REA DE SUSTENTABILIDAD PARA EL DESARROLLO

PROGRAMA ACADMICO DE QUMICA

ESPECIALIDAD TECNOLOGIA AMBIENTAL
GRUPO
QU- 304
MATERIA
MICROBIOLOGIA AMBIENTAL
TITULO
AISLAMIENTO E IDENTIFICACIN DE MICROORGANISMOS
DE LA MATRIZ AMBIENTAL: AGUA
ASESORA
Dr. ROSA RICO MATA
DATOS DE IDENTIFICACIN DE LOS ANALISTAS
Fecha de inicio del anlisis: 1 de Julio del 2015
Fecha de termino: 9 de Julio de 2015
Nombre
Cargo
Mara Guadalupe Regina Salas
Responsable
Padilla
Vctor Manuel Guadalupe Pia

Administrador

Cardona
Andrs Ramrez Snchez
No Miguel ngel Pedroza Daz
Jorge Rentera Aldana

Laboratorista 1
Laboratorista 2
Laboratorista 3

GENERACIN: 2014-2016

DATOS DEL SITIO EN ESTUDIO

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1.- Breve descripcin del estatus ambiental del sitio de estudio: La muestra para
el anlisis microbiolgico se tom de la planta tratadora de aguas residuales de la
Universidad Tecnolgica de Len, en la cual llegan descargas de aguas a diario, las mismas
que despus del proceso en el que se someten son utilizadas para las reas verdes y para
el drenaje de la misma universidad, de esta manera haciendo de esta una simbiosis
ambiental.

SITIO DE
MUESTRE
O

Nombre

Ubicacin
/coordenadas
GPS

Planta Tratadora
de agua residual
de la UTL

21.062997,101.582700.

Imagen de mapa satelital

2. Evidencia fotogrfica del sitio

Fecha:30 de Junio del 2015
Fecha:30 de Junio del 2015
Hora:10:40 a.m.
Hora:10:45 a.m.

DATOS DE LAS MUESTRAS A ANALIZAR

1. Identificacin
Hora de toma de
Hora de siembra:11:00 a.m.
muestra:10:40 a.m.
Punto de Muestreo (ubicacin /coordenadas Tiempo de exposicin (aplica solo para
GPS):
muestra de aire)
Matriz ambiental:Agua

Nombre del/ los analistas que tomaron

la muestra:No Miguel ngel Pedroza
Daz

Nombre del/ los analistas que sembr la

muestra:Andrs Ramrez Snchez

2.Parmetros Fisicoqumicos
Color:Caf

Temperatura (oC) ambiental:

20 CpH:5

Olor: Materia orgnica en

Describir condiciones
descomposicin y heces fecales.
climatolgicas:Soleado
3. Evidencia fotogrfica del sitio de toma de muestra

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AISLAMIENTO DE MICROORGANISMOS
1. Justificacin del proceso para la identificacin bacteriana
La identificacin de una bacteria que interviene en un ciclo biogeoqumico es de suma
importancia ya que
se estudia su proceso metablico, que nos permite conocer la
manera en la que asimila los nutrientes proporcionados por el micromedio ambiente en
donde se encuentre, sobre todo a conocer que mecanismos metablicos utiliza para
degradar o transformar sustancias orgnicas o inorgnicas que se encuentran disueltas
en el agua y cuya funcin del microorganismo es retirarlas de dicha matriz como un
proceso de depuracin de agua, y por lo tanto se debe de aislar en un medio selectivo
para poder hacer las pruebas correspondientes para su identificacin, para despus
poder implementar el microorganismo en un proceso de Biorremediacin si es que sus
propiedades metablicas pudiesen favorecer al mismo.

2. Dos medios de siembra (Nombre y Composicin)

Agar Triple Azcar de Hierro
Agar Kliger de Hierro
1.- Extracto de Carne
y amonio

7.- Sulfato de Hierro

1.- Peptona de Carne

de Fenol

2.- Pluripeptona
Sodio

8.- Tiosulfato de

2.- Cloruro de Sodio

3.- Cloruro de Sodio

9.- Rojo de Fenol

8.-Rojo
9.-Agar

3.-Lactosa

Morfologa Colonial (Medio 1)

Descripcin

Crecimiento de colonias de una forma

puntiforme, con bordes ondulados, y
una superficie convexa lisa y cremosa.
Imagen

4.-Tripteina
Morfologa Colonial (Medio 2)
Descripcin

Crecimiento de colonias de una

forma puntiforme, con bordes
ondulados, y una superficie
convexa lisa y cremosa.

Imagen

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3. Dos Medios selectivos de resiembra (Nombre y composicin)

Agar Triple Azcar de Hierro
Agar Mac Conkey
1.- Extracto de Carne
Hierro y amonio

7.- Sulfato de

2.- Pluripeptona
Sodio

8.- Tiosulfato de

3.- Cloruro de Sodio

9.- Rojo de Fenol

4.- Lactosa

1.- Peptona
2.- Pluripeptona

10.-Agar

3.-Lactosa
4.- Mezcla de sales biliares
5.- Cloruro de Sodio
6.-Agar

Morfologa Colonial (Medio 1)

Descripcin

Colonias incoloras con bordes regulares de

1,5 mm aproximadamente de Shigella
Flexneri

Imagen

Morfologa Colonial (Medio 2)

Descripcin

Colonias incoloras con bordes regulares de

1,5 mm aproximadamente, regreso en
Shigella flexneri

Imagen

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4. Procedimiento de Aislamiento
(describir detalladamente la cantidad de materiales y los pasos a seguir)

2 charolas de pesado
Materiales y equipo
1 parrilla de calentamiento
1 esptula
1 agitador de vidrio
2 matraces Erlenmeyer 250 mL
Agua destilada
2 vasos de precipitado 250 mL
Mecheros Bunsen
3 cajas Petri
Asas metlicas

Reactivos y medios de cultivo

Agar triple azcar de hierro

Preparacin de medios de cultivo:

Pesar 6.25 g de Agar Triple Azcar de Hierro y disolverlo en 100 mL de agua

destilada y calentarlo durante 1 minuto o hasta que el medio se disuelva
completamente en el agua, despus llevar a esterilizar durante 15 minutos a 120
C, en condiciones estriles distribuir el medio en las placas Petri
(Aproximadamente 33. 33 mL en cada caja), se necesitan 3 cajas; una para la
siembra, otra para la resiembra y una tercera de control. Una vez que se reparti
el medio se dejan solidificar.

Pasos para el aislamiento del microorganismos (siembra, seleccin de la

colonia y resiembra):

Siembra: Una vez que se distribuy el medio en las placas, se toma la muestra de
agua de la planta de tratamiento de aguas residuales de la UTL ya previamente
recolectada, con ayuda del mechero se esteriliza el asa metlica de nicromo y se
toma un poco de la muestra, despus esta se distribuye en el medio por el mtodo
de estriado, como se muestra en las siguientes imgenes y se pone a incubar a 37
C de 18 a 24 horas.

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Seleccin de la colonia: Despus del periodo de incubacin se observa el

crecimiento que hubo en el mismo y verificar que la morfologa de las colonias
sean las que se pretenden identificar puesto que en un medio de cultivo pueden
crecer diferentes tipos de bacterias, ya que se verific que la colonia que se busca
identificar se elige la que haya quedado aislada de las dems, de esta manera
lograr un cultivo selectivo para su resiembra.
Resiembra: Se hace una divisin en la placa seleccionada para la resiembra, esta
se marca por debajo de la misma con ayuda de un marcador, para poder hacer dos
estriados y aislar dos colonias previamente seleccionadas, cada una en su
respectiva zona de la caja Petri con su crecimiento, con ayuda del mechero se
Prueba
de Motilidad
esteriliza el asa y se toman dos
colonias
y se siembran mediante el mtodo ya
mencionado, se incuban a 37 de 18 a 24 horas.
Cpsula
5. Esquema del Perfil bioqumico (metablico )
para la identificacin del microorganismo seleccionado
Catalasa
Tincin de Gram

(-)

Degradacin de la
Casena (-)

(+
))

Produccin de Indol (-)

Prueba Rojo de Metilo (-)

Vogues Proskauer (-)

Produccin de Gas (-)

Produccin de cido
Sulfhdrico (-)

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RESULTADOS DEL AISLAMIENTO E IDENTIFICACIN

1. EVIDENCIA FOTOGRAFICA DEL CULTIVO DE LA MUESTRA (SIEMBRA)

2. MORFOLOGA COLONIAL OBSERVADA

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Tipo de colonia 1: Descripcin

FOTO 1

Crecimiento abundante en el medio de

cultivo, las colonias son incoloras y con
una morfologa de bordes regulares y
con una elevacin convexa.

Tipo de colonia 2: Descripcin

FOTO 2

La colonia seleccionada tiene un borde

ondulante, es incolora y tiene una
superficie opaca.

Tipo de colonia 3: Descripcin

FOTO 3

Su transmisin de luz es opaca y

tiene una consistencia cremosa.

3. EVIDENCIA FOTOGRAFICA DEL CULTIVO PURO ( RESIEMBRA)

FOTO 1

FOTO2

4. MORFOLOGIA COLONIAL OBSERVADA

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FOTO 1
Descripcin

La
resiembra
result
muy
favorable, esto quiere decir que el
medio de cultivo seleccionado para
la resiembra si fue el correcto
para la bacteria que se deseaba
aislar.
En la foto 1 se puede observar las
colonias aisladas en las dos partes
del medio, se puede identificar
claramente el estriado que se
realiz de una manera correcta,
las colonias estn un poco
pequeas porque an les falta
crecimiento, esta foto se tom
despus
de
12
horas
de
incubacin.
En la foto 2 se puede observar que
las colonias que ya crecieron un
poco ms, pues el estriado
se
alcanza a distinguir claramente.

FOTO 2

FOTO 3

La foto 3 se tom despus de 24

horas de incubacin que necesitan
este tipo de bacterias para su
crecimiento por lo tanto las
bacterias aisladas se alcanzan a
ver perfectamente.

5. EVIDENCIA FOTOGRFICA DEL RESULTADO DEL PERFIL BIOQUMICO

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Nombre de la
prueba

Medio de
cultivo
utilizado

1. Tincin
de
Gram

Resultado
obtenido
(positivo/negat
ivo)

Evidencia fotogrfica

Negativo

Fundamento de la prueba

Es un tipo de tincin diferencial empleada en la microbiologa para la visualizacin de

bacterias. Un microorganismo gram positivo debe presentar una pared celular sana. El
mismo microorganismo, si sufre dao de la pared por una u otra causa, se vuelve gram
negativo. Esto indica la importancia de la pared para la retencin o el escape del
colorante. Una posible teora del mecanismo de tincin es la siguiente:
El colorante bsico entra al microorganismo, donde forma con el yodo una laca insoluble
en agua. El alcohol o la acetona empleados para aclarar, deshidrata las paredes de los
microorganismos gram positivos, tratados con mordiente, y forma una barrera que la laca
no puede atravesar. En las clulas gram negativas, los lpidos de la pared (ms
abundantes que en las clulas gram positivas) se disuelven por este tratamiento, lo que
permite el escape del complejo de cristal violeta con yodo.

2. Prueba
de
Motilida
d

1.- Agar SIM

Positivo en el
rea anaerobia

Fundamento de la prueba

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La movilidad se demuestra por un enturbiamiento del medio o por crecimiento que

difunde ms all de la lnea de inoculacin. Esto se debe a la presencia de flagelos que le
permiten desplazarse por el medio en busca de alimento. Puede ser en medio aerbico o
anaerbico.

3.- Prueba de
Cpsula

Negativo

La cpsula es una cubierta de grosor variable formada habitualmente por unidades de

polisacridos, protenas o ambos. Si est bien estructurada y se encuentra bien adherida a
la clula, se le denomina cpsula; si por el contrario, tiene estructura mal definida y su
adhesin es dbil, se le conoce como glicoclix. De acuerdo a su estructura qumica, puede
ser flexible o rgida. La rigidez le confiere la caracterstica de una matriz impermeable.
Determina la adhesin a superficies (biopelculas), constituye una barrera de proteccin
contra la fagocitosis y los anticuerpos e impide la desecacin y la accin de otros agentes.

4.- Prueba de
Catalasa

1.- Agua
oxigenada

Positivo

Fundamento de la prueba

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La catalasa es una enzima que poseen la mayora de las bacterias aerobias. Descompone
el perxido de hidrgeno en agua y oxgeno. El desprendimiento de burbujas procedentes
del oxgeno indica que el microorganismo posee dicha enzima.
H2O2 + catalasa -------------------H2O + O2

5.-

Degradacin de
la casena

1.- Agar leche

descremada

Negativo

Fundamento de la prueba

Las proteasas son excretadas al medio para la degradacin de protenas, la casena es la

protena de la leche que le da el color blanco, cuando la casena es hidrolizada por las
proteasas o enzimas que degradan esta protena, desaparecer el color blanco alrededor
del crecimiento bacteriano.

6.- Produccin de
Indol

1.- Agua de
Peptona

Negativo

Fundamento de la prueba
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El indol es un compuesto que se genera mediante la desaminacin reductiva

del triptfano y esta reaccin es llevada a cabo por algunas bacterias que poseen las
enzimas denominadas en su conjunto triptofanasas. Para detectar la produccin de indol
se utiliza el medio Caldo triptfano y la lectura de la prueba se realiza con el reactivo de
Kovacs, con el que el indol producido reacciona generando una coloracin rosa intensa.
C11H12N2O2+ triptofanasa ---------- C8H7N + NH3 + C3H4O3 + energa

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7.-Prueba RM-VP

1.-Caldo RN-VP
Negativo

9.1.- Caldo
Fundamento
la prueba
Produccin
Lactosadode Negativo
de gas CO2 y
H2
La prueba de rojo de metilo detecta la fermentacin acido-mixta, donde se acumulan
acido relativamente fuertes (actico, frmico, lctico, etc.) bajando as el pH del medio
hasta 4-5. Dicho cambio de pH se detecta aadiendo un indicador (rojo de metilo) al
medio de cultivo
C6H12O6 + fermentacin + rojo de metilo ------
cidos + cambio de
color
Fundamento de la prueba
El extracto de carne y la peptona son la fuente de carbono y nitrgeno mientras que la
lactosa es el hidrato de carbono a fermentable. Por la fermentacin de la lactosa se
produce cido y gas (CO2 y H2), el cual se evidencia al utilizar campanas Durham).

C6H12O6 C3H4O3 + NADH + H+ C3H3O3 + CO2

8.- Vogues
Proskauer

1.- Caldo
RM-VP
10.Produccin
de cido
Sulfhdrico

Negativo
1.- Agar
Kliger de
Hierro

Negativa

Fundamento de la prueba

Detecta la fermentacin butanodilica. En esta fermentacin se producen menor

cantidad de cidos que en la fermentacin cido-mixta, y una gran cantidad de
butanodiol. Mediante un reactivo (alfa-naftol
Fundamento
y KOH) sededetecta
la prueba
la presencia de un
precursor delEnbutanodiol
el medio (acetilmetilcarbinol
de cultivo, el extracto
o acetona).
de carne
La acetona
y la pluripeptona,
en presencia
aportan
de
nutrientes
oxigeno se oxida
adecuados
a diacetilo.
para El
el diacetilo
desarrollo
origina
bacteriano.
una coloracin
La lactosa,
roja
sacarosa
al reaccionar
y glucosa
con los
son los hidratos
restos guanidnicos
de carbono
de algunos
fermentables.
aminocidos
El rojo
de la
depeptona
fenol esdel
el medio
indicador de pH, y el cloruro de sodio
mantiene el balance asmtico. Por fermentacin de azucares, se producen cidos, que se
detectan por medio del indicador rojo de fenol, el cual vira al color amarillo en medio
C6H12O6acido.
---->C4H10O2
El Tiosulfato
+ de
C10H8O
sodio se
+ reduce
KOH ---->
a sulfuro
C3H6O
de +
hidrogeno
O2 -- C4H6O2
el que reacciona
+
luego con
una sal de hierro
aminocidos
proporcionado
--elcoloracin
tpico sulfuro
roja
de hierro de color negro.
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Na2S2O3 + Tiosulfato reductasa y cistena desulfurilasa H2S + FeSO4 (sal de

hierro) Fe2S3
Azucares + rojo de fenol cidos + color amarillo

11.- Prueba de
degradacin de
Citrato.

1.- Agar Citrato de

Simmons

Negativo

Fundamento de la prueba
En esta prueba se determina si el microorganismo es capaz de utilizar el citrato como
nica fuente de Carbono para su metabolismo y crecimiento. El medio de cultivo Citrato
de Simmons incluye; citrato de Sodio, un anin como nica fuente de Carbono y Fosfato
de Amonio como fuente de Nitrgeno.
La citrato permeasa permiten el transporte de citrato al interior de las clulas y la enzima
citrasa convierte el citrato en cido pirvico y CO 2. El CO2 liberado se combina con el
sodio y agua y forman carbonato de sodio que es alcalino cambiando el bromotimol de
verde a azul intenso.

Citrato ---------------- Oxalacetato + Acetato

Piruvato +
Acetato
Reaccin en pH cido
2 Piruvato -----------------

Acetato + CO2 + Lactacto

2 Piruvato -- ---------------- Acetona

+ 2 CO2

Reaccin en pH bsico
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Citrato -------------------

CO2 + cido Frmico + 2 cido Actico

IDENTIFICACIN DEL MICROORGANISMO AMBIENTAL

EN LA MATRIZ DE ESTUDIO: AGUA
1.- Nombre cientfico del microorganismo identificado de acuerdo a los
resultados
del perfil bioqumico planteado ( genero y especie)
Shigella flexneri

2. Taxonoma del o los microorganismo identificados

Son Bacterias Anaerobias y Anaerobias facultativas.
Familia:
Dominio: Bacteria
Enterobacteriaceae
Filo: Proteobacteria

Gnero: Shigella
Clase: Grammproteobacteria
Especie: S.flexneri
Orden: Enterobacteriales
3. Caractersticas generales

Shigella es un gnero bacteriano perteneciente a la familia Enterobacteriaceae, integrado

por bacterias de forma bacilar, no esporulados, inmviles, pero animados de movimiento
pendular
(oscilacin)
in
situ.
Son gram negativos, aerobios-anaerobios facultativos. Citocromo-oxidasa negativos.
Fermentan la glucosa sin produccin de gas; no obstante, se han encontrado algunos
biotipos que producen gas de la glucosa. No descarboxilan la lisina. No fermentan la
lactosa. No utilizan el citrato como nica fuente de carbono. No crecen en el medio
cianuro potsico. Su actividad bioqumica es muy reducida.

4. Conclusin parcial sobre las interacciones bacterianas en la matriz

estudiada y la importancia de la microbiologa en el rea ambiental
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El perfil bioqumico de la bacteria que fue aislada de la muestra de la planta tratadora

de aguas residuales de la Universidad Tecnolgica de Len UTL, corresponde a una
bacteria patgena (Shigella Flexneri), esta es una entero bacteria Gram negativa, no
esporulada, sin cpsula en su estructura celular, tiene una baja actividad bioqumica,. Sus
enzimas son muy especficas, pues bajo esta serie de pruebas slo fue identificada la
catalasa pues pudo descomponer el perxido en agua ms oxgeno,
no hacen
fermentaciones, algunas de ellas la de la lactosa, y la cido-mixta, motivo por el cual las
pruebas de RM-VP resultaron negativas, por otro lado tampoco ocupa el citrato como
nica fuente de carbono para su crecimiento pues slo creci en el agar TSI el cual fue el
seleccionado para su aislamiento.

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