o igual que el observado en el sitio de la inyeccin aviar. Este esquema de interpretacin se
utiliza en los pases de la Unin Europea (EU) y se recomienda en la Directiva del Consejo
64/432/ECC (11). A veces se utiliza una interpretacin ms rigurosa.
iv)
En la prueba de la cola, se inserta oblicuamente en las capas ms profundas de la piel una aguja corta
con el bisel hacia fuera, en la cara lateral del pliegue de la cola, a medio camino entre la lnea del pelo
y la cara ventral del pliegue. La interpretacin estndar es que cualquier cambio palpable o visible se
considera una reaccin. Tambin se emplea una interpretacin modificada: una prueba positiva es
cualquier inflamacin palpable o visible en el sitio de la inyeccin que tenga un aumento diferencial de
grosor de 4 mm en comparacin con el pliegue caudal opuesto. Si un animal tiene slo un pliegue
caudal, se considera que la prueba es positiva si el grosor del pliegue caudal es de 8 mm o ms.
Pruebas de laboratorio basadas en sangre
Adems de la prueba clsica de la tuberculina intradrmica, se dispone de varias pruebas diagnsticas

sanguneas nuevas (16). Debido al coste y la naturaleza ms compleja de las pruebas de laboratorio, se suelen
usar como pruebas de apoyo para confirmar o negar los resultados de la prueba intradrmica. Las pruebas de
proliferacin de linfocitos y del interfern gamma corresponden a la inmunidad celular, mientras que el
enzimoinmunoensayo (ELISA) corresponde a la inmunidad humoral.
a)
Prueba de proliferacin de linfocitos

Este tipo de ensayo compara la reactividad in vitro de los linfocitos de la sangre perifrica a la tuberculina
PPD (PPD-B) y a una tuberculina PPD de Mycobacterium avium (PPD-A). La prueba se puede realizar con
sangre entera (4) o con linfocitos purificados de muestras de sangre perifrica (14). Estas pruebas tratan de
aumentar la especificidad de los ensayos eliminando la respuesta de los linfocitos a antgenos
"inespecficos" o con reaccin cruzada asociados a especies de micobacterias no patgenas a las que el
animal puede haber estado expuesto. En general, los resultados se analizan como el valor obtenido en
respuesta a PPD-B menos el valor obtenido en respuesta a PPD-A. El valor B menos A debe estar por
encima de un valor de corte que se puede alterar para aumentar la especificidad o sensibilidad del
diagnstico. El ensayo tiene valor cientfico, pero no se emplea para diagnstico rutinario porque la prueba
es lenta, y la logstica y su ejecucin en el laboratorio son complicadas (requiere tiempos de incubacin
largos y el uso de nucletidos radioactivos). Sin embargo, la prueba puede ser til para animales salvajes y
animales de zoo. Se ha descrito en ciervos una prueba de sangre con ensayos de transformacin de
linfocitos y ELISA que tiene una elevada sensibilidad y especificidad para el diagnstico de infecciones por
495
M. bovis (14). La prueba es relativamente cara y todava no se ha sometido a comparaciones entre distintos
laboratorios.
b)
Prueba de interfern gamma

En esta prueba se mide la liberacin de una linfoquina (interfern gamma) en un sistema de cultivo de
sangre completa. El ensayo se basa en la liberacin de interfern gamma por linfocitos sensibilizados
durante un perodo de incubacin de 16-24 horas con antgeno especfico (tuberculina PPD). Esta prueba
compara la produccin de interfern gamma tras la estimulacin con PPD bovina y aviar. La cuantificacin
del interfern gamma se realiza por un ELISA "en sandwhich" que utiliza dos anticuerpos monoclonales
contra el interfern gamma bovino. La muestra se debe transportar al laboratorio y se debe realizar el
ensayo entre 24-30 horas desde la recogida. Comparada con la prueba cutnea, la prueba posee una
sensibilidad elevada pero parece menos especfica en varios casos. No obstante, el uso de antgenos
definidos de micobacterias promete mejorar la especificidad (4). Para animales de manejo difcil o peligroso,
como el ganado excitado u otros bvidos, presenta la ventaja sobre la prueba cutnea de que slo
necesitan ser capturados una vez.
c)
Enzimoinmunoensayo
Ha habido numerosos intentos fallidos para desarrollar pruebas serodiagnsticas de utilidad clnica para la
tuberculosis. Las pruebas ELISA parecen la mejor eleccin y pueden ser un complemento, ms que una
alternativa, a las pruebas basadas en la inmunidad celular. Pueden ser tiles en ganado anrgico y en
ciervos. Una ventaja es su simplicidad, pero su especificidad y sensibilidad son limitadas en el ganado,
debido principalmente al desarrollo tardo e irregular de la respuesta inmune humoral durante la
enfermedad. Sin embargo, la respuesta de anticuerpos en el ciervo parece desarrollarse antes y de modo
ms previsible, y se ha descrito que la sensibilidad de un ELISA comparativo puede ser de hasta el 85%
(15). Es posible su mejora utilizando diferentes antgenos, como protenas (por ejemplo, MPB 70, que es
muy especfica pero carece de sensibilidad). Adems, se ha descrito en animales infectados por M. bovis
un incremento anamnsico, lo que origina mejores resultados en ELISA 2-8 semanas despus de una
prueba normal de tuberculina cutnea. Tambin se ha demostrado que una comparacin entre los niveles
de anticuerpos contra PPD-B y PPD-A es til para aumentar la especificidad en ELISA (15). El ELISA
tambin puede resultar de utilidad para detectar infecciones por M. bovis en animales salvajes. En Nueva
Zelanda se ha aprobado como una prueba de apoyo paralelo en granjas de ciervos y se realiza 13-33 das
despus de la prueba cutnea en la mitad del cuello.

La nica vacuna disponible en la actualidad contra las infecciones por M. bovis es el bacilo de Calmette-Guerin
(BCG), que es una cepa viva atenuada de M. bovis . sta ha mostrado una eficacia variable con el ganado
bovino, que se puede deber a varios factores, como la formulacin de la vacuna, la ruta de vacunacin y el grado
de exposicin a micobacterias ambientales (29). Se han realizado experimentos con otras vacunas, pero no se
ha demostrado que alguna de ellas induzca una proteccin superior a la BCG. La eficacia de la BCG parece
variar de modo similar a lo descrito en humanos. Varias vacunas nuevas se estn probando actualmente. El ADN
del microorganismo de la tuberculosis se est estudiando en detalle y se ha publicado recientemente la
secuencia genmica completa. Esto puede ayudar en particular a identificar genes asociados con la virulencia y
a obtener avances con una vacuna con ADN. En los pases infectados donde no hay prueba ni esquemas de
control por sacrificios, puede utilizarse la vacunacin con BCG para reducir la extensin de la infeccin en el
ganado. Antes de iniciar un programa de vacunacin, el calendario de vacunacin debe ajustarse a las
condiciones locales. La dosis tpica est entre 104 y 106 unidades formadoras de colonias suministradas
subcutneamente. La vacuna debe basarse en la cepa estndar de referencia, la BCG Pasteur (33). Es
importante advertir que el uso de la vacuna limita las pruebas cutneas de tuberculina y otras pruebas
inmunolgicas. Por tanto, la vacunacin del ganado no debe efectuarse en pases donde las medidas de control
o de mercado se basen en tales pruebas. Las vacunas con BCG pueden emplearse tambin para reducir la
distribucin de M. bovis en los reservorios de animales salvajes. Antes de eso es esencial validar el sistema de
liberacin a esas especies particulares.
produccin de vacunas veterinarias. Las normas dadas aqu y en el Captulo I.1.7 son de carcter general y se
pueden suplementar con requisitos nacionales y regionales.
Las tuberculinas eran preparaciones realizadas de los productos tratados por calor del crecimiento y lisis de
M. tuberculosis o de M. bovis (conocidas respectivamente como tuberculinas humanas y bovinas). Al principio, el
medio de cultivo utilizado para su produccin fue caldo de glicerol. En la dcada de 1940, las "tuberculinas de
medio sinttico concentradas por calor " o tuberculinas HCSM, preparadas de cultivos en medios lquidos
496
sintticos, reemplazaron a las "antiguas" tuberculinas. En la actualidad, tanto las antiguas tuberculinas como las
tuberculinas HCSM se han reemplazado, casi por entero, con los derivados de protenas purificadas o PPD.
Produccin de tuberculina
1.
Control del inculo
a)

Las cepas de M. bovis utilizadas para preparar inculos de siembra se deben identificar como especie por
pruebas apropiadas. Se debe mantener un registro de sus orgenes e historia posterior. Los inculos de los
cultivos no deben tener ms de cinco pases. Las cepas de produccin de M. bovis AN5 o Vallee son las
utilizadas ms frecuentemente.
b)
Mtodo de cultivo
Si el inculo del cultivo se cultiv en medio slido, es necesario adaptar el microorganismo a crecer en
cultivo de flotacin (por ejemplo, incorporando un trozo de patata estril en los cultivos con medio lquido,
como el medio de Watson Reid). Cuando el cultivo se ha adaptado al medio lquido, se puede utilizar para
producir el lote de inculo primario, que se conserva en forma liofilizada. ste se utiliza para inocular
medios para la produccin de lotes de inculos secundarios, que no deben de tener ms de cuatro pases
en cultivo del inculo primario. El inculo secundario se utiliza para inocular los cultivos de produccin (1,
17).
El substrato del cultivo de produccin debe ser capaz de originar un producto adaptado a los estndares
internacionales reconocidos (Organizacin Mundial de la Salud [OMS], Farmacopea Europea, u otra
autoridad reconocida de control). Debe estar libre de ingredientes txicos o que causen reacciones
alrgicas.
c)
Validacin
Las cepas de M. bovis utilizadas como inculos de siembra deben estar libres de
microorganismos contaminantes.
Los lotes de inculo deben ser eficaces en cuanto a produccin de tuberculina con potencia suficiente. Las
pruebas necesarias se describen ms adelante en la Seccin C.4.
2.
Mtodo de produccin
El microorganismo se cultiva en un medio sinttico, la protena del filtrado se precipita qumicamente (empleando
sulfato amnico o cido tricloroactico [TCA]), se lava y se resuspende. Se recomienda tuberculina PPD, porque
se puede estandarizar de modo ms preciso.
Se puede aadir como conservante un antimicrobiano que no origine reacciones falsas positivas, como el fenol
(no ms de 0,5% [p/v]). Como estabilizador se puede aadir glicerol (no ms del 10% [p/v]) o glucosa (2,2%
[p/v]). No se deben emplear derivados mercuriales. El producto se distribuye aspticamente en recipientes
estriles de vidrio neutro, que se cierran para evitar contaminacin. El producto se puede liofilizar.
3.
Control interno
Los matraces de produccin, inoculados con cultivos de siembra adecuados, se incuban por un perodo
apropiado. Cualquier matraz con contaminacin o con crecimiento anormal debe eliminarse despus de
autoclavarlo.
Cuando progresa la incubacin, el crecimiento en superficie de muchos cultivos se humedece y se puede
introducir en el medio o depositarse en el fondo del matraz.
En las tuberculinas PPD, el pH del precipitado disuelto (la llamada tuberculina concentrada) debe ser 6,6-6,7.
El nivel de protena del concentrado de PPD se determina por el mtodo Kjeldahl o cualquier otro mtodo
adecuado. Se suele comparar el nitrgeno total y el nitrgeno precipitable por TCA.
El producto final debe someterse a bioensayos en cobayas. Se deben realizar pruebas de potencia y
especificidad en comparacin con una tuberculina de referencia (PPD). Segn el contenido en protena y la
concentracin final requerida, se hacen diluciones con un tampn, normalmente a 1,0 mg/ml (1, 17).
497
4.
Control de lotes
Las muestras deben cumplir los estndares reconocidos oficialmente para la produccin de tuberculina tal como
se indican en la Farmacopea Europea o en las normas reguladoras equivalentes.
a)
Esterilidad
Generalmente, las pruebas de esterilidad se realizan conforme a directrices internacionales (ver tambin
Captulo I.1.5).
b)
Inocuidad
Dos cobayas, con peso individual superior a 250 g, que no hayan sido tratados previamente con material
que interfiera con la prueba, se inyectan subcutneamente con 0,5 ml de la tuberculina de prueba. No
deben presentarse efectos anormales en 7 das.
Las pruebas sobre tuberculina para micobacterias vivas se pueden realizar sobre la tuberculina
inmediatamente antes de distribuirla en los recipientes finales o en muestras tomadas de los mismos
recipientes finales. Se debe tomar una muestra de por lo menos 10 ml e inyectarla intraperitonealmente en
al menos dos cobayas, dividiendo la dosis entre ellos. Se aconseja tomar una muestra mayor, como por
ejemplo 50 ml, y concentrar cualquier micobacteria residual por centrifugacin o filtracin en membrana. Se
observan los cobayas durante al menos 42 das y despus se examinan macroscpicamente post-mortem.
Se examina cualquier lesin microscpicamente y mediante cultivo.
c)
Efecto sensibilizador
Para probar el efecto sensibilizador, se toman tres cobayas que no se hayan tratado previamente con
material que interfiera con la prueba y se inyectan intradrmicamente en tres ocasiones, cada vez con 0,1ml
que contiene el equivalente de 500 UI de la preparacin ensayada. A los 15-21 das despus de la tercera
inyeccin cada cobaya, junto con cada uno de tres cobayas control que no se han inyectado antes, se
inyecta con la misma dosis de la misma tuberculina. Las reacciones en los dos grupos de cobayas no
deben diferir significativamente cuando se observan 24-28 horas ms tarde.
d)
Potencia
La potencia se determina por comparacin con una preparacin de referencia de tuberculina bovina en
cobayas sensibilizados con M. bovis .
En la dcada de los 1970s, los pases de la entonces denominada Comunidad Econmica Europea (EEC,
ahora la EU) establecieron un estndar para las tuberculinas HCSM bovinas. Este estndar de la EEC para
la HCSM tiene una potencia de 65.000 unidades provisionales de tuberculina de la Comunidad por ml.
En los aos 1960s, la EEC reconoci un estndar de la ECC para PPD bovina, a la que se adjudic una
potencia de 50.000 unidades provisionales de tuberculina de la Comunidad por mg de PPD y que fue
distribuida en estado liofilizado. Por desgracia, el nmero de ampollas de lifilos no fue suficiente para las
necesidades de la OMS y se decidi por tanto producir una nueva preparacin de PPD bovina que pudiera
designarse por la OMS como el nuevo estndar internacional para las tuberculinas PPD bovinas.
Este nuevo estndar de PPD bovina tuvo que calibrarse frente al estndar existente en la ECC. Mediante
ensayos de colaboracin internacional, con cobayas y ganado bovino, se comprob que el nuevo estndar
bovino tena una potencia relativa de 65% frente al estndar de la ECC. Por tanto, en 1986, la OMS dio
oficialmente al estndar internacional para las tuberculinas PPD bovinas un valor de 32.500 UI/mg. Esto
significa que las unidades provisionales de tuberculina de la Comunidad son equivalentes con las IUs. La
Farmacopea Europea tambin ha reconocido el estndar internacional de la OMS para PPD bovina.
Para mantener el stock del estndar internacional actual, es deseable que los pases productores de
tuberculina PPD bovina establezcan sus propias preparaciones nacionales de referencia para PPD bovina
como estndares de referencia. Estas preparaciones nacionales de referencia deben calibrarse frente al
estndar oficial internacional de PPD bovina, en cobayas y en ganado bovino (22, 28, 32).
Estandarizacin en cobayas
Una prueba de potencia adecuada es la siguiente: En cobayas con sensibilizacin homloga, se

bioensayan las tuberculinas PPD producidas frente al estndar de la tuberculina PPD bovina mediante una
prueba de seis puntos, con tres diluciones seriadas de 1/5 por cada tuberculina. Las diluciones de las
preparaciones de tuberculina se realizan en solucin tampn isotnica que contiene 0,0005% (p/v) de
498
polisorbato 80 (Tween 80). Se escogen volmenes con 0,001. 0,0002 y 0,00004 mg de tuberculoprotena,
que corresponden a 32, 6,4 y 1,28 UI, respectivamente, del estndar internacional de PPD, porque estas
cantidades dan buenas reacciones cutneas, fciles de determinar y con lmites aceptables. El volumen
inyectado es 0,2 ml. En una prueba, se comparan dos tuberculinas ensayadas con la tuberculina estndar
en nueve cobayas, aplicando ocho inyecciones intradrmicas por animal y empleando un diseo equilibrado
incompleto de cuadro latino (12).
Los cobayas se sensibilizan 5-7 semanas antes del ensayo con una dosis baja de bacilos vivos (0,001 o
0,0001 mg de peso hmedo) de una cepa virulenta de M. bovis (1 mg de peso hmedo). Los bacilos se
suspenden en solucin salina fisiolgica y se realiza una inyeccin intramuscular profunda de 1 ml en la
parte media del muslo. Al tiempo de la prueba, los cobayas infectados con la dosis baja de M. bovis deben
estar an en buenas condiciones de salud y los resultados de numerosos exmenes post-mortem, poco
despus de los ensayos de estandarizacin, deberan mostrar que los cobayas no sufren tuberculosis y por
lo tanto no excretan bacilos tuberculosos.
Se puede utilizar una prueba alternativa de potencia, menos fiable, que no usa micobacterias patgenas
vivas y que es ms adecuada para laboratorios que carecen de reas de aislamiento para el mantenimiento
seguro de los cobayas infectados. Esta prueba de potencia de la tuberculina se realiza as: la tuberculina
PPD se bioensaya, en cobayas con sensibilizacin homloga, frente al estndar de la tuberculina PPD
bovina mediante una prueba de ocho puntos que comprende cuatro diluciones de 20, 10, 5 y 2,5 UI. El
volumen inyectado es 0,1 ml. En esta prueba, se comparan dos tuberculinas ensayadas con la tuberculina
estndar en ocho cobayas, aplicando ocho inyecciones intradrmicas por animal y empleando un diseo de
cuadro latino. Los cobayas se sensibilizan con bacilos inactivados de M. bovis 5-7 semanas antes del
ensayo. Los bacilos se suspenden en tampn y se preparan como una emulsin con adyuvante incompleto
de Freund. Se realiza una inyeccin intramuscular profunda en la parte media del muslo, usando una dosis
de 0,5 ml.
Normalmente, la lectura de las pruebas se realiza 24 horas despus de la inyeccin de las tuberculinas,
pero se puede hacer una segunda lectura adicional a las 42 horas. Se miden los diferentes dimetros de los
eritremas en milmetros con calibradores, y se registran en hojas de datos. Los resultados se evalan
estadsticamente por mtodos estadsticos estndar para ensayos en paralelo segn Finney (12). Se
calculan las potencias relativas de las dos tuberculinas ensayadas con sus lmites de confianza del 95%, las
pendientes de las curvas de log de la dosis versus respuesta para cada preparacin (aumento medio de
reaccin por aumento de unidad log de la dosis) y los cocientes F para las desviaciones del paralelismo.
Se acuerdo con la Farmacopea Europea, la potencia estimada para las tuberculinas bovinas debe de estar
entre el 66% y el 150% de la potencia indicada en el prospecto.
Estandarizacin de la tuberculina bovina en el ganado
De acuerdo con el nmero 384 de la Serie de Informes Tcnicos de la OMS, se debe realizar la prueba de
potencia en la especie animal y en las condiciones en que las tuberculinas se usarn en la prctica (32).
Esto significa que las tuberculinas bovinas deben ensayarse en ganado tuberculoso infectado de forma
natural. Como esto es difcil de cumplir, las pruebas de potencia se realizan en cobayas. Sin embargo, son
necesarias pruebas peridicas en ganado tuberculoso y las preparaciones estndar siempre requieren su
calibracin en el ganado. La frecuencia de las pruebas en el ganado puede reducirse si se est seguro de
que las preparaciones estndar son representativas de las tuberculinas en uso y de que los procedimientos
de produccin garantizan esta lgica.
Una prueba adecuada de potencia para las tuberculinas bovinas en ganado se realiza del modo siguiente:
Las tuberculinas de ensayo se prueban frente a un estndar de tuberculina PPD bovina mediante una
prueba de cuatro puntos usando dos diluciones seriadas de 1/5 para cada tuberculina. Para el estndar se
inyectan 0,1 y 0,02 mg de tuberculoprotena que se corresponden con 3.250 y 650 UI del estndar
internacional de tuberculina PPD bovina. Las tuberculinas de ensayo se diluyen de modo que se apliquen
las mismas cantidades de protena. El volumen inyectado es 0,1 ml y la distancia entre los sitios de
inyeccin en el rea media cervical es de 15-20 cm. En una prueba, se comparan tres tuberculinas de
ensayo con la tuberculina estndar en ocho cabezas de ganado tuberculoso, aplicando por animal ocho
inyecciones intradrmicas a ambos lados del cuello y empleando un diseo equilibrado completo de cuadro
latino. Antes de la inyeccin y 72 horas despus, se mide el grosor de la piel en cada sitio inyectado con
calibradores en dcimas de milmetro tan exactamente como sea posible.
Los resultados se analizan estadsticamente utilizando los mismos mtodos estndar para ensayos en
paralelo que los empleados en pruebas de potencia con cobayas.
499
e)
Especificidad
Un ensayo adecuado de especificidad es el siguiente: en cobayas con sensibilizacin heterloga, se
prueban tres tuberculinas bovinas de ensayo con el estndar de la tuberculina PPD aviar (o tres
tuberculinas aviares de ensayo frente al estndar de la tuberculina PPD bovina) mediante una prueba de
cuatro puntos, con dos diluciones seriadas de 1/25 de cada tuberculina. Se escogen cantidades de 0,03 y
0,0012 mg de tuberculoprotena de ensayo, que corresponden a 1500 y 60 UI, porque estas dosis dan
buenas reacciones cutneas y de fcil lectura. Las dosis de inyeccin del estndar son ms bajas, 0,001 y
0,0004 mg. En una prueba, se comparan tres tuberculinas con la tuberculina estndar en ocho cobayas
mediante ocho inyecciones intradrmicas por animal, empleando un diseo equilibrado completo de cuadro
latino. La lectura de los resultados y el tratamiento estadstico es igual que en la prueba de potencia.
f)
Estabilidad
Siempre que las tuberculinas cumplan con las normas legislativas en cuanto a produccin y se guarden
protegidas de la luz a una temperatura entre 2C y 8C, pueden utilizarse hasta la fecha de caducidad que
se especifica en el permiso para la produccin de tuberculina. Para el almacenamiento a largo plazo, se
recomienda mantener la PPD en forma concentrada en vez de diluida, y el concentrado tambin debe
mantenerse en la obscuridad.
g)
Control de pH
El pH debe estar entre 6,5 y 7,5.
h)
Contenido en protena
El contenido proteico se determina como se indica en la Seccin C.3. Control interno.
i)
Almacenamiento
Durante el almacenamiento, la tuberculina bovina lquida debe protegerse de la luz y mantenerse a una
temperatura de 5+3C. Las preparaciones liofilizadas pueden mantenerse a temperaturas ms elevadas
(pero sin exceder los 25C) y protegidas de la luz. Deben reducirse al mnimo las exposiciones a
temperaturas superiores y a la luz solar directa.
j)
Conservantes
Se debe demostrar que los conservantes antimicrobianos u otras substancias que pueden aadirse a las
tuberculinas no afectan a la seguridad y eficacia del producto.
La mxima concentracin permitida para el fenol es 0,5% (p/v), y para el glicerol es 10% (v/v).
k)
La experiencia con humanos y con animales ha llevado a la observacin de que la tuberculina diluida de
modo apropiado, inyectada intradrmicamente, origina una reaccin localizada en el sitio de la inyeccin sin
manifestaciones generalizadas. Incluso en individuos muy sensibles, las reacciones generalizadas graves
son extremadamente raras. Pero la experiencia ha demostrado que un operador con hipersensibilidad
puede adquirir sntomas generalizados graves por contacto intradrmico accidental (herida por picadura de
aguja) con tuberculina bovina. Estos individuos no deberan realizar la prueba cutnea de la tuberculosis
con la dosis alta de 2000-5000 UI de tuberculina, que es unas 1000 veces la dosis humana normal de 5 UI.
5.
a)
Inocuidad
Se debe realizar una prueba para la ausencia de propiedades txicas o irritantes (ver Seccin C.4.b.)
b)
Potencia
La potencia de la tuberculina debe determinarse por mtodos biolgicos. Estos mtodos deben utilizarse
para las tuberculinas HCSM y PPD; se basan en la comparacin de las tuberculinas a ensayar con una
preparacin estndar de referencia de tuberculina del mismo tipo (ver tambin Seccin C.4.d.).
500
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Vaccines. WHO, Veterinary Public Health Unit, Geneva. WHO/CDS/VPH/94.138.
*
**
NB: Existen laboratorios de referencia de la OIE para la Tuberculosis bovina (ver Cuadro en la parte 3 de
www.oie.int)
502
CAPTULO 2.3.4.
LEUCOSIS BOVINA ENZOTICA
RESUMEN
La leucosis bovina enzotica (LBE) es una enfermedad del ganado bovino adulto causada por el
retrovirus de la leucemia bovina (BLV). El ganado puede infectarse a cualquier edad, incluida la
fase embrionaria. La mayora de las infecciones son subclnicas, pero un porcentaje del ganado
mayor de 3 aos ( 30%) desarrolla linfocitosis persistente y una pequea proporcin de
linfosarcomas (tumores) en varios rganos internos. Tambin se ha registrado infeccin natural en
bfalos, ovejas y capibaras. Los sntomas clnicos, cuando se presentan, dependen de los rganos
afectados. El ganado con linfosarcomas casi siempre muere sbitamente o en semanas o meses
despus de la aparicin de los sntomas clnicos.
Identificacin del agente: Los virus se pueden aislar por cultivo de linfocitos perifricos y la
demostracin del virus se puede lograr por microscopa electrnica o por pruebas de deteccin del
antgeno de BLV. Por la reaccin en cadena de la polimerasa se puede detectar el ADN del
provirus en la sangre perifrica o en los tumores.
Pruebas serolgicas: Los mtodos ms utilizados son la inmunodifusin en medio slido (IGDA)
de sueros o el enzimoinmunoensayo (ELISA) para sueros o muestras de leche. En muchos pases
estas pruebas constituyen la base de polticas acertadas de erradicacin. Tambin pueden
utilizarse otras pruebas como el radioinmunoensayo. Se han comercializado. varios kits de pruebas
IGDA y ELISA.
Requisitos para las vacunas y los materiales de diagnstico: No existen vacunas contra el
BLV.
A. INTRODUCCIN
Pueden existir varias causas de los linfosarcomas del ganado bovino, pero la nica causa conocida es el
retrovirus de la leucemia bovina (BLV), que origina la leucosis bovina enzotica (LBE). El trmino leucosis
bovina espordica (LBES) se reserva normalmente para los linfomas de tipo cutneo y tmico de los terneros,
que se definen por la edad del animal afectado y por la distribucin de los tumores. Se desconoce la causa o
causas de la LBES. Tambin hay condiciones linfosarcomatosas que no corresponden a las categoras de la
LBES o la LBE, como el caso del linfoma multicntrico de adultos, de aparicin espordica y de etiologa
desconocida. Solamente deben denominarse leucosis o Leucosis enzotica bovina a los linfomas causados por
infeccin con BLV.
Aunque los animales pueden infectarse con BLV a cualquier edad, los tumores (linfosarcomas) se observan
tpicamente en animales de ms de 3 aos. Normalmente las infecciones son subclnicas; solamente el 30-70%
del ganado infectado desarrolla una linfocitosis persistente, y el 0,1-10% desarrolla tumores. Los sntomas
dependen del lugar en que aparecen los tumores y pueden incluir desarreglos digestivos, inapetencia, prdida de
peso, debilidad general y, a veces, manifestaciones neurolgicas. Los ganglios linfticos superficiales pueden
verse inflamados y se pueden palpar bajo la piel o por examen rectal. Los rganos implicados con ms
frecuencia son la cuarta cavidad del rumen, la aurcula derecha del corazn, el bazo, el intestino, el hgado, el
rin, la tercera cavidad del rumen, los pulmones y el tero. La susceptibilidad del ganado a una linfocitosis
persistente est determinada genticamente, y quiz tambin el desarrollo del propio tumor. Existen dudas sobre
el papel del virus como causa de la deficiencia inmunolgica o del aumento de prdidas selectivas. En un estudio
se demostr que las manadas infectadas con BLV presentaban menor produccin lctea (2,5-3% a nivel de la
manada) y un aumento en la tasa de prdidas selectivas, as como una mayor susceptibilidad a otras
enfermedades de etiologa infecciosa, del tipo de la mastitis, diarrea y neumona, pero el efecto sobre la fertilidad
fue escaso (9).
503
Captulo 2.3.4. Leucosis bovina enzotica
El virus puede detectarse por cultivo in vitro de linfocitos de la sangre perifrica. En los linfocitos sanguneos y en
clulas tumorales el virus se presenta como un provirus integrado en el ADN de la clula. Tambin se encuentra
en la fraccin celular de varios lquidos del cuerpo (fluidos nasales y bronquiales, saliva, leche). La transmisin
natural depende de la transferencia de clulas infectadas, por ejemplo durante el parto. Tambin se produce
transmisin artificial, especialmente por agujas contaminadas con sangre, equipo quirrgico, guantes usados en
exmenes rectales, etc. La trasmisin horizontal en ausencia de estos factores suele ser baja. En regiones con
muchos insectos chupadores de sangre, especialmente tbanos, stos pueden transmitir el virus de forma
mecnica.
Aunque se pueden infectar varias especies animales por inoculacin con el virus, la infeccin natural solo tiene
lugar en el ganado bovino (Bos taurus y Bos indicus), en bfalos y en capibaras. Las ovejas son muy
susceptibles a la inoculacin experimental y a menudo desarrollan tumores a una edad ms temprana que el
ganado bovino. Tambin pueden detectarse anticuerpos persistentes despus de una inoculacin experimental
en ciervos, conejos, ratas, cobayas, gatos, ovejas, monos rhesus, chimpancs, antlopes, cerdos, cabras y
bfalos.
Probablemente el BLV estaba presente en Europa durante el siglo XIX, desde donde se extendi al continente
americano en la primera mitad del siglo XX. Puede haber regresado a Europa y a otros pases, con la
importacin de ganado norteamericano (11). Varios pases han sido reconocidos oficialmente como libres de
infeccin por BLV.
Se han realizado diversos estudios para determinar si el BVL causa enfermedades en humanos, sobre todo por
el consumo de leche de vacas infectadas. Sin embargo, no existe evidencia concluyente de transmisin, y en la
actualidad se considera que el BLV no representa un peligro para el hombre.
1.
El BLV es un retrovirus exgeno relacionado desde el punto de vista estructural y funcional con los virus
humanos 1 y 2 que infectan los linfocitos T (HTLV-1 y HTLV-2). Las principales clulas diana del BLV son los
linfocitos B. Las partculas vricas constan en esencia de un ARN de cadena sencilla, la nucleoprotena p12, la
protena p24 de la cpsida, la glicoprotena transmembrana gp30, la glicoprotena de la envuelta gp51, y varias
enzimas entre las que se incluye la transcriptasa inversa. El ADN del provirus, que se genera por trascripcin
inversa de la mayor parte del genoma vrico, se integra al azar en el ADN nuclear de la clula hospedadora,
donde permanece sin dar lugar a virus libres in vivo. Cuando las clulas infectadas se cultivan in vitro,
generalmente mediante co-cultivo de linfocitos con una lnea celular indicadora, se producen virus infecciosos, lo
que sucede ms rpidamente si se estimulan las clulas con mitgenos (16).
a)

Las clulas mononucleares se aslan en un gradiente de densidad a base de ficoll/metrizoato sdico,
partiendo de 1,5 ml de sangre tratada con etiln diamino tetra-actico (EDTA). Despus se cultivan con 2 x
6
10 clulas de pulmn bovino fetal (FBL) y se cultivan durante 3-4 das en 40 ml de medio mnimo esencial
(MEM) con 20% de suero bovino fetal. El virus forma sincitios en la monocapa celular. Se pueden preparar
cultivos de corta duracin, cultivando durante 3 das las clulas mononucleares en una bandeja de plstico
con 24 pocillos en ausencia de las clulas FBL (13). Los antgenos p24 y gp51 pueden detectarse en el
sobrenadante de los cultivos mediante radioinmunoensayo (RIA), enzimoinmunoensayo (ELISA),
inmunotransferencia o por inmunodifusin en gel de agar (IGDA), y la presencia de partculas de BLV y de
provirus se puede demostrar por microscopa y por PCR, respectivamente.
b)

Varios autores han descrito la utilizacin de la reaccin en cadena de la polimerasa (PCR) para detectar el
provirus del BLV (3-5, 19). Con diversa eficacia, se han utilizado cebadores construidos para combinarse
con las regiones gag, pol y env del genoma. El mtodo ms sensible y rpido es la PCR doble (anidada)
seguida por electroforesis y tincin (4, 12). El mtodo descrito se basa en secuencias cebadoras del gen
env, que codifica la gp51. Este gen est muy conservado, y tanto el gen como el antgeno estn
generalmente presentes en todos los animales infectados a lo largo de las fases de la infeccin. La tcnica
est limitada en su ejecucin a aquellos laboratorios que dispongan de servicios de virologa molecular, y
deben tenerse en cuenta las precauciones normales y los procedimientos de control necesarios para
asegurar la validez de los resultados de la prueba (ver Captulos I.1.4. y I.1.8.). Se han publicado otros
protocolos de PCR para la deteccin de secuencias del provirus del BLV (3, 4, 19).
504
La PCR anidada se aplica a la deteccin de la infeccin por BLV en animales individuales en las siguientes
circunstancias:
Terneros jvenes con anticuerpos del calostro,
Casos de tumor, para diferenciar entre linfoma espordico e infeccioso,
Tejido tumoral de casos sospechosos recogidos en mataderos,
Nuevas infecciones, antes del desarrollo de anticuerpos contra el BLV,
Casos de resultados dbilmente positivos o inciertos en pruebas de tipo ELISA,
Anlisis sistemtico de ganado en centros de prueba de reproduccin (antes de la introduccin en

centros de inseminacin artificial)
Ganado empleado en la produccin de vacunas, para comprobar que estn exentos de BLV.
La prueba de PCR no es adecuada para utilizacin a nivel de manada, pero puede emplearse como una
ayuda a la serologa en pruebas confirmativas.
Sensibilidad y fiabilidad del mtodo
i)
Sensibilidad analtica
Aunque la prueba de PCR anidada tiene una sensibilidad terica de una molcula problema, en la
prctica la sensibilidad analtica es algo ms baja, alrededor de 5-10 molculas de ADN provrico por
muestra.
ii)
Muestras positivas falsas

La elevada sensibilidad del mtodo de la PCR anidada puede causar problemas de muestras falsas
positivas debido a la contaminacin entre las muestras. Para reducir esto, se adoptan durante el
anlisis varios procedimientos especiales, como la utilizacin de cabinas de flujo laminar, empleo de
locales separados para las distintas fases del proceso, guantes nuevos en cada caso, uso de tubos de
apertura especial para cada ensayo individual, controles negativos (blancos con agua), etc. Estas
precauciones contra la contaminacin se han descrito extensamente (5).
iii)
Muestras negativas falsas

Debe advertirse que solo una pequea proporcin de los linfocitos perifricos resulta infectada, lo que
limita la sensibilidad del ensayo. La presencia en algunas muestras de sustancias inhibidoras puede
originar resultados falsos negativos. Para detectar esto se utiliza en cada ensayo, por lo menos, un
control positivo. Adems, a cada muestra se aaden controles internos (rplicas). La rplica es una
molcula problema modificada que se amplifica con los mismos cebadores que la molcula problema
real, pero que genera un producto ms largo en PCR, y que puede visualizarse mediante
electroforesis en gel de agarosa. La rplica se aade a una concentracin baja y esto, junto con el
mayor tamao del producto de la PCR, favorece una amplificacin del problema real (2). No obstante,
es posible que la rplica compita con la verdadera molcula. Por tanto, puede ser necesario analizar
cada muestra con y sin rplica.
Los linfocitos de la sangre perifrica (PBL) se separan de la sangre con EDTA utilizando el mtodo FicollPaque de separacin (Pharmacia & Upjohn, Uppsala, Sweden). Alternativamente, se puede utilizar la capa
leucocitaria o incluso sangre completa, por ejemplo cuando las muestras se han congelado.
Los tumores y otros tejidos deben homogenizarse para formar una suspensin al 10%.
Extraccin del ADN
La purificacin del ADN total es un prerequisito para alcanzar una sensibilidad ptima. Se han
comercializado varios mtodos de purificacin, por ejemplo el NucleoSpin (Macherey-Nagel) o el
tratamiento con resina quelante (BioRad).
505
El siguiente mtodo se basa en estudios de Singer-Sam et al. (17) y Walsh et al. (20). Se deben adoptar
precauciones especiales en todos los pasos para evitar el riesgo de contaminacin (5).
i)
En un tubo eppendorf de 1,5 ml para cada muestra, se aaden 100 l de resina quelante (Sigma C7901 o Chelex de BioRad).
ii)
A los tubos con la resina quelante se aaden 100 l de las muestras y 10 l de la rplica. Las
muestras se agitan en un vrtex.
iii)
Se cierran los tubos eppendorf y se incuban a 56C-60C durante 20 minutos.
iv)
Los tubos se agitan en un vrtex durante 10 segundos.
v)
Se incuban los tubos a 96C durante 8-10 minutos.
vi)
Los tubos se agitan en un vrtex durante 10 segundos y se colocan inmediatamente en hielo.
vii)
Opcional: Todas las muestras se equilibran a una cantidad estndar de ADN (500 ng/reaccin)
aplicando, por ejemplo, el mtodo Beta Globin (19).
viii) Se centrifugan los tubos a 15.000 g durante 2 minutos.

ix)
Se utilizan 5 l en el ensayo de PCR.
Procedimiento de PCR anidada
i)
Diseo de cebadores y secuencias

Se han publicados varios protocolos de PCR para la deteccin de secuencias del provirus del BLV (3,
4, 19). Como ejemplo, se describe con detalle un ensayo de PCR basado en el desarrollado por
Ballagi-Pordany et al. (3). La regin del BLV usada como diana es el gen de la gp51 (env). La
secuencia empleada para el diseo de los cebadores est disponible en el banco de datos GenBank,
con nmero de acceso K02120. Las secuencias de los cebadores son:
Oligo
Secuencia
Posicin en
K02120
OBLV1A
(5-CTT-TGT-GTG-CCA-AGT-CTC-CCA-GAT-ACA-3)
5029
OBLV6A
(5-CCA-ACA-TAT-AGC-ACA-GTC-TGG-GAA-GGC-3)
5442
OBLV3
(5-CTG-TAA-ATG-GCT-ATC-CTA-AGA-TCT-ACT-GGC-3)
5065
OBLV5
(5-GAC-AGA-GGG-AAC-CCA-GTC-ACT-GTT-CAA-CTG-3)
5376
Tamao del producto de PCRI: 440 bp; tamao del producto de PCRII: 341 bp; tamao del producto de
la rplica: 761 bp.
ii)
Mezclas de reaccin
Las mezclas de reaccin se combinan (excepto la muestra y la rplica) antes de aadirlas a los tubos
de reaccin. Cada cinco muestras debe aadirse un control negativo (con agua bidestilada) y un
control positivo. Los volmenes totales de mezcla se calculan multiplicando los volmenes indicados
por el nmero total de muestras, incluyendo los controles, ms uno. Se utiliza polimerasa Taq a una
pre-dilucin de 1/10.
1
Las muestras de ADN y las rplicas (2) deben aadirse en recintos separados del laboratorio: el
recinto nmero 1 para preparaciones de ADN y para rplicas, y el recinto nmero 2 para productos de
la PCRII a fin de minimizar la contaminacin.
506
Disponible del Dr. Belk, Department of Virology, National Veterinary Institut, Box 585, Biomedical Centre, S-751 23,
Uppsala, Suecia.
a)
Reactivos aadidos en una habitacin limpia del laboratorio
Esta mezcla se puede preparar por adelantado y mantener a 4C hasta 1 mes.
Reaccin PCRI
Reaccin PCRII
H2O bidestilada (estandarizada)
21 l
21 l
10 tampn para PCR (Perkin Elmer)
5 l
5 l
4 1 l
4 1 l
5 l
5 l
OBLV1A
1.5 l
OBLV6A
1.5 l
OBLV3
1.5 l
OBLV5
1.5 l
En total:
38 l
38 l
Reactivos por reaccin (conc.)
dNTP (10 mM)

Seroalbmina bovina (1 mg/ml)
Cebadores (10 pmol/l):
Lo siguiente debe aadirse inmediatamente antes de comenzar la PCR

Reaccin PCRI
Reaccin PCRII
MgCl2 (25 mM)
5 l
5 l
Polimerase Taq (1 unidad/reaccin)
2 l
2 l
2 gotas
2 gotas
45 l
45 l
Aceite mineral
En total:
b)
Reactivos aadidos en el recinto nmero 1 (ADN) 2 (PCRII)

Muestra de ADN (o de agua)
Producto de PCRI
En total:
iii)
Reaccin PCRI
Reaccin PCRII
5 l
5 l
50 l
50 l
Perfiles trmicos de la PCR

Para la PCRI
5
94C/45 segundos, 60C/60 segundos, 72C/90 segundos
30
72C/420 segundos 20C
Para la PCRII
iv)
30
72C/420 segundos 20C
Procedimiento de laboratorio
I
Mezclar los reactivos para la PCR como se describe en el paso ii. Cuando se aadan las muestras de
ADN, utilizar guantes o abridores de tubos distintos para cada tubo individual. Colocar las muestras en
507
hielo. Ajustar el termociclador a 80C. Poner las muestras en el termociclador e iniciar el programa de
I
la PCR (paso iii).
II
Mezclar los reactivos para la PCR como se describe en el paso ii. Usar guantes o abridores de tubos
I
distintos para cada tubo individual cuando se aada el producto de la PCR . Colocar las muestras en
hielo. Ajustar el termociclador a 80C. Poner las muestras en el termociclador e iniciar el programa de
II
la PCR (paso iii).
Electroforesis en gel de agarosa

II
Llevar los productos de la PCR al laboratorio de electroforesis. Depositar aproximadamente 10-15 l

de las muestras y 23 l de tampn de carga en un gel de agarosa al 2% que contenga bromuro de
etidio al 0,01%. La electroforesis se realiza a 90 mA durante 2 horas utilizando 0,5 x tampn
Tris/borato/EDTA (TBE). Para controlar el tamao de los productos de amplificacin se recomienda un
patrn de 100 bp. El anlisis de los productos de la PCR se realiza por iluminacin con luz UV.
i)
Muestras positivas
Las muestras positivas deben dar productos de PCR del tamao esperado (341 bp), similar al
producto del control positivo.
ii)
Muestras negativas
Las muestras negativas no deben dar productos de PCR del tamao esperado (341 bp), pero debe
estar presente el producto de la rplica (144 bp).
iii)
Resultados dudosos
El ensayo debe repetirse cuando los controles positivos (rplica o control positivo externo) son
negativos o si los controles negativos con agua son positivos.
Prueba confirmativa
Para una identificacin confirmativa, los productos de la PCR se pueden secuenciar, hibridar a una sonda o
analizarse mediante anlisis del polimorfismo de fragmentos de restriccin (RFLP) (10).
2.
Pruebas serolgicas
La infeccin del ganado con el virus dura toda la vida y origina una respuesta persistente de anticuerpos, los
cuales se detectan por primera vez a las 3-16 semanas post-infeccin. Los anticuerpos derivados de la madre
pueden tardar de 6-7 meses en desaparecer. No hay modo de distinguir entre los anticuerpos adquiridos por
transferencia pasiva y los que resultan como consecuencia de una infeccin activa. Sin embargo, la infeccin
activa se puede confirmar por la deteccin del provirus del BLV mediante PCR. Los anticuerpos pasivos tienden
a proteger a los terneros contra la infeccin. Durante el perodo prximo al parto, las vacas pueden tener
anticuerpos sricos que son indetectables por IGDA debido al paso de los anticuerpos desde el sistema
circulatorio de la vaca al calostro. Por tanto, cuando se utiliza la prueba IGDA, un resultado negativo de la prueba
con suero tomado a ese tiempo (2-6 semanas antes del parto y 1-2 semanas despus del parto) no es
concluyente y la prueba debe repetirse. No obstante, la prueba IGDA se puede realizar en esta fase con el
calostro.
Los anticuerpos que primero se detectan son los dirigidos contra gp51 y p24 del virus. La mayor parte de las
pruebas rutinarias IGDA y ELISA detectan anticuerpos contra la glicoprotena gp51, que son de aparicin
temprana. Se han descrito mtodos para realizar estas pruebas (6, 8).
Existen sueros liofilizados para utilizar en ELISA como sueros estndar de la OIE, que son dbilmente positivos y
negativos, y estn disponibles en el laboratorio de referencia de la OIE en Inglaterra (ver Cuadro en la Parte 3 de
este Manual). Estos sueros pueden emplearse para establecer la sensibilidad de las pruebas ELISA. Debe
advertirse que aunque el suero dbilmente positivo se ha equilibrado para ser equivalente al E4 diluido 1/10, no
es adecuado para utilizacin en la prueba IGDA. Como las disponibilidades son limitadas, se sugiere que los
estndares de trabajo para ELISA sean locales y calibrados frente a sueros estndar.
a)
Enzimoinmunoensayo (prueba prescrita para el mercado internacional)

Se puede utilizar un ELISA indirecto o un ELISA de bloqueo. Las pruebas basadas en estos principios estn
comercializadas; se pueden necesitar kits diferentes para muestras de suero o de leche. Algunos ELISAs
son lo suficientemente sensibles como para utilizarse con muestras mezcladas, acumuladas en comn. Las
pruebas ELISA se realizan en la fase slida de microplacas. El antgeno del BLV se emplea para recubrir
las placas, bien directamente o por medio de un anticuerpo policlonal o monoclonal (MAb) de captura. El
antgeno se prepara de modo similar a como se hace para la prueba IGDA y se utiliza a una dilucin
predeterminada (por ejemplo, 1/10) en solucin salina tamponada con fosfato (PBS). En forma de kit, las
508
placas se adquieren a veces antigenizadas. Se pueden aadir algunos conservantes a las muestras de
leche para evitar su agriamiento por fermentacin. Normalmente, las muestras con conservante no se
deterioran de modo significativo si se conservan hasta 6 semanas a 4C.
Enzimoinmunoensayo indirecto ELISA para leche

El siguiente mtodo es adecuado para la deteccin de anticuerpos en muestras de leche de mezcla.
Controles
En cada ensayo deben incluirse controles de leche fuertemente positiva, dbilmente positiva y negativa, y
controles de diluyente. Un control fuertemente positivo se prepara diluyendo a 1/25 el suero estndar
positivo de la OIE (E4 1/10) en leche negativa. Un control dbilmente positivo se prepara diluyendo el suero
estndar positivo de la OIE (E4 1/10) 25 veces el nmero de muestras de leche individuales que componen
el conjunto de leche problema. La leche utilizada para diluir los controles de suero estndar no debe ser
pasteurizada, debe estar descremada y con conservante.
Ejemplo de procedimiento de la prueba
i)
Las muestras de leche deben mantenerse en reposo en un refrigerador hasta que se forme una capa
cremosa definida (24-48 horas), o alternativamente se centrifugan a 2.000 rpm durante 10 minutos. La
capa cremosa se elimina antes de la prueba.
ii)
En columnas alternadas, se unen a la placa de titulacin un antgeno de BLV y un control negativo de

antgeno. Se mezclan 100 l de la muestran problema con 100 l de tampn de lavado para hacer una
dilucin 1/2 en la placa, aadindolo a dos pocillos de control de antgeno y a dos pocillos con
antgeno BLV.
iii)
La placa se cierra y se mezcla el contenido de los pocillos en un agitador.
iv)
Se incuba la placa durante 14-18 horas a 2-8C.
v)
Se aaden 300 l de diluyente de lavado por pocillo y se eliminan; a continuacin se aaden otros
200 l de diluyente de lavado, se agita durante 10 segundos, y se vuelve a eliminar. Finalmente se
aaden otros 300 l y se deja en reposo durante 3 minutos antes de eliminar.
vi)
Se aaden 200 l por pocillo de IgG anti-bovina purificada por afinidad y conjugada con peroxidasa de
rbano, y la placa se incuba durante 90 minutos a temperatura ambiente.
vii)
La placa se lava aadiendo 300 l de diluyente de lavado por pocillo; luego se elimina y se vuelven a
aadir otros 300 l de diluyente de lavado, que se deja en reposo durante 3 minutos y se elimina. Los
pasos vi y vii se repiten.
viii) Se aaden 200 l de substrato ABTS (cido 2,2-azino-bis-[3-etilbenzotiazolina-6-sulfnico])

(precalentado a 25C) y se incuba la placa durante 20 minutos a temperatura ambiente en la
oscuridad. La reaccin se detiene aadiendo 50 l de solucin de parada.
Se ajusta el lector de placas y se lee la absorbancia a 405 nm. Todos los pocillos de la microplaca deben
leerse en las 2 horas siguientes a la adicin de la solucin de parada. La lectura de absorbancia de los
pocillos que contienen antgeno negativo se resta de las lecturas de los pocillos que contienen el antgeno
positivo. Para cada muestra problema, los dos valores de absorbancia neta se promedian. Lo mismo se
lleva a cabo con los controles duplicados dbilmente positivos. Las lecturas de los duplicados no deben
diferenciarse en ms de 0,1 unidades de absorbancia.
Para que la prueba se considere vlida, el promedio de la absorbancia neta de los controles dbilmente
positivos (WP) debera estar entre 0,2-0,6 unidades de absorbancia. La absorbancia neta de los controles
fuertemente positivos debera ser >1,0 unidades de absorbancia. La absorbancia neta del control negativo y
del control de los diluyentes debera estar por debajo del lmite del valor dudoso.
Teniendo en cuenta los criterios anteriores:
i)
Las muestras problemas son positivas si los valores de absorbancia neta son mayores o iguales que
los del control WP.
509
ii)
Las muestras problema son dudosas si su absorbancia neta es el 75% o menos que el valor de la
absorbancia neta del control WP.
Por ejemplo, si la absorbancia neta del control WP = 0,40
entonces el lmite inferior del valor dudoso = 0,40 x 0,750 = 0, 30
Por tanto, en este ejemplo, el rango dudoso sera 0,30-0,39
y las muestras con valor > 0,40 se consideraran positivas.
iii)
Las muestras problema son negativas si el valor de su absorbancia neta est por debajo del lmite
inferior del rango dudoso (< 0,30 en el ejemplo).
Enzimoinmunoensayo de bloqueo ELISA para suero

El siguiente mtodo es adecuado para la deteccin de anticuerpos en muestras
suero.
i)
Recubrimiento de la placa
aisladas o conjuntas de
Todos los pocillos se recubren con anticuerpo contra el BLV prediluido en tampn de recubrimiento
(100 l/pocillo); la placa se cierra y se incuba durante 18 horas a 4C. Se realiza un ciclo de lavado
(lavado estndar), que consiste en tres lavados llenando los pocillos hasta arriba y dejando cada vez
el tampn durante 3 minutos; despus se seca la placa. Se aade el antgeno del BLV prediluido en
tampn de lavado (100 l/pocillo); se cierra la placa y se incuba durante 2 horas a 37C. Se realiza
otro ciclo estndar de lavado.
ii)
Preparacin y adicin de muestras y controles

Los controles de suero positivo y negativo se prediluyen en tampn de lavado (1/2) y se aade la
solucin a cuatro pocillos por cada control (100 l/pocillo). Para probar muestras de mezclas conjuntas
se pueden agrupar 80 sueros diluidos (1/2) con el tampn de lavado y la solucin se aade a dos
pocillos (100 l/pocillo) por cada muestra. Las muestras aisladas deben diluirse 1/100 con tampn de
lavado y aadir la solucin a dos pocillos (100 l/pocillo) por cada muestra. Despus de colocar las
muestras, se cierra la placa y se incuba durante 18 horas a 4C. Se realiza un breve lavado llenando
los pocillos y vacindolos inmediatamente.
iii)
Preparacin y adicin de conjugados y substrato

A todos los pocillos se aade (100 l/pocillo) anticuerpo biotinilado prediluido (utilizando tampn de
lavado + 10% de suero fetal bovino). Se cierra la placa y se incuba en un agitador durante 1 hora a
37C. Se realiza un lavado estndar como se describi anteriormente. Se prediluye avidina conjugada
con peroxidasa en el tampn de lavado y se aade a todos los pocillos (100 l/pocillo). Se cierra la
placa y se incuba en un agitador durante 30 minutos a 37C. Se realiza un lavado estndar. Se aade
a todos los pocillos 100 l del substrato ortofeniln diamina y se cierra la placa dejndola en la
oscuridad durante 9 minutos. La reaccin se detiene aadiendo 0.5 M de cido sulfrico
(100 l/pocillo).
Se ajusta el lector de placas y se lee la absorbancia a 490 nm. Para lectores de doble longitud de onda se
utiliza un filtro de referencia entre 620 nm y 650 nm. Los resultados se leen dentro de los 60 minutos
siguientes a la adicin de la solucin de parada.
La absorbancia del control negativo debe estar prxima a 1,1 + 0,4. Si la absorbancia es menor de 0,7 el
tiempo para el desarrollo del color en el paso iii antes descrito debe aumentarse (ver, preparacin y adicin
de conjugados y substrato). A la inversa, si la absorbancia supera 1,5 el tiempo debe acortarse. La
absorbancia del control positivo debe ser menor que la absorbancia del control negativo x 0,25.
Una muestra es positiva cuando la absorbancia de cada uno de los dos pocillos problema es igual o menor
que la absorbancia media de los cuatro pocillos negativos x 0,5.
Una muestra es negativa cuando la absorbancia de cada uno de los dos pocillos problema es igual o mayor
que la absorbancia media de los cuatro pocillos negativos x 0,65.
Para muestras que dan valores comprendidos entre la absorbancia del control negativo x 0,50 y la
absorbancia del control negativo x 0,65 se recomienda volver a probar el animal tomando una muestra un
mes ms tarde.
510
Sensibilidad del enzimoinmunoensayo
Se puede determinar la sensibilidad de las pruebas ELISA para leches de mezcla utilizando los sueros
estndar de la OIE que son dbilmente positivos y negativos. Las pruebas deben dar resultado positivo con
E4 cuando se diluye en leche negativa a una dilucin de 250 veces el nmero de leches individuales de la
mezcla (Directiva 88/406 de la Unin Europea). Por ejemplo, para mezclas de 60 leches, E4 se debe diluir
1/250 x 60 =1/15000. Utilizando el suero estndar de la OIE dbilmente positivo disponible en la actualidad
(E4 1/10), en la muestra anterior la dilucin debera ser 1/25 x 60 =1/1500. Para muestras de leche
individual, el suero estndar de la OIE dbilmente positivo diluido 1/25 (E4 1/250) en leche negativa, debe
ser positivo.
Cuando se prueban muestras de mezclas de sueros, el suero estndar de la OIE debe dar un resultado
positivo a una dilucin igual al nmero de animales individuales de la mezcla. Por ejemplo, para un conjunto
de 50 muestras individuales, el suero estndar de la OIE dbilmente positivo diluido 1/50 en suero negativo
debera dar un resultado positivo. En las pruebas en que las muestras de suero se ensayan
individualmente, el suero estndar de la OIE dbilmente positivo sin diluir debe ser positivo.
b)
Inmunodifusin en gel de agar (prueba prescrita para el comercio internacional)

La prueba IGDA es especfica, pero no muy sensible, para detectar anticuerpos en muestras de suero
individuales. Sin embargo, no es adecuada para muestras de leche (excepto el primer calostro) debido a su
escasa especificidad y sensibilidad. La prueba IGDA es sencilla y fcil de realizar y ha sido muy til y eficaz
como base en esquemas de erradicacin.
En los kits comerciales para pruebas IGDA se incluyen sueros de referencia, pero no hay sueros estndar
de la OIE actualmente disponibles para esta prueba. Se puede obtener consejo de los laboratorios de
referencia de la OIE que se indican en la Parte 3 de este Manual.
i)
Gel de agar: Se prepara una solucin de agar o agarosa al 0,8-1,2% en tampn Tris 0,2 M, pH 7,2,
que contenga 8,5% de NaCl. Una manera de preparar el agar es disolver 24,23 g de Tris metilamina
en 1 litro de agua destilada y ajustar el pH a 7,2 con HCl 2,5 M. Se disuelve cloruro sdico (85 g) en
250 ml de Tris/HCl y se lleva a 1 litro. Se aade la agarosa (8 g) y la mezcla se calienta en una olla a
2
presin o en un autoclave a 4,55 kg/cm durante 10 minutos. La mezcla se reparte en alcuotas de
15 ml que pueden mantenerse a 4C durante aproximadamente 6 semanas.
ii)
Antgeno: El antgeno debe contener la glicoprotena gp51 especfica de BLV. El antgeno se prepara
en un sistema adecuado de cultivo celular, como en monocapas de clulas de rin de cordero fetal
(FLK) persistentemente infectadas. Las clulas utilizadas para producir el antgeno del BLV deben
estar libres del virus no citoptico de la diarrea vrica bovina y de retrovirus bovinos, as como de virus
similares al de la inmunodeficiencia bovina (lentivirus) y de virus bovinos sincitiales (espumavirus).
Despus de 3-4 das de cultivo a 37C, el medio de crecimiento se reemplaza con medio de
mantenimiento. Se recogen las clulas 7 das despus, empleando una solucin estndar de
tripsina/verseno y la suspensin celular obtenida se centrifuga a 500 g durante 10 minutos.
A continuacin, las clulas se resuspenden en medio de crecimiento; 30% de las clulas se
devuelven al recipiente de cultivo y el resto se desecha. Se recoge todo el sobrenadante y se
concentra 50100 veces por mtodos disponibles, bien sea por concentracin del material en tubos
Visking inmersos en polietiln glicol o por precipitacin con sulfato amnico seguida de ultrafiltracin, o
mediante precipitacin con polietiln glicol y posterior desalinizacin y separacin por tamao en una
columna de poliacrilamida. El antgeno contiene fundamentalmente gp51, pero tambin puede
contener p24.
El antgeno se puede estandarizar para la glicoprotena gp51 por titulacin con E4 del siguiente modo.
Se preparan diluciones dobles de la preparacin de antgeno. La dilucin mayor que, probada contra
el suero estndar E4 sin diluir, origina una lnea de precipitacin equidistante entre el antgeno y el
suero, contiene una unidad. En la prueba se utilizan dos unidades de antgeno.
iii)
Suero control positivo: El control de suero positivo deriva de un animal infectado natural o
experimentalmente (vacas u ovejas). La lnea de precipitacin formada entre los pocillos del antgeno
y del suero control debe ser ntida y equidistante. Se debe incluir en la prueba una dilucin del control
de suero positivo que origine un resultado positivo dbil como indicador de la sensibilidad de la
prueba.
iv)
Suero control negativo: Se utiliza suero de animales no infectados (vacas u ovejas).
v)
Sueros problema: Sueros de cualquier especie animal.
i)
El agar se licua calentndolo en un bao de agua hirviendo y se vierte en placas de Petri (15 ml por
placa de Petri de 8,5 cm de dimetro). Las placas se dejan enfriar a 4C alrededor de 1 hora antes de
511
cortar en el agar los bloques de los pocillos. Se emplea un molde que origina una disposicin
hexagonal de seis pocillos alrededor de un pocillo central. Se pueden utilizar pocillos de varias
dimensiones; un sistema adecuado emplea pocillos de 6,5 mm de dimetro con 3 mm de separacin
entre los pocillos. Para obtener mejores resultados, las placas deben usarse el mismo da que se
preparan y cortan.
ii)
El antgeno se coloca en el pocillo central de la disposicin hexagonal y los sueros problema en los
pocillos exteriores, alternados con suero control positivo. Debera preparase tambin un sistema
control por placa con suero control positivo, suero control dbilmente positivo y suero control negativo
en lugar de los sueros problema.
iii)
Las placas se mantienen a temperatura ambiente (20-27C) en una cmara hmeda cerrada y se
observan a las 24, 48 y 72 horas.
iv)
Interpretacin de los resultados: Un suero problema es positivo si forma una lnea de precipitacin
especfica con el antgeno y es una lnea de identidad con la del suero control. Un suero problema es
negativo si no forma una lnea especfica con el antgeno y no refleja la lnea del suero control. Pueden
aparecer lneas inespecficas que no convergen con las lneas formadas por el control positivo. Un
suero problema es dbilmente positivo si curva la lnea del suero control hacia el pocillo del antgeno,
sin formar una lnea visible de precipitacin con el antgeno. La reaccin es dudosa si no puede
interpretarse como positiva o negativa. La prueba no tiene validez si los controles no dan los
resultados esperados. Los sueros que originan resultados dudosos o dbilmente positivos pueden
concentrarse y volverse a probar.

En terneros jvenes nacidos de madres infectadas con BLV, los anticuerpos maternos contra la gp51 del BLV
son importantes como proteccin contra la infeccin por BLV (12). Sin embargo, varios experimentos en los que
se ha utilizado BLV inactivado, clulas FLK fijadas e infectadas, o gp51 purificada indican que stos antgenos
solo inducen proteccin a corto plazo. Tambin se ha comprobado que la vacunacin del ganado con clulas
vivas de una lnea celular BL3, establecida a partir de un animal con leucosis bovina espordica, solo provoca
proteccin de corta duracin. La naturaleza del antgeno que proporciona proteccin en estos casos se
corresponde probablemente con un antgeno de transplante asociado al tumor (18). Las clulas ovinas que solo
sintetizan los productos gp51 y gp30 del gen env y la principal protena estructural p24, indujeron una respuesta
serolgica en el ganado bovino (1); el ganado result protegido despus de vacunacin repetida con estas
clulas.
La vacunacin de ovejas con un virus vacunal recombinante que expresa la gp51 del BLV indujo proteccin (14).
No obstante, la proteccin se desarroll sin produccin de niveles detectables de anticuerpos neutralizantes.
Adems, Portetelle et al. encontraron que los virus vacunales recombinantes protegan a las ovejas incluso en
ausencia de anticuerpos anti-gp51 (15). Por consiguiente, se interpreta que la inmunidad mediada por clulas
puede jugar un papel importante en la inmunidad protectora contra la infeccin por BLV. Se ha logrado la
expresin de gp51 por virus recombinantes y por levaduras que contienen la secuencia del gen env del BLV.
Estos sistemas provocan proteccin en ovejas (7). Pese a estos avances en el conocimiento, no existen todava
vacunas comercializadas para el control de la LBE.
REFERENCIAS
1.
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infection by means of cell-derived vaccine. Vaccine, 9, 889895.
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BALLAGI-PORDANY A. & BELAK S. (1996). The use of mimics as internal standards to avoid false negatives in
diagnostic PCR. Mol. Cell. Probes, 10, 159164.
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BALLAGI-PORDANY A., KLINTEVALL K., MERZA M., KLINGEBORN B. & BELAK S. (1992). Direct detection of bovine
leukaemia virus infection: practical applicability of a double polymerase chain reaction. J. Vet. Med. [B], 39,
6977.
4.
BEIER D., BLANKENSTEIN P. & FECHNER H. (1998). Chances and limitations for the use of the polymerase chain
reaction in the diagnosis of bovine leukemia virus (BLV) infection in cattle. Dtsch Tierartzl. Wochenschr.,
105, 408412.
5.
BELAK S. & BALLAGI-PORDANY A. (1993). Experiences on the application of the polymerase chain reaction in a
diagnostic laboratory. Mol. Cell. Probes, 7, 241248.
512
6.
COMMISSION OF THE EUROPEAN COMMUNITIES (1991). Council Directive of Amending Directive 64/432/EEC as
Regards the Diagnosis of Bovine Brucellosis and Enzootic Bovine Leukosis. Off. J. European Communities
Council, 14 May 1991.
7.
DANIEL R.C.W., GATEI M.H., GOOD M.F., BOYLE D.B. & LAVIN M.F. (1993). Recombinant viral vaccines for
enzootic bovine leucosis. Immunol. Cell Biol., 71, 399404.
8.
DIMMOCK C.K., RODWELL B.J. & CHUNG Y.S. (1987). Enzootic bovine leucosis. Pathology, Virology and
Serology. Australian standard diagnostic techniques for animal disease. No. 49. Australian Agricultural
Council.
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EMANUELSSON U., SCHERLING K. & PETTERSSON H. (1992). Relationships between herd bovine leukemia virus
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15. PORTETELLE D., LIMBACH K., BURNY A., MAMMERICKX M., DESMETTRE P., RIVIERE M., ZAVADA J. & PAOLETTI E.
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PCR-based typing from forensic material. BioTechniques, 10, 506513.
*
* *
NB: Existen laboratorios de referencia de la OIE para la Leucosis bovina enzotica (ver Cuadro en la Parte 3 de
este Manual de animales terrestres o consultar la pgina web de la OIE para una lista ms actualizada:
www.oie.int).
513
CAPTULO 2.3.5.
RINOTRAQUEITIS BOVINA INFECCIOSA /

VULVOVAGINITIS PUSTULAR INFECCIOSA
RESUMEN
La rinotraqueitis bovina infecciosa/vulvovaginitis pustular infecciosa, causada por el herpesvirus 1
bovino (BHV1), es una enfermedad del ganado bovino domstico y silvestre. El virus est
distribuido por todo el mundo, pero se ha erradicado de Austria, Dinamarca, Finlandia, Suecia y
Suiza, y otros pases han iniciado programas de control.
La enfermedad se caracteriza por sntomas clnicos del tracto respiratorio superior, como
descargas nasales (muco) purulentas, y conjuntivitis. Los sntomas generales son fiebre,
depresin, inapetencia, aborto y reduccin de la produccin de leche. El virus tambin puede
infectar el tracto genital y originar vulvovaginitis pustular y balanopostitis. El anlisis post-mortem
revela rinitis, laringitis y traqueitis. La mortalidad es baja. Muchas infecciones siguen un curso
subclnico. Las infecciones bacterianas secundarias pueden ocasionar una enfermedad
respiratoria ms grave.
Identificacin del agente: El virus se puede aislar de frotis nasales durante la fase aguda de la
infeccin, y de varios rganos post-mortem. El examen post-mortem revela rinitis, laringitis y
traqueitis.
Para aislar el virus se utilizan varios tipos de cultivos celulares de origen bovino, como
clulas secundarias de cultivos de pulmn o rin, o la lnea celular Madin-Darby de rin bovino.
A los 2-4 das el virus produce efecto citoptico. Se identifica por mtodos de neutralizacin o de
deteccin de antgenos con sueros monoespecficos o anticuerpos monoclonales. Los
aislamientos de BHV1 se pueden subtipar por anlisis del ADN con enzimas de restriccin.
Se han desarrollado mtodos de deteccin del ADN vrico y la tcnica de la reaccin en cadena
de la polimerasa puede ser particularmente til en estudios a partir de muestras de semen.
Pruebas serolgicas: Las pruebas utilizadas ms ampliamente para la deteccin de anticuerpos
son las de neutralizacin del virus y varios tipos de enzimoinmunoensayos (ELISAs). Los
anticuerpos se pueden detectar en la leche con un mtodo ELISA.
Requisitos para las vacunas y los materiales de diagnstico: Se dispone de vacunas
atenuadas y muertas. Las vacunas deben proteger clnicamente al ganado en caso de infeccin y
reducir notablemente la liberacin subsiguiente de virus. Las vacunas no deben producir
enfermedad, aborto ni reacciones locales o sistmicas y deben ser genticamente estables. En
1995, se consiguieron vacunas con un mutante deleccionado. El uso de una tcnica gE ELISA
permite distinguir entre ganado infectado y ganado vacunado con esas vacunas marcadas.
A. INTRODUCCIN
La rinotraqueitis bovina infecciosa/ vulvovaginitis pustular infecciosa (RBI/VPI), causada por el herpesvirus
bovino tipo 1(BHV1), es una enfermedad del ganado bovino domstico y salvaje. El BHV1 es un miembro del
gnero Varicellovirus de la subfamilia Alfaherpesvirinae, que pertenece a la familia Herpesviridae. El genoma
vrico es ADN bicatenario que codifica para unas 70 protenas, de las que se conocen 33 que son estructurales
y hasta 15 que no son estructurales. Las glicoprotenas vricas, que se localizan en la envoltura superficial del
virin, tienen un papel importante en la patognesis y en la inmunidad. Por diferencias en el anlisis del ADN
con enzimas de restriccin, el BHV1 se puede diferenciar en los subtipos 1.1 (infecciones respiratorias), 1.2
514
Captulo 2.3.5. Rinotraqueitis bovina infecciosa/vulvovaginitis pustular infecciosa
(infecciones respiratorias y genitales) y 1.3 (infecciones neurolgicas; BHV5), 2a y 2b (17). El virus del subtipo 2
parece menos virulento que el del subtipo 1 (7). Sin embargo, solo hay un tipo antignico de BHV1.
El nombre de la enfermedad indica los sntomas clnicos ms destacables. Despus de un perodo de
incubacin de 2-4 das, se evidencia una notable descarga nasal serosa, salivacin, fiebre, inapetencia y
depresin. En unos pocos das las descargas nasales y oculares cambian a mucopurulentas. Las lesiones
necrticas en la nariz pueden progresar hasta formar lceras y pstulas recubiertas por una seudomembrana
que obstruye las vas respiratorias altas y conduce a una respiracin bucal. La infeccin tambin puede producir
aborto y una disminucin de la produccin de leche (10). Donde se practica la monta natural, la infeccin genital
puede originar vulvovaginitis o balanopostitis. stas se caracterizan por lesiones necrticas ligeras o graves de
la mucosa vaginal o prepucial. Despus de la inseminacin artificial con semen infectado, puede aparecer
endometritis (12). En terneros infectados con HBV1, se desarrolla una enfermedad sistmica, con lesiones
necrticas focales en las vsceras y posiblemente con una gastroenteritis pronunciada. Muchas infecciones
siguen un curso subclnico (32). La meningoencefalitis parece ser el resultado de una infeccin por un
herpesvirus relacionado, pero distinto, recientemente designado como BHV5 (27), aunque la infeccin por BHV1
tambin puede causar meningoencefalitis de forma espordica. El BHV1 puede afectar a animales de cualquier
edad, pero es ms comn en animales de edad superior a 6 meses.
Los casos de enfermedad respiratoria o genital provocados por BHV1 sin complicaciones duran 5-10 das. Las
infecciones bacterianas secundarias, por ejemplo con Pasteurella spp., pueden originar sntomas clnicos ms
graves debido a la afeccin de vas respiratorias ms profundas.
El virus penetra en el animal por la nariz y se replica con ttulos altos en las membranas mucosas del tracto
respiratorio superior y en las amgdalas. Despus se disemina a las conjuntivas y por transporte por el axn de
las neuronas alcanza el ganglio trigmino. En ocasiones se presenta un nivel bajo de viremia. En una infeccin
genital, el BHV1 se replica en la membrana mucosa de la vagina o del prepucio, y se establece en forma latente
en los ganglios sacros. El ADN del virus permanece en las neuronas de los ganglios, probablemente durante
toda la vida del hospedador. El estrs, como el producido por el transporte o el parto, puede inducir la
reactivacin de la infeccin latente. El virus puede, por tanto, liberarse al medio de modo intermitente.
La lesin primaria consiste en una necrosis focal de las membranas mucosas nasales, larngeas, traqueales o
genitales. Esta lesin es, probablemente, la secuela directa de la replicacin del virus y su consiguiente efecto
citoptico (ECP). El animal reacciona con una respuesta inflamatoria intensa. Las lesiones se pueden unir
formando grandes pstulas que muestran una infiltracin masiva de leucocitos. Los leucocitos de la sangre
perifrica pueden contener BHV1 (9, 19). Una infeccin aguda por BHV1 produce apoptosis en las clulas
linfoides (35). Cuando aparecen infecciones bacterianas secundarias, se puede desarrollar una neumona. En
fetos abortados, se presentan pequeos focos necrticos en diversos tejidos, particularmente en el hgado.
Normalmente una infeccin induce una respuesta de anticuerpos y una respuesta inmune mediada por clulas
en 7-10 das. La respuesta inmune parece durar toda la vida, aunque puede estar bajo los lmites de deteccin
de algunas pruebas. No obstante, la inmunidad protectora despus de la infeccin no es duradera: el ganado
puede reinfectarse. Los anticuerpos maternos se transfieren por el calostro a los terneros jvenes que estn, por
consiguiente, protegidos contra la enfermedad ocasionada por el BHV1 (16). Estos anticuerpos maternos tienen
una vida media de aproximadamente 3 semanas, pero en ocasiones se pueden detectar en animales de hasta 9
meses de edad, y raramente en animales ms viejos.
El virus se distribuye por todo el mundo, en paralelo con la distribucin del ganado domstico. Otros rumiantes
se pueden infectar por el BHV1, pero probablemente no influyen en la extensin del BHV1 entre el ganado
domstico. No existen otros reservorios de BHV1 aparte de los rumiantes. No se conoce la dosis infectiva
mnima del BHV1. Despus de la infeccin, se detecta la liberacin nasal de virus durante 10-14 das, con ttulos
8
10
mximos de 10 -10 DICT50 (dosis infecciosa 50% cultivo tisular) por ml de secrecin nasal. A distancias cortas
es posible la transmisin area del BHV1 (15). El semen de un toro infectado puede contener BHV1 y el virus
puede por tanto transmitirse por monta natural y por inseminacin artificial (21).
El control del BHV1 se basa en las medidas higinicas normales de una granja. Idealmente, se impone al
ganado de nueva adquisicin un perodo de cuarentena de 2-3 semanas y solo el que sea seronegativo para
BHV1 resulta admitido. En general, las vacunas evitan el desarrollo de sntomas clnicos graves y reducen la
liberacin del virus despus de la infeccin, pero no evitan la infeccin. Solo se deben utilizar vacunas con
eficacia y seguridad demostradas (ver Seccin C).
Se puede sospechar que la infeccin por BHV1 es la causa de la enfermedad por los sntomas clnicos,
patolgicos y epidemiolgicos. Sin embargo, para hacer un diagnstico definitivo, se necesita el examen de
laboratorio. Un procedimiento de diagnstico completo en el laboratorio trata de detectar el virus causante (o los
componentes vricos) y los anticuerpos especficos que induce.
515
1.
a)
Recogida y procesamiento de muestras

Se recogen hisopos nasales de varios animales afectados (de cinco a diez) que estn en la primera fase
de la infeccin. Este ganado todava mostrar descargas nasales serosas en vez de mucopurulentas. En
los casos de vulvovaginitis o balanopostitis toman hisopos de los genitales. Los hisopos deben frotarse
vigorosamente contra las superficies mucosas. Tambin se puede lavar el prepucio con solucin salina y
recoger el lquido de lavado. Las muestras se suspenden en medio de transporte (medio de cultivo de
clulas que contenga antibiticos y 2-10% de suero fetal bovino para evitar la inactivacin de los virus), se
enfran a 4C y se envan rpidamente al laboratorio.
Durante la necropsia, se recogen para la deteccin del virus las membranas mucosas del tracto
respiratorio y porciones de las amgdalas, pulmones y ganglios linfoides bronquiales. En casos de aborto,
se examina el hgado fetal, los pulmones, el bazo, el rin y un cotiledn placentario. Las muestras se
deben enviar al laboratorio en hielo con la mayor rapidez posible.
Despus de su llegada al laboratorio, los hisopos se agitan en el medio de transporte para desprender el
virus y se dejan a temperatura ambiente durante 30 minutos. Despues de extraer los bastoncillos se
clarifica el medio de transporte por centrifugacin a 1.500 g durante 10 minutos. Los tejidos se
homogenizan para formar suspensiones al 10-20% (p/v) en medio de cultivo celular antes de centrifugar a
1.500 g durante 10 minutos. Los sobrenadantes de estas muestras se filtran a travs de filtros de 0.45 m
y se utilizan para el aislamiento de virus.
El aislamiento de virus a partir del semen requiere algunas adaptaciones particulares, porque el fluido
seminal contiene enzimas y otros factores que son txicos para las clulas e inhiben la replicacin vrica
(ver ms adelante).
b)
Aislamiento vrico
Para aislar los virus, se pueden utilizar varios tipos de cultivos celulares. Resultan adecuadas las clulas
primarias o secundarias de rin de bovino, de pulmn o de testculos, las cepas celulares derivadas de
pulmn fetal bovino, cornetes nasales o trquea, y las lneas celulares establecidas, como la lnea celular
Madin-Darby de rin bovino. Los cultivos celulares pueden cultivarse en tubos de vidrio o de plstico, en
placas o discos. Cuando se utilizan placas de plstico de 24 pocillos, se inocula en estos cultivos celulares
100-200 l de los sobrenadantes descritos anteriormente. Despus de un perodo de absorcin de 1 hora,
se lavan los cultivos y se aade medio de mantenimiento. El suero empleado como suplemento del medio
de mantenimiento debe estar libre de anticuerpos contra BHV1. Los cultivos celulares se observan
diariamente para ECP, que normalmente aparece a los tres das de la inoculacin. Se caracteriza por la
agrupacin de clulas redondeadas en forma de racimos que se juntan alrededor de un hueco en la
monocapa; a veces, se pueden observar clulas gigantes con varios ncleos. Se requiere experiencia para
reconocer esta apariencia caracterstica. Si despus de 7 das no aparece ECP, se debe realizar otro pase.
El cultivo celular se congela y se descongela, se clarifica por centrifugacin, y se usa el sobrenadante para
inocular monocapas recin preparadas.
Para identificar el virus que produce ECP como BHV1, el sobrenadante del cultivo debe neutralizarse con
un antisuero monoespecfico contra BHV1 o con un anticuerpo monoclonal (MAb) neutralizante. Con este
propsito, se llevan a cabo diluciones decimales del sobrenadante de prueba y se aade a cada dilucin
antisuero monoespecfico contra BHV1 o un suero negativo como control. Despus de incubar a 37C
durante 1 hora, se inoculan las muestras en un cultivo celular; a los 3-5 das se calcula el ndice de
neutralizacin. El ndice de neutralizacin es el ttulo del virus (en log10) en presencia del suero control
negativo, menos el ttulo del virus en presencia del antisuero especfico. Si el ndice de neutralizacin es
mayor de 1.5, el aislado se considera BHV1. Para acortar el procedimiento de aislar el virus, se pueden
inocular dos muestras en cultivo celular: una que se ha preincubado con antisuero monoespecfico y otra
que se ha incubado con el suero control negativo. Si el antisuero monoespecfico inhibe el ECP, el aislado
se considera BHV1.
Un mtodo alternativo de identificar el virus es la demostracin directa de antgeno de BHV1 en las clulas
prximas al ECP mediante una prueba de inmunofluorescencia o inmunoperoxidasa (11) con antisuero
monoespecfico o con MAb conjugado.
516
Aislamiento de virus del semen (Una prueba prescrita para el comercio internacional)
Se deben probar al menos 0,05 ml de semen natural, con dos pases en cultivo celular. Para semen
conservado, se debe hacer una aproximacin que asegure que se examina el equivalente a 0,05 ml de
semen natural. El semen fresco natural es generalmente citotxico y debe prediluirse antes de aadirlo a
los cultivos celulares. A veces surge un problema similar con el semen conservado. A continuacin se
expone un procedimiento adecuado de prueba.
i)
Diluir 200 l de semen fresco en 2 ml de suero bovino fetal (libre de anticuerpos contra BHV1) que
contenga antibiticos.
ii)
Mezclar vigorosamente y mantener 30 minutos a temperatura ambiente.
iii)
Inocular 1 ml de la mezcla semen/suero en una monocapa de clulas susceptibles (ver arriba,

aislamiento de virus) en una placa de cultivo de tejidos de 6 pocillos.
iv)
Incubar las placas 1 hora a 37C.
v)
Eliminar la muestra, lavar dos veces la monocapa con 5 ml de medio de mantenimiento, y aadir 5 ml
de medio de mantenimiento a cada pocillo.
vi)
Incluir en la prueba controles negativos y positivos para BHV1. Tener mucho cuidado para evitar la
contaminacin de los pocillos de ensayo con el control positivo; por ejemplo, manejando siempre el
control al final, y utilizando placas separadas.
vii)
Observar diariamente las placas al microscopio para aparicin de ECP. Si aparece ECP, se realizan
pruebas confirmativas para BHV1 por mtodos de neutralizacin especfica o de marcaje inmune (ver
antes).
viii) Si despus de 7 das no se observa ECP, los cultivos se congelan y se descongelan, se clarifican por
centrifugacin, y se utiliza el sobrenadante para inocular nuevas monocapas.
ix)
c)
La muestra se considera negativa si no se evidencia ECP a los 7 das de incubacin de los cultivos
del nuevo pase.
Deteccin del antgeno vrico

Los hisopos nasales, oculares o genitales se pueden extender directamente, en portaobjetos de vidrio o
bien, despus de centrifugar, se puede colocar en los portas el depsito celular (ver seccin B.1.a.). Estos
portaobjetos se someten a una prueba estndar de inmunofluorescencia directa o indirecta. En la prueba
de inmunofluorescencia directa, el antisuero monoespecfico se conjuga con isotiocianato de fluorescena,
mientras que en el procedimiento indirecto es el segundo anticuerpo contra la inmunoglobulina bovina el
que se conjuga al isotiocianato de fluorescena. Para obtener los mejores resultados, se necesita
muestrear varios animales procedentes de una poblacin que presenten fiebre y una descarga nasal
serosa ligera. Los frotis deben secarse al aire y se fijan con acetona dentro de las 24 horas. Los frotis de
escobillones nasales del ganado bovino con descargas nasales mucopurulentas o hemorrgicas suelen
ser negativos (28). La ventaja de esta tcnica de deteccin de antgeno es que puede permitir el
diagnstico en el mismo da. Sin embargo, la sensibilidad de este procedimiento es menor que la del
aislamiento del virus (5). En cada prueba se deben incluir controles positivos y negativos.
El tejido recogido post-mortem se puede analizar para la presencia de antgeno de BHV1 por la prueba de
inmunofluorescencia en secciones o cortes congelados. Tambin se puede utilizar inmunohistoqumica. La
ventaja es que se puede determinar la localizacin del antgeno. El uso de MAbs para detectar antgeno de
BHV1 est creciendo, lo que conduce a un incremento de la especificidad de la prueba. Sin embargo, tales
MAbs deben ser seleccionados cuidadosamente, ya que deben dirigirse contra epitopos conservados que
estn presentes en todos los aislados de BHV1.
Otra posibilidad para la deteccin rpida y directa de antgeno vrico es el uso de un enzimoinmunoensayo
(ELISA). El antgeno se puede capturar por MAbs o por anticuerpos policlonales fijados a una fase
slida, generalmente el pocillo de una microplaca. Se necesitan cantidades de antgeno equivalentes a
104-105 DICT50 de BHV1 para obtener una tasa elevada de resultados positivos (4). Esto no resulta
excesivamente elevado porque el ganado bovino puede excretar ttulos de 108-109 DICT50/ml de fluido
nasal a los 35 das de la infeccin. La sensibilidad se puede aumentar por sistemas de amplificacin (ver
la ref. 6 para un ejemplo).
Las ventajas de los mtodos de deteccin de antgeno frente a los de aislamiento de virus son que no se
necesitan servicios de cultivos celulares y que se puede hacer un diagnstico de laboratorio en 1 da. Las
desventajas radican en la menor sensibilidad de la deteccin directa del antgeno y en la necesidad extra
de realizar el aislamiento del virus, si se necesita el aislado para estudios posteriores.
517
d)
Deteccin del cido nucleico

En la ltima dcada se han descrito varios mtodos para demostrar la presencia del ADN del BHV1 en
muestras clnicas, incluyendo la hibridacin ADN-ADN y la reaccin en cadena de la polimerasa (PCR). El
uso de la PCR en el diagnstico rutinario est creciendo (18). En comparacin con el aislamiento de virus,
la PCR tiene la ventaja principal de que es ms sensible y ms rpida: puede realizarse en 1-2 das.
Tambin puede detectar ADN en ganglios sensoriales con infeccin latente (29). La desventaja es que es
fcil de contaminar y por consiguiente hay que tomar medidas para evitar falsos resultados positivos.
Hasta la fecha la PCR se ha utilizado principalmente para detectar ADN del BHV1 en muestras de semen
infectado artificial (37) o naturalmente (29, 30). Los investigadores destacan que es importante optimizar
cuidadosamente las condiciones de la prueba PCR, incluyendo la preparacin de las muestras, la
2+
concentracin de Mg , los cebadores y la polimerasa Taq, y los programas de ciclos. La regin a
amplificar debe estar presente en todas las cepas de BHV1 y la secuencia nucleotdica debe estar
conservada. Se han utilizado los genes TK, gB, gC, gD y gE como dianas para la amplificacin por PCR.
Para distinguir entre el virus salvaje y el de cepas vacunales con el gen gE deleccionado se pueden utilizar
PCRs basadas en la deteccin de las secuencias de gE (9, 26). Con la tcnica de la PCR no es posible
discriminar entre la infeccin con cepas IBR virulentas y la infeccin con otras cepas vivas atenuadas. Se
han desarrollado PCRs que distinguen entre BHV1 y BHV5 (1, 25).
Experimentalmente, la PCR resulta ms sensible que el aislamiento de virus: detecta cinco veces ms
muestras positivas que el aislamiento de virus. Adems, tiene un lmite de deteccin de tan solo tres
molculas. Sin embargo, no se puede excluir la posibilidad de falsos resultados negativos. Para identificar
posibles resultados falsos negativos se recomienda introducir un ADN molde de control interno en el tubo
de reaccin de la muestra del semen, que se amplifique con los mismos cebadores. Tal ADN molde de
control se puede construir insertando, por ejemplo, un fragmento de 100 pares de bases en la regin
analizada. Este molde de control tambin hace posible semicuantificar la cantidad de ADN detectada (25,
29, 30).
Antes de que se reconozca internacionalmente a la PCR como un instrumento de diagnstico adecuado
para el comercio internacional, deber ser validada por una prueba comparativa entre diferentes
laboratorios.
e)
Diferenciacin de subtipos del herpesvirus bovino 1

Los subtipos 1 y 2b del BHV1 se pueden diferenciar por inmunofluorescencia, radioinmunoprecipitacin,
inmunoperoxidasa o pruebas de inmunotransferencia (24, 36). El anlisis con endonucleasas de restriccin
permite diferenciar entre todos los subtipos reconocidos de BHV1 (17). El ADN se extrae primero de los
viriones o de clulas infectadas, se digiere con endonucleasas de restriccin, y los fragmentos que resultan
se separan por electroforesis en gel de agarosa. El tamao y el nmero de los fragmentos indican el
subtipo del virus. Tales tcnicas son de un valor diagnstico limitado, pero pueden ser tiles en estudios
epidemiolgicos.
f)

El aislamiento del BHV1 de un animal no significa necesariamente que el virus sea la causa del brote de la
enfermedad. Por ejemplo, puede ser un virus latente que se haya reactivado debido a condiciones de
estrs. Se debe hacer un diagnstico de laboratorio confirmativo con un grupo de animales, y debe estar
acompaada de seroconversin de negativos a positivos o de un aumento en el ttulo de anticuerpos
contra BHV1 de cuatro veces o ms. El ganado del que se recogen los frotis nasales se sangra dos veces,
con 2-3 semanas de diferencia. Estas muestras de pares de sueros se examinan juntas en una prueba
serolgica para la presencia de anticuerpos especficos (ver Seccin B.2).
2.
Pruebas serolgicas
Las pruebas serolgicas se pueden utilizar para diferentes fines:

i)
Para diagnosticar una infeccin aguda: se examinan en una prueba muestras de suero de las fases
agudas y de convalecencia de la infeccin en los mismos animales. Una seroconversin de negativos a
positivos o un aumento de cuatro veces o ms en el ttulo de anticuerpos se considera que es indicativo de
infeccin.
ii)
Para demostrar la ausencia de infeccin, por ejemplo, con relacin al mercado internacional.
iii)
Para determinar la prevalencia de la infeccin en estudios seroepidemiolgicos.
iv)
Para apoyar programas de erradicacin y el control subsiguiente.
518
v)
Para propsitos de investigacin, por ejemplo, la evaluacin de la respuesta de anticuerpos despus de la

vacunacin y de una infeccin de desafo.
Para detectar anticuerpos contra el BHV1 en el suero se emplean normalmente pruebas de neutralizacin
vrica (NV) y varios ELISAs (13). Una prueba serolgica alternativa es la inmunofluorescencia indirecta
(33). Como la latencia del virus es una secuela normal de la infeccin por BHV1, la identificacin de
animales serolgicamente positivos supone un indicador til y fiable del estado infectivo. Cualquier animal
con anticuerpos contra el virus se considera un portador y un potencial excretor intermitente del virus. Las
nicas excepciones a esto son los terneros jvenes que han adquirido de modo pasivo los anticuerpos por
el calostro de sus madres y el ganado no infectado, vacunado con vacunas inactivadas.
Los mtodos ELISAs, incluyendo el gE-ELISA, se utilizan cada vez ms para detectar anticuerpos en
muestras de leche entera, pero presentan algunas limitaciones. Una prueba de leche negativa indica que
menos del 20% de los adultos de la poblacin lechera posee anticuerpos contra BHV1. Muchas vacas
individuales seropositivas presentan un ttulo de anticuerpos en la leche menor de 1/5. Este ttulo puede
ser variable, dependiendo del nivel de deteccin del ELISA utilizado. Por consiguiente, no es posible
declarar que un grupo de animales o una poblacin est libre de infeccin por BHV1 basndose en
pruebas con leche individual o colectiva, y una prueba de leche negativa debera continuarse con el
anlisis de muestras individuales de suero de todo el ganado de la explotacin. A efectos de un control
general, las pruebas en los tanques de leche entera pueden proporcionar una estimacin de la prevalencia
del BHV1 en una manada, un rea o un pas (20). stas deberan suplementarse con pruebas de suero
(individual o colectivo) de explotaciones no lecheras.
a)
Neutralizacin de virus (una prueba prescrita para el comercio internacional)

Las pruebas de NV se llevan a cabo con varias modificaciones. Las pruebas varan respecto de la cepa de
virus utilizada en el protocolo de la prueba, la dilucin inicial de suero, el perodo de incubacin de la
mezcla virus/suero (1-24 horas), el tipo de clulas utilizadas, el da de la lectura final, y la lectura de punto
final (50% frente a 100%) (22). De estas variables, el perodo de incubacin de la mezcla virus/suero posee
el efecto ms importante sobre el ttulo de anticuerpos. Un perodo de incubacin de 24 horas puede
detectar ttulos hasta 16 veces superiores que un perodo de incubacin de 1 hora (2), y se recomienda
cuando se requiere la mxima sensibilidad (por ejemplo, a efectos del mercado internacional). En la prueba
de NV resulta adecuado utilizar varias clulas bovinas o lneas celulares, incluyendo clulas secundarias
de rin o de testculo de bovino, estirpes celulares de pulmn de bovino o de clulas de la trquea, o la
lnea celular establecida de Madin-Darby de rin bovino.
A continuacin se indica un protocolo adecuado para una prueba de NV.
i)
Inactivar los sueros, incluidos los sueros control estndar, durante 30 minutos en un bao de agua a
56C.
ii)
Preparar diluciones dobles de los sueros de prueba en medio de cultivo celular. Comenzar con suero
no diluido y continuar horizontalmente hasta la dilucin 1/1024 en una placa de microtitulacin de
grado de cultivo celular, con 96 pocillos de fondo plano. Utilizar por lo menos dos pocillos por dilucin
y 50 l por pocillo. En la prueba tambin se incluyen diluciones de un suero control positivo, de un
positivo dbil y de un control negativo. Se utiliza un pocillo adicional con suero sin diluir como control
de toxicidad de los sueros.
iii)
Aadir a cada pocillo 50 l del stock de BHV1 diluido en medio de cultivo de modo que suponga 100200 DICT50 por pocillo. En los pocillos de control de toxicidad, aadir 50 l de medio de cultivo en
lugar de virus. Aadir 100 l de medio de cultivo a diez pocillos vacos para control de las clulas.
iv)
Hacer por lo menos cuatro diluciones decimales del stock residual de virus (re-titulacin) en medio de
cultivo, 50 l por pocillo y al menos cuatro pocillos por cada dilucin.
v)
Incubar las placas durante 18-24 horas a 37C.
vi)
Aadir 100 l por pocillo de la suspensin celular a razn de 3 x 10 clulas por pocillo.
vii)
Incubar las placas durante 3-5 das a 37C.
viii) Leer microscpicamente las placas para ECPs. Validar la prueba comprobando la re-titulacin del
virus (que debera dar un valor de 100 DICT50, con una variacin permisible de 30-300 DICT50), los
sueros control y los pocillos de control de clulas. El suero control positivo debera dar un ttulo de + 1
dilucin doble (+ 0.3 unidades logartmicas decimales) respecto a su valor. El suero positivo dbil
debera ser positivo. El suero negativo no debera producir neutralizacin cuando se prueba sin diluir
(equivalente a una dilucin final de en la fase de neutralizacin). En los pocillos de control de
clulas, la monocapa debera estar intacta.
519
ix)
b)
Los resultados de la prueba sobre el suero se expresan como el inverso de la dilucin del suero que
neutraliza el 50% de los pocillos. Si en el 50% de los pocillos con suero no diluido se neutraliz el
virus, el ttulo (de la dilucin inicial) se considera 1 (1/2 utilizando la dilucin final convencional). Si
todos los pocillos con suero no diluido y el 50% de los pocillos con suero diluido a 1/2 mostraran
neutralizacin del virus, el ttulo (de la dilucin inicial) sera 2 (dilucin final 1/4). Para resultados
cualitativos, cualquier neutralizacin de ttulo 1 o superior (dilucin inicial convencional) se considera
positiva. Si se observa citotoxicidad en los pocillos de control de la toxicidad del suero, la muestra se
describe como txica (sin resultado), a menos que se observe neutralizacin del virus sin citotoxicidad
a diluciones ms altas y se pueda establecer un ttulo sin ambigedad. Cuando existe citotoxicidad
con un suero del que resulta crtico obtener un resultado, el cambiar el medio en los pocillos de las
diluciones ms bajas 16-24 horas despus de aadir las clulas puede eliminar el efecto citotxico
con muchos sueros problema.
Enzimoinmunoensayo (una prueba prescrita para el comercio internacional)

Los mtodos ELISAs para detectar anticuerpos contra BHV1 parecen estar reemplazando gradualmente
las pruebas NV. No se ha establecido un procedimiento ELISA estndar. Hay disponibles varios tipos de
ELISA, incluyendo ELISAs indirectos y de bloqueo. Los procedimientos indirectos son los de uso ms
comn. Existen diversas preparaciones comerciales ELISA, muchas de las cuales son tambin adecuadas
para detectar anticuerpos en la leche. Por razones de estandarizacin en un pas o estado, sera deseable
comparar la calidad de las preparaciones comerciales y probar cada lote respecto a criterios definidos
previamente en un laboratorio nacional de referencia, antes de su uso en otros laboratorios del pas.
Existen ciertas variaciones en los procedimientos para ELISA. Los ms comunes son: las preparaciones de
antgenos y los recubrimientos, la dilucin de la muestra de ensayo, el perodo de incubacin del antgeno
y la muestra de ensayo, y la solucin de substrato/cromgeno. Antes de su uso rutinario, un ELISA debera
validarse respecto a sensibilidad, especificidad y reproducibilidad. Con este fin, se debera probar un juego
de sueros bien definidos (por ejemplo, mediante la prueba NV) que fueran muy positivos, dbilmente
positivos y negativos.
A continuacin se presenta un ejemplo de procedimiento para un ELISA indirecto:
520
i)
Preparar el antgeno haciendo crecer BHV1 en cultivos celulares. Cuando se observa que se ha
desarrollado ECP, se congela el medio y las clulas a -20C. Despus de descongelar, el lisado
celular resultante se centrifuga durante 4 horas a 8.500 g. El precipitado que contiene el virus se
resuspende en un pequeo volumen de solucin salina tamponada con fosfato (PBS), se enfra con
hielo, y se rompe en un desintegrador ultrasnico. Despus, la preparacin de antgeno se centrifuga
10 minutos a 800 g y el sobrenadante se utiliza a una dilucin apropiada para recubrir las placas. En
la literatura publicada sobre el tema se pueden encontrar muchos mtodos alternativos de produccin
de antgeno.
ii)
Recubrir con antgeno los pocillos de la placa de microtitulacin aadiendo 100 l de antgeno diluido
(en 0,05 M de tampn carbonato, pH 9.6) a cada pocillo de la microplaca. Cerrar las placas con cinta,
incubar a 4C toda la noche o a 37C durante 1-2 horas, y guardar a -20C.
iii)
Antes de realizar la prueba, lavar las placas. Para evitar uniones inespecficas en la prueba, que
originan niveles altos de fondo, se puede necesitar un segundo recubrimiento con una protena no
relevante (por ejemplo, albmina). Aadir tampn, la muestra de suero, y los controles de sueros
positivo, dbilmente positivo y negativo. Normalmente las muestras de suero se diluyen de 1/10 a
1/100 en PBS con 0,05% de Tween 20. Agitar, sellar las placas e incubar durante 1 hora a 37C.
iv)
Lavar las placas cuidadosamente, aadir inmunoglobulina anti-bovina conjugada con peroxidasa de
rbano a una dilucin predeterminada e incubar de nuevo 1 hora a 37C.
v)
Aadir una solucin recin preparada de substrato/cromgeno (por ejemplo, tampn 0,1 M de citrato
fosfato, pH 4, que contenga 2, 2-azino-bis-[3-etilbenzotiazolina-6 cido sulfnico]). 2NH4 [ABTS;
0,5 mg/ml] y una solucin al 3% de H2O2 recin aadido [2 l/ml], e incubar por un tiempo apropiado.
vi)
Medir la absorbancia de las placas en un fotmetro de microplacas a la longitud de onda adecuada.
vii)
Una muestra de ensayo se considera positiva si tiene un valor de absorbancia 0,2 veces mayor que el
control de suero negativo. La prueba es vlida si los sueros positivo y dbilmente positivo son
positivos y si el suero negativo tiene un valor de absorbancia menor de 0,2. Las pruebas no vlidas
deben repetirse. Los lmites aceptables para los valores control y de corte deben determinarse para el
ensayo individual.
Enzimoinmunoensayo de bloqueo
El principio del ELISA de bloqueo o competitivo se basa en bloquear la unin del antgeno a un antisuero
contra BHV1 o a un MAb anti-BHV1 marcado con una enzima, mediante los anticuerpos presentes en la
muestra de prueba. La presencia de anticuerpos en la muestra de prueba bloquear la unin, originando
un descenso en el desarrollo del color despus de aadir la solucin de cromgeno/substrato. Una
comparacin entre ELISAs indirectos y ELISAs bloqueantes mostr que el ltimo tipo es por lo general ms
sensible (22): Recientemente, se han descrito gE-ELISAs que se pueden utilizar juntamente con vacunas
marcadoras para detectar el ganado infectado en poblaciones vacunadas (31, 34). En una prueba gEELISA, la leche puede reemplazar al suero (34).
c)
Estandarizacin
En cada prueba serolgica se deberan incluir controles adecuados de suero muy positivo, de suero
dbilmente positivo, y de suero negativo. En Europa, un grupo de cientficos encabezado por el grupo de
veterinarios de inseminacin artificial de la Unin Europea (EU) ha acordado recientemente utilizar un
suero muy positivo, uno dbilmente positivo y otro negativo para la estandarizacin de las pruebas sobre
BHV1 en los laboratorios que examinan rutinariamente muestras de centros de inseminacin artificial (23).
Estos sueros se han adoptado como estndares internacionales de la OIE para pruebas con BHV1 y estn
1
disponibles en los Laboratorios de Referencia de la OIE para RBI/VPI . Las pruebas ordenadas con fines
de mercado internacional (NV o ELISA) deben ser capaces de registrar como positivos tanto los
estndares positivos fuertes como los dbiles (o los estndares nacionales secundarios de potencia
equivalente).

En la actualidad se dispone de varias vacunas con BHV1 atenuado e inactivado. Las vacunas contienen cepas
de virus que por lo general han crecido durante mltiples pases en cultivo celular. Algunas de las cepas de virus
vacunales tienen un fenotipo sensible a la temperatura, es decir, no se multiplican a 39C o a temperaturas
superiores. Las vacunas atenuadas se administran intranasalmente o intramuscularmente. Las vacunas
inactivadas contienen altos niveles de virus inactivados o porciones de las partculas vricas (glicoprotenas)
suplementadas con un adyuvante para estimular una respuesta inmune adecuada. Las vacunas inactivadas se
administran intramuscularmente o subcutneamente.
En varios pases existen vacunas marcadoras. Estas vacunas marcadoras, atenuadas o inactivadas, se basan
en mutantes deleccionados o en una subunidad del virin, por ejemplo, la glicoprotena D. El uso de tales
vacunas marcadoras con pruebas diagnsticas paralelas permite distinguir entre el ganado infectado y el
ganado vacunado suministrando as las bases para nuevos programas de erradicacin del BHV1. Los
programas de vacunacin intensiva pueden reducir la prevalencia de animales infectados (3, 14), que puede ser
analizada por pruebas diagnsticas en paralelo. En situaciones donde resulte econmicamente justificable, los
animales infectados restantes podran ser eliminados si fuera necesario, lo que resultara en una regin libre de
BHV1. Algunos pases han apoyado recientemente tal programa de erradicacin y ya no permiten la vacunacin.
produccin de vacunas veterinarias. Las normas dadas aqu y en la Captulo I.1.7. pretenden ser de naturaleza
tipo general y se pueden suplementar con requisitos nacionales y regionales.
1.
Control de inculos
a)

La vacuna se prepara utilizando un sistema de lotes de inculo. Se debe documentar el origen, la historia
de los pases y las condiciones de mantenimiento del inculo primario de virus (MSV). En el MSV se debe
realizar una prueba de identidad del virus. El lote de inculo contiene cepas de BHV1 que se han atenuado
para originar una cepa viva vacunal. Las cepas se pueden atenuar por pases mltiples en cultivo celular,
por adaptacin del virus a crecer a bajas temperaturas (mutantes sensibles a la temperatura), o mediante
ingeniera gentica, por ejemplo seleccionando uno o ms genes del virus que no sean esenciales para su
replicacin. Debera haber algn medio de distinguir entre el virus vivo vacunal y el virus natural (por
ejemplo, mediante modelos de crecimiento especfico dependientes de la temperatura, o por anlisis del
polimorfismo en fragmentos de restriccin). Las cepas utilizadas para la preparacin de las vacunas
inactivadas no necesitan ser atenuadas. El lote de inculo debe carecer de contaminantes.
Se pueden obtener del Central Institute for Animal Disease Control, Infectious Diseases Section, P.O. Box 2004, 8203
AA Lelystad, The Netherlands, y de AFSSA Lyon, Laboratoire de pathologie bovine, 31 avenue Tony Garnier, BP 7033,
69342 Lyon Cedex 07, Francia.
521
b)
Mtodo de cultivo
Las clulas utilizadas para la produccin de vacunas se preparan tambin mediante un sistema de lotes de
inculo. El virus debe cultivarse en lneas celulares establecidas que se haya comprobado que resultan
adecuadas para produccin de vacunas, por ejemplo la lnea celular de Madin-Darby de rin bovino. Se
debe conocer la historia de la lnea celular. Debe estar libre de agentes indeseables y puede probarse para
capacidad oncognica.
c)

Cualquiera que sea el mtodo de preparacin del lote de inculo del virus vacunal, el lote de virus de
siembra destinado para su incorporacin a una vacuna viva debe ser eficaz, seguro y puro.
i)
Eficacia
Se debe demostrar en un experimento de desafo de la vacunacin en condiciones de laboratorio. Se
presentan varios ejemplos de normas en una monografa de la Farmacopea Europea (8). En
resumen, se administra la vacuna a cinco terneros seronegativos para BHV1, de 2-3 meses de edad.
Se mantienen dos terneros como control. Todos los terneros se inoculan intranasalmente 3 semanas
despus con una cepa virulenta de BHV1 que origina los sntomas tpicos de la enfermedad. Los
terneros vacunados no deben mostrar sntomas o solamente sntomas suaves. El ttulo mximo de
virus en la mucosa nasal de los terneros vacunados debe ser por lo menos 100 veces inferior al de
los terneros control. El perodo de excrecin del virus debe ser al menos 3 das ms corto en los
terneros vacunados que en los terneros control.
ii)
Inocuidad
Una cantidad de virus equivalente a diez dosis de vacuna debera (a) no inducir reacciones
localizadas o sistmicas significativas en terneros jvenes, (b) no causar infeccin fetal o aborto, y (c)
no revertir a la forma virulenta durante cinco pases seriados en terneros. Para una vacuna inactivada,
se suele administrar generalmente una dosis doble. La prueba de reversin a la virulencia no es
aplicable a las vacunas inactivadas.
iii)
Pureza
El lote de inculo se prueba para ausencia de virus extraos y para ausencia de contaminacin con
bacterias, hongos y micoplasmas. En las vacunas con BHV1 se deben excluir especficamente los
siguientes virus indeseables: adenovirus, virus de Akabane, coronavirus bovino, herpesvirus bovino
tipos 1, 2, 4 y 5, parvovirus bovino, virus respiratorio sincitial de los bvidos, rotavirus bovino, virus
vaccinia, y los virus de la enfermedad de Aujeszky, lengua azul, fiebre efmera bovina, leucemia
bovina, papiloma bovino, estomatitis popular bovina, diarrea vrica bovina, viruela vacuna, fiebre
aftosa o glosopeda, enfermedad nodular cutnea, fiebre catarral maligna, parainfluenza 3, rabia,
peste bovina, y estomatitis vesicular. Como el virus de la diarrea vrica bovina se ha encontrado con
frecuencia como contaminante de las vacunas, se debe tener especial cuidado para asegurar que
est ausente.
2.
Mtodo de fabricacin
Todas las substancias utilizadas en la produccin de las vacunas deben estar libres de contaminacin. Se
deben utilizar clulas que no tengan ms de 20 pases a partir del inculo inicial de clulas. El virus de inculo no
debera de tener ms de 5 pases a partir del MSV. Las cepas de virus vacunales obtenidas por ingeniera
gentica se tratan del mismo modo que las cepas atenuadas por mtodos convencionales. Cuando se crecen
suficientes clulas, se produce la infeccin de la lnea celular con el virus de la vacuna. La adicin de
antibiticos se reserva, por lo general, al medio lquido de cultivo. El sobrenadante se recoge cuando la
produccin de virus (antgeno) alcanza el mximo. Para las vacunas vivas, el sobrenadante se clarifica, se
mezcla con un estabilizador, se liofiliza y se envasa. Para la produccin de vacunas clsicas inactivadas, el
sobrenadante se homogeniza antes de aadir el agente inactivante para asegurar una inactivacin adecuada.
Despus del proceso de inactivacin se lleva a cabo una prueba para comprobar la inactivacin completa del
virus. La prueba consiste en efectuar al menos dos pases en clulas. La suspensin de virus inactivados se
mezcla despus con un adyuvante y se envasa. La produccin de vacunas debe seguir las directrices de
Buenas Prcticas de Produccin (GMP).
3.
Control interno
El inculo de clulas de trabajo y el inculo de virus de trabajo deben estar libres de contaminacin. Las clulas
deben tener su morfologa normal antes de inocular el virus. Se comprueban para ECP durante el cultivo. Las
clulas control no inoculadas deben mantener su morfologa hasta el tiempo de la recogida del material. Se
realiza una titulacin del virus en el sobrenadante recogido. Durante la produccin de vacunas inactivadas, se
realizan pruebas que aseguran la inactivacin. El material final debe ser probado para ausencia de
contaminantes.
522
4.
Control de lotes
Normalmente se realizan las siguientes pruebas en cada lote. Se pueden encontrar ejemplos de normas para
realizar el control de lotes en las directrices de la EU, la Farmacopea Europea y el Cdigo de Regulaciones
Federales del Departamento de Agricultura de los EE.UU.
a)
Esterilidad
No deben estar presentes bacterias, hongos, micoplasmas ni virus ajenos. Las pruebas de esterilidad y de
ausencia de contaminacin en los materiales biolgicos se describen en el Captulo I.1.5.
b)
Inocuidad
Una dosis doble de vacuna, para el caso de vacunas inactivadas, y una dosis diez veces superior a la
normal, para el caso de vacunas vivas, no debe producir efectos adversos en terneros jvenes que sean
seronegativos para BHV1.
c)
Potencia
Es suficiente probar un lote representativo para eficacia, como se describe en la Seccin C.1.c.i. Para
vacunas vivas, se debe determinar el ttulo de virus de cada lote y no debe ser superior a 1/10 de la dosis a
la que la vacuna es segura ni inferior al ttulo mnimo de distribucin. Para vacunas inactivadas, la potencia
se ensaya utilizando otro mtodo validado, por ejemplo la determinacin de la eficacia en terneros.
d)
Es suficiente probar este parmetro en el lote de inculo del virus de la vacuna. Una vacuna eficaz con
BHV1 debera inducir una inmunidad protectora por lo menos durante 1 ao, aunque muchas vacunas
existentes no han sido probadas al respecto.
e)
Estabilidad
Para vacunas vivas, se deben realizar titulaciones de virus pasados 3 meses de la fecha de caducidad que
se indica. Adems, se realizan pruebas para determinar el contenido en humedad, concentracin de
conservantes y pH. Para vacunas inactivadas, tambin se prueba la viscosidad y la estabilidad de la
emulsin.
f)
Conservantes
Debe demostrarse la eficacia de los conservantes y comprobarse su concentracin y persistencia durante
el perodo de validez. La concentracin debe acomodarse a los lmites de conservante establecidos.
g)
No se necesitan precauciones especiales. El BHV1 no es patgeno para el hombre.
5.
a)
Inocuidad
Cada producto debe ser seguro por lo menos en dos terneros susceptibles que reciban una dosis doble de
vacuna (vacunas inactivadas) o diez veces superior (vacunas vivas).
b)
Potencia
Ver Seccin C.4.c.
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* *
NB: Existen laboratorios de referencia de la OIE para la Rinotraqueitis bovina infecciosa/vulvovaginitis

pustular infecciosa (ver Cuadro en la parte 3 de este Manual de animales terrestres o consultar la pgina
web de la OIE para una lista actualizada: www.oie.int)
525
CAPTULO 2.3.6.
TRICOMONOSIS1
RESUMEN
La tricomonosis bovina venrea est causada por Trichomonas foetus, un protozoo flagelado.
Presenta una distribucin mundial y en cierta ocasin mostr una enorme importancia econmica
como causa de aborto e infertilidad, especialmente en vacas lecheras. En las reas del mundo
donde est ampliamente distribuido el uso de la inseminacin artificial, la prevalencia se encuentra
muy reducida, aunque todava presenta importancia en rebaos de vacas para carne o en otras
circunstancias donde no se utiliza la inseminacin artificial.
La transmisin de la enfermedad tiene lugar primariamente mediante el coito, aunque tambin
puede tener lugar la transmisin mecnica mediante instrumentos de inseminacin o el examen del
aparato genital. El microorganismo puede sobrevivir a 5 C en semen completo o diluido. Los toros
constituyen el reservorio principal de la enfermedad ya que tienden a ser portadores a largo plazo,
mientras que la mayora de las vacas eliminan la infeccin espontneamente. Por estas razones,
normalmente se prefieren las muestras procedentes de toros para llevar a cabo el diagnstico y
control de la enfermedad.
Identificacin del agente: Trichomonas foetus es un protozoo piriforme eucarita, flagelado, de
aproximadamente 8-18 m de largo y 4-9 m de ancho, con tres flagelos anteriores y uno
posterior, y una membrana ondulante. Los microorganismos se desplazan con un movimiento
rotatorio entrecortado y se observan en pruebas de cultivo de muestras prepuciales de toros
infectados y lavados vaginales o mucus cervico vaginal de las vacas infectadas, o, a veces, en los
fetos abortados. Los microorganismos pueden cultivarse in-vitro, y pueden observarse en un
portaobjetos hmedo o teido. El mtodo de diagnstico estndar para los toros implica la
recogida, examen y cultivo del esmegma del prepucio y el pene. El esmegma se puede recoger de
diferentes maneras, incluyendo el lavado prepucial o el rascado de la cavidad prepucial y el glande
del pene a nivel del frnix con una pipeta de inseminacin seca. Existen una variedad de medios
2
de cultivo in-vitro, aunque, ms recientemente, se ha introducido una prueba de cultivo campo
disponible comercialmente que permite el crecimiento de los tricomonas y el examen microscpico
directo.
Pruebas alternativas: La infeccin tambin puede detectarse mediante la reaccin de
amplificacin en cadena de la polimerasa (PCR). En el pasado se ha utilizado como prueba para
rebaos una reaccin de aglutinacin empleando mucus recogido a partir del cervix y un antgeno
preparado a partir de microorganismos cultivados. De manera similar se ha utilizado una prueba
intradrmica empleando un precipitado del organismo con cido tricloroactico.
Requisitos para las vacunas y los materiales de diagnstico: Se encuentra disponible
comercialmente una vacuna de clulas enteras muertas parcialmente eficaz bien como vacuna
3
monovalente, o como parte de una vacuna polivalente que contiene Campylobacter y Leptospira .
2
3
526
Nomenclatura de las enfermedades parasitarias: ver la nota en el Captulo 2.3.15. Tripanosomiasis (transmitida por la
mosca tse-tse).
Ensayo InPouchTM, BioMed Diagnostics, San Jos, California, Estados Unidos de Amrica (EEUU).
Trich Guard o Trich Guard V5-L, Fort Dodge Laboratories, Fort Dodge, Iowa, EEUU.
Captulo 2.3.6. Tricomonosis
A. INTRODUCCIN
La tricomonosis bovina venrea est causada por el protozoo flagelado Trichomonas foetus. Los hospedadores
naturales de T. foetus son el ganado vacuno (Bos taurus, B. Indicus). En el intestino del ganado bovino se
encuentran especies no patgenas de tricomonas; T. suis de los cerdos es indistinguible morfolgicamente,
serolgicamente y genticamente de T. foetus.
Trichomonas foetus es piriforme, con 8-18 m de largo y 4-9 m de ancho, con tres flagelos anteriores y uno
posterior y una membrana ondulante. Los microorganismos vivos se desplazan con un movimiento rotatorio
entrecortado y pueden detectarse mediante microscopa visible. Pueden utilizarse la microscopa de contraste de
fases o campo oscuro u otros mtodos para observar los detalles necesarios para la identificacin. Las
descripciones morfolgicas detalladas, incluidos los estudios de microscopa electrnica, han sido publicados por
Warton & Honigberg (47). Es importante diferenciar T. foetus de otros protozoos flagelados contaminantes que
pueden encontrarse presentes en el tracto reproductor bovino (3, 6, 33, 45). Una caracterstica importante es el
nmero de flagelos observados bajo iluminacin de contraste de fases, ya que puede ayudar a diferenciar
T. foetus de algunos flagelados bovinos que parecen similares. Se ha descrito una tcnica de tincin que puede
utilizarse para observar ms claramente la morfologa (25).
El microorganismo se multiplica mediante fisin binaria longitudinal; no existe reproduccin sexual y no se han
observado estadios del parsito resistentes al medio ambiente.
En unos primeros estudios se reconocieron tres serotipos basados en la aglutinacin (42): la cepa belfast,
descrita como predominante en Europa, Africa y EEUU (23); la cepa brisbane en Australia (12); y la cepa
manley, que ha sido descrita solamente en algunos brotes (42). Poco trabajo ms se ha realizado en este
campo. Necesita realizarse ms trabajo en el rea de comparar las caractersticas de crecimiento, la variacin
gentica y antignica y la patognesis de los aislados de T. foetus de diferentes zonas antes de que pueda
realizarse la designacin de cepa y serotipo con garantas.
Los microorganismos pueden cultivarse in vitro, preferiblemente en medio de Diamond (10), medio de Clausen
(28) o medio de Trichomonas, el cual se encuentra disponible comercialmente (40). En EEUU se ha desarrollado
una prueba de cultivo de campo que permite el crecimiento de los tricomonas y el examen microscpico directo
TM
sin aspiracin del inculo (41, 46) (InPouch TF, ver nota al pie 2).
La transmisin de la infeccin en condiciones naturales tiene lugar a travs del coito, mediante inseminacin
artificial o mediante el examen del aparato genital de las vacas. El lugar de la infeccin en los toros es
principalmente la cavidad prepucial (1, 35), y se observan pocas o ninguna manifestaciones clnicas. En los toros
mayores de 3-4 aos raramente tiene lugar la recuperacin espontnea y el toro se convierte en una fuente
permanente de infeccin. En los toros menores de 3-4 aos la infeccin puede ser transitoria.
Los microorganismos estn presentes en nmero pequeo en la cavidad prepucial de los toros, con alguna
concentracin en el frmix y alrededor del glande del pene (20). El toro infectado crnicamente no muestra
lesiones patentes. En la vaca, la lesin inicial es una vaginitis, que puede continuar en los animales gestantes
con la invasin del cervix y el tero. Pueden aparecer varias secuelas, incluyendo una placentitis que lleva a un
aborto prematuro (1-16 semanas), flujo uterino y piometra. En algunos casos, la gestacin no finaliza con el
aborto a pesar de la infeccin y nace un ternero normal a trmino. En cuanto al rebao, las vacas presentan
estros irregulares, flujo uterino, piometra y aborto prematuro (1, 15, 42). Generalmente, la vaca se recupera y
despus de la infeccin o el aborto se hace inmune, al menos durante esa temporada de cra (1, 15, 44).
1.
a)
Identificacin del agente mediante examen directo del cultivo (el ensayo prescrito para el
comercio internacional )
El diagnstico provisional de la tricomonosis se basa en la historia clnica, sntomas de aborto prematuro,
revisiones repetidas, o ciclos de celo irregulares. La confirmacin depende de la demostracin de los
microorganismos en el lquido placentario, el contenido estomacal de los fetos abortados, los lavados
uterinos, el flujo piometral o el mucus vaginal. En los rebaos contaminados, el material ms fiable para el
diagnstico son los lavados prepuciales o vaginales, o los raspados (24, 29, 31, 41). En Europa Occidental,
las Directivas de la Unin Europea (UE) requieren la recogida de lavados prepuciales, o, en el caso de los
animales hembra, una prueba de aglutinacin de mucus vaginal (13).
527
El nmero de microorganismos vara en dependencia con diferentes situaciones. Son numerosos en los
fetos abortados, en el tero se mantienen varios das despus del aborto y en las vacas infectadas
recientemente, son muy abundantes en el mucus vaginal 12-20 das despus de la infeccin. A partir de
entonces el nmero de microorganismos vara de acuerdo con la fase del ciclo del celo, siendo el ms
elevado 3-7 das despus de la ovulacin. Los microorganismos de T. foetus estn presentes en el toro
infectado en un nmero muy alto en la mucosa del prepucio del pene, aparentemente sin invadir los tejidos
submucosos. Generalmente, se recomienda dejar pasar 1 semana despus de la ltima revisin antes de
tomar una muestra prepucial.
Recogida de muestras
Se han descrito varias tcnicas para recoger muestras prepuciales de los toros o muestras vaginales de las
vacas. Es importante evitar la contaminacin fecal, ya que se pueden introducir protozoos intestinales que
pueden confundirse con T. foetus (45). La contaminacin de las muestras debera minimizarse eliminando
el material externo y los pelos sucios de alrededor del orificio prepucial o de la vulva; sin embargo, debe
evitarse la limpieza del rea, concretamente con desinfectantes, ya que puede disminuir la sensibilidad del
diagnstico. En los toros pueden recogerse las muestras raspando la mucosa prepucial y del pene con una
pipeta de inseminacin artificial (31, 41) o una escobilla metlica (30, 31), mediante lavado prepucial (41), o
lavando la vagina artificial despus de la recogida del semen (19). Esta ltima tcnica no es recomendable
ya que su sensibilidad puede ser menor (19). Las muestras de vacas se recogen mediante lavado de la
vagina o raspando el crvix con una pipeta de inseminacin artificial o una escobilla metlica (24, 27).
Cuando las muestras deben enviarse a un laboratorio y no pueden recogerse en 24 horas, debera
emplearse un medio de transporte (por ejemplo medio de Winters, solucin tamponada salina con suero
bovino fetal al 5%, o leche desnatada, con o sin antibiticos [37] o en tioglicolato [5]), o la bolsa plstica de
cultivo de campo (5, 46). Los microorganismos deben protegerse durante el transporte de la exposicin a la
luz y de las temperaturas extremas, las cuales deberan permanecer por encima de los 5C y por debajo de
los 38C (5).
Cultivo
Deberan prepararse cultivos cuando los microorganismos son demasiado escasos para una deteccin
directa y una identificacin precisa. Normalmente es necesario el cultivo de los microorganismos porque, en
la mayora de los casos, el nmero de microorganismos no es suficientemente grande para hacer un
diagnstico positivo mediante un examen directo. Pueden utilizarse varios medios. Los medios elegidos son
el medio CPLM (cistena/peptona/infusin de hgado y maltosa), el medio BGPS (extracto de
carne/glucosa/peptona y suero), el medio de Clausen (Neopeptna-Lemco-extracto de hgado y glucosa),
medio Diamond para tricomonas, medio Oxoid para Trichomonas y los sistemas de cultivo comerciales (11,
28, 32, 40). La inoculacin de las muestras en los medios de cultivos debera realizarse lo antes posible
despus de la recogida. Es necesario procesar la muestra mediante centrifugacin en las muestras
recogidas mediante lavado prepucial. Entonces se examina el sedimento y se inocula en medios de cultivo.
Tambin es importante asegurarse de que los medios de cultivo se utilicen antes de la fecha establecida de
caducidad, ya que muchos medios no son estables. La calidad del agua empleada es importante, y puede
aadirse a los medios un antifngico para controlar el crecimiento de los hongos.
La deteccin inicial de los microorganismos puede realizarse mediante microscopa de campo claro, en un
portaobjetos hmedo preparado directamente a partir de la muestra o el cultivo, o a travs de la pared
TM
TM
(sistema InPouch
TF, ver nota al pie 2) utilizando el alfiler de plstico
plstica del InPouch
proporcionado especialmente, o los microorganismos pueden verse en un microscopio de campo claro
estndar utilizando un aumento de 100 o superior. Puede ser til un microscopio invertido para examinar los
tubos que contienen medio de cultivo (de Diamond). Los medios de cultivo deberan examinarse
microscpicamente despus de la inoculacin en intervalos desde el da 1 al da 7 (26). Los
microorganismos pueden identificarse en base a los rasgos morfolgicos caractersticos. Los
microorganismos con forma de pera tienen tres flagelos anteriores y uno posterior, y una membrana
ondulante que se extiende cerca del extremo posterior de la clula. Tambin tienen un axostilo que
normalmente se extiende ms all del extremo posterior de la clula. La microscopa de contraste de fases
es muy valiosa para revelar estos rasgos, o tambin puede emplearse un procedimiento de tincin
desarrollado recientemente (25). Ambas tcnicas funcionan bien cuando se encuentran presentes un
nmero relativamente alto de microorganismos, especialmente la tcnica de tincin.
Procedimientos de cultivo
Medio de Diamond modificado
El material de vidrio utilizado para el cultivo debera lavarse en agua destilada (evitando el empleo de
detergentes). El medio de Diamond modificado consiste en: 2 g de tripticasa de peptona, 1 g de extracto de
528
levadura, 0,5 g de maltosa, 0,1 g de clorhidrato de L-cistena, y 0,02 g de cido L-ascrbico; y se lleva hasta
90 ml con agua destilada que contiene, de cada uno, 0,08 g de K2HPO4 y KH2PO4, y se ajusta hasta pH 7,2
-7,4 con hidrxido sdico o cido clorhdrico. Despus de la adicin de 0,05 g de agar, el medio se
autoclava durante 10 minutos a 121 C, se deja enfriar hasta los 49C, y entonces se aaden
aspticamente 10 ml de suero bovino inactivado (inactivado mediante calentamiento hasta 56C durante 30
minutos), 100.000 unidades de penicilina G cristalizada y 0,1g de sulfato de estreptomicina. El medio se
reparte aspticamente en alicuotas de 10 ml en viales estriles de 16 x 125 mm con tapn de rosca, y se
refrigeran a 4C hasta su uso. Los medios deberan cultivarse hasta 7 das y las muestras examinarse en
intervalos diarios (1, 26). La incorporacin de agar en el medio limita a los microorganismos contaminantes
en su mayora a la porcin superior del tubo del ensayo, mientras que ayuda a mantener las condiciones
microaerfilas en el fondo del tubo, donde los tricomonas se encuentran en grandes cantidades.
Ensayo de cultivo de campo (InPouchTM TF)
Cuando se requiere una combinacin de comodidad y sensibilidad puede utilizarse una prueba de cultivo de
TM
campo (sistema InPouch TF) (1, 4, 32, 41, 46). Consiste en una bolsa de plstico transparente y flexible
con dos cmaras. La cmara superior contiene un medio especial en el que se introduce la muestra. Las
muestras de campo para la inoculacin directa se recogeran normalmente mediante la tcnica de raspado
prepucial (1, 41). Las muestras recogidas mediante lavado prepucial requieren centrifugacin antes de
introducir el sedimento en la cmara superior. Despus de mezclar, el medio se introduce en la cmara
inferior, y entonces la bolsa se sella y se incuba a 37C. El examen microscpico de los tricomonas puede
realizarse directamente a travs de la bolsa plstica (4). Los resultados del diagnstico con muestras de
TM
toros utilizando bien el medio de Diamond o el sistema InPouch TF han mostrado que los dos mtodos
ofrecen resultados comparables o que hay algunas ventajas (en comodidad y resultados en el ensayo) con
TM
el sistema InPouch TF (4, 5, 24, 32, 41).
Sensibilidad y especificidad globales del ensayo de cultivo e identificacin
Cualquier estimacin de la sensibilidad y especificidad diagnstica del ensayo de cultivo e identificacin

depender de la eficacia en la recogida de la muestra, el manejo y el procesamiento, as como la
TM
composicin y calidad del medio de cultivo. Se ha estimado que la sensibilidad del sistema InPouch TF en
los toros es de un 92% (95% de intervalo de confianza, 84-96%) (31). Para el Diamond y otros medios
relacionados las estimaciones han sido variables, debido posiblemente a la variacin en la composicin y la
preparacin, aunque oscilan entre el 78% y el 99%. Hasta hace poco se ha asumido que la especificidad
del ensayo de cultivo era del 100%, pero se trata probablemente de una sobreestimacin.
Cada muestra tomada a partir de un toro en concreto que se sabe que est infectado no dar
necesariamente un resultado de cultivo positivo. Incluso con las condiciones ptimas de muestreo,
transporte, cultivo e identificacin, debera obtenerse ms de una muestra negativa antes de que exista una
certeza razonable de que el animal no est infectado. Deberan calcularse valores de prediccin negativos
utilizando una estimacin de la sensibilidad del ensayo de diagnstico, y la probabilidad de infeccin preensayo del animal (31), para estimar la probabilidad de que un animal no se encuentre infectado. Existen
pocas estimaciones de la sensibilidad de diagnstico de la muestra estndar y el mtodo de cultivo con las
muestras de las hembras.
La infeccin en las hembras se elimina normalmente entre 90-95 das, de manera que puede ser difcil
aislar microorganismos a partir de animales en fases tardas de su infeccin. En vacas jvenes infectadas
experimentalmente, se consigui una sensibilidad aparente del 88% a lo largo de un periodo de
TM
10 semanas despus de la infeccin utilizando el mtodo de cultivo InPouch TF (24).
El diagnstico de un aborto inducido por T. foetus puede ser relativamente fcil cuando se recupera un feto
abortado, debido al gran nmero de microorganismos demostrable en el contenido abomasal del feto o en
los lquidos de la placenta. Adems, pueden utilizarse tcnicas inmunohistoqumicas en los fetos abortados
para demostrar microorganismos de T. foetus invasores de tejidos.
b)

Las tcnicas moleculares que utilizan la tecnologa de la reaccin en cadena de la polimerasa (PCR) han
sido aprovechadas para la identificacin de T. foetus (14, 21). El desarrollo de un ensayo diagnstico de
PCR ofrece varias ventajas potenciales, incluyendo una sensibilidad analtica aumentada, un tiempo de
diagnstico ms rpido, y el hecho de que los microorganismos de la muestra recogida no necesitan ser
viables. Investigaciones iniciales (14, 21) demostraron que los cebadores de ADN son capaces de detectar
un nmero muy bajo de parsitos a partir de cultivos de laboratorio del organismo, sin la presencia de
material prepucial. Sin embargo, en las muestras prepuciales se requiere un nmero ms elevado de
parsitos para proporcionar un resultado positivo del PCR; ello es debido probablemente a la inhibicin por
529
componentes del esmegma prepucial. Se han descrito varias tcnicas de extraccin del ADN (14, 21, 34), y
es probable que la sensibilidad del ensayo diagnstico se encontrar influida por la eficiencia del mtodo de
extraccin, y los procedimientos para superar a los inhibidores contaminantes. Se ha estimado que la
TM
sensibilidad diagnstica de los ensayos de PCR es similar a la del sistema de cultivo InPouch TF (14, 21).
Sin embargo, se han analizado demasiado pocas muestras a partir de una poblacin pequea de toros
infectados como para establecer un clculo firme de la sensibilidad.
La especificidad de diagnstico del ensayo de PCR depende de la especificidad de los cebadores. Un grupo
de cebadores (21) origin productos no especficos de tamao similar en aproximadamente un tercio de las
muestras control negativo. Una pareja de cebadores basados en la secuencia 5.8s del rRNA han
demostrado una buena especificidad de diagnstico en muestras de animales negativos (14), aunque se
necesita ms trabajo con estos cebadores empleando diferentes poblaciones de animales. Estos cebadores
rinden productos de amplificacin a partir de algunos flagelados cercanos y relacionados (Trichomonas
suis, T. monilensis, y un tricomonas de los gatos) que son indistinguibles de los de T. foetus (14, 18). Es
posible que algunas de estas especies sean sinnimos de T. foetus. Un trabajo reciente ha demostrado que
estos cebadores pueden utilizarse para distinguir entre T. foetus y tricomonas que no son T. foetus, y que a
veces se encuentran en muestras prepuciales (3, 6, 33). Las tcnicas basadas en el ADN tienen potencial
como un ensayo primario o auxiliar (3, 6, 14, 29, 34). Aunque esta tecnologa representa una esperanza en
la investigacin, es necesario realizar ms trabajos para evaluar y validar su aplicacin en el diagnstico
clnico de las infecciones por T. foetus, antes de sustituir al mtodo de cultivo como el ensayo diagnstico
rutinario.
2.
Ensayos alternativos
En los aos 40 se desarrollaron pruebas de aglutinacin de mucus e intradrmicos, y todava encuentran un uso
limitado, aunque restringen su utilidad problemas de sensibilidad y especificidad. Se estn desarrollando
actualmente otros ensayos inmunolgicos basados en el enzimoinmunoensayo (ELISA) (1, 17). Las tcnicas
inmunohistoqumicas que utilizan anticuerpos monoclonales han puesto de manifiesto microorganismos de
T. foetus en tejidos fijados con formaldehdo (38).
a)
Prueba de aglutinacin de mucus

En los aos 40 se desarroll una prueba de aglutinacin de mucus (23, 26) que detecta aproximadamente
un 60% de las vacas infectadas de forma natural, con niveles de anticuerpos que varan de acuerdo con la
fase del estro. Las muestras del mucus se recogen a partir de la regin cervical de la vagina,
preferiblemente unos pocos das despus del estro. Los anticuerpos aparecen en el mucus cervical
aproximadamente 6 semanas despus de la infeccin, y persisten durante varios meses. Los anticuerpos
tambin se pueden encontrar en las secreciones prepuciales (39, 43). El ensayo de aglutinacin del mucus
es ms til como un ensayo de rebao, siendo capaz de detectar infecciones latentes o eliminadas
recientemente. Es especfico y no da reaccin cruzada con Campylobacter foetus o Brucella abortus,
aunque carece de sensibilidad.
Para tomar la muestra cervical debera utilizarse un tubo de cristal de 30 cm de longitud, 9 mm de dimetro,
y doblado en un ngulo de 150C a aproximadamente 9 cm de un extremo, o una pipeta de inseminacin
artificial. No debera utilizarse aquel mucus que contenga sangre, y el animal debera muestrearse de
nuevo. El suero contiene anticuerpos no especficos y har que tenga lugar la aglutinacin. El mucus se
diluye 1/5 con suero fisiolgico salino y se emulsiona en un tubo de Griffith. Se preparan muestras por
duplicado diluidas 1/10 y 1/20, pipeteando 2 ml de mucus y 2 ml de agar fundido (56C en un bao con
agua) en los tubos para la dilucin 1/10, y 1ml de mucus, 1 ml de tampn salino y 2 ml de agar fundido para
la dilucin 1/20. Tambin se preparan controles por duplicado que contienen 2 ml de tampn salino y 2 ml
de agar fundido. Todos los tubos se mantienen durante la mezcla en un bao con agua a 56C y entonces
se vierten individualmente en placas de Petri de 5 cm y se dejan enfriar. El antgeno para el ensayo se
prepara aadiendo lentamente un cultivo de tricomonas a una mezcla 2/1 de tampn salino y glucosa al 1%
para alcanzar una concentracin de aproximadamente 100.000 microorganismos/ml (aproximadamente seis
tricomonas/campo del microscopio a x400). A continuacin, se aaden 1,5 ml de antgeno a cada placa de
Petri, y las placas se incuban durante 1,5 horas a 37C, y se dejan a temperatura ambiente durante
1,5 horas ms. Se considera positiva la aglutinacin a una dilucin de 1/10.
b)
Ensayo intradrmico Tricin

Se ha descrito un ensayo intradrmico para el diagnstico de tricomonosis bovina (22). El lugar de
inyeccin es en la piel del cuello, parecido al lugar que se utiliza en la prueba de la tuberculina. Se inyecta
intradrmicamente una dosis de 0,1 ml del antgeno Tricin y la reaccin se mide 30-60 minutos ms tarde.
La reaccin consiste en un halo superficial que se observa visualmente y muestra un incremento >2 mm en
el grosor de la piel.
530
c)
Inmunohistoqumica en tejidos
En el feto abortado no existen lesiones especficas macroscpicas o microscpicas, y para realizar el
diagnstico es necesaria la identificacin de los microorganismos. Se ha descrito una tcnica
inmunohistoqumica para detectar T. foetus en la placenta y pulmones fetales de abortos bovinos fijados
con formaldehdo e incluidos en parafina empleando un anticuerpo monoclonal (Mab) (38). La tincin
4
inmunohistoqumica se realiza utilizando un sistema de marcaje con estreptavidina/biotina disponible
comercialmente y un Mab (34.7C4.4) frente a T. foetus. En el protocolo, secciones de 4 m desparafinadas
se incuban con el anticuerpo despus de bloquear con un suero de cabra no inmune. Despus de tres
lavados en tampn las secciones se incuban durante 30 minutos a 37C con inmunoglubulina biotinilada de
cabra anti-ratn y anti-conejo. Despus de tres lavados adicionales en tampn, la estreptavidina marcada
con peroxidasa se aplica durante 30 minutos a 37C, y la actividad enzimtica se diluye con AEC (3-amino9-etilcarbazol) al 3% en N,N dimetilformamida. Las secciones se tien por contraste con hematoxilina Gill II
durante 3 minutos, se lavan y se aclaran en tampn durante 1 minuto. Este mtodo se ha utilizado para
diagnosticar abortos causados por T. foetus.

Las vacunas de clulas completas para vacas han mostrado ofrecer proteccin, y se encuentran disponibles
comercialmente (9) bien como una bacterina monovalente, o como parte de una vacuna polivalente que
tambin contiene Campylobacter y Leptospira spp. (vacuna CL) (1) (ver nota al pie 3). Estos productos muestran
eficacia en la hembra pero no en el toro (2). Este resultado contrasta con los primeros estudios en Australia en
los cuales se consigui la proteccin o incluso la eliminacin en toros que recibieron fracciones de membrana o
glicoprotena de T. foetus (7, 8). Se han puesto de manifiesto anticuerpos especficos en el suero y el mucus
vaginal de vacas jvenes inoculadas con una vacuna que contiene T. foetus (17). En este estudio, una vacuna de
clulas muertas parcialmente efectiva no previno la infeccin, pero pareci permitir la desaparicin de la infeccin
en hembras vacunadas antes del momento de la gestacin en que el feto se encuentra generalmente en un
mayor riesgo de aborto. Se estn buscando ms vacunas efectivas que hagan uso de antgenos superficiales de
membrana de T. foetus , y presentan el potencial de una vacuna recombinante (9, 16).
La vacuna de clulas enteras se produce cultivando T. foetus (cultivo VMC-84) en medio modificado de Diamond
(9), y congelando el cultivo a 20C durante 60 minutos. Despus de descongelar se aade una suspensin de 5
7
x 10 microorganismos/ml en tampn salino fosfato a la vacuna CL.
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*
* *
533
CAPTULO 2.3.7.
ANAPLASMOSIS BOVINA
RESUMEN
La anaplasmosis bovina es consecuencia de la infeccin con Anaplasma marginale. Se conoce
desde hace tiempo una segunda especie, A. centrale. No est claro si representa una verdadera
especie separada. Anaplasma marginale es responsable de casi todos los brotes de la enfermedad
clnica. El microorganismo se clasifica en el gnero Anaplasma, que pertenece a la familia
Anaplasmataceae del orden Rickettsiales. Genticamente, A. marginale encaja dentro del
genogrupo II de las Ehrlichiae.
Los signos caractersticos de la anaplasmosis son anemia e ictericia, pero la enfermedad clnica
solo se puede confirmar por identificacin del organismo. Una vez infectado, el ganado puede
permanecer toda la vida como portador, y la identificacin de estos animales depende de la
deteccin de anticuerpos especficos mediante pruebas serolgicas o del ADN de las rickettsias
mediante tcnicas de amplificacin.
Identificacin del agente: El examen microscpico de sangre o de frotis de rganos con tincin
de Giemsa es el mtodo ms comn para identificar Anaplasma en animales con infeccin clnica.
En estos frotis, A. marginale aparece dentro de los eritrocitos como cuerpos densos y redondeados
de 0.3-1.0 m de dimetro, la mayor parte de ellos situados en la zona marginal del eritrocito o en
su proximidad. Anaplasma centrale es aparentemente similar, pero la mayor parte de los
microorganismos se sitan lejos del margen del eritrocito. En algunos pases existen colorantes
comerciales que permiten una tincin rpida de Anaplasma.
Es importante que los frotis se hagan bien y estn exentos de material extrao. Los frotis de
material de ganado vivo deberan prepararse, con preferencia, de sangre obtenida de la vena
yugular o de algn otro gran vaso. En el caso de diagnosis post-mortem, los frotis deben proceder
de rganos internos (incluyendo hgado, rin, corazn y pulmones) y de la sangre retenida en
vasos perifricos. Esto ltimo es particularmente deseable si el estado de descomposicin,
despus de la muerte, es avanzado.
Pruebas serolgicas: Las pruebas serolgicas ms utilizadas han sido la fijacin del
complemento (FC) y las pruebas de aglutinacin en placa. Sin embargo, datos recientes confirman
que la prueba FC presenta una sensibilidad baja (20%) que resulta inaceptable para la
identificacin de ganado con infeccin persistente. Por consiguiente la prueba FC debe
considerarse como una prueba poco fiable para certificar el estado de animales individuales. Para
la deteccin de animales portadores se ha demostrado que un enzimoinmunoensayo competitivo
(C-ELISA), disponible comercialmente, presenta una sensibilidad muy mejorada (96%). Tambin
pueden utilizarse pruebas ELISA indirectas, ELISA puntuales y de inmunofluorescencia indirecta.
Se han utilizado pruebas experimentales basadas en el cido nucleico, que son capaces de
detectar la presencia de una infeccin de bajo nivel en ganado portador y en las garrapatas que
actan como vectores. Cuando se utilizan para el diagnstico pruebas basadas en la reaccin en
cadena de la polimerasa est justificada una cierta precaucin, ya que se necesita una reaccin
combinada para identificar portadores de bajo nivel y puede tener lugar una amplificacin
inespecfica.
Requisitos para las vacunas y los materiales de diagnstico: En varios pases se usan
vacunas vivas para proteger el ganado contra la infeccin por A. marginale. La vacuna que
contiene A. centrale es de uso ms amplio y confiere proteccin contra cepas virulentas de A.
marginale.
534
Captulo 2.3.7. Anaplasmosis bovina
Se dispone de vacuna contra Anaplasma centrale en forma refrigerada y congelada. El control de

calidad es muy importante ya que pueden estar presentes en el ganado donador otros agentes
transmisibles por la sangre que pueden contaminar las vacunas y tener una diseminacin amplia.
Por esta razn se recomienda la vacuna congelada que permite un control de calidad posterior a la
produccin, lo que limita el riesgo de contaminacin con otros patgenos.
Las vacunas contra Anaplasma centrale no son completamente seguras. Una recomendacin
prctica es limitar su uso, en la medida de lo posible, a terneros, pues la inmunidad inespecfica
reducir el riesgo de algunas reacciones vacunales que pueden requerir tratamiento con
tetracicilina o imidocarb. La inmunidad parcial se desarrolla en 6-8 semanas y dura varios aos
despus de una nica vacunacin.
A. INTRODUCCIN
Los brotes de anaplasmosis bovina se deben normalmente a la infeccin por Anaplasma marginale. Anaplasma
centrale produce una anemia moderada, pero los brotes en el campo son muy raros. En algunos aislamientos de
A. marginale se han descrito estructuras adicionales asociadas con los cuerpos de Anaplasma (17); aunque este
parsito se ha denominado A. caudatum, no se considera como una especie separada.
Anaplasma marginale se presenta en la mayor parte de los pases tropicales y subtropicales, y en algunas
regiones ms templadas. Anaplasma centrale se describi por vez primera vez en Sudfrica. Desde entonces el
organismo ha sido importado en otros pases incluyendo Australia y algunos pases de Sudamrica, Sudeste
asitico y Oriente Medio- para ser utilizado como vacuna contra A. marginale.
Las especies de Anaplasma se consideraron en principio como protozoos parsitos, pero la investigacin
posterior revel que no posean atributos que justificaran esta descripcin. Desde 1957 se han clasificado en la
familia Anaplasmataceae del orden Rickettsiales. Recientemente se ha propuesto una reorganizacin de la
familia, que en el pasado inclua los gneros Anaplasma, Aegyptianella, Haemobartonella y Eperythrozoon (31),
basndose en una combinacin del anlisis de secuencias del ARN ribosmico 16 S, de groesI, y del gen de la
protena superficial (6,37). En la familia Anaplasmataceae reorganizada se incluye toda la subdivisin alfa de
Proteobacterias que pertenecen a los gneros Ehrlichia, Anaplasma, Cowdria, Wolbachia y Neorickettsia,
reteniendo provisionalmente a Aegyptianella. Adems, el gnero Anaplasma se ha ampliado hasta incluir
Ehrlichia phagocytophila, Ehrlichia bovis y Ehrlichia platys, con la nueva designacin de Anaplasma
phagocytophila que incluye tanto Ehrlichia equi como la Ehrlichia del agente HGE. Los gneros
Haemobartonella y Eperythrozoon se consideran en la actualidad ms prximos a los micoplasmas.
Las especies de Anaplasma se trasmiten mecnica o biolgicamente por insectos vectores. Una revisin basada
en un estudio cuidadoso de experimentos de transmisin presenta una lista de 14 garrapatas diferentes que han
sido descritas como capaces de transmitir experimentalmente A. marginale (13). stas son: Argas persicus,
Ornithodoros lahorensis, Boophilus annulatus, B. decoloratus, B. microplus, Dermacentor albipictus,
D. andersoni, D. occidentalis, D. variabilis, Hyalomma excavatum, Ixodes ricinus, Rhipicephalus bursa,
R. sanguineus and R. simus. Los autores concluyeron que algunos de estos resultados, como los de R. bursa,
H. excavatum y O. lahorensis no son muy convincentes y que las garrapatas identificadas como A. persicus eran
probablemente A. sanchezi o A. radiatus. Adems, Rhipicephalus e. evertsi y Hyaloma m. rufipes se han descrito
como vectores experimentales en Sudfrica (28). La transmisin intra o interespecfica es comn, incluso en las
especies de Boophilus de un solo hospedador. Las garrapatas macho pueden ser particularmente importantes
como vectores .La demostracin experimental de la implicacin de un vector no implica necesariamente que
tenga un papel en la transmisin en condiciones de campo. Sin embargo, las especies de Boophilus son
claramente vectores importantes de la anaplasmosis en pases tales como Australia o Sudfrica, y algunas
especies de Dermacentor son vectores eficaces en los Estados Unidos de Amrica (USA).
Otros artrpodos picadores muy diversos se han considerado como vectores mecnicos, particularmente en
USA. Se ha demostrado la transmisin experimental con ciertas especies de Tabanus (mosca del caballo) y con
mosquitos del gnero Psorophora (30). La importancia de los insectos picadores en la transmisin natural de la
anaplasmosis no est bien documentada y parece variar mucho de una regin a otra. Anaplasma marginale
puede transmitirse tambin con facilidad durante la vacunacin contra otras enfermedades, a menos que se
utilice una aguja nueva o esterilizada para inyectar a cada animal. Se ha descrito una transmisin similar por
medio de instrumentos quirrgicos no esterilizados.
Los principales vectores de A. centrale parecen ser garrapatas de hospedadores mltiples, propias de frica,
como R. rimus. No se ha demostrado que la garrapata comn de los bvidos (B. microplus) sea un vector. Esto
es importante porque A. centrale se utiliza como vacuna en regiones infestadas por B. microplus.
535
Los sntomas clnicos ms marcados de la anaplasmosis son anemia e ictericia, la ltima con aparicin tarda en
la enfermedad. No se presenta hemoglobinemia ni hemoglobinuria, lo que puede ayudar al diagnstico
diferencial entre anaplasmosis y babesiosis, que a menudo es endmica en las mismas regiones. No obstante, la
enfermedad solo se puede confirmar por identificacin del microorganismo causante.
1.
Las muestras obtenidas a partir de ganado vivo deben incluir frotis finos de sangre y sangre recogida con
anticoagulante. Los frotis finos de sangre, secados con aire, se mantienen de modo satisfactorio a temperatura
ambiente por lo menos 1 semana. Las muestras de sangre con coagulante deberan mantenerse a 4C a menos
que se lleve al laboratorio en unas pocas horas. Esta muestra es til para preparar frotis frescos si los anteriores
no fueran satisfactorios. Adems un cierto volumen pequeo de clulas y/o un recuento de eritrocitos puede
ayudar a poner de manifiesto la implicacin de Anaplasma cuando en los frotis se detecta solo un nmero
pequeo de parsitos, como puede ocurrir en la fase de recuperacin de la enfermedad.
En contraste con Babesia bovis, Anaplasma no se acumula en los capilares, de modo que es apropiada la
sangre de la yugular u otro gran vaso. Debido a la morfologa poco diferencial de Anaplasma, es esencial que los
frotis estn bien preparados y libres de substancias extraas, pues las partculas de restos pueden confundir la el
diagnstico. Las extensiones gruesas de sangre, que se utilizan en el diagnstico de la babesiosis, no son
apropiadas para el diagnstico de la anaplasmosis, porque Anaplasma es difcil de identificar una vez que se
separa de los eritrocitos.
Las muestras obtenidas de animales muertos deben ser frotis finos, secados al aire, del hgado, rin, corazn y
pulmones y de un vaso sanguneo perifrico. ste ltimo se recomienda, en particular, si hay un retraso notable
antes del examen post-mortem porque, en tales circunstancias, la contaminacin bacteriana en los frotis de los
rganos puede conducir a una identificacin equvoca de Anaplasma. Los frotis de cerebro, que son tiles en el
diagnostico de algunas formas de babesiosis, no tienen valor directo en el diagnstico de la anaplasmosis (14),
aunque deberan incluirse para el diagnstico diferencial cuando sea pertinente.
Para la preparacin de frotis se requiere la sangre de rganos, mejor que los tejidos de los rganos per se,
porque el objetivo es ser capaz de examinar microscpicamente eritrocitos intactos para la presencia de
Anaplasma. Los frotis derivados de sangre de rganos se mantienen satisfactoriamente durante varios das a
temperatura ambiente (14).
Los frotis de sangre y de los rganos se fijan 1 minuto con metanol absoluto y se tien con 10% de colorante de
Giemsa durante 30 minutos. Despus de la tincin, los frotis se lavan tres o cuatro veces con agua de grifo para
eliminar el colorante adherido y luego se secan al aire. Los frotis se examinan con aceite de inmersin a un
aumento de 700-1.000 x.
En los frotis teidos con Giemsa, A. marginale aparece como cuerpos densos, redondeados y muy coloreados
dentro de los eritrocitos, de aproximadamente 0,3-1,0 m de dimetro. La mayor parte de estos cuerpos se
localizan en el margen del eritrocito o en su proximidad. Esta caracterstica diferencia A. marginale de
A. centrale, presentando en este ltimo caso los microorganismos una localizacin ms centrada en el eritrocito.
1
En algunos pases , se dispone de colorantes comerciales para tincin rpida de Anaplasma.
El porcentaje de eritrocitos infectados vara segn la fase y la gravedad de la enfermedad. Con A. marginale
pueden presentarse parasitemias mximas que superan el 50%. Durante los perodos de alta parasitemia, son
comunes las infecciones mltiples de eritrocitos individuales.
La infeccin se hace microscpicamente visible en 2-6 semanas despus de la transmisin. Durante la
enfermedad clnica, la parasitemia se duplica aproximadamente cada da hasta los 10 das, y luego decrece a
una velocidad similar. Puede persistir durante algunas semanas una anemia muy fuerte despus de que los
parsitos lleguen a ser virtualmente indetectables en los frotis. Despus de la recuperacin de la infeccin inicial,
la mayor parte del ganado permanece con infeccin latente durante el resto de su vida.
Para detectar Anaplasma en frotis realizados post-mortem se puede utilizar la tincin con anticuerpos
fluorescentes como una tcnica alternativa. Johnston et al. (14) han descrito un procedimiento de
inmunofluorescencia directa para el diagnstico post-mortem de anaplasmosis. Aunque parece ser ms sensible
que la tincin con Giemsa, la fluorescencia inespecfica es un problema importante.
536
Los colorantes rpidos incluyen Camco-Quick y Diff-Quick, Baxter Scientific Products, McGaw Park, Illinois, USA y Hema
3 y Hema-Quick, Curtin-Matheson, Houston, Texas, USA.
Un procedimiento costoso, pero en ocasiones justificable para confirmar la infeccin, particularmente en ganado
con infeccin latente, consiste en inocular sangre del animal sospechoso en un ternero esplenectomizado (sin
bazo). Se inocula intravenosamente una cantidad (hasta 500 ml) de la sangre del donador con anticoagulante en
el ternero esplenectomizado, y luego se examinan frotis de sangre al menos cada 2-3 das. Si el donador est
infectado, se observar Anaplasma en los frotis del ternero esplenectomizado, por lo general, en 4 semanas,
aunque este perodo puede prolongarse a 8 semanas.
Las pruebas basadas en los cidos nuclicos para detectar A. marginale en ganado portador son de desarrollo
reciente (8, 9, 11, 12, 33). Se ha descrito una sonda radiactiva de ARN que detect parasitemias tan bajas como
0,000025% (8). Las garrapatas infectadas tambin se han identificado utilizando una sonda para ADN clonado
(13). La sensibilidad analtica de mtodos basados en la reaccin en cadena de la polimerasa (PCR) se ha
estimado en 0,0001% de eritrocitos infectados, pero a este nivel solo se detectara una parte del ganado portador
(9, 11). Recientemente se ha utilizado una tcnica PCR combinada que es sensible y potencialmente especfica
para identificar ganado portador de A. marginale (33). Esta tcnica es capaz de identificar niveles de menos de
30 eritrocitos infectados por ml de sangre, lo que equivale a una parasitemia de aproximadamente 0,000001%,
que est bien por debajo de los niveles ms bajos en los portadores (33). No obstante, la PCR combinada
plantea serios problemas de control de calidad para un uso rutinario (33). Los laboratorios que emplean esta
prueba deberan reconocer los problemas de especificidad debidos a amplificacin inespecfica.
Un paso adicional, como el anlisis con enzimas de restriccin, la hibridacin tipo Southern, o la secuenciacin,
puede confirmar la especificidad de lo que resulte amplificado.
Por lo general, excepto con animales que han sido tratados o se encuentran en una fase muy inicial de la
infeccin (<14 das), el mtodo preferido para identificar animales infectados es el enzimoinmunoensayo
competitivo (C-ELISA) o la prueba de hemaglutinacin en placa (CAT) (ver ms adelante).
2.
Pruebas serolgicas
Las infecciones por Anaplasma persisten normalmente durante toda la vida del animal. Sin embargo, excepto en
pequeos recrudecimientos ocasionales, no se puede detectar fcilmente Anaplasma en frotis de sangre
despus de un episodio de parasitemia. Por tanto, se han desarrollado varias pruebas serolgicas con objeto de
detectar los animales con infeccin latente.
Una caracterstica del diagnstico serolgico de la anaplasmosis son los resultados tan variables que se han
descrito por distintos laboratorios en muchas pruebas respecto a la sensibilidad y la especificidad. Esto se debe,
al menos en parte, a la inadecuada evaluacin de las pruebas que usan un nmero significativo de animales
positivos y negativos conocidos. En especial, hay que destacar que la capacidad de algunos ensayos para
detectar infecciones conocidas de larga duracin raramente se ha enfocado de un modo adecuado. Una
excepcin es la tcnica C-ELISA descrita recientemente (ver ms adelante), que ha sido validada utilizando
animales verdaderamente positivos y negativos, definidos por PCR combinada (33). Por consiguiente, aunque la
mayor parte de las pruebas descritas en esta seccin son tiles para obtener datos epidemiolgicos de una base
amplia, se debe tener precaucin en lo que respecta a su uso para la certificacin de la enfermedad.
Debe advertirse que en las pruebas serolgicas existe un grado alto de reacciones cruzadas entre A. marginale y
A. centrale. Aunque las especies patgenas se pueden identificar a veces con antgenos de la especie homloga
o heterloga, en muchas ocasiones se obtienen resultados equvocos.
a)
Una tcnica C-ELISA, que utiliza un antgeno recombinante denominado rMSP5 y un anticuerpo
monoclonal (Mab) especfico para MSP5, ha resultado muy sensible y especfica para detectar animales
infectados por Anaplasma (16, 23, 33, 36). Todas las cepas probadas de A. marginale, A. ovis y A. centrale,
expresan el antgeno MSP5 e inducen anticuerpos contra el eptopo inmunodominante reconocido por el
Mab especfico de MSP5. La prueba result especfica al 100% utilizando 261 sueros negativos conocidos
de una regin no endmica, detectando perfectamente a los 16 das de la infeccin experimental por
garrapata o por inoculacin de sangre el ganado infectado. Adems, se demostr capaz de detectar ganado
que haba sido infectado experimentalmente 6 aos antes (16). En la deteccin de ganado con infeccin
persistente en una regin endmica de anaplasmosis, donde los verdaderos positivos o negativos se
definieron mediante un procedimiento de PCR combinada, la C-ELISA con rMSP5 tuvo una sensibilidad del
96% y una especificidad del 95% (33). Un estudio independiente mediante el uso de ELISA indirecto (IELISA) valid el uso de rMPS5 como antgeno de diagnstico (29), Sin embargo, los estudios iniciales
sugieren que en su formato actual la tcnica de ELISA indirecto con rMPS5 es menos sensible que CELISA (29).
537
Los resultados de la prueba C-ELISA con el rMSP5 se pueden obtener en menos de 2,5 horas. Una prueba
2
comercializada contiene las instrucciones especficas. En general, sin embargo, se realiza del modo
siguiente.
Reactivos del equipo

Una placa de microtitulacin con 96 pocillos recubiertos con el antgeno rMSP5,
Una placa de adsorcin/transferencia con 96 pocillos recubiertos para la adsorcin de suero y
reduccin de la unin de fondo,
Conjugado MaAb/peroxidasa, 100 x,
Solucin de lavado y tampn preparado para dilucin del conjugado, 10 x,
Substrato para usar y soluciones para detener las reacciones,
Controles positivos y negativos
i)
Aadir 70 l de suero sin diluir a la placa de adsorcin/transferencia recubierta e incubar 30 minutos a

ii)
Transferir 50 l del suero adsorbido por pocillo a la placa recubierta de rMSP5 e incubar 60 minutos a
iii)
Eliminar el suero y lavar dos veces la placa utilizando la solucin de lavado, diluida.
iv)
Aadir 50 l por pocillo del conjugado Mab/peroxidasa diluido a la placa recubierta de rMSP5, e
incubar 20 minutos a temperatura ambiente.
v)
Eliminar el conjugado Mab/peroxidasa diluido y lavar la placa cuatro veces utilizando la solucin de
lavado diluida.
vi)
Aadir 50 l por pocillo, de la solucin de substrato, cubrir la placa con papel de aluminio, e incubar
20 minutos a temperatura ambiente.
vii)
Aadir 50 l por pocillo de la solucin para detener las reacciones a la solucin de substrato que se
encuentra en los pocillos y golpear ligeramente por los lados de la placa para mezclar el contenido de
los pocillos.
viii) Leer las placas en el equipo de lectura a 620 nm.
La densidad ptica media (OD) del control negativo debe estar entre 0.40 y 2.10. El porcentaje de inhibicin
del control negativo debe ser > 30%.
El porcentaje de inhibicin se calcula del siguiente modo:

100 OD de la muestra x 100/ OD media del control negativo = Porcentaje de inhibicin.
Las muestras con <30% de inhibicin son negativas: Las muestras con >30% de inhibicin son positivas.
b)
Prueba de aglutinacin en placa

La ventaja de la CAT es que es una tcnica sensible, que puede realizarse en el laboratorio o en el campo,
y que proporciona el resultado en unos pocos minutos. Las reacciones inespecficas pueden ser un
problema. El antgeno para CAT es una suspensin de partculas de A. marginale. Se infectan terneros
esplenectomizados por inoculacin intravenosa con sangre que contenga eritrocitos infectados por
Anaplasma. Cuando la parasitemia excede 50%, el animal se sangra, los eritrocitos infectados se lavan, se
lisan, y las membranas de los eritrocitos y las partculas de Anaplasma se centrifugan. Los sedimentos se
sonican, se lavan, y luego se resuspenden en una solucin de colorante para producir la solucin de
antgeno.
538
VMRD, Inc., 4641 Pullman_Albion Rd., P.O. Box 502, Pullman, Washington 99163, USA. Tel.: (1.509) 334.58.15; Fax:
(1.509) 332.53.56; http://www.vmrd.com
Un procedimiento con ligeras modificaciones del descrito originalmente (1,2) es el siguiente:

i)
Comprobar antes de su uso que todos los componentes de la prueba estn a una temperatura de 2526C (esta temperatura constante es un factor crtico en la prueba).
ii)
En cada crculo de la placa de ensayo (un plstico claro tipo perspex o una placa de cristal con
crculos marcados de 18 mm de dimetro), colocar juntos, pero sin tocarse, 10 l de factor de suero
3
bovino (BSF), 10 l del suero de ensayo, y 5 l del antgeno CAT . En cada placa se deben probar
sueros negativos y dbilmente positivos.
iii)
BSF es suero de un animal seleccionado con un alto nivel de conglutinina. Si se desconoce el nivel de
conglutininas, se puede utilizar suero fresco de un animal que est libre de Anaplasma. La raza Jersey
es adecuada, habitualmente. El BSF se debe guardar a 70C en pequeas alcuotas, y cada vez que
se realizan las pruebas se utiliza una alcuota fresca. La inclusin de BSF mejora la sensibilidad de la
prueba.
Mezclar bien con una varilla de vidrio. Despus de mezclar cada prueba, limpiar la varilla de vidrio con
un papel limpio para evitar la contaminacin cruzada.
c)
iv)
Colocar la placa de prueba en una cmara hmeda y agitar a 100-110 rpm durante 7 minutos.
v)
Leer inmediatamente contra una luz. Una aglutinacin caracterstica del antgeno (valorada de +1 a
+3) se considera un resultado positivo. Se considera que la prueba da un resultado negativo cuando
no existe esa aglutinacin caracterstica.

Se han publicado manuales detallados para realizar tanto la versin estndar (34) como la versin en
microttulo (35) de la prueba FC para anaplasmosis. Aunque la prueba de FC se ha empleado ampliamente
durante muchos aos usando ambas tcnicas, datos recientes confirman que carece de sensibilidad y falla
en la deteccin de una proporcin importante de ganado portador (3). Por consiguiente, la prueba FC no
puede ser recomendada como ensayo fiable para detectar animales infectados.
d)
Se ha encontrado un mtodo I-ELISA, basado en el uso de un antgeno normal de eritrocitos (antgeno
negativo) y de un antgeno de eritrocitos infectados por A. marginale (antgeno positivo), que es fiable para
la deteccin de sueros positivos frente a A. marginale (7). Aunque ms lento que las pruebas que utilizan un
solo antgeno, esta prueba elimina los sueros con niveles de actividad inespecfica debidos a los isoanticuerpos para los componentes de los eritrocitos normales. La prueba identific correctamente los 100
sueros positivos conocidos tomados de ganado bovino hasta despus de 3 aos de la infeccin, mientras
que el 3% de sueros negativos, el 2% de sueros de Babesia bovis y el 4% de sueros de B. bigemina dieron
falsos resultados positivos.
La prueba con los dos antgenos se realiza como se indica.
Antgeno negativo
La sangre de un ternero esplenectomizado se recoge en etiln diamino tetra-actico sdico (EDTA). Las
clulas se lavan tres veces son solucin salina tamponada con fosfato (PBS) y se centrifugan 10 minutos a
5.000 g a 5C. Despus de la centrifugacin, se extraen los glbulos blancos diluyendo las clulas diez
veces en PBS y pasndolas a travs de una columna de celulosa Whatman CFI1. Despus de otra
centrifugacin, se diluye un volumen de las clulas en dos volmenes de PBS y se guardan en alcuotas de
2.5 ml en la fase de vapor de nitrgeno lquido. Cuando se necesita, se descongela una alcuota a
temperatura ambiente y se sonica 30 segundos a 100 W con una pequea sonda a 0C. El producto
sonicado se diluye luego, segn se necesite, para utilizar en la prueba ELISA.
Antgeno positivo
Un ternero que se ha utilizado previamente para producir antgeno negativo se infecta con A. marginale por
inoculacin sangunea. Cuando la parasitemia alcanza el 80-85%, se toman 500-1.000 ml de sangre, se
procesan y se almacenan como se ha descrito antes. Cuando se necesitan, se sonican alcuotas, como
antes, y se diluyen convenientemente.
En EE.UU. y Mxico la prueba se realiza con volmenes mayores de reactivos: antgeno (15 l), suero (30 l), y factor de
suero bovino (30 l) en un tiempo de reaccin de 4 minutos (ver paso iv).
539
Se utilizan placas de micro-ELISA, con 96 pocillos, de fondo plano. Con cada lote nuevo de antgeno se
realizan las titulaciones estndar del antgeno, tanto positivo como negativo, por el sistema del tablero de
ajedrez, para determinar el rango de trabajo, que normalmente es 1/400 (150-200 g de protena/ml). A
cada pocillo de la placa se aade el antgeno diluido (200 l) , una mitad de la placa con antgeno positivo, y
la otra mitad con antgeno negativo. Las placas se cierran con sus tapaderas y se incuban toda la noche a
4C. Despus de la incubacin, se extrae la solucin de antgeno y las placas se lavan tres veces con PBS
que contenga 0.1% de Tween 20 (PBST), y luego se bloquean con una solucin de suero normal de caballo
al 1% en PBS durante 60 minutos a 37C.
Despus dell bloqueo, las placas se lavan cinco veces con PBST antes de aadir 200 l de los sueros de
prueba. (Los sueros de prueba se diluyen de 1/400 a 1/800 con PBST que contenga 1% de suero de
caballo). Las placas se cierran con sus tapaderas y se incuban 2 horas a 37C. Luego se lavan los pocillos
cinco veces con PBST y se aaden 200 l del segundo anticuerpo conjugado (IgG anti-bovina obtenida de
cabra conjugada con peroxidasa de rbano), a una dilucin 1/400 en PBS con 1% de suero de caballo. Las
placas se cierran con sus tapaderas y se incuban 2 horas a 37C. Despus de la incubacin, se extrae el
conjugado y los pocillos se lavan cinco veces con PBS antes de la adicin de 200 l de substrato, de
preparacin reciente.
El substrato se prepara as; se disuelve cido 5-amino saliclico recristalizado a concentracin de 1 mg/ml
en tampn fosfato, pH 6.8, a 32C; por cada ml de solucin se aaden luego 2 l de perxido de hidrgeno
al 30%. Despus de la adicin del substrato se cierran las placas y se agitan suavemente 30 minutos a
22C. A continuacin, inmediatamente, se leen las placas a 492 nm con un lector de placas. La columna
uno de cada placa se usa siempre como blanco.
Para cada muestra las lecturas netas se calculan restando el resultado del antgeno negativo del resultado
del antgeno positivo. En cada lote de ensayos, se prueba rutinariamente un grupo de 20 sueros negativos y
un suero estndar positivo para A. marginale. Se calcula un umbral como la lectura de la absorbancia neta
media (ms dos desviaciones estndar) de los 20 sueros negativos estndar. La relacin de todas las otras
absorbancias netas se determina usando como unidad el umbral. El suero positivo se utiliza para
determinar que cada lote de prueba se realiza con normalidad.
e)
Enzimoinmunoensayo de punto
Comparado con I-ELISA, la prueba ELISA de punto tiene las ventajas potenciales de ser rpida, barata, y
sencilla de realizar. Se ha descrito que el mtodo de ELISA de punto descrito a continuacin presenta una
sensibilidad del 93% y una especificidad del 96% (21).
i)
Recoger sangre con parasitemia elevada en EDTA.
ii)
Eliminar el plasma y lavar los eritrocitos con tampn glicina 0,1 M, pH 3,0.
iii)
Lavar los eritrocitos con PBS, pH 7,4, en presencia de inhibidores de proteasas (tetrationato sdico
3,5 mM) y 0,01% de timerosal.
iv)
Eliminar la capa de leucocitos despus de cada lavado.
v)
Resuspender los eritrocitos en PBS a dilucin 1/5, sonicar, someter a tres ciclos de congelacin y
descongelacin, y volver a sonicar el lisado.
vi)
Mezclar el material con un volumen igual de Nonidet P-40 en PBS, e incubar 3 minutos a 25C.
vii)
Recoger los cuerpos de Anaplasma por centrifugacin diferencial.
viii) Lavar el precipitado tres veces con tampn fro (cloruro de colina 155 mM, HEPES [N-2hidroxietilpiperazina, cido N-2-etanesulfnico] 5 mM, pH 7,4).
ix)
Resuspender el precipitado en PBS y medir la concentracin de protena.

Depositar el antgeno (1,0 l/disco; 25 g de protena/ml) sobre discos (de 6 mm de dimetro) de
nitrocelulosa cortados con una taladradora de papel. Secar al aire los discos recubiertos con el
antgeno. En estos discos el antgeno permanece estable durante ms de 2 aos si se mantienen a 20C o a 4C, y por al menos 3 meses cuando se conservan a 25C.
540
i)
Colocar los discos con el antgeno en pocillos con el fondo plano de placas de microtitulacin.
ii)
Todos los procedimientos se realizan a 25C y utilizando reacciones de 200 l de volumen.
iii)
Incluir sueros positivos y negativos conocidos y controles de antgeno.
iv)
Para el bloqueo, aadir PBS que contenga 0,5% de Tween 20 a cada pocillo, incubando luego
15 minutos.
v)
Probar los sueros a una concentracin inicial de 1/200 en PBS que contenga 0,05% de Tween 20, e
incubar 1 hora.
vi)
Lavar tres veces, 10 minutos cada vez, con PBS que contenga 0,1% de Tween 20.
vii)
Aadir el conjugado de fosfatasa alcalina/ protena A, diluido 1/500 en PBS que contenga 0,5% de
Tween 80, e incubar los pocillos 30 minutos, lavando despus como antes, excepto que el ltimo
lavado se hace con PBS solo.
viii) Aadir nitroazul de tetrazolio/5-bromo-4-cloro-indoxil fosfato en tampn Tris 0,1 M, pH 9,5, y permitir
que el color aparezca por 10-20 minutos.
ix)
f)
La aparicin de un punto de color prpura, de intensidad variable, indica una reaccin positiva; no se
ve color en los discos con reacciones negativas.
Prueba de inmunofluoresencia indirecta con anticuerpo

Debido al nmero limitado de pruebas de inmunofluorescencia indirecta con anticuerpo (IFI) que puede
realizar diariamente un operador, se suelen preferir otras pruebas serolgicas. La prueba IFI se realiza
como se describe para la babesiosis bovina en el Captulo 2.3.8., excepto que para la preparacin de frotis
de antgeno se utiliza sangre infectada por A. marginale. Un problema serio de esta prueba es la
fluorescencia inespecfica. Es muy probable que el antgeno obtenido de sangre recogida tan pronto como
aparezca una parasitemia adecuada (5-10%) resulte idneo. La fluorescencia inespecfica debida a
anticuerpos que se adhieren a eritrocitos infectados puede reducirse lavando los eritrocitos en un tampn
glicina cido antes de que se preparen los frotis de antgeno (22). Los eritrocitos infectados se lavan dos
veces en tampn glicina 0.1 M (pH 3,0, centrifugado a 1.000 g por 15 minutos a 4C) y luego una vez en
PBS, pH 7,4.

Se han utilizado varios procedimientos de inmunizacin para proteger al ganado bovino contra la anaplasmosis
en pases donde la enfermedad es endmica, pero ninguno es ideal (19). El uso de la especie menos patgena
A. centrale, que proporciona una proteccin parcial cruzada frente a A. marginale, es el mtodo aceptado ms
ampliamente, aunque no se utiliza en Amrica del Norte. Otro mtodo implica el uso de una cepa de A. marginale
atenuada por pases en hospedadores no bovinos, como el ciervo o la oveja (32).
En esta seccin, se describe la produccin de vacuna viva de A. centrale. Incluye la infeccin de un ternero
esplenectomizado susceptible y el uso de su sangre como vacuna. Existen descripciones detalladas del
procedimiento de produccin y se debe hacer referencia a estas publicaciones para detalles de los
procedimientos que se resumen aqu (4, 10,25).
Las directrices para la produccin de vacunas se presentan en el Captulo I.1.7. Principios de la produccin de
vacunas veterinarias. Las normas dadas aqu y en el Captulo I.1.7. intentan ser de naturaleza general y pueden
completarse con requisitos nacionales y regionales.
La vacuna para Anaplasma centrale puede suministrarse en forma congelada o refrigerada dependiendo de la
demanda, redes de transporte y la disponibilidad de servicios de nitrgeno lquido o de hielo seco. En la mayor
parte de los casos se recomienda la vacuna congelada, ya que permite un control de calidad de cada lote
despus de la produccin. Sin embargo, es ms costosa de producir y ms difcil de transportar que la vacuna
refrigerada. El riesgo de contaminacin hace que el control despus de la produccin sea esencial, pero puede
ser prohibitivamente costoso.
541
1.
Control del inculo
a)

Anaplasma centrale se aisl por primera vez en 1911 en Sudfrica y se ha utilizado como vacuna en
Sudamrica, Australia, frica, Oriente Medio, y Sudeste Asitico. Solo suministra proteccin parcial, pero
adecuada, en regiones donde las cepas que provocan la enfermedad son de una virulencia moderada
(como Australia) (10). En los trpicos hmedos, donde A. marginale parece ser un parsito muy virulento, la
proteccin suministrada por A. centrale puede ser inadecuada para evitar la enfermedad en algunos
animales.
Normalmente, Anaplasma centrale causa infecciones benignas, especialmente en terneros menores de
9 meses de edad. Se han descrito reacciones graves despus de la vacunacin cuando se inocula ganado
adulto.
El pase rpido de A. centrale por terneros esplenectomizados parece reducir su virulencia (10).
b)
Preparacin y conservacin de los estabilizados

El material infeccioso se conserva fcilmente en nitrgeno lquido o en hielo seco como estabilizados
congelados de la sangre infectada. El crioconservante recomendado es dimetil sulfxido (DMSO), ya que
permite la administracin intravenosa del estabilizado despus de la descongelacin. En otra parte (10) se
describe con detalle la tcnica de congelacin pero, en resumen, se basa en lo siguiente: se recoge sangre
infectada, se enfra a 4C, y se aade, lentamente y con agitacin, crioconservante fro (4 M DMSO en
PBS) en una proporcin final sangre/conservante de 1:1, para dar una concentracin final 2 M de DMSO.
Todo el proceso de dilucin se realiza en un bao de hielo y la sangre diluida se distribuye en recipientes
adecuados (por ejemplo, en crioviales de 5 ml), que se congelan tan pronto como sea posible en la fase de
vapor de un contenedor de nitrgeno lquido.
c)

La idoneidad de un aislamiento de A. centrale como vacuna se determina inoculando ganado susceptible,
observando las reacciones posteriores, y estimulando luego a los animales y a controles susceptibles con
una cepa virulenta local de A. marginale. Tanto la seguridad como la eficacia se pueden estimar
observando las parasitemias en extensiones de sangre teida y el descenso volumtrico de clulas
empaquetadas de ganado vacuno durante la vacunacin y durante los perodos de reaccin estimulante. Se
puede determinar la pureza del aislamiento, para posibles contaminantes presentes, mediante un estudio
serolgico de sueros en parejas del ganado bovino utilizado en la prueba de seguridad (26).
2.
Mtodo de fabricacin
a)
Produccin de vacuna congelada

Se descongelan las cantidades del estabilizado congelado (5-10 ml) por inmersin de los viales en agua
precalentada a 40C. El material descongelado se mantiene en hielo y se usa tan pronto como sea posible
(en 30 minutos) para infectar un ternero susceptible esplenectomizado por inoculacin intravenosa.
La parasitemia del ternero donante de analiza diariamente examinando extensiones de sangre teida de la
yugular, y se recoge la sangre para produccin de la vacuna cuando se alcanza una parasitemia adecuada.
8
El mnimo requerido para produccin de la vacuna es una parasitemia de 1 x 10 /ml (aproximadamente 2%
de parasitemia en la sangre de la yugular). Si no se obtiene una parasitemia adecuada, puede ser
necesario realizar un pase de la cepa mediante subinoculacin de 100-200 ml de sangre a un segundo
ternero esplenectomizado.
La sangre del donante se recoge mediante canulacin asptica de la yugular o la cartida, utilizando
heparina como anticoagulante (5 Unidades Internacionales [UI] de heparina/ml de sangre).
En el laboratorio, la sangre parasitada se mezcla a 37C con un mismo volumen de glicerol 3M en PBS,
suplementado con 5mM de glucosa (concentracin final de glicerol 1,5 M). La mezcla se equilibra a 37C
durante 30 minutos y se distribuye en recipientes adecuados (por ejemplo, en crioviales de 5 ml). Los viales
se enfran en la fase de vapor de nitrgeno lquido a una velocidad aproximada de 10C/minuto y, cuando
estn congelados, se guardan en la fase lquida (5).
En lugar de glicerol se puede utilizar DMSO como crioconservante. En este caso se lleva a cabo del mismo
modo que para la preparacin del estabilizado (20,24).
542
Si se tiene que diluir la vacuna preparada en glicerol, el diluyente debe ser PBS con 1.5 M de glicerol y
5 mM de glucosa (15). Las vacunas crioconservadas con DMSO deben diluirse con diluyente que contenga
la misma concentracin de DMSO que la sangre original crioconservada (27).
b)
Produccin de vacuna refrigerada

El material infeccioso para vacunas refrigeradas se preparara como para las vacunas congeladas, pero
debe ser procesado y utilizado tan pronto como sea posible despus de su recogida. La sangre infecciosa
7
se puede diluir para lograr 1 x 10 parsitos por dosis de vacuna. Un diluyente adecuado es 10% de suero
bovino estril en una solucin de glucosa/solucin salina equilibrada que contenga las
siguientes cantidades por litro: NaCl (7,00 g), MgCl2.6H2O (0,34 g), glucosa (1,00 g), Na2HPO4 (2,52 g),
KH2PO4 (0,90 g), y NaHCO3 (0,52 g).
Si no se dispone de diluyente, se debera utilizar como anticoagulante dextrosa citrato cido (20% [v/v]) o
dextrosa citrato fosfato (20% [v/v]) para suministrar la glucosa necesaria para la supervivencia de los
organismos.
c)
Utilizacin de la vacuna
En el caso de las vacunas congeladas, los viales se descongelan por inmersin en agua precalentada a
40C, y el contenido se mezcla con un diluyente adecuado hasta la dilucin requerida. Si se preparan
vacunas con glicerol, deben mantenerse fras y utilizarlas en un tiempo de 8 horas despus de la
preparacin (5). Si se utiliza DMSO como crioconservante, las vacunas preparadas deben mantenerse en
hielo y utilizarse en 15-30 minutos (24). El modo ms comn de administracin de la vacuna es por va
subcutnea.
Las vacunas refrigeradas se deben mantener en fro y utilizarse dentro de los 6 das siguientes a su
preparacin.
La cepa de A. centrale que se usa en las vacunas es de virulencia reducida, pero no es por completo
segura. En consecuencia, un consejo prctico es limitar el uso de las vacunas a terneros, en los que la
inmunidad inespecfica reducir el riesgo de reacciones debidas a la vacunacin. Cuando se tienen que
vacunar animales de mayor edad, existe el riesgo de reacciones graves. Estas reacciones no son
frecuentes, pero la presencia de animales de reproduccin valiosos o en estado de gravidez merece
atencin, y deberan observarse los animales entre las 4 y 6 semanas despus de la vacunacin. Los
animales clnicamente enfermos deben tratarse con tetraciclina o imidocarb a dosis recomendadas por los
fabricantes.
La inmunidad de proteccin se desarrolla en 6-8 semanas y por lo general persiste varios aos.
A menudo se utilizan en paralelo las vacunas contra la anaplasmosis y la babesiosis, pero no es
recomendable utilizar simultneamente otras vacunas.
3.
Control interno
a)
Origen y mantenimiento de los donantes de vacuna

Debe identificarse una fuente de terneros exentos de infeccin natural por Anaplasma y de otras
enfermedades transmitidas por garrapatas. Si no se dispone de ellos, puede ser necesario criar los terneros
bajo condiciones libres de garrapatas con el propsito especfico de produccin de vacunas.
Los terneros deben mantenerse en condiciones que eviten su exposicin a enfermedades infecciosas y a
garrapatas e insectos picadores. En ausencia de servicios adecuados, debe valorarse el riesgo de
contaminacin con agentes de enfermedades infecciosas que estn presentes en el pas concreto, y se
deben comparar los beneficios derivados de la produccin local de vacunas frente a las posibles
consecuencias adversas de difundir enfermedades (10).
b)
Ciruga
Para permitir el mximo rendimiento de obtencin de organismos para produccin de vacunas, los terneros
donantes deben ser esplenectomizados. Esto se lleva a cabo con preferencia en terneros jvenes con
anestesia general. Los detalles de esta tcnica, incluyendo los procedimientos pre- y post-operatorios, se
describen en otra parte (10).
543
c)
Seleccin de donantes para vacunas antes de la inoculacin

Los terneros donantes deben examinarse en cuanto a todas las infecciones sanguneas que sean
prevalentes en el pas productor de la vacuna, incluyendo Babesia, Anaplasma, Cowdria, Theileria y
Trypanosoma. Esto se lleva a cabo mediante examen rutinario de extensiones de sangre teidas despus
de la esplenectoma, y preferiblemente tambin por serologa. Cualquier ternero que muestre evidencias de
infecciones naturales debe ser rechazado. Tambin debe confirmarse la ausencia de otros agentes
infecciosos. Estos pueden incluir a los agentes de la leucosis enzotica bovina, enfermedad de las
mucosas, rinotraqueitis bovina infecciosa, fiebre efmera, enfermedad de Akabane, lengua azul, glosopeda
o fiebre aftosa y peste bovina. Las pruebas dependern de las enfermedades prevalentes en el pas y de la
disponibilidad de ensayos, pero en ltimo trmino deberan contemplar la serologa de sueros pareados y,
en algunos casos, el aislamiento del agente (5, 24, 26).
d)
Observacin de parasitemias despus de la inoculacin

Es necesario determinar la concentracin de parsitos en la sangre recogida para vacunas. Existen
tcnicas cuidadosas para determinar el contaje de los parsitos (10), pero, en ausencia de stas, la
concentracin de parsitos se puede calcular a partir del contaje de eritrocitos y de la parasitemia
(porcentaje de eritrocitos infectados).
e)
Recoleccin de sangre para vacunas

Antes del uso, debe esterilizarse todo el equipo (por ejemplo, en autoclave). Una vez alcanzada la
parasitemia deseada, la sangre se recoge con heparina utilizando tcnicas aspticas estrictas. Esto se
realiza ms fcilmente si se seda al ternero y se usa un circuito cerrado de recoleccin.
Se pueden extraer hasta 3 litros de sangre con niveles de infeccin elevados de un ternero de 6 meses. Si
el ternero va a permanecer vivo, es adecuada la transfusin de una cantidad similar de sangre de un
donante apropiado. Alternativamente, el ternero debe ser sacrificado inmediatamente despus de la
extraccin de la sangre.
f)
Distribucin de las vacunas

Todo el proceso se realiza en un ambiente apropiado, como en una cabina de flujo laminar, utilizando
tcnicas estriles estndar. El uso de un agitador mecnico o magntico asegura una buena mezcla de la
sangre y del diluyente a travs de todo el proceso de distribucin.
4.
Control de lotes
En el caso de las vacunas refrigeradas, la potencia, seguridad y esterilidad de los lotes de vacuna no se puede
determinar, y para las vacunas congeladas las especificaciones dependen del pas concreto. Las siguientes
indicaciones se aplican a las vacunas congeladas producidas en Australia.
a)
Esterilidad y ausencia de contaminantes

Para cada lote de vacuna y diluyente se emplean tcnicas estndar de esterilidad (ver Captulo I.1.5).
La ausencia de contaminantes se confirma inoculando ganado y observndolo serolgicamente en cuanto a
agentes infecciosos que potencialmente podran contaminar la vacuna. El ganado inoculado durante la
prueba de potencia (ver seccin C.4.c) es adecuado para este fin. Dependiendo del pas de origen de la
vacuna, estos agentes incluyen los microorganismos que causan la leucosis enzotica bovina, rinotraqueitis
bovina infecciosa, enfermedad de las mucosas, fiebre efmera, enfermedad de Akabane, virus Aino, lengua
azul, parainfluenza, glosopeda o fiebre aftosa, enfermedad nodular, rabia, fiebre del Valle del Rift, peste
bovina, pleuroneumona bovina contagiosa, enfermedad de Jembrana, cowdriosis, especies patgenas de
Theileria y Trypanosoma, Brucella abortus, Coxiella y Leptospira (5).
b)
Seguridad
Las reacciones vacunales del ganado inoculado en la prueba de potencia (ver seccin C.4.c) se observan
mediante la medicin de la parasitemia y el descenso volumtrico en clulas empaquetadas. Solo se ponen
en circulacin para uso los lotes con niveles de patogenicidad iguales o inferiores a un estndar
predeterminado.
c)
Potencia
La vacuna se descongela y se diluye 1/50 con un diluyente adecuado (15). La vacuna diluida se incuba
luego 8 horas a 30C, y se inoculan subcutneamente cinco cabezas de ganado con dosis de 2 ml. Los
544
animales inoculados se observan para presencia de infecciones examinando frotis de sangre, teidos. Para
que un lote sea aceptable todos deberan estar infectados. Un lote que sea infeccioso al 1/50 se
recomienda para uso a una dilucin 1/5 con diluyente isotnico.
d)
Despus de una inoculacin se logra inmunidad parcial, pero duradera. No existe evidencia de que la
vacunacin repetida tenga un efecto estimulante.
e)
Estabilidad
Cuando se almacena en nitrgeno lquido, la vacuna se puede mantener durante 5 aos. Una vez que se
descongela, pierde rpidamente su potencia. La vacuna descongelada no puede congelarse de nuevo.
f)
Conservantes
No se aaden conservantes. En la fase de distribucin, se aade a la vacuna penicilina (500.000 UI/litro) y
estreptomicina (370.000 UI/litro).
g)
La vacuna no es infecciosa para humanos. Cuando el producto se almacena en nitrgeno lquido, se
aplican las precauciones normales en cuanto a conservacin, transporte y manejo del material
ultracongelado.
5.
a)
Inocuidad
Ver Seccin C.4.b
b)
Potencia
Ver Seccin C.4.c
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*
* *
547
CAPTULO 2.3.8.
BABESIOSIS BOVINA
RESUMEN
La babesiosis es una enfermedad del ganado bovino transmitida por garrapatas y causada por los
parsitos protozoarios Babesia bovis, B. bigemina, B. divergens y otras especies. Boophilus spp.,
vectores principales de B. bovis y B. bigemina, se encuentran ampliamente distribuidos en paises
tropicales y subtropicales. El vector ms importante de B. divergens es Ixodes ricinus. Otros
vectores importantes incluyen Haemaphysalis y Rhipicephalus spp.
Identificacin del agente: Es posible la demostracin de los parsitos en los animales muertos
mediante el examen microscpico de frotis de sangre, cerebro, rin, hgado y bazo, con tal de que
la descomposicin no est avanzada. Los frotis se fijan con metanol, se tien con Giemsa al 10%
durante 20-30 minutos, y se examinan a 800-1000X con aceite de inmersin. En el caso de
animales vivos, se deben preparar frotis finos o gruesos de sangre capilar obtenidos, por ejemplo,
a partir del extremo de la cola. Se encuentran disponibles pruebas sensibles de la reaccin en
cadena de la polimerasa que pueden detectar y diferenciar especies de Babesia en el ganado
bovino.
Pruebas serolgicas: El mtodo de inmunofluorescencia indirecta (IFI) es la prueba ms
ampliamente utilizada para la detecccin de anticuerpos frente a B. bovis y B. divergens, aunque
los enzimoinmunoensayos estn ganando en popularidad. La prueba IFI ha sido utilizada para la
detecccin de anticuerpos frente a B. bigemina, pero las reacciones serolgicas cruzadas hacen
difcil el diagnstico de la especie.
Requisitos para las vacunas y los materiales de diagnstico: En varios pases se preparan
vacunas con cepas vivas o atenuadas de B. bovis, B. bigemina o B. divergens se producen en
varios pases a partir de la sangre de animales donantes infectados. Las vacunas se presentan en
forma congelada o refrigerada. Se recomienda generalmente la produccin de la vacuna
congelada ya que permite un exhaustivo control de post-produccin de cada lote. El riesgo de
contaminacin de esta vacuna derivada de sangre hace que sea esencial un minucioso control de
calidad, aunque puede ser prohibitivamente caro.
Las vacunas vivas de Babesia no son completamente seguras. Una recomendacin prctica es
limitar su uso a terneros, donde la inmunidad inespecfica minimizar el riesgo de reacciones frente
a la vacuna. Cuando van a vacunarse animales viejos, el riesgo de reaccin justifica el seguimiento
riguroso y el tratamiento con un babesicida, si surgen reacciones.
La inmunidad protectora se desarrolla en 3-4 semanas y dura varios aos despus de una sola
vacunacin.
A. INTRODUCCIN
La babesiosis bovina est causada por parsitos protozoarios del gnero Babesia, orden Piroplasmida, phylum
Apicomplexa. De las especies que afectan al ganado bovino, dos -Babesia bovis y B. bigemina- se encuentran
ampliamente distribuidas y son muy importantes en Africa, Asia, Australia y Amrica Central y del Sur. Babesia
divergens es importante econmicamente en algunas partes de Europa.
El vector de Babesia son garrapatas (18). Boophilus microplus es el vector principal de B. bigemina y B. bovis, y
se encuentra ampliamente distribuido en los trpicos y subtrpicos. El vector de B. divergens es Ixodes ricinus.
Otros vectores importantes incluyen Haemaphysalis, Rhipicephalus y Boophilus spp. Babesia bigemina presenta
la distribucin ms amplia de todas.
548
Captulo 2.3.8. Babesiosis Bovina
Generalmente, B. bovis es ms patgeno que B. bigemina y B. divergens. Las infecciones se caracterizan por
fiebre alta, ataxia, anorexia, shock circulatorio generaly, a veces tambin sntomas nerviosos como resultado del
secuestro de eritrocitos infectados en los capilares cerebrales. En casos agudos, la mxima parasitemia
(porcentaje de eritrocitos infectados) en sangre circulante es menor del 1%. Esto contrasta con las infecciones
por B. bigemina, donde la parasitemia a menudo excede del 10% y puede llegar a un 30%. En las infecciones por
B. bigemina, los sntomas ms inportantes incluyen fiebre, hemoglobinuria y anemia. En las infecciones por
B. bigemina no tiene lugar el secuestro intravascular de eritrocitos infectados. La parasitemia y aspecto el clnico
de las infecciones por B. divergens son algo parecidas a las infecciones por B. bigemina (20).
Los animales infectados desarrollan una inmunidad de por vida frente a la reinfeccin con las mismas especies.
Tambin existe evidencia de un grado de proteccin cruzada en animales inmunes a B. bigemina frente a
posteriores infecciones por B. bovis. Los terneros raramente muestran signos clnicos de enfermedad
despus de la infeccin, independientemente de la especie de Babesia implicada o el estado inmune de las
madres (8, 10, 11).
1.
El mtodo tradicional de identificacin del agente en animales infectados es mediante el examen microscpico de
frotis finos y gruesos de sangre teidos, por ejemplo, con Giemsa. La sensibiliad de esta tcnica es tal que puede
detectar parasitemias tan bajas como un parsito por 107 glbulos rojos (RBCs) (6). La diferenciacin de
especies es buena en frotis finos pero pobre en los frotis gruesos, ms sensibles. Esta tcnica es adecuada,
normalmente, para la deteccin de infecciones agudas, pero no para la deteccin de portadores donde las
parasitemias son en su mayora muy bajas. La identificacin y diferenciacin del parsito puede mejorarse
empleando un colorante fluorescente, como el naranja de acridina, en lugar del Giemsa (19). Se ha desarrollado
un mtodo BBC (Cuantitative Buffy Coat ) empleando naranja de acridina para teir parsitos en los vasos
capilares para demostrar Plasmodium en sangre humana y potencialmente podra detectar tambin parasitemias
bajas por Babesia, aunque la diferenciacin es probable que resulte deficiente (6).
Las muestras de animales vivos deberan recogerse preferiblemente de capilares, como los de la punta de la
oreja o el extremo de la cola, ya que B. bovis es ms comn en la sangre capilar. Los parsitos Babesia
bigemina y B. divergens se encuentran distribuidos uniformemente a lo largo del tejido vascular. Si no es posible
preparar frotis frescos a partir de sangre capilar, se debera recoger sangre estril de la yugular en presencia de
un anticoagulante con cido eitilen diamino tetra-actico (EDTA) (por ejemplo 1 mg/ml). La heparina puede
afectar a las caractersticas de color de la tincin y no est recomendada. La muestra debe mantenerse fra,
preferiblemente a 5C, hasta que se transporte al laboratorio, de nuevo preferiblemente en pocas horas desde su
recogida. Los frotis de sangre se secan al aire, se fijan en metanol absoluto durante 1 minuto, y se tien con el
colorante Giemsa al 10% durante 20-30 minutos. Es preferible teir los frotis de sangre tan pronto como sea
posible despus de su preparacin para asegurar una definicin adecuada del colorante. Los frotis gruesos se
preparan depositando una gota pequea (aproximadamente 50 l) de sangre sobre un porta limpio.
Entonces esta gota se seca al aire, se fija por calor a 80 durante 5 minutos, y se tie con Giemsa al 10%
durante 15-20 minutos. Los frotis de sangre sin teir no deben guardarse en soluciones con formol ya que puede
afectar a la calidad de la tincin.
Las muestras de animales muertos deben consistir en frotis finos de sangre, as como de (en orden preferente)
cortex cerebral, rin, hgado, bazo y mdula sea. Los frotis de rganos se preparan presionando un porta
limpio sobre la superficie de un corte fresco del rgano o aplastando una pequea muestra del tejido entre dos
portas limpios colocados longitudinalmente para dejar una pelcula de tejido sobre cada superficie. Entonces, el
frotis se seca al aire (en climas hmedos ayudado mediante calentamiento suave), se fija durante 5 minutos en
metanol absoluto, y se tie durante 20-30 minutos en Giemsa al 10%. Este mtodo resulta especialmente
adecuado para el diagnstico de infecciones por B. bovis, pero es poco fiable si las muestras se recogen 24 o
ms horas despus de que se haya producido la muerte. Sin embargo, los parsitos a menudo pueden ser
detectados en sangre recogida de las venas de los miembros bajos uno o ms das despus de la muerte.
Todos los frotis teidos se observan con aceite de inmersin utilizando (como mnimo) lentes ocular de 8X y
objetivo de 60X. B. bovis es un parsito pequeo, localizado normalmente en posicin central en el eritrocito.
Mide aproximadamente 1-1.5 m de largo y 0.5-1.0 m de ancho y, habitualmente, se encuentra en parejas que
forman un ngulo obtuso entre ellas. Babesia divergens es tambin un parsito pequeo y es morfolgicamente
muy parecido a B. bovis. Sin embargo, las parejas que forman ngulos obtusos estn localizadas normalmente
en el borde del eritrocito. Babesia bigemina tiene forma tpica de pera, aunque se encuentran muchas formas
variadas y sencillas. Tiene 3-3.5 m de largo y 1-1.5 m de ancho, y las formas apareadas a menudo tienen en
cada parsito dos puntos separados teidos de rojo (B. bovis y B. divergens siempre tienen slamente uno). En
casos agudos, la parasitemia por B. bovis raramente alcanza el 1%, pero con B. bigemina y B. divergens la
549
norma son parasitemias mucho ms elevadas. Los frotis gruesos de sangre son especialmente tiles para el
diagnstico de infecciones por B. bovis de bajo nivel, como son los frotis de rganos (1).
Se han utilizado sondas para detectar ADN de algunas especies de Babesia, pero generalmente no son ms
sensibles que la microscopa directa y la aplicacin en diagnsticos de rutina es limitada (19). Los ensayos de
reaccin en cadena de la polimerasa (PCR) han demostrado ser muy sensibles, particularmente en la deteccin
de B. bovis y B. bigemina en ganado portador (7, 11, 17, 35). Se han descrito niveles de deteccin tan bajos
como tres eritrocitos parasitados en 20l de clulas concentradas (36). Se han descrito varias tcnicas de PCR
que pueden detectar y diferenciar especies de Babesia en infecciones de portador (7, 35). Sin embargo, los
ensayos de PCR no se prestan bien para pruebas a gran escala y son poco prometedores para sustituir a las
pruebas serolgicas como mtodo de eleccin para estudios epidemiolgicos. Los ensayos de PCR son tiles
como pruebas confirmativas y en algunos casos como pruebas reguladoras.
Se han utilizado mtodos de cultivo in-vitro para demostrar la presencia de infecciones portadoras de Babesia
spp. (22), y B. bovis tambin ha sido multiplicada en cultivo. La parasitemia mnima detectable mediante este
mtodo depender, en gran medida, de las infraestructuras disponibles y las habilidades del usuario (6), pero
puede ser tan baja como 1010 (19), haciendo de ste un mtodo muy sensible para la demostracin de la
infeccin. Un beneficio aadido es que es 100% especfico.
La confirmacin de la infeccin en un animal sospechoso de ser portador tambin puede realizarse
transfundiendo intravenosamente aproximadamente 500 ml de sangre de yugular en un becerro
esplenectomizado libre de Babesia, y monitorizando al ternero para la presencia de infeccin. Este mtodo es
incmodo y caro, y obviamente no adecuado para el uso diagnstico rutinario. Sin embargo, los gerbos de
Mongolia (Meriones unguiculatus) se pueden utilizar para demostrar la presencia de B. divergens.
2.
Pruebas serolgicas
La prueba de inmunofluorescencia indirecta (IFI) es utilizada ampliamente para detectar anticuerpos frente a
Babesia spp., aunque el ensayo tiene una especificidad baja en B. bigemina. En la prueba IFI para B. bigemina
las reacciones cruzadas con anticuerpos frente a B. bovis son un problema particular en areas donde coexisten
los dos parsitos. La prueba IFI tienen las desventajas del manejo de pocas muestras y la subjetividad. Se ha
desarrollado una prueba de enzimoinmunoensayo (ELISA), validada internacionalmente para el diagnstico de
infeccin por B. bovis (13, 29, 38), pero, a pesar de los esfuerzos de varios investigadores en diferentes
laboratorios, no existe un ELISA parecido validado para B. bigemina. Los ELISAs para anticuerpos frente a
B. bigemina tienen una especificidad baja. En un estudio (16), un antisuero frente a B. bigemina pareci
reaccionar especficamente con fibringeno. Sin embargo, un ELISA desarrollado y validado recientemente en
Australia (30) resulta esperanzador. En ausencia de otra prueba factible para B. bigemina, se ha incluido aqu el
procedimiento para dicha prueba. Tambin se han desarrollado ELISAs para B. divergens (9) utilizando antgeno
derivado de cultivo, de gerbos (Meriones) o de ganado vacuno, pero no parece existir uno que haya sido validado
internacionalmente.
a)
Enzimoinmunoensayo para Babesia bovis

La preparacin del antgeno est basada en una tcnica descrita por Waltisbuhl et al. (38). A partir de un
ternero esplenectomizado se recoge la sangre infectada (normalmente 5-10% de parasitemia) en presencia
de EDTA. La sangre se lava tres veces en cinco volmenes de tampn fosfato salino (PBS), y las clulas
infectadas se concentran mediante lisis diferencial de las clulas no infectadas en solucin salina
hipotnica. Las clulas infectadas son ms resistentes a la lisis en solucionas salinas hipotnicas que las
clulas no infectadas. Se preparan series de soluciones salinas hipotnicas, oscilando entre el 0,35% hasta
0,50% de NaCl, con incrementos del 0,025%. Para encontrar la mejor concentracin, se aaden cinco
volmenes de cada solucin salina a un volumen de RBC concentrados, que se mezclan suavemente y se
dejan reposar durante 5 minutos.
Las mezclas se centrifugan y los sobrenadantes se aspiran. Se aade un volumen igual de plasma
(conservado a partir de la sangre original) a cada tubo con los RBC concentrados, y los contenidos de los
tubos se mezclan. Se preparan frotis finos de sangre a partir de las mezclas de clulas sanguneas
resuspendidas, se fijan en metanol, y se tien con Giemsa. Estos frotis se examinan al microscopio para
determinar que solucin salina lisa la mayora de los RBC no infectados pero deja intactos a los RBC
infectados. Debera ser posible conseguir una infeccin >95% en los RBC intactos restantes. La mayor
parte de los RBC concentrados se lisa diferencialmente con la solucin salina ptima y se centrifugan. El
sedimento (>95% de RBC infectados) se lisa en agua destilada a 4C, y los parsitos se precipitan a
12,000 g durante 30 minutos. El precipitado se lava tres veces en PBS mediante resuspensin y
centrifugacin a 4C. Se resuspende entonces en uno a dos volmenes de PBS a 4C, y se sonica en
volmenes adecuados utilizando una potencia media durante 60-90 segundos. El material sonicado se
ultracentrifuga, (105.000 g durante 60 minutos a 4C) y se conserva el sobrenadante. El sobrenadante se
550
mezcla con un volumen igual de glicerol y se conserva en alicuotas de 2-5 ml a 70C. Es aceptable la
conservacin a corto plazo a 20C para la alicuota de trabajo.
i)
Se aaden 100 l del antgeno, diluido 1/400 a 1/600 en tampn carbonato 0,1M, pH 9,6, a cada
pocillo de una placa de microtitulacin de poliestireno con 96 pocillos. La placa se cubre y se incuba
durante la noche a 4C.
ii)
Se elimina el antgeno y los pocillos se bloquean durante 2 horas a temperatura ambiente mediante la
adicin de 200 l de una solucin de caseinato sdico al 2% en tampn carbonato.
iii)
Despus de bloquear, los pocillos se lavan brevemente con PBS que contiene 0,1% de Tween 20
(PBST) y se aaden 100 l de suero bovino diluido 1/100 en PBST que contiene 5% de suero normal
de caballo o 5% de leche desnatada en polvo, y las placas se incuban durante 2 horas a temperatura
ambiente.
iv)
La fase de lavado consiste en un lavado suave con PBST, seguido de tres lavados de 5 minutos con el
mismo tampn (durante los cuales la placa se agita vigorosamente), y finalmente las placas se
someten a un lavado suave.
v)
A continuacin, se aaden 100 l de IgG anti-bovina marcada con peroxidasa y diluida

adecuademente en PBST con suero de caballo o leche desnatada y las placas se agitan durante otros
30 minutos a temperatura ambiente. (NB: algunos lotes de leche desnatada en polvo pueden contener
inmunoglobulinas que pueden interferir con las IgG anti-bovinas conjugadas).
vi)
Los pocillos se lavan como se describi anteriormente en la fase iv, y se aaden 100 l de substrato
de peroxidasa (ABTS [2, 2- Azino-bis-(cido 3-ethylbenzothiazolin-6-sulfnico)]) a cada pocillo. La
reaccin del substrato se deja continuar hasta que la absorbancia de un control positivo fuerte incluido
en cada placa se acerca a 1. En este punto se lee la absorbancia a 414 nm en un lector de placas de
microtitulacin.
Para controlar la variacin entre placas, se incluyen en cada placa sueros conocidos positivos y negativos
(38). Los sueros problema se bareman en relacin al control positivo. Los resultados del ELISA se expresan
como un porcentaje de dicho control positivo (porcentaje de positividad). Los valores umbral positivo y
negativo deben determinarse en cada laboratorio probando tantos sueros positivos y negativos como sea
posible.
Cada lote de antgeno y conjugado deben ser valorados empleando un sistema de doble entrada o mtodo
del tablero de ajedrez. El enzima ms adecuado para el conjugado es la peroxidasa de rbano picante. El
ABTS o la tetrametil benzidina (TMB) son substratos adecuados. Con esta prueba, es posible detectar
anticuerpos hasta cuatro aos despus de una infeccin simple. Deberan producirse de un 95-100% de
reacciones positivas con animales inmunes a B. bovis, 1.2% de reacciones falsos positivos con suero
negativo y <2% de reacciones falsos positivos con animales inmunes a B. bigemina.
b)
Enzimoinmunoensayo para Babesia bigemina

Este ELISA est basado en un antgeno de 58 kDa identificado por varios grupos en aislamientos de
B. bigemina en Australia, Amrica Central y Texas, Estados Unidos de Amrica, Egipto y Kenia (30). Se ha
utilizado un anticuerpo monoclonal (Mab) (D6) (Tick Fever Research Centre, Qld, Australia) dirigido contra
este antgeno para desarrollar un ELISA de inhibicin competitiva (30). El antgeno utilizado en el ELISA es
un pptido de 26 kDa (Tick Fever Research Centre, Qld, Australia), codificado por un fragmento de 360 bp
del gen p58, expresado en E. coli y purificado mediante columnas de afinidad. Este antgeno tambin puede
ser empleado en un formato de ELISA indirecto, aunque se debe esperar alguna reaccin cruzada de
anticuerpos frente a B. bovis.
i)
El antgeno recombinante de 26 kDa se diluye hasta una concentracin de 2 g/ml en tampn

carbonato 0,1 M, pH 9.6, y se aaden 100 l en cada pocillo de una placa de microtitulacin de
96 pocillos. Las placas se incuben durante la noche a 4C.
ii)
Se retira el exceso de antgeno y los pocillos se bloquean durante 1 hora a temperatura ambiente
mediante la adicin a cada pocillo de 200 l de una disolucin del 2% de caseinato sdico en tampn
carbonato.
551
iii)
Despus de un lavado suave (3 x 200 l) con PBS que contiene 0,1% de Tween 20 (PBST), se
aaden 100 l de suero sin diluir y las placas se incuban durante 30 minutos a temperatura ambiente
con agitacin suave.
iv)
Las placas se lavan entonces con PBST (5 x 200 l, 5 minutos de incubacin con agitacin), y se
aaden a cada pocillo 100l de Mab D6 marcado con peroxidasa diluido a una concentracin de 0,03
g/ml en PBST conteniendo un 2% de leche desnatada en polvo. Las placas se incuban a temperatura
ambiente durante 30 minutos con agitacin suave.
v)
Las placas se lavan de nuevo, se aaden 100l de substrato de peroxidasa TMB a cada pocillo, y se
incuban en la oscuridad hasta que la absorbancia de los pocillos control conjugados (sin suero) se
aproxima a 1. En este momento la reaccin se para mediante la adicin de 50 l de cido sulfrico y
se lee la absorbancia a 450 nm. Se deben incluir en cada placa de ensayo sueros control positivos y
negativos.
Se calcula el porcentaje de inhibicin (PI) para el suero problema relativo al control conjugado (PI = 100[100 x absorbancia problema/absorbancia del control conjugado]). Los valores umbral positivo y negativo
deben determinarse en cada laboratorio probando tantos sueros positivos y negativos como sea posible.
La especificidad del ELISA ha sido estimada en un 97% y la sensibilidad para la deteccin de anticuerpos
en terneros infectados experimentalmente es del 95,7% (30).
c)
Los portas con antgeno se preparan a partir de sangre de yugular, de manera ideal cuando la parasitemia
se encuentra entre un 2% y 5%.
La sangre se recoge en presencia de un anticoagulante adecuado (citrato sdico o EDTA), y despus se
lava al menos tres veces en cinco a diez volmenes de PBS para eliminar las protenas contaminantes del
plasma, y, en particular, las inmunoglobulinas del hospedador. Despus de lavar, los RBC infectados se
resuspenden en dos volmenes de PBS con 1% de seroalbmina bovina (BSA). La BSA se emplea para
adherir los RBCs al porta. Preferentemente, se preparan frotis monocapa depositando una gota de sangre
sobre un porta limpio, el cual se centrifuga en una citocentrfuga. El sistema proporciona frotis muy
uniformes. Alternativamente, se pueden preparar frotis finos mediante la tcnica convencional (arrastrando
una gota de sangre con el extremo de otro cubreobjetos). Los frotis se secan al aire y se fijan en un horno
de aire caliente a 80C. Los frotis de sangre fijados se tapan (por ejemplo con papel de aluminio o cinta
adhesiva de papel de estraza) para permanecer hermticos, y se guardan a 70C hasta que se necesiten
(mximo 5 aos).
Los sueros control y problema se diluyen 1/30 en PBS. Los sueros se pueden utilizar con o sin inactivacin
del complemento por calor durante 30 minutos a 56C. Los portas se marcan con 8-10 divisiones con un
lpiz graso para crear divisiones hidrofbicas. Utilizando una pipeta de precisin se aaden 5-10 l de cada
dilucin de suero en cada cuadrado de prueba. Las preparaciones se incuban a 37C durante 30 minutos
en una cmara hmeda. En cada porta de prueba se emplean como controles diluciones de sueros
positivos y negativos dbiles.
Despus de la incubacin, los portas se lavan cuidadosamente una vez con PBS, dos veces ms durante
10 minutos con PBS, y despus otra con agua. Entonces se aade en cada cuadrado de prueba una
dilucin adecuada de un anticuerpo antibovino marcado con isotiocianato de fluorescena (disponible
comercialmente). Cada nuevo lote de conjugado debe ser titulado previamente, y el rango de trabajo
normalmente se encuentra entre 1/400 y 1/200. Generalmente, para este propsito, son ms adecuados los
anticuerpos conjugados de conejo y pollo que los anticuerpos de cabra. Los portas con el conjugado se
incuban de nuevo a temperatura ambiente durante 30 minutos, y se lavan como antes. Los portas hmedos
se montan con cubreobjetos con glicerol y PBS 1:1, y se examinan mediante microscopa de fluorescencia.
Un operario competente puede examinar aproximadamente 150 muestras por da.
d)
Otras pruebas
En aos recientes se han descrito otras pruebas serolgicas, que incluyen un ELISA de punto, un ELISA en
porta (25), y pruebas de aglutinacin de latex y en tarjeta (3, 26). Estas pruebas presentan niveles
aceptables de sensibilidad y especificidad en B. bovis y, en el caso del ELISA de punto, tambin para B.
bigemina. Sin embargo, ninguna de estas pruebas parece haber sido adoptada para uso diagnstico en
otros laboratorios ms que en aquellos en los que tuvieron lugar su desarrollo original y validacin. Por
tanto se desconoce la adaptabilidad de estas pruebas para laboratorios de diagnstico rutinario.
552

El ganado vacuno desarrolla una inmunidad larga y duradera despus de una infeccin con B. bovis,
B. divergens o B. bigemina. Esta caracterstica ha sido explotada en algunos paises para inmunizar ganado
ferente a la babesiosis (8, 14, 27, 34). La mayora de estas vacunas vivas contienen cepas especialmente
seleccionadas de Babesia, principalmente B. bovis y B. bigemina, y son producidas como un servicio para las
industrias de ganadera en instalaciones de produccin costeadas por el gobierno, concretamente en Australia,
Argentina, Sudfrica, Israel y Uruguay. En Irlanda se ha empleado con xito una vacuna experimental de B.
divergens preparada a partir de sangre de Meriones (gerbos) infectados (21).
En Austria se prepara una vacuna muerta de B. divergens a partir de la sangre de terneros infectados, aunque
existe poca informacin disponible sobre el nivel y duracin de la inmunidad conferida. Tambin se han
desarrollado vacunas experimentales que contienen antgenos sintetizados in vitro (2, 32), aunque el nivel y
duracin de la proteccin frente a un estmulo heterlogo es poco claro. Se han caracterizado protenas del
parsito y ha habido algn progreso en el desarrollo de vacunas de subunidades (11, 33). No existe una vacuna
de subunidades efectiva disponible comercialmente.
Las instrucciones para la produccin de vacunas veterinarias se dan en el Captulo I. 1. 7. Principios de
produccin de vacunas veterinarias. Las directrices que se ofrecen aqu y en el Captulo I. 1. 7 pretenden ser de
naturaleza general y pueden ser completadas mediante requisitos nacionales o regionales.
Esta seccin tratar la produccin de vacunas vivas de babesiosis, principalmente aquellas frente a infecciones
en ganado vacuno por B. bovis y B. bigemina. La produccin conlleva la infeccin de terneros con cepas
seleccionadas, y el uso de la sangre como vacuna (8, 12, 14). Los terneros utilizados para la infeccin con estas
cepas deben encontrarse libres de agentes infecciosos que puedan ser transmitidos por productos derivados de
su sangre. En el caso de B. divergens, la sangre de los gerbos infectados (Meriones unguiculatus) puede ser
empleada en lugar de la sangre bovina. Tambin se han utilizado mtodos de cultivo in-vitro para producir
parsitos para vacuna (24, 27). Sin embargo, el relativamente alto coste de produccin a partir de cultivo y la
evidencia de una posible deriva antignica durante su mantenimiento en cultivo a largo plazo, hacen
impracticable en la actualidad el cultivo en masa de Babesia en la mayora de los laboratorios.
Las vacunas de Babesia bovis y B. bigemina pueden prepararse en forma congelada o refrigerada dependiendo
de la demanda, los sistemas de transporte y la disponibilidad de suministro de nitrgeno lquido o hielo seco. Es
preferible la preparacin de vacuna congelada (12, 14, 27, 34), ya que permite un control riguroso de postproduccin de cada lote. Sin embargo, es ms costosa de producir y ms difcil de transportar que la vacuna
refrigerada. EL riesgo potencial de contaminacin de esta vacuna derivada de sangre convierte en esencial el
control de post-produccin, pero puede situar la produccin ms all de los recursos financieros de algunos
pases en regiones endmicas (14). Es poco probable que una instalacin de produccin que suministre a un
mercado anual menor de 50.000 dosis funcione sin respaldo financiero.
1.
Control del inculo
a)
Cepas disponibles internacionalmente
Se han utilizado eficientemente cepas australianas atenuadas de B. bovis y B. bigemina para inmunizar
ganado vacuno en Africa, Amrica del Sur y Sureste de Asia (12, 14). Estn disponibles cepas transmisibles
y no transmisibles mediante garrapatas. Tambin se ha desarrollado una cepa de B. divergens con una
virulencia reducida en Meriones (39).
Aislamiento y purificacin de cepas locales.
Las cepas de B. bovis, B. divergens y B. bigemina que se encuentran libres de contaminantes, tales como
Anaplasma, Eperythrozoon, Theileria, Trypanosoma y varios agentes bacterianos y virales, son ms
fcilmente aislables alimentando garrapatas infectadas en ganado vacuno esplenectomizado. Los vectores
y modos de transmisin de las especies difieren, y estas caractersticas pueden ser utilizadas para
diferenciar las especies (18).
Babesia spp. tambin puede ser aislada a partir de ganado vacuno infectado mediante subinoculacin de
sangre en terneros esplenectomizados susceptibles. Una desventaja importante de este mtodo es la
dificultad de separar Babesia spp. de contaminantes tales como Anaplasma y Eperythrozoon. El aislamiento
de B. divergens es un procedimiento relativamente simple debido a la susceptibilidad de Meriones (21). Se
puede realizar el mantenimiento de las cepas aisladas in vitro (23) para eliminar la mayora de los
contaminantes, pero no para distinguir Babesia spp. Se puede emplear la quimioterapia selectiva para
553
obtener B. bovis puro a partir de una infeccin mixta por Babesia, mientras que el trnsito rpido en
terneros susceptibles permitir el aislamiento de B. bigemina (1).
Atenuacin de las cepas
Se han comunicado varias formas de atenuar Babesia spp. El mtodo ms seguro de reducir la virulencia
de B. bovis conlleva el trnsito rpido de la cepa a travs de terneros esplenectomizados susceptibles. La
atenuacin no est garantizada, pero normalmente aparece despus de 8 a 20 pases en ternero (8).
La virulencia de B. bigemina disminuye durante la permanencia prolongada del parsito en animales con
infeccin latente. Esta caracterstica ha sido empleada para obtener cepas avirulentas mediante infeccin
de terneros, esplenectomizndolos despus de 3 meses y utilizando los parsitos resultantes para repetir el
proceso (8).
Atenuacin de B. divergens para Meriones seguida de mantenimiento in vitro a largo plazo (39).
Se ha intentado la atenuacin de Babesia spp. con irradiacin, aunque los resultados han sido variables. De
manera similar, se ha utilizado experimentalmente la conservacin in vitro en medios modificados.
Las cepas avirulentas deben guardarse como muestras vivas para pruebas de seguridad y uso futuro como
inculo para la produccin de vacuna.
b)
Preparacin y almacenamiento del inculo original

Las cepas avirulentas son fcilmente almacenables como sangre infectada congelada en nitrgeno lquido o
hielo seco. El dimetil sulfxido (DMSO) (28) y la polivinilpirrolidona PM 40.000 (37) son los crioprotectores
recomendados, ya que permiten la administracin intravenosa despus de congelar el inculo original. Un
informe detallado sobre la tcnica de congelacin empleando DMSO se comunica en otra parte (28).
Brevemente, implica lo siguiente:
La sangre infectada se recoge y se enfra a 4C. Se aade entonces, agitando lentamente, el crioprotector
fro (4M DMSO en PBS) hasta una relacin final sangre/protector de 1:1, siendo la concentracin final de
DMSO de 2M. Este mtodo de dilucin se lleva a cabo en un bao de hielo, y la sangre diluida se reparte
en contenedores adecuados (por ejemplo crioviales de 5 ml), y se congela tan pronto como sea posible en
la fase de vapor de un contenedor de nitrgeno lquido. Los viales se almacenan en la fase lquida de un
depsito destinado para prevenir la prdida de viabilidad y la contaminacin. Almacenados de esta forma,
se ha sabido de lotes de inculos originales de Babesia que han permanecido viables durante 20 aos.
c)
Preparacin y almacenamiento del inculo de trabajo

El inculo de trabajo se prepara de la misma forma que el inculo original (Seccin C. 1. b.), utilizando ste
ltimo como material de partida.
d)
Validacin de la seguridad y eficacia del inculo de trabajo

La idoneidad de un inculo de trabajo se determina mediante la inoculacin de una cantidad adecuada de
ganado bovino susceptible con la vacuna preparada a partir de ste, y estimulndolos a ellos y a controles
susceptibles con una cepa virulenta heterloga. La seguridad y la eficacia pueden juzgarse mediante la
medida de la fiebre, las parasitemias en frotis sanguneos teidos, y la disminucin de los volmenes de
clulas concentradas. La pureza del inculo de trabajo se analiza valorando la presencia de posibles
contaminantes en el ganado utilizado en la prueba de seguridad, como se menciona en la Seccin C. 4. b.
2.
Mtodo de fabricacin
a)
Produccin de un concentrado de vacuna congelado

Primero, se descongelan rpidamente volmenes de 5-10 ml del inculo de trabajo mediante inmersin de
los viales en agua precalentada a 40C. El material descongelado se mantiene en hielo y se utiliza tan
pronto como sea posible (en 30 minutos si se utiliza DMSO) para infectar un ternero esplenectomizado
susceptible (libre de contaminantes potenciales para la vacuna) mediante inoculacin intravenosa.
La sangre adecuada para la vacuna se obtiene mediante monitorizacin de frotis de sangre de yugular y
recoleccin del volumen necesario de sangre cuando se alcanza una parasitemia adecuada. Una
parasitemia de 1 x 108/ml (aproximadamente 2% de parasitemia en sangre de yugular) es adecuada, por lo
general, para la produccin de la vacuna. Si no se obtiene una parasitemia adecuada de B. bovis, puede
554
ser necesario el pase de la cepa mediante subinoculacin de 100-500 ml de sangre en un segundo ternero
esplenectomizado. No se recomienda el pase de B. bigemina.
La sangre del ternero donante infectado se recoge mediante canulacin de la yugular empleando como
anticoagulante heparina libre de conservantes (5 Unidades Internacionales [UI]de heparina/ml de sangre).
En el laboratorio, la sangre parasitada se mezcla con volmenes iguales de glicerol 3M en PBS
suplementado con glucosa 5 mM (la concentracin final de glicerol es 1.5 M) a 37C durante 30 minutos. La
mezcla se equilibra entonces a 37C durante 30 minutos, y se dispensa en contenedores adecuados (por
ejemplo crioviales de 5 ml). Los viales se enfran a razn de aproximadamente 10 C /minuto en la fase de
vapor de nitrgeno lquido y, una vez congelados, se almacenan en la fase lquida (12, 14).
El DMSO puede ser empleado como crioprotector en lugar del glicerol. Ello se lleva a cabo de la misma
forma que la descrita para la preparacin del inculo original (34).
Si una vacuna congelada con glicerol va a ser diluida, el diluyente debe ser iso-osmtico y consistir en PBS
conteniendo glicerol 1.5 M y glucosa 5 mM. De manera similar, el diluyente empleado en la vacuna
criopreservada con DMSO debe ser iso-osmtico, y debe contener la misma concentracin de DMSO en
PBS.
Se puede preparar una vacuna congelada que contenga tanto B. bovis como B. bigemina (27) mezclando
igual nmero de parsitos obtenidos a partir de donantes distintos.
Despus de su reconstitucin y dilucin, la dosis recomendada de vacuna oscila entre 1 a 2 ml,
dependiendo de las prcticas y requisitos locales.
b)
Produccin de vacuna refrigerada

El material infeccioso utilizado en la preparacin de la vacuna refrigerada se obtiene de la misma manera
que la vacuna congelada, pero debe ser expedido y utilizado tan pronto como sea posible despus de la
recogida. Si es necesario obtener el mximo nmero de dosis por ternero, el material infeccioso puede
diluirse para proporcionar el nmero necesario de parsitos por dosis (normalmente 2,5 a 10 x 107). Un
diluyente adecuado es suero bovino estril al 10% en una solucin equilibrada de sales conteniendo los
siguientes ingredientes por litro: NaCl (7,00 g), MgCl2.6H2O (0,34 g), glucosa (1,00 g), Na2HPO4 (2,52 g),
KH2PO4 (0,90 g), y NaHCO3 (0,52 g).
La sangre que contiene B. divergens puede diluirse en solucin de Hanks. Si no se necesita diluyente, se
pueden emplear como anticoagulantes dextrosa cido ctrico o dextrosa citrato fosfato estriles, a razn de
una parte por cuatro partes de sangre, para proporcionar la glucosa necesaria para la supervivencia del
parsito.
3.
Control interno
a)
Fuentes y mantenimiento de los donantes de vacuna

Debe identificarse una fuente de donantes libres de infecciones naturales con Babesia, otras enfermedades
transmitidas por insectos, y otros agentes infecciosos transmisibles por la sangre. Si no se encuentra
disponible una fuente adecuada, puede ser necesario criar terneros donantes en condiciones libres de
garrapatas con ese objetivo especfico.
Los terneros donantes se deben mantener en condiciones que prevengan la exposicin a enfermedades
infecciosas y a garrapatas e insectos chupadores. En ausencia de las instalaciones adecuadas, se debe
estimar el riesgo de contaminacin con los agentes de enfermedades infecciosas presentes en el pas
implicado, y se deberan sopesar los beneficios de la produccin local de vacuna (en contraposicin a la
importacin de un producto adecuado) frente a las posibles consecuencias adversas de diseminacin de la
enfermedad (8).
b)
Ciruga
Los terneros donantes deben ser esplenectomizados pera permitir un rendimiento mximo de parsitos
para la produccin de la vacuna. Esto se realiza mejor en terneros jvenes y bajo anestesia general.
c)
Eleccin de donantes de vacuna antes de la inoculacin

Los terneros donantes deben examinarse para la presencia de agentes de todas las infecciones
transmisibles por la sangre prevalentes en el pas, incluyendo Babesia, Anaplasma, Theileria y
555
Trypanosoma. Ello se puede realizar mediante el examen rutinario de tinciones de frotis de sangre despus
de esplenectoma, y preferiblemente mediante pruebas serolgicas pre- y post-cuarentena. Los terneros
que muestren evidencia de infecciones naturales con alguno de estos agentes deben ser rechazados. Se
debe confirmar la ausencia de otros agentes infecciosos endmicos en el pas, pudiendo incluir los agentes
de la leucosis bovina enzotica, el virus de la inmunodeficiencia bovina, pestivirus bovino, rinotraqueitis
bovina infecciosa, la enfermedad de Akabane, fiebre efmera, lengua azul, glosopeda y peste bovina. Los
procedimientos de ensayo dependern de las enfermedades prevalentes en el pas y la disponibilidad de
pruebas, pero deben consistir en serologa de parejas de sueros y, en algunos casos, aislamiento de los
virus y deteccin del antgeno o ADN (12, 34).
d)
Seguimiento de las parasitemias despus de la inoculacin.

En la sangre recogida para la vacuna es necesario determinar la concentracin de parsitos. Existen
tcnicas precisas para determinar el recuento de parsitos (1), aunque la concentracin parasitaria puede
ser estimada a partir del recuento de RBC y la parasitemia (% de RBCs infectados).
e)
Recogida de sangre para la vacuna

Todo el equipamiento debe ser esterilizado antes de usarse (por ejemplo mediante autoclavado). Cuando
se alcanza la parasitemia deseada se recoge la sangre en presencia de heparina empleando tcnicas
estrictas de asepsia. Ello se realiza mejor si el ternero es sedado con, por ejemplo, xylazina y mediante el
empleo de un sistema de recogida en circuito cerrado.
Se pueden recoger hasta 3 litros de sangre fuertemente infectada a partir de un ternero de 6 meses. Est
indicada la transfusin de una cantidad similar de sangre de un donante adecuado si el ternero se va a
mantener vivo. Alternativamente, el ternero debe ser sacrificado inmediatamente despus de recoger la
sangre.
f)
Distribucin de la vacuna
Todos los procedimientos se realizan en un ambiente adecuado, tal como una cabina de flujo laminar,
empleando tcnicas estriles estndar. El uso de un agitador magntico o mecnico asegurar la correcta
mezcla de la sangre y el diluyente a lo largo del proceso de reparto.
4.
Control del lote
La potencia, seguridad y esterilidad de los lotes de vacuna no se pueden determinar en el caso de la vacuna
refrigerada, y las especificaciones de la vacuna congelada dependen del cdigo prctico del pas implicado. A
continuacin se indican las especificaciones para la vacuna congelada producida en Australia.
a)
Esterilidad y ausencia de contaminantes

Para cada lote de vacuna y diluyente se utilizan ensayos estndar de esterilidad. Se determina la ausencia
de contaminantes realizando pruebas serolgicas apropiadas en el ganado donante y mediante inoculacin
de linfocitos donantes en ovejas monitorizndolas para la presencia de infecciones vricas. Los agentes de
la leucosis bovina enzotica, rinotraqueitis infecciosa bovina, pestivirus bovino, fiebre efmera, enfermedad
de Akabane, el virus Aino, Brucella abortus y Leptospira, glosopeda, enfermedad nodular cutnea de los
bvidos, fiebre del valle del Rift, peste bovina, pleuroneumona bovina contagiosa, cowdriosis, enfermedad
de Jembrana, y especies patgenas de Theileria y Trypanosoma (12, 14) son contaminantes potenciales.
b)
Inocuidad
Las reacciones a la vacuna en el ganado inoculado en la prueba de potencia (ver Seccin C. 4. c.) se
monitorizan midiendo la parasitemia, la fiebre y la prdida del volumen de las clulas concentradas.
Solamente se libran para su uso los lotes con niveles de patogenicidad iguales o menores que un estndar
predeterminado.
c)
Potencia
El concentrado congelado de vacuna con glicerol se descongela y se diluye 1/5 con diluyente isotnico (12,
14). La vacuna preparada se incuba entonces durante 8 horas a 30 C, y se inoculan subcutneamente
cinco terneros con dosis de 2 ml cada uno. En los terneros inoculados se monitoriza la presencia de
infecciones mediante el examen de frotis de sangre teidos. Solamente se libran para su uso los lotes
completamente infectivos a una dilucin de trabajo de 1/5.
556
d)
Normalmente la inmunidad a largo plazo es consecuencia de una sola inoculacin. Se han descrito
evidencias de fallos en vacunas de B. bovis (4) y estn relacionados con el tipo de cepas de vacuna, la
presencia de cepas silvestres heterlogas, y factores del hospedador. Existe escasa evidencia de
disminucin de inmunidad con relacin al tiempo (8).
e)
Estabilidad
La vacuna se puede mantener almacenada en nitrgeno lquido durante 5 aos. El diluyente estril se
puede almacenar en el frigorfico durante 2 aos. La vacuna descongelada pierde rpidamente potencia y
no se puede volver a congelar.
f)
Conservantes
En el momento de la dispensacin se aaden a la vacuna penicilina (500,00 UI/litro) y estreptomicina
(370,000 g/litro).
g)
Uso de la vacuna
En el caso de la vacuna congelada, los viales se deben descongelar mediante inmersin en agua
precalentada a 40C. La vacuna con glicerol debe mantenerse fra y usarse en 8 horas (9, 10), mientras que
la vacuna con DMSO como crioprotector debe mantenerse en hielo y ser utilizada a los 15-30 minutos de
descongelacin.
La vacuna fra debe mantenerse refrigerada y usarse a los 4-7 das de la preparacin, dependiendo de la
viabilidad de los parsitos.
Las cepas de B. bovis, B. divergens y B. bigemina empleadas en la vacuna pueden presentar virulencia
atenuada, por lo que no sern completamente seguras. Por tanto, una recomendacin prctica consiste en
limitar el uso de la vacuna a terneros, donde la inmunidad inespecfica minimizar el riesgo de reacciones a
la vacuna. Si se van a vacunar animales viejos, existe el riesgo de reacciones graves. Estas reacciones
aparecen poco frecuentemente, aunque las hembras gestantes o las reservas de engorde valiosas justifican
la debida atencin, y deben ser observados diariamente durante 3 semanas despus de la vacunacin. De
manera ideal, se deberan tomar las temperaturas rectales del ganado vacunado y los animales deben ser
tratados si se desarrolla fiebre apreciable. Las reacciones frente a B. bigemina y B. divergens se observan
generalmente hacia el da 6-8 y las de B. bovis hacia el da 10-16 (8).
La inmunidad protectora se desarrolla en 3-4 semanas y en la mayora de los casos dura al menos 4 aos.
A menudo las vacunas de babesiosis y anaplasmosis se utilizan conjuntamente, aunque no es aconsejable
utilizar otras vacunas al mismo tiempo (8).
h)
Precauciones
Las vacunas de B. bovis y B. bigemina no son infectivas en humanos. Sin embargo han sido descritos
casos de B. divergens en individuos esplenectomizados. Cuando la vacuna se almacena en nitrgeno
lquido, se aplican las precauciones habituales referidas al almacenamiento, transporte y manejo de
material ultracongelado.
5.
a)
Inocuidad
Ver Seccin C. 4. b.
b)
Potencia
Ver Seccin C. 4. c.
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*
* *
559
CAPTULO 2.3.9.
CISTICERCOSIS BOVINA
Ver Captulo 2.10.1. Cisticercosis
*
* *
560
CAPTULO 2.3.10.
DERMATOFILOSIS
RESUMEN
La dermatofilosis (tambin conocida como estreptotricosis) es una dermatitis exudativa y pustular
que afecta principalmente al ganado vacuno, ovejas y caballos, pero tambin a cabras, perros y
gatos, muchos mamferos salvajes, reptiles y, en ocasiones, al hombre. La enfermedad, grave en
los rumiantes, se debe a efectos inmunomoduladores inducidos por infestacin con la garrapata
Amblyomma variegatum.
El diagnstico de laboratorio de la dermatofilosis depende de la demostracin de la bacteria
Dermatophilus congolensis en material clnico procedente de la piel o de otros rganos. Raramente
se ven afectados otros lugares distintos a la piel. En los cocodrilos se puede encontrar
Dermatophilus cheloniae.
Identificacin del agente: Dermatophilus congolensis afecta generalmente a la epidermis
produciendo la formacin de costras. Puede demostrarse en frotis procedentes de costras
emulsionadas o maceradas en agua o en frotis de impresin de la base de las costras adherentes
recin extradas. El microorganismo es Gram positivo, pero su morfologa es ms fcil de observar
en frotis teidos con Giemsa. En frotis teidos, el microorganismo se presenta como filamentos
ramificados con mltiples cadenas de cocos. Esta apariencia caracterstica posee valor
diagnstico. En costras secas o con infeccin secundaria, pueden presentarse slo cocos libres,
de modo que se requiere tincin por inmunofluorescencia. Se puede demostrar Dermatophilus
congolensis en secciones histopatolgicas por tincin con Giemsa o por inmunofluorescencia. En
los cocodrilos se puede encontrar Dermatophilus cheloniae.
El aislamiento de D. congolensis a partir de costras recin extradas es directo, pero el
microorganismo se enmascara fcilmente por el crecimiento excesivo de otras bacterias. Cuando
se cultiva a partir de zonas contaminadas, resultan necesarias tcnicas especiales que incluyen
filtracin, quimiotaxis o medios selectivos.
La demostracin e identificacin de D. congolensis mediante inmunofluorescencia es un mtodo de
diagnstico fiable y muy sensible, pero requiere que los laboratorios dispongan de sus propios
antisueros de diagnstico ya que no estn disponibles comercialmente. Aunque se han descrito
reacciones antignicas cruzadas con especies de Nocardia, sta proporciona solamente una
fluorescencia dbil. En teora, se debera utilizar un anticuerpo monoclonal especfico para
D. congolensis.
Pruebas serolgicas: Se han utilizado varias pruebas serolgicas en estudios de la epidemiologa
y patognesis de la dermatofilosis. Los anticuerpos se pueden demostrar en todos los casos
excepto en la sangre fetal de rumiantes sanos, pero se pueden utilizar los elevados niveles
asociados con la infeccin clnica para identificar los animales que han sido infectados con la
enfermedad.
Requisitos para las vacunas y los materiales de diagnstico: En la actualidad, no hay vacunas
disponibles.
561
Captulo 2.3.10. Dermatofilosis
A. INTRODUCCIN
La dermatofilosis (tambin conocida como estreptotricosis, o, en el caso de las ovejas, como "enfermedad
nodular de la lana") es una dermatitis exudativa y pustular que afecta principalmente al ganado vacuno, ovejas y
caballos, pero tambin a cabras, perros y gatos a muchos mamferos salvajes, reptiles y, en ocasiones, al
hombre. Es la enfermedad cutnea ms comn de los cocodrilos en Australia y tiene impacto en las granjas de
esta especie (2). La dermatofilosis est causada por la bacteria Dermatophilus congolensis, la especie tipo del
gnero Dermatophilus, que es un miembro de los Actinomicetos (Dermatophilus cheloniae se ha aislado de los
cocodrilos). Tpicamente, la infeccin origina la formacin de costras densas en la piel pero en ciertas reas,
como en el perineo de los rumiantes y en las articulaciones de los caballos, se pueden presentar lesiones
hmedas con piel engrosada y plegada. En tales lesiones se encuentran costras relativamente finas. Donde las
lesiones se exponen a la humedad prolongada, con infeccin secundaria o sin ella, se pueden presentar lesiones
exudativas.
La enfermedad, grave en rumiantes, se debe a los efectos inmunomoduladores inducidos por la infestacin con
individuos adultos de la garrapata Amblyomma variegatum (1).
Debe recordarse que tanto las costras como los cultivos pueden originar infecciones en el hombre.
1.
Normalmente el diagnstico se basa en la demostracin del microorganismo causante de las lesiones en las
costras o en el exudado que se encuentra debajo de las costras. El microorganismo presenta un aspecto
microscpico caracterstico -sus filamentos septados y ramificados se dividen longitudinal y transversalmente
formando cadenas de cocos esfricos u ovoides, cada uno de 0,5 m de dimetro, en varias filas. Esta
morfologa posee valor diagnstico, siempre que los cocos se dispongan en filas transversales de cuatro o ms,
y es fcilmente visible en preparaciones teidas. Sin embargo, esta disposicin peculiar puede alterarse durante
la preparacin de los frotis para examen si el material se extiende de modo demasiado vigoroso sobre el
portaobjeto.
Se pueden preparar frotis por impresin en las superficies hmedas y cncavas de costras recin eliminadas.
Tambin se preparan frotis densos a partir de costras emulsionadas en agua destilada estril. Alternativamente,
las costras se pueden remojar durante la noche en agua destilada o en solucin salina para humedecerlas y
utilizar la superficie inferior para frotis de impresin, presionando firmemente esta superficie sobre un porta para
microscopa. Los frotis se secan luego al aire, se fijan con calor o por inmersin en metanol durante 5 minutos, y
se tien. El microorganismo se tie bien con fucsina fenicada diluida o con azul de metileno, pero la mejor
diferenciacin en frotis densos se logra con la tincin de Gram o, preferiblemente, con una dilucin 1/10 de
Giemsa durante 30 minutos, mediante las cuales aparece D. congolensis teido de oscuro y contrastando con el
fondo ms plido o rosado de la tincin de contraste tomada por los queratinocitos y los neutrfilos. La tincin de
Gram no da tan buenos resultados como la de Giemsa debido a que puede sobrecolorear el fondo y no mostrar
claramente la disposicin escalonada de las formas cocoides.
Con frecuencia las costras hmedas o con infeccin secundaria contienen muy pocos filamentos intactos, y el
microorganismo puede no teirse como Gram positivo. En tales muestras, los cocos no se pueden distinguir
morfolgicamente de otros cocos bacterianos, de modo que se necesita tincin por inmunofluorescencia. Sin
embargo, los antisueros especficos para inmunofluorescencia no estn disponibles comercialmente. Se utilizan
frotis finos, fijados por calor. En casos difciles y cuando se sospecha la infeccin de rganos distintos de la piel,
se aconseja el examen histopatolgico deL material de las biopsias o necropsias. Se emplea la tincin de
Giemsa o la inmunofluorescencia.
En la mayora de los casos, el aspecto caracterstico de las lesiones y del microorganismo en los frotis de
dermatofilosis bovina tpica hace innecesario el cultivo. Sin embargo, en los casos raros en los que un frotis
teido con Giemsa no suministre un resultado definitivo, se puede confirmar el diagnstico aislando la bacteria.
Los cultivos se llevan a cabo en agar-sangre y se incuban a 37C. El crecimiento se acelera en condiciones de
microaerofilia; a las 24 horas se observan colonias de color grisceo amarillento, normalmente hemolticas, de
alrededor de 1 mm de dimetro, formando hoyos en el medio. La incubacin aerobia produce a las 24 horas
colonias puntiformes similares que crecen hasta 1 mm a las 48 horas. Las colonias de aspecto rugoso se forman
por los filamentos ramificados, pero el crecimiento continuo aerbico estimula la produccin de cocos, que por lo
general son de color amarillo. Las colonias toman un aspecto liso, frecuentemente amarillento. Normalmente los
cocos son muy mviles cuando proceden de cultivos jvenes. Las colonias deben diferenciarse de las de
especies de Nocardia y Streptomyces, ninguna de las cuales produce filamentos que se fragmentan para dar
lugar a mltiples cadenas de cocos mviles.
562
Captulo 2.3.10. Dermatofilosis
Para el aislamiento, el material se puede extender directamente a partir de las superficies internas de las costras
no contaminadas y recin extradas o de emulsiones de costras, pero el crecimiento relativamente lento de D.
congolensis resulta fcilmente enmascarado por el excesivo crecimiento de otras bacterias. Por tanto se
requieren tcnicas especiales para el estudio de muestras contaminadas. En la mayora de las muestras de
emulsiones de material se presentan cocos libres, bien sean mviles o no. Normalmente es suficiente una
filtracin de la emulsin por un filtro de membrana de 0,45 m para reducir o eliminar los contaminantes y
permitir el aislamiento del filtrado, como se describe arriba. Alternativamente, se puede usar el mtodo de
Haalstra (3). Se colocan pequeos trozos de costra en una botella con 1 ml de agua destilada estril y se
mantiene durante 3-4 horas a temperatura ambiente. La botella abierta se coloca luego durante 15 minutos en
una jarra de anaerobios. Se extraen muestras de la superficie del lquido con un asa bacteriolgica y se cultivan.
El mtodo depende de la liberacin de la costra de cocos mviles de D. congolensis y su atraccin quimiotrpica
hacia la atmsfera rica en dixido de carbono de la jarra de anaerobios. Tambin se puede utilizar un medio
selectivo que incluye 1000 unidades/ml de polimixina B en agar-sangre, que resulta efectivo cuando el
contaminante es susceptible a este antibitico.
Para la identificacin de antgenos de D. congolensis y para el diagnstico de la dermatofilosis, la tincin de frotis
o tejidos por inmunofluorescencia es la tcnica inmunolgica ms fiable y sensible. Se pueden preparar con
facilidad, por mtodos estndar, anticuerpos policlonales de animales inoculados con D. congolensis, pero existe
el riesgo de posible reaccin cruzada con especies de Nocardia. Es preferible la utilizacin de anticuerpos
monoclonales contra antgenos especficos de especie (4). Se tien frotis finos de emulsiones de costras que se
fijan por calor o frotis de impresin. Siempre deben incluirse muestras conocidas como control positivo y control
negativo.
2.
Pruebas serolgicas
El diagnstico clnico se lleva a cabo mejor utilizando los mtodos descritos anteriormente que mediante los
mtodos serolgicos. Los anticuerpos se pueden demostrar en todos los casos, excepto en la sangre fetal de
rumiantes sanos, pero los niveles aumentan con la infeccin clnica. El enzimoinmunoensayo (ELISA) constituye
un mtodo sensible y cmodo, y la elevacin de los ttulos por encima de los valores basales puede utilizarse en
estudios epidemiolgicos para identificar animales que han padecido la enfermedad (5). En la actualidad, el
ELISA solo es adecuado como un mtodo de investigacin; no se utiliza en el diagnstico habitual.

Las vacunas estn en fase de desarrollo, pero an no estn disponibles en el mercado.
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*
* *
563
CAPTULO 2.3.11.
TEILERIOSIS
RESUMEN
Los parsitos del ganado vacuno y transmitidos por garrapatas del gnero Theileria constituyen
importantes restricciones para la mejora de la industria ganadera en amplias regiones del Viejo
Mundo1. Las especies ms importantes econmicamente, Theileria annulata y T. parva, son
responsables de una mortalidad y de prdidas en la produccin que solamente pueden adivinarse,
aunque sistemticamente estas especies estn documentadas como una causa muy importante de
enfermedad. Generalmente, la theileriosis bovina se controla mediante el uso de acaricidas para
matar a las garrapatas, aunque este mtodo no es sostenible porque los acaricidas son caros,
porque se ha desarrollado resistencia frente a muchos de ellos, porque las normas con respecto a
la circulacin del ganado vacuno y la cuarentena no se hacen cumplir de manera rigurosa, y,
porque habitualmente la gestin y el mantenimiento de los baos desinfectantes y los sistemas de
pulverizacin son deficientes.
Identificacin del agente: El diagnstico de una variedad de sndromes provocados por los
parsitos se basa principalmente en los sntomas clnicos, el conocimiento de la enfermedad y la
distribucin del vector, y la identificacin de los parsitos en la sangre teida mediante Giemsa y
frotis de ganglios linfticos. La presencia del esquizonte en frotis de biopsias de ganglios linfticos
es un rasgo diagnstico caracterstico de las infecciones con T. parva y T. annulata. Los animales
infectados con T. parva presentan ganglios linfticos hipertrficos, fiebre, una frecuencia
respiratoria que crece gradualmente, disnea y diarrea espordica. Las lesiones post mortem
observadas son edema pulmonar, hipertrofia del bazo, espuma en la traquea, hipertrofia de los
ganglios linfticos, hemorragias en los rganos internos, erosiones abomasales y presencia de
linfocitos parasitados e infiltraciones linfoproliferativas en los tejidos viscerales. La patologa
general provocada por los esquizontes de T. annulata recuerda la de T. parva, aunque las fases de
piroplasma tambin pueden ser patgenas, causando anemia e ictericia.
Pruebas serolgicas: El ensayo ms ampliamente utilizado para el diagnstico de las especies
de Theileria es la prueba de inmunofluorescencia indirecta (IFI). Para realizar la prueba de IFI,
pueden prepararse antgenos de esquizonte y piroplasma sobre portas o en suspensin y
almacenarse mediante congelacin a 20C, excepto en el caso de la suspensin de piroplasma,
que se guarda a 4C. Los sueros problema se diluyen con lisado de linfocitos bovinos y se incuban
con el antgeno en suspensin, y entonces se aade una inmunoglobulina anti-bovina conjugada.
La fluorescencia es especfica para el agente causal si se utiliza el ensayo como se describe. El
ensayo IFI es sensible, bastante especfico y, normalmente, fcil de realizar. Sin embargo,
presenta limitaciones para estudios a gran escala en zonas donde las especies se solapan,
debido a los problemas de reaccin cruzada entre algunas especies de Theileria. El ensayo IFI
para T. parva no distingue entre diferentes concentrados inmunognicos. Los nuevos
enzimoinmunoensayos para T. parva y T. mutans, basados en antgenos recombinantes
especficos del parsito, han demostrado mayor sensibilidad y especificidad y han sustituido
mayoritariamente a los ensayos IFI utilizados previamente en frica. Adems, los ensayos
diagnsticos moleculares ms recientes, en particular aquellos basados en la reaccin en cadena
de la polimerasa y la hibridacin de lnea inversa, estn demostrando ser herramientas poderosas
para la caracterizacin de polimorfismos parasitarios, definiendo una gentica de poblaciones y
generando datos epidemiolgicos.
564
En este Captulo, el trmino Nuevo Mundo se refiere a las Amricas, y el trmino Viejo Mundo se refiere a Europa,
Africa y Asia.
Captulo 2.3.11. Teileriosis
Requisitos para las vacunas y los materiales de diagnstico: Las vacunas fiables, de eficacia
conocida, constituyen un desarrollo reciente. La vacuna frente a T. annulata se prepara a partir de
lneas celulares infectadas con esquizontes que han sido aislados a partir de ganado vacuno y
atenuados durante el cultivo in-vitro. La vacuna contiene clulas infectadas con esquizontes y debe
mantenerse congelada hasta poco antes de la administracin. La vacunacin frente a T. parva se
basa en un mtodo de infeccin y tratamiento en el cual al ganado vacuno se le administra una
dosis subcutnea de esporozoitos derivados de garrapatas y un tratamiento simultneo con una
formulacin de tetraciclina de larga duracin. Este tratamiento da por resultado una reaccin de
fiebre de la Costa Este moderada o no aparente seguida de recuperacin. Los animales
restablecidos presentan una inmunidad fuerte frente a un estmulo homlogo, la cual se mantiene
toda la vida del animal.
En el mtodo de vacunacin con clulas vivas puede ser necesario utilizar ms de un concentrado
del parsito para inducir una inmunidad protectora ms amplia. Generalmente, los animales
inmunizados llegan a hacerse portadores del concentrado parasitario inmunizante. Deben tomarse
precauciones de seguridad en la preparacin y la manipulacin de vacunas de T. parva para
proteger a los trabajadores implicados y para evitar la contaminacin de los estabilizados. Tambin
debera considerarse el riesgo de introducir nuevos aislados en una zona en la que entonces
pueden establecerse como portadores.
A. INTRODUCCIN
Las teilerias son parsitos protozoarios intracelulares obligados que infectan Bovidae salvajes y domsticos en la
mayor parte del mundo (algunas especies tambin infectan a pequeos rumiantes). Se transmiten por garrapatas
ixodides, y presentan ciclos vitales complejos en los hospedadores vertebrados e invertebrados. Existen seis
especies identificadas de Theileria que infectan el ganado vacuno; T. parva y T. annulata son las dos ms
patgenas y las ms importantes desde el punto de vista econmico. T. parva se encuentra en 13 pases del
Africa subsahariana y causa la fiebre de la Costa Este, la enfermedad Corridor y la enfermedad January.
Theileria annulata, la causa de la teileriosis tropical, se encuentra en grandes zonas de la costa Mediterrnea del
Norte de Africa, extendindose hacia el norte de Sudn, y hacia Europa del sur. Tambin se encuentran
afectadas el Sur-este de Europa, el prximo y Medio Este, India, China y Asia Central. Generalmente, Theileria
taurotragi y T. mutans no causan enfermedad o bien provocan una enfermedad leve, y T. velifera no es
patgena. Estos tres ltimos parsitos se encuentran principalmente en Africa, y se solapan en su distribucin,
complicando la epidemiologa de la theileriosis en el ganado vacuno. Actualmente, se cree que el grupo de
parsitos mencionado como el complejo T. sergenti/T. buffeli/T. orientalis consiste en dos especies- T. sergenti y
T. buffeli/T. orientalis; este ltimo puede denominarse como T. buffeli (14).
La mayora de los concentrados de Theileria parva producen un estado de portador en el ganado vacuno
recuperado, y estudios recientes en los que se utilizaron marcadores de ADN para cepas del parsito han
mostrado que los animales portadores de T. parva constituyen una fuente de infeccin y que el parsito puede
transmitirse por las garrapatas de manera natural en el campo (R. Bishop, R. Skilton, D. Odongo y S. Morzaria,
datos no publicados). La gravedad de la fiebre de la Costa Este puede variar dependiendo de factores tales
como la virulencia de la cepa del parsito, las tasas de infeccin de esporozoitos en las garrapatas y el fondo
gentico de los animales infectados. A menudo se observa que el ganado vacuno autctono de las zonas
endmicas de fiebre de la Costa Este experimenta una enfermedad leve o infeccin subclnica, mientras que el
ganado vacuno indgena o extico introducido desarrolla normalmente una enfermedad grave.
El mtodo ms prctico y ms ampliamente utilizado para el control de la teileriosis consiste en el control qumico
de las garrapatas con acaricidas. Sin embargo, la prctica del control de las garrapatas se ha vuelto menos
segura debido a la resistencias al acaricida, el elevado coste de estos, la pobre gestin del control de las
garrapatas y el movimiento ilegal del ganado vacuno en muchos pases. Para T. annulata se ha utilizado
ampliamente la vacunacin empleando lneas celulares infectadas con esquizontes atenuados, mientras que
para el control de T. parva en varios pases de Africa del este, central y del sur, se est aplicando la infeccin
empleando esporozoitos derivados de garrapatas y el tratamiento con tetraciclina.
Para tratar T. parva y T annulata, se utiliza la quimioterapia empleando parvaquone, buparvaquone y
halofuginone, aunque los tratamientos con estos agentes no esterilizan las infecciones por teilerias.
565
El diagnstico se basa en los sntomas clnicos, el conocimiento de la enfermedad y la distribucin del vector, as
como el examen de la sangre teida con Giemsa y de frotis de ganglios linfticos e impresiones de tejidos.
Theileria parva y T. annulata se diagnostican mediante la deteccin de los esquizontes en las clulas blanca o de
los piroplasmas en los eritrocitos. La fase de piroplasma sigue a la fase de esquizonte y, tanto en T. parva como
en T. annulata, generalmente es menos patgena y, por tanto, se encuentra a menudo en casos recuperados o
menos agudos.
1.
Identificacin del agente ( prueba prescrita para el comercio internacional)
La presencia del esquizonte en biopsias teidas mediante Giemsa o en frotis de impresiones de tejido de
ganglios linfticos, hgado y bazo, es un rasgo diagnstico caracterstico de las infecciones por T. parva y
T. annulata. Los esquizontes son transitorios en el grupo T. sergenti/T. buffeli/T. orientalis, y la fase de
piroplasma puede ser patgena. Los esquizontes de T. taurotragui no se detectan fcilmente en frotis de sangre
teidos mediante Giemsa. T. velifera puede distinguirse por la presencia de un velo en una cara del piroplasma.
Los esquizontes de T. mutans, si se detectan, son diferentes de los de T. parva, y presentan partculas nucleares
ms grandes, aplanadas e irregulares. Los piroplasmas (fase intraeritrocitaria) de T. parva, T. annulata y
T. mutans son similares, aunque los de T. annulata y T. mutans, normalmente, son ms grandes y pueden
observarse mientras se dividen. Sin embargo, desde un punto de vista prctico, los esquizontes y los
piroplasmas de las diferentes teilerias son difciles de distinguir en frotis teidos mediante Giemsa.
La fase patgena de T. parva y T. annulata es el esquizonte. Al principio causa un proceso linfoproliferativo, y
ms tarde provoca una enfermedad linfodestructiva. El animal infectado presenta un aumento de tamao de
los ganglios linfticos, fiebre, un aumento gradual de la frecuencia respiratoria, disnea y/o diarrea. Las lesiones
post-mortem ms frecuentes consisten en ganglios linfticos aumentados de tamao, un bazo notablemente
hipertrfico, edema pulmonar, espuma en la trquea, erosiones y ulceracin en el abomaso, y enteritis con
necrosis de las placas de Peyer. Los tejidos linfoides se hacen ms grandes en las fases iniciales de la
enfermedad, pero si el animal sobrevive se atrofian durante las fases crnicas de la misma. Cuando se examinan
histolgicamente, se encuentran presentes infiltraciones de linfocitos inmaduros en el pulmn, rin, cerebro,
hgado, bazo y ganglios linfticos. Las clulas parasitadas con esquizontes pueden encontrarse en frotis de
impresiones de todos los tejidos: los frotis de pulmn, bazo, rin, hgado y ganglios linfticos son
particularmente tiles para demostrar esquizontes, y, en casos de ms larga duracin, infiltraciones linfocitarias
de los riones que recuerdan a infartos. En los animales recuperados aparecen recadas ocasionales. En las
zonas endmicas de T. parva se observa, a veces, un sndrome nervioso denominado turning sickness, y se
considera que se encuentra asociado con la presencia de agregados intravasculares y extravasculares de
linfocitos infectados con esquizontes, trombosis y necrosis isqumica.
En T. annulata, tanto las fases de esquizonte como la de piroplasma pueden ser patgenas. Los esquizontes son
escasos en la sangre perifrica de los animales con enfermedad aguda. La patologa general causada por los
esquizontes de T. annulata recuerda a la de T. parva, mientras que la anemia y la ictericia son rasgos de la
patologa por piroplasmas. Las cepas patgenas de T. mutans tambin producen anemia, al igual que las cepas
de Japn y Corea referidas como T. sergentii.
Los piroplasmas de la mayora de las especies de Theileria pueden persistir durante aos o meses en los
animales recuperados, y pueden detectarse de manera intermitente en exmenes posteriores. Sin embargo, los
resultados negativos del examen microscpico de frotis de sangre no excluyen una infeccin latente. Puede
inducirse la recada en la parasitemia con algunas especies de Theileria mediante esplenectoma. Los
piroplasmas tambin se ven en los frotis preparados post-mortem, aunque los parsitos parecen encogidos y su
citoplasma apenas es visible.
La respuesta inmune frente a estos parsitos es complicada. La inmunidad mediada por clulas es la respuesta
protectora ms importante en T. parva y T. annulata. En T. parva, las principales respuestas protectoras se
encuentran mediadas a travs del complejo principal de histocompatibilidad (MHC) bovino de clase I y restringido
a los linfocitos T citotxicos.
2.
Pruebas serolgicas
Prueba de inmunofluorescencia indirecta (la prueba prescrita para el comercio

internacional)
El ensayo de inmunofluorescencia indirecta (IFI) es la prueba diagnstica para Theileria spp. ms
ampliamente utilizada.
566
Preparacin del antgeno de esquizonte
i)
Portas con antgeno de esquizonte

Los antgenos utilizados para los ensayos IFI de esquizontes se obtienen a partir de lneas celulares
infectadas con esquizontes y preparadas como se describe ms adelante:
Los cultivos con 200 ml a 1 litro de clulas infectadas con esquizontes de T. parva o T. annulata, de
los que al menos un 90% de las clulas se encuentran infectadas, se centrifugan a 200 g durante
20 minutos a 4C. Se retira el lquido sobrenadante y el precipitado celular se resuspende en 100 ml
de tampn salino fosfato (PBS) fro (4C), pH 7,2-7,4, y se centrifuga como antes. Este proceso de
lavado se repite tres veces y, despus del lavado final, se resuspende el precipitado en PBS
(aproximadamente 100 ml) para alcanzar una concentracin final de 107 clulas/ml.
Se preparan frotis con la suspensin celular sobre portas multipocillo recubiertos con Tefln2, o para
su separacin en portas ordinarios empleando TEXPEN3 o laca de uas. Los frotis deberan
proporcionar entre 50 y 80 clulas intactas por campo visual cuando se examinan con un objetivo de
40X.
Los antgenos se reparten sobre los portas utilizando una pipeta multicanal o una pipeta de 100 l.
Dispensando y aspirando inmediatamente la suspensin de esquizontes, queda una monocapa de
esquizontes en cada pocillo.
Este procedimiento se realiza para cada pocillo hasta que se agota el volumen. Con este
mtodo pueden obtenerse aproximadamente 600 portas de buena calidad que contienen un total de
6.000 puntos antignicos. Los frotis se secan al aire, se fijan en acetona durante 10 minutos, se
envuelven individualmente en papel de seda y, a continuacin, en grupos de cinco en papel
de aluminio, y se almacenan en contenedores plsticos hermticos e impermeables al agua a 20 o a
70C. Los antgenos se mantienen estables durante al menos 1 ao a 20C y durante ms tiempo a
70C.
ii)
Antgeno de esquizonte en suspensin

Primero se centrifugan 500 ml de clulas infectadas con T. parva o T. annulata que contienen
106 clulas/ml a 200 g durante 10 minutos a 4C, y el precipitado celular obtenido se lava dos veces
en 100 ml de PBS fro. La viabilidad de las clulas se determina mediante eosina o exclusin con azul
tripan (debera ser superior al 90%). Las clulas se resuspenden a 107/ml en tampn salino fro. A
este volumen se le aade gota a gota dos volumenes de una solucin de fijacin fra que contiene un
80% de acetona y formaldehdo al 0,1 % (0,25% de formalina) en PBS, mientras la suspensin celular
se agita lentamente y de manera continua. La suspensin celular se mantiene a 20C y se deja fijar
durante 24 horas. Las clulas fijadas se lavan entonces tres veces en tampn salino fro y se
centrifugan a 200 g durante 20 minutos a 4C. Despus del ltimo lavado, las clulas se resuspenden
a razn de 107/ml en tampn salino. Las clulas fijadas se distribuyen en alcuotas de 0,5 ml. El
antgeno con un 0,2% de azida sdica es estable a 4C durante 2 semanas, y se mantiene estable
indefinidamente a 20C. Este mtodo tambin se puede utilizar para preparar antgeno de esquizonte
de T. taurotragi (J. Katende, A. Musoke y S. Morzaria, datos no publicados).
Preparacin del antgeno de piroplasma
i)
Portas con antgeno de piroplasma

La fase de piroplasma de Theileria spp. no puede mantenerse en cultivo, con lo que el antgeno de
piroplasma debe prepararse a partir de animales infectados. Las infecciones experimentales se
inducen infectando subcutneamente al ganado vacuno con esporozoitos, o utilizando garrapatas
infectadas con T. parva, T. annulata o T. taurotragi. Los picos de parasitemias presentan una duracin
corta y, si los animales sobreviven a la enfermedad, el porcentaje de clulas rojas infectadas (RBC)
disminuye considerablemente en pocos das. Las infecciones con el grupo parsito referido como
T. sergentii/T. buffeli/T. orientalis, T. mutans o T. velifera se inducen, generalmente, inoculando
intravenosamente a ganado vacuno esplenectomizado con sangre de un animal portador, o con un
estabilizado de sangre, o mediante la aplicacin de garrapatas infectadas. Cuando la parasitemia de
piroplasmas es del 10% o superior, se recogen 100 ml de sangre infectada a partir de la vena yugular
en un contenedor de vaco heparinizado o con cido etiln diamino tetraactico (EDTA), y se mezclan
cuidadosamente con 2 litros de PBS. La mezcla se centrifuga a 500 g durante 10 minutos a 4C; se
retiran el plasma y la capa de clulas blancas, los RBC se resuspenden de nuevo en 2 litros de PBS, y
se repite el paso de centrifugacin. Es importante retirar la capa de clulas blancas despus de cada
lavado. Este procedimiento de lavado se repite cuatro veces. Despus del lavado final se utiliza una
alcuota de los RBC concentrados para preparar diluciones seriadas dobles en PBS, y se coloca una
gota de 5 l de cada dilucin sobre los portas. Las gotas secas se fijan con metanol y se tien con
colorante Giemsa, y se examina la concentracin de los RBS empleando un microscopio de campo
2
3
A la venta, por ejemplo, en Bellco Glass, Vineland, New Jersey, Estados Unidos, o Glaxo-Wellcome, Reino Unido.
A la venta en Twmark-tex, Roseland, N.J. 07068, EEUU.
567
claro. Se selecciona entonces para la preparacin a gran escala de portas con antgeno de piroplasma
la dilucin que proporciona una capa sencilla de RBS dispuestos uniformemente en la gota. Se
pueden preparar aproximadamente 10.000 portas de antgeno (100.00000 puntos antignicos) a partir
de 100 ml de sangre infectada. Los frotis con antgeno se dejan secar a temperatura ambiente antes
de fijarlos en acetona fra durante 10 minutos. Los frotis fijados pueden almacenarse de la misma
forma que los portas con los antgenos de esquizonte, y mantenerse durante tiempos similares.
ii)
Antgeno de piroplasma en suspensin

Se encuentra disponible un mtodo alternativo al descrito anteriormente para la preparacin de
antgenos, y ha sido probado en T. parva. En este procedimiento, se recogen 100 ml de sangre de una
animal con una alta parasitemia de piroplasmas y se preparan como se ha descrito previamente, y el
volumen de clulas concentradas se ajusta al 5% con PBS.
Se aade un volumen de la suspensin de RBC a dos volmenes de lquido de fijacin (ver ms arriba
en antgeno de esquizonte en suspensin) mientras se agita. Las clulas se dejan fijar a 20C
durante 24 horas. Las clulas fijadas se lavan entonces tres veces con PBS y se centrifugan a 1.000 g
durante 30 minutos. El sedimento se resuspende hasta el volumen original de sangre con PBS que
contiene un 0,2% de azida sdica.
El antgeno de piroplasma es estable a 4C cuando se conserva con azida sdica al 0,2% durante un
periodo de al menos 3 aos.
Estandarizacin del antgeno

Las suspensiones de antgeno de esquizonte y piroplasma se mezclan en un mezclador rotatorio y se titulan
en PBS mediante dilucin doble comenzando a partir de la muestra sin diluir hasta la dilucin 1/16. La
dilucin recomendada para el uso de ese lote de antgeno se toma como la dilucin que proporciona una
distribucin celular de aproximadamente 50-80 clulas infectadas con esquizontes, o 150-200 de RBC
infectados por campo visual cuando se examinan con una lente objetivo de 40X. Cuando se emplea esta
dilucin se preparan frotis de antgeno sobre portas. Los frotis de antgeno, ms los portas con antgeno
congelados previamente (y descongelados antes de usarse) se prueban frente a una gama de diluciones de
un panel de sueros control fuertes, intermedios, y dbilmente positivos y negativos. El antgeno se utiliza en
el ensayo IFI de rutina si los sueros control positivo son titulados hasta su ttulo conocido y los sueros
negativos control no dan fluorescencia.
En muchos laboratorios se utilizan rutinariamente ambos tipos de preparaciones de antgeno, los frotis
fijados con acetona almacenados a 20C o 70C, y los antgenos en suspensin fijados y almacenados a
4C o 20C. La sensibilidad de ambos tipos de antgenos es parecida. Los portas con antgenos pueden
utilizarse en los laboratorios donde se encuentran disponibles instalaciones para almacenamiento a baja
temperatura y una fuente segura de electricidad. Sin embargo, tales antgenos solamente pueden
transportarse en hielo seco o nitrgeno lquido. Los antgenos fijados en suspensin tienen la ventaja sobre
los portas con antgeno de que el mtodo inicial de preparacin es ms simple y rpido. Puede
almacenarse un lote grande de este antgeno en un contenedor y tomarse alcuotas cuando sea necesario,
a partir de las cuales se preparan frotis frescos para el ensayo IFI. Se evita, por lo tanto, la necesidad de
una instalacin de almacenamiento de gran tamao. Los antgenos fijados en suspensin tambin pueden
almacenarse a 4C y pueden transportarse a temperatura ambiente sin prdida de antigenicidad.
Preparacin del lisado de linfocitos bovinos
Se prepara un lisado de linfocitos de acuerdo con el mtodo descrito por Goddeeris et al. (15) para su
empleo en los ensayos con antgenos de T. parva en suspensin. Brevemente, se esplenectomiza un
ternero de 3 meses y se mantiene bajo condiciones libres de garrapatas y moscas tse-ts. Para excluir la
posibilidad de una infeccin latente, se toman frotis de sangre del animal diariamente durante un periodo de
4 semanas, se tien con colorante de Giemsa y se examinan para detectar la presencia de parsitos. Se
sacrifica el animal y se eliminan el timo y todos los ganglios linfticos accesibles. Estos tejidos se cortan en
pedacitos en PBS fro que contiene un 0,45% de EDTA como anticoagulante. Se extraen las clulas del
tejido, y se separan del resto pasndolas a travs de un pao de muselina, y se lavan tres veces con
PBS/EDTA mediante centrifugacin a 200 g durante 20 minutos a 4C. Los linfocitos lavados se
resuspenden en PBS sin EDTA hasta dar una concentracin final de 5 x 107 clulas/ml. Las clulas se
destruyen mediante sonicacin en alcuotas de 100 ml en hielo durante 5 minutos empleando la sonda de
3/8. El material sonicado se centrifuga a 1.000 g durante 30 minutos a 4C y el sobrenadante, ajustado a
10 mg protena/ml, se almacena a 20C en alcuotas de 4 ml.
Antes de desenpaquetarlos, los portas con antgenos de esquizonte y piroplasma se sacan del almacenaje
a 20C y se dejan descongelar durante 30 minutos a 4C y 30 minutos a temperatura ambiente. El
antgeno de esquizonte congelado, fijado en suspensin y almacenado a 20C, se descongela a
568
temperatura ambiente, mientras que el antgeno de piroplasma, mantenido a 4C, se resuspende mediante
agitacin, se pasa a travs de una aguja de calibre 25 para deshacer los grumos (no es necesario para el
antgeno de esquizonte), y se diluye hasta alcanzar las diluciones estandarizadas previamente. Los
antgenos se distribuyen sobre los portas empleando una pipeta multicanal o una pipeta de 100 l.
Dispensando y aspirando inmediatamente la suspensin de esquizonte o piroplasma, quedar una
monocapa de esquizontes o piroplasmas en cada pocillo. Los portas se dejan secar bien a 37C o a
Para la investigacin inicial utilizando antgeno en suspensin de T. parva, se preparan diluciones 1/40 de
los sueros problema y control en lisado de linfocitos (195 l de lisado de linfocitos + 5 l de suero), y se
incuban durante 30 minutos a temperatura ambiente. Para los portas con antgeno se emplean las
diluciones 1/40 y 1/60. Si se desea obtener un ttulo de anticuerpo de punto final, se pueden preparar
diluciones dobles o quntuples en PBS. Para cada porta se incluyen los sueros control positivo y negativo
diluidos 1/40. Los portas se incuban a temperatura ambiente en una cmara hmeda durante 30 minutos, y
entonces se lavan dos veces en PBS durante 15 minutos. A cada pocillo se le aaden 20 l de
inmunoglobulina antibovina conjugada con isotiocianato de fluorescena (FITC) a la dilucin ptima
recomendada. Como colorante de contraste se incorpora en el conjugado azul Evans a una dilucin final de
1/10.000. Los portas se incuban durante 30 minutos a temperatura ambiente en una cmara hmeda, se
lavan como antes, se montan con un cubreobjetos en glicerol al 50% en PBS, pH 8,0, y se examinan para
observar fluorescencia empleando por ejemplo un microscopio fluorescente equipado con iluminacin epiKoem (lmpara de mercurio de 100 W), con filtro de UV, oculares 6,3X y objetivos de inmersin Phaco FL
40/1,3.
Caractersticas del ensayo de inmunofluorescencia indirecta

Empleando el ensayo como se ha descrito, la fluorescencia es normalmente especfica para las especies
concretas de Theileria (ver ms adelante). La incorporacin del azul Evans proporciona un buen contraste,
haciendo fcil la lectura. El montaje de los portas en glicerol al 50% a pH 8.0 reduce la prdida rpida de
intensidad del FITC y permite fotografiar la preparacin. Los portas son estables una vez preparados, y
pueden leerse hasta 72 horas despus de la preparacin cuando se mantienen en la oscuridad a 4C.
Los anticuerpos frente a T. parva y T. annulata se detectan por primera vez entre los das 10 y 14 utilizando
el antgeno de esquizonte despus de la infeccin con los esporozoitos, mientras que, empleando el
antgeno de piroplasma, los anticuerpos se detectan primero entre los das 15 y 21. Los anticuerpos
permanecen durante un periodo de tiempo variable despus de la recuperacin, dependiendo de factores
tales como el establecimiento de la fase de portador, la intervencin quimioterpica, y la presencia o
ausencia de estimulacin repetida. Despus de la recuperacin de la fiebre de la Costa Este o la teileriosis
tropical, algunos animales pueden presentar niveles bajos de ttulo de anticuerpo en el ensayo IFI despus
de 4-6 meses, aunque los anticuerpos pueden persistir durante ms de un ao despus de una sola
estimulacin.
El ensayo IFI es til para identificar manadas que contienen portadores de T. annulata, pero no siempre es
suficientemente sensible para detectar a todos los individuos infectados. Tanto los antgenos de esquizonte
como de merozoito para IFI han fracasado en la deteccin de anticuerpo en algunos animales que son
portadores de una infeccin evidente con piroplasmas (10).
En las infecciones por T. mutans inducidas mediante inoculacin con esporozoitos, los anticuerpos se
detectan por primera vez entre los das 10 y 15 despus de la aparicin de los piroplasmas. Se detectan
ttulos bajos durante al menos 12-24 meses.
Cuando el ensayo IFI se emplea rutinariamente para la deteccin de anticuerpos frente a una de las
Theileria spp. bovinas, es sensible y requiere poca estandarizacin. Sin embargo, si el ensayo se emplea
para detectar anticuerpos cuando tienen lugar infecciones mixtas de Theileria, es necesario evaluar
cuidadosamente la especificidad del ensayo. Por ejemplo, T. annulata y T. parva presentan reaccin
cruzada, aunque estas reacciones cruzadas son cuatro a seis veces ms bajas que con el suero homlogo.
Esto no es importante en el campo, ya que las enfermedades no solapan. Tal reaccin cruzada no parece
ocurrir entre T. parva y T. mutans o entre T. annulata y T. mutans. Existe un ttulo bajo de reaccin cruzada
entre T. parva y T. taurotragi, lo cual es un problema, ya que las dos infecciones solapan completamente
con la distribucin de T. parva. Se ha modificado el ensayo IFI de forma que se puede usar un panel de
anticuerpos monoclonales (MAbs) para detectar antgenos de Theileria preparados como linfocitos
infectados con esquizontes fijados sobre portas multipocillo recubiertos con Tefln (ver nota al pie 2). Este
panel de MAbs puede detectar diferencias entre ciertos concentrados de T. parva y entre T. parva y otras
especies de teilerias. Es un ensayo til y forma parte del proceso de caracterizacin de T. parva,
especialmente, para los aislamientos de campo y para el control de la calidad del laboratorio durante la
preparacin del estabilizado (7).
569
Ensayos futuros para el diagnstico de Theileria

El ensayo IFI es fcil de realizar y razonablemente sensible y especfico. Sin embargo, el ensayo presenta
limitaciones para los estudios serolgicos a gran escala, particularmente en zonas donde se solapan varias
especies, debido a los problemas de reacciones cruzadas entre diferentes especias de Theileria descritos
ms arriba. Son necesarias pruebas ms especficas, fciles de interpretar, y suficientemente robustas para
utilizarse en condiciones de campo. Las pruebas serolgicas basadas en los enzimoinmunoensayos
(ELISA) se estn utilizando cada vez ms para la deteccin de anticuerpos especficos frente al parsito. El
ELISA se ha adaptado con xito para la deteccin de anticuerpos frente a T. annulata (16), y se ha
mostrado que detecta anticuerpos durante un periodo de tiempo ms largo que el IFI (20, 21). Tambin se
ha descrito un ELISA para T. mutans (22). Se han utilizado dos MAbs especficos frente a T. mutans en un
sistema ELISA para la deteccin de anticuerpos y antgenos en infecciones agudas, subagudas y crnicas.
El ensayo es ms especfico y sensible que la prueba IFI. Sin embargo, los ensayos utilizados ms
ampliamente para la deteccin de T. parva y T. mutans son los ELISA indirectos basados en antgenos
especficos del parsito, PIM y p32, respectivamente. Estos ensayos se han evaluado exhaustivamente en
el laboratorio y en el campo, y actualmente se estn empleando en grandes zonas de Africa. Los antgenos
que se usan en estos ensayos se expresan en Escherichia coli utilizando el pGEX como vector de
expresin. Los productos expresados son protenas de fusin con la glutatin S transferasa y se recubren
directamente sobre las placas del ELISA. Estos ELISAs proporcionan una especificidad y sensibilidad ms
altas que el ensayo IFI (24, 27) y se espera que pronto se encuentren disponibles comercialmente.
Una gama de sondas que estn basadas en secuencias gnicas del RNA ribosomal se encuentra
disponible para detectar todas las especies de Theileria que se sabe que infectan el ganado vacuno (2, 6).
Tambin se han desarrollado sondas de ADN especficas para T. parva (1, 9, 24) y T. mutans (25). La
tecnologa de la reaccin en cadena de la polimerasa (PCR) se encuentra disponible para amplificar
cantidades mnimas de ADN del parsito un milln de veces, aumentando enormemente la sensibilidad de
las sondas de ADN (3). Se desarroll una PCR especfica para ensayar muestras de sangre de ganado
vacuno portador de T. annulata (12). Recientemente se ha presentado un ensayo de transferencia de lnea
inverso (RLB) basado en la hibridacin de productos de PCR con sondas especficas de oligonucletidos
inmovilizadas sobre una membrana para la deteccin simultnea de diferentes especies de Theileria (17).
Se espera que la combinacin del ELISA, PCR y sondas de ADN aumentar enormemente nuestra
capacidad actual para identificar a los animales infectados, haciendo posible el seguimiento preciso de las
especies de Theileria.
La amplificacin por PCR de los genes p33/p34 del complejo T. sergenti/T. buffeli/T. orientalis, seguida de
un anlisis mediante enzimas de restriccin, puede emplearse para diferenciar T. sergenti de
T. buffeli/T. orientalis (23).

C1. Vacunas de cultivos celulares frente a Theileria annulata
Se ha intentado la vacunacin frente a T. parva y T. annulata desde que los microorganismos causales fueron
reconocidos por primera vez al principio del siglo pasado. Sin embargo, las vacunas vivas seguras y de potencia
conocida constituyen un desarrollo mucho ms reciente. Las ms utilizadas consisten en vacunas de cultivos
celulares de esquizontes atenuados frente a T. annulata. Se han descrito los procedimientos para la produccin y
el ensayo de seguridad (13, 18, 30), y la vacuna se utiliza ampliamente en Israel, Irn, Turqua, India, Africa del
norte, Asia central y la Repblica Popular de China.
1.
Control del inculo
a)

Los cultivos primarios de clulas infectadas con T. annulata pueden establecerse a partir de ganglios
linfticos, hgado o bazo tripsinizados recogidos aspticamente a partir de un animal infectado despus de
la muerte, o a partir de la capa de leucocitos de sangre perifrica heparinizada separada en un gradiente de
densidad (Ficoll Hypaque), o utilizando linfocitos centrifugados de una biopsia de material de ndulos
linfticos, empleando el mtodo sencillo de la jeringa de plstico (8, 13).
Los cultivos del inculo se preparan a partir de lneas celulares preservadas en fro que se han aislado de
ganado vacuno y han sido atenuadas como se describe ms adelante. Se recomienda el cultivo para la
produccin de la vacuna a partir del cultivo del inculo despus de un mximo de 25-30 pases, aunque
existe alguna duda sobre la estabilidad inmunognica de estos cultivos durante los pases a largo plazo.
570
b)
Mtodo de cultivo
las clulas infectadas se cultivan inicialmente en medio mnimo esencial de Eagle (MEM) o en medio
Leibovitz L15 suplementado con suero bovino al 20% y que contiene penicilina (100 unidades/ml),
estreptomicina (50 g/ml) y micostatina (75 unidades/ml) en frascos de cultivo celular de 25 ml con tapn de
rosca. Un medio alternativo es el RPMI 1640 con suero bovino fetal al 10%, glutamina 2 mM, penicilina y
estreptomicina, y normalmente se emplea con cultivos establecidos. El medio se repone cada 3-4 das. La
presencia de clulas libres brillantes y refrctiles en el medio (mediante examen con un microscopio
invertido o de contraste de fases) es indicativa de un cultivo celular infectado. Los cultivos pueden
establecerse como monocapa o en suspensin. El pase se efecta decantando el medio, aadiendo
versene al 0,025% durante 15 minutos a los cultivos en monocapa, dispersando las clulas, y contando y
dispensando segn el tamao del frasco. Se introducen aproximadamente 106 clulas en los frascos de
25 cm2, y, para los frascos ms grandes, se usa la misma proporcin de inculo en 100-200 ml. La tcnica
general de cultivo es la descrita por Brown (8).
El suero es esencial para el mantenimiento de estos cultivos, y se obtiene a partir de terneros hasta una
edad de 6 meses, o de fuentes comerciales, y se prueba antes de utilizarse para la existencia de toxicidad
mediante tres pases en una lnea celular establecida.
c)
Atenuacin de la virulencia
La atenuacin de los esquizontes de T. annulata se consigue mediante crecimiento prolongado y pase en
cultivo (30). Se desconoce el mecanismo de atenuacin, aunque el nmero de las divisiones celulares
parece ser ms importante que el tiempo en cultivo o el nmero de pases. Los aislados de campo han
requerido el pase durante periodos desde 4 hasta 30 meses para conseguir una atenuacin completa. La
atenuacin se ensaya mediante la inoculacin del cultivo en terneros susceptibles cada 20-30 pases. Una
muestra del cultivo debera criopreservarse cada 10 pases en caso de prdida accidental o de
contaminacin. Las atenuacin completa se consigue cuando los cultivos no generan fiebre o esquizontes y
piroplasmas detectables en ganado vacuno susceptible. Un cultivo atenuado de 105 clulas infectar con
cierta seguridad al ganado vacuno e inducir una reaccin serolgica, y no producir enfermedad a una
dosis de 109 clulas. Los cultivos pueden criopreservarse empleando bien dimetil sulfxido (DMSO) o
glicerol. Ms adelante se describen dos mtodos para almacenar y repartir la vacuna.
2.
Mtodo de fabricacin
Antes de comenzar a producir la vacuna, se necesita un material para el inculo con caractersticas conocidas
(31). Se distinguen tres tipos de material para el inculo:
Inculo original: Clulas infectadas con esquizontes a partir de un pase especfico que han sido seleccionadas y
almacenadas permanentemente, y, a partir de las cuales, se derivan todos los pases. Para preparar el inculo
original, las clulas infectadas con esquizontes que han demostrado ser seguras para el ganado vacuno se
propagan hasta obtener aproximadamente 5 x 108 clulas en un slo pase de cultivo. Las clulas se
criopreservan en aproximadamente 100 criotubos que contienen 5 x 106 clulas cada uno.
Inculo de trabajo: Clulas infectadas con esquizontes con un nivel de pase entre el inculo original y el inculo
de produccin. Para preparar el inculo de trabajo, se transfiere el contenido de un slo criotubo de inculo
original a un tubo de centrfuga de 10 ml que contiene 8 ml de medio completo. El tubo se centrifuga a 600 g
durante 15 minutos a 4C, y el precipitado se transfiere a frascos de 75 cm2 que contienen 15-20 ml de medio. El
medio se cambia al da siguiente y 4 das despus las clulas se dispersan y se siembran en frascos ms
grandes. Despus de 5-6 subcultivos adicionales, hay suficientes clulas disponibles para comenzar la fase de
produccin. Debera realizarse una revisin de la viabilidad del inculo original, recuperando uno de los criotubos
una vez que ste ha sido criopreservado durante al menos 24 horas.
Inculo de produccin: Clulas infectadas con esquizontes de un nivel de pase especfico, que se utiliza para la
preparacin de un lote de la vacuna sin una propagacin posterior. El inculo de produccin se obtiene
propagando grandes cantidades de clulas en cultivos en monocapa o suspensin. Los cultivos monocapa se
cultivan en frascos desde 150 cm2 hasta 175 cm2 que normalmente proporcionan una media de 7 x 107 hasta 8 x
107 clulas por frasco. Se necesitan aproximadamente 80 ml de medio completo por frasco. En un sistema de
cultivo de frascos rotatorios se pueden obtener 1.2-1.5 x 108 clulas en un frasco rotatorio convencional
(700 cm2) que contienen 100-120 ml de medio. La mejor produccin a gran escala para obtener un rendimiento
mximo en clulas la han mostrado los cultivos estacionarios sembrados con 106 clulas y los frascos rotatorios
con hasta 4x107 clulas/frasco en medio L-15 con un 20% de suero, seguido de 7 das de cultivo sin cambio de
medio (34).
571
Se concentran y se juntan las clulas infectadas con esquizontes de todos los frascos y se computa su nmero
total. Alternativamente, pueden sembrarse de nuevo aproximadamente un 20% de las clulas para preparar otro
lote de vacuna. Pueden prepararse varios lotes de vacuna utilizando una porcin del inculo de produccin como
inculo de trabajo. Como el cultivo prolongado puede provocar la alteracin en las propiedades de los
esquizontes, tales como la capacidad inmunognica, despus de varios lotes la vacuna siguiente se produce
preparando un inculo de produccin fresco a partir del inculo original.
Las clulas infectadas con esquizontes se mezclan con DMSO hasta una concentracin final del 7% o en glicerol
hasta una concentracin final del 10%, y se distribuyen en viales de plstico de 2 ml en alcuotas de 1,8 ml, y
cada vial contiene diez dosis de la vacuna concentrada. El nmero adecuado de clulas infectadas con
esquizonte por dosis se encuentra sujeto a controversia. Una aproximacin prctica recomendada consiste en
preparar dosis de 106-107 clulas infectadas para contrarestar las condiciones ambientales variables en el
campo.
La vacuna se congela introduciendo los viales en un ultracongelador (-70C) y transfirindolos a nitrgeno lquido
24 horas despus. Alternativamente, los viales pueden introducirse en vapores de nitrgeno lquido durante
3 horas y entonces sumergirse en nitrgeno lquido para ser almacenados (30). La vacuna se transporta hasta el
campo en nitrgeno lquido, y se diluye 1/10 en tampn isotnico salino en una botella con tapn de rosca con
una tapa de goma o silicona para un vaciado asptico. La vacuna se administra subcutneamente hasta
30 minutos despus de la descongelacin (28).
En Irn se emplean las clulas cultivadas de dos lotes. El segundo lote se administra 30-60 das despus de la
inoculacin de la vacuna preparada con el primer lote (18).
En Marruecos se utiliza una vacuna de cultivo en fresco, normalmente a una dosis decimal ms baja. Sin
embargo, existen problemas con el control de calidad de las vacunas de este tipo.
3.
Control de lote
En Israel, las vacunas de esquizontes se prueban antes de ponerse en circulacin mediante el siguiente
procedimiento (29).
La vacuna congelada tiene una vida media prcticamente ilimitada en estado congelado, pero normalmente se
produce en lotes individuales pequeos (3-5 ml dosis), lo que hace impracticable la prueba completa de cada
lote, por razones econmicas. Por lo tanto, se recomienda que se pruebe la inocuidad y eficacia del inculo
original, mientras que en cada lote se estudie solamente la esterilidad y la potencia. Esta recomendacin se basa
en el hecho de que una vez que los cultivos de esquizontes se han atenuado nunca se ha observado reversin a
virulencia durante el cultivo posterior. En lo que concierne a la eficacia, no se han observado alteraciones obvias
de las propiedades inmunognicas durante el nmero limitado de pases (20-30) implicados en la produccin de
la vacuna real.
a)
Inocuidad
Ausencia de propiedades que originen reacciones locales o sistmicas indebidas: A pesar del hecho de que
el inculo original se prepara a partir de esquizontes atenuados, por razones legales y prcticas se
recomienda ensayar la inocuidad de una muestra de la vacuna real que se produce a partir del inculo
original. Con este propsito se inoculan dos a cuatro terneros susceptibles del lote ms sensible disponible,
con una dosis diez veces mayor que la recomendada para la inmunizacin. Esta dosis no debera producir
sntomas clnicos ms all de un incremento transitorio en la temperatura. Con el inculo original
completamente atenuado no se observarn esquizontes o piroplasmas en frotis de ganglio linftico o de
hgado o en frotis de sangre. Sin embargo, diferentes razas de ganado vacuno pueden mostrar
sensibilidades diferentes frente a la vacuna. Esto debera tenerse en mente cuando se va a administrar la
vacuna de un inculo original parcialmente atenuado a lotes de ganado vacuno de alta calidad.
A continuacin de la prueba de inocuidad satisfactoria con una muestra, todos los lotes siguientes
producidos a partir del mismo inculo original pueden tambin utilizarse sin realizar una prueba posterior de
inocuidad. Sin embargo, si a consecuencia de la vacuna aparecen parsitos y signos clnicos en el ganado
bovino de campo, debe probarse de nuevo el lote implicado u otro paralelo del mismo inculo origina,l para
garantizar su inocuidad.
b)
Eficacia
Capacidad para proteger frente a la teileriosis transmitida de forma natural: El lote de la vacuna
experimental utilizado para el ensayo de inocuidad tambin puede emplearse para probar la eficacia de la
vacuna anti-Theileria derivada de cultivo. Se vacunan tres o cuatro terneros con una dosis convencional de
vacuna 6 semanas ms tarde; los terneros vacunados y el mismo nmero de terneros no vacunados se
572
infectan entonces con esporozoitos de T. annulata. La infeccin puede inducirse mediante garrapatas
adultas vivas derivadas de fases preimaginales infectadas con T. annulata, o mediante inoculacin del
estabilizado preparado a partir de garrapatas infectadas maceradas (para ver las tcnicas, ver la Seccin
C2.1.). La experiencia muestra que la inoculacin del estabilizado (garrapatas maceradas) induce
generalmente una respuesta ms grave que un nmero equivalente de garrapatas vivas infectadas a las
que se les permite alimentarse del ganado. Sin embargo, a largo plazo, los resultados obtenidos mediante
la sensibilizacin con el estabilizado parecen ser ms reproducibles que los obtenidos con diferentes lotes
de garrapatas vivas, infectndose cada uno de ellos en condiciones distintas.
No existen estndares acordados internacionalmente sobre el tamao de la dosis de sensibilizacin
utilizada para ensayar la eficacia de la vacuna derivada del cultivo de T. annulata. Se han empleado de
cinco a diez hembras y el mismo nmero de machos de garrapatas infectadas de Hyalomona sin alimentar
para la infeccin del ganado vacuno. De manera alternativa, un estabilizado equivalente a 2-4 garrapatas
maceradas inoculadas subcutneamente en la zona del cuello producir siempre una teileriosis aguda. Para
la evaluacin de las respuestas frente a la infeccin de los terneros control vacunados y no vacunados se
siguen empleando los siguientes parmetros: la duracin e intensidad de la pirexia, el porcentaje de clulas
infectadas con esquizontes en frotis de ganglio linftico o biopsia heptica, el porcentaje de infeccin con
piroplasmas en frotis de sangre, la disminucin en el recuento de clulas rojas y blancas y la intensidad de
manifestaciones clnicas tales como anorexia, depresin y posicin yacente.
Los resultados de la prueba de eficacia dependen de factores tales como las caractersticas inmunolgicas
del aislado de T. annulata crecida y atenuada en cultivo, la virulencia del aislado de campo utilizado para la
sensibilizacin, las especies de garrapatas infectadas utilizadas para producir esporozoitos y la dosis del
parsito empleada para la sensibilizacin. Los datos de la bibliografa (30) muestran que los terneros
vacunados con la vacuna de esquizontes pueden exhibir aparentemente una proteccin casi total, o pueden
mostrar un nivel bajo de parasitemia, acompaada de fiebre moderada y una alteracin insignificante del
resto de los parmetros a partir de sus valores de prevacunacin. Cuando el ganado vacunado con la
vacuna de esquizontes se sensibiliz con parsitos derivados de garrapatas de una zona geogrficamente
apartada, se demostr un grado de proteccin menor. Por el contrario, los terneros control no vacunados
exhibieron un nivel alto de parasitemia y pancitopenia en la mayora de los ensayos, acompaado de
manifestaciones clnicas graves. En ausencia de una medicacin especfica una porcin considerable de los
animales control sucumbieron a la infeccin.
Las observaciones de campo tambin se han utilizado para evaluar la eficacia de las vacunas anti Theileria
(29, 35). El ganado vacuno autctono susceptible, as como razas exticas de alta calidad fueron protegidas
frente a la teileriosis clnica, y sucumbieron frente a la teileriosis en pastos en los que el ganado no fue
vacunado. Como la vacuna de esquizontes atenuada totalmente no produce piroplasmas, la presencia de
esta fase de la teileria en el ganado vacunado que no muestra signos clnicos se considera que es el
resultado de una infeccin no aparente inducida por garrapatas.
c)
Potencia
Viabilidad de las clulas infectadas con esquizonte: La vacuna congelada permanece bsicamente estable
durante el tiempo de su almacenamiento, incluso durante largos periodos, aunque durante los procesos de
congelacin y descongelacin tiene lugar alguna prdida de viabilidad. La viabilidad debera ensayarse en
condiciones lo ms parecidas posibles a aquellas que se obtienen cuando la vacuna se emplea en el
campo. Por esta razn la vacuna debera descongelarse, y la suspensin diluida de clulas infectadas con
esquizontes debera dejarse a temperatura ambiente durante 60 minutos antes de realizar los ensayos de
viabilidad. Una prueba sencilla para evaluar la viabilidad de las clulas infectadas es el recuento por
exclusin con nigrosina (36). Aunque, en la mayora de los casos, se encuentran un 80-90% de clulas
vivas, aquella vacuna que, despus de descongelarse, diluirse y dejarse a temperatura ambiente durante
1 hora, todava contiene un 50% o ms de clulas vivas, puede emitirse para su uso.
La viabilidad de los esquizontes tambin se refleja por la eficiencia de plaqueo de las clulas infectadas con
esquizontes (36), ya que slo las clulas que contienen esquizontes viables se multiplican en cultivo. Con
este propsito la vacuna descongelada y diluida se pasa del frasco a un tubo de centrfuga. Se toma una
muestra para el recuento y la suspensin se centrifuga durante 15 minutos a 600 g. Mientras tanto se
determina el nmero total de clulas (vivas y muertas) para establecer que la vacuna congelada tena la
concentracin inicial de clulas necesaria. Despus de la centrifugacin se desecha el sobrenadante y las
clulas se resuspenden en el volumen original utilizando medio de cultivo completo. Se preparan diluciones
seriadas decimales de las clulas en medio completo en tubos estriles de 10 ml, de manera que las dos
ltimas diluciones contengan 5 x 10 y 5 clulas por ml. Se introducen doce rplicas de 200 l de cada una
de las dos ltimas diluciones en una placa de cultivo con 96 pocillos. Las placas se incuban a 37C en una
atmsfera de CO2 al 5% y los cultivos se revisan con un microscopio invertido 6 y 9 das despus de la
siembra. Se cuenta el nmero de pocillos que contienen tericamente 1 clula cada uno y en los cuales se
573
observa crecimiento. La vacunas que muestran una eficiencia de plaqueo <2 (clulas) son adecuadas para
el uso en el campo.
d)
Esterilidad
Los ensayos de esterilidad y ausencia de contaminacin de los materiales biolgicos puede encontrarse en
el Captulo I.1.5.
e)
Mtodo de empleo
Estas vacunas no producen efectos adversos en el ganado vacuno sano. Sin embargo, los animales con
infecciones, concretamente infecciones vricas, pueden no tolerar bien la vacunacin. No se recomienda la
administracin de una vacuna vrica, como la de la glosopeda, durante el periodo de inmunizacin (periodo
de reaccin), ya que puede encontrarse comprometida la respuesta inmune (18). En Irn no est
recomendado vacunar vacas de ms de 5 meses de gestacin, aunque los estudios en ganado gestante
con los concentrados de la vacuna utilizados en Israel no encontraron efectos sobre la gestacin (29). La
inmunidad generada es de larga duracin.
En general, el ganado vacuno debera inmunizarse en los primeros meses de vida, y la sensibilizacin con
garrapatas en condiciones naturales refuerza la inmunidad. Aunque se han identificado cepas de
T. annulata diferentes antignicamente (28), normalmente, se considera que existe suficiente proteccin
cruzada entre las cepas para proporcionar una proteccin adecuada frente a la sensibilizacin en el campo
en todos los pases, como en Israel. Un slo concentrado ha demostrado ser efectivo inmunolgicamente
en 1.5 millones de cabezas de ganado vacuno (11, 35) en las zonas extensas e infectadas de Asia central.
Sin embargo, como se ha descrito previamente, en Irn se utilizan rutinariamente dos concentrados (18).
C2. Infeccin y tratamiento de vacunacin frente a Theileria parva

La vacunacin frente a T. parva se basa en un mtodo de infeccin y tratamiento en el que se inocula
subcutneamente una alcuota de esporozoitos viables, y los animales se tratan simultneamente con una
formulacin de una tetraciclina de larga duracin (32). Las tetraciclinas disminuyen la gravedad de la infeccin, y
la infeccin leve resultante se controla normalmente por medio de la respuesta inmune del hospedador, de
manera que se consigue un estado de portador. Siempre existen riesgos asociados con el empleo de parsitos
vivos para la inmunizacin; sin embargo, con un control de calidad apropiado y la determinacin cuidadosa de la
dosis para inmunizacin segura y efectiva, el mtodo puede utilizarse y est siendo utilizado con xito en el
campo. Este mtodo tambin se ha aplicado de manera eficaz para T. annulata, aunque se prefiere la
vacunacin con cultivo celular, el cual no es prctico para la inmunizacin frente a T. parva. Algunos
estabilizados de T. parva han mostrado ser capaces de infectar ganado vacuno eficazmente sin inducir
enfermedad, y pueden utilizarse sin tratamiento con tetraciclina. Uno de estos estabilizados se est aplicando en
el campo y ofrece unas ventajas considerables sobre las infecciones con estabilizados potencialmente letales, y
ahorros en el coste de la vacunacin. Sin embargo, distintos estabilizados obtenidos a partir de estos
concentrados pueden provocar una enfermedad grave en el ganado vacuno, acentuando la importancia de una
dosis inmunizante controlada cuidadosamente.
1.
Preparacin del estabilizado
Para obtener resultados consistentes en las inmunizaciones de campo es esencial que los estabilizados de
esporozoitos preparados a partir de garrapatas se preparen a partir de un estabilizado del inculo de trabajo
completamente caracterizado. El estabilizado del inculo de trabajo debera derivar directamente del
estabilizado del inculo original de referencia, con caractersticas del estabilizado del inculo original y
disponible en cantidad adecuada para la preparacin futura de estabilizados inmunizantes.
La infeccin se establece con el estabilizado del inculo de trabajo de T. parva mediante inoculacin de ganado
vacuno sano y serolgicamente negativo frente a las enfermedades transmitidas por garrapatas. Durante la fase
de parasitemia de la enfermedad, los animales se alimentan con ninfas limpias de Rhipicephalus appendiculatus
cultivadas en el laboratorio, y se recogen las garrapatas hinchadas e infectadas. Las garrapatas adultas
resultantes se aplican entre 3 semanas y cuatro meses despus de la muda en las orejas de conejos sanos. Se
aplican unas 600 garrapatas en cada oreja y las garrapatas no adheridas se eliminan despus de 24 horas.
Despus de cuatro das se obtienen las garrapatas y se recogen muestras (normalmente 60 garrapatas) para
determinar la proporcin de infeccin en las glndulas salivares diseccionadas. Las garrapatas restantes se
cuentan en lotes de 1000 aproximadamente. Se puede obtener una estimacin del nmero total de garrapatas
contando y pesando un nmero determinado y pesando entonces el nmero total de garrapatas. Las garrapatas
se lavan en un tamiz bajo un chorro rpido de agua del grifo y pueden desinfectarse en su superficie con
clorhidrato de benzalconio al 1%, o en alcohol al 70%, y ser lavan de nuevo en agua destilada.
574
Las garrapatas se depositan (~ 1000) en tarros de cristal grueso o en vasos de plstico, y se aaden 50 ml de
MEM con sales de Hank o Earle y albmina de plasma bovino (BPA) al 3,5%. Los tarros se mantienen en hielo, y
las garrapatas se muelen utilizando un homogenizador de tejidos (por ejemplo Silverson LR2) durante 2 minutos
empleando un cabezal de desintegracin de apertura grande, y durante 3 minutos utilizando un cabezal de
apertura pequea (filtro emulsionante). El material molido de las garrapatas se lleva hasta 50 ml por cada 100
garrapatas, se centrifuga a 50 g durante 5 minutos, y se concentra el sobrenadante. Se aade un volumen igual
de glicerol fro al 15% en MEM/BPA gota a gota mientras que el tejido de las garrapatas se mantiene fro en hielo
y se agita mediante un agitador magntico. El volumen final contendr esporozoitos de un equivalente a diez
garrapatas/ml. El nmero de equivalentes de garrapatas/ml puede ajustarse si la proporcin de infeccin por
parsito en un lote concreto de garrapatas fuese muy alto o muy bajo. La concentracin final de glicerol en el
estabilizado de esporozoitos es del 7.5%.
El tejido molido de las garrapatas se distribuye en tubos de cristal mediante una jeringa o pipeta para los
volmenes pequeos, o mediante una jeringa automtica para volmenes ms grandes. Como alternativa, se ha
utilizado un equipo de inseminacin artificial con tubos de plstico premarcados, como el que se emplea para
dispensar el semen. Este sistema es el ideal para grandes volmenes de estabilizados, y el cdigo de color y el
marcaje proporcionan una seguridad extra para identificar cada tubo. Se debera permitir un tiempo de equilibrio
de 30-45 minutos para los estabilizados de pequeo volumen antes de colocarse en el ultracongelador (-70C).
Una vez congelado, el estabilizado puede trasladarse a un almacenamiento permanente en nitrgeno lquido
teniendo cuidado de no permitir ninguna subida de temperatura durante el traslado.
La infectividad del estabilizado se determina mediante inoculacin de una dosis estndar de 1,0 ml en ganado
vacuno susceptible. El estabilizado se titula en el ganado vacuno, y se establecen su infectividad y letalidad a
distintas diluciones para su empleo en la inmunizacin. Tambin se determina la sensibilidad frente a
tetraciclinas, bsicamente para proporcionar una dosis controlada de estabilizado, preferiblemente mediante una
dosis nica de una tetraciclina de larga duracin administrada al mismo tiempo que la inoculacin. La dosis
inmunizante debera inducir una infeccin muy leve o no aparente (4), y el animal debera desarrollar un ttulo
serolgico y ser inmune frente a una sensibilizacin homloga letal. Si un tratamiento nico con tetraciclina no
suprime la infeccin en todo el ganado vacuno, entonces se examina una dosis ms baja de estabilizado o
pueden utilizarse dos tratamientos con tetraciclina (en los das 0 y 4). Ms recientemente, cuando se ha utilizado
con una dilucin apropiada de estabilizado, una dosis nica de 30 mg/Kg de oxytetraciclina de larga duracin ha
mostrado ser efectiva en inmunizaciones de campo. Un mtodo alternativo que se ha empleado implica la
infeccin con el estabilizado y el tratamiento con buparvaquon a 20 mg/Kg el octavo da (dependiendo del
estabilizado). Este mtodo puede aplicarse cuando las tetraciclinas no son fiables, pero requiere que el animal
sea manipulado ms de una vez. Un tratamiento nico con buparvaquon a 2,5 mg/Kg en el momento de la
infeccin tambin ha mostrado ser efectivo en infecciones con estabilizado que no se han controlado con un
tratamiento nico de 20 mg/Kg de una formulacin de tetraciclina de larga duracin. Una vez que se establece el
procedimiento que da por resultado una dosis inmunizante segura y efectiva, debe cumplirse estrictamente en el
campo, o puede tener lugar un fallo en la inmunizacin. Tambin es importante que se determinen la dilucin del
estabilizado y el rgimen droga/dosis en el ganado vacuno ms susceptible de ser utilizado. La infeccin y el
mtodo de tratamiento se aplica normalmente empleando una tetraciclina de larga duracin, y se recomienda
que la tetraciclina se administre primero, por si el animal se escapa habiendo recibido solamente el estabilizado.
2.
Precauciones de seguridad
En una reunin celebrada en Malawi en 1988 se adoptaron las siguientes recomendaciones sobre la seguridad
en la preparacin, manipulacin y entrega de las vacunas para el tratamiento de la infeccin por T. parva (4).
a)
Recogida de garrapatas en el campo

Es importante que se utilicen cepas de laboratorio bien caracterizadas de Rhipicephalus appendiculatus
durante la preparacin de los estabilizados para la inmunizacin.
Si las garrapatas de campo se recogen con fines experimentales, debera tenerse en consideracin el
posible peligro para los humanos de los patgenos presentes en estas garrapatas. El patgeno ms
importante que se ha reconocido es el virus de la fiebre hemorrgica de Crimea-Congo, generalmente
asociado con las garrapatas del gnero Hyalomma y ampliamente extendido en la zona de distribucin
geogrfica de R. appendiculatus. Por tanto, aquellos que manipulen colecciones de garrapatas de campo
deberan estar sobre aviso de los riesgos potenciales. Las garrapatas de las especies de Hyaloma no
deberan separarse de los hospedadores; las garrapatas hinchadas total o parcialmente no deberan
machacarse entre los dedos. Si se sacan, las garrapatas deberan manejarse con pinzas.
b)
Instalaciones para la manipulacin de garrapatas

Debe controlarse la manipulacin en el laboratorio de las garrapatas recogidas en el campo para evitar la
adherencia al personal. Las garrapatas recogidas en el campo deberan alimentarse sobre conejos y
575
ganado vacuno en instalaciones de aislamiento. Los animales de los que se han alimentado las garrapatas
infectadas en el laboratorio o recogidas en el campo deberan destruirse despus de la transmisin y
recogerse antes de dejar las instalaciones de aislamiento. Despus del hinchado de las garrapatas
recogidas del campo en los animales de laboratorio, deberan homogenizarse alcuotas y examinarse para
la presencia de patgenos humanos externos mediante inoculacin en clulas Vero y de rin de hamster
lactante (BHK). Los efectos de estas inoculaciones deberan estudiarse durante tres pases. Cualquier
garrapata no utilizada debera destruirse mediante mtodos qumicos o por incineracin.
c)
Preparacin del estabilizado

Debera tenerse cuidado durante la preparacin del estabilizado de esporozoitos cuando se estn moliendo
las garrapatas, para evitar la infeccin del personal por aerosoles con patgenos externos. Los encargados
de la molienda de las garrapatas deberan instruirse en los peligros potenciales implicados; el acceso a
zonas donde se homogenizan las garrapatas debera restringirse a personal especfico e informado; el
personal debera llevar puesta ropa protectora, incluidos guantes y mascarillas; y el molido de las
garrapatas debera llevarse a cabo en una campana de seguridad microbiolgica (ver Captulo I.1.6.
Seguridad humana en los laboratorios veterinarios de microbiologa).
d)
Estndares futuros para garantizar la calidad y la seguridad

En una reunin posterior en Kampala en 1991 (5), se cre un comit bajo los auspicios de la Organizacin
para la Unidad Africana (OUA), la Organizacin de las Naciones Unidas para la Agricultura y la
Alimentacin (FAO), y el Laboratorio Internacional para la Investigacin sobre Enfermedades de los
Animales (ILRAD) para determinar los estndares de las vacunas vivas frente a enfermedades transmitidas
por las garrapatas. En el caso de T. parva, este comit observar con detalle la caracterizacin de los
parsitos empleando MAbs y sondas de ADN, la titulacin de la infectividad in-vitro, y las recomendaciones
ms formales sobre los ensayos de inocuidad con los organismos contaminantes. Se han preparado
borradores con estndares y es esencial que la FAO revise un conjunto de estndares actualizados y que
sean aprobados por la OIE. Ms recientemente se han preparado estabilizados para la inmunizacin de
acuerdo con un conjunto propuesto de estndares (26). De esta manera, los estabilizados inmunizantes
futuros se prepararn de acuerdo con estndares que permitirn su utilizacin en el campo de manera
efectiva y con confianza.
3.
Pureza de los estabilizados
Tanto las garrapatas como los mamferos de experimentacin son fuentes potenciales de contaminacin de los
estabilizados con patgenos externos. En ambos casos, entre los contaminantes potenciales se incluyen
Ehrlichia bovis, Borrelia sp. bovina, orbivirus, bunyavirus y otros. Por lo tanto, las garrapatas recogidas en el
campo no deberan utilizarse para la preparacin de estabilizados inmunizantes. Con este propsito deberan
emplearse colonias de garrapatas de laboratorio bien caracterizadas y libres de patgenos. Solamente deberan
utilizarse para la alimentacin de las garrapatas ganado bovino y conejos sanos y libres de parsitos transmitidos
por garrapatas. Los estabilizados deberan prepararse en condiciones aspticas. En algunas circunstancias
puede estar indicado el empleo de antibiticos a concentraciones adecuadas para el cultivo de tejidos. Los
estabilizados preparados deberan someterse a ensayos rutinarios de seguridad mediante su inoculacin en
clulas BHK y Vero, seguidos de tres pases en estos sistemas (como se indica anteriormente). Los estabilizados
deberan someterse a una caracterizacin in vivo rutinaria, la cual debera implicar el ensayo de infectividad en
ganado vacuno intacto susceptible, sensibilidad a las tetraciclinas y otras drogas anti-Theileria, y estudios de
inmunidad cruzada. Debera prepararse un estabilizado del inculo de trabajo caracterizado para asegurar la
pureza de los concentrados de T. parva en el estabilizado inmunizante derivado.
Durante la preparacin del estabilizado se debe tambin tener cuidado para evitar la contaminacin del
concentrado utilizado con otros concentrados de T. parva. Se deben hacer cumplir los procedimientos de
garanta de seguridad, por ejemplo, para la manipulacin de las garrapatas infectadas, y las reglas beberan
cumplirse estrictamente. Las instalaciones para garrapatas deberan permitir la separacin estricta de las
garrapatas infectadas y las no infectadas. El personal de la unidad de garrapatas debera utilizar batas
independientes para cada lote de garrapatas utilizado en la preparacin del estabilizado, y las batas deberan
esterilizarse diariamente. Debera evitarse el trabajo simultneo con muchos concentrados diferentes. Los
sistemas de almacenamiento del estabilizado deberan incorporar un marcaje claro en cada tubo o tubos del
estabilizado.
Las inspecciones del control de calidad del estabilizado deberan determinar el parecido del inculo al
concentrado parental, y tambin detectar cualquier contaminacin externa por T. parva.
4.
Riesgos de la vacunacin
La introduccin de un concentrado para inmunizacin en una zona/pas del que no es originario puede dar como
resultado que el parsito o un componente (s) de ese concentrado se establezcan como portadores en el ganado
576
vacuno y sean transmitidos por garrapatas. Debera considerarse el efecto a largo plazo sobre la epidemiologa
de la enfermedad de los parsitos nuevos (y potencialmente letales) antes de su introduccin, y debera
controlarse cuidadosamente despus de la inmunizacin.
Antes de la inmunizacin, debera llevarse a cabo la caracterizacin de los parsitos en poblaciones concretas, e
intermitentemente despus de la inmunizacin. Actualmente, la caracterizacin de los concentrados de parsitos
en relacin con la vacunacin se basa principalmente en la inmunizacin y en experimentos de sensibilizacin
cruzada en el ganado vacuno. Sin embargo en laboratorios que poseen un alto grado de experiencia se han
intentado realizar varios mtodos para caracterizar in vitro los concentrados de parsitos. Estudios preliminares
han mostrado que los concentrados de parsitos que difieren en su perfil de MAbs pueden no presentar
proteccin cruzada, mientras que los concentrados que presentan perfiles similares ofrecen proteccin cruzada
(19). Sin embargo, experimentos ms recientes utilizando otros concentrados de T. parva han demostrado que
esta observacin es errnea. Otro mtodo ha utilizado clones de clulas T especficos frente a lneas celulares
parasitadas para detectar diferencias antignicas, ya que se cree que las respuestas de las clulas T son
importantes como mediadores de la inmunidad frente a T. parva. (19). Actualmente no existen ensayos in vitro
que se correlacionen con la proteccin in vivo. Recientemente se ha propuesto un ndice de reaccin frente a la
enfermedad obtenido estadsticamente y basado en medidas parasitolgicas, clnicas y hematolgicas, para
caracterizar los niveles de infectividad y virulencia de diferentes concentrados de parsitos y valorar la
intervencin del control frente a la teileriosis (33).
5.
Estrategia de vacunacin
A diferencia de T. annulata, donde se observa una proteccin cruzada considerable en diferentes cepas del
campo, en T. parva se da una situacin mucho ms compleja. Se utilizan dos estrategias para tratar de superar
esta complejidad antignica. En varios pases se ha probado una combinacin de tres concentrados que
proporcionan un amplio espectro de proteccin. La mezcla se prepar en Malawi en un proyecto de la FAO para
la distribucin de T. parva en una regin endmica. A continuacin se prepar por la ILRI un estabilizado
trivalente similar para la FAO. Este ltimo estabilizado se prepar segn los ltimos estndares propuestos y se
utiliza de manera segura y efectiva en Tanzania. Si un estabilizado no protege frente a un concentrado nuevo,
debera aislarse, caracterizarse, ensayarse y considerarse para su empleo, bien slo o junto con el estabilizado
inmunizante actual. Otra estrategia consiste en preparar estabilizados a partir de concentrados nacionales o
locales para su empleo en zonas definidas. Esta estrategia es ms costosa en tiempo y recursos, pero evita
hasta un cierto lmite la introduccin de nuevos concentrados en una zona. Con el movimiento del ganado existe
un riesgo de introduccin de diferentes concentrados en una zona, lo que puede cortar la inmunidad
proporcionada por el concentrado local. Por lo tanto es necesario evaluar cuidadosamente la utilizacin de
concentrados locales o introducidos para la inmunizacin.
La infeccin y el mtodo de tratamiento por medio de la inmunizacin son efectivos con tal de que se hagan
cumplir las medidas adecuadas de garanta de calidad. A largo plazo, los problemas relacionados con la entrega
y el riesgo de induccin de estados de portador y transmisin de la enfermedad subrayan la necesidad de la
identificacin de antgenos protectores para el desarrollo de vacunas de subunidades.
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*
* *
579
CAPTULO 2.3.12.
SEPTICEMIA HEMORRGICA
RESUMEN
La septicemia hemorrgica (SH) es una enfermedad septicmica aguda y mortal del ganado
vacuno y de los bfalos producida por algunos serotipos de Pasteurella multocida. Es una
pasteurelosis primaria que se reproduce experimentalmente mediante la administracin de cultivos
puros del organismo causante.
El diagnstico de la SH depende del aislamiento del organismo causante, P. multocida, a partir de
la sangre o de la mdula de un animal muerto mediante la aplicacin de mtodos biolgicos y de
cultivo, as como su identificacin y tipado mediante mtodos bioqumicos y serolgicos.
Identificacin del agente: Se pueden obtener cultivos puros de P. multocida sembrando, por
extensin, sobre medios de cultivo artificiales o por inoculacin de material sospechoso de
infeccin en ratones y el cultivo posterior de su sangre, despus de la muerte, en un medio
adecuado. La identificacin se basa en el estudio de los caracteres morfolgicos, bioqumicos y de
cultivo de P. multocida.
La identificacin del serotipo especfico se lleva a cabo utilizando uno o varios mtodos
serolgicos. stos incluyen la aglutinacin rpida en porta, la hemaglutinacin indirecta para la
determinacin del tipo capsular utilizando hemates de oveja recubiertos con extractos
bacterianos, la determinacin del tipo somtico por pruebas de inmunodifusin en gel de agar,
utilizando extractos celulares desnaturalizados por calor, o mediante hemaglutinacin empleando
clulas tratadas con cido.
Pruebas serolgicas: Normalmente, con fines diagnsticos, no se utilizan las pruebas serolgicas
para detectar anticuerpos especficos
Requisitos para las vacunas y los materiales de diagnstico: Las vacunas contra la septicemia
hemorrgica son bacterinas simples tratadas con formalina, o preparaciones densas de bacterinas
con adyuvantes. stos ltimos aumentan el nivel y prolongan la duracin de la inmunidad.
Los inculos de los cultivos para la produccin de vacunas deben contener organismos
capsulados. Las vacunas se estandarizan en cuanto a densidad bacteriana mediante pruebas de
turbidez. Las pruebas de potencia se realizan preferentemente en ratones y/o conejos.
A. INTRODUCCIN
La septicemia hemorrgica (SH) es una enfermadad septicmica, aguda, de elevada mortalidad en el ganado
vacuno y en los bfalos, causada por algunos serotipos de Pasteurella multocida (2, 9, 12, 13). En la actualidad
se conocen dos serotipos el asitico y el africano. Se dispone de cuatro mtodos de serotipado: el mtodo para
el serotipado capsular, que utiliza una prueba de hemaglutinacin indirecta (IHA) (6); el serotipado somtico,
mediante aglutinacin; la prueba de inmunodifusin en gel de agar (IGDA) (14, 20, 21), y un sistema de tipado
capsular mltiple, basado en la reaccin en cadena de la polimerasa (PCR) que se ha desarrollado
recientemente como una alternativa gentica, rpida, al mtodo convencional de serotipado capsular (26). Las
cepas asiticas pertenecen al tipo capsular B, mientras que las cepas africanas son del tipo B y E (15). Utilizando
los mtodos de tipado somtico, todas las cepas pertenecen al tipo 6 por pruebas de aglutinacin y al tipo 2 por
pruebas IGDA.
El sndrome clnico de SH incluye una fase inicial, con subida de temperatura (que a menudo pasa inadvertida),
una fase de implicacin respiratoria, y una fase terminal de septicemia y decaimiento, que conduce a la muerte.
El perodo de incubacin es normalmente de 1-3 das, y el curso de la enfermedad puede variar desde una
580
Captulo 2.3.12. Septicemia hemorrgica
muerte sbita, sin signos clnicos observables, hasta un cuadro de postracin que se extiende hasta los 5 das
(9, 13).
Generalmente, se piensa que los bfalos son ms susceptibles a la SH que el ganado bovino, y en esta especie,
la duracin de la enfermedad es ms corta. En reas endmicas, la mayor parte de las muertes se limitan a
terneros maduros y adultos jvenes. En reas no endmicas, pueden presentarse epizootias masivas. Si el
tratamiento no se realiza en fase temprana (en el estadio de pirexia) los casos de mortalidad se aproximan al
100% (9, 13).
Se puede hacer un diagnostico basado en los signos caractersticos, lesiones patolgicas evidentes, historial del
ganado, modelos de morbilidad y mortalidad, susceptibilidad de la especie, y edad del grupo afectado. Por lo
general, resulta til un diagnstico clnico provisional para poder iniciar medidas de control.
En un examen post-mortem, la primera lesin evidente es un edema subcutneo, en particular en la regin
submandibular y en el pecho. Otras lesiones incluyen hemorragias de tipo petequial o de tipo hematoma,
congestin y/o consolidacin pulmonar, neumona fibrosa, pleuresa y pericarditis (9.13).
La confirmacin diagnstica en el laboratorio se lleva a cabo por aislamiento en cultivo o en ratones, seguido de
la identificacin del agente causal como tipo B o E por mtodos bioqumicos y serolgicos. Excepcionalmente,
cuando el cultivo in vitro no resulta vlido, se puede inocular un ratn con la muestra clnica. La sangre del ratn
se utiliza despus para preparar extensiones de sangre sobre portas y para el cultivo del microorganismo, las
cuales pueden emplearse a continuacin en pruebas rpidas de aglutinacin en portas. Se lleva a cabo una
confirmacin complementaria por mtodos bioqumicos y serolgicos convencionales.
1.
Aislamiento e identificacin del agente
Mtodos de cultivo y bioqumicos
En la SH, la septicemia tiene lugar en la fase terminal de la enfermedad. Por tanto, las muestras de sangre
procedentes de animales enfermos antes de la muerte no siempre contienen microorganismos de P. multocida.
Adems, no estn siempre presentes en las secreciones nasales de los animales enfermos.
Una muestra de sangre o un bastoncillo de algodn o hisopo empapado en el contenido del corazn resultan
muestras adecuadas si se toman a las pocas horas de la muerte. Si el animal lleva muerto algn tiempo, se
puede tomar un hueso largo, desprovisto de tejido. Si no existen servicios para un examen post-mortem, se
puede obtener sangre de la vena yugular por incisin y/o aspiracin. Las muestras de sangre deben enviarse en
hielo, por cualquier medio estndar de transporte y bien empaquetadas, para evitar cualquier prdida.
Los frotis de sangre de animales infectados se tien con los colorantes de Gram, de Leishman o con azul de
metileno. Los microorganismos se presentan como bacilos cortos Gram-negativos y con tincin bipolar. No se
puede establecer un diagnstico definitivo basada solamente en el examen microscpico directo.
Se cultivan las muestras de sangre, o el material de los bastoncillos de algodn despus de su lavado en 2-3 ml
de solucin salina fisiolgica estril. Alternativamente, la superficie de un hueso largo se limpia con alcohol, se
esteriliza a la llama y se abre por rotura. Se extrae la mdula en condiciones aspticas y se cultiva. Normalmente
el cultivo directo resulta satisfactorio solo si la muestra es fresca y est libre de contaminantes o invasores postmortem que pudieran enmascarar el crecimiento de cualquier Pasteurella presente.
En exmenes biolgicos, se inocula subcutnea o intramuscularmente en ratones un pequeo volumen (0.2 ml)
del lquido de lavado de los bastoncillos o hisopos de algodn impregnados de sangre o con una porcin de
mdula sea en solucin salina. El ratn sirve normalmente como un filtro biolgico para microorganismos
extraos. Si existe P. multocida viable, el ratn muere a las 24-36 horas de la inoculacin, y se puede comprobar
en frotis de sangre el crecimiento de P. multocida en cultivo puro. Por lo general, los cultivos puros de P.
multocida se pueden obtener a partir de muestras de sangre de ratones, incluso aunque las muestras originales
procedan de canales relativamente viejas. El microorganismo puede identificarse por sus caractersticas
morfolgicas y de cultivo, por reacciones bioqumicas y por pruebas serolgicas.
Un medio de cultivo adecuado para el crecimiento de Pasteurella es un medio con casena/sacarosa/extracto de
levadura (CSY) solidificado con agar y que contenga 5% de sangre. La composicin de este medio incluye:
hidrolizado de casena (3 g), sacarosa (3 g), extracto de levadura (5 g), cloruro sdico (5 g), ortofosfato
dipotsico cido anhidro (3 g) y agua destilada hasta 1 litro. El pH se ajusta a 7,3-7,5, despus de lo cual se
581
aade agar al 1,5%. El medio se autoclava a una presin de 1 bar durante 15 minutos. Despus de enfriar a 4550C, se aade sangre de ternero al 5% (libre de anticuerpos frente a P. multocida) (31).
En aislamientos primarios P. multocida forma colonias lisas, brillantes, de aspecto grisceo y traslcido, de
aproximadamente 1 mm de dimetro, despus de 24 horas de incubacin a 37C en medio slido con sangre.
Las colonias obtenidas en medio slido CSY son de mayor tamao. Los cultivos viejos, en particular los
obtenidos sobre medios que carecen de sangre, pueden producir colonias ms pequeas. Pasteurella multocida
no crece en medio slido de MacConkey. Los frotis de sangre o tejido teidos por el mtodo de Gram muestran
formas cocoides que son pequeas, ovales, con tincin polar y Gram-negativas. Se puede observar un cierto
grado de pleomorfismo, particularmente en cultivos viejos, con bacilos largos, de longitud variable. La tincin
bipolar es ms evidente con azul de metileno o con el colorante de Leishman.
Los microorganismos causantes de SH son oxidasa, catalasa e indol positivos y reducen los nitratos a nitritos. No
producen sulfhdrico ni ureasa, y son incapaces de utilizar el citrato o de licuar la gelatina. Siempre fermentan la
glucosa y la sacarosa con produccin exclusiva de cido. La mayor parte de las cepas tambin fermentan el
sorbitol. Algunas cepas fermentan la arabinosa, xilosa y maltosa, mientras que la salicina y la lactosa casi nunca
son fermentadas.
Una propiedad de las cepas de P. multocida que causan la SH es su capacidad para producir la enzima
hialuronidasa (7). Despus de identificar el gnero y la especie a partir de las caractersticas del cultivo y por
pruebas bioqumicas, la produccin de hialuronidasa se puede utilizar como una prueba especfica para
pasteurelas que causan SH. Debe advertirse que los serotipos B excepto el B.2 (o 6:B), y el tipo E no producen
hialuronidasa.
Un cultivo productor de cido hialurnico se siembra en el centro de una placa de medio slido con dextrosa y
almidn. El cultivo de pasteurela en el que se va a investigar la produccin de hialuronidasa se siembra por estra
en ngulos rectos. Las placas se incuban durante 18 horas a 37C. Originariamente se utilizaba Streptococcus
equi como productor de cido hialurnico, pero en la actualidad es ms adecuado un cultivo de P. multocida tipo
A, con cpsula mucosa. En el punto de interseccin, el crecimiento de la cepa mucosa productora de cido
hialurnico se ver disminuido hasta una fina lnea de crecimiento, indicando la produccin de hialuronidasa por
el cultivo ensayado. El uso de placas con medios recin preparados y un incubador con humidificacin facilita la
produccin de cido hialurnico y, por consiguiente, la interpretacin de la prueba.
Mtodos inmunolgicos
Se utilizan varias pruebas inmunolgicas para la identificacin de los serotipos de P. multocida que causan SH.
stas incluyen una prueba rpida de aglutinacin en porta (20), una prueba IHA para el tipado capsular (6), una
prueba de aglutinacin con clulas tratadas con cido clorhdrico para el tipado somtico (21), la prueba IGDA (1,
14,32), y la prueba de contra-inmunoelectroforesis (CIEP) (8).
Para la mayor parte de estas pruebas se preparan sueros hiperinmunes en conejos contra las cepas especficas
de referencia. Los cultivos en medio CSY lquido (despus de 6-8 horas de incubacin) se siembran en medio
slido CSY con sangre. Despus de incubar toda la noche (18-20 horas) las clulas se lavan con solucin salina
fisiolgica que contiene 0,3% de formalina. La turbidez de la suspensin celular se ajusta a la de un tubo nmero
4 de la escala de MacFarland. A intervalos de 3-4 das los conejos se inoculan subcutnea o intramuscularmente
con 0,2, 0,5, 1,0, 1,5 y finalmente con 2,0 ml de esta suspensin. Una semana despus de la ltima inyeccin,
los conejos se inoculan subcutnea o intramuscularmente con 0.5 ml de una suspensin celular similar, pero
viva. Los animales se sangran 10 das despus. El suero se guarda a 20C, pero para uso regular se mantienen
pequeas cantidades a 4 C adicionadas con mertiolato al 1/10.000.
a)
Prueba rpida de aglutinacin en porta (tipado capsular)

Una colonia aislada se mezcla en un porta con una gota de solucin salina, se aade una gota de
antisuero, y el porta se calienta suavemente. En 30 segundos aparece una aglutinacin floculenta y
granulosa. Los cultivos viejos pueden presentar una aglutinacin granular fina que tarda ms en aparecer.
b)
Prueba de la hemaglutinacin indirecta (tipado capsular)

En un principio esta prueba se realizaba utilizando hemates (RBCs) humanos de tipo O sensibilizados
con el antgeno (6), pero ms recientemente se han utilizado RBCs de oveja (24,31). El antgeno se prepara
como sigue:
Un caldo de cultivo de 6-8 horas, de una cepa de referencia, se siembra en medio slido CYS con sangre y
se incuba toda la noche a 37C. Las clulas se recogen en 3 ml de solucin salina fisiolgica con 0,3% de
formalina. Esta suspensin se calienta luego a 56C durante 30 minutos, se centrifuga a 3.000 g durante 15
minutos a 4C, y el lquido sobrenadante claro se mantiene a -20C. Si no se dispone de centrfuga
582
refrigerada, la centrifugacin a 1.500 g durante 30 minutos permite obtener un sobrenadante lquido. ste
se utiliza como el extracto antignico. Se sigue un procedimiento similar para preparar un extracto
antignico de una cepa desconocida que se desea tipar.
Por otro lado, se recoge sangre de oveja, con un anticoagulante, en condiciones aspticas y se centrifuga a
500 g durante 10 minutos. Las RBCs sedimentadas se lavan tres veces con solucin salina fisiolgica
estril. El extracto antignico procedente de una cepa de prueba preparada por el mtodo descrito
anteriormente se utiliza para sensibilizar las RBCs o se absorbe en las RBCs. Esto se lleva a cabo
aadiendo a las RBCs 15 volmenes del extracto antignico e incubando la mezcla 1 hora a 37C con
agitacin frecuente. Las RBCs sensibilizadas se recogen por centrifugacin, se lavan tres veces con
solucin salina fisiolgica estril, y se hace una suspensin final al 1% en solucin salina fisiolgica. El
antisuero hiperinmune de tipo especfico (tres volmenes) se absorbe durante 30 minutos a temperatura
ambiente mediante la adicin de las RBCs sedimentadas (un volumen), y a continuacin se centrifuga a
500 g por 10 minutos para sedimentar las RBCs. El antisuero absorbido se inactiva luego por calentamiento
a 56C durante 30 minutos.
La prueba se puede realizar en tubos o en placas, y se lleva a cabo en dos filas. La prueba descrita a
continuacin corresponde a la realizacin en placas de Lucite (una marca comercial de placas de
metacrilato).
i)
El extracto capsular de la cepa desconocida se prepara como se ha indicado antes y se utiliza para
sensibilizar las RBCs de oveja. Los sueros hiperinmunes de serotipo especfico conocido que se han
obtenido en conejos contra los tipos A,B,D y E se diluyen del siguiente modo:
ii)
Usando cuatro filas separadas, los primeros pocillos de cada una se llenan con 0,72 ml de solucin
salina y los siguientes seis pocillos, o ms, con 0,4 ml.
iii)
Cada uno de los sueros hiperinmunes de tipo especfico se diluye separadamente en cada fila
aadiendo 0,08 ml del suero al primer pocillo y mezclando con una pipeta. Se transfieren 0,4 ml de
este pocillo al siguiente, se mezcla, y el proceso se repite hasta el pocillo siete. Esto supone una
dilucin 1/10 en el primer pocillo y una dilucin doble en cada uno de los siguientes.
iv)
Cada uno de los pocillos se rellena con 0,4 ml de RBCs sensibilizadas con el antgeno absorbido, se
agita levemente y se deja incubar a temperatura ambiente. Mediante la adicin de los glbulos rojos
sensibilizados, la dilucin del suero en los pocillos se dobla, es decir, 1/20 en el primer pocillo, 1/40 en
el segundo, y as sucesivamente. En cada realizacin de la prueba se incluye un control positivo, un
control negativo y un control de solucin salina.
v)
La primera lectura se realiza a las 2 horas y la final 18 horas despus. La presencia de aglutinacin de
las RBCs por los lados de los pocillos cncavos se considera un resultado positivo, y la formacin de
un botn en el centro de los pocillos como negativo. Dependiendo del tamao de la aglutinacin se
establece una clasificacin arbitraria de 1-4. Una cepa desconocida en cuanto a tipado se identifica
por el suero hiperinmune con el que presenta aglutinacin. En caso de ausencia de aglutinacin con
todos los sueros, la cepa se considera como no tipificable.
Aunque la prueba IHA puede usarse para tipar cepas desconocidas, la prueba en s es ms eficaz cuando
se trata de serotipos B y E y es ms fiable como prueba cuantitativa frente a estas cepas.
c)
Pruebas de inmunodifusin en medio slido

Las pruebas IGDA de inmunodifusin en gel de agar se utilizan para lo que se conoce como tipado
capsular as como para el tipado somtico, dependiendo de los antgenos y de los antisueros
empleados. Se utiliza la tcnica de la difusin doble. Los pocillos se disponen en el agar solidificado
siguiendo un modelo circular con un pocillo central y seis pocillos perifricos.
i)
Tipado capsular: El gel del medio se prepara con 1% de agar Noble, o un producto equivalente, en
tampn fosfato 0,2 M con mertiolato, a una concentracin final de 1/10.000 (1,32). Los antgenos y
antisueros son los mismos que para el tipado capsular por el mtodo de IHA (6). El antisuero estndar
se coloca en el pocillo central, y los antgenos de prueba se colocan en los pocillos perifricos
alternando con el antgeno homlogo estndar.
ii)
Tipado somtico: El gel del medio es agar Noble, especial, o un producto equivalente, a una
concentracin de 0,9% en una solucin de cloruro sdico al 0,85%.
iii)
Para la preparacin del antgeno, se recogen las clulas crecidas en cada placa en 1 ml de cloruro
sdico al 8,5% que contiene 0,3% de formalina. La suspensin se calienta a 100C durante 1 hora, las
clulas se sedimentan por centrifugacin, y el sobrenadante lquido se utiliza como antgeno.
583
d)
iv)
Los antisueros contra los 16 tipos somticos (14) se obtienen hiperinmunizando pollos. La bacterina
emulsificada en aceite1 (1 ml) se inyecta subcutneamente en la porcin media del cuello de pollos de
12-16 semanas de edad. Tres semanas despus se inocula otra inyeccin intramuscular de 1 ml en el
pecho, a razn de 0,5 ml a cada lado del esternn. Una semana despus las aves se sangran, y el
suero se separa y conserva con 0,01% de tiomerosal y 0,06% de fenol. Los sueros se ensayan frente
a todos los tipos somticos y aquellos que muestren reaccin cruzada se eliminan.
v)
El antgeno de prueba se coloca en el pocillo central y en los pocillos perifricos se disponen los
antisueros contra los diferentes serotipos. Todos los serotipos que producen septicemia hemorrgica
(cepas asiticas y africanas) reaccionarn con el antisuero de tipo 2. Pueden presentarse reacciones
cruzadas con el tipo 5.
Contra-inmunoelectroforesis
La CIEP representa un mtodo rpido para la identificacin de cultivos pertenecientes a los tipos capsulares
B y E.
e)
i)
Preparacin del extracto capsular: El extracto capsular se prepara de la misma manera que la descrita
para la prueba de IHA.
ii)
Preparacin de antisueros hiperinmunes: Los antisueros se preparan en conejos como en el caso de

la prueba de IHA.
iii)
Medio para la CIEP: El medio para la CIEP consta de agarosa (2,0 g), barbitona sdica (2,06 g), cido
dietil barbitrico (0,37 g), agua destilada (180 ml) y solucin de mertiolato al 1/1.000 (20 ml).
iv)
Tampn de Veronal acetato (tampn barbitona): El tampn barbitona consta de barbitona sdica
(29,24 g), acetato sdico anhidro (11,70 g), cido clorhdrico 0,1 N (180 ml), y agua destilada hasta
completar 3 litros. El pH debera ser de 8,8.
v)
Preparacin de las placas: Las placas para electroforesis se preparan pretratando las lminas de
vidrio (57 mm x 70 mm) con 12 ml del medio. En una fila, se practican siete pocillos de 4 mm de
dimetro y separados entre s por 7 mm. A 6 mm de distancia (de centro a centro) se prepara un
conjunto de pocillos en paralelo con el otro conjunto de pocillos.
vi)
Procedimiento de la prueba: Al pocillo del lado del ctodo se le aaden 20 l de antgeno capsular y al
del lado del nodo se aade un volumen idntico del antisuero especfico de tipo. Los controles que se
incluyen en la prueba son una solucin de cloruro sdico al 0,85% contra el antisuero positivo, y
extracto capsular contra el suero negativo de conejo as como muestras control positivas y negativas.
El tanque de electroforesis se llena con tampn barbitona, pH 8,8. El antgeno y el antisuero se
someten a electroforesis durante 30 minutos a 150 V (25 V/cm). A continuacin se examinan las
placas para comprobar la presencia de lneas de precipitacin.
vii)
Interpretacin de los resultados: La presencia de una lnea definida entre los pocillos del antgeno y
del antisuero se considera un resultado positivo.
Pruebas de aglutinacin (antgeno somtico)

El antgeno somtico O se prepara por un mtodo similar al descrito previamente en la prueba IHA
(19,21). Un cultivo de prueba de 6-8 horas se siembra en medio slido CSY con sangre y se incuba toda la
noche. Las clulas de cada placa se recogen en 2-3 ml de solucin salina fisiolgica con 0,3% de formalina,
y se centrifuga a 3.000 g durante 15 minutos a 4C (o 1.200-1.500 g durante 30-45 minutos a temperatura
ambiente). Las bacterias depositadas se resuspenden en 25 ml de solucin salina con HCl normal (0,85%
de cloruro sdico en una solucin 1 N de HCl) hasta dar una opacidad aproximadamente equivalente a la
de un tubo nmero 6 de la escala de Brown, y se incuba toda la noche. La suspensin se centrifuga de
nuevo, el sobrenadante se elimina, y los restos celulares se lavan de modo sucesivo con solucin salina
tamponada con fosfato (PBS) a pH 5,0, 6,0 y 7,0, respectivamente.
Finalmente, se prepara en PBS a pH 7,0 una suspensin de los restos celulares, equivalente a la opacidad
del tubo nmero 6 de Brown. Cualquier suspensin que muestre signos de aglutinacin debe desecharse.
584
La preparacin de una emulsin estable de aceite es un proceso delicado. Los antgenos bacterianos se cubren en
medio lquido con un aceite mineral ligero (adyuvante) y luego se emulsifican (se estabilizan) con un agente
emulsionante, en este caso lanolina (grasa de lana). Esto debe hacerse debido a que la fase acuosa que contiene la
bacteria (fase lquida) no se mezcla con la fase lipdica (adyuvante). La proporcin entre el aceite y el agente
emulsionante vara con diferentes lotes de lanolina y tiene que ser ajustada de modo adecuado. Cuanto mayor sea el
porcentaje de lanolina, mayor ser la estabilidad de la emulsin. No obstante, un elevado porcentaje de lanolina puede
hacer la solucin muy viscosa, lo que no favorecer el proceso de vacunacin en condiciones de campo.
Se preparan antisueros contra suspensiones de clulas bacterianas completas de las cepas de referencia
6:B (SH asitica), 6:E (SH africana) y 11:B (cepa australiana 989, no productora de SH). Las pruebas de
aglutinacin se realizan en un porta y el antgeno de prueba se emplea contra los tres tipos de sueros. Una
aglutinacin fina y granular indica una aglutinacin somtica especfica. La realizacin de pruebas utilizando
antgenos estndar facilitar la estimacin y la interpretacin. Cuando ocurre una aglutinacin parcial
inespecfica, las pruebas realizadas con diluciones decimales del suero contra los antgenos de ensayo y
contra los antgenos estndar pueden ayudar a identificar el antgeno somtico.
f)
Designacin de serotipos
En general, se adoptan dos sistemas de serotipado. Uno es el tipado capsular mediante la prueba IHA de
Carter (6) o por pruebas IGDA (1, 32). El otro es el tipado somtico mediante el mtodo de Namioka &
Murata (19, 21, 22) y por el mtodo de Heddleston et al. (14). Existe un acuerdo generalizado de que la
designacin de los serotipos debe basarse en una combinacin somtico-capsular. Dos sistemas
normalmente en uso son el de Namioka-Carter y el de Carter-Heddelston. En el primer sistema, los
serotipos de SH asitica y africana se designan respectivamente como 6:B y 6:E, mientras que en el ltimo
se designan como B.2 y E.2, respectivamente.
g)
Pruebas de sensibilidad a antimicrobianos

La determinacin de la sensibilidad a antimicrobianos (AST) es particularmente necesaria en el caso de
P. multocida, cuya resistencia a los agentes antimicrobianos normalmente utilizados ha sido objeto de una
revisin por Kehrenberg et al. (16). Los mtodos para ATS se describen en el Captulo I.1.10. Tcnicas de
laboratorio para ensayos de sensibilidad de bacterias frente a antimicrobianos. El mtodo de difusin en
disco se ha utilizado para ensayar bacterias patgenas comunes de crecimiento rpido y se considera que
funciona bien con P. multocida (3). Se pueden obtener resultados fiables mediante pruebas de difusin en
disco que utilicen una metodologa estandarizada y una medida de la zona de dimetros que se
correlacione con la concentracin mnima inhibitoria (MIC) y con el comportamiento de las cepas en cuanto
a su clasificacin como clnicamente susceptibles y resistentes. La seleccin de los agentes antimicrobianos
ms apropiados a probar es una decisin que debe hacerse por cada laboratorio de acuerdo con las
necesidades de los veterinarios en activo y las substancias disponibles para uso veterinario en el pas. Los
siguientes agentes han demostrado eficacia clnica: penicilina, amoxicilina (o ampicilina), cefalotina,
ceftiofur, cefquinoma, estreptomicina, gentamicina, espectinomicina, florfenicol, tetraciclina, sulfonamidas,
trimetroprim/sulfametoxazol, eritromicina, tilmicosin, enrofloxacina (u otras fluoroquinonas).
La amplificacin de secuencias de ADN por PCR permite directamente una deteccin rpida y una identificacin
provisional de microorganismos a partir de muestras clnicas o a partir de pequeas cantidades de cultivos
bacterianos tanto mixtos como en cultivo puro. No se requieren procedimientos complejos para la extraccin y
purificacin de ADN excepto cuando se utilizan muestras de sangre, orina o restos fecales. La presencia en
estos materiales de compuestos que inhiben la PCR requiere que se extraigan o eliminen antes de la
amplificacin.
a)
Ensayo de PCR especfico para Pasteurella multocida

La tecnologa de la PCR puede aplicarse a la deteccin rpida, sensible y especfica de P. multocida
(17, 23, 29). Aunque cada mtodo publicado evidencia algunos inconvenientes, la rapidez y especificidad
del ensayo de PCR especfico para P. multocida (29) permite una eficacia ptima sin necesidad de
hibridacin adicional. Aunque el uso de hibridacin puede confirmar la especificidad, este enfoque solo es
posible en laboratorios especializados. El ensayo de PCR especfico para P. multocida identifica todas las
subespecies de P. multocida; subsp. multocida, subsp. gallica, y subsp. septica por medio de una
amplificacin especfica de un fragmento de ADN de aproximadamente 460 bp dentro del gen KMT1.
Aunque el ADN de P. canis biovar 2 tambin resulta amplificado, estas especies son fcilmente
diferenciables mediante la produccin de indol.
Se transfiere directamente una fraccin de una colonia aislada del organismo sospechoso a la mezcla de
PVCR. Alternativamente, el ADN patrn puede obtenerse de 2 l de un cultivo puro o mixto en medio
lquido. Todos los mtodos utilizados actualmente para la preparacin del ADN patrn proporcionan
resultados reproducibles con los cebadores KMT1 (29), y permiten la deteccin de unos
10 microorganismos por reaccin. La sensibilidad y especificidad de la PCR especfica para P. multocida
representa el argumento ms convincente para el uso de la tecnologa de PCR en la investigacin de
laboratorio en casos sospechosos de SH. Se puede detectar Pasteurella multocida independientemente de
la pureza de la muestra, lo que supone una ventaja si sta procede de una canal antigua o de tomas
nasales o de las amgdalas. En tales casos, se debera inocular los bastoncillos de algodn que contienen
la muestra en 2 ml de medio CSY lquido e incubar en rotacin durante 2-4 horas; se aaden luego 2 l del
cultivo directamente a la mezcla de la PCR antes de la amplificacin.
585
Secuencias de los cebadores (29):

PCR especfica para P. multocida:
KMT1T7
KMT1SP6
5-ATC-CGC-TAT-TTA-CCC-AGT-GG-3
5-GCT-GTA-AAC-GAA-CTC-GCC-AC-3
Condiciones de la PCR:
Se aade el ADN molde a la mezcla de PCR que contiene (en un volumen total de 25 l) 1 x tampn para
PCR, 200 M de cada desoxinucletido trifosfato (dNTP), 2 mM de Mg Cl2, 3.2 pmoles de cada cebador y
0.5 g de ADN Taq polimerasa. Los parmetros de ciclacin para un Termociclador Corbett FTS-320 (o
modelo similar) son: desnaturalizacin inicial a 95C durante 5 minutos; 30 ciclos de 95C durante 1 minuto,
de 55C durante 1 minuto, de 72C durante 1 minuto; con una extensin final a 72C durante 7 minutos. El
producto de la reaccin se mantiene a 4C hasta que se utiliza para electroforesis; 5 l de cada muestra se
someten a electroforesis en gel de agarosa al 2% en 1 x tampn de desarrollo Tris-acetato (TAE) a 4 V/cm
por 1 hora. El gel se tie con bromuro de etidio y los fragmentos de ADN se visualizan por luz UV en un
transiluminador.
b)
Sistema de tipado capsular mltiple de Pasteurella multocida por PCR

La identificacin de los genes implicados en la biosntesis de las cpsulas polisacardicas de P. multocida
A:1 (11) y B:2 (4) suministr la informacin necesaria para determinar la regin biosinttica de los tres
serogrupos restantes (D, E y F) (4). Con este conocimiento, se identificaron las secuencias especficas de
serogrupo para utilizarlas como cebadores en un sistema de tipado capsular mltiple por PCR (4). Los
cebadores especficos de P. multocida se incluyen como un control interno para la identificacin de la
especie.
PCR capsular mltiple:
CAPA-FWD
CAPA-REV
CAPB-FWD
CAPB-REV
CAPD-FWD
CAPD-REV
CAPE-FWD
CAPE-REV
CAPF-FWD
CAPF-REV
KMT1T7
KMT1SP6
5-TGC-CAA-AAT-CGC-AGT-GAG-3
5-TTC-CCA-TCA-TTG-TCA-GTG-3
5-CAT-TTA-TCC-AAG-CTC-CAC-C-3
5-GCC-CGA-GAG-TTT-CAA-TCC-3
5-TTA-CAA-AAG-AAA-GAC-TAG-GAG-CCC-3
5-CAT-CTA-CCC-ACT-CAA-CCA-TAT-CAG-3
5TCC-GCA-GAA-AAT-TAT-TGA-CTC-3
5-GCT-TGC-TGC-TTG-ATT-TTG-TC-3
5-AAT-CGG-AGA-ACG-CAG-AAA-TCA-G-3
5-TTC-CGC-CGT-CAA-TTA-CTC-TG-3
5-ATC-CGC-TAT-TTA-CCC-AGT-GG-3
5-GCT-GTA-AAC-GAA-CTC-GCC-AC-3
Tamao de los fragmentos resultantes:

Serogroup A
Serogroup B
Serogroup D
Serogroup E
Serogroup F
CAPA-FWD/CAPA-REV
CAPB-FWD/CAPB-REV
CAPD-FWD/CAPD-REV
CAPE-FWD/CAPE/REV
CAPF-FWD/CAPF-REV
1044 pb
760 pb
657 pb
511 pb
851 pb
Condiciones de la PCR:
Se aade el ADN patrn a la mezcla de PCR que contiene (en un volumen total de 25 l) 1 x tampn para
PCR, 200 M de cada desoxinucletido trifosfato (dNTP), 2 mM de Mg Cl2, 3.2 pmoles de cada cebador y
1 g de ADN Taq polimerasa. En la publicacin original (4) se sugiere utilizar un programa de ciclacin
estndar como el del ensayo especfico de P. multocida por PCR. Sin embargo, la validacin del sistema
mltiple de PCR indica que se debera usar el siguiente programa ptimo de ciclacin en el caso de
emplear un Perkin Elmer GeneAmp PCR System 2440: desnaturalizacin inicial a 95C durante 5 minutos;
30 ciclos de 95C durante 30 segundos, de 55C durante 30 segundos, de 72C durante 90 segundos; con
una extensin final a 72C durante 5 minutos. La electroforesis en gel de agarosa se lleva a cabo como se
ha indicado anteriormente.
c)
Ensayo de PCR para cepas de tipo especfico B causantes de SH

Tambin es posible realizar una identificacin provisional de cepas de P. multocida de tipo especfico B
causantes de SH mediante amplificacin por PCR (5,29). El anlisis comparativo con el genoma de
Haemophilus influenzae Rd indica que en ambos ensayos se amplifican regiones de ADN que estn muy
586
prximas, aunque se evidencian pequeas diferencias en cuanto a especificidad. Hasta la fecha, el ensayo
de PCR para cepas de tipo especfico B causantes de SH (29) es especfico al 100% para serotipos de tipo
B de aislamientos de P. multocida que causan SH. Los cultivos de tipo B cuyo antgeno somtico
predominante es del tipo 2 o del tipo 5 se identifican por amplificacin de un fragmento de unas 620 pb con
los cebadores KTSP61 y KTT72.
PCR para cepas de tipo especfico B causantes de SH
KTT72
KTSP61
5-AGG-CTC-GTT-TGG-ATT-ATG-AAG-3
5-ATC-CGC-TAA-CAC-ACT-CTC-3
Las condiciones de la PCR para cepas de tipo especfico B causantes de SH son como las descritas para la
PCR especfica de P. multocida.
Los cebadores de la PCR para cepas de tipo especfico B causantes de SH se pueden utilizar tambin en
una PCR mltiple con los cebadores especficos de P. multocida, lo que disminuye notablemente el tiempo
necesario para la deteccin de P. multocida y la identificacin provisional del serotipo causante de la SH.
Las condiciones de PCR mltiple son como las descritas anteriormente excepto que se utilizan 3.2 pmoles
de cada uno de los cuatro cebadores y 1g de ADN Taq polimerasa. En el caso de microorganismos
sospechosos, el uso del sistema mltiple de PCR especfico para P. multocida/ PCR para cepas
de tipo especfico B causantes de SH puede confirmar la identidad y suministrar un serotipo provisional en
34 horas, en comparacin con las 2 semanas que puede requerir el anlisis bioqumico y el serotipado por
mtodos convencionales.
d)
Diferenciacin genotpica de los aislamientos

Una vez que se ha realizado la identificacin provisional (o definitiva), se puede lograr una identificacin
adicional de los aislamientos por mtodos de determinacin de la huella molecular genotpica. El anlisis
por endonucleasas de restriccin con el enzima HhaI ha resultado muy til para caracterizar serotipos de
tipo B productores de SH, con 13 perfiles nicos de huellas entre 54 aislamientos semejantes al perfil de la
cepa de referencia con serotipo somtico 2 (33). Por el contrario, aunque se observ un perfil nico con
HhaI entre 13 aislamientos del serogrupo E, fue posible la diferenciacin de estas cepas despus de la
digestin con la enzima HpaII. El ribotipado y la separacin por electroforesis en campo pulsante de
fragmentos de ADN de gran tamao, tambin permite una discriminacin til de los serogrupos B y E en
aislamientos de P. multocida (27). Sin embargo, estas tcnicas son utilizadas en gran parte con fines de
investigacin y requieren un equipamiento especializado.
Para cualquier laboratorio con capacidad para realizar PCR resulta posible llevar a cabo las determinacin
de huellas moleculares genotpicas con PCR, y se dispone de varios mtodos utilizados con anterioridad en
otros microorganismos para la diferenciacin en P. multocida. El anlisis de ADN polimrfico amplificado al
azar (RAPD) y la tcnica de PCR con cebadores aleatorios (AP-PCR) han sido tiles, respectivamente, en
estudios epidemiolgicos de P. multocida aislada de conejos (10) y en la diferenciacin de aislamientos de
P. multocida obtenidos despus de la vacunacin en pavos (15). Sin embargo, no se ha descrito con
anterioridad ningn anlisis mediante RAPD y AP-PCR de aislamientos de P. multocida que causan SH. El
anlisis de P. multocida mediante secuencias repetitivas por PCR ha permitido una diferenciacin entre los
aislamientos de origen aviar y porcino, aunque todas las cepas analizadas que causaban SH mostraron
perfiles similares (28,30).
2.
Pruebas serolgicas
Por lo general en el diagnstico no se utilizan pruebas serolgicas para detectar anticuerpos. La prueba IHA
puede utilizarse con este fin, siguiendo un mtodo en cierto modo similar al descrito antes para el tipado
capsular. Cuando por la prueba IHA se detectan ttulos altos, el resultado indica una exposicin reciente a SH.
Como SH es una enfermedad que se presenta principalmente en animales mantenidos en condiciones de cra
poco sofisticadas, donde los sistemas de declaracin de casos de enfermedad son tambin pobres, a menudo se
produce un retraso considerable en la declaracin de brotes epidmicos. Las muertes se producen de modo muy
repentino y cuando la declaracin se produce no existen cadveres disponibles para el examen. En tales
situaciones, a efectos de diagnstico, la presencia de ttulos altos en IHA, de 1/160 hasta 1/1280 o superiores, en
animales supervivientes que han estado en contacto con las manadas infectadas, es un indicador de exposicin
reciente a SH.
587

Los tres tipos de vacunas utilizadas contra la SH son bacterinas, vacunas precipitadas con almina (APV) y
vacunas con adyuvantes lipdicos (OAV). Para lograr una inmunidad suficiente con bacterinas, se requiere una
vacunacin repetida. La administracin de bacterinas muy densas puede dar lugar a la aparicin de reacciones
anafilcticas, que son menos frecuentes con APV y casi inexistentes con las OAV.
Las directrices para la produccin de vacunas se presentan en el Captulo I.1.7. Principios de produccin de
vacunas veterinarias. Las normas dadas aqu y en el Captulo I.1.7 intentan ser de naturaleza general y pueden
suplementarse con requisitos regionales y nacionales.
1.
Control de inculos
a)

Se utiliza un aislamiento local de P. multocida que represente el serotipo predominante. Se debe mantener
un cultivo estable y bien capsulado que produzca grandes colonias, de aproximadamente 2 mm de
dimetro, en medio slido CSY con sangre. Los cultivos del inculo deben mantenerse en medio nutritivo
semislido a temperatura ambiente como cultivos en picadura, o como cultivos liofilizados.
b)
Mtodo de cultivo
Se infecta un ternero con el cultivo, y, dentro de las 2-3 horas post-mortem, se toma aspticamente sangre
del corazn y se guarda en alcuotas de 1 ml a 20C. Para cada nuevo lote de vacuna se usa una alcuota
reciente. Se permite subcultivar esta alcuota una o dos veces, con tal de que el tamao de las colonias no
disminuya. Se descongela una alcuota de sangre, se siembra sobre el medio slido CSY con sangre, y el
crecimiento resultante se prueba en aglutinacin sobre un porta con el antisuero adecuado. Un buen cultivo
presentar una aglutinacin gruesa y floculenta, en menos de 30 segundos. Un cultivo pobre solo producir
una aglutinacin fina y granular.
Los lotes de siembra deben ser:
i)
Puros: Exentos de agentes contaminantes.
ii)
Seguros: Sin producir reacciones adversas en la especie a la que va dirigida cuando se suministra
siguiendo las recomendaciones.
iii)
Eficaces: Estimulan la inmunidad eficazmente como se indica en las pruebas de potencia.
Las pruebas requeridas se describen ms adelante en la Seccin C.4.
2.
Mtodo de produccin
Para la produccin de vacunas se requieren suspensiones bacterianas densas. Deben tener un contenido
bacteriano mnimo de 1.5 g de peso seco por litro de suspensin. Existen dos mtodos para producir
suspensiones densas. El primero consiste en cultivar en medio slido en frascos Roux y recoger en solucin
salina fisiolgica con formalina, con lo que se puede lograr suspensiones de cualquier densidad. Este
procedimiento resulta laborioso ya que cada frasco debe ser recolectado por separado y probado en cuanto a
pureza. El segundo mtodo es el recomendado y se basa en el uso de un gran contenedor con cultivos aireados
en un medio que permita especficamente el crecimiento de P. multocida. Un medio estril adecuado hidrolizado
de casena (2 g), sacarosa (6 g), extracto de levadura (6 g), cloruro sdico (5 g), ortofosfato cido dipotsico
anhidro (8,6 g), ortofosfato dicido de potasio anhidro (1,36 g) y agua destilada hasta un litro. Se obtiene un
crecimiento ms denso si la casena, la sacarosa y el extracto de levadura se preparan concentrados, se
esterilizan por filtracin o se autoclavan durante 10 minutos a 107C, y se transfieren de modo asptico al tanque
que previamente ha sido esterilizado por calor con el resto de los ingredientes.
Existen dos tipos de proceso de aireacin por vrtex y por inyeccin. En la aireacin por vrtex, el aire estril se
introduce con un compresor, y el cultivo se agita por la fuerza de impulsin de la columna que opera en la
corriente de aire, mientras que en la aireacin por inyeccin el aire se dispersa a travs de un inyector. Una
aireacin intermitente parece producir un crecimiento ms denso (25). Cuanto ms fino est el aire dispersado,
mejor es el crecimiento bacteriano. Normalmente se emplean contenedores de 20-40 litros, y la incubacin se
realiza a 37C. En sistemas de cultivo continuo, una vez alcanzada la densidad mxima, lo que normalmente
ocurre hacia las 15 horas, se recoge un 25% del volumen de trabajo y se reemplaza cada hora. Las cosechas de
los cultivos continuos se recogen en recipientes relativamente pequeos por separado, pero, despus de varios
das, la densidad disminuye, posiblemente debido a la prdida del antgeno capsular. Por esta razn, son
preferibles los cultivos discontinuos. Si los recipientes con cultivos discontinuos se inoculan con 50 ml/litro de
588
medio, se obtiene una turbidez mxima en 15-18 horas, que es cuando el crecimiento se puede detener por
adicin de formalina a una concentracin final de 0,5%. Este procedimiento, en el que se emplea un gran inculo
y el crecimiento se detiene despus de un corto perodo, ayuda a reducir la posibilidad de contaminacin. La
turbidez se estandariza con una referencia que contenga el equivalente a 1,5 g/litro, peso seco/volumen.
OAV se logra emulsificando volmenes iguales de un aceite mineral ligero y de suspensin bacteriana, con 5%
de lanolina pura anhidra como agente emulsionante. El aceite mineral y la lanolina se esterilizan primero, y
despus de enfriarse a 40C, se aade a la muestra 0,5% de formalina. La suspensin bacteriana se aade
lentamente y se contina la emulsin por otros 10 minutos. Despus de dejar estabilizar toda la noche, la mezcla
se re-emulsiona, se embotella y se guarda a 4C durante 2 semanas antes de uso.
3.
Control interno
Es necesario controlar la concentracin adecuada de masa microbiana, la capsulacin de la bacteria, la pureza

del cultivo y la eficacia de la inactivacin.
4.
Control de lotes
a)
Esterilidad
Las pruebas de esterilidad y de ausencia de contaminantes en materiales biolgicos pueden verse en el
Captulo I.1.5.
b)
Inocuidad
Se vacunan dos cabezas de ganado seronegativo con el doble de la dosis recomendada y se observa la
presencia de efectos adversos durante un periodo de 10-14 das.
Se inoculan intramuscularmente cinco ratones con 0.2 ml de vacuna cada uno, y se observan durante
5 das. La sangre de cualquier ratn que muera, se cultiva para investigar la presencia de P. multocida.
c)
Potencia
Las pruebas de potencia se pueden realizar por cualquiera de los mtodos siguientes:
i)
Vacunacin del ganado seguida del desafo directo o pruebas de proteccin pasiva en el ratn,
utilizando los sueros bovinos. Este procedimiento no es muy viable ya que el desarrollo de una
inmunidad adecuada en el ganado despus de la OAV necesita un tiempo largo.
ii)
Vacunacin de conejos seguida del desafo directo o prueba de proteccin pasiva en el ratn
utilizando los sueros de conejo; o
iii)
Pruebas de potencia en ratn, que es el mtodo ms factible de los tres.
Cada ratn, de un grupo de 50 se vacuna intramuscularmente con 0,2 ml de vacuna, y se repite la dosis
14 das despus. Al da 21, los ratones se dividen en diez grupos de cinco, y a cada grupo se le desafa con
las diluciones respectivas de un cultivo de 6-8 horas en medio lquido de una cepa de campo a niveles de
10-1-10-10; un grupo control de 50 ratones se estimula de forma similar, y se observa a todos los ratones por
5 das. La dosis letal media (LD50) se puede calcular para obtener una indicacin de la dosis suficiente para
proteger el ganado: las vacunas preparadas del modo descrito contienen al menos 104 unidades de
proteccin en los ratones vacunados.
d)
Una dosis simple de vacuna, administrada a terneros jvenes de 4-6 meses de edad, proteger a los
animales susceptibles durante 3-4 meses cuando se usa APV, y durante 6-9 meses cuando se usa OAV.
e)
Estabilidad
La emulsin de OAV debe ser de color blanco puro, y adherirse al vidrio como pintura. Si la emulsin
muestra signos de fragmentacin, debe desecharse. Se puede permitir la separacin de una capa fina de
aceite en la superficie. Se puede guardar durante 6 meses a 4-8C sin prdida notable de potencia. No
debe congelarse. El aumento en la concentracin de lanolina mejora la estabilidad, pero tambin aumenta
la viscosidad lo que es un inconveniente importante. El uso de otros agentes emulsionantes como Arlacel
favorece la produccin de emulsiones ms finas y estables.
589
f)
Mtodo de uso
La vacuna debe administrarse por inyeccin intramuscular profunda. Se recomienda el uso de jeringas de
nylon de 5 ml para dosis de 3 ml y una aguja de calibre 14-15, y la edad recomendada para la
primovacunacin es 4-6 meses. En vacunaciones profilcticas de rutina, se recomienda una dosis simple de
OAV a los 4-6 meses, una de recuerdo 3-6 meses despus, y una revacunacin anual, en adelante. Donde
las prcticas ganaderas impidan el manejo de animales individuales a los tiempos adecuados, se
recomienda la vacunacin de todos los animales mayores de 4 meses de edad, con preferencia antes de la
poca de reproduccin, y la vacunacin 6 meses despus de todos los terneros menores de 1 ao. Ante la
presencia de un brote en los animales vacunados, se aconseja una dosis de APV seguida de una dosis de
OAV.
g)
La liberacin de OAV en el tejido subcutneo puede originar, en ocasiones, ndulos fibrosos en los sitios de
inyeccin. Se pueden desarrollar raramente abscesos si no se observan condiciones de esterilidad, aunque
la mayora de los animales son resistentes a tales infecciones. APV puede producir ocasionalmente
reacciones anafilcticas.
5.
a)
Inocuidad
Ver Seccin C.4.b.
b)
Potencia
Ver Seccin C.4.c.
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serogroup B and E Pasteurella multocida isolates. J. Clin. Microbiol., 30, 15181524.
*
* *
592
CAPTULO 2.3.13.
ENCEFALOPATA ESPONGIFORME BOVINA
RESUMEN
La encefalopata espongiforme bovina (EEB) es una enfermedad neurolgica, mortal, reconocida
por primera vez en 1986 en Inglaterra. Los cambios patolgicos, el modelo epidemiolgico y la
transmisin indican que la EEB es una de las encefalopatas espongiformes causadas por agentes
infecciosos no convencionales o priones. El arquetipo de este grupo de enfermedades es el prurigo
lumbar de las ovejas y las cabras (ver Captulo 2.4.8. Prurigo lumbar).
La epizootia actual de la EEB se puede explicar por la exposicin oral a un agente semejante al del
prurigo lumbar en las protenas derivadas de rumiantes que se incluan en los concentrados
crnicos patentados como comida o en suplementos alimenticios. Los casos iniciales de EEB en
otros pases parecen ser el resultado de exportaciones de ganado infectado de Inglaterra o de
comida con derivados crnicos contaminados, aunque ahora se implican tambin exportaciones de
otros pases. Otros casos iniciales son claramente autctonos, sin una relacin clara con alimentos
crnicos importados, lo que sugiere la existencia de casos previos no detectados. En Julio de 1988
se aplic en Inglaterra la prohibicin de alimentar a los rumiantes con protenas derivadas de
rumiantes. Desde entonces, salvo ciertas excepciones, en toda la Unin Europea y en algunos
otros pases se ha prohibido la alimentacin de los rumiantes con protenas derivadas de
mamferos. Desde Abril de 1996, sta prohibicin respecto a la alimentacin con derivados
crnicos de mamferos se ha extendido en Inglaterra a todos los animales de granja. La decisin
2000/766/EC de la Comisin Europea de diciembre del ao 2000 incluy una prohibicin temporal
de la alimentacin de animales de granja para produccin alimentaria con protenas procesadas de
origen animal. Se ha demostrado la transmisin experimental de la EEB al ganado bovino despus
de la exposicin parenteral y oral a tejido cerebral de ganado bovino afectado. Como consecuencia
de estas medidas de control, la epizootia est ya en descenso en algunos pases europeos, como
Inglaterra y Suiza. En la actualidad se presentan casos de EBE en la mayor parte de Europa, y
tambin se han detectado en Asia y en Norteamrica.
Se sospecha que el agente de la EEB es la fuente comn de encefalopatas espongiformes
transmisibles (EET) en otras especies de bvidos y de flidos. Existe evidencia de una relacin
causal entre el agente de la EEB y una nueva forma variante de EET, la enfermedad de
Creutzfeldt-Jakob (CJD).
En Inglaterra la EEB presenta una mayor incidencia en el ganado bovino de entre 4 y 5 aos. La
duracin clnica es variable pero puede prolongarse durante varios meses. Los sntomas clnicos
observados son lo bastante llamativos como para sospechar la existencia de la enfermedad,
particularmente si se eliminan otros diagnsticos diferentes. Los primeros sntomas clnicos suelen
ser sutiles y pueden llevar a la eliminacin de animales afectados antes de que se dispare la
sospecha de EEB. En pases con una poltica establecida contra la enfermedad, los casos
clnicamente sospechosos deben sacrificarse, analizarse los cerebros y destruirse las
correspondientes canales. La confirmacin del diagnstico se basa fundamentalmente en el
examen inmunohistoqumico del cerebro (IHQ). Solamente se han descrito lesiones en el sistema
nervioso central (SNC). Las recomendaciones sobre precauciones de seguridad en el manejo de
material infectado con EEB consideran que la EEB es una zoonosis adscrita actualmente al nivel 3
de contencin (con derogacin).
Identificacin del agente: En la actualidad no existe ninguna prueba diagnstica para la deteccin
del agente de la EEB en el animal vivo. La naturaleza de los agentes que causan las EET no est
clara. En la patognesis de estas enfermedades presenta una importancia crtica una isoforma de
593
Captulo 2.3.13. Encefalopata espongiforme bovina
una protena de membrana PrP1 (denominada PrPres) que es especfica de la enfermedad y

parcialmente resistente a proteasas, y que segn la hiptesis del prin constituye el nico
componente del agente infeccioso.
Para confirmar el diagnstico de la encefalopata espongiforme, es necesario realizar un examen
histolgico e inmunohistoqumico del cerebro. Con una experiencia clnica y patolgica adecuada,
la correlacin en la EEB entre el diagnstico clnico y el neurohistolgico puede superar el 90%. El
examen histopatolgico tambin puede aportar un diagnstico diferencial en casos en los que no
se detectan lesiones de EEB. La lesin patognomnica es una combinacin de un cambio
espongiforme en la materia gris del cerebro y una vacuolizacin neuronal de algunos ncleos
cerebrales. Normalmente, aunque no siempre, este cambio presenta simetra bilateral. La
deteccin en el SNC del ganado bovino afectado de acumulaciones de PrP anormal (PrPres)
mediante mtodos inmunoqumicos especficos representa una aproximacin al diagnstico
especfico de la enfermedad. En extractos de cerebros no fijados, se puede detectar PrPres por
inmunotransferencia u otros mtodos de inmunoensayo. En cerebros fijados con formalina, se
pueden demostrar las disposiciones caractersticas de las acumulaciones de PrP especficas de la
enfermedad mediante mtodos inmunohistoqumicos. Ambos enfoques se utlizan ampliamente en
la actualidad como mtodos de diagnstico confirmativo y se recomiendan como adicionales al
examen histolgico. No debera establecerse un diagnstico negativo basndose nicamente en la
ausencia de vacuolizacin detectable. Los mtodos IHQ y otros mtodos de deteccin de PrP
pueden proporcionar un diagnstico de EEB en animales que parecen clnicamente normales, con
lesiones espongiformes mnimas en el cerebro (o sin ellas). En los extractos tratados con
detergente de cerebros no fijados (o fijados con formalina) y afectados por EEB, se pueden
visualizar por microscopa electrnica fibrillas caractersticas, que son homlogas a las fibrillas
asociadas con el prurigo lumbar y que estn compuestas por PrPres. Este punto de vista se ha
utilizado tambin para confirmar el diagnstico, pero carece de la sensibilidad de los mtodos
inmunoqumicos estndar.
La EEB se puede transmitir al ratn mediante la inoculacin intracerebral o intraperitoneal de tejido
cerebral de ganado bovino con afeccin terminal o por la alimentacin, pero los perodos de
incubacin, de varios meses, excluyen este bioensayo para una utilizacin de rutina. ste es el
nico mtodo prctico actualmente disponible para detectar la infectividad.
Pruebas serolgicas: En las EETs no se han detectado respuestas inmunes especficas.
Requisitos para las vacunas y los materiales de diagnstico: En la actualidad no existen
productos biolgicos disponibles. En muchos pases se utilizan para el diagnstico de la EEB kits
comerciales.
A. INTRODUCCIN
Se ha descrito previamente un detallado informe en ingles, en francs y en espaol (55), sobre la encefalopata
espongiforme bovina (EEB), su trasmisin experimental (20, 39), su distribucin, epidemiologa, sntomas
clnicos, patologa, diagnstico, prevencin y control. Revisiones ms recientes contienen informacin
actualizada (2, 16, 17, 26, 28, 36, 46, 62, 65, 80, 81, 96). De modo invariable, la EEB es una enfermedad mortal
del ganado bovino, cuyos casos se reconocieron por primera vez en Inglaterra en Noviembre de 1986 (92). La
EEB pertenece al grupo de las enfermedades conocidas como encefalopatas espongiformes transmisibles (EET)
o enfermedades prinicas, tipificadas en las especies animales por el prurigo lumbar de las ovejas. Estas
enfermedades se definen por la acumulacin patolgica de una isoforma anormal, parcialmente resistente a
proteasas, de una protena codificada por el hospedador (PrP), que se designa como PrPres. La acumulacin
tiene lugar principalmente en el sistema nervioso central (SNC), aunque tambin en el tejido linforeticular y en los
tejidos nerviosos perifricos. Los estudios retrospectivos indican que los primeros casos de EEB se presentaron
en Abril de 1985. Los estudios epidemiolgicos iniciales establecieron que la presencia de EEB presentaba la
forma de una fuente epizoonsica comn y extendida, debida a una infeccin transmitida por los alimentos, con
un agente semejante al del prurigo lumbar presente en las harinas producidas de derivados crnicos y utilizadas
en las dietas como suplemento proteico.
Adems de en Inglaterra, en otros pases se ha presentado EEB en ganado bovino importado y/o en ganado
bovino autctono. Probablemente, el origen de tales casos est relacionado directa o indirectamente con la
1
594
PrP: Protena prin.
exportacin de ganado bovino infectado o en alimentos contaminados de pases con presencia de EEB,
incluyendo histricamente a Inglaterra. Parece claro que la infeccin se ha propagado despus dentro de los
pases donde tuvieron lugar los casos (24, 25, 31). En algunos pases, los nicos casos detectados reflejan una
exposicin endgena ms bien que una relacin directa con la importacin de alimento contaminado. Se han
registrado casos de EEB dentro de la poblacin bovina autctona fuera de Inglaterra, en la mayora de los pases
europeos y en algunos otros donde se han establecido sistemas eficaces de seguimiento y control. stos
incluyen Austria, Blgica, Canad, la Repblica Checa, Dinamarca, Finlandia, Francia, Alemania, Grecia, Irlanda,
Israel, Italia, Japn, Liechtenstein, Luxemburgo, Pases Bajos, Polonia, Portugal, Eslovaquia, Eslovenia, Espaa
y Suiza. Para estadsticas actuales sobre la EEB en el mundo, los lectores deben consultar la pgina Web de la
OIE.
A partir de Julio de 1988 en Inglaterra, y de Enero de 1989 en Irlanda del Norte, se prohibi la alimentacin de
rumiantes con protenas derivadas de rumiantes. Con algunas excepciones, la prohibicin de alimentar a los
rumiantes con protenas derivadas de mamferos se ha introducido desde entonces en otras partes: en Suiza en
Diciembre de 1990 (86) y en la Unin Europea en Junio de 1994 (62). En Inglaterra, desde Abril de 1996, esta
prohibicin de la Unin Europea para protenas presentadas en forma de harinas de derivados crnicos, se
extendi a todos los animales de granja, incluyendo caballos y peces. Desde Enero de 2001, la utilizacin de
piensos con derivados crnicos de mamferos y de peces est prohibida en toda la Unin Europea (32).
Se ha demostrado experimentalmente que la EEB puede transmitirse al ganado por va parenteral y oral despus
de la exposicin a tejido cerebral de ganado afectado (20, 90). Estudios epidemiolgicos britnicos han revelado
un mayor riesgo en la descendencia de casos clnicos de EEB para desarrollar la enfermedad (27, 29, 30, 38,
98). No se ha establecido si esto se debe a una verdadera transmisin materna. Se considera que este riesgo no
es la causa del mantenimiento de la infeccin endmica de la poblacin bovina en Inglaterra, y las estimaciones
de este riesgo se han revisado posteriormente a la baja (26). No existe evidencia de transmisin horizontal de
EEB en el ganado bovino. Los estudios epidemiolgicos y de transmisin no han encontrado evidencias de
riesgo en el semen (100), en la leche (58, 84) ni a travs de embriones (100, 101). A consecuencia de las
medidas de control, la epizootia en Inglaterra y Suiza ha descendido (48), y en otras partes muestra los primeros
efectos del control en forma de cambios en la incidencia de la edad especfica (24, 31, 65). En algunos pases no
se han ejercido controles lo suficientemente largos como para reconocer los efectos. La interpretacin del estado
de la epizootia en Europa se ha visto favorecida por la introduccin de un seguimiento activo mediante pruebas
de diagnstico rpido, que han confirmado la infeccin en el ganado con sntomas clnicos y han detectado
tambin animales infectados que no se haban reconocido por no haber llegado al punto de la manifestacin
clnica. La investigacin retrospectiva en las granjas de origen de la enfermedad confirma, con frecuencia, que se
presentan algunos sntomas previos al sacrificio, pero no han despertado la consideracin suficiente como para
establecer sobre ellos un diagnstico de la EEB.
Durante el transcurso de la epizootia de EEB se ha sospechado la existencia de EETs en varias especies de
bvidos y felinos exticos mantenidos en cautividad y en gatos domsticos y, en algunos casos, se sabe que
estn causadas por el agente de la EEB o un agente que es indistinguible de dicho agente por los mtodos
actualmente disponibles. Se supone que la exposicin tuvo lugar por va alimentaria.
Los estudios epidemiolgicos llevados a cabo en el pasado, no han encontrado relacin entre la exposicin del
hombre a los agentes causales de las encefalopatas espongiformes en animales y la existencia de la EET
humana es decir, la enfermedad de Creutzfeldt-Jakob (CJD). En particular, no se ha establecido un mayor
riesgo ocupacional o diettico por exposicin a productos ovinos, lo que sugiere que los agentes del prurigo
lumbar no representan un peligro para la salud humana bajo condiciones de exposicin naturales. Sin embargo,
el estudio de casos de CJD en Inglaterra dio lugar en Marzo de 1996 al anuncio del reconocimiento de diez
casos de una variante aparentemente nueva de CJD espordica (v-CJD) en dicho pas (99). La identificacin de
la cepa del agente causal de v-CJD en ratones (11, 76) proporcion evidencia clara de que en v-CJD se
encuentra tambin la misma cepa del agente derivado de la EEB. Esta conclusin est tambin apoyada por
estudios que muestran similitudes entre los modelos de las bandas de inmunotransferencia y de glicoprotenas
de la isoforma de PrPres relacionada con la enfermedad en pacientes con v-CJD y los de algunas especies de
animales con EEB adquirida natural o experimentalmente (18, 49). Por tanto, teniendo en cuenta la evidencia
actual, la explicacin ms probable de los casos de v-CJD es que se deben a la exposicin al agente de la EEB,
aunque no puede excluirse la participacin de un agente indistinguible de la EEB por los mtodos actuales. La
incidencia actual de la enfermedad debe ser considerada con cautela. Por consiguiente, se recomienda ahora
tomar precauciones para el manejo del agente de la EBE basadas en la suposicin de que la EBE es
transmisible a los humanos. Debido a que se desconoce el perodo de incubacin de v-CJD, es demasiado
prematuro predecir el desarrollo de la epidemia. Los intentos en este sentido han originado predicciones muy
variables, aunque, como los casos continan apareciendo, los lmites de seguridad se van estrechando (19, 37,
41-43, 51, 59).
Se ha observado EEB clnica en ganado bovino adulto, y en general se presenta en animales de 4-5 aos. No
existen razas predilectas, pero la incidencia en las explotaciones segn el tipo de aptitud indica que sta es mas
alta en las vacas de leche que en las de carne, y en Inglaterra los terneros procedentes de explotaciones de
produccin lctea fueron los alimentados principalmente con raciones concentradas que contenan pienso con
595
harinas de derivados crnicos. La aparicin de sntomas clnicos no es estacional ni se asocia con una fase
determinada del ciclo reproductor.
La EEB presenta unos comienzos que pasan desapercibidos y, por lo general, un curso progresivo lento (9, 55,
92, 97). En ocasiones, se presenta un caso con sntomas agudos y con un rpido deterioro (97), aunque la
frecuencia de las observaciones es un factor importante a la hora de determinar si se pierden los sntomas
iniciales. Los sntomas, aunque variables, incluyen por lo general cambios de comportamiento, aprehensin e
hiperactividad. Por ejemplo, las vacas afectadas pueden resistirse a entrar a las salas de ordeo o patean
vigorosamente durante el ordeo. La falta de coordinacin en las patas traseras y la debilidad pueden ser las
primeras caractersticas observadas, especialmente en vacas de aptitud no lctea. En el transcurso del periodo
clnico predominan los sntomas neurolgicos y pueden incluir muchos aspectos de un estado mental y de
comportamiento alterado, anormalidades posturales y de movimiento, y una sensacin anormal, aunque los
sntomas nerviosos ms comunes son aprehensin, ataxia de las patas posteriores e hiperestesia al contacto y a
los sonidos. El intenso prurito que es caracterstico de algunas ovejas con prurigo lumbar no es destacable en el
ganado bovino con EEB, aunque en algunos casos manifiestan tendencia a rozarse y rascarse. A veces los
animales afectados se mantienen con la cabeza baja, el cuello extendido y las orejas dirigidas hacia atrs. La
anormalidad en el andar incluye agitacin de los cuartos traseros y extensin de las patas; estas caractersticas
se aprecian mejor cuando el ganado est pastando. La ataxia tambin pueden implicar a las patas delanteras y,
a medida que avanza la gravedad de los sntomas motores, el cuadro clnico est dominado por una debilidad
generalizada que ocasiona cadas y postracin. Aunque no son sntomas especficos, la rumia reducida (3, 5), la
braquicardia y las alteraciones del ritmo cardaco (4) sugieren que las perturbaciones autnomas constituyen una
caracterstica de la EEB. A medida que la enfermedad progresa, los sntomas nerviosos se acompaan de
manifestaciones clnicas generales, como prdida del aspecto normal, reduccin del peso corporal y disminucin
de la produccin lctea. No ha habido cambios en la descripcin clnica de la EEB a lo largo de la epizootia en
Inglaterra (95). Los sntomas clnicos en otros pases donde se ha presentado EEB son esencialmente similares
(9). El desarrollo clnico, que se extiende por lo general a un perodo de semanas o meses, requiere
eventualmente el sacrificio por consideraciones sociales. Una poltica establecida para determinar el estado de
un pas en cuanto a EEB exige la declaracin obligatoria y la investigacin diagnstica de casos clnicamente
sospechosos, su sacrificio y la destruccin completa de las canales del ganado afectado (63). Al principio de la
enfermedad los sntomas pueden ser sutiles, variables e inespecficos, y pueden enmascarar el diagnstico
clnico en un examen inicial. La observacin continuada de esos casos equvocos, junto a procedimientos
adecuados de patologa clnica para eliminar diagnsticos diferenciales, en especial desrdenes metablicos,
permitirn establecer la progresin de los sntomas esenciales. Algunos sntomas tempranos de la EEB son
similares a manifestaciones de la cetosis nerviosa, falta de magnesio, listeriosis enceflicas y otras encefalitis.
Los sntomas clnicos desapercibidos a veces se manifiestan aumentados en condiciones de estrs, como el
causado por el transporte.
Debido a la relacin establecida entre la EEB y la v-CJD, los agentes de la EEB y de las EET relacionadas se
consideran en la actualidad vinculados a la EET humana (1). En consecuencia, los veterinarios y el personal de
laboratorio que realiza necropsias de animales sospechosos de EEB o que maneja tejidos derivados de tales
animales debe llevar a cabo el trabajo en el nivel de contencin 3 (ver Captulo I.1.6), a veces con limitaciones.
No existen evidencias de que el patgeno se transmita por el aire. Por tanto no se requiere que el aire del
laboratorio se filtre a travs de filtros HEPA. Adems los agentes de las EET no se inactivan con fumigantes
convencionales, por lo que no hay necesidad de que las instalaciones se sellen para permitir la fumigacin. Estas
limitaciones se contienen en cdigos de conducta emitidos por el Comit Asesor sobre Patgenos Peligrosos
(ACDP) bajo los auspicios del Departamento Ejecutivo de Salud y Seguridad del Reino Unido, en apoyo de la
legislacin britnica y europea para proteger a los individuos en su puesto de trabajo. Siempre deben
determinarse los riesgos locales para tener en consideracin la naturaleza del trabajo. Es importante vestir ropa
adecuada y seguir estrictamente el cdigo de conducta para evitar la exposicin al agente. Los laboratorios que
trabajan sobre EEB deben cumplir con la normativa nacional sobre biocontencin y bioseguridad. Los
procedimientos recomendados para descontaminacin pueden no ser completamente efectivos cuando se trata
con material de un ttulo alto o cuando el agente se protege en el interior de materia orgnica seca. La
inactivacin fsica que se recomienda es un tratamiento en autoclave a 134C-138C durante 18 minutos a una
presin de 18 libras por pulgada cuadrada. Sin embargo, la temperatura no es siempre totalmente eficaz y la
inactivacin completa puede no alcanzarse en determinadas condiciones, como cuando el material problema se
presenta en forma de macerado (82). La desinfeccin se lleva a cabo con hipoclorito sdico que contenga un 2%
de cloro libre, o con hidrxido sdico 2 N, aplicado durante ms de 1 hora en el caso de superficies o durante
toda la noche en el caso de equipos (83).
1.
La naturaleza de los agentes que causan las EETs en animales o en el hombre no est clara (71). La nica
macromolcula especfica de la enfermedad identificada en enfermedades de tipo prurigo lumbar es la forma
modificada (PrPres) de una protena de membrana codificada por el hospedador (PrPC), que est altamente
596
conservada y es de funcin desconocida. Con frecuencia PrPres se denomina tambin PrPSc y PrPD en el prurigo
lumbar y PrPbse en la EEB. Una importante tendencia cientfica sostiene que el agente se compone solamente de
la isoforma PrP especfica de la enfermedad y que la forma alterada es capaz de inducir la conversin de la
forma normal: esta interpretacin representa la hiptesis del prin o de solo protena. La tendencia opuesta
mantiene que el agente es un virus o partcula similar, y que contiene cido nucleico. La identificacin de varias
cepas o aislamientos de agentes del prurigo lumbar, con perodos de incubacin y modelos de cambios
neuropatolgicos caractersticos cuando se transmiten a ratones, se considera que apoya la ltima hiptesis.
Estudios previos para determinar la resistencia del agente a la degradacin se han interpretado como una
indicacin de que los agentes de las EETs no contienen cidos nucleicos. Sin embargo, un anlisis crtico de las
caractersticas de la desnaturalizacin de los agentes de EETs, incluyendo los efectos de radiaciones ultravioleta
e ionizantes, de temperaturas extremas, del autoclave y de un amplio espectro de desinfectantes qumicos,
sugiere que los datos obtenidos son compatibles con los esperados para virus muy pequeos (15). Las bases
moleculares para la variacin de cepas son todava confusas, aunque quienes apoyan la hiptesis del prin
sostienen que sta no es incompatible con la existencia de diversas cepas (66).
La caracterizacin de los aislamientos mediante transmisin de EEB a ratones ha indicado que la EEB est
causada por una nica cepa mayoritaria del agente que difiere de las caracterizadas para el agente del prurigo
lumbar en las ovejas (10). La uniformidad de la patologa entre el ganado bovino afectado apoya tambin la
nocin de una cepa nica de EEB y facilita la definicin de un fenotipo particular de la enfermedad en el caso de
la EEB (91). Este modelo especfico de neuropatologa en la especie hospedadora es una caracterstica
importante para definir un caso de EEB. Sin embargo, resulta difcil excluir totalmente la posibilidad de que
puedan existir otras cepas del agente con baja frecuencia. A falta de mtodos in-vitro para el aislamiento del
agente causal, la confirmacin convencional del diagnstico de este grupo de enfermedades ha sido la
demostracin de las caractersticas morfolgicas de la encefalopata espongiforme por examen histopatolgico.
ste sigue siendo, por definicin, el nico mtodo por el que se puede diagnosticar esta patologa vacuolar
caracterstica. Sin embargo, dado el papel esencial de la molcula PrPres y el aumento en las posibilidades
tcnicas en ste rea, es importante en la actualidad que los enfoques diagnsticos utilicen uno o ms mtodos
para detectar la forma anormal de la protena. La demostracin por microscopa electrnica de fibrillas
caractersticas en extractos del SNC, denominadas fibrillas asociadas a prurigo lumbar (SAF), que estn
fundamentalmente compuestas de PrPres, es otro mtodo morfolgico de diagnstico. Los mtodos de deteccin
de la PrP especfica de la enfermedad incluyen la demostracin inmunohistoqumica (IHC), inmunotransferencia
de SAF y, ms recientemente, una serie de inmunoensayos rpidos para anlisis. El uso de cada mtodo
particular depende del propsito del diagnstico aplicado en el contexto epidemiolgico y de su validacin a
dichos efectos. Estos propsitos varan desde la confirmacin del diagnstico clnico en el control de la
enfermedad epizotica al anlisis de poblaciones sanas para evidenciar la enfermedad encubierta o preclnica.
La definicin adoptada del caso patolgico tambin variar en funcin del mtodo aplicado para la confirmacin
de un caso o para el muestreo de una poblacin. En la primera situacin es importante utilizar enfoques que
permitan verificar el fenotipo patolgico de la EEB. Parece tambin claro que un aspecto crtico en este proceso
de seleccin de un mtodo nico o de un enfoque plural es la realizacin de mtodos individuales. Debe
destacarse que el desarrollo de mtodos es un campo en rpida evolucin, particularmente en lo que se refiere a
los ensayos rpidos de inmunoanlisis para la deteccin de PrPres. Debe tenerse cuidado con la interpretacin
de los datos utilizando metodologas que no resistan una referencia cruzada con los estndares definidos aqu.
Esto es particularmente importante respecto a la definicin de cepa. Sin una comparacin apropiada con criterios
previamente publicados, las diferencias metodolgicas pueden generar diferencias en los resultados que no
justifican notificar la identificacin de una nueva cepa. Los anuncios precipitados sobre deteccin de nuevas
cepas pueden tener repercusiones serias, y por otra parte la identificacin razonada es importante a efectos
estratgicos y de control.
El control de calidad (CC) y la calidad de la determinacin (CD) deben ser una parte esencial de los
procedimientos de las pruebas. Para obtener asistencia en esta rea y favorecer comparaciones entre
laboratorios a nivel internacional se puede contactar con los laboratorios de referencia de la OIE.
a)
Para la preparacin del material sujeto a examen diagnstico se sacrifica el ganado sospechoso de
enfermedad con una inyeccin intravenosa de una solucin concentrada de barbiturato, despus de sedarlo
si es necesario. Se ha descrito el procedimiento tcnico relativo a la recogida, la fijacin y el tratamiento
histolgico (8, 73), y se revisa a continuacin de forma resumida.
En un pas donde no se haya descrito la presencia de EEB, o sta es de baja incidencia, en todos los casos
de control de la enfermedad neurolgica del ganado bovino adulto es importante adoptar un enfoque
neuropatolgico estndar en el que se examinen reas representativas de todo el cerebro. El alejamiento
de esta norma depende de circunstancias nacionales locales, que incluyen si es o no necesario realizar un
diagnstico diferencial. Adems, cuando se seleccionan inmunoensayos rpidos como mtodo inicial de
eleccin, debe tenerse cuidado de que el muestreo y la preparacin de los tejidos para una prueba no
comprometa la capacidad para confirmar el fenotipo patolgico por mtodos histopatolgicos.
597
El tejido cerebral debe extraerse lo ms rpidamente posible despus de la muerte del animal. Para su uso
potencial en pruebas de deteccin de la PrP especfica de la enfermedad, el material fresco debe tomarse
como una seccin transversal completa de la mdula (2-4 g), en torno al extremo caudal del cuarto
ventrculo (llamado obex), evitando especficamente daar la regin del obex. La mdula espinal cervical y
el hemisferio lateral del cerebelo tambin ofrecen reas ptimas de muestreo que no deben infiltrarse en las
necesidades histopatolgicas. Este tejido se congela antes de la prueba; deben tomarse precauciones para
asegurar que los tejidos para examen histolgico o IHC no se congelen, pues esto provoca lesiones falsas
que pueden interferir con la identificacin de la vacuolizacin, y/o la localizacin del lugar seleccionado. Es
posible (pero no deseable) realizar inmunohistoqumica para PrP con material que se ha congelado antes
de la fijacin (21). Sin embargo, es importante estar seguro de que se han identificado y comprobado los
sitios adecuados antes de considerar un resultado negativo. Si se muestrea el resto del tejido cerebral para
examen histopatolgico, debe colocarse en aproximadamente 4-6 litros de solucin salina fijadora con 10%
de formol, que debe cambiarse dos veces a la semana. Despus de una fijacin de 2 semanas, el cerebro
se corta en secciones transversales. El tiempo de fijacin puede reducirse cortando en fresco el tallo
cerebral en porciones transversales ms pequeas, dejando intactas las reas que son importantes para el
diagnstico, como el obex, los pednculos cerebelares y los culcolos rostrales. El tiempo de fijacin de
estas piezas pequeas del tallo cerebral se puede reducir a 2-5 das dependiendo de otros factores
(temperatura, agitacin, uso de microondas). Despus de completar las 2 semanas estndar de fijacin, las
otras partes del cerebro fijadas con formol pueden utilizarse para un diagnstico diferencial. En principio,
debera seleccionarse una nica pieza cortada por el obex de la mdula oblonga (Fig. 1) para su
tratamiento histolgico por mtodos convencionales de inclusin en parafina para tejido nervioso. Las
secciones, en cortes de 5 m de grosor, se examinan para el caracterstico cambio espongiforme y para
vacuolizacin neuronal. Si los resultados no son claros debido a lesiones mnimas, o cuando resultan de
difcil interpretacin histolgica por autolisis o dao del material, o si no estn presentes lesiones
histolgicas, es necesario llevar a cabo pruebas adicionales del tipo de IHC o inmunotransferencia.
Cuando en un pas en particular se detecta la presencia de EEB en la poblacin de ganado bovino
autctono, con evidencias de que la distribucin de las lesiones coincide con la de los cerebros del ganado
en la epizootia de Inglaterra, es adecuado extraer tan solo el cerebro posterior a efectos de control (Fig. 1).
Esto se puede realizar por el agujero occipital sin la extraccin del calvario. Este procedimiento reduce la
cantidad de fijador utilizado, disminuyendo costes y aumentando la seguridad, pero manteniendo una
representacin de las principales reas que son objeto del examen histolgico. El diagnstico puede
confirmarse si se presentan los cambios tpicos en la mdula a nivel del obex. Cuando las lesiones no
resultan aparentes en la mdula (obex), se debe realizar inmunohistoqumica. Sin embargo, dado el modelo
constante de lesin, es poco probable que esto contribuya a una confirmacin adicional en ms del 0,5% de
los casos de EEB con lesiones ausentes en la seccin de la mdula (obex) (88). Obviamente, este
protocolo abreviado no permite establecer un anlisis neuropatolgico completo para un diagnstico
diferencial, ni representa una caracterizacin fenotpica completa de ninguna EET.
Fig. 1. Tallo cerebral despus de retirar el cerebelo, a) vista dorsal, y b) vista lateral.
Niveles recomendados para tomar las secciones:
AA = mdula en el obex; BB = mdula a travs de los pednculos cerebelares caudales;
CC = cerebro medio a travs de los culculos rostrales.
598
En zonas donde se identifica el ndice de casos por vigilancia activa, puede carecerse de las reas del
cerebro necesarias para una caracterizacin fenotpica completa. En la mayora de los pases, solo se
recoge el cerebro posterior (ver ms adelante), incluso antes de la primera confirmacin de EEB. En teora,
se deben recoger cabezas muestreadas en el transcurso de la vigilancia activa hasta disponer de las
primeras pruebas. Esto facilita un muestreo amplio de cerebros de animales positivos y permite el enfoque
recomendado para la caracterizacin de los casos. Tal hecho es particularmente importante si se utilizan
pruebas que no estn validadas y cuando se reivindica la identificacin de nuevas cepas en ausencia de
comparaciones con los mtodos aqu descritos.
El procesamiento del tejido cerebral para utilizacin en la prueba rpida debe realizarse exactamente como
indica el fabricante del kit o el mtodo de la prueba. Los detalles del proceso varan de mtodo a mtodo y
no deben cambiarse sin datos de validacin que apoyen la variacin metodolgica. La muestra preferida
para el inmunoensayo es el obex o una zona situada 1,5 cm por delante. La eleccin debe tener en cuenta
el mejor mtodo de confirmacin, pues la incapacidad para examinar histolgicamente el tallo cerebral por
el obex puede ocultar la deteccin bilateral de la vacuolizacin. El muestreo de la mdula rostral para la
prueba rpida no compromete el examen por medios histolgicos o inmunohistoqumicos. La semiseccin
del tallo cerebral a nivel del obex impide determinar la simetra de las lesiones, pero tal necesidad es menor
si se emplea inmunohistoqumica. Sin embargo, si se adopta este enfoque, resulta crtico asegurarse de
que el sitio elegido no est daado. Tanto el ncleo dorsal del nervio vago (el rea objetivo del prurigo
lumbar) como el ncleo del tracto solitario (el rea objetivo en el ganado bovino) son pequeos y se sitan
cerca del eje (Fig. 2).
Figura 2. Seccin transversal a nivel del obex para identificar los sitios clave
para el diagnstico por histopatologa e inmunohostoqumica en la EEB (ncleo del tracto solitario [1] y
ncleo del tracto V del trigmino [2]) y en el prurigo lumbar (ncleo dorsal del vago [3]).
Una semiseccin no apropiada puede ocasionar fcilmente la prdida completa del rea objetivo en la
prueba confirmativa y reducir por tanto la eficacia del programa de vigilancia. Tal enfoque requiere el apoyo
en una poltica clara y un programa de control de formacin y procedimientos de muestreo. Debido a la
distribucin irregular de PrPres, el tamao de la muestra debe ser el especificado en el kit de diagnstico, y
si no est especificado debe ser al menos de 0,5 g. La realizacin de todas las pruebas puede estar
influenciada por cambios autolticos. Para reducir el peligro de los operadores que recogen un gran nmero
de muestras durante un programa de vigilancia activa, los cerebros deben ser muestreados sin abrir el
crneo. Esto es llevado a cabo fcilmente, incluso en los mataderos, entrenando a los operarios a utilizar
una cuchara especialmente diseada que se puede insertar en el agujero occipital de la cabeza cortada. A
continuacin se describe un protocolo elaborado por el Laboratorio de Referencia de la OIE en Berna,
Suiza. Algunos fabricantes de pruebas rpidas tambin venden cucharas desechables para extraer el
cerebro.
Obtencin del tallo cerebral o mdula

Una vez que se ha separado la cabeza del cuerpo entre el atlas y el agujero occipital, se coloca en un
soporte con el hueso frontal hacia abajo; el extremo caudal de la mdula es as visible por el agujero
599
occipital. Se disecciona la mdula a travs del agujero occipital, sin abrir el crneo, por medio de una
cuchara especialmente diseada, de bordes afilados y mango largo (Fig. 3). Se inserta la cuchara en el
agujero occipital, entre la mdula espinal y el hueso, y se va pasando a lo largo de la pared sea,
movindola lateralmente para ir seccionando los nervios craneales a ambos lados, al tiempo que se evita
deteriorar el tejido cerebral por dejar el instrumento pegado al hueso. La cuchara avanza de este modo
hasta una distancia de aproximadamente 7 cm y a continuacin se inclina hacia abajo, seccionando y
separando la mdula oblonga caudal (con algunos fragmentos de cerebelo) del resto del cerebro. El
operario atrae luego hacia s la cuchara, mantenindola en posicin inclinada hacia abajo. De esta manera,
la mdula espinal seccionada se desliza fuera del crneo pasando por el agujero occcipital.
Fig. 3. La cabeza se separa del cuerpo y se coloca del revs en un soporte; la mdula espinal (bs) se separa del
hueso dando cortes laterales (flechas curvas) mediante una cuchara especialmente diseada de bordes afilados y
mango largo que se inserta en el agujero occipital entre el hueso y el tejido cerebral. La muestra preferida para
inmunoensayo es el obex o una zona 1,5 cm anterior al obex.
b)
Examen histolgico
La definicin inicial de un caso patolgico de EEB se basa en los cambios histopatolgicos en el SNC y
esto ha supuesto la confirmacin normal del diagnstico clnico de la EEB (88, 92). El examen
histopatolgico tambin permite verificar el fenotipo neuropatolgico caracterstico de la EEB (78, 94). Los
cambios histopatolgicos son neurodegenerativos y muy similares a los del prurigo lumbar en las ovejas.
Las propiedades ms destacables son una vacuolizacin que supone un cambio espongiforme en la
materia gris de reas neuroanatmicas especficas, y la presencia vacuolas nicas o mltiples dentro de la
zona perinuclear de las neuronas. La apariencia exacta del cambio espongiforme en las EETs observable
por microscopa ptica se ha definido con anterioridad (56). En la EEB, el cambio espongiforme es la forma
predominante del cambio vacuolar. Ambas formas de vacuolizacin se distribuyen bilateralmente y
normalmente de modo simtrico, con un aspecto repetitivo de gravedad en lo que respecta a su distribucin
por el cerebro (89, 94). En la epizootia de EEB en Inglaterra, la elevada frecuencia de vacuolizacin en el
parnquima neuronal de algunos ncleos anatmicos de la mdula oblonga a nivel del obex supuso un
medio adecuado para establecer un diagnstico con una nica seccin de la mdula (88). Sin embargo, la
observacin de lesiones medulares equvocas a este nivel hace necesario el examen de otras reas
cerebrales para detectar casos de EEB con lesiones mnimas o potencialmente atpicas y para, cuando sea
necesario, establecer diagnsticos diferenciales. En la EEB no hay alteraciones neurodegenerativas
destacables distintas a la vacuolizacin. Como en el prurigo lumbar, otra caracterstica es una gliosis
(astrocitosis), particularmente en las zonas de vacuolizacin. La deteccin de gliosis puede verificarse
mediante el uso de colorantes especiales y por inmunohistoqumica. Por ejemplo, la astrocitosis puede
demostrarse detectando el aumento de protena cida fibrilar de la gla (GFAP).
600
La interpretacin de los cambios vacuolares observados en el cerebro bovino debe hacerse con precaucin.
En las neuronas del ncleo rojo y oculomotor del cerebro medio del ganado bovino se han descrito, de
modo ocasional, vacuolas perinucleares que son indistinguibles de las presentes en la EEB (34, 40, 57, 92).
Por tanto, como ocurre en el prurigo lumbar, donde el diagnstico se puede equivocar por la presencia de
vacuolizacin neuronal dispersada por la mdula de ovejas sanas (ver Captulo 2. 4. 8. Prurigo lumbar (86,
87), el diagnstico histopatolgico de la EEB no debe establecerse por la aparicin de neuronas vacuoladas
aisladas. Incluso la presencia de neuronas vacuoladas relativamente numerosas en el ncleo rojo y en los
ncleos habenulares deben ignorarse. La mayor seguridad para reducir los diagnsticos falsos positivos
reside en determinar la presencia del cambio espongiforme en localizaciones neuroanatmicas especficas.
Como en el prurigo lumbar de las ovejas, existe la posibilidad de que ocurran casos de EEB donde las
lesiones cerebrales sean mnimas o indetectables por microscopa. Este problema potencial solo puede
resolverse por criterios diagnsticos que sean independientes de la histopatologa (73, 93). (Ver tambin la
siguiente seccin)
c)
Deteccin de formas de PrP especficas de la enfermedad

Durante los ltimos aos, en muchos pases el examen histopatolgico limitado a la mdula oblonga ha
sido el mtodo de investigacin utilizado en el laboratorio para procesar un gran nmero de casos
sospechosos. La demostracin de cambios tpicos proporciona un diagnstico definitivo. En la actualidad
muchos laboratorios han mejorado o reemplazado el examen histopatolgico con IHC y otros mtodos para
la deteccin de PrP. Cuando los resultados del anlisis histopatolgico son confusos o negativos, o cuando
las muestras de cerebro son inadecuadas para un examen histolgico debido a autolisis o daos, la
deteccin de la acumulacin de PrP anormal constituye el mtodo de eleccin. La aplicacin de estas
pruebas para PrP est en aumento en la fase descendente de la epizootia y en programas de vigilancia que
requieren un control crtico de la enfermedad.
La utilizacin de IHC para detectar la acumulacin de PrPres en material fijado con formalina e incluido en
parafina es un mtodo para emplear junto a la evaluacin histopatolgica de las secciones de la mdula o
incluso como una alternativa a tal procedimiento (47, 94). Se han aplicado con xito varios protocolos para
la deteccin de PrPres por IHC como diagnstico de la EEB (44, 47, 54, 94). Es conveniente una
armonizacin para conseguir un mtodo de diagnstico rutinario por IHC que est completamente validado
y estandarizado. Sin embargo, es probable que solo se puedan emitir los principios generales, y que los
mtodos exactos se determinen a nivel de cada laboratorio individual. Una colaboracin establecida por la
Comisin Europea entre laboratorios europeos consider la necesidad de homogenizar los mtodos de
diagnstico y concluy que una estandarizacin total de los mtodos era difcil y probablemente
innecesaria. Las condiciones locales siempre imponen un cierto grado de variacin entre los laboratorios, y
cada mtodo debe optimizarse para su utilizacin con los tejidos estndar y los reactivos comunes (como el
agua) que se emplean localmente. Histricamente, tambin ha habido una dependencia casera de
anticuerpos policlonales, pero el aumento de anticuerpos monoclonales disponibles comercialmente ha
reducido significativamente esta variacin. Es mucho ms importante lograr un procedimiento
estandarizado, controlado por el ejercicio de anlisis de calidad y por la comparacin con resultados de un
mtodo modelo estandarizado.
La tcnica es ms sensible que la tcnica histopatolgica normal y puede detectar casos en los ltimos
meses de la incubacin antes de la aparicin de los cambios vacuolares, al menos en casos de EEB
inducida experimentalmente (62) y posiblemente tambin en la infeccin natural (23). Por tanto la EEB
puede diagnosticarse mediante IHC en animales con cambios morfolgicos poco claros o inexistentes. La
tcnica no necesita perodos largos de fijacin de los tejidos, aunque para mayor exactitud debe seguir las
normas establecidas en histopatologa, y funciona bien en tejidos autolisados en los que no es posible la
evaluacin morfolgica siempre que el tejido se procese histolgicamente de un modo adecuado. La
deteccin de la acumulacin de PrP anormal por IHC es tan sensible como el mtodo de
inmunotransferencia para la deteccin de PrPres (69). En combinacin con buenas preparaciones
histolgicas, la IHC permite detectar las acumulaciones de PrP anormal. Como estas acumulaciones, de
modo similar a que ocurre con la patologa vacuolar, presentan un modelo tpico de distribucin y
apariencia, su deteccin supone una prueba simultnea o confirmativa del fenotipo de la enfermedad.
Los laboratorios sin una experiencia inmunohistoqumica previa pueden desear adoptar el mtodo modelo
que se describe a continuacin. Como para otras tcnicas descritas en este texto, las indicaciones
resultarn por s mismas insuficientes para permitir su inmediata reproduccin en el laboratorio. Sin
embargo, mediante consultas con los autores y el seguimiento de las modificaciones especficas que sean
necesarias para justificar las variaciones en las calidades o concentraciones de los reactivos, puede
utilizarse para comparacin con mtodos preferidos a nivel local. El mtodo descrito ms adelante es el
utilizado en el diagnstico de la EEB por el Laboratorio de Referencia de la OIE en Inglaterra, y para la
preparacin de materiales de referencia en otros laboratorios.
601
Marcaje inmunohistoqumico de PrP especfica de la enfermedad
Reactivos
Guardar las preparaciones comerciales segn indican las instrucciones del fabricante.
Solucin salina tamponada con Tris que contiene 0,5% de Tween 20, pH 7,6 (TBST)
cido frmico (96%)
Solucin de tampn citrato (0,2%), pH 6,4
Perxido de hidrgeno (30% p/v) (Sigma)
Metanol
Kit de Vectastain Elite RAT con el complejo de IgG avidina-biotina (ABC), de Vector Labs
Solucin de sulfato de cobre (0,5%)
Di-amino-benzidina (DAB) (Sigma)
Hematoxilina de Mayer
HCl conc. al 0,5% en etanol absoluto
Etanol absoluto
Xileno
Amoniaco en agua
Anticuerpo primario (anticuerpo monoclonal R145 de rata contra PrP bovina, disponible en la Agencia para
Laboratorios Veterinarios de Weybridge, Inglaterra)
Tejidos
Tejidos fijados con formalina de un grosor mximo de 3 mm. Sumergir en 96% de cido frmico durante
1 hora. Lavar en agua corriente durante 10 minutos. Sumergir en formalina neutra tamponada durante
1 hora y procesar por el mtodo usual para inclusin en parafina.
Mtodo
Despus de la preparacin de los bloques de inclusin en parafina (siguiendo los mtodos rutinarios), cortar
en secciones finas de 3 m de grosor y montar en portas recubiertos de polisina o similares. Secar al aire y
colocar en una estufa a 60C durante toda la noche.
602
i)
Eliminar la parafina de los cortes en xileno durante 10 minutos.
ii)
Lavar dos veces en etanol absoluto durante 30 segundos (agitar).
iii)
Lavar en agua corriente del grifo durante 10 minutos.
iv)
Sumergir en cido frmico al 96% durante 5 minutos. (El tratamiento con cido frmico se emplea
para la recuperacin preliminar de antgeno, y tambin para mantener una buena morfologa tisular
durante el posterior pase por autoclave, a la vez que aumenta la seguridad del operario reduciendo
los niveles de infectividad en el tejido manejado).
v)
Lavar en agua corriente del grifo durante 10 minutos.
vi)
Sumergir en solucin de tampn citrato en un recipiente de plstico abierto y autoclavar durante

5 minutos a 121C.
vii)
Enfriar 10 minutos a temperatura ambiente y luego lavar en agua corriente del grifo durante
10 minutos.
viii)
Sumergir en perxido de hidrgeno al 3% en metanol durante 20 minutos.
ix)
Lavar en agua corriente durante 10 minutos.
x)
Secar los cortes y aislarlos con un marcador.
xi)
A partir de ahora los cortes no se deben dejar secar.
xii)
Lavar dos veces los cortes con TBST.
xiii)
Aadir el suero normal de conejo (NRS)* durante 60 minutos a temperatura ambiente (* Diluir el
NRS siguiendo las instrucciones del fabricante).
xiv)
Eliminar el NRS y aplicar el anticuerpo primario (anticuerpo monoclonal R145 de rata contra PrP
bovina a dilucin 1/3.000) durante 16-18 horas a temperatura ambiente.
xv)
Lavar los cortes dos veces con TBST durante 2-3 minutos cada vez.
xvi)
Aplicar el anticuerpo secundario* (Ig de conejo anti-rata) durante 60 minutos a temperatura

ambiente (*Diluir el anticuerpo secundario siguiendo las instrucciones del fabricante).
xvii)
Preparar el complejo avidina-biotina (ABC) siguiendo las instrucciones del fabricante y dejar a
temperatura ambiente durante 30 minutos antes de usar.
xviii)
Lavar los cortes dos veces con TBST durante 3 minutos cada vez.
xix)
Aplicar el ABC durante 30 minutos a temperatura ambiente.
xx)
Lavar los cortes dos veces con TBST durante 3 minutos cada vez.
xxi)
Aplicar DAB durante 10 minutos.
xxii)
Lavar dos veces con agua de grifo durante 2 minutos cada vez.
xxiii)
Sumergir en sulfato de cobre acuoso al 0,5% durante 5 minutos.
xxiv)
Lavar con agua de grifo durante 1 minuto.
xxv)
Sumergir los cortes en hematoxilina de Mayer durante 5 minutos.
xxvi)
Lavar con agua de grifo hasta que el agua de lavado corra clara.
xxvii)
Diferenciar con alcohol cido al 1% (1% de HCl en etanol) durante 2-3 segundos.
xxviii)
Lavar los cortes con agua de grifo durante 1 minuto.
xxix)
Sumergir en agua alcalinizada con amonaco para convertir en azul la coloracin marrn de
contraste de la hematoxilina. Se puede obtener el mismo efecto lavando en agua corriente durante
5 minutos o mediante inmersin en 0,05% de carbonato de litio.
xxx)
Sumergir dos veces los cortes en etanol absoluto durante 30 segundos cada vez.
xxxi)
Aclarar los cortes con xileno durante 2-5 minutos.
xxxii)
Colocar los cubres y dejar secar.
Se considera que las acumulaciones de PrP anormal detectadas por IHC constituyen potencialmente un
diagnstico preclnico del prurigo lumbar en las ovejas (en algunos genotipos, pero no en todos) utilizando
biopsias de tejidos linfoides de las amgdalas (72) o de la membrana nictitante (64). Sin embargo, mediante
bioensayos con ratn o por IHC, no se ha logrado detectar la infectividad de la EEB en los tejidos linfticos
durante el perodo de incubacin o en el transcurso de la enfermedad clnica en ganado bovino infectado
experimentalmente (90), excepto en el leon distal que contiene las placas de Peyer. Esto sugiere que tales
tejidos no son adecuados en la actualidad para utilizarlos en diagnstico. Un resultado no publicado sobre
la deteccin de infectividad en las amgdalas de un animal infectado experimentalmente a los 10 meses de
la exposicin oral, permanece incompleto. El hallazgo contrasta con los resultados negativos de las
amgdalas recogidas en dicho estudio antes y despus de ese tiempo, y no supone un avance importante
en las posibilidades de las pruebas en ganado in-vivo.
La deteccin de PrPres por purificacin de las fibrillas asociadas al prurigo lumbar (SAF) y por tcnicas de
inmunotransferencia (35, 50, 79), se realiza con material del cerebro o de la mdula espinal, fresco (sin fijar)
o congelado. Las mejoras en los mtodos de purificacin y extraccin de PrP (7, 22) han contribuido al
aumento de la sensibilidad de este mtodo. Cuando el tamao de la muestra es considerable, esta
metodologa suele proporcionar un mtodo sensible para el diagnstico confirmativo, despus de una
sospecha inicial de la enfermedad por pruebas rpidas de desarrollo ms reciente (ver a continuacin). Por
este motivo, y a falta de un mtodo publicado que sea accesible y completo, se reproduce aqu el mtodo
de inmunotransferencia de SAF.
Protocolo para el diagnstico de las EET mediante inmunotransferencia de SAF

Se describe un ejemplo del procedimiento seguido para la purificacin y deteccin de la isoforma de la
protena prinica que es especfica de la enfermedad (PrPres), partiendo de material obtenido del tallo
cerebral no fijado. Primero se obtiene la purificacin de las fibrillas asociadas al prurigo lumbar (SAF) por
ultracentrifugacin, y luego se sigue un tratamiento con proteinasa K para digerir los restos de la PrPc
celular. Despus, las fibrillas se centrifugan a travs de una capa de sacarosa para una purificacin
adicional, antes de detectar la PrPres por inmunotransferencia.
603
El material del tallo cerebral se debe tomar, si es posible, de la regin del obex (esta es la regin con
contenido ms elevado de PrPres). Se debe disponer de las siguientes muestras:
Control negativo: 4 g.
Control positivo: 4 g.
Muestra sospechosa con seal fuerte en prueba rpida (por ejemplo, densidad ptica [DO] >2,5 en la
prueba Bio-Rad Platelia): 1 g, que ser tratado completamente con proteinasa K*.
Muestra sospechosa con seal dbil en prueba rpida (por ejemplo, DO < 2,5 en la prueba Bio-Rad
Platelia): 2 g con tratamiento con proteinasa K y 2 g sin tratamiento.
*NOTA: Dependiendo del resultado en la prueba rpida, la cantidad de material del tallo cerebral puede ser
2 g 1 g, a efectos confirmativos. Sin embargo, si el examen de una muestra de 1 g resulta negativo, dicha
muestra debe repetirse con al menos 2 g y con tratamiento con proteinasa K.
i)
Tomar la cantidad adecuada de material del tallo cerebral (regin del obex).
ii)
Cortar en pequeos trozos (eliminando la duramadre) y aadir 5 ml de tampn de lisis del cerebro
(BLB) (10 g de N-lauroil-sarcosina, sal sdica [Catlogo Sigma No. L5125] en 100 ml de tampn
fosfato sdico 0,01 M, pH 7,4, ms inhibidores de proteasas - 10 l de fluoruro de fenilmetilsulfonil
[PMSF] 100 mM y 10 l de N-etil-maleimida [NEM] 100 mM).
iii)
Homogenizar cuidadosamente en un homogenizador de vidrio (douncer).
iv)
Transferir cuidadosamente a tubos de plstico de 50 ml.
v)
Aadir otros 2-5 ml de BLB en el homogenizador, lavar bien y aadir tambin el lavado al tubo de
plstico, llevando el volumen final del homogeinizado a 10 ml. Sonicar durante 1 minuto.
vi)
Transferir la muestra a un tubo cerrado, equilibrar el peso aadiendo BLB, y cerrar el tubo con la
tapadera.
vii)
Centrifugar a 20.000 g (17.000 rpm) durante 30 minutos a 10C en un rotor 70Ti de una ultracentrfuga
Beckman.
viii) Extraer cuidadosamente el sobrenadante con una jeringa y pasarlo a un tubo de centrfuga limpio.
Despus, llenar con BLB hasta el cuello del tubo. Cerrar los tubos como antes y centrifugar a
177.000 g (46.000 rpm) durante 135 minutos a 10C en un rotor 70Ti de una ultracentrfuga Beckman.
ix)
Eliminar el sobrenadante y suspender el precipitado en 3 ml de agua destilada con 50 l de Tris-HCl 1

M, pH 7,4 (0,0167 M) por aspiracin suave con una pipeta. Para muestras menores de 2 g de material
cerebral solo se emplea 1,5 ml de agua destilada con 25 l de Tris-HCl 1 M, pH 7,4 (0,0167 M).
x)
Incubar en un bao de agua a 37C durante 15 minutos con agitacin ocasional.
xi)
Para la solucin KI-HSB, preparar 1,5 g de tiosulfato sdico, 1 g de N-lauroil-sarcosina en 1 ml de TrisHCl 1 M y aadir 10 g de yoduro potsico para una solucin al 10% o 15 g para una solucin al 15%.
Diluir a 100 ml con agua destilada. Aadir a la muestra 6 ml de la solucin KI-HSB al 15% e incubar
otros 30 minutos como en el paso anterior x. Para menos de 2 g de material cerebral, se aaden 3 ml
de KI-HBS al 15%.
xii)
Dividir la solucin en dos alcuotas de 4,5 ml (solo para muestras que se dividen para anlisis con y
sin tratamiento con proteinasa K).
xiii) A una alcuota aadir 1 mg/ml de proteinasa K (PK) e incubar 1 hora como en el paso x. Cantidad de
solucin de PK a aadir, para 2 g y menos: 45 l.
xiv) A la otra alcuota, aadir 4,5 ml de KI-HSB al 10% y despus transferir cuidadosamente a un tubo de
ultracentrfuga. Aadir al fondo del tubo con una jeringa y con cuidado 2 ml de sacarosa al 20% y
llenar el tubo hasta el cuello con KI-HSB al 10%. Centrifugar a 189.000 g (51.000 rpm) durante 1 hora
a 10C.
xv)
Realizar el paso anterior con la muestra tratada con proteinasa K.
xvi) Eliminar cuidadosamente los sobrenadantes y secar bien los tubos, poniendo siempre atencin en el
precipitado.
604
xvii) Resuspender las muestras en 40 l de tampn de muestra (2 ml de dodecil sulfato sdico al 20%
[SDS], 1 ml de Tris-HCl [1 M, pH 7,4], 1 ml de mercaptoetanol, 0,6 g de sacarosa, 1-3 gotas de azul de
bromotimol, 15 ml de agua destilada).
xviii) Sonicar las muestras durante 30 segundos.
xix) Centrifugar brevemente para concentrar la muestra en el fondo del tubo.
SDS-PAGE (electroforesis
inmunotransferencia
en
gel
de
poliacrilamida
con
dodecil
sulfato
sdico)
i)
Disponer una placa grande de vidrio y otra pequea con espaciadores para preparar un minigel
despus de lavar los cristales con etanol al 70% y secarlos por completo.
ii)
Preparar el gel de separacin y verterlo o pipetearlo entre las dos placas hasta unos 2 cm del extremo
de la placa de vidrio pequea. Pipetear cuidadosamente una capa de isopropanol sobre el gel y dejar
reposar durante aproximadamente 60 minutos.
iii)
Lavar cuidadosamente la superficie del gel con agua desionizada. Preparar el gel de concentracin y
verterlo o pipetearlo encima del gel de separacin. Insertar un peine a los 30 segundos y dejar reposar
el gel durante 5 minutos.
iv)
Extraer el peine y montar el aparato del gel.
v)
Llenar la cmara del gel de electroforesis con el tampn de electroforesis (Tris 25 mM [3,03 g/litro],
glicina 192 mM [14,4 g/litro], metanol al 20% [200 ml/litro], SDS al 0,2% [2 g/litro]). El nivel del gel debe
estar bastante por debajo del nivel del tampn. Limpiar cuidadosamente con una pipeta los pocillos de
las calles de recorrido de restos de gel.
vi)
Depositar 30 l de cada muestra en el equipo de minigel con 13% de SDS despus de incubar las
muestras durante 5 minutos a 95C.
vii)
Llevar a cabo la electroforesis en el gel a 100 V hasta que las muestras hayan entrado bien en el gel
de separacin y continuar despus a 200 V (por otros 30-40 minutos). Detener el recorrido cuando el
color azul del frente alcance el borde final del gel.
viii) Iniciar la transferencia: para ello, disponer en el siguiente orden en la cmara semiseca:
-
tres capas de papel Whatman bien empapadas en tampn de transferencia, de tamao

ligeramente mayor que las membranas;
membrana immobilon-P-Transfer (esta membrana debe equilibrarse previamente, primero en

metanol durante 5 minutos y luego en tampn de transferencia);
gel;
tres capas de papel Whatman bien empapadas en tampn de transferencia.
Cerrar la cmara semiseca y efectuar la transferencia a 15 V durante 50 minutos.

ix)
Sacar la membrana de la cmara de transferencia y bloquearla en 20 ml de I-Block (5% de leche en

polvo desnatada en solucin salina tamponada con fosfato [PBS] + 0,1% de Tween 20) durante
30 minutos a temperatura ambiente en un agitador.
x)
Incubar con el anticuerpo primario en I-Block durante 1,5 horas a temperatura ambiente o durante toda
la noche a 4C.
xi)
Lavar tres veces durante 10 minutos cada vez con PBS + 0,1% de Tween 20 (PBS/Tween) en un
agitador.
xii)
Incubar durante 1 hora con el conjugado (GAM-AP) diluido 1/1000 en PBS/Tween a temperatura
ambiente en un agitador.
xiii) Lavar tres veces durante 10 minutos cada vez con PBS/Tween en un agitador.
xiv) Incubar en tampn de ensayo durante 2 minutos a temperatura ambiente con agitacin.
xv)
Visualizar los anticuerpos unidos aadiendo 1,5 ml del reactivo de deteccin CDP Star (Tropix) en
cada transferencia e incubando durante 5 minutos. A continuacin, envolver la membrana en papel de
plstico y detectar las seales en una cmara o mediante exposicin a un film.
605
Como este protocolo se centra en concentrar por ultracentrifugacin la PrPres insoluble, no hay que esperar
la observacin de seal en la muestra digerida del control negativo, ni en la alcuota no digerida, que
contienen solo PrPc soluble, y que es probable que presente solo una seal de baja intensidad. La
glicoprotena prinica est dos veces glicosilada. En consecuencia, despus de la digestin con PK la
PrPres produce bandas con masas moleculares de 30-27 kDa, 26-24 kDa y 21-19 kDa por
inmunotransferencia. En la PrPres de la EEB la banda superior es la ms destacable. ste es tambin el
caso en la seal de la mayora de los casos de prurigo lumbar, pero las intensidades de las bandas tambin
pueden ser diferentes.
Control Negativo:
-
No tratado con PK: sin seal o solo una seal dbil de PrPc (33-35 kDa).
Tratado con PK: sin seal especfica de PrP
Control Positivo:
-
No tratado con PK: seal muy fuerte, a veces demasiado fuerte como para diferenciar bandas
aisladas, con la seal de mayor intensidad a 33-35 kDa.
Tratado con PK: tres bandas visibles de PrPres.
Debe observarse un desplazamiento en el peso molecular cuando se compara la fraccin digerida y la no

digerida del control positivo, que corresponde a la comprobacin de la actividad PK.
Muestra para diagnstico:
La muestra problema tratada con PK se considera positiva si las seales que corresponden a PrPres
son claramente visibles. Es conveniente que las muestras para diagnstico se coloquen en la misma
prueba de transferencia que el control positivo tratado con PK. Siempre deben colocarse en el mismo
gel que una muestra control para PrPc no digerida con el fin de poder apreciar el desplazamiento en
peso molecular.
La muestra para diagnstico tratada con PK se considera negativa si no existe una seal especfica
detectable de PrPres.
La prueba debe repetirse si los resultados del control negativo o positivo son atpicos o si los de la
muestra problema no son concluyentes, como por ejemplo cuando las seales:
-
son muy dbiles (repetir la preparacin de SAF con mayor cantidad de material cerebral)
muestran bandas que no corresponden con el control positivo (repetir el procedimiento y utilizar
adems otros mtodos de diagnstico).
Pruebas rpidas para la deteccin de las formas de PrP especficas de la enfermedad

Las tcnicas automatizadas de inmunotransferencia y enzimoinmunoensayo (ELISA) permiten el anlisis de
muchas muestras cerebrales (60, 61, 69, 70) y en la actualidad estn comercializadas. Tales tcnicas se
pueden realizar con rapidez, son ms sensibles que el mtodo histopatolgico y su sensibilidad es
equiparable a la de la inmunotransferencia de SAF. En comparacin con la inmunohistoqumica, su
sensibilidad est por determinar. En un ensayo llevado a cabo en representacin de la Comisin Europea
(60, 61), se demostr que para el diagnstico con tejido cerebral en poblaciones seleccionadas resultaban
adecuados un mtodo de inmunotransferencia y dos mtodos especficos de tipo ELISA. Esta evaluacin
se limit a comparar el anlisis de una muestra de cerebros de ganado identificado como sospechoso por
cambios histopatolgicos caractersticos de EEB con el de una muestra de cerebros de ganado bovino de
Nueva Zelanda, no expuesto a EEB y que eran histolgicamente negativos. Estas pruebas estn ahora
aprobadas, y se utilizan en pases europeos y en algunos otros para programas de anlisis y seguimiento a
gran escala. Constituyen un medio de anlisis de animales en la fase tarda del perodo de incubacin (los
ltimos meses), por ejemplo en muestreos de material post-mortem recogido de ganado bovino sacrificado
rutinariamente. Estas pruebas, desarrolladas recientemente, ofrecen una ayuda eficaz en pases que llevan
a cabo un seguimiento de la deteccin de nuevos casos de EEB y en aquellos otros en los que se
considera necesario un medio para determinar la prevalencia de EEB, que sea independiente del sistema
de la declaracin de casos sospechosos. Desde su introduccin en Europa, en Enero de 2001, estas
pruebas han sido las responsables de la identificacin de la mayora de los animales infectados por EEB.
En algunos pases, dada la rapidez con que pueden obtenerse los resultados, las pruebas rpidas
constituyen la prueba inicial preferida, aunque la confirmacin de un diagnstico de EEB requiere el
examen del cerebro fijado por histopatologa y/o por IHC.
606
En el ao 2001 la Comisin Europea evalu una nueva generacin de pruebas rpidas de diagnstico (33,
70). El proceso ha resaltado la necesidad de tal evaluacin y ha identificado los peligros de utilizar
prematuramente los medios de investigacin para un control activo. Aunque el programa de evaluacin
sirve para apoyar la legislacin europea respecto al seguimiento de la EEB, las consecuencias son tambin
relevantes para otros pases. La aparicin de resultados falsos positivos y negativos es tan elevada que la
introduccin de nuevas pruebas debera basarse antes en una cuidadosa evaluacin de la prueba y de su
realizacin. Las pretensiones de los fabricantes deberan basarse en datos, evaluados preferiblemente de
modo independiente. Hay que destacar que el proceso de una validacin completa de todos estos mtodos
de diagnstico de la EEB est limitado por la ausencia de un verdadero estndar de oro y por la
consiguiente necesidad de aplicar estndares de comparacin que estn basados en relativamente pocos
estudios. Por tanto, persiste la necesidad de que se publiquen estudios a gran escala sobre realizacin de
las pruebas ya que ninguno de los datos publicados hasta la fecha cumple los procedimientos reconocidos
para la validacin de las pruebas de otras enfermedades. Los estudios iniciados por la Comisin Europea
representan evaluaciones de las pruebas, y sus validaciones estn en marcha. Debe tenerse cuidado con la
interpretacin comparada de las pruebas cuando se aplican a animales aparentemente sanos ya que las
diferentes pruebas pueden variar en sensibilidad respecto a la fase de incubacin y a la patognesis de la
enfermedad.
A continuacin se presentan algunos breves detalles de las cinco pruebas aprobadas actualmente por la
Unin Europea para su utilizacin. Ver la Seccin B1 para el intercambio de terminologa respecto a la
forma anormal de PrP.
d)
La prueba Enfer Test2 es una prueba cualitativa basada en un inmunoensayo quimioluminiscente en

microplaca para la deteccin de la protena resistente del prin (PrPres). La PrPres extrada de
muestras se une a pocillos preparados en placas de microtitulacin y se detecta con un anticuerpo
primario policlonal anti-PrP, un anticuerpo secundario conjugado con peroxidasa de rbano, y un
substrato quimioluminiscente.
La prueba Platelia o TeSeE3 es un inmunoensayo en sndwich que utiliza dos anticuerpos

monoclonales para la deteccin de la protena anormal del prin que es resistente a la proteinasa K.
La presencia de la PrP anormal se revela por un substrato coloreado. La prueba se ha autorizado
tanto en formato manual como automatizado.
La prueba Prionics Check Western Blot4 es un mtodo basado en inmunotransferencia para la

deteccin de la forma especfica de la enfermedad de la protena del prin. Las muestras se
homogenizan y se tratan con proteinasa para eliminar la PrP normal (PrPc) y para convertir la PrPres al
fragmento PrP27-30. Las muestras se separan por electroforesis en gel, se transfieren a una
membrana y se identifica PrP27-30 por su inmunoreactividad con anticuerpos anti-PrP y por los pesos
moleculares de las bandas
La prueba CDI5 es un inmunoensayo de conformacin automatizada para la deteccin de la

enfermedad que origina PrPres. La prueba se basa en un ELISA tipo sndwich que utiliza un
anticuerpo marcado con europio para detectar cualquier PrP presente en la muestra. La comparacin
entre la forma normal (PrPc) y la total (PrPc ms PrPres) permite determinar el nivel de la PrPres
anormal presente en la muestra.
La prueba Prionics Check LIA6 es un inmunoensayo luminiscente en microplaca. Las muestras se

tratan con proteinasa K para degradar la PrPc, mientras la PrPres se reduce al fragmento de 2730 kDa. La reaccin proteoltica se detiene y la PrPres que contiene la muestra se detecta por un
enzimoinmunoensayo en sndwich con una reaccin enzimtica quimioluminiscente.
Otras pruebas de diagnstico

Mediante tincin negativa de los extractos de tejido enceflico o medular, fresco o congelado obtenidos con
detergentes, se ha empleado como mtodo adicional de diagnstico de la EEB la demostracin por
microscopa electrnica de las fibrillas caractersticas, que son las homlogas en los bvidos a las SAF en
ovinos (ver Captulo 2.4.8. Prurigo lumbar), (75, 79, 92). Esta evidencia es particularmente til cuando el
examen histopatolgico resulta difcil por la descomposicin post-mortem (74). Trabajos recientes sobre el
2
3
4
5
6
Prueba distribuida por: Abbot Diagnostics, Abbot Laboratorios, 100 Abbot Park Road, Abbot Park, IL 60034-3500, EE.UU.
Platelia Bio-Rad (Una versin posterior de esta prueba, la TeSeE, ha sido aprobada por la Comisin Europea y est
actualmente comercializada). Bio-Rad, 3 Boulevard Raymond Poincar, 92430 Marnes la Coquette, Paris, Francia.
Prionics Check Western Blot and Prionics LIA: Prionics, Wagistrasse 27a, CH-8952 Schlieren, Suiza. Distribuidor: Roche
Diagnpostics GmbH, 68298 Mannheim, Alemania.
Prueba CDI: InPro Biotechnology, 870 Dubuque Avenue, South San Francisco, CA 94080, EE.UU.
Prionics LIA, Wagistrasse 27a, CH-8952 Schlieren, Suiza (ver nota 4 a pie de pgina), www.prionics.com
607
prurigo lumbar indican que el mtodo se puede aplicar, con modificaciones, a tejido fijado con formalina
(13). La deteccin de las fibrillas se correlaciona bien con el diagnstico histopatolgico de la EEB (77) pero
no ofrece la especificidad o sensibilidad que presentan los mtodos de IHC o de inmunotransferencia.
Algunas de las pruebas inmunolgicas rpidas tambin son eficaces en presencia de autolisis (14) y dada
su mayor sensibilidad que la deteccin de SAF pueden ser las pruebas preferidas en tales circunstancias.
La infeccin por EEB se puede observar mediante una inoculacin intracerebral/intraperitoneal (39) o por
alimentacin de ratones con tejido cerebral de ganado con una afeccin terminal (6), pero este bioensayo
no resulta prctico para el diagnstico rutinario debido al largo tiempo de incubacin (> 292 das). Un futuro
desarrollo de ratones transgnicos que sobreexpresen el gen PrP bovino podra, tericamente, ofrecer
bioensayos con perodos de incubacin ms cortos para la EEB. Sin embargo, los datos obtenidos de un
estudio de este tipo no conducen a perodos de incubacin ms reducidos que los de las cepas normales
de ratones (12).
Existe la necesidad de una prueba para la EEB que pueda aplicarse al animal vivo y que tenga una
sensibilidad capaz de detectar PrPres a niveles bajos, como ocurre en las primeras fases del periodo de
incubacin de la enfermedad. De vez en cuando se publican diversos enfoques potenciales, a menudo de
forma preliminar, basados solo en datos limitados. Ninguno ha progresado hasta el punto de superar una
revisin detallada y la evaluacin crtica por otros, de modo que las pretensiones de dichos trabajos deben
interpretarse con cautela.
Algunas protenas marcadoras, fundamentalmente la apolipoprotena E (Apo E), se pueden detectar por
electroforesis bidimensional en el lquido cerebroespinal de casos clnicamente sospechosos e
histopatolgicamente confirmados de EEB (53). Sin embargo, la Apo E es un marcador inespecfico de
neurodegeneracin y no puede ser til para el diagnstico de casos preclnicos de EEB. El anlisis del
lquido cerebroespinal para la protena 14-3-3 tampoco es de utilidad en el diagnstico de la EEB (68). De
modo similar, los estudios sobre las protenas S-100 en el lquido cerebroespinal (45) y en el suero (67) no
proporcionan resultados sobre los que basar pruebas tiles para el diagnstico de EEB. La deteccin
electroqumica de metabolitos en la orina (52) presenta una validacin final que indica unos valores de
especificidad y sensibilidad inferiores a los requeridos para un posible papel independiente en el
diagnstico de la EEB. Hay datos preliminares que indican que en la orina del ganado bovino infectado se
puede detectar un derivado de la molcula de PrP (77), lo que ha abierto nuevas investigaciones con vistas
a comercializar una prueba de diagnstico, pero se necesita ms evaluacin y revisin de los datos.
2)
Pruebas serolgicas
A semejanza de lo que ocurre con el prurigo lumbar, donde no se ha detectado respuesta inmune en el
hospedador, parece probable que no exista respuesta inmune en el caso de la EEB.

En la actualidad no existen productos biolgicos disponibles. Como se ha comentado anteriormente, en muchos
pases se ha autorizado la utilizacin de kits comerciales para diagnstico.
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*
* *
NB: Existen laboratorios de referencia de la OIE para la encefalopata espongiforme bovina (ver Cuadro en la
Parte 3 de este Manual de animales terrestres o consultar la pgina web de la OIE para una lista actualizada:
www.oie.int).
614
CAPTULO 2.3.14.
FIEBRE CATARRAL MALIGNA
RESUMEN
La fiebre catarral maligna (FCM) es una enfermedad aguda, generalizada y habitualmente fatal
que afecta a muchas especies de Artiodactyla. Se ha descrito que la enfermedad afecta con
mayor frecuencia a especies de la subfamilia Bovinae y la familia Cervidae, pero tambin se ha
comprobado en cerdos domsticos as como en jirafas y especies de antlopes pertenecientes a la
subfamilia Tragelaphinae. La FCM se caracteriza por acumulaciones celulares linfoides
caractersticas en rganos no linfoides, vasculitis e hiperplasia de linfocitos T en rganos linfoides,
y puede ser causada por uno de los dos gammaherpesvirus. El herpesvirus-1 alcelafino (AIHV-1),
cuyo hospedador natural, el u, no se ve afectado en apariencia, causa la enfermedad en bvidos
en regiones de frica y en una variedad de especies rumiantes en colecciones zoolgicas de todo
el mundo. El herpesvirus-2 ovino (OvHV-2), que prevalece en todas las variedades de ovejas
domsticas como una infeccin subclnica, es la causa de la FCM en la mayor parte del mundo.
Esta forma de la enfermedad se calific primeramente como FCM asociada a la oveja. En ambas
formas de la enfermedad, los animales que tienen la enfermedad clnica no son fuente de
infeccin, ya que el virus slo lo excretan los hospedadores naturales, ues y ovejas,
respectivamente.
Normalmente, la FCM aparece de forma espordica y afecta a unos pocos animales, aunque
ambos virus pueden provocar epizootias. Existe una gradacin marcada en la susceptibilidad
hacia la forma OvHV-2 de la FCM que vara desde la resistencia relativa de Bos taurus y
B. indicus, pasando por el bfalo de agua y muchas especies de ciervos, hasta los muy
susceptibles ciervos del Pre David y vacas de Bali. La enfermedad puede presentar un espectro
amplio de manifestaciones clnicas que varan desde la forma aguda, en la que se observan
cambios mnimos previos a la muerte, hasta los casos ms complejos caracterizados por fiebre
alta, opacidad bilateral de la crnea, descargas catarrales profusas de ojos y nariz, necrosis del
hocico y erosin del epitelio bucal. La infectividad slo puede recuperarse a partir de los animales
con la forma AIHV-1 de la FCM empleando tcnicas que mantienen la viabilidad de las clulas
hospedadoras, mientras que la forma OvHV-2 nunca se ha recuperado a partir de los animales
afectados. Normalmente el diagnstico se consigue observando los cambios histopatolgicos
caractersticos, aunque la deteccin del ADN vrico en cualquiera de las formas de la enfermedad
se ha convertido en la opcin preferida.
Identificacin del agente: El AIHV-1 se puede recuperar a partir de los animales afectados
clnicamente utilizando leucocitos de sangre perifrica o suspensiones celulares preparadas a
partir de ganglios linfticos o bazo, pero la viabilidad celular debe conservarse durante el proceso
ya que la infectividad no se puede recuperar de clulas muertas. Tambin se puede recuperar el
virus a partir de los ues, o de leucocitos de sangre perifrica o de suspensiones celulares de
otros rganos. Probablemente la mayora de los cultivos en monocapas de origen rumiante son
susceptibles y desarrollan efecto citoptico (ECP), aunque se han usado extensamente los
cultivos celulares de tiroides de bovino para recuperar el virus. Los aislados primarios producen de
forma tpica un ECP multinucleado en el cual se puede identificar el antgeno vrico mediante
inmunofluorescencia o inmunocitoqumica empleando antisueros adecuados o anticuerpos
monoclonales. El agente OvHV-2 nunca se ha identificado formalmente, aunque las lneas
celulares linfoblsticas propagadas a partir de animales infectados contienen el ADN especfico
del OvHV-2.
Manual de la OIE para animales terrestres 2004
615
Captulo 2.3.14. Fiebre catarral maligna
El ADN vrico se ha detectado en el material clnico procedente de casos de FCM causada tanto
por el AIHV-1, como por el OvHV-2 mediante la reaccin en cadena de la polimerasa, y ste se ha
convertido en el mtodo elegido para el diagnstico de la forma OvHV-2 de la enfermedad.
Pruebas serolgicas: El u infectado, el hospedador natural, desarrolla de forma estable
anticuerpos contra el AIHV-1, que se pueden detectar en una variedad de ensayos, entre ellos, de
neutralizacin
vrica,
de
inmunoelectrotransferencia,
de
enzimoinmunoensayo,
de
inmunofluorescencia y de inmunocitoqumica. Sin embargo, la respuesta de anticuerpos de los
animales afectados clnicamente es limitada y no desarrollan anticuerpos neutralizantes, de modo
que la deteccin depende del empleo de ensayos de inmunofluorescencia o de
inmunoelectrotransferencia. Los anticuerpos contra el OvHV-2 slo se han detectado empleando
el AIHV-1 como fuente de antgeno. De forma invariable, las ovejas domsticas producen
anticuerpos que se pueden detectar mediante inmunofluorescencia o inmunoelectrotransferencia.
Frecuentemente se pueden detectar los anticuerpos en las vacas con FCM mediante
inmunofluorescencia, en tanto que en animales afectados de forma ms grave, tales como los
ciervos, no siempre estn presentes los anticuerpos. El enzimoinmunoensayo de inhibicin
competitiva (CI-ELISA) ms recientemente desarrollado parece tener una sensibilidad y
especificidad igual o mayor que otras pruebas.
Requisitos para las vacunas y los materiales de diagnstico: No se han desarrollado vacunas
contra esta enfermedad.
A. INTRODUCCIN
La fiebre catarral maligna (FCM) es una enfermedad generalmente fatal de vacas y muchas otras especies de
Artiodactyla, que tiene lugar despus de una infeccin, bien con el herpesvirus-1 alcelafino (AIHV-1) o bien con
el herpesvirus-2 ovino (OvHV-2). El u (Connochaetes spp. de la subfamilia Alcelaphinae), el hospedador
natural del AIHV-1, no sufre enfermedad clnica despus de la infeccin. De la misma forma, la infeccin de la
oveja domstica, el hospedador natural del OvHV-2, no se asocia con ninguna reaccin clnica. La enfermedad
causada por el AIHV-1 se limita a aquellas reas de frica en las que estn presentes los ues y a las
colecciones zoolgicas en cualquier otro sitio, y en un principio se calific como FCM derivada del u. La forma
OvHV-2 de la enfermedad tiene lugar en cualquier parte del mundo donde se practique la cra de ovejas, y se ha
descrito como FCM asociada a ovejas (SA). Ambas formas de la enfermedad pueden presentar un espectro
amplio de manifestaciones clnicas, aunque los cambios histopatolgicos caractersticos son muy similares en
todos los casos.
Cambios clnicos y patolgicos
Los signos clnicos de la FCM son muy variables y van desde una forma peraguda a una crnica en la que, en
general, las manifestaciones ms evidentes aparecen en los casos ms prolongados. En la forma peraguda o
bien no se detectan signos clnicos, o bien se puede desarrollar depresin seguida de diarrea o disentera
durante 12-24 horas antes de la muerte. En general, el inicio de los signos se asocia con la aparicin de fiebre,
lagrimeo seroso abundante y exudado nasal, que progresa hasta descargas mucopurulentas profusas. Los
animales pueden estar inapetentes y se puede reducir la produccin de leche. De forma caracterstica,
desarrollan opacidad bilateral progresiva de la crnea, que comienza en la periferia. En algunos casos aparecen
lesiones en la piel (caracterizadas por ulceracin y exudacin), que pueden formar costras endurecidas
asociadas con la necrosis de la epidermis, y frecuentemente estn restringidas al perineo, las ubres y pezones.
La salivacin asociada con la hiperemia puede ser un signo temprano, que progresa hasta provocar erosiones
en la lengua, el paladar duro, las encas y, de manera caracterstica, las porciones distales de las papilas
bucales. Los ganglios linfticos superficiales se pueden infartar y las articulaciones de los miembros se pueden
inflamar.
Es posible que presenten signos nerviosos tales como hiperestesia, falta de coordinacin, nistagmo y presin de
cabeza en ausencia de otros signos clnicos o como parte de un sndrome caracterstico ms amplio.
Existe un amplio espectro de susceptibilidad a la enfermedad inducida por el OvHV-2, que vara desde Bos
taurus y B. indicus, que son relativamente resistentes, pasando por muchas especies de ciervos y el bfalo de
agua (Bubalus bubalis), que son ms susceptibles, hasta la extremadamente susceptible vaca de Bali (Bos
javanicus) y el ciervo del Pre David (Elaphurus davidianus). Las especies ms resistentes tienden a
experimentar una infeccin ms prolongada y lesiones complejas, mientras que en las especies ms
susceptibles el curso de la enfermedad tiende a ser ms corto y los signos clnicos menos dramticos.
616
Recientemente se han confirmado informes de varios pases, y en particular de Noruega, en el sentido de que la
enfermedad afecta a los cerdos domsticos (10). Los signos son muy similares a los que se observan en vacas
afectadas por la forma aguda.
Una forma leve de la enfermedad descrita en 1930 se consider con cierto escepticismo debido a que se poda
confirmar slo mediante cambios histolgicos observados en el examen post mortem. Sin embargo,
investigaciones recientes llevadas a cabo con mtodos moleculares y serolgicos, parece que confirman que
unos pocos animales infectados se pueden recuperar, tanto despus de reacciones clnicas leves como
despus de otras bastante graves (11).
Patologa
Los cambios patolgicos conjuntos reflejan la gravedad de los signos clnicos, pero, generalmente, son extensos
y pueden implicar la mayora de sistemas orgnicos. Las erosiones y las hemorragias pueden presentarse a lo
largo del tracto intestinal, y, en los casos ms agudos, se pueden asociar con contenidos intestinales
hemorrgicos. En general, los ganglios linfticos estn hipertrficos, aunque la extensin de su participacin
vara en cada animal. Con frecuencia, los ganglios linfticos aparecen firmes y blancos al diseccionarlos,
mientras que en otros casos, en particular los submandibulares y retrofarngeos, pueden estar hemorrgicos e
incluso necrticos. A menudo se observan en el tracto respiratorio las acumulaciones catarrales, las erosiones y
la formacin de una membrana diftrica.
Frecuentemente, en el tracto urinario, estn presentes hemorragias equimticas caractersticas del
revestimiento epitelial de la vejiga, mientras que el crtex renal puede estar afectado con mltiples focos
blancos elevados, de 15 mm de dimetro y a veces rodeados por una zona delgada hemorrgica.
Los cambios histolgicos son la base para confirmar los casos de FCM y se caracterizan por degeneracin
epitelial, vasculitis, hiperplasia y necrosis de los rganos linfoides, y acumulaciones intersticiales extensas de
clulas linfoides en rganos no linfoides. Las lesiones epiteliales pueden presentarse en todas las superficies
epiteliales y se caracterizan por erosin y ulceracin, con infiltracin frecuente de clulas linfoides intraepiteliales
y subepiteliales, que pueden estar asociadas con vasculitis y hemorragias.
Generalmente, est presente la vasculitis y puede ser notable en el cerebro, afectando a venas, arterias,
arteriolas y vnulas. Se caracteriza por infiltracin de clulas linfoides de la tnica adventicia y media, con
frecuencia asociada con degeneracin fibrinoide. El lumen, puede estar pavimentado por clulas linfoides y, a
veces, en los casos graves, las acumulaciones subendoteliales y el dao endotelial por las clulas linfoides
pueden conducir a la oclusin del vaso.
La hiperplasia de los ganglios linfticos se caracteriza por una expansin de las clulas linfoblsticas del
paracrtex, mientras que las lesiones degenerativas se asocian generalmente con los folculos.
Frecuentemente, el edema con inflamacin linfoide afecta al tejido perinodal.
Es tpica la acumulacin intersticial de las clulas linfoides en los rganos no linfoides, en particular en el crtex
renal y las reas periportales del hgado, y, en el caso del rin, puede ser muy extensa. En el cerebro puede
observarse una meningoencefalitis no supurativa acompaada de manguito perivascular linfoctico y un
incremento marcado en el nmero de clulas del lquido cerebroespinal.
Las lesiones macroscpicas en la crnea se reflejan histolgicamente por la infiltracin de clulas linfoides que
se origina en el limbo y que progresa hacia el centro, con desarrollo de edema y erosin en los casos ms
avanzados. Tambin se puede presentar vasculitis, hipopion e iridociclitis.
Las caractersticas patolgicas de la FCM causadas por cualquiera de los agentes son esencialmente similares.
Sin embargo, adems del examen histolgico, los mtodos disponibles para el diagnstico de la enfermedad
inducida por el AIHV-1 o el OvHV-2 son muy diferentes y por ello se consideran por separado.
B1. Herpesvirus-1 alcelafino
Esta forma de la enfermedad se presenta en las regiones de cra de ganado bovino del ste de frica donde los
pastores utilizan reas en las que pastan ues, y en reas del sur de frica donde pastan juntos ues y vacas.
Sin embargo, la enfermedad tambin puede afectar a una variedad de otras especies de rumiantes en
colecciones zoolgicas de todo el mundo y as, aparte del antlope de las subfamilias Alcelaphinae e
Hippotraginae, es aconsejable considerar a todos los rumiantes como susceptibles. La mayora de pruebas de
laboratorio cuentan con un aislado atenuado (WC11), que se ha sometido a muchos pases de laboratorio y se
emplea como fuente de antgeno vrico y de ADN (13). La publicacin reciente de la secuencia nucleotdica
completa del virus virulento de un nmero bajo de pases (C500) constituir la base de estudios futuros de este
virus (4).
617
1.
Animales afectados clnicamente
a)
Aislamiento
La caracterstica ms notable de la FCM inducida por el AIHV-1 es la falta de antgeno vrico detectable o
de citologa especfica de herpesvirus en las lesiones. As, la confirmacin de la infeccin depende de la
recuperacin vrica. Generalmente, la infectividad est asociada estrictamente a las clulas y, por tanto, el
aislamiento se puede conseguir slo a partir de suspensiones celulares o bien de leucocitos de sangre
perifrica, de ganglios linfticos o bien de otros tejidos afectados. Las suspensiones celulares se preparan
en el sobrenadante de cultivos de tejidos, aproximadamente 5 106 clulas/ml, y se inoculan en
monocapas de cultivos celulares preestablecidos. Se utilizan extensamente clulas de tiroides de bovino,
pero probablemente la mayora de cultivos celulares en monocapa primarios o de un nmero bajo de
pases de origen rumiante proporcionar un sustrato celular adecuado para el aislamiento vrico. Despus
de 3648 horas de incubacin, se debera cambiar el medio de cultivo y observar las monocapas al
microscopio (40) para comprobar si existen signos evidentes de efectos citopticos (ECP). Estos
aparecen de modo caracterstico como focos multinucleados en las monocapas, despus se retraen
progresivamente hasta formar unos cuerpos densos con procesos citoplsmicos que pueden separarlos. A
este proceso le sigue el recrecimiento de las monocapas normales. Un ECP puede tardar hasta 21 das en
hacerse visible y rara vez se presenta antes del da 7. La infectividad en esta fase tiende a estar muy
asociada a las clulas y, de este modo, cualquier pase posterior o almacenamiento debe emplear mtodos
que aseguren el mantenimiento de la viabilidad celular. Se debera determinar la especificidad del aislado
utilizando antisueros especficos o anticuerpos monoclonales (MAbs) en pruebas de fluorescencia o
inmunocitoqumicas.
b)
ADN vrico
De forma caracterstica, en los tejidos afectados se puede detectar muy poco ADN vrico, por tanto, es
necesario amplificar el genoma vrico mediante cultivo convencional o mediante la reaccin en cadena de
la polimerasa (PCR).
Se ha publicado un mapa de restriccin de la cepa de laboratorio estndar (WC11) empleando los enzimas
de restriccin HindIII, EcoRI, BamHI y SmaI y se ha clonado la mayora del genoma (2). Tales clones se
pueden utilizar para identificar y caracterizar otros gammaherpesvirus aislados de bovinos. Se han
generado los datos de secuencia del aislado WC11 del AIHV-1 y se han identificado los cebadores
adecuados para utilizarlos en la prueba de PCR (7). Sin embargo, no se considera ninguno
apropiado para utilizarlo como ayuda diagnstica. Adems, se ha publicado el genoma completo del
aislado virulento C500 (4).
Hospedadores naturales
Prcticamente todos los ues estn infectados con el AIHV-1 a los 6 meses de vida, lo que provoca la extensin
del virus como una epizootia intensa durante el periodo perinatal. Se asume que las especies Connochaetes
taurinus taurinus, C.t. albojubatus y C. gnu estn infectadas por el mismo virus. La infeccin parece persistir
tambin en la mayora de grupos de ues de colecciones zoolgicas. Sin embargo, es posible que la infeccin
pueda estar ausente en animales que se hayan mantenido aislados durante la juventud o que vivan en grupos
pequeos. La infeccin natural se ha detectado con xito mediante ensayos de hibridacin en secciones de
pulmn de ues azules jvenes en Sudfrica (12).
En rara ocasin se contemplar el aislamiento vrico. Despus de la infeccin existe un breve periodo de tiempo
en el que se excreta el virus en una forma libre de clulas y se puede aislar a partir de frotis nasales. Tambin
se puede aislar el virus en ese momento a partir de leucocitos, pero en los animales mayores es menos
probable el xito a menos que el animal est inmunodeprimido por estrs o por una intervencin farmacolgica.
Adems, se puede aislar el virus estableciendo cultivos de tejidos a partir de animales que son aparentemente
normales y se ha logrado en cultivos en monocapa, tanto de rin como de clulas de tiroides, procedentes de
animales adultos.
Otros antlopes grandes de las subfamilias Alcelaphinae y Hippotraginae tambin estn infectados con
gammaherpesvirus que estn muy relacionados desde el punto de vista antignico, pero no existe evidencia de
que puedan transmitirse a otras especies y causar la FCM.
2.
Pruebas serolgicas
La respuesta de anticuerpos de los animales afectados clnicamente es limitada, sin desarrollo de anticuerpos
neutralizantes. En los casos clnicos la presencia de anticuerpos se puede demostrar de forma estable mediante
618
inmunofluorescencia o la prueba de la inmunoperoxidasa (IPT) empleando como sustrato cultivos celulares

infectados con el aislado vrico WC11. A pesar de que se han descrito otros mtodos de deteccin de
anticuerpos, ninguno ha demostrado ser satisfactorio. El primer mtodo desarrollado fue un
enzimoinmunoensayo de inhibicin competitiva (CI-ELISA) diseado para detectar anticuerpos dirigidos frente al
OvHV-2 (9) y que utiliza un MAb (15-A) que tiene como diana un eptopo, al parecer conservado en todos los
virus de la FCM.
Despus de la infeccin de los ues parece que se desarrollan anticuerpos de forma estable y se pueden
identificar mediante pruebas de neutralizacin que emplean el aislado libre de clulas WC11, o mediante
inmunofluorescencia, utilizando de nuevo el aislado WC11 e IgG anti-bovina, que se sabe que reacciona con la
IgG de u. La cepa vrica Minnesota de la FCM, que no se distingue de la cepa WC11 del AIHV-1, se utiliza para
la produccin de antgeno para el CI-ELISA.
Hasta ahora no ha habido intentos para estandarizar la prueba de inmunofluorescencia indirecta (IFI) o la IPT,
pero los dos mtodos descritos a continuacin se ofrecen a modo de ejemplo. La validacin del CI-ELISA
contina en curso.
a)

La prueba IFI es menos especfica que la de neutralizacin vrica (NV), y puede utilizarse para demostrar
diversas variedades de antgenos tempranos y tardos en las monocapas de clulas infectadas por el
AIHV-1. Los anticuerpos que reaccionan en la prueba IFI o en la IPT se desarrollan en vacas y en conejos
infectados de forma experimental durante el periodo de incubacin, y ms tarde en el curso clnico de la
enfermedad, aunque las reacciones cruzadas con algunos otros herpesvirus bovinos, as como el OvHV-2,
reducen el valor diagnstico diferencial. Algunas veces, la deteccin de tales anticuerpos de reaccin
cruzada es til para confirmar un diagnstico de la SA-FCM.
Preparacin de portas fijados
Se inoculan cultivos celulares con el AIHV-1 (cepa WC11) cerca de o recin alcanzada la confluencia
(vase Seccin B1.2.c.). Se deberan procesar en paralelo, como control, cultivos no inoculados. Despus
de unos 4 das (cuando se espere que aparezcan los primeros signos de ECP, pero antes de declarar
visible un ECP) se tratan los cultivos como se indica seguidamente: se elimina el medio, se extraen las
clulas con una solucin de tripsina-EDTA y se centrifugan aproximadamente a 800 g durante 5 minutos,
se elimina el sobrenadante y se resuspenden las clulas en 10 ml de solucin salina tamponada con
fosfato (PBS) por cada botella de plstico de cultivo celular de 800 ml.
Se realiza una prueba depositando unas pequeas cantidades de la suspensin celular en dos pocillos de
un porta multiprueba recubierto de politetrafluoroetileno; se secan al aire y se fijan con acetona. Estos
pequeos depsitos revelan con un suero estndar positivo y la anti-IgG conjugada para la especie
apropiada. Se examina la incidencia de las clulas positivas y negativas bajo el microscopio de luz
ultravioleta. Se ajusta la suspensin celular mediante la adicin de clulas no infectadas y/o PBS hasta
alcanzar la concentracin adecuada que dar lugar a una capa nica de clulas cuando se extiendan
sobre el porta, con clulas positivas claramente definidas sobre un fondo de clulas negativas.
Se deposita una pequea cantidad de la suspensin celular positiva ajustada y de las suspensiones control
negativo en portas multiprueba segn el modelo deseado, y se secan al aire. Se fijan con acetona
durante 10 minutos. Se lavan, se secan y se conservan con gel de slice dentro de un contenedor
hermtico a 70C.
Un procedimiento alternativo, que es ms fcil de evaluar, consiste en preparar monocapas de clulas
infectadas y no infectadas en tubos de Leighton o en portas compartimentalizados. Las monocapas
celulares se infectan a partir de 150 a 200 DICCT50 (dosis infectiva 50% en cultivo celular) del virus que se
diluye en el medio de cultivo celular. Los portas infectados y no infectados se fijan con acetona y se
conservan, como se ha indicado anteriormente, a 70C.
i)
Los portas se rehidratan durante 5 minutos con PBS, se lavan con agua destilada y se secan al aire.
ii)
Los sueros se diluyen 1/20 en PBS. Las muestras que den un fondo alto de tincin se pueden volver a
probar a diluciones mayores. Se aplican los sueros diluidos a una pequea cantidad de clulas
positivas, por la presencia del virus de la FCM y a otra pequea cantidad de clulas control negativo
para cada muestra. Se incluyen controles de suero positivo y negativo. Lo ideal es que la prueba se
valide volviendo a titular el control positivo para determinar su punto final.
619
iii)
Se incuban a 37C durante 30 minutos en una cmara hmeda.
iv)
Se eliminan los lquidos sobrantes. Los portas se lavan mediante dos cambios de PBS, durante
5 minutos cada uno.
v)
Se lavan con PBS durante 1 hora con agitacin y, seguidamente, los portas se secan al aire.
vi)
Se aplica IgG anti-bovina de conejo conjugada a isotiocianato de fluorescena (FITC) a una dilucin
de trabajo predeterminada.
vii)
Se incuban a 37C durante 20 minutos, se elimina el lquido de los portas y se lavan dos veces con
PBS durante 10 minutos cada vez.
viii) Se tien de contraste con azul de Evans 1/104 durante 30 segundos y se lavan con PBS durante
2 minutos. Se sumergen en agua destilada, se secan y se montan en PBS/glicerol (50/50).
ix)
b)
Se examinan por microscopa de fluorescencia para detectar uniones especficas de anticuerpos a las
clulas infectadas.
Prueba de inmunoperoxidasa
Se prepara una dilucin del AIHV-1 cultivado en clulas de turbinados de cornetes etmoidales bovinos (BT)
que contiene aproximadamente 103 DICCT50 en una suspensin de clulas BT tripsinizadas en fresco y se
inocula en tubos de Leighton con cubreobjetos, 1,6 ml por tubo, o en portas de cuatro cmaras, 1,0 ml por
cmara.
Los cultivos celulares se examinan a los 46 das para detectar posibles ECPs y se fijan con acetona
cuando comiencen los signos de ECP. Se quitan las cmaras de plstico, pero no las gomas, a partir de
las cmaras de los portas antes de la etapa de fijacin y para sta se emplea acetona (p.ej. UltimAR) que
no degrada las gomas. Las clulas fijadas se conservan a 70C.
i)
Se prepara diluyente de la IPT (21,0 g de NaCl y 0,5 ml de Tween 20 se adicionan a 1 litro de 0,01 M
PBS, pH 7,2) y lquido de lavado (0,5 ml de Tween 20 se aaden a 1 litro de 0,01 M PBS, pH 7,2).
ii)
El suero problema se diluye 1/20 en el diluyente de la IPT y se extienden 150200 l sobre un

cubreobjetos fijado infectado con el virus o una cmara de un porta.
iii)
Se incuba el cubreobjetos en una cmara hmeda a 37C durante 30 minutos.
iv)
Se sumerge el cubreobjetos tres veces en lquido de lavado.
v)
Se extienden 150200 l de IgG anti-bovina marcada con peroxidasa (1/5000 en diluyente de la IPT)
sobre el cubreobjetos o sobre la cmara del porta.
vi)
Se incuba el cubreobjetos o el porta a 37C durante 30 minutos.
vii)
Se sumerge el cubreobjetos tres veces en lquido de lavado.
viii) Se diluye en sustrato AEC (3-amino-9-etilcarbazol) en agua destilada (5 ml de agua destilada, dos
gotas de tampn, dos gotas de perxido de hidrgeno y 3 gotas de AEC) y se aplica al cubreobjetos o
al porta.
c)
ix)
Se incuba en una cmara hmeda a 37C durante 810 minutos.
x)
Se sumerge el cubreobjetos en agua destilada, se seca al aire y se monta en un porta de cristal. Las
cmaras del porta compartimentalizado se examinan una vez secas.
xi)
El porta se examina al microscopio ptico. La presencia de un color rojizo-parduzco en el ncleo de

las clulas infectadas indica una reaccin positiva.
Neutralizacin vrica
Se han desarrollado pruebas para detectar anticuerpos dirigidos contra el AIHV-1 tanto en el reservorio
infectado de forma natural como en los hospedadores indicadores. La primera de stas es una prueba de
NV que emplea el virus libre de clulas de la cepa WC11 y la segunda prueba utiliza un aislado de antlope
(AIHV-2). AIHV-1 y AIHV-2 producen anticuerpos de reaccin cruzada y, por tanto, cualquiera de las cepas
puede utilizarse en los ensayos. Esta prueba es laboriosa, pero puede llevarse a cabo en placas de
microtitulacin con lneas celulares o clulas de un nmero bajo de pases. Las principales aplicaciones se
orientan al estudio del rango y extensin de la infeccin natural en las especies de vida salvaje, cautivas en
los zoolgicos y, en menor extensin, en las poblaciones de ovejas. Tambin es til en los intentos
dirigidos al desarrollo de vacunas que, en todos los casos, han tenido un xito muy limitado. Se pueden
inducir anticuerpos de NV de ttulo alto, pero, evidentemente, no son protectores.
620
El stock del AIHV-1 (cepa WC11) se replica en cultivos celulares primarios o secundarios de rin bovino,
tiroides bovino, testculo bovino a bajo pase u otro tipo de clulas permisivas. El virus se conserva en
alcuotas a 70C. El stock se titula para determinar la dilucin que d una 100 DICCT50 en 25 l bajo las
condiciones de prueba.
i)
Los sueros se inactivan durante 30 minutos a 56 C en un bao de agua.
ii)
Se realizan diluciones al doble de los sueros problema en el medio de cultivo celular desde 1/2 a 1/16
en una placa de microtitulacin para cultivo celular de 96 pocillos de fondo plano, utilizando cuatro
pocillos por cada dilucin y volmenes de 25 l por cada pocillo. En la prueba tambin se incluyen
sueros control positivo y negativo. No se dispone de sueros estndares, pero deberan prepararse
estndares internos positivos y titularse en un rango apropiado.
iii)
Se aaden 25 l por pocillo del stock del virus WC11 diluido en el medio de cultivo de modo que la
dilucin calculada proporcione 100 DICCT50 por pocillo.
iv)
Se incuban durante una hora a 37C. Tambin se incuba el stock vrico residual.
v)
Se vuelve a titular el virus residual en cuatro etapas de dilucin a la dcima, empleando 25 l por
pocillo y al menos cuatro pocillos por cada dilucin.
vi)
Se aaden 50 l por pocillo de suspensin celular de rin bovino a una densidad de 3 105
clulas/ml.
vii)
Las placas se incuban en atmsfera humedecida y CO2 a 37C durante 710 das.
viii) Las placas se examinan al microscopio para detectar posibles ECPs. Se valida la prueba
comprobando de nuevo la titulacin (que debera dar un valor de 100 DICCT50 con un rango
permisible 30300) y los sueros control. El suero estndar positivo debera dar un ttulo dentro de 0,3
log10 unidades de su media predeterminada.
d)
ix)
Los resultados del suero problema se determinan por el mtodo de SpearmanKrber como la
dilucin del suero que neutraliza al virus en el 50% de los pocillos.
x)
Un suero negativo no debera dar neutralizacin a la menor dilucin probada (1/2 equivalente a la
dilucin de 1/4 en la etapa de neutralizacin).
Enzimoinmunoensayo de inhibicin competitiva (CI-ELISA)

Primero se desarroll un CI-ELISA para detectar anticuerpos frente al OvHV-2 (9) que utiliza un MAb (15-A)
dirigido contra un eptopo presente en un complejo de glicoprotenas que parece estar conservado en
todos los virus de la FCM. El MAb se prepar contra el aislado Minnesota del virus, que es indistinguible de
la cepa WC11 del AIHV-1. La prueba se ha empleado para detectar anticuerpos en el suero de rumiantes
salvajes y domsticos en Norteamrica y se han detectado anticuerpos frente a los siguientes virus
patognicos: AlHV-1, AlHV-2, OvHV-2, CpHV-2 y el herpesvirus de origen desconocido que se observ que
causa la FCM clsica del ciervo de cola blanca, as como los virus del grupo de la FCM todava no
descritos como patognicos, tales como los del antlope del gnero Oryx, el buey almizclero (Ovibos
moschatus) y otros. Recientemente la prueba se ha remodelado para incrementar su sensibilidad (8). Este
cambio puede permitir la deteccin de anticuerpos de corderos recin infectados y de animales en la fase
aguda de la enfermedad, que a veces no se detectaban en el formato previo. El CI-ELISA tiene la ventaja
de ser ms rpido y presenta ms rendimiento que la prueba IFI o la IPT. Se dispondr de datos de
validacin adicionales cuando se extienda su uso a ms laboratorios en otras partes del mundo.
Se dispone comercialmente de un juego completo de reactivos para el CI-ELISA, incluyendo placas
prerrecubiertas, sueros control y anticuerpos marcados. Se da el siguiente protocolo para que los
laboratorios que lo deseen preparen sus propias placas antigenadas. Placas immuno 4 ELISA (Dynatech
Lab, Chantilly, Virginia) se cubren a 4C (39F) durante 1820 horas con 50 l de una solucin que
contenga 0,2 g de antgenos vricos semipurificados del la FCM (aislados Minnesota o WC11 del AlHV-1)
en 50 mM tampn carbonato/bicarbonato (pH 9,0). Las placas recubiertas se bloquean a temperatura
ambiente (2125C, 7077F) durante 2 horas con 0,05 M PBS que contiene sacarosa al 2%, 0,1 M glicina,
seroalbmina bovina al 0,5% y NaCl al 0,44% (pH 7,2). Despus del bloqueo, se vacan los pocillos y
seguidamente se secan las placas en un ambiente de baja humedad a 37C durante 18 horas, se
introducen en bolsas de plstico con desecante y se sellan y conservan a 4C (39F) (8). El MAb 15-A est
conjugado con peroxidasa de rbano picante por la empresa VMRD, que emplea un mtodo estndar con
periodato.
i)
Los controles positivos y negativos (suero o plasma) se diluyen 1/5 con tampn de dilucin (PBS que
contenga Tween 20 al 0,1%, pH 7,2).
621
ii)
Se aaden 50 l de muestras diluidas control o problema a una placa antigenada (cuatro pocillos para
el control negativo y dos pocillos para el control positivo). Se deja vaco el pocillo A1 como blanco
para el lector de placas.
iii)
Se cubre la placa con parafilm y se incuba durante 60 minutos a temperatura ambiente (2125C,
70 77F).
iv)
Mediante un frasco lavador, se lava la placa tres veces con tampn de lavado (el mismo que el
tampn de dilucin: PBS que contenga Tween 20 al 0,1%, pH 7,2).
v)
Se prepara en el momento el conjugado anticuerpo-peroxidasa 1 diluyendo una parte del conjugado

100 con 99 partes del tampn de dilucin.
vi)
Se adicionan 50 l del conjugado anticuerpo-peroxidasa a cada pocillo de muestra. Se cubre la placa

con parafilm y se incuba durante 60 minutos a temperatura ambiente (2125C, 7077F).
vii)
La placa se lava tres veces con tampn de lavado.
viii) A cada pocillo de muestra se adicionan 100 l de solucin de sustrato (TMB Microwell, BioFX
Laboratories, Owings Mills, Maryland). Se incuba durante 60 minutos a temperatura ambiente (21
25C; 7077F). No se elimina la solucin de los pocillos.
ix)
Se para la reaccin aadiendo 100 l de solucin de parada (0.18 M cido sulfrico) a cada pocillo.
No se elimina la solucin de los pocillos.
x)
Se leen las densidades pticas (OD) mediante un lector de placas de ELISA a 450 nm.
xi)
Se calcula el % de inhibicin:
100
OD de la muestra (Media) 100
= % de Inhibicin
OD media del control negativo

xii)
Interpretacin de los resultados: Si una muestra problema provoca una inhibicin igual o mayor del
25% se considerar positiva. Si una muestra problema provoca una inhibicin menor del 25% se
considerar negativa.
xiii) Validacin de la prueba: La OD media del control negativo debe caer entre los valores 0,40 y 2,10. La
media del control positivo debe producir una inhibicin mayor del 25%.
B2. Herpesvirus-2 ovino

Esta forma de la enfermedad, que se presenta en vacas y otras especies animales de todo el mundo,
normalmente aparece de foma espordica y afecta slo a uno o unos pocos animales. Sin embargo, de vez en
cuando, se producen incidentes en los que se ven afectados varios animales, lo que parece estar asociado con
ciertos rebaos de ovejas que pueden continuar transmitiendo la enfermedad durante unos cuantos aos.
Tambin se puede transmitir ms fcilmente la enfermedad al ciervo rojo (Cervus elaphus) y a otras especies de
ciervos, al bfalo de agua (Bubalus bubalis) e incluso con mayor facilidad al ciervo del Pre David (Elaphurus
davidianus) y a la vaca de Bali (Bos javanicus). El OvHV-2 tambin causa la FCM en colecciones zoolgicas en
las que la enfermedad se ha descrito en una variedad de especies entre las que se incluye la jirafa. Se ha
descrito la enfermedad en cerdos procedentes de varios pases, pero se reconoce con mayor frecuencia en
Noruega, donde regularmente se presentan casos que implican a diversos animales.
El diagnstico no puede basarse en los signos clnicos y en el examen patolgico global, ya que stos pueden
ser extremadamente variables. El examen histolgico de una variedad de tejidos incluye, con frecuencia, rin,
hgado, vejiga urinaria, epitelio bucal, crnea/conjuntiva y cerebro, y ha sido el nico mtodo para conseguir un
diagnstico ms acertado. Sin embargo, ahora tambin se puede tratar de detectar anticuerpos dirigidos frente
al virus y/o ADN vrico y esto se ha convertido rpidamente en el mtodo elegido.
Se debe enfatizar que la causa vrica de la SA-FCM no se ha aislado y que las evidencias del OvHV-2 se basan
en: (a) la presencia de anticuerpos en los sueros de todas las ovejas domsticas, que presentan reaccin
cruzada con los antgenos del AIHV-1 en la prueba IFI y en los de inmunoelectrotransferencia (5), pero no en los
de neutralizacin; (b) el desarrollo de anticuerpos que presentan reaccin cruzada con el AIHV-1 en la prueba
IFI en una proporcin de vacas con la SA-FCM y en todos los cricetos infectados de forma experimental; (c) la
deteccin y clonacin del ADN procedente de lneas celulares linfoblsticas derivadas de casos naturales de la
SA-FCM que hibrida de modo cruzado con el ADN del AIHV-1, pero que es distinto de l.
1.
Los intentos para recuperar el virus que causa la enfermedad a partir de casos clnicos han fallado
invariablemente. Sin embargo, existen varios informes sobre la recuperacin de diferentes agentes vricos
622
procedentes de casos clnicos, ninguno de los cuales ha establecido una relacin causal; su aislamiento por
supuesto es fortuito o debido a contaminacin de laboratorio; sin embargo, se han generado lneas celulares
linfoblsticas a partir de vacas y ciervos afectados, algunos de los cuales transmiten la enfermedad despus de
la inoculacin en animales de experimentacin (14). Tales lneas celulares contienen secuencias vricas que
hibridan con clones del ADN del AIHV-1 (3). Se han clonado diversos fragmentos vricos procedentes de una
librera genmica de una de tales lneas que ha sido objeto de caracterizacin posterior. Para la secuenciacin
se eligi un subcln que no hibridaba con el AIHV-1 y se descubri que codificaba una protena muy similar a la
protena del tegumento del virus EpsteinBarr. En esta secuencia se identificaron los cebadores adecuados
para ser utilizados en el ensayo de la PCR y se dise un protocolo sensible en el que se amplific inicialmente
un fragmento de 422 pares de bases (bp), seguido de la amplificacin de un fragmento interno truncado de 238
bp. Se ha demostrado que esta prueba es capaz de detectar tan slo 35 equivalentes del genoma vrico y que
no se amplifica el producto procedente del AIHV-1 o de otros herpesvirus bovinos (1). As, esta PCR se
considera muy especfica y sensible para el AIHV-2 y se emplea en todo el mundo en estudios de la enfermedad
de animales afectados clnicamente y del hospedador natural. Esta prueba est emergiendo como una prueba
firme que se puede emplear para detectar ADN vrico en leucocitos de sangre perifrica de animales afectados
clnicamente as como en tejidos frescos y muestras incluidas en parafina recogidas en examen post mortem.
Se ha informado acerca del uso de partculas magnticas para purificar el ADN antes de la amplificacin lo que
resulta en una mejora adicional de la prueba, pero todava se tiene que evaluar. Tambin se ha descrito un
ensayo de PCR fluorognico cuantitativo para el OvHV-2 (6) y es probable que en el futuro tenga valor para su
aplicacin.

La extraccin del ADN a partir de material clnico se lleva a cabo de acuerdo con el protocolo definido en
un kit de extraccin apropiado (p.ej. Quiagen DN easy Tissue Kit). Las reacciones de amplificacin se
realizan en volmenes de 50 l que contengan no ms de 2 g ADN problema en 10 mM Tris HCl, pH 8,3,
50 mM KCl, 2 mM MgCl2, gelatina al 0,01% (v/v), sulfuro de dimetilo al 10% (v/v), 200 m de dATP, dCTP,
dGTP y dTTP (Pharmacia), 1 M de cada cebador y 2 unidades de ADN-polimerasa Taq con 50 l de
aceite mineral (Sigma) para impedir la evaporacin.
El programa consiste en un preciclo a 99C durante 3 minutos, despus de el cual se aade la mezcla del
enzima y los dNTP. A esto le siguen 25 ciclos a 94C durante 20 segundos, a 60C durante 30 segundos y
a 72C durante 30 segundos. Una alcuota de 2 l del producto primario de amplificacin, especificado
mediante el par cebador 556/755, se transfiere directamente a una nueva mezcla de reaccin y se
amplifica empleando los pares de cebadores 556/555 bajo condiciones idnticas durante unos 25 ciclos
adicionales con una extensin final a 72C durante 5 minutos.
Los productos finales de la amplificacin (10 l) se analizan mediante electroforesis en gel de agarosa al
1,8% y fluorescencia con bromuro de etidio. Tambin se amplifican y analizan con cada lote de muestras
problema un control positivo conocido y agua destilada.
La oveja domstica es el hospedador natural del OvHV-2 y se ha demostrado que todos los animales estudiados
son seropositivos para el AIHV-1. Es ms, parece que algunos corderos se infectan en el tero, lo que hace muy
difcil su identificacin en los animales no infectados. Frecuentemente los corderos neonatales son la fuente de
infeccin, aunque las ovejas de cualquier edad pueden transmitir la enfermedad. Nunca se ha recuperado el
virus a partir de las ovejas, pero el ensayo de PCR desarrollado para detectar el ADN del OvHV-2 en casos
clnicos de FCM tambin se ha empleado para detectar el virus en los leucocitos de sangre perifrica de ovejas
adultas normales y en secreciones nasales y orofaringe de los corderos durante los primeros meses de vida. De
este modo, al igual que parece suceder en la infeccin de ues debida al AIHV-1, las ovejas se infectan con el
OvHV-2 cuando son jvenes y permanecen as infectadas de forma latente de por vida.
Hasta la fecha permanecen a nivel especulativo los factores que predisponen a los hospedadores susceptibles
para la propagacin y transmisin del virus de la FCM.
Adems de las ovejas, las cabras domsticas y otros miembros de la subamilia Caprinae presentan anticuerpos
que reaccionan frente al AIHV-1 de forma similar al suero de oveja. Esto implica que estas especies se infectan
con virus similares al OvHV-2 y se ha hallado que algunas cabras son positivas en un ensayo de PCR para el
OvHV-2, aunque no se conoce su papel potencial para causar la FCM.
2.
Pruebas serolgicas
Slo se han detectado anticuerpos dirigidos frente al OvHV-2 utilizando el AIHV-1 como fuente de antgeno. Los
anticuerpos frente al AIHV-1 se pueden detectar en el 7080% de las vacas afectadas clnicamente mediante
procedimientos IFI o IPT, pero en general no estn presentes en ciervos afectados o animales que desarrollan la
enfermedad en la modalidad aguda o peraguda. Los anticuerpos se detectan mediante una prueba IFI
623
empleando clulas de cultivo de tejidos infectados con el AIHV-1. Las monocapas celulares que crecen sobre
los cubreobjetos exhibiendo ECPs del orden del 1050% se recogen, se lavan, se fijan con acetona y se utilizan
en el ensayo. Los cubreobjetos se montan con DPX, con el lado que contiene las clulas hacia arriba, sobre
portas microscpicos y se tratan con suero normal de caballo al 10% antes de seguir con el procedimiento
convencional de la prueba IFI. El procedimiento de la IPT puede llevarse a cabo del mismo modo que en el caso
del AIHV-1. El nico virus de vaca del que se ha descrito que presenta reaccin cruzada con el AIHV-1 es el
herpesvirus bovino tipo 4 (BHV-4). As, el control negativo para esta prueba debera consistir en monocapas
infectadas con el BHV-4 de forma similar. Slo se considerarn positivos los sueros en el caso de que los focos
muestren una distribucin de antgeno intranuclear caracterstica con poco o ninguna tincin citoplsmica
detectada en las clulas infectadas por el AIHV-1 y ninguna reaccin en las clulas infectadas por el BHV-4. Los
sueros que reaccionen con los antgenos de ambos virus se considerarn como resultados no concluyentes. Se
ha desarrollado una tcnica CI-ELISA para detectar anticuerpos frente al OvHV-2 (9) que utiliza MAbs (15-A)
preparados contra el llamado aislado vrico Minnesota, que es indistinguible del AIHV-1. Se ha empleado esta
prueba para detectar anticuerpos en el suero de rumiantes salvajes y domsticos en Norteamrica y parece que
tiene algn xito. Sin embargo, se aprecia una escasa correlacin entre el desarrollo de anticuerpos detectados
en el suero de corderos y la adquisicin de infeccin con el OvHV-2, como parece indicar la presencia de ADN
vrico detectado por PCR, puesto que se detect resultado positivo slo en una parte de las ovejas. Esto
muestra un marcado contraste con otros estudios acerca del empleo de la prueba IFI que indican que la
mayora, sino todas las ovejas domsticas, son seropositivas. En un estudio realizado sobre la reaccin del
suero de oveja hacia las protenas estructurales del AIHV-1 en ensayos de inmunoelectrotransferencia, la
reactividad de los diferentes sueros vari considerablemente, lo que indica que las ovejas individuales
responden de modo diferente con respecto al reconocimiento, por parte de los anticuerpos, de los eptopos de
reaccin cruzada del AIHV.1. De modo que es probable que algunos resultados negativos obtenidos mediante
un CI-ELISA se deban a la extrema especificidad de eptopo de tal prueba basada en MAbs que fallan en
detectar anticuerpos en una proporcin de los sueros. Por tanto, se deberan interpretar con precaucin los
resultados de tales ensayos. Sin embargo, recientemente se ha descrito una prueba remodelada que puede
solventar el problema de la sensibilidad (8) y proporciona una mayor utilidad.
La tcnica CI-ELISA, como se describe en la Seccin B1.2.d, se ha utilizado con xito para detectar anticuerpos
contra el OvHV-2.
B3. Control
Hasta la fecha el control depende de la segregacin de los hospedadores naturales de las especies
susceptibles; el alcance de esa segregacin depende de cules sean las especies implicadas. En el caso del
AIHV-1, parece que los animales afectados por la FCM nunca, o raramente, transmiten la infeccin, puesto que
slo el hospedador natural puede actuar como fuente de infeccin. Aparentemente los ues son transmisores
eficaces de la infeccin de la mayora de las restantes categoras de rumiantes y que, por tanto, es importante
su separacin en el caso de poblaciones mixtas. Igualmente, los pastores deben asegurarse de que las vacas
estn completamente separadas de la zona de los ues y de los pastos recin utilizados por ellos, en particular
en la poca de partos de los ues.
En el caso del OvHV-2, el requisito de separar las ovejas depende de la susceptibilidad de las especies
implicadas. As, en el caso del ciervo del Pre David y la vaca de Bali, se debe asegurar una estricta separacin
y evitar el contacto a travs de los fomites. Igualmente, en el caso de los ciervos de granja se deben realizar
todos los esfuerzos razonables para independizar la gestin de las ovejas y los ciervos, aunque el gamo parece
ser ms resistente a la FCM. Slo en raras ocasiones las vacas desarrollan la SA-FCM, y por este motivo
generalmente se manejan junto con las ovejas sin tomar precauciones que impidan la transmisin de la
enfermedad. Sin embargo, si se producen casos mltiples, es esencial separar el rebao de ovejas tan lejos
como sea posible de las vacas. Como tales rebaos pueden continuar siendo fuentes de infeccin durante
algunos aos, se debera considerar la eliminacin de estos rebaos mediante su sacrificio.
Adicionalmente, la posibilidad de que puedan producirse periodos de incubacin muy largos, por encima de
9 meses, obliga a realizar un pronstico cauteloso en el caso de que se aconseje controlar tales brotes.

No se ha identificado un rgimen de vacunacin eficaz. Sin embargo, la mayora de las investigaciones emplean
aislados del AIHV-1 que se adaptan al cultivo de tejidos y que generalmente son avirulentos. Estudios recientes
de los cambios moleculares en el virus han mostrado que, en el curso de la adaptacin al cultivo in vitro, se
produce una delecin especfica en el ADN vrico que parece ser una constante entre los diferentes aislados
durante el proceso de atenuacin. As, se ha propuesto que este segmento deleccionado codifica un factor (es)
virulento(s). La omisin de este producto en las vacunas probadas previamente puede haber contribuido al
escaso xito de estos experimentos. Una secuencia homloga a esta delecin est presente tambin en el
OvHV-2, lo que sugiere que est conservada y, de este modo, proporciona un peso adicional a la hiptesis de
que puede tener un papel importante en la patognesis de la FCM (4).
624
Por tanto, las estrategias de vacunacin futuras deberan considerar la incorporacin de estos componentes
vricos que pueden proteger frente a ambas formas de la FCM.
REFERENCIAS
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*
* *
625
CAPTULO 2.3.15.
TRIPANOSOMOSIS
(TRANSMITIDA POR LA MOSCA TSETS)
RESUMEN
La tripanosomosis1 transmitida por la mosca tsets es una enfermedad compleja producida por
varias especies de protozoos parsitos del gnero Trypanosoma, transmitida cclicamente por el
gnero Glossina (mosca tsets). Esta enfermedad puede afectar a varias especies de mamferos
pero, desde el punto de vista econmico, la tripanosomosis trasmitida por la mosca tsets, es
especialmente importante en el ganado vacuno. Est producida principalmente por Trypanosoma
congolense, T. vivax y, en menor medida, por T. brucei brucei.
Identificacin del agente: Se pueden utilizar varias tcnicas de deteccin de parsitos,
incluyendo el examen microscpico de extensiones gruesas o finas de sangre fresca y teida. La
sensibilidad diagnstica aumenta de forma significativa concentrando los parsitos antes de
examinarlos, en combinacin con el uso de un microscopio de contraste de fases o de campo
oscuro. Las tcnicas de concentracin de parsitos tienen la ventaja aadida de que el
hematocrito, y por tanto el nivel de anemia, se puede determinar a nivel de animales individuales
y/o a nivel de manada. Una prueba muy sensible, utilizada sobre bases ms experimentales, es la
reaccin en cadena de la polimerasa.
Pruebas serolgicas: Dos pruebas de deteccin de anticuerpos tripanosomiales, la prueba de
inmunofluorescencia indirecta y la deteccin de anticuerpos por enzimoinmunoensayo (ELISA), se
utilizan de manera rutinaria para la deteccin de anticuerpos en el ganado bovino. Presentan una
alta sensibilidad y especificidad pero slo se pueden utilizar para el diagnstico preliminar de la
tripanosomosis. En particular, el ELISA para deteccin de anticuerpos, se presta a la
automatizacin y permite un alto grado de estandarizacin cuando se han desarrollado y validado
antgenos recombinantes.
Requisitos para las vacunas y los materiales de diagnstico: En la actualidad no se utilizan
productos biolgicos.
A. INTRODUCCIN
La tripanosomosis transmitida por la mosca tsets es una enfermedad compleja producida por varias
especies de protozoos parsitos del gnero Trypanosoma, transmitida cclicamente por el gnero Glossina
(mosca tsets). La mosca tsets ocupa 10 millones de kilmetros cuadrados y afecta a 37 pases,
fundamentalmente en frica. La enfermedad afecta a varias especies de mamferos pero, desde el punto de vista
econmico, la tripanosomosis transmitida por la tsets es particularmente importante en el ganado vacuno (en
frica del Sur se refieren a ella como nagana o enfermedad de la mosca tsets). Est causada
fundamentalmente por Trypanosoma congolense, T. vivax y, en menor grado, T. brucei brucei. Trypanosoma
uniforme, T. simiae y T. suis son otras especies menos comunes transmitidas por la mosca tsets.
Trypanosoma vivax tambin se transmite mecnicamente por moscas picadoras, como lo pone de manifiesto su
presencia en Amrica del Sur y Central. La tripanosomosis transmitida por la mosca tsets tambin afecta a los
humanos, produciendo la enfermedad del sueo, por infeccin tanto por T. brucei gambiense como por T. brucei
rhodesiense.
1
626
Nota sobre la nomenclatura de enfermedades por parsitos:

La Asociacin Mundial para los avances en Parasitologa Veterinaria ha recomendado una nomenclatura estandarizada
en "Standardised Nomenclature of Animal Parasitic Diseases" (Kassai, T., Cordero del Campillo M., Euzeby J., Gaafar
S., Hiepe Th. & Himonas C.A. [1988]. Vet Parasitol., 29, 299326). En principio, el nombre de la enfermedad se
construye aadiendo el sufijo "osis" a la raiz del nombre de la taxonoma del parsito. En este Manual se ha seguido
esta terminologa, y "trypanosomosis" reemplaza por tanto al trmino antiguo "trypanosomiasis".
Captulo 2.3.15. Tripanosomosis (transmitida por la mosca tsets)
Los sntomas clnicos de la tripanosomis transmitida por tsets pueden incluir fiebre intermitente, edema, aborto
y extenuacin. La anemia se desarrolla generalmente en animales afectados y es seguida por prdida de peso
corporal, produccin reducida y a menudo mortalidad. Los sntomas postmorten incluyen adelgazamiento,
infarto ganglionar, hgado y bazo inflamados, lquido excesivo en las cavidades del cuerpo, y hemorragias
petequiales. En los animales muertos durante la fase crnica de la enfermedad, los rganos linfticos
generalmente ya no estn inflamados y es comn encontrar miocarditis grave. Ni los sntomas clnicos ni los
postmorten de la tripanosomosis transmitida por la mosca tsets son patognomnicos. Por tanto, el
diagnstico debe hacerse con tcnicas directas que confirmen la presencia de tripanosomas bien por
visualizacin microscpica, o por tcnicas serolgicas indirectas o por la reaccin en cadena de la polimerasa
(PCR).
Existen una gran variedad de pruebas de diagnstico (25) y los investigadores tratan an de mejorar las
existentes y de desarrollar nuevas pruebas. Las pruebas de diagnstico usuales varan en sensibilidad y
especificidad, comodidad de aplicacin y coste (23). La eleccin de una prueba en particular se guiar por
principios econmicos y la disponibilidad de expertos, pero especialmente por las necesidades del diagnstico.
Por ejemplo, se aplican diferentes grados de sensibilidad y especificidad para la confirmacin de la infeccin en
un animal individual en comparacin con la deteccin de la infeccin a nivel de manada. De forma similar, la
prueba(s) de diagnstico para establecer la prevalencia parasicolgica de tripanosomosis es diferente de la
requerida para establecer la presencia o ausencia de la enfermedad en la zona. Se pueden conseguir
diagnsticos fiables combinando pruebas diagnsticas apropiadas. La interpretacin fiable de los resultados de
pruebas diagnsticas depender de la validez de las pruebas as como de la seleccin/recogida apropiada de la
muestra, el tamao de la muestra, y la forma de realizar las pruebas diagnsticas.
1.
Las tcnicas de deteccin de parsitos son muy especficas, pero su sensibilidad es relativamente baja (es decir,
la proporcin de resultados negativos falsos es alta). La sensibilidad es especialmente baja cuando se
consideran los resultados a nivel de animal individual ms que a nivel de manada. Debido a su baja sensibilidad,
la prevalencia parasitolgica aparente de la tripanosomosis es generamente ms baja que la prevalencia
parasitolgica verdadera. La baja sensibilidad diagnstica hace que sea difcil detectar tripanosomosis cuando
est presente con baja prevalencia parasitolgica, y es imposible establecer la ausencia de la enfermedad con
un grado alto de seguridad. Adems, en las reas donde se usan ampliamente frmacos tripanosomicidas, los
parsitos no pueden ser detectados.
Existen varias tcnicas de deteccin de parsitos, cada una con una sensibilidad distinta. La eleccin depender
de las instalaciones de laboratorio disponibles y del objetivo del diagnstico.
Tcnicas de examen directo
Las tcnicas ms simples son el examen de extensiones de sangre fresca, gruesas o finas, obtenidas
generalmente de la vena de la oreja, vena yugular o vena de la cola. Entre las tcnicas directas de examen, las
extensiones finas de sangre teida se consideran ms especficas pero menos sensibles que las otras dos. La
especificidad y la sensibilidad real de estas tcnicas es directamente dependiente del volumen de sangre
realmente examinado y de la destreza y experiencia del microscopista.
a)
Extensiones de sangre fresca

Se realizan colocando una gota de sangre (alrededor de 2 l) sobre una porta limpio de microscopio y se
cubre con un cubreobjetos (22x22 mm). La sangre se examina microscpicamente a un aumento total de
x400 con apertura de condensador, contraste de fase o contraste de interferencia. Se examinan
aproximadamente 50100 campos. Se puede reconocer a los tripanosomas por su movimiento entre los
eritrocitos (RBCs).
El mtodo es simple, barato y da resultados inmediatos. Dependiendo del tamao del tripanosoma y de los
movimientos, se puede hacer un diagnstico preliminar de la especie de tripanosoma. La confirmacin final
de la especie se hace mediante el examen de la preparacin teida.
La sensibilidad diagnstica del mtodo es generalmente baja, pero depende de la experiencia del
examinador y del nivel de parasitemia. Se puede mejorar la sensibilidad de forma notable lisando los RBCs
antes del examen utilizando un agente hemoltico como dodecil sulfato sdico (SDS).
627
b)
Extensiones gruesas de sangre

Se hacen colocando una gota de sangre (510l) sobre una porta limpio de microscopio y extendindola
sobre un rea de 2 cm de dimetro, aproximadamente, utilizando el borde de otro porta. El grosor de la gota
resultante debe ser tal que, cuando se seque, se puedan leer a travs de ella los nmeros de la esfera de
un reloj de pulsera. La gota se seca complemente agitndola rpidamente en el aire y, sin fijacin, se
deshemoglobiniza por inmersin en agua destilada durante unos pocos segundos y se seca antes de
teirla. Se debera guardar el frotis, seco y protegido del polvo, calor, moscas y otros insectos.
Se tie durante 30 minutos con colorante Giemsa diluido al 4% en solucin salina tamponada con fosfato,
pH 7.2. El tiempo de tincin y la dilucin del colorante pueden variar segn el colorante y la tcnica
individual. Por consiguiente, es importante comenzar con las instrucciones del fabricante y variar el tiempo
de tincin y la concentracin de la tincin hasta obtener los resultados ptimos. El frotis teido se lava con
agua tamponada y se examina con un aumento total de x500 a x1000.
El mtodo es simple y relativamente barato, pero los resultados son lentos debido al proceso de tincin. Los
tripanosomas se reconocen fcilmente por su morfologa general, pero pueden resultar daados durante el
proceso de tincin. Esto puede hacer difcil la identificacin de la especie.
c)
Extensiones finas de frotis de sangre

Los frotis finos de sangre se hacen colocando una gotita de sangre (alrededor de 5 l), por ejemplo, desde
un tubo capilar para microhematocrito, sobre un porta de microscopio limpio aproximadamente a 20 mm
desde un extremo (dejando espacio para aplicar el frotis grueso) y extendindolo con el borde de otro porta.
Este porta se coloca en un ngulo de aproximadamente 30 con el primer porta y se mueve para hacer
contacto con la gota de sangre. Se deja que la sangre corra a lo largo del borde del porta extensor, que se
empuja hacia el otro extremo del porta con un movimiento bastante rpido pero suave. Si se utiliza la
cantidad correcta de sangre, el porta debera cubrirse con una extensin de sangre uniforme antes de
alcanzar el extremo del porta. Idealmente, deberan prepararse gotas finas de forma que los RBCs estn
juntos pero que no se solapen. El porta se seca rpidamente agitndolo en el aire y se protege del polvo,
moscas y otros insectos. El porta se fija durante 3 minutos en metanol, y se tie como en los frotis gruesos
de sangre. Despus de la tincin, el porta se lava suavemente con agua corriente y se deja secar. Una
variacin de este mtodo es fijar en metanol durante 2 minutos, aplicar colorante MayGrnwald durante
2 minutos, y despus aadir un volumen igual de agua tamponada, pH 7,2, dejarla 8 minutos y dejar
escurrir. Se examinan aproximadamente 50100 campos del frotis fino teido, con una lente de objetivo de
aceite de inmersin de x50 o x100, antes de considerar que la muestra es negativa. Incluso despus de
haber detectado un tripanosoma, se investigan aproximadamente 20 campos adicionales para determinar
si est presente ms de una especie.
La tcnica descrita anteriormente puede utilizarse para muestras de biopsia de la linfa obtenidas de
ganglios linfticos, despus de una puncin.
Generalmente, se prepara un frotis grueso y fino de la misma muestra. Los frotis gruesos contienen ms
sangre que los finos y, por tanto, tienen una sensibilidad diagnstica mayor. Los frotis finos, por otra parte,
permiten la identificacin de la especie de Trypanosoma. Las especies de tripanosoma se pueden
identificar mediante las siguientes caractersticas morfolgicas:
Trypanosoma vivax: 2027 m de largo, membrana ondulante no evidente, flagelos libres presentes en el
extremo anterior, extremo posterior redondeado, cinetoplasto grande y terminal.
Trypanosoma brucei es una especie de tripanosoma polimrfico. Se pueden distinguir dos formas
diferentes, es decir, una forma larga fina y una forma corta gruesa. A menudo, se observan formas
intermedias con caractersticas tanto de formas finas como gruesas. El citoplasma en muestras teidas
contiene a menudo grnulos basflos.
Trypanosoma brucei (forma larga fina): 1722 m de largo y alrededor de 2,8 m de ancho,
membrana ondulante llamativa, flagelo libre presente en el extremo anterior, extremo posterior en
punta, cinetoplasto pequeo y subterminal.
Trypanosoma brucei (forma corta gruesa): 1722 m de largo y alrededor de 3,5 m de ancho,
membrana ondulante llamativa, sin flagelo libre, extremo posterior en punta, cinetoplasto pequeo y
subterminal.
Trypanosoma congolense: 825 m (especie pequea), membrana ondulante no evidente, sin flagelo libre,
extremo posterior redondeado, cinetoplasto de tamao mediano y terminal, a menudo situado lateralmente.
Aunque se considera que T. congolense es monomrfico, a veces se observa un grado de variacin
morfolgica. Dentro de T. congolense, hay diferentes tipos o subgrupos (savannah, forest, kilifi, tsavo) que
tienen diferente patogenicidad (2). Sin embargo, estos tipos se pueden distinguir solamente utilizando PCR.
628
Trypanosoma theileri: (especie grande), tpicamente 6070 m, pero los organismos individuales oscilan
entre 19 y 120 m (16, 20), la membrana ondulante es llamativa, tiene flagelo largo libre, extremo posterior
en punta, el cinetoplasto es grande y situado cerca del ncleo y en posicin marginal. Normalmente el
Trypanosoma theileri no es patgeno, pero su presencia puede confundir el diagnstico parasitolgico. En
Europa del Oeste T. theleiri es la nica especie de tripanosoma que se presenta en el ganado vacuno.
Tcnicas de concentracin de parsitos
La probabilidad de detectar tripanosomas en una muestra de un animal infectado depende en gran medida de la
cantidad de sangre examinada y del nivel de parasitemia. La cantidad de sangre examinada con tcnicas de
anlisis directo es baja y los parsitos a menudo son muy escasos en la sangre de un animal infectado. Estos
dos factores contribuyen a la baja sensibilidad de las tcnicas de anlisis directo. Se puede mejorar la
sensibilidad aumentando el volumen examinado de sangre y mediante la concentracin de tripanosomas.
a)
Tcnica de centrifugacin del microhematocrito (mtodo de Woo)

La tcnica de centrifugacin del hematocrito, o el mtodo de Woo (28), se utiliza mucho para el diagnstico
de tripanosomosis animal. Se basa en la separacin de los diferentes componentes de la muestra de
sangre dependiendo de su gravedad especfica. El mtodo es de la siguiente forma:
i)
Se recoge sangre fresca generalmente de la vena de la oreja (alrededor 70 l) en tubos capilares

heparinizados (75 x 1,5 mm).
ii)
Un extremo del tubo capilar se sella con pegamento o mediante calentamiento, asegurndose de que
la columna de sangre no se carbonice por la llama.
iii)
Los tubos capilares sellados se colocan en una centrfuga para microhematocrito con los bordes
sellados apuntando hacia el exterior. Para asegurar un buen equilibrio, los tubos se cargan
simtricamente.
iv)
Se cierra la cubierta del rotor y se cierra la tapadera de la centrfuga.
v)
Los tubos capilares se centrifugan a 9.000 g durante 5 minutos.
vi)
Se prepara un tubo portador de un portaobjetos sobre el que se han fijado dos piezas de vidrio de 25 x
10 x 1,2 mm, separados 1,5 mm, para formar una ranura.
vii)
El tubo se coloca en la ranura, se pone un cubre en la parte superior y la interfase se llena de agua.
viii) Se examina la interfase celular plasma/leucocitos (capa leucoctica) girando el tubo lentamente. El
movimiento del tripanosoma se puede detectar primero utilizando las lentes de objetivo x10 con una
apertura reducida del condensador; los tripanosomas pueden verse ms claramente utilizando las
lentes objetivo x40 preferiblemente a una distancia larga de trabajo para permitir una adecuada
profundidad de foco a travs del tubo capilar.
La tcnica de centrifugacin del microhematocrito es ms sensible que las tcnicas de examen directo (15).
En el caso de las infecciones de T. vivax, la sensibilidad de los mtodos Woo se acerca al 100% cuando la
parasitemia es >700 tripanosomas/ml de sangre. La sensibilidad se reduce hasta 50% cuando la
parasitemia vara entre 60 y 300 tripanosomas/ml de sangre. Los tripanosomas se vuelven ms difciles de
detectar cuando la parasitemia es menor de 60 tripanosomas/ml de sangre (8). La identificacin de las
especies de tripanosomas es difcil. Como la gravedad especfica de T. congolense es similar a la de los
RBCs, los parsitos a menudo se encuentran bajo la capa leucoctica en la capa de RBCs. Para mejorar la
separacin de RBCs y parsitos, y aumentar la sensibilidad para T. congolense, se puede aumentar la
gravedad especfica de RBCs mediante la adicin de glicerol.
Una modificacin del mtodo de Woo es el mtodo de la capa leucoctica cuantitativa (QBC) (1). El mtodo
se ha usado para el diagnstico de las infecciones de T.b.gambiense. El mtodo es probablemente
demasiado caro para el uso rutinario a gran escala en inspecciones de tripanosomosis animal.
b)
Tcnica de la capa leucoctica en campo oscuro/contraste de fase

La tcnica de la capa leucoctica o mtodo de Murray (21) representa una tcnica mejorada para la
deteccin de tripanosomas y se usa ampliamente. Se lleva a cabo siguiendo los pasos i) a v) anteriores,
despus de los cuales se corta el tubo capilar, con un lapicero con punta de diamante, 1 mm por debajo de
la capa leucoctica, para incluir la capa superior de RBCs. La capa leucoctica y la capa superior de RBCs
se extraen sobre un porta limpio de microscopio y se cubren con un cubreobjetos (22 x 22 mm). Se
examinan aproximadamente 200 campos de la preparacin para detectar la presencia de tripanosomas
629
mviles con un microscopio de campo oscuro o de contraste de fase con una lente objetivo x40. Las
especies de tripanosoma se pueden identificar con referencia a los siguientes criterios:
Trypanosoma vivax: Grande, extremadamente activo, atraviesa el campo completo muy rpidamente,
detenindose ocasionalmente.
Trypanosoma brucei: Varios tamaos, movimiento rpido en reas limitadas.
Trypanosoma congolense: Pequeo, lento, se adhiere a los RBCs por el extremo anterior.
Trypanosoma theileri: Ms del doble del tamao de los tripanosomas patgenos, tiende a rotar.
Igual que con la tcnica de centrifugacin del microhematocrito, la tcnica de la capa leucoctica es ms
sensible que las tcnicas directas de examen. La sensibilidad del mtodo de la capa leucoctica se puede
mejorar utilizando la tcnica de la centrifugacin doble de la capa leucoctica (15). Se centrifuga una
cantidad total de 1.5002.000 l de sangre, despus de lo cual se aspira la capa leucoctica en un tubo
capilar de microhematocrito y se centrifuga de nuevo. Se examina la capa leucoctica. Comparada con la
tcnica de la centrifugacin del microhematocrito, la tcnica de la capa leucoctica tiene la ventaja aadida
de que las preparaciones se pueden fijar y teir para una identificacin ms precisa de especies y
mantener como un registro permanente.
Tanto la centrifugacin del microhematocrito como las tcnicas de la capa leucoctica dan resultados
directos y pueden utilizarse para investigar grandes nmeros de animales. Requieren equipo especializado
y suministro de electricidad, lo que hace la prueba ms cara en comparacin con el examen de la extensin
de sangre fresca. Sin embargo, esto se compensa con el aumento en la sensibilidad. Ambas tcnicas de
deteccin de parsitos descansan en la deteccin de tripanosomas mviles y vivos. Debido a que los
tripanosomas pueden perder su vigor y morir bastante rpidamente una vez que se extrae la muestra de
sangre, las muestras recogidas en tubos capilares deberan enfriarse inmediatamente y no dejar que se
sobrecalienten en la centrfuga para microhematocrito o en la fase de microscopio. Las muestras deberan
examinarse tan pronto como se pueda despus de recogerlas, preferiblemente en las dos horas siguientes.
La centrifugacin del microhematocrito y las tcnicas de la capa leucoctica son especialmente tiles porque
se puede evaluar el hematocrito (PCV) a la misma vez. Para determinar el PCV despus de la
centrifugacin, el tubo capilar del microhematocrito (conteniendo sangre de la vena de la oreja o de la
yugular) se coloca en un lector de hematocrito. La longitud de la columna del concentrado de eritrocitos se
expresa como un porcentaje del volumen total de sangre. Es til medir el PCV para determinar el grado de
anemia. La anemia puede ser causada por factores diferentes de la tripanosomosis transmitida por mosca
tsets. Permanece, sin embargo, como uno de los indicadores ms importantes de tripanosomosis en el
ganado vacuno. Como la tripanosomosis es un problema de manada, el perfil de PCV de una manada est
influido por el nmero de animales infectados con tripanosomosis y puede utilizarse para indicar diferencias
en el desafo de la enfermedad. El PCV medio est tambin influido por la edad y el nivel de susceptibilidad
gentica del ganado vacuno.
c)
Intercambio de aniones
La tcnica de cromatografa de intercambio aninico a microescala (mAECT) se utiliza ampliamente para
el diagnstico en humanos de la enfermedad del sueo producida por T.b. gambiense (18). La sangre se
pasa a travs de una columna de dietil aminoetil (DEAE)celulosa equilibrada con una solucin salina
tamponada con fosfato (PBS) de una fuerza inica ajustada a la sangre de la especie examinada de animal.
Como las RBCs estn cargadas ms negativamente que los tripanosomas, se mantienen en la columna y
los tripanosomas pasan a travs con el eludo, que se recoge, se centrifuga para concentrar los
tripanosomas y se examina al microscopio.
Se pueden examinar grandes volmenes de sangre de cada animal y por tanto, el mtodo tiene una alta
sensibilidad. Sin embargo, la tcnica es lenta y no es adecuada para el examen de un gran nmero de
animales.
d)
Cultivo invitro
Se ha descrito un procedimiento para el cultivo invitro de T. brucei, pero durante muchos aos el xito ha
sido irregular. Adems, el mtodo necesita un equipamiento sofisticado, produce resultados despus de un
considerable retraso y no es ciertamente adecuado para su uso a gran escala. Un equipo (KIVI) para el
aislamiento invitro de tripanosomas ha demostrado ser prometedor en el aislamiento y amplificacin de
todas las especies de T. brucei en humanos, animales domsticos y de juego (26). El valor de la prueba en
el aislamiento de T.congolense y T. vivax es an desconocido. Como se basa en el cultivo de formas
procclicas de tripanosomas, no es posible la diferenciacin de especies (14).
630
Inoculacin en animales
La subinoculacin de sangre en roedores, generalmente ratones o ratas, es particularmente til para revelar
infecciones subclnicas. Los animales de laboratorio se inyectan intraperitonealmente con 0,25 ml (dependiendo
del tamao del roedor) de sangre recogida recientemente. La inmunosupresin artificial de animales receptores
por irradiacin o tratamiento farmacolgico aumentar de forma importante las oportunidades de aislamiento del
parsito. Se sangran tres veces a la semana durante al menos 2 meses. La sangre recogida se examina
mediante el mtodo de la extensin en fresco.
La inoculacin en animales es ms sensible que el examen directo de extensiones en fresco. Sin embargo, el
mtodo no es prctico; es caro y el diagnstico no es inmediato. El mtodo es muy sensible para detectar las
infecciones de T.b.brucei. Sin embargo, algunas cepas de T. congolense no se transmiten fcilmente y T. vivax
raramente infecta a roedores de laboratorio. Tambin debera evitarse la inoculacin animal ya que perturba
gravemente al bienestar animal.
Prueba para detectar antgeno tripanosomal
Se ha descrito un enzimoinmunoensayo (ELISA) de deteccin del antgeno para tripanosomosis (22). Las
evaluaciones de campo de la prueba no han dando resultados repetitivos (5). Por consiguiente, se necesita
trabajo adicional para descubrir y superar la causa de estas inconsistencias antes de que la prueba pueda
utilizarse en el diagnstico rutinario de tripanosomosis.
Pruebas de amplificacin de ADN
Se ha desarrollado un mtodo PCR como un instrumento para el diagnstico de infecciones con tripanosomas
africanos en humanos y en animales, as como en moscas tsets. Se puede amplificar secuencia de ADN
nuclear repetitivo y especfico para T. vivax y tres tipos de T. congolense (4, 6, 19); sin embargo, los cebadores
actuales para T. vivax parecen no ser capaces de amplificar algunos genotipos dentro de esta especie. Existe un
conjunto de cebadores genricos para la deteccin de las tres subespecies de T. brucei. Los conjuntos de
cebadores disponibles para los diferentes subgneros de tripanosoma, especies y tipos son los
siguientes: T. brucei subgenus TBR1 y TBR2; T. congolense (tipo savannah) TCN1 y TCN2; T. congolense
(tipo forest) TCF1 y TCF2; T. congolense (tipo Kenya coast) TCK1 y TCK2; y T. vivax TVW1 y TVW2.
Recientemente se han desarrollado pruebas de PCR de fragmentos polimrficos de restriccin (RFLP) que
permiten la identificacin de todas las especies de Trypanosoma como infecciones simples o mixtas utilizando
una nica prueba (3, 7, 9).
Las amplificaciones de PCR estndar se llevan a cabo en una mezcla de reaccin que contiene Tris/HCl, MgCl2,
KCl, cada uno de los cuatro trifosfatos de deoxyribonucletico, cebadores, ADN molde y ADN polimerasa Taq.
Las muestras se incuban durante varios ciclos a diversas temperaturas. Los productos de la PCR se someten a
electroforesis en agarosa. Los geles se tien con bromuro de etidio.
El procedimiento es extremadamente sensible, pero pueden producirse resultados positivos falsos como
consecuencia de contaminacin de las muestras con otro ADN. La prueba requiere equipo especializado y
personal muy entrenado, de forma que no es adecuada para utilizacin en muchos laboratorios. Pueden
producirse resultados negativos falsos cuando la parasitemia es muy baja (< 1 tripanosoma/ml de sangre), lo que
sucede con frecuencia en infecciones crnicas; tambin pueden producirse cuando la especificidad de los
cebadores es demasiado alta, de forma que no se reconozcan todos los aislados de una especie particular de
tripanosoma. La recogida de muestras se ha simplificado adaptando la prueba mediante la utilizacin de sangre
o capa leucoctica depositada sobre papel de filtro (9, 12). Se puede procesar un gran nmero de muestras a la
vez, lo que la convierte en potencialmente adecuada para reconocimientos a gran escala. Sin embargo, por el
momento, el coste de los anlisis por PCR es prohibitivo para la utilizacin rutinaria de la prueba.
2.
Pruebas serolgicas
Se han desarrollado varias tcnicas de deteccin de anticuerpos para detectar anticuerpos tripanosomales para
el diagnstico de tripanosomosis animal, con sensibilidad y especificidad variable. Los mtodos preferidos son la
prueba de inmunofluorescencia indirecta (IFAT) (13) y el ELISA para deteccin de anticuerpos tripanosomales
(11, 17). La identificacin de los principales antgenos de tripanosomas, y su produccin como molculas
recombinantes o pptidos sintticos, conduce actualmente al desarrollo y validacin de nuevas pruebas basadas
en el empleo de molculas definidas. Por tanto, en un futuro prximo, podra mejorarse la especificidad de las
pruebas serolgicas hasta permitir la deteccin de anticuerpos especficos de especie, y alcanzar un alto nivel de
estandarizacin que no se logra actualmente mediante la utilizacin de extractos totales de parsitos.
631
a)

El mtodo original de esta prueba (27) ha sido reemplazado por una nueva tcnica para la preparacin de
antgenos de tripanosomas (13), que implica la fijacin de tripanosomas vivos utilizando una mezcla de 80%
de acetona fra y 0,25% formalina en solucin salina normal.
i)
Preparar frotis finos de sangre con una gran parasitemia o de una suspensin de tripanosomas. Secar
al aire y fijar en acetona durante 5 minutos.
ii)
Marcar crculos de 5 mm de dimetro sobre portas de vidrio utilizando laca de uas.
iii)
Utilizando una pipeta, colocar un suero problema, diluido al 1/40, en cada crculo, asegurndose de
que el rea en cada crculo est completamente cubierta.
iv)
Incubar la preparacin de suero problema/antgeno a 37C durante 30 minutos en cmara hmeda.
v)
Lavar la preparacin tres veces en PBS durante 5 minutos cada vez a 4C, con agitacin suave. Secar
los portas al aire.
vi)
Aplicar conjugado: IgG antibovina de conejo o de cabra

conjugada con isotiocianato de fluorescena.
vii)
Incubar y lavar como anteriormente. Escurrir en agua destilada. Secar los portas al aire.
(para pruebas con sueros bovinos)
viii) Montar los portas en PBS o glicerol tamponado y examinar la fluorescencia.
b)
Enzimoinmunoensayo de deteccin de anticuerpos

El ELISA original para anticuerpos (17) se ha desarrollado ms recientemente para su utilizacin en
experimentos a gran escala con tripanosomosis bovina (11). Se han desarrollado ELISAs utilizando placas
de microtitulacin preantigenizadas con T. congolense o T. vivax que presentan la ventaja de que se utiliza
un antgeno desnaturalizado estandarizado, y que se pueden almacenar durante largos periodos a
temperatura ambiente (24).
El antgeno estndar para las pruebas de anticuerpos de tripanosomosis se deriva de tripanosomas
tomados del torrente circulatorio. Los antgenos se preparan de una fraccin soluble de tripanosomas
purificada por cromatografa de parsitos de sangre entera de ratas infectadas por medio de intercambio
aninico en DEAE, lisados mediante ciclos de congelacindescongelacin y por centrifugacin a 10.000 g
durante 30 minutos. Tambin se pueden utilizar antgenos obtenidos de formas de tripanosoma procclico
propagados invitro (10).
Para el anlisis de muestras de sangre recogidas sobre papel de filtro se han adaptado tanto el IFAT como
el ELISA de deteccin de anticuerpos. La sangre contenida en un tubo capilar de centrifuga de
microhematocrito heparinizado se deposita sobre un papel de filtro (Whatman No. 4). Las muestras se
secan al aire protegidas de la luz solar y se colocan en una bolsa de plstico con desecador de gel de slice
con un auto indicador. La bolsa se cierra y debera mantenerse tan fra como sea posible hasta que las
muestras se refrigeren o congelen.
Cada microplaca ELISA se realiza con sueros de referencia fuertemente positivos, dbilmente positivos y
negativos, que se requieren para cumplir con los valores predeterminados para asegurar la calidad de la
prueba. La absorbancia de cada muestra probada por ELISA se expresa como un porcentaje (positividad
del porcentaje, PP) del estndar de referencia fuertemente positivo (29). Los resultados son, por tanto,
cuantificables. El valor lmite se determina utilizando muestras de campo positivas y negativas conocidas
(5).
Ambas pruebas de deteccin de anticuerpos tienen alta sensibilidad y especificidad altas. Su especificidad
de especie es baja generalmente. Detectan respuestas inmunes a infecciones actuales y pasadas y
pueden, consecuentemente, proporcionar solamente un diagnstico preliminar de infeccin activa.
El inmunodiagnstico necesita un equipo caro y sofisticado y experiencia, lo que no est siempre
disponible. Ha de llevarse a cabo en laboratorios especializados y hay un retraso sustancial entre el
muestreo real y la disponibilidad de los resultados. Sin embargo, el ELISA para anticuerpos se presta a un
alto grado de automatizacin y estandarizacin. La recogida y el almacenamiento de muestras se llevan a
cabo fcilmente mediante el uso de papeles de filtro. Todos estos factores hacen del ELISA para
anticuerpos una prueba muy til en mediciones a gran escala para determinar la distribucin de
tripanosomosis transmitida por la tsets.
632

En la actualidad no se utilizan productos biolgicos.
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of enzymelinked immunosorbent assay techniques for the detection of antibody in infectious disease
*
* *
N.B. Hay un laboratorio de referencia de la OIE para Trypanosomosis (transmitida por tsets) (ver Cuadro en la
Parte 3 de este Manual de animales terrestres o consultar el sitio Web de la OIE para una lista ms actualizada:
www.oie.int).
634

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Dentro de su mandato, sujeto al Acuerdo SPS con la OMC, salvaguardar el comercio

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LISTADO DE ENFERMEDADES DE LA OIE

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ENFERMEDADES DE ESPECIES MLTIPLES- LISTA B

ENFERMEDADES BOVINAS- LISTA B

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Estructura del Manual de animales terrestres y sistema de numeracin

Formato de los captulos

Explicacin de las pruebas descritas y del cuadro de las pginas xiiixvi

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Lista de laboratorios de referencia de la OIE

Manual de la OIE sobre animales terrestres 2004

LISTA DE PRUEBAS PARA EL COMERCIO

Enfermedad vesicular porcina

Peste de los pequeos rumiantes

Pleuroneumona bovina contagiosa

Dermatosis nodular contagiosa

Fiebre del Valle del Rift

HI, ELISA, PRN

Id. agente, IGDA,

Viruela ovina y viruela caprina

Peste equina africana

Peste porcina africana

Peste porcina clsica (clera del cerdo)

NPLA, FAVN, ELISA

Gripe aviar muy virulenta

Paratuberculosis (enfermedad de Johne

Larva perforada del Nuevo Mundo

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Lista de pruebas para el comercio internacional

Campilobacteriosis genital bovina

Leucosis bovina enzotica

Rinotraqueitis bovina infecciosa

NV, ELISA, Id. agente

FC, Agg. card

Id. agente, IFI

Encefalopata espongiforme bovina

Fiebre catarral maligna

NV, IFI, PCR

Tripanosomosis (transmitida por la