Documentos de Académico
Documentos de Profesional
Documentos de Cultura
Cap16 Libro Practica 1
Cap16 Libro Practica 1
Las herramientas
moleculares
Captulo 16
El ADN en el laboratorio
Precauciones
El trabajo de biologa molecular requiere de una serie de precauciones para
no contaminar las muestras con cidos nucleicos extraos. Es necesario
limpiar las reas de trabajo con solventes como el cido clorhdrico (10%),
sosa (NaOH, 0.5 N) y/o etanol (70%). Tambin hay que utilizar guantes para
proteccin personal y para evitar contaminar las muestras, as como trabajar
con materiales y soluciones estriles. Se recomienda trabajar en una campana
de flujo laminar y si es posible, someter el material a radiacin ultravioleta de
5 a 10 minutos para degradar cualquier cido nucleico presente.
ADN
Colecta de materiales en campo
El ADN es muy estable y slo se requiere mantener las muestras congeladas
antes de su extraccin. Muchos investigadores las guardan y congelan en el
buffer de extraccin (siguiente seccin).
Mtodos de extraccin
En la extraccin de los cidos nucleicos, stos se separan de cualquier otro
compuesto proveniente de las clulas o del ambiente del cual se tomaron las
muestras (p. ej. en muestras de suelos debemos considerar la alta concentracin de cidos hmicos, que son materia orgnica parcialmente degradada
que no es soluble en agua a pH bajo y tiene un poder quelante muy alto, por
lo que interfieren con la amplificacin del ADN). Inicialmente es necesario
llevar a cabo una lisis para liberar al ADN del interior celular, para lo cual se
utilizan los buffers de extraccin que contienen 1) detergentes, como sodio
dodecilo sulfato (SDS) a una concentracin final del 1% o Triton X al 0.5%;
2) una molcula quelante (p. ej. EDTA, cido etileno amino tetra actico,
50mM), que tiene cuatro grupos carboxilo y dos grupos amino, cuya forma
completamente de-protonizada puede unirse a cualquier complejo metlico
en solucin, quitando a los cationes de la solucin para desestabilizar la membrana celular e inhibir a las ADNasas; 3) sales (p.ej. cloruro de sodio, NaCl
20mM), que forman una capa inica suave que recubre al ADN protegindolo
y ayudando a evitar su degradacin; 4) Tris-HCl 20mM con pH entre 7.5 y 8.2
para mantener el pH de la solucin estable; 5) proteinasa K (concentracin
final 0.5 ml ml-1) para degradar protenas o enzimas.
Durante este paso con buffer de extraccin es comn someter la muestra a
tres o cuatro ciclos de incubacin a temperaturas entre los 50C y 70C alternados
con agitacin de la muestra (manual, con vrtex o en homogenizadores celulares
utilizando micro esferas) e incubacin a 4 C. La temperatura de incubacin no
puede ser mayor a los 80C, ya que a esta temperatura se comienza a degradar el
ADN. Estas incubaciones facilitan la ruptura de lpidos en la membrana celular,
permitiendo la liberacin del ADN de la estructura celular.
Posteriormente, resulta necesario tratar las muestras con dos extracciones
de fenol para eliminar las protenas (como nucleasas); para ello se agrega de
fenol el mismo volumen de la muestra, se mezcla bien (vrtex), centrifuga
a 10,000 xg (tres minutos), recuperando el sobrenadante con cuidado de no
acarrear las protenas que quedan en la interfase. Hay que considerar que no
todos los paquetes comerciales de extraccin llevan a cabo este paso, por lo
que se podra observar una degradacin de las muestras por nucleasas con el
tiempo, aun cuando se guarden en el congelador. Despus de la extraccin con
fenol, es comn llevar a cabo otra extraccin con cloroformo para acabar de
limpiar la muestra de cualquier residuo lipdico. Una vez ms, hay que agregar igual volumen de cloroformo que el de la muestra, mezclar bien (vrtex)
PURIGEN
QUIAGEN
MILIPORE
GENTRA
MoBio
En algunos casos hemos modificado los protocolos de uso de dichos paquetes, esto con el fin de ajustarlos a los requerimientos de los organismos en
estudio o para mejorar los resultados obtenidos.
2. Centrifugar a 4500 xg por 3 minutos y eliminar el sobrenadante perfectamente escurriendo las muestras en papel secante.
3. Resuspender en 300 l de buffer Tris HCl2 0.1M pH 8.
4. Adicionar 40 l de lisozima (20 mg/ml) y 5l de ARNasa (7000 U/ml).
5. Incubar a 37 C por 5 min., posteriormente a -20C durante 10 min. y
finalmente a 85 C durante 10 min. Entre cada incubacin, mezclar vigorosamente.
6. Agregar 20 l de proteinasa K (20 mg/ml).
7. Incubar a 70C durante 10 min., durante la incubacin invertir manualmente 5-10 veces.
8. Centrifugar a 8 000 xg durante 1 min.
9. Recuperar el sobrenadante (aprox. 250 l ), sin tocar el botn y transferir a
un tubo nuevo. Adicionar 150 l de isopropanol absoluto fro (a -20 C).
10. Incubar a -20 C durante 30 min.
11. Centrifugar a 10 000 xg durante 3 min. Eliminar perfectamente el sobrenadante.
12. Limpiar el botn con 300 l de etanol al 70% agitando brevemente en
vrtex.
13. Centrifugar a 10 000 xg por 3 min. Eliminar perfectamente el sobrenadante.
14. Secar perfectamente el botn a 65 C por 5 min. y resuspender en 50 a
00l de agua pura, desionizada y estril.
Un mtodo alternativo y muy eficiente es utilizar las soluciones del paquete
de la marca PUREGENE, al que aplicamos las siguientes modificaciones:
Tratamiento previo
1. Cultivar las bacterias en medio slido, pobre en nutrientes, durante el
tiempo necesario para obtener un crecimiento abundante pero de clulas
jvenes.
2. En un tubo de 1.5 ml estril agregar 0.5 ml de sulfato de magnesio 10
mM.
3. Agregar una asada pequea de bacterias (calculando una cantidad de 2 colonias medianas) y homogeneizar perfectamente pipeteando suavemente.
4. Incubar en hielo durante 10 min.
5. Centrifugar a 7000 xg durante 5 min. a 4 C.
6. Eliminar totalmente el sobrenadante colocando los tubos boca-abajo en
un papel secante.
Lisis celular
1. Agregar 300 l de solucin de lisis y resuspender las clulas pipeteando
suavemente varias veces.
2. Incubar a 80C por 5 min. Es conveniente mezclar invirtiendo los tubos
5-10 veces.
3. Incubar a 20C por 5 min.
4. Mezclar vigorosamente durante 10 seg.
Tratamiento con ARNasa
1. Agregar 4 l de solucin de ARNasa.
2. Mezclar invirtiendo los tubos 25-30 veces.
3. Incubar a 37C durante 15-30 min. Conservar en hielo.
Precipitacin de protenas
1.
2.
3.
4.
Reactivos:
Buffer de extraccin CTAB
SDS 20%
Acetato de potasio 5 M
Acetato de sodio 3 M
ARN
Precauciones
Una vez colectado el material es necesario agregarle una solucin que estabilice al
ARN lo antes posible, ya que los cambios en el patrn de expresin de los genes
debido a la degradacin del ARN o a inducciones en la transcripcin ocurren
inmediatamente. Debido a su estructura qumica el ARN es una molcula muy
frgil que puede romperse por accin de los grupos 2-OH (altamente reactivos)
adyacentes al esqueleto de ribosa-fosfato. Existen paquetes comerciales para
estabilizacin de muestras de ARN de compaas como QIAGEN, Ambion y
RNA-works, que en general funcionan con una mezcla de anticuerpos especficos
para ribonucleasas, inhibidores de ribonucleasas y/o contienen compuestos que
neutralizan a los grupos 2-OH (como es el caso de RNA-works).
Dado que las ARNasas no van a ser inactivadas en su totalidad en el autoclave,
resulta esencial trabajar con material estril y de preferencia de un solo uso. El
material de vidrio debe lavarse con una solucin 0.5 N de NaOH, enjuagarse tres
veces con agua de-ionizada y meterse al autoclave durante 2 horas. El material
de plstico deber limpiarse con etanol absoluto y meterse al autoclave durante
45 minutos. Las micro esferas de vidrio, generalmente utilizadas en la extraccin
para incrementar la lisis celular por accin fsica, deben someterse a combustin
durante 12 hrs. a 450 C y deben pasar en el autoclave 45 minutos.
Es importante que los reactivos que se utilicen en la extraccin de ARN se
mantengan en alcuotas con los volmenes mnimos necesarios para cada etapa
del proceso y en caso de ser posible se pasen dos veces por el autoclave.
Cuando se extraen los cidos nucleicos para su amplificacin, es indispensable separar los sitios en los que se lleva a cabo la extraccin y la amplificacin,
o en su caso, limpiar a profundidad la zona donde se llev a cabo la extraccin
con NaOH 0.5N y con etanol absoluto antes de amplificar. En cada una de
estas dos etapas es ideal utilizar juegos de pipetas diferentes, o en su defecto
usar puntas de pipeta con filtro en la preparacin de las mezclas de reactivos
a utilizar en la amplificacin. Tambin resulta propicio trabajar siempre bajo
la campana de flujo laminar con dos mecheros encendidos.
El mtodo BOOM, desarrollado por Boom et al. (1990) lleva a cabo la extraccin con el cido tiosanato de guanidina, separando los cidos nucleicos con
base en su alta afinidad para enlazarse en matrices de slica, en vez de utilizar
fenol. Dado que este mtodo aisla tanto ADN como ARN, resulta esencial
utilizar las nucleasas especficas para ADN que lo eliminen de la muestra.
Algunas compaas han creado paquetes de extraccin basados en este
principio, que utilizan matrices de slica diseadas para favorecer el enlace
de ARN (como RNeasy de QIAGEN).
Las molculas grandes de ARN, incluyendo ARNr y ARNm, son insolubles
en soluciones con altas concentraciones de sal, por lo que durante su precipitacin es comn utilizar cloruro de litio 8 M (libre de ARNasas) e incubar
las muestras a 0C durante dos horas antes de centrifugar. Sin embargo, este
mtodo no debe ser utilizado para ARN que ser sometido a transcripcin
reversa (vase ms adelante).
Transcripcin reversa
Esta tcnica permite pasar, en sentido inverso al dogma central de la biologa
molecular, de ARN a ADN. El primer paso es convertir el mARN en ADN
complementario (cADN) a partir de la actividad de la reverso transcriptasa.
Esta enzima existe en la naturaleza como parte del mecanismo de replicacin
en virus, y utiliza un tARN como oligonucletido o primer.
Mtodo utilizado para transcripcin reversa para
expresin de genes involucrados en la fijacin de
nitrgeno en muestras acuticas (modificado por
Zani et al., 2000 del kit de Promega de RT-PCR)
El cADN formado durante la transcripcin reversa es posteriormente utilizado en la reaccin de PCR para amplificarlo e identificar el gen que estaba
originalmente expresndose en nuestra muestra (ver captulo 17).
Mtodo para aislamiento de ARN total de muestras
de agua ambientales (modificado a partir del kit de
QIAGEN, Rneasy; Falcn et al., 2004)
1 Colectar muestras de agua en filtros DURAPORE (Millipore, Corp. San
Jos, CA. EUA).
2 Colocar filtros con las clulas hacia fuera dentro de tubos Eppendorf de
1.5 ml con micro esferas de vidrio y con la solucin RLT que contiene
Bibliografa
Boom, R., C J Sol, M M Salimans, C L Jansen, P M Wertheim-van Dillen y J van der
Noordaa, 1990. Rapid and simple method for purification of nucleic acids. Journal
of Clinical Microbiology 28(3): 495-503.
Chomczynski, P. y N Sacchi, 1987. RNA isolation from cultured cells. Analytical
Biochemistry 162: 156-159.
Doyle, JJ y JL Doyle, 1987.A rapid DNA isolation procedure for small quantities of
fresh leaf tissue. Phytochemistry Bulletin 19: 11-15.