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Toxicologa I
INDICE
Presentacin .
12
17
23
34
39
Bibliografa..
44
PRESENTACIN
En el ltimo siglo ha habido un gran incremento en el uso de compuestos qumicos
sintticos, empleados para diferentes propsitos, como medicamentos (drogas),
conservadores de alimentos, pesticidas, qumicos de uso agrcola o casero,
agentes para limpieza y compuestos utilizados en guerras.
Solamente una parte de esos compuestos han sido suficientemente examinados
para valorar adecuadamente su impacto potencial en la salud humana. Adems
estos estudios son limitados. Por ejemplo, con frecuencia slo se evala una ruta
de aplicacin y podra ser que sta no sea la principal en la que el ser humano
pudiera estar expuesto, lo cual podra ser un factor que influenciara la toxicidad.
Adems muchas de las pruebas de toxicidad se realizan en sistemas modelo
(animales, plantas, microorganismos, etc.) y se ha visto que no es posible
extrapolar los resultados de los animales al hombre en forma concluyente. Todo
esto conduce a problemas para plantear procesos regulatorios y legislativos con
informacin experimental limitada y por otro lado el conflicto de intereses de las
industrias, grupos de consumidores y activistas ambientales. El pblico en general
no est dispuesto a perder las ventajas obtenidas con la industria qumica, pero
cada vez demanda ms ser protegidos de cualquier efecto adverso que surja por
su uso.
La toxicologa es la ciencia que estudia los txicos y las intoxicaciones. Lo cual
comprende el estudio del agente txico, su origen y propiedades, sus mecanismos
de accin, las consecuencias de sus efectos lesivos, los mtodos analticos,
cualitativos y cuantitativos para su determinacin, los modos de evitar la
contaminacin ambiental y de los lugares de trabajo, las medidas profilcticas de
la intoxicacin y el tratamiento general. Vista de este modo constituye una vasta
ciencia que aunque sigue siendo el hombre su principal objetivo, trasciende al
medio ambiente, la industria, los alimentos, los animales etc.
Es fundamental para el progreso de la toxicologa el poder realizar la
determinacin de los posibles riesgos que pudieran surgir de la exposicin a una
substancia. La evaluacin de la toxicidad busca determinar qu tan venenoso
podra ser una substancia. La evaluacin de riesgo, involucra la evaluacin
cuantitativa del efecto deletereo que podra ocurrir bajo condiciones particulares
de exposicin. El riesgo viene de la unin entre toxicidad y exposicin en un
sentido matemtico.
En este manual se plantean algunas pruebas en modelos biolgicos para la
evaluacin de la toxicidad de algunos compuestos. No son las nicas que se
pueden realizar, sin embargo se trata de introducir este tipo de pruebas como
ejemplo para el curso de Toxicologa de la carrera de Qumico Farmacutico
Bilogo.
EJERCICIO 1
REFLEXIN DE LA PELCULA ERIN BROCKVICH
Fecha de entrega: A ms tardar el jueves 21 de agosto a la hora de laboratorio.
Instrucciones: Una vez que hayas visto la pelcula redacta una reflexin que
incluya cada uno de los siguientes puntos. No incluyas la pregunta dentro del texto
y busca que la redaccin tenga coherencia e ilacin entre cada uno de los temas.
1. Cules son los eventos que desatan la trama de la pelcula?
2. Qu hace Erin Brockovich?
3. Cmo se involucra en el bufete?
4. Cmo es que se involucra en el caso de PG & E?
5. Cul es el txico por el cual se presenta el problema?
6. Qu enfermedades recurrentes encuentra en los habitantes de la zona y
qu le menciona el investigador de los efectos del txico en los humanos?
hay relacin?
7. Cul es el nivel que mencionan como nivel mximo del txico y cul haba
en el agua de acuerdo a los reportes?
8. Qu dilemas ticos se observan en la trama?
9. Qu sucede al final de la pelcula y era la nica opcin?
10. Qu relacin encuentras entre la pelcula y los temas que se ven en
clase?
11. De acuerdo a esta pelcula, cules pasos se deben hacer para identificar
el problema?
12. Si estuvieras en el lugar de Erin Brockovich, qu haras?
Letra Arial 12, mrgenes de 3cm, interlineado sencillo, MXIMO una pgina.
El trabajo deber incluir al inicio el nombre completo del alumno iniciando por los
apellidos, grupo y la fecha.
PRCTICA 1
MANEJO DE LA ESTERILIDAD
Objetivo
Que el alumno reconozca la importancia del manejo adecuado de la esterilidad y
verifique el manejo personal de ella realizando la manipulacin de medios, pipetas
y tubos estriles.
Introduccin
El control absoluto de bacterias por esterilizacin y su control por confinamiento y
desinfeccin son aspectos muy importantes del trabajo de laboratorio. El propsito
de los procedimientos de seguridad en el laboratorio es doble, por un lado es
proteger el experimento que se est realizando y por otro proteger al
experimentador.
Si se generalizara, se podra pensar que las bacterias que normalmente son
manejadas son residentes naturales en el ambiente y por lo tanto inocuas para el
hombre. Sin embargo hay un amplio espectro de grados de virulencia en relacin
a la susceptibilidad del humano. Por este motivo, la indicacin es precaucin hay
que manejar todas las bacterias como potencialmente dainas para la salud
humana.
Aunque las definiciones de esterilizacin, desinfeccin y antisepsis son aceptadas
en forma general, es muy comn que estos trminos se confundan. La distincin
exacta entre estos trminos y el conocimiento bsico de cmo realizarlos y
vigilarlos son importantes para su aplicacin efectiva.
La esterilizacin es definida como el uso de un procedimiento fsico o qumico para
destruir toda la vida microbiana, incluyendo grandes cantidades de endosporas
bacterianas altamente resistentes, los cuales pueden estar en objetos inanimados.
Generalmente en el laboratorio microbiolgico, el vapor es usado para la
esterilizacin de medios de cultivo, equipo y material de vidrio, el calor seco es
usado para material de vidrio y equipo metlico, el gas es usado para
instrumentos, la filtracin para soluciones y la radiacin es usada con propsitos
limitados.
La desinfeccin es un proceso menos letal que la esterilizacin. Elimina
virtualmente todos los microorganismos patgenos reconocidos pero no
necesariamente todas las formas microbianas (p. ej. Endosporas bacterianas) en
objetos inanimados. Como puede verse en esta definicin, la desinfeccin no
asegura la muerte de todas las formas microbianas, y por lo tanto el proceso de
desinfeccin pierde el margen de seguridad que se obtiene mediante la
esterilizacin, por lo que es un proceso que disminuye el nivel de contaminacin
microbiana.
6
Esporas
+
-
Bacterias
Bacilo
tuberculoso
+
+
-
Clulas
vegetativas
+
+
+
mortal
hongos
Virus
pequeos
+
+
+
medianos
+
+
+
+
+
+
Concentracin o nivelb
Actividad desinfectante
(alta)
Variable
3% 6%
1% 8%
Variable
Variable
500 5 000 mg de cloro libre o
disponible/litro
70%
0,5% 3%
30-50 mg de yodo/litro; 1%-2% de yodo
disponible
0,1% - 0,2%
Alta a intermedia
Alta a intermedia
Alta a baja
Alta
Alta
Intermedia
Intermedia
Intermedio a baja
Intermedia a baja
Baja
70%
1 mg -2 mg de yodo libre/litro; 1%-2% de
yodo disponible
Clorhexidina
0,75% -4,0%
Hexaclorofeno
1% -3%
Paraclorometaxilenol
0,5%-4,0%
a
Esta lista de germicidas qumicos, se centra en formulaciones genricas.
b
Para esterilizacin o desinfeccin se refiere a las instrucciones del fabricante para los tiempos de exposicin y condiciones
tambin como recomendaciones para enjuague y manejo subsecuente de utensilios procesados.
c
Hay varias preparaciones de glutaraldehdo en el mercado, pueden ir desde las que se pueden utilizar directamente, u
otras que debern diluirse antes de usarse.
d
Debido a la controversia sobre el papel del formaldehdo como un carcingeno ocupacional potencial, su uso est limitado
a ciertas situaciones especficas bajo condiciones controladas.
El dixido de cloro se dice que es el qumico activo resultante al mezclar agua, clorito de sodio y cido lctico en diversas
proporciones, dependiendo de su uso como esterilizante o desinfectante. De forma similar al caso de los compuestos
clorados, el espectro de accin germicida es amplio, pero los efectos oxidantes en metales o superficies plsticas pueden
limitar su uso.
f
En aos recientes, se han registrado varios productos conteniendo bajas concentraciones (<0,1%) de cido peractico
(peroxiactico) combinado con bajas concentraciones (<0,1%) de perxido de hidrgeno para uso como esterilizantes o
desinfectantes. Esta combinacin de dos poderosos qumicos oxidantes a bajas concentraciones hace posible tener una
actividad germicida de amplio espectro mientras que se minimizan los efectos negativos tales como la corrosin que se
presenta a concentraciones altas del cido peractico.
g
Debido a que existen muchas formulaciones registradas como desinfectantes hospitalarios que actan sobre diferentes
tipos de bacterias, y que cada uno de ellos est compuesto de varios ingredientes activos, es difcil definir una clasificacin
genrica. Debido a esto hay que poner mucha atencin a la informacin de los productos comerciales, as como a la
literatura respecto al espectro de actividad, patrones de uso, instrucciones de uso, precauciones, etc.
h
Estos desinfectantes pueden estar disponibles en forma lquida o slida (por ejemplo: Hipoclorito de sodio o de calcio). El
blanqueador casero comn, es una excelente y barata fuente de hipoclorito de sodio. Concentraciones de entre 500 y 1
000 mg de cloro por litro son apropiadas para la gran mayora de usos que requieren un nivel intermedio de actividad
germicida. Concentraciones ms altas son extremadamente corrosivas, adems de irritantes, y slo debern usarse en
material orgnico que es difcil de limpiar (por ejemplo: Superficies porosas) o con contenidos inusualmente altos de
microorganismos (por ejemplo: Salpicaduras de material cultivado en el laboratorio).
i
La efectividad de los alcoholes como germicidas de nivel intermedio es limitada, puesto que se evaporan rpidamente,
dando como resultado tiempo de contacto muy cortos y tambin poca capacidad para penetrar residuos de material
orgnico. Hay rpida actividad tuberculocida, bactericida y fungicida pero vara en el espectro de la actividad virucida. Los
utensilios para ser desinfectados con alcoholes debern ser cuidadosamente limpiados previamente y entonces debern ser
sumergidos por un tiempo apropiado (por ejemplo: 10 min).
j
Slo debern ser usados iodforos comerciales como desinfectantes de superficies duras, y siguiendo las instrucciones
del fabricante para garantizar la efectividad y estabilidad del producto. Estos antispticos no son convenientes para la
desinfeccin de instrumentos mdicos o utensilios o para la desinfeccin de superficies en el ambiente.
k
Esta no es una lista de formulaciones completa, aunque incluye los germicidas que son ms comnmente usados en
como antispticos en hospitales.
Los factores que influencian la muerte microbiana que deben ser considerados en
la seleccin del proceso de esterilizacin incluyen los siguientes:
1. El diseo y/o composicin qumica del objeto.
2. El estado biolgico y fsico del microorganismo antes de la esterilizacin.
3. La resistencia inherente del microorganismo al proceso de esterilizacin y la
proporcin resultante de los microorganismos muertos.
4. La poblacin inicial de microorganismos asociada con el objeto que va a ser
esterilizado.
5. La intensidad del agente esterilizador.
6. La duracin de la exposicin al ambiente esterilizador.
En la siguiente tabla se muestran los mtodos convencionales de esterilizacin y
los utensilios esterilizados por cada uno.
Proceso
Calor hmedo
Calor seco
Objeto
Soluciones parenterales
Instrumentos
Equipo para procesos aspticos
Medios de cultivo
Tapones de hule
Material de vidrio
Aceites
Instrumentos
Agujas
Petrolato
Polvos
Equipo para procesos aspticos
xido de etileno
Radiacin ionizante
Filtracin
Desarrollo
Material y substancias utilizadas
Tubos de 13 mm x 100 mm con tapa de rosca,
Pipetas Automticas y puntas,
Propipeta,
Papel,
Papel aluminio,
Mechero,
Gradilla,
Algodn,
Tijeras,
Botellas con tapa de rosca,
Caldo nutritivo.
Procedimiento
Prepare el caldo nutritivo y esterilice en botellas de 250 ml o 500 ml con
tapa de rosca.
Esterilice 30 tubos de 13 mm X 100 mm con tapa de rosca dejando flojas
las tapas para realizar el proceso adecuadamente. Al final del proceso
cierre las tapas.
Esterilice cajas con puntas para las pipetas automticas.
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Resultados
Conclusiones
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PRCTICA 2
EFECTO DE ANTIBITICOS EN Escherichia coli
Objetivo
Construir una curva dosis-respuesta de un antibitico en un cultivo de Escherichia
coli.
Introduccin
Las enfermedades infecciosas han causado la muerte de millones de series
humanos a lo largo de la historia de la humanidad. Con el descubrimiento de los
antibiticos, esta realidad comenz a ser modificada y en los aos ochenta del
siglo XX, poda hablarse de una victoria prcticamente total frente a las
infecciones por microorganismos. Sin embargo, este aparente triunfo fue destruido
por la propagacin de una nueva enfermedad: el sndrome de inmunodeficiencia
adquirida (SIDA).
En la actualidad, las enfermedades infecciosas muestran una tendencia
emergente, por lo que el conocimiento de los antibiticos, a quienes se prefiere
denominar en la actualidad como drogas antibacterianas, resulta de suma
importancia para los interesados en los temas de salud.
El origen de la palabra antibitico es griego: anti significa contra, y bios,
vida. Los antibacterianos son sustancias naturales, semisintticas o sintticas,
que a concentraciones bajas, inhiben el crecimiento o provocan la muerte de las
bacterias. Popularmente se les conoce a todos como antibiticos, aunque en
realidad, estos son nicamente las sustancias producidas de forma natural por
algunos microorganismos.
La accin del agente antibacteriano es lograda mediante los siguientes
mecanismos de accin:
inhibicin de la sntesis de la pared celular
inhibicin de la sntesis de protenas
inhibicin del metabolismo bacteriano
inhibicin de la actividad o sntesis del cido nucleico
alteraciones en la permeabilidad de la membrana celular
Con cualquiera de estas acciones o con una combinacin de ellas, el germen
es incapaz de sobrevivir.
Un germen puede desarrollar resistencia ante un antibitico. Esto quiere
decir que ser incapaz de daar a dicho germen. La resistencia puede
desarrollarse por mutacin de los genes residentes o por adquisicin de nuevos
genes. La resistencia de los grmenes a los antibiticos es en la actualidad uno de
los grandes desafos para las autoridades de salud.
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Observaciones y resultados
Tubo
Concentracin (U
de antibitico)
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
Medio
Grfica
Conclusiones
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PRACTICA 3
NIVELES DE FLOR EN ORINA
Objetivo
Determinar los niveles de flor en orina como biomarcador de exposicin por el
mtodo de ion selectivo.
Introduccin
Biomarcador de exposicin
La presencia de un txico en el ambiente implica un riesgo, no obstante, para
hablar de impregnacin hay que detectar el txico en el organismo, y para que
exista intoxicacin debe aparecer una sintomatologa o alteraciones clnicas. Por
otra parte, la relacin entre el nivel de txico presente en el organismo y la
respuesta txica es algo complejo y difcilmente predecible ya que depende de
numerosos factores (toxicocinticos, genticos, etc...). Un mtodo de cuantificar la
exposicin a xenobiticos y su posible impacto sobre la especie humana es el uso
de procedimientos de monitorizacin biolgica por medio de biomarcadores.
Biomarcador de exposicin se podra definir, en sentido amplio, como la presencia
de un xenobitico en un fluido biolgico que puede ser cuantificable.
Los biomarcadores se utilizan para:
1. Detectar la presencia de una exposicin
2. Identificar a los individuos sensibles de una poblacin
3. Fundamentar la decisin de intervenir, tanto a nivel individual como ambiental
En el diseo de una rutina de muestreo es necesario considerar lo siguiente:
1. Especificidad y sensibilidad del biomarcador
2. Dificultad de muestreo
3. Cintica de la formacin del biomarcador y estabilidad del biomarcador.
4. Fcil anlisis
Una de las limitaciones ms importantes de los biomarcadores radica en que no
pueden aplicarse a sustancias que ejercen sus efectos txicos de forma
instantnea (por ejemplo, gases y vapores irritantes primarios) o sustancias que
tienen una tasa de absorcin muy pequea.
Fundamento del mtodo
La determinacin del ion fluoruro, se basa en el uso de un electrodo de in
selectivo, el cual esta constituido de manera similar al electrodo simple de vidrio
para medir pH, excepto que funciona a base de una membrana de cristal de
16
17
Anote los clculos necesarios para preparar la solucin de fluoruros 100 ppm.
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20
Mencione por que Flor en orina es el mejor biomarcador para este txico y a que
tipo de exposicin refiere.
Bibliografa
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PRACTICA 4
TOXICIDAD DE METALES PESADOS EN PLANTAS.
EFECTO DE CROMO (III) Y (VI)
Objetivo
El alumno identificar los diferentes sntomas de toxicidad causados por metales
(cromo) en plantas.
Introduccin
Los metales son elementos distribuidos en el ambiente. Algunos de ellos pueden
ser dainos para el hombre. Los metales difieren de otros txicos ya que estos no
pueden ser destruidos ni creados por el hombre. Su influencia en el hombre
depende de su transporte a travs del medio ambiente (agua, aire, suelo y
comida), o por alteracin de la especiacin bioqumica del elemento.
Los metales se redistribuyen de manera natural en el medio ambiente mediante
los ciclos biolgicos y geolgicos. El agua de lluvia disuelve las rocas y las menas
y transporta los materiales a los ros, arroyos y luego los sedimenta. Los ciclos
biolgicos incluyen la bioconcentracin por las plantas y los animales y los
incorporan a sus ciclos alimenticios. Por otro lado las actividades antropognicas
modifican (aumentan) el contenido del metal en una regin.
Hay factores que influencian la toxicidad de los metales:
-Interaccin con metales esenciales. Por ejemplo por metabolismo similar entre un
metal esencial y el txico.
-Formacin de complejos metal-protena. Como las metalotionenas que se
acomplejan con Cd, Zn, o Cu.
-Edad y estadio de desarrollo. En el caso de nios y jvenes, ingieren ms
caloras por Kg de peso que los adultos, por lo que si hay algn metal
contaminante, mayor ser la ingesta. Adems por ejemplo el Pb se absorbe ms
por va GI en los nios que en los adultos. Por otro lado, el crecimiento rpido y la
divisin celular, da oportunidad para efectos genotxicos.
-Factores por estilo de vida. Por ejemplo, el tabaquismo aumenta la exposicin al
Cd y la ingestin de alcohol predispone a la prdida de metales esenciales.
-Forma qumica o especiacin. La forma qumica de un metal repercute en la
biodistribucin en el organismo. El tetraetilo de Pb y el metilmercurio son solubles
en lpidos y son ms solubles en mielina que las sales inorgnicas de stos.
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Sal
g/lt
Ca(NO3)2.4H2O
CaCl2.2 H2O
KH2PO4
KNO3
Mg(ClO4)2
FeCl3
H3BO3
MnCl2. 4H2O
MoO3
Zn(NO3)2.6H2O
CuSO4.5H2O
8,431
31,421
13,183
2,585
23,323
0,726
0,143
0,077
0,001
0,011
0,011
Resultados
25
Control:
10 ppm:
26
100 ppm:
1 000 ppm:
27
Conclusiones
Cuestionario
1. Compare sus resultados con los de sus compaeros. En general, Cul es
ms txico en los organismos el Cr(III) o el Cr(VI)? Por qu?
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Bibliografa
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PRCTICA 5
ENSAYO DE MICRONCLEOS
Objetivo
Determinar la presencia de microncleos como medida de inestabilidad gentica
inducida por agentes genotxicos.
Introduccin
La integridad gentica de la poblacin humana se ve afectada por la actividad
industrial, por lo que es importante utilizar mtodos para determinar el grado de
dao gentico en una poblacin (ensayos de genotoxicidad). Los microncleos
son cuerpos citoplsmicos de naturaleza nuclear que corresponden a material
gentico no incorporado correctamente a las clulas hijas durante la divisin
celular. Estos reflejan aberraciones cromosmicas y son originados por roturas en
el material gentico o por errores durante la replicacin y posterior divisin del
DNA y/o por exposicin a agentes genotxicos. Hay factores que pueden influir o
modificar el nmero de microncleos que pueden estar presentes en una clula,
como edad, gnero, tratamientos mdicos, la exposicin diaria a agentes
genotxicos etc.
Los microncleos (MN) son masas de cromatina que tienen forma de pequeos
ncleos, que aparecen cerca del ncleo principal en las clulas interfsicas. Los
MN se pueden generar en forma espontnea o como respuesta a determinados
agentes (clastognicos y/o aneugnicos) como resultado de la prdida de
fragmentos cromosmicos y/o cromosomas enteros durante la divisin celular. Las
roturas cromosmicas darn lugar a fragmentos cromosomales acntricos que al
no disponer de centrmero no se incluirn en los ncleos hijos durante la divisin
celular, al no poderse unir al huso mittico en la anafase. Estos fragmentos se
rodean de membrana nuclear y aparecen como pequeos ncleos. Si el dao
genotxico ha afectado a las protenas del cinetocoro al centrmero o al huso
mittico lo ms probable es que haya un retraso mittico y un desequilibrio en la
distribucin de cromosomas provocando que los cromosomas rezagados se
pierdan durante la anafase y se rodeen de envoltura nuclear.
Del 10 al 25% de los linfocitos de sangre perifrica son de vida larga (hasta ms
de 5 aos) y generalmente estn en estado no proliferativo (fase G 0), al estar en
este estado, requieren un estmulo durante el cultivo que se realiza con PHA. Sin
embargo como los MN son inestables tienden a desaparecer a lo largo de las
divisiones celulares, por lo cual es importante saber si una clula se ha dividido y
cuntas veces lo ha hecho, para ello se utiliza citocalasina B que detiene la
citocinesis al impedir la polimerizacin de la actina. De esta forma las clulas que
hayan llevado a cabo una divisin celular aparecern como binucleadas y las que
30
Figura 1 (a) (b) y (c) clulas binucleadas portadoras de microncleos; tanto las clulas como los
microncleos cumplen los criterios de seleccin definidos por el comit internacional de
microncleos humanos; (d) (e) y (f) distintos estadios de clulas en vas de apoptosis; (g) (h)
e (i) clulas con distintos ndices de divisin nuclear; (g) clulas mononucleadas; (h) clula
trinucleada portadora de microncleos: (i) clula tetranucleada portadora de microncleos,
(j) clula mononucleada con microncleos
31
Reactivos
Amortiguador
EDTA 0.1 M
Tris HCl 0.01M
NaCl 0.02 M
pH 7.0
Giemsa al 10%
En una caja Koplin colocar 5 ml de solucin madre de Giemsa y agregar 45 ml de
agua destilada.
Solucin madre de Giemsa
Giemsa 1 g
Glicerina 67 ml
Metanol absoluto 133 ml
Calentar en estufa o en bao mara la glicerina a 60C, agregar el colorante y
mantener 30 min a la misma temperatura. Agregar el metanol y agitar durante 4 h.
Filtrar y guardar en frasco mbar en el refrigerador.
Desarrollo
Procedimiento
MN en clulas de epitelio bucal
Realizar un raspado de la parte interna de las mejillas con un cepillo dental sin
tocar lengua ni dientes. Sumergir el cepillo en 10 ml de amortiguador (EDTA 0.1 M,
Tris HCl 0.01 M, NaCl 0.02 M, pH 7.0), agitar por 1 minuto y centrifugar a 1500
rpm durante 10 minutos. Aspirar el sobrenadante y lavar 3 veces con el
amortiguador a las mismas condiciones. Al final la pastilla se resuspende en 1.5 ml
de amortiguador. Dejar caer desde una distancia de 20 cm dos gotas de la
suspensin de linfocitos en un portaobjetos humedecido con etanol. Dejar secar la
laminilla a 37C durante 10 minutos. Sumergir la laminilla en el colorante Giemsa
al 10% durante 5 a 10 minutos. Realizar la observacin y el conteo en el
microscopio mediante inmersin.
Resultados
Se cuentan 1000 clulas en interfase y se indicar el nmero de clulas con MN.
Observacin en el microscopio
32
Conclusiones
Cuestionario
1.Describa mediante un esquema cmo se producen los microncleos en una
clula.
33
Bibliografa
34
PRCTICA 6
PRUEBA DE MOVILIDAD (EVASIN) DE LOMBRICES
Este ensayo es una prueba aguda (se desarrolla en 48 h) que se puede aplicar
como una alternativa a pruebas de mortalidad. Se basa en la evaluacin de
efectos subletales caracterizados por el comportamiento de evasin de las
lombrices, para la cual se mide el nmero de lombrices que se desplazan desde
un suelo contaminado y que, por tanto, evaden la exposicin. Dicho
comportamiento se calcula a travs de la concentracin efectiva media (CE50),
que indica la concentracin a la que el comportamiento de evasin es el 50 % de
los organismos expuestos, comparado con el control. Esta prueba se usa para
evaluar si el hbitat es funcional para la lombriz (Feisthauer, 2003; Hund et al.,
2003).
Material y equipo
Contenedor de prueba
Guantes
Balanza analtica
Papel aluminio
Micropipeta de 100 a 1000 L
Papel filtro
Potencimetro
Pinzas
Pipetas volumtricas de 1 a100 mL
Puntas para micropipeta de 100 a 1000 L
Tela sinttica (organza)
Contenedor de Prueba
El contenedor de prueba es un recipiente redondo de acero inoxidable o PVC con
un dimetro de 21 cm, altura de 5 cm y espesor de 3 mm; tiene seis cmaras
unidas en forma radial con paredes (placas) de 6 cm de ancho, 5 cm de altura y un
espesor de 2 mm, y una cmara central con un dimetro de 8 cm y paredes de espesor de 2 mm. Las paredes y la cmara central estn intercomunicadas con cinco
arcos y dos arcos, respectivamente, los cuales tienen una dimensin de 0.5 cm de
altura y 1 cm de ancho.
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Organismos de prueba
Se emplean lombrices adultas cliteladas (Eisenia fetida), con un peso de 0.250 a
0.500 g cada una.
Suelo
El suelo problema (4 kg) se tamiza a travs de una malla de 4 mm. Se determina
su pH y porcentaje de Humedad. En funcin de los resultados de estas
determinaciones se realiza el ajuste a un pH de 6.5 a 7.0 y un contenido de
humedad del 70%. Las concentraciones de muestra provienen de diferentes
suelos contaminados y sitios de referencia (tambin se puede trabajar con fases
de procesos de biorremediacin), por lo que se obtienen suelos o muestras con
concentraciones diversas.
Procedimiento
Preparacin de los organismos
Previamente a la prueba, las lombrices se depositan en cajas de Petri con papel
filtro humedecido con agua desionizada, para que vacen sus intestinos durante 5
h. Posteriormente son lavadas, secadas y pesadas.
Desarrollo de la prueba
Se pesan 100 g del suelo problema y del suelo control, y se colocan en el
contenedor de seis cmaras, alternando el suelo control y el suelo contaminado en
diferentes concentraciones.
Nota:
Para controlar variables como % de materia orgnica y % de humedad todas las
muestras sern mezcladas con suelo control en una relacin 1:3 y medidos en
volumen de 350 ml.
Posteriormente se depositan 10 lombrices en la cmara central. La migracin de la
lombriz es lenta, por lo que, si despus de 10 min no se observa migracin, se
acerca una lmpara para disminuir el tiempo de espera y acelerar el movimiento
36
Al trmino de 48 h, las paredes de las cmaras son tapadas con una placa
divisoria con dimensiones de 12 cm de altura, 8.3 cm de ancho y espesor de 0.5
mm (figura 2.7) para evitar el movimiento de la lombriz hacia las cmaras vecinas.
El suelo y los organismos de cada cmara debern ser sacados para registrar el
nmero de lombrices en cada una de ellas, as como para evaluar su movimiento
ante los estmulos de tacto y registrar su peso al final de la prueba.
Clculos
Si es una prueba de concentraciones mltiples, que tienen cuatro o ms
concentraciones y un contenedor por cada concentracin (alternando suelo limpio
y contaminado), la evasin se determina aplicando la siguiente frmula a cada
rplica (ISO, 2008; De Silva y Van Gesten, 2009):
E= C - P / L x 100
Donde E = evasin (%)
C = nmero de lombrices en el control
P = nmero de lombrices en el suelo problema
L = nmero total de lombrices expuestas
Para evaluar si el suelo analizado es un hbitat adecuado para las lombrices, se
evalan los siguientes criterios:
Si el 50 % de los organismos se encuentran en el suelo contaminado o tratado, se
considera que no muestran preferencia por ningn tipo de suelo y que dicho suelo
es un hbitat adecuado.
Por su parte, si el porcentaje de lombrices en el suelo contaminado es del 20%, se
considera que el suelo tiene efecto sobre los organismos y, por lo tanto, que es
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txico o de baja calidad (Hund et al., 2003; Hund et al., 2005; Ricardo et al., 2010).
Preparen una presentacin (15 minutos por equipo) en la que muestren los
resultados del experimento, recalcando si los suelos utilizados presentaban
toxicidad para los organismos usados.
Preparen un reporte de la prctica por equipo.
Cuestionario.
1. Menciona las caractersticas de los ensayos para toxicidad aguda, subcrnica y
crnica.
2. Qu es un bioensayo?
Bibliografa
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BIBLIOGRAFA GENERAL
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(Casarett and Doull's Essentials of Toxicology) McGraw-Hill Professional; First
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