Informes Microbiologia I

INGENIERIA INDUSTRIAL Y DE SISTEMAS
INGENIERIA AGROINDUTRIAL
Tema:
Informes de Laboratorio
Microbiologa
Curso:
Microbiologa I
Profesor:
Flor Vsquez Nez
Alumno:
Armas Castillo Luis Miguel
Seccin:
2009
2009
INFORMES DEL LABORATORIO DE MICROBIOLOGIA 2009
Universidad Nacional
Federico Villarreal
Microbiologa I
Ing. Flor Vsquez Nez
INFORMES DEL
LABORATORIO DE
MICROBIOLOGIA
2|P gi na
Laboratorio 01
NORMAS DE
BIOSEGURIDAD
UNFV
FIIS
Ing. AGROINDUSTRIAL
MICROBIOLOGIA I
3|P gi na
NORMAS DE BIOSEGURIDAD
I. OBJETIVOS
-
El principal objetivo al desarrollar en este laboratorio es que el alumno a prenda cuales son
los riesgos a los que puede estar expuesto durante su aprendizaje en el laboratorio de
Microbiologa.
Saber resolver los posibles inconvenientes y accidentes.
Crear en el alumno una actitud mental lgica y de control ante cualquier accidente y sobre
todas las cosas, PREVENIR en lo posible todo los accidentes.
Los riesgos potenciales del laboratorio pueden referirse a materiales
II. INTRODUCCION
Se define Bioseguridad como el conjunto de normas o actitudes que tienen como objetivo
prevenir los accidentes en el rea de trabajo, es decir, a disminuir el potencial riesgo ocupacional.
Tambin se puede definir como el conjunto de medidas preventivas que deben tomar el personal
que trabaja en reas de la salud para evitar el contagio de enfermedades de riesgo profesional.
Definimos Riesgo como la probabilidad que tiene un individuo de sufrir lesin, enfermedad,
complicacin de la misma o muerte como consecuencia de la exposicin a un factor de riesgo.
Cuando hablamos de Riesgo Ocupacional nos referimos al riesgo al cual est expuesto un
trabajador dentro de las instalaciones donde labora y durante el desarrollo de su trabajo.
Se consideran como trabajadores del Laboratorio de Hematologa todas las personas
incluidas los estudiantes y el personal de entrenamiento cuyas actividades incluyen el contacto
con pacientes, con sangre u otros lquidos biolgicos o con desechos biolgicos, dentro del
ambiente del laboratorio. La frecuencia de exposicin accidental de los trabajadores de la salud al
Virus de la Inmunodeficiencia Humana (VIH), al virus de la Hepatitis B y C (VHB y VHC) y a otras
enfermedades transmisibles por contacto con sangre u otros lquidos infectantes manejados en el
laboratorio, depende de su actividad u oficio bsico, de su actitud frente a la bioseguridad y de las
condiciones especificas de su trabajo o factores de riesgo a los que est sometido.
III. ANTECEDENTES
En la historia de la microbiologa se cuentan muchos ejemplos de infecciones contradas en
el laboratorio: en 1957 se seala la ocurrencia de casos de fiebre tifoidea, clera brucelosis,
ttanos, etc. asociados con el trabajo de laboratorio, adems de algunos agentes patgenos
considerados como de muy alto riesgo por presentar una situacin especial, ya que su infectividad
se mantiene aun en la sangre los tejidos de vertebrados asintomticos naturalmente infectados,
con lo cual la enfermedad puede transmitirse a los manipuladores de estos animales
aparentemente sanos y sus productos, como ocurri con la enfermedad de Marburgo aparecida
en 1967.
4|P gi na
Se ha elaborado una clasificacin de agentes biolgicos sobre la base del riesgo que
representan para el individuo que trabaja con ellos y para la comunidad, se han establecido 4
grupos de riesgo en orden creciente de peligrosidad
GRUPO I: agentes con bajo riesgo para el individuo y la comunidad
GRUPO II: agentes con moderado riesgo individual y riesgo comunitario limitado
GRUPO III: agentes con elevado riesgo individual y bajo riesgo para la comunidad
GRUPO IV: agentes con alto riesgo para el individuo y para la comunidad
NORMAS GENERALES DE BIOSEGURIDAD

PRECAUCIONES QUE DEBA ADOPTAR EL PERSONAL DE LABORATORIO
No se permitir comer, beber, fumar y/o almacenar comidas as como cualquier otro tem
personal (maquillaje, cigarrillos, etc.) dentro del rea de trabajo.
Usar bata de manga larga dentro de laboratorio, la cual se pondr al momento de entrar y
deber ser quitada inmediatamente antes de abandonar el laboratorio.
Asegurarse de no presentar cortes, raspones u otras lastimaduras en la piel y en caso de

que as sea cubrir la herida de manera conveniente.
Usar guantes de ltex de buena calidad para todo manejo de material biolgico o donde
exista, aunque sea de manera potencial, el riesgo de exposicin a sangre o fluidos
corporales. Cambiar los guantes toda vez que hayan sido contaminados, lavarse las manos
y ponerse guantes limpios.
No tocar los ojos, nariz o piel con las manos enguantadas.
No abandonar el laboratorio o caminar fuera del lugar de trabajo con los guantes puestos.
Bajo ninguna circunstancia se pipeteara sustancia alguna con la boca, para ello se utilizaran
peras plsticas o pipeteadores automticos.
Lavar las manos con jabn y agua inmediatamente despus de realizar el trabajo. Descartar
los guantes de ltex en un recipiente con solucin desinfectante.
No detener manualmente la centrifuga, no destaparla antes de que cese de girar.
No permitir la entrada de personas ajenas al laboratorio y/o que no tengan sus

implementos de bioseguridad adecuados.
Emplear en todo momento las medidas de bioseguridad aqu expuestas
DERRAMES Y ACCIDENTES
Cuando se produzca derrame de material infectado o potencialmente infectado, el

operador deber ponerse guantes y luego cubrir el fluido derramado con papel
absorbente, derramar alrededor de este solucin descontaminante, y finalmente verter
solucin descontaminante sobre el papel y dejar actuar por 10 minutos.
Usando papel absorbente seco y limpio levantar el material y arrojarlo al recipiente de

desechos contaminados para su posterior eliminacin. La superficie deber ser enjuagada
con solucin descontaminante.
5|P gi na
No se recomienda el uso de alcohol ya que evapora rpidamente y coagula los residuos

orgnicos superficiales sin penetrar en ellos.
Durante todo el procedimiento de desinfeccin deber usarse guantes y evitar el contacto

con el material derramado y desinfectado.
Los pinchazos, heridas punzantes, lastimaduras y piel contaminada por salpicadura de

materiales infectados debern ser lavados con abundante agua y jabn desinfectante. Se
deber favorecer el sangrado de la herida.
Si un trabajador sufre exposicin parenteral o de las membranas mucosa a sangre o fluidos

corporales, se deber identificar el material y, si es posible determinar la presencia de virus
o anticuerpos. El trabajador deber informar cualquier enfermedad febril aguda que ocurra
dentro de las doce semanas posteriores a la exposicin.
ELEMENTOS PROTECTORES Y SU USO ADECUADO
Se usaran guantes de ltex en todo procedimiento que implique el manejo de material

biolgico o donde exista el riesgo de exposicin a sangre o fluidos corporales, as mismo
debern usarse en los procesos de descontaminacin y eliminacin de residuos
contaminados.
Los guantes debern ser descartados una vez hayan sido contaminados en los sitios
dispuestos para los residuos contaminados, y luego reemplazados por otros.
No tocar los ojos, nariz o piel con las manos enguantadas.
Usar mascarilla en los procedimientos en los que pueda haber riesgo de salpicadura de
material biolgico en la mucosa bucal y nasal.
El uso de la bata ser obligatorio en todo momento dentro del laboratorio, la cual deber
ser retirada antes de salir del laboratorio. Esta deber ser de manga larga para protegerse
de cualquier reactivo o agente qumico, o material biolgico manipulado en el laboratorio.
Debern usarse zapatos cerrados dentro del laboratorio para evitar el contacto de la piel
con material contaminado o cualquier producto qumico peligroso, por derramamiento o
salpicadura.
Deber usarse gorro de tela para evitar el contacto directo del cabello con material
contaminado o sustancias qumicas peligrosas.
MANIPULACION Y EVACUACION DE DESECHOS CONTAMINADOS
Todo el equipo reusable (puntas de micropipetas, cnulas, tubos, etc.) deber ser ubicado
en un recipiente metlico o de plstico resistente a punciones y cortaduras, que contenga
liquido descontaminante y deber estar localizado en el mismo lugar de trabajo.
Despus es preciso desinfectar el material con sustancias qumicas antes de limpiarlo e

introducirlo en la autoclave.
Todo elemento descartable (agujas, jeringas, etc.) deber ser colocado en un recipiente de
material resistente a punciones y cortaduras. Estos recipientes deben ser preferiblemente
amplios de paredes rgidas y semirrgidas, con tapa asegurada para su posterior descarte y
contener en su interior una solucin descontaminante, y estar ubicados lo ms cerca
posible del lugar de uso de los instrumentos.
6|P gi na
Para la eliminacin de todo material contaminado, el mtodo de eleccin es la incineracin

de los mismos, o el material puede ser autoclavado y luego destruido o enterrado.
Los residuos lquidos que se sospechen estn contaminados deben ser tratados con
desinfectantes antes de su eliminacin o colectados en recipientes que sean eliminados en
forma segura
SOLUCIONES DESINFECTANTES
Todos los materiales utilizados con las muestras de los pacientes o con los pacientes debern
ser descontaminados, la solucin desinfectante utilizada va a depender del tipo de material de
que se trate y al grado de contaminacin.
Para la descontaminacin del material descartable (agujas, jeringas, etc.) se utilizara

hipoclorito de sodio al 10% (clorox, lmpido). Se preparara la concentracin de hipoclorito
indicada en el momento en que ser utilizada.
Las agujas se descartaran junto con la jeringa en el recipiente destinado para esto sin
colocar los protectores ni doblarse, junto con otros materiales punzo-cortantes. El material
se expondr a la accin del hipoclorito durante 30 minutos.
Pasado el tiempo se toma el material (con pinzas o otro mtodo que impida el contacto
con este) dejando que se escurra la solucin descontaminante, y se dejara caer en una caja
de cartn, cerrar la caja y colocarla en una bolsa de residuos de color oscuro.
Descartar la solucin de hipoclorito por el desage.
Para la descontaminacin del material reusable se utilizara Glutaraldehido al 2% por ser

menos corrosivo.
Se utilizaran dos recipientes, uno con agua destilada donde se sumergir el material para
retirar la mayor cantidad posible de las materias orgnicas que contengan. Y otro
recipiente con glutaraldehido al 2% donde se sumergir el material durante 30 minutos.
Despus de este tratamiento se retirara el material para lavarlo y esterilizarlo.
La solucin de glutaraldehido tiene una duracin promedio de 28 das, pero se debe

controlar su pH diariamente. El agua destilada se descartara cada vez que sea utilizada.
Ambas soluciones se descartaran en el desage.
Las superficies de trabajo debern limpiarse diariamente con solucin desinfectante. Esta
solucin puede ser hipoclorito de sodio.
VIGILANCIA Y EVALUACION
Resulta necesario que exista una organizacin y medidas apropiadas que garanticen la
seguridad del personal de los laboratorios y de los que le rodean. En correspondencia con los
grupos de riesgo se han elaborado tambin cuatro niveles de bioseguridad, o sea,
combinaciones tcnicas y prcticas de laboratorio, equipos de seguridad y facilidades del
laboratorio apropiadas para el riesgo que representan los agentes infecciosos que se
manipulan en estos lugares.
Otras funciones relativas a la organizacin de la seguridad en los laboratorios son:
Redactar protocolos de bioseguridad en cada rea y velar por su debido cumplimiento.
Implantar procedimientos de emergencia, particulares y generales, para casos de

accidentes laborales de cualquier tipo.
7|P gi na
Garantizar el entrenamiento adecuado del personal que trabaja en el laboratorio.
Velar por que se cumplan las disposiciones relativas a la seguridad del transporte y
recepcin o envo de materiales que contengan o con sospechas de contener agentes
patgenos.
FACTORES DE RIESGO
Se conoce como factores de riesgo a todos los elementos, sustancias, procedimientos o
acciones humanas presentes en el ambiente laboral que de una u otra forma tienen la capacidad
de producir lesiones al individuo o daos materiales en el trabajo; encontrndose as en la fuente,
el medio o en las personas y tienen como caracterstica fundamental que son fcilmente
controlables. Los diferentes factores a que estamos expuestos como trabajadores del rea de la
salud, se pueden clasificar en fsicos, qumicos, ergonmicos, elctricos, psicosociales y biolgicos.
FISICOS
Son los factores que actan sobre tejidos y rganos no por composicin qumica sino por
efectos energticos. Se dividen en:
Formas Ondulatorias:
Ruidos, Vibraciones
Temperaturas extremas: afectan de forma hormonal y/o humoral al trabajador.

Radiaciones:
No ionizantes (UV, IR, RV, microondas)
Ionizantes (Rayos X, neutrones)
Las radiaciones estn determinadas por dos fuentes:
Emisores deliberados: TV, estaciones radiales, etc.
Emisores accidentales: equipos elctricos, etc.
La luz como fuente de energa y como agente fsico posee tambin sus fuentes:
Natural: sol, luna.
Artificial: lmparas de gas, incandescentes, etc.
QUIMICOS
Los factores qumicos son aquellos que por su composicin qumica son capaces de daar
temporal o definitivamente al organismo expuesto. Se pueden clasificar en:
Slidos
Polvos
Humos
Lquidos
Vapores
Neblinas
Rocos
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Gases
Estos agentes qumicos pueden penetrar al organismo por diferentes mecanismos de

absorcin, como son: vas respiratorias, piel, vas digestivas y mucosas. Todos los agentes
qumicos tienen efectos nocivos ya que pueden afectar localmente al organismo o en forma
general lo que muchas veces casa efectos irritantes, asfixiantes, cancergenos, mutagenicos,
etc.
ERGONOMICOS
La iluminacin deficiente.
El diseo deficiente del sitio de trabajo y sus mobiliarias.
Hay que tener en cuenta las posturas y posiciones del cuerpo pues llevan a incurrir al
padecimiento de lumbagos, inflamaciones, mala circulacin, etc.
Las cargas pesadas, se debe tener mucho cuidado cuando se maneja con ellas, pues hay
condiciones y parmetros que indican la relacin del peso de la carga, pues muchas veces
ocasiona desgarros, etc.
ELECTRICOS
Entre los factores elctricos que le pueden causar mal al trabajador estn: el no hacer
control de calidad a la maquinaria o equipos que funcionan con electricidad, ya que los cables
pueden tener peladuras o no se les este dando un buen manejo lo que conlleva a un riesgo para el
trabajador.
Tambin el sitio donde est ubicado el equipo, pues este no debe estar en sitios donde se
puedan tropezar con l o donde estn en contacto con agua porque puede haber una explosin o
una descarga elctrica para los que estn cerca.
PSICOSOCIALES
Consisten en los cambios inesperados que se presentan en un individuo en su rea de
trabajo lo cual conlleva a perjuicios en su salud:
o
El trabajo repetitivo causa desinters y desmotivacin por el mismo, lo cual con un

aumento en su actividad diaria ocasiona el estrs laboral.
El desequilibrio psicofsico tiene como consecuencia malas relaciones con los
compaeros, ya que se vuelve poco tolerante y mal humorado.
Tambin suceden con frecuencia alteraciones psicosomticas que se detectan con
cefalea, trastornos digestivos, asma, etc.
El estrs ocupacional son alteraciones del individuo a nivel fsico y mental, algunas
manifestaciones mentales de estrs son:
o
Subjetivos: ansiedad.
Comportamiento: aislamiento de la familia.
Trastornos psiquitricos, clnicos
Trastornos adoptivos, afectivos.
9|P gi na
BIOLOGICOS
De todos los factores de riesgo existentes en un laboratorio, los riesgos biolgicos son los
ms importantes por la variedad y gran agresividad de microorganismos que se presentan
(bacteria, virus y hongos), que causan accidentes o enfermedades profesionales.
Los riesgos de peligrosidad variables a los que est sujeto el personal de laboratorios
hematolgicos, los cuales son potencialmente letales, destacan el riesgo de contraer infecciones
con los agentes patgenos objeto de trabajo o con otros no sospechosos que se encuentran
presentes en las muestras que se reciben en el laboratorio, estos agentes se comportan como
riesgo primario para el operador y en ocasiones para la comunidad.
Los riesgos biolgicos inducen infecciones agudas y crnicas, parasitismo y reacciones
toxicas y alrgicas a agentes vegetales y animales. Las infecciones pueden ser causadas por
bacteria, virus, Ricketsias, Chlamydia, hongos y parsitos. Se considera que entre las causas ms
frecuentes de infeccin en el personal de laboratorio, se encuentran:
o
Accidentes de trabajo al manipular las muestras
Negligencia e inobservancia de reglamentos al manipular agentes infecciosos
No disponer de medios adecuados de proteccin
Personal inadecuadamente entrenado
Por estas razones hemos elaborado este manual de recomendaciones y educacin sobre
algunas medidas generales y especificas que se deben tener en cuenta en laboratorios donde se
trabaje con agentes infecciosos para el hombre.
10 | P g i n a
Laboratorio 02
MATERIALES Y EQUIPOS DEL

LABORATORIO DE
MICROBIOLOGIA
UNFV
FIIS
Ing. AGROINDUSTRIAL
MICROBIOLOGIA I
11 | P g i n a
MATERIALES Y EQUIPOS DEL

LABORATORIO DE MICROBIOLOGIA
I. INTRODUCCION
En un laboratorio de qumica se utiliza una amplia variedad de instrumentos utilizados por

los cientficos que trabajan en l. Esto incluye tanto los dispositivos como mechero Bunsen y
microscopios como los equipos especializados, tales como espectrofotmetros y calormetros. En
su conjunto, se denominan material de laboratorio.
En el desarrollo del laboratorio de microbiologa, se hace necesario el uso de materiales y
equipos que faciliten la realizacin de las prcticas. Ciertos materiales usados pueden ser de
acero inoxidable y de vidrio. Los hay de vidrio resistente a altas temperaturas por su alto
contenido de dixido de silicio, bajo lcali, cido brico, lo que condiciona su escaso coeficiente de
dilatacin, teniendo gran aplicacin en la fabricacin de los materiales de vidrio conocido como
pyrex. En esta prctica se conocer diversos materiales de vidrio y equipos as como sus
aplicaciones en el laboratorio de microbiologa.
II. OBJETIVOS
-
Identificar, discriminar y describir los materiales de laboratorio.

Aprender el manejo correcto de los materiales y equipos de laboratorio.
Clasificar e identificar las funciones de los materiales y equipos de laboratorio.
III. MATERIALES Y EQUIPOS

3.1 MATERIALES
1. Tubo de Pruebas. Son de vidrio, generalmente pyrex. Sirven para ensayos
qumicos con pequeas cantidades de reactivos. Hay de diferentes capacidades.
Ofrecen resistencia al calentamiento y a los cambios bruscos de temperatura.
2. Vaso de precipitado. Son de vidrio pyrex. Hay de diversas capacidades:

20 ml, 50 ml, 100 ml, 400 ml y 1000 ml. Algunos presentan pico se les
conoce como beaker.
3. Pipetas. Es de vidrio. De forma cilndrica, huecas en ambos extremos, la

parte inferior ms delgada que la superior. Sirven para medir lquidos. Hay de
1, 5, 10, 15 ml.
12 | P g i n a
4. Placa petri. Se usa mucho en microbiologa, para sembrar

muestras en medios de cultivo que sirven para el desarrollo de
microorganismos. Tiene forma de plato plano con bordes
elevados que consta de una base y una tapa.
5. Asa de kohle. Est formada por una base que puede estar hecha de platino, acero,
aluminio y un filamento que puede ser de nicromo, tungsteno o platino que termina en un
aro o punta. Nos ayuda a transportar microorganismos de un medio a otro.
6. Aguja de Kohle. Sirve para realizar la siembra de un cultivo
7. Campana de Durham. Se colocan en los tubos de prueba y sirve para indicar la presencia
de gases en el medio de cultivo.
8. Mechero Bunsen. Funciona con gas y aire para proporcionar buena

cantidad de calor.
9. Pinza de metal. Para soportar, quitar materiales del horno u otra fuente de
calor.
10. Papel Kraft. Se utiliza para envolver los materiales de vidrio y

someterlos a esterilizacin.
11. Propipeta. Se utiliza para succionar lquidos a travs de la pipeta.
12. Luna reloj. Es un recipiente para pesar agares.
13. Hervidor. Se utiliza para esterilizar frascos de vidrios.
15. Esptula de metal. Para tomar cantidades de muestra.
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3.2 EQUIPOS
1. Incubadora. Permite mantener caliente el producto en prueba.
2. Estufa Elctrica. Se utiliza para esterilizacin de materiales, para la

determinacin de la humedad de muestras de alimentos. Aqu se
pueden controlar las temperaturas de secado.
3. Centrifugas. Funcionan a velocidades relativamente altas 4000
rpm. Se usan para separar un compuesto de menor densidad en

base a la precipitacin
4. Microondas. Cada vez son ms populares y se utilizan para calentar

medios con agar. Las botellas o matraces deben tener el tapn aflojado ya
que si est cerrado estallan fcilmente.
5. Bao mara. Es un equipo de acero inoxidable, donde se calienta

agua que va hasta los 90o C. y es usado para experimentos que
requieren calentamiento a vapor.
6. Microscopio. Equipo que permite la observacin de objetos y detalles de

estructuras tan pequeas que no podran ser observadas a simple vista.
7. Cabinas de Seguridad Biolgica. Son recintos ventilados diseados para

limitar al mximo el riesgo del personal del laboratorio expuesto a agentes
infecciosos. Estos equipos tienen como objetivo principal proporcionar una zona
de trabajo que minimice la probabilidad que una partcula transportada por el
aire tiende a escapar hacia el exterior de la cabina y contaminar as al operario y
a la zona que lo rodea.
8. Autoclaves. Se utiliza para esterilizacin de materiales. Deben poseer manmetro y termostato,

as como vlvula de seguridad, sistema de desconexin.
9. Congeladores. Permite almacenar cultivos previamente envasados y sellados. No se deben llenar
completamente para evitar que rebosen por el incremento de volumen
14 | P g i n a
Material de
madera
Material de
plstico o goma
Material de vidrio
Material de
metal
Material
Instrumentos
de
de medicin
porcelana
Crisol
Calormetro
Gradilla
Gradilla
Alambique, Ampolla de
decantacin
Anillo de hierro
Mortero
(utensilio)
Pipeta (qumica)
Baln de destilacin,
Bureta
Doble nuez
Mortero
(utensilio)
Pizeta
Cristalizador,
Cuentagotas, Aparato
de Kipp
Esptula
Embudo
Bchner
Probeta (qumica)
Embudo de
decantacin, Matraz de
Erlenmeyer
Kitasato, Matraz
aforado
Pera de succin
Material
volumtrico
Instrumentos
trmicos
Bureta
Calormetro, Cmara
infrarroja
Colormetro
Matraz aforado
Espectrofotmetro
de transformada de
Fourier
Micropipeta
Hipsmetro,
Termmetro de
mximas y mnimas
Termmetro de
Breguet, Termmetro
de alcohol
Gradilla
Espectrmetro
Probeta
(qumica)
Termmetro de bulbo,
Pirmetro
Pie universal
PH-metro
Pipeta (qumica)
Termmetro de bulbo
hmedo, Psicrmetro
Placa de Petri, Pipeta

(qumica)
Agitador magntico
RIFMA
Tapn
Probeta (qumica),
Retorta, Viscosmetro
Asa bacteriolgica
Densmetro
Tubo de
microcentrfuga
Serpentn, Extractor
Soxhlet
Autoclave de
laboratorio
Tubo de ensayo, Tubo

refrigerante (qumica)
Bao Mara
Varilla de vidrio
(qumica), Vaso de
precipitados
Vidrio de reloj
(qumica), Picnmetro,
Centrfuga
Propipeta
Mechero Bunsen,
Termociclador
Termmetro de
mercurio, Termmetro
de resistencia
Termmetro,
Termistor, Termostato
Termmetro de gas,
Termoscopio
Laboratorio 04
PREPARACION DE
MEDIOS DE CULTIVO
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Ing. AGROINDUSTRIAL
MICROBIOLOGIA I
PREPARACION DE MEDIOS DE CULTIVO

I. INTRODUCCION
Uno de los sistemas ms importantes para la identificacin de microorganismos es
observar su crecimiento en sustancias alimenticias artificiales preparadas en el laboratorio. El
material alimenticio en el que crecen los microorganismos es el Medio de Cultivo y el crecimiento
de los microorganismos es el Cultivo. Se han preparado ms de 10.000 medios de cultivo
diferentes.
Para que las bacterias crezcan adecuadamente en un medio de cultivo artificial debe reunir
una serie de condiciones como son: temperatura, grado de humedad y presin de oxgeno
adecuada, as como un grado correcto de acidez o alcalinidad. Un medio de cultivo debe contener
los nutrientes y factores de crecimiento necesarios y debe estar exento de todo microorganismo
contaminante.
II. OBJETIVOS
-
Identificar las clases de medios de cultivo

Preparar medios de cultivo lquidos y slidos
Identificar los requerimientos nutricionales de los microorganismos.
III. GENERALIDADES
Uno de los sistemas ms importantes para la identificacin de

microorganismos es observar su crecimiento en sustancias alimenticias
artificiales preparadas en el laboratorio. El material alimenticio en el que
crecen los microorganismos es el Medio de Cultivo y el crecimiento de los
microorganismos es el Cultivo. Se han preparado ms de 10.000 medios de
cultivo diferentes.
Para que las bacterias crezcan adecuadamente en un medio de cultivo artificial debe reunir
una serie de condiciones como son: temperatura, grado de humedad y presin de oxgeno
adecuado, as como un grado correcto de acidez o alcalinidad. Un medio de cultivo debe contener
los nutrientes y factores de crecimiento necesarios y debe estar exento de todo microorganismo
contaminante.
La mayora de las bacterias patgenas requieren nutrientes complejos
similares en composicin a los lquidos orgnicos del cuerpo humano. Por eso, la
base de muchos medios de cultivo es una infusin de extractos de carne y
Peptona a la que se aadirn otros ingredientes.
El agar es un elemento solidificante muy empleado para la preparacin
de medios de cultivo. Se lica completamente a la temperatura del agua
hirviendo y se solidifica al enfriarse a 40 grados. Con mnimas excepciones no
tiene efecto sobre el crecimiento de las bacterias y no es atacado por aquellas
que crecen en l.
La Gelatina es otro agente solidificante pero se emplea mucho menos ya que bastantes
bacterias provocan su licuacin.
17 | P g i n a
En los diferentes medios de cultivo se encuentran numerosos materiales de

enriquecimiento como hidratos de carbono, suero, sangre completa, bilis, etc. Los hidratos de
Carbono se adicionan por dos motivos fundamentales: para incrementar el valor nutritivo del
medio y para detectar reacciones de fermentacin de los microorganismos que ayuden a
identificarlos. El suero y la sangre completa se aaden para promover el crecimiento de los
microorganismos menos resistentes.
Tambin se aaden colorantes que actan como indicadores para detectar, por ejemplo, la
formacin de cido o como inhibidores del crecimiento de unas bacterias y no de otras (el Rojo
Fenol se usa como indicador ya que es rojo en pH bsico y amarillo en pH cido. La Violeta de
Genciana se usa como inhibidor ya que impide el crecimiento de la mayora de las bacterias Grampositivas).
Condiciones generales para el cultivo de microorganismos
El desarrollo adecuado de los microorganismos en un medio de cultivo se ve afectado por
una serie de factores de gran importancia y que, en algunos casos, son ajenos por completo al
propio medio.
1. Disponibilidad de nutrientes adecuados
Un medio de cultivo adecuado para la investigacin microbiolgica ha de contener, como
mnimo, carbono, nitrgeno, azufre, fsforo y sales inorgnicas. En muchos casos sern
necesarias ciertas vitaminas y otra sustancia inductoras del crecimiento. Siempre han de
estar presentes las sustancias adecuadas para ejercer de donantes o captadores de
electrones para las reacciones qumicas que tengan lugar.
Todas estas sustancias se suministraban originalmente en forma de infusiones de carne,
extractos de carne o extractos de levadura. Sin embargo, la preparacin de estas sustancias
para su aplicacin a los medios de cultivo provocaba la prdida de los factores nutritivos
lbiles.
Actualmente, la forma ms extendida de aportar estas sustancias a los medios es utilizar
peptona que, adems, representa una fuente fcilmente asequible de nitrgeno y carbn
ya que la mayora de los microorganismos, que no suelen utilizar directamente las
protenas naturales, tienen capacidad de atacar los aminocidos y otros compuestos ms
simples de nitrgeno presentes en la peptona.
Ciertas bacterias tienen necesidades nutritivas especficas por lo que se aade a muchos
medias sustancias como suero, sangre, lquido asctico, etc. Igualmente pueden ser
necesarios ciertos carbohidratos y sales minerales como las de calcio, magnesio,
manganeso, sodio o potasio y sustancias promotoras del crecimiento, generalmente de
naturaleza vitamnica.
Muy a menudo se aaden al medio de cultivo ciertos colorantes, bien como indicadores de
ciertas actividades metablicas o bien por sus capacidades de ejercer de inhibidores
selectivos de ciertos microorganismos.
18 | P g i n a
2. Consistencia adecuada del medio
Partiendo de un medio lquido podemos modificar su consistencia aadiendo productos

como albmina, gelatina o agar, con lo que obtendramos medios en estado semislido o
slido. Los medios solidificados con gelatina tienen el gran inconveniente de que muchos
microorganismos no se desarrollan adecuadamente a temperaturas inferiores al punto de
fusin de este solidificante y de que otros tienen la capacidad de licuarla.
Actualmente los medios slidos son de uso universal, por su versatilidad y comodidad, pero
hay tambin gran cantidad de medios lquidos cuyo uso est ampliamente extendido en el
laboratorio.
3. Presencia (o ausencia) de oxgeno y otros gases
Gran cantidad de bacterias pueden crecer en una atmsfera con tensin de oxgeno
normal. Algunas pueden obtener el oxgeno directamente de variados sustratos. Pero los
microorganismos anaerobios estrictos slo se desarrollarn adecuadamente en una
atmsfera sin oxgeno ambiental. En un punto intermedio, los microorganismos
microaerfilos crecen mejor en condiciones atmosfricas parcialmente anaerobias (tensin
de oxgeno muy reducida), mientras los anaerobios facultativos tienen un metabolismo
capaz de adaptarse a cualquiera de las citadas condiciones.
4. Condiciones adecuadas de humedad
Un nivel mnimo de humedad, tanto en el medio como en la atmsfera, es imprescindible
para un buen desarrollo de las clulas vegetativas microbianas en los cultivos. Hay que
prever el mantenimiento de estas condiciones mnimas en las estufas de cultivo a 35-37C
proporcionando una fuente adecuada de agua que mantenga la humedad necesaria para el
crecimiento de los cultivos y evitar as que se deseque el medio.
5. Luz ambiental
La mayora de los microorganismos crecen mucho mejor en la oscuridad que en presencia
de luz solar. Hay excepciones evidentes como sera el caso de los microorganismos
fotosintticos.
6. pH
La concentracin de iones hidrgeno es muy importante para el crecimiento de los
microorganismos. La mayora de ellos se desarrollan mejor en medios con un pH neutro,
aunque los hay que requieren medios ms o menos cidos. No se debe olvidar que la
presencia de cidos o bases en cantidades que no impiden el crecimiento bacteriano
pueden sin embargo inhibirlo o incluso alterar sus procesos metablicos normales.
7. Temperatura
Los microorganismos mesfilos crecen de forma ptima a temperaturas entre 15 y 43C.
Otros como los psicrfilos crecen a 0C y los temfilos a 80C o incluso a temperaturas
superiores (hipertemfilos). En lneas generales, los patgenos humanos crecen en rangos
de temperatura mucho ms cortos, alrededor de 37C, y los saproftos tienen rangos ms
amplios.
19 | P g i n a
8. Esterilidad del medio
Todos los medios de cultivo han de estar perfectamente estriles para evitar la aparicin
de formas de vida que puedan alterar, enmascarar o incluso impedir el crecimiento
microbiano normal del o de los especmenes inoculados en dichos medios. El sistema
clsico para esterilizar los medios de cultivo es el autoclave (que utiliza vapor de agua a
presin como agente esterilizante)
La evolucin de los medios de cultivo
Podemos decir que la microbiologa empieza su verdadero desarrollo como ciencia en el
momento en que se descubre el microscopio y comienza la observacin de los primeros
microorganismos, pero es indudable que la puesta a punto de los medios de cultivo y la utilizacin
del agar como solidificante, marcan dos importantes puntos de inflexin en su evolucin. La
primera noticia de la utilizacin de medios de cultivo nos llega del miclogo Brefeld, que consigui
aislar y cultivar esporas de hongos en medios slidos realizados a base de gelatina.
Sin embargo este sistema no era adecuado para las bacterias (por su menor tamao) y no
fue hasta el ao 1878 cuando Lister populariz un mtodo enfocado al cultivo puro basado en
diluciones seriadas en un medio lquido. Koch realiz sus investigaciones utilizando en un primer
momento rodajas de patata como soporte nutritivo slido, pero no tard en recurrir al caldo de
carne lquido, diseado por Loeffler, al que, en 1881, aadi gelatina, logrando un medio slido
transparente ideal para la observacin de la morfologa macroscpica de las colonias microbianas.
En el ao 1882 tiene lugar uno de los grandes avances de la microbiologa en relacin con
los medios de cultivo: el mdico alemn Walter Hesse introduce el agar-agar (polisacrido extrado
de algas rojas) como solidificante. En 1887 un ayudante de Koch llamado Petri, comienza a utilizar
placas de cristal planas, que se llaman desde entonces placas de Petri, para sustituir a las clsicas
bandejas de vidrio cubiertas con campanas que se usaban hasta entonces.
Beijerinck y Winogradsky, que desde de 1888 realizaron sus investigaciones sobre las
bacterias quimioauttrofas (utilizacin de nitrgeno y azufre sobre todo) tuvieron gran
importancia en el desarrollo de los medios selectivos y de enriquecimiento. Disearon este tipo de
medios de tal forma que su especial composicin qumica favoreca el crecimiento de ciertos tipos
de microorganismos que, en funcin de sus procesos metablicos, eran los nicos capaces de
utilizar para su desarrollo ciertos nutrientes del medio.
En 1892 Wrtz impuls el uso de los medios diferenciales, incorporando indicadores de pH
a la composicin de ciertos medios con lo cual se poda observar la produccin de cidos en la
fermentacin en ciertos microorganismos.
Tipos bsicos de medios de cultivo
Atendiendo a su estado fsico:
o
Lquidos
Semislidos
slidos
20 | P g i n a
Atendiendo a su utilidad prctica:
Para usos generales: no selectivos, para cultivo de una amplia variedad de

organismos difciles de hacer crecer. A menudo estn enriquecidos con materiales
como: sangre, suero, Hemoglobina, FX, FV, glutamina, u otros factores accesorios
para el crecimiento de las bacterias (Agar Sangre, Schaeadler, etc.)
selectivos: (pueden ser de moderada o de alta selectividad) se

aaden sustancias que inhiban el crecimiento de ciertos grupos de
bacterias, permitiendo a la vez el crecimiento de otras. Variando las
sustancia aadidas, se vara el tipo y grado de selectividad (Mac
Conkey, Kanamicina-Vancomicina).
enriquecidos: ralentizan/suprimen el crecimiento de la flora

competitiva normal potenciando el cultivo y crecimiento deseado
(Selenito, medio con Vitamina K).
Para aislamientos especializados: formulaciones nutritivas especiales

que satisfacen requerimientos de grupos especficos de bacterias,
ayudando a su identificacin (Lowenstein).
Medios para identificacin:
diferenciales: formulaciones especiales en las que se estudian las

peculiaridades fisiolgicas (nutricin y respiracin sobre todo)
especficas de las bacterias. Seleccionando los medios adecuados se
puede llegar a la identificacin de casi cualquier bacteria (OxidacinFermentacin).
IV CUESTIONARIO.
1. Por qu se prepara los medios en agua destilada?
La ventaja es que el agua destilada es 100% pura, y es apta para el crecimiento de
las bacterias en ella, a una temperatura adecuada, el agua destilada es la indicada para los
medios de cultivo por estas razones. Para limpiar materiales de laboratorio, es la mejor, ya
que esta purificada y libre de partculas contaminantes.
El agua destilada es aquella cuya composicin se basa en la unidad de molculas de
H2O. Es aquella a la que se le han eliminado las impurezas e iones mediante destilacin. La
destilacin es un mtodo, en desuso para la produccin de agua pura a nivel industrial.
Esta consiste en separar los componentes lquidos de una mezcla.
2. Realice una descripcin del agar-agar, su composicin qumica, sus funciones,
aplicaciones.
Agar-agar o agar es una substancia gelatinosa derivada de algas marinas. El medio
de cultivo es un polisacrido sin ramificaciones obtenido de la pared celular de varias
especies de algas rojas de los gneros Gelidium, Euchema y Gracilaria entre otros actuando
como pigmento que da un color caracterstico a cada una. La palabra agar viene del malayo
agar-agar, que significa jalea.
21 | P g i n a
Qumicamente el agar es un polmero de subunidades de galactosa; en realidad es

una mezcla heterognea de dos clases de polisacridos: agaropectina y agarosa.1 Aunque
ambas clases de polisacridos comparten el mismo esqueleto de galactosa, la agaropectina
est modificada con grupos cidos, tales como sulfato y piruvato. Los polisacridos de agar
sirven como la estructura primaria de la pared celular de las algas. Disuelto en agua
caliente y enfriado se vuelve gelatinoso. Su uso principal es como medio de cultivo en
microbiologa, otros usos son como laxante, espesante para sopas, gelatinas vegetales,
helados y algunos postres y como agente aclarador de la cerveza.
Medios selectivos
Los medios de agar selectivos son utilizados para aplicar una presin selectiva a los
organismos que crecen en ellos, por ejemplo para seleccionar solamente bacterias gramnegativas se usa el agar Mac Conkey, que a su vez tiene un colorante que indica si la
bacteria es fermentadora de lactosa o no.
Usos en biologa molecular
La carga neutra y el bajo grado de complejidad qumica de la agarosa hacen poco
probable que interaccione con biomolculas, como protenas. Los geles hechos de agarosa
purificada tienen un tamao de poro relativamente grande, hacindolo til para la
separacin basada en el tamao molecular de complejos de protenas o protenas mayores
a 200 KDa y fragmentos de ADN mayores a 100 pares de bases. La agarosa se puede utilizar
para la separacin electrofortica en la electroforesis de gel de agarosa o para la
cromatografa de exclusin molecular. Y como tambin otro contenido.
Uso en la cocina
Esta alga tiene su origen en los mares del sur de frica. Es incoloro, inspido y
absorbe agua en cantidades de 200 y 300 veces su peso, formando una gelatina. Tambin
hay un producto comercial denominado "agar-agar". Se utiliza entre otras cosas como
estabilizador de algunos alimentos y comestibles y para la realizacin de gelatinas.
Su poder gelificante es su gran baza pues, con muy poco polvo de gelatina en una
proporcin de agua abundante, da lugar a una gelatina muy dura y compacta; en caliente
gelifica, a diferencia de la gelatina de colas de pescado que tiene que estar completamente
fra para que cuaje. Tambin cabe destacar que gelifica zumos de frutas exticas (como la
pia) y que la gelatina normal no puede gelificar por la acidez de stos zumos. Por otra
parte tambin se puede utilizar en la fabricacin de gomitas.
No hace efecto para gelatinizar en contacto con productos grasos, como caldos sin
desgrasar o productos aceitosos. Para hace gelatinas rgidas se deben de aadir a caldos
hirviendo 16 gramos por litro, y para gelatinas ms blandas para base de platos aadir 6
gramos y 5 hojas de cola de pescado por litro; tiene que cocer bien para que no aparezca el
agar-agar en forma de puntos.
22 | P g i n a
3. Describa la formulacin y preparacin de los siguientes medios: bsicos, selectivos,

enriquecidos, de enriquecimiento, diferenciales, especiales.
Medios de cultivo bsicos. Permiten el crecimiento de una gran variedad de

microorganismos. Pertenecen a esta categora las infusiones de extractos de carne y
peptona, una mezcla de composicin similar a la de los lquidos orgnicos, que se utiliza
para muchas bacterias patgenas (causantes de enfermedades).
Medios de cultivo selectivos. Favorecen el crecimiento de un gnero o de una especie
concreta de microorganismos. Son muy tiles para aislar ciertos microorganismos a partir
de una poblacin mixta. Por ejemplo, si a un cultivo se le aade un inhibidor del
crecimiento de bacterias Gram +, como el cristal violeta, nos aseguramos de que en ese
cultivo slo van a crecer bacterias Gram -. Pertenecen a esta categora el caldo lactosa bilis
verde brillante o el agar Salmonella-Shigella. Segn el procedimiento que se utiliza para
favorecer el crecimiento de microorganismos concretos, podemos distinguir entre medios
de cultivo diferenciales y medios de enriquecimiento.
Medios de cultivo diferenciales. Utilizan propiedades diferenciales del crecimiento
microbiano. El medio de cultivo con agar sangre diferencia las bacterias hemolticas de las
no hemolticas, el medio de cultivo de McConkey diferencia a las que son lactosa (+) de los
lactosa (-).
Medios de enriquecimiento. Deberan llamarse medios enriquecidos porque lo que se hace
es aadir aditivos, que favorecen el crecimiento de un grupo determinado de
microorganismos, y neutralizantes que inhiben el crecimiento de otros microorganismos
que interferiran con el que estamos buscando. Se puede adicionar sangre, suero o
extractos de tejidos animales o de plantas. Por ejemplo el caldo selenito cistina o el caldo
agar sangre
23 | P g i n a
Laboratorio 05
SIEMBRA DE
MICROORGANISMOS
UNFV
FIIS
Ing. AGROINDUSTRIAL
MICROBIOLOGIA I
24 | P g i n a
SIEMBRA DE MICROORGANISMOS
I. OBJETIVOS
Aplicar tcnica de siembra en medios lquidos.
Observar el crecimiento de bacterias en los diversos medios de cultivo.
Identificar caractersticas de desarrollo de microorganismos.
II. INTRODUCCION
Para efectuar el estudio de los microorganismos, se han diseado diversos mtodos que
permiten cultivarlos bajo condicione artificiales, en los que es posible cultivarlos bajo condiciones
experimentales y manejar un solo tipo de microorganismo. Una de las tcnicas ms usadas en el
laboratorio de microbiologa consiste en transferir una muestra microbiolgica de un ambiente
determinado a un medio de cultivo, lo que permite obtener cultivos microbianos. A l efectuar este
procedimiento, es necesario considerar que en el rea de trabajo, existen muchos otros
microorganismos; debido a esto, es necesario tomar precauciones para impedir que stos
penetren y contaminen los cultivos en estudio. Por otra parte, para considerar no slo el aspecto
nutricional, sino tambin las condiciones ambientales de su hbitat natural, por lo que en el medio
de cultivo se debe ajustar el pH y concentracin de sales y durante la incubacin condiciones tales
como la temperatura, aireacin la luminosidad.
La aplicacin de estos procedimientos ha permitido propagar a los microorganismos en
cultivos mixtos, as como su aislamiento y la obtencin de cultivos puros, facilitando de este modo,
el estudio, caracterizacin, aplicacin y control de los mismos. La forma de sembrarlos y cultivarlos
depende del tipo de microorganismo y propsito especfico del estudio.
III. MARCO TEORICO
Cultivar un microorganismo significa promover intencionalmente el desarrollo de ste en
medios de cultivo y condiciones de laboratorio controladas. La poblacin de microorganismos
desarrollada en un medio se denomina cultivo. Cuando ste contiene una sola especie de
microorganismo, se denomina cultivo puro o axnico, cuando contiene ms de una especie de
microorganismos se denomina cultivo mixto. Un cultivo tipo contiene una especie conocida de
microorganismos y es conservada en el laboratorio para realizar diversos ensayos y estudios.
Un cultivo axnico consiste en una sola especie microbiana, proveniente de una sola clula.
Los cultivos axnicos son muy raros en la naturaleza. En los medios naturales -por ejemplo, en el
suelo, agua, o en el cuerpo humano- existen cultivos mixtos. En un cultivo mixto, viven muchas y
diferentes especies de forma conjunta. Un cultivo axnico se obtiene artificialmente en el
laboratorio. A la hora de obtener un cultivo axnico se han de tomar precauciones especiales, ya
que los microorganismos estn por todas partes, en la naturaleza, en el laboratorio y en los
instrumentos y recipientes usados en los experimentos. Estos microorganismos no deseados o
contaminantes deben ser eliminados de un cultivo para que ste pueda ser axnico. El segundo
paso para obtener un cultivo axnico es inocular o introducir, una sola clula de un
microorganismo en un medio slido o liquido, esterilizado previamente. De esta manera, aislamos
un solo microorganismo del resto y se podr multiplicar en condiciones favorables.
25 | P g i n a
Un clon est constituido por una poblacin de clulas descendientes de un solo

microorganismo. Una colonia es un clon lo suficientemente grande como para ser visible sobre la
superficie de un medio slido.
Un cultivo microbiano que ha estado creciendo por cierto tiempo en el mismo tubo o
matraz, debe ser transferido a un medio de cultivo nuevo, de otra manera el crecimiento y
sobrevivencia no pueden continuar. En esta transferencia se deben considerar dos aspectos
bsicos referentes a: no introducir microorganismos indeseables (contaminantes) y concentracin
o carga microbiana de la muestra (inculo) a sembrar.
Para impedir la contaminacin de los cultivos, es necesario tener plena conciencia de la
ubicuidad de los microorganismos, lo que determina que el are y todas las superficies estn
densamente pobladas por microorganismos, de este modo en la transferencia de una muestra
microbiolgica a otro recipiente, se deben tener una serie de cuidados que eliminen los riesgos de
contaminacin. Estos incluyen el rea de trabajo, el lavado de las manos, la esterilizacin de todos
los utensilios y medios de cultivo a emplear y realizar la transferencia del microorganismo en una
zona estril, la que se obtiene trabajando cerca de la flama del mechero. Al conjunto de
procedimientos realizados para prevenir o evitar la contaminacin se le llama tcnica asptica; el
seguimiento cuidadoso y detallado de la misma evita accidentes tales como:
o La contaminacin y prdida del cultivo en estudio
o La salida y dispersin de microorganismos del cultivo, lo que ocasionara la contaminacin
de utensilios, productos y del personal. Este ltimo aspecto es particularmente importante
cuando se trabaja con cultivos de microorganismos patgenos.
Con relacin a la concentracin del inculo, un error frecuente del principiante consiste en
tomar muestras grandes, lo que es innecesario. Una colonia de bacterias del tamao de la cabeza
de un alfiler contiene varios millones de microorganismos, es obvio que con una cantidad
pequesima (casi invisible) que se adhiera al asa, ser ms que suficiente para efectuar una
transferencia exitosa.
IV RESULTADOS Y DISCUSIONES
En los tubos se observar las siguientes caractersticas de desarrollo:
o Si hay enturbamiento del medio
o Si hay formacin de una pelcula sobre la superficie o un anillo
o Si hay sedimento en el fondo del tubo
De acuerdo a las observaciones hechas se especificarn si son aerobios o anaerobios.
26 | P g i n a
V CUESTIONARIO
1. Cmo se prepara una muestra antes de aplicar una tcnica de siembra?

En microbiologa se entiende por "siembra" la operacin que consiste en depositar un
germen aspticamente en un medio de cultivo.
Toda siembra debe adaptarse a los siguientes principios generales
1.
2.
3.
4.
5.
Practicarla en medios de cultivo favorable y previamente esterilizado.

Emplear instrumentos aspticos.
No contaminar ni destruir el inculo,
Depositarla aspticamente en los medios elegidos.
Esterilizar los instrumentos empleados antes y despus de cada operacin.
2. Cules son las pautas necesarias para hacer la inoculacin de la muestra?

Para la inoculacin de muestras es necesario tener en cuenta lo siguiente:
El asa: Es un alambre de cromo nquel, tiene un dimetro de 0,3 a 1 mm. de dimetro y
est sujeto a un mango de vidrio o de metal. El hilo puede terminar recto (aguja), en anillo
(asa) o aplastado (esptula).
Los medios de cultivo, como ya se ha dicho, pueden ser slidos o lquidos, y estar
contenidos en tubos, placas o frascos. La tcnica general de las siembras variar segn el
estado fsico del material a sembrar y del medio de cultivo.
3. Explica sobre las tcnicas de siembra de microorganismos segn el tipo de medio de
cultivo.
El mtodo de siembra por estra en placa
Es el mtodo ms fcil y el ms usado para obtener cultivos axnicos. Para ello, con
un asa de siembra se toma una muestra de la poblacin mixta y a continuacin se hacen
estras sobre la superficie de un medio slido preparado en una placa Petri (a las placas
Petri tambin se les denomina simplemente placas). Conforme se van haciendo estras en
zigzag con el asa, cada vez se van depositando en la superficie del medio menos
microorganismos. A continuacin, se flamea el asa, se toca en la regin donde se han
realizado las ltimas estras y se contina la siembra con la misma tcnica, en la superficie
de medio sin sembrar an. Repitiendo este proceso varias veces se logra separar clulas
individuales. A continuacin, las placas se incuban en un lugar adecuado, permitiendo que
las clulas aisladas experimenten un nmero suficiente de divisiones para formar colonias
visibles. Aunque cada colonia posiblemente representa un clon derivado de una sola clula,
no podemos asegurarlo. Quizs, dos clulas quedaron depositadas tan juntas que han
originado una nica colonia mixta. Por tanto, para asegurarnos de que hemos obtenido un
cultivo axnico, conviene repetir el procedimiento a partir de una colonia bien aislada en la
primera placa. Las colonias que se desarrollen la segunda vez, sern, casi con toda
seguridad, cultivos axnicos.
27 | P g i n a
Los mtodos de vertido en placa y extensin en placa
En estos mtodos, las suspensiones de clulas microbianas se diluyen antes de su

siembra en placa. Se siguen estas tcnicas cuando la muestra contiene tantos
microorganismos, que la dilucin no se puede realizar en una sola etapa. Por ejemplo, una
suspensin con mil millones de clulas por mililitro debe ser diluida 107 veces para obtener
una suspensin con un centenar de clulas por mililitro, Por tanto, se realizan diluciones
seriadas (en varias etapas), normalmente de diez en diez, pero a veces de cien en cien. Para
realizar diluciones de diez en diez, se aade 1 ml de la suspensin bacteriana a 9 ml (le
medio estril o solucin salina, igualmente estril. Se agita vigorosamente para diluir las
clulas y el proceso se repite cuantas veces sea necesario. A continuacin, se puede
proceder de dos maneras diferentes.
En el mtodo de vertido en placa, las muestras diluidas se mezclan con agar fundido
y se vierten en placa. Algunas colonias quedarn embebidas en el agar y otras crecern en
la superficie. Las colonias superficiales se extendern y sern ms grandes. En el segundo
mtodo (extensin en placa), las muestras diluidas se siembran directamente en la
superficie de la placa de agar, extendindolas con ayuda de un asa de Diralsky de cristal
estril. La suspensin se absorbe en el agar, dejando las clulas microbianas sobre la
superficie. En ambas tcnicas las placas se incuban hasta la aparicin de las colonias. Como
en el mtodo de siembra por estra, no existe la seguridad de que las colonias que
aparecen en las placas sembradas por extensin o en el agar solidificado sembrado por el
mtodo del vertido en placas sean cultivos axnicos hasta que se repita el proceso. Las dos
tcnicas de siembra por dilucin presentan la ventaja de que permiten obtener un mayor
nmero de colonias aisladas que el mtodo de siembra por estra, por tanto se eligen
cuando se ha de seleccionar una cepa a partir de una mezcla con varios tipos de
microorganismos.
4. Establecer las diferencias entre aerobios estrictos, anaerobios estrictos, anaerobios

facultativos, anaerobios facultativos.
Bacterias aerobias: son aquellas que necesitan oxgeno para su metabolismo. Realizan la
oxidacin de la materia orgnica en presencia de oxgeno molecular, es decir, realizan la
respiracin celular.
Aerobias estrictos: slo pueden sobrevivir en ambientes oxigenados
Aerobias facultativas: pueden vivir en ambientes con oxgeno o sin l
Bacterias anaerobias: son aquellas que no utilizan oxgeno molecular en su actividad

biolgica. La obtencin de energa la realizan mediante catabolismo fermentativo. Se
pueden distinguir dos grupos dentro de ellas:
Anaerobias facultativas: pueden vivir en ambientes con oxgeno o sin l.
Bacterias anaerobias estrictas: slo pueden sobrevivir en ambientes carentes de oxgeno.
28 | P g i n a
5. Cmo se conservan los medios de cultivo?
Esto se puede llevar a cabo haciendo resiembras en un medio fresco,

mensualmente o con otra periodicidad. Pero un cultivo puro tambin puede mantenerse
viable durante aos sin hacerlo crecer peridicamente. A los cultivos que se mantienen en
el laboratorio para su estudio y como referencia se les denomina cultivos de coleccin.
Muchos laboratorios poseen una coleccin de cepas que se han aislado en el mismo o que
han obtenido de las denominadas colecciones de cultivos tipo, que son organizaciones que
mantienen un nmero enorme de cultivos microbianos como un servicio a los
microbilogos. Existen muchas tcnicas de mantenimiento de los cultivos puros, pero casi
todas consisten en una desecacin (eliminacin del agua) o en un almacenamiento a baja
temperatura.
Los cultivos generalmente se desecan por liofilizacin (congelacin y desecacin). El
mtodo consiste en lo siguiente: el cultivo lquido se vierte en un pequeo vial o ampolla
de vidrio y se aade leche descremada para proteger las clulas durante el proceso. La
mezcla se congela en hielo seco y se expone al vaci para su sublimacin (eliminacin del
agua congelada). Durante el proceso de sublimacin las clulas permanecen congeladas.
Posteriormente se procede al sellado de los viales, mientras an se mantiene el vaco. Los
cultivos liofilizados se almacenan a temperatura ambiente.
Para almacenar un cultivo empleando bajas temperaturas, se mezcla con sustancias
protectoras, como la leche descremada, el glicerol, o el dimetilsulfxido (DMSO). Los tubos
de ensayo se sellan y se almacenan por debajo de los - 50oC, en nitrgeno lquido o en un
ultracongelador, capaz de alcanzar tan bajas temperaturas.
6. Cul es la composicin qumica de la sal, azcar, almidn y colapez?
SAL:
El sodio (Na) de la sal hace que los componentes alcalinos y cidos del cuerpo se
mantengan siempre en un estado estable. Por ejemplo, la cal hace un papel importante en
el momento de la digestin, ya que ayuda al cido para hacer la digestin. Tambin tiene
un papel importante en la funcin de mantenimiento de los msculos y de los nervios. El
sodio forma parte de todas las plantas y vegetales.
El Cloro (Cl) de la sal, ayuda en la fabricacin de los jugos gstricos, muchas veces, la falta
de este componente produce en el ser humano mareos, flacidez, desgana y nerviosismo.
Sobre todo despus de sudar mucho las cualidades de la sal se pierden creando as un
desequilibrio mental y corporal.
AZUCAR:
Qumicamente azcares y carbohidratos son sinnimos, pero normalmente los azcares se
refieren a dulces, pequeos, carbohidratos solubles. La palabra azcar generalmente se usa
como sinnimo para la sacarosa (sucrosa). En este apartado nos referimos a los azcares
como pequeos y dulces carbohidratos solubles.
29 | P g i n a
Azcar
Sacarosa
(glucosa + fructosa)
Estructura
Dulzor en comparacin
con la sacarosa
100%
Glucosa
74%
Fructosa
173%
Maltosa
(glucosa + glucosa)
33%
Lactosa
(galactosa + glucosa)
16%
30 | P g i n a
ALMIDON:
Desde el punto de vista de su composicin qumica, el almidn es un polisacrido formado
por gran cantidad de azcares simples que se entrelazan y forman una cadena. Los
azcares que lo constituyen son molculas de glucosa, a su vez compuestos de carbono,
hidrgeno y oxgeno.
La frmula del almidn es (C6H10O5)n , siendo n el nmero que indica la cantidad de
molculas de glucosa. La cadena del almidn puede ser simple (amilosa) o ramificada
(isoamilosa). Todas las clases de almidn se tien de azul en contacto con el yodo, y tal
coloracin desaparece si se aporta calor. Al calentar y enfriar de inmediato, se forman
engrudos. Los diferentes almidones -entre los que cabe mencionar, por ser los ms
empleados, el de maz, el de trigo, el de papa y los arrurruces, que tienen su origen en
diversas plantas tropicales- se aplican en la industria alimentaria como fuente de azcares,
en la fabricacin de explosivos, pegamentos y pasta de papel.
COLAPEZ
Colapez o cola de pescado son lminas transparentes que se disuelven ponindolas
primero en agua fra y despus al fuego con poco agua. Se emplean para hacer gelatina o
dar consistencia a algunos preparado (se obtiene de las branquias de ciertos peces de agua
dulce, especialmente el esturin
Colapez
Comestible:
Energa:
Carbohidratos:
Grasas:
Protenas:
Fibra:
Colesterol:
Hierro:
Calcio:
fosforo:
AGSat:
AGSat:
AGPoliInsat:
100 %
6,00 Kcal.
0,00 g.
0,00 g.
1,40 g.
31 | P g i n a
Laboratorio 07
PREPARACION DE
MEDIOS DE
CULTIVO SOLIDO
UNFV
FIIS
Ing. AGROINDUSTRIAL
MICROBIOLOGIA I
32 | P g i n a
PREPARACION DE MEDIOS DE
CULTIVO SOLIDOS
I. INTRODUCCION
Para efectuar el estudio de los microorganismos, se han diseado diversos mtodos que
permiten cultivarlos bajo condicione artificiales, en los que es posible cultivarlos bajo condiciones
experimentales y manejar un solo tipo de microorganismo. Una de las tcnicas ms usadas en el
laboratorio de microbiologa consiste en transferir una muestra microbiolgica de un ambiente
determinado a un medio de cultivo, lo que permite obtener cultivos microbianos. A l efectuar este
procedimiento, es necesario considerar que en el rea de trabajo, existen muchos otros
microorganismos; debido a esto, es necesario tomar precauciones para impedir que stos
penetren y contaminen los cultivos en estudio. Por otra parte, para considerar no slo el aspecto
nutricional, sino tambin las condiciones ambientales de su hbitat natural, por lo que en el medio
de cultivo se debe ajustar el pH y concentracin de sales y durante la incubacin condiciones tales
como la temperatura, aireacin la luminosidad.
La aplicacin de estos procedimientos ha permitido propagar a los microorganismos en
cultivos mixtos, as como su aislamiento y la obtencin de cultivos puros, facilitando de este modo,
el estudio, caracterizacin, aplicacin y control de los mismos. La forma de sembrarlos y cultivarlos
depende del tipo de microorganismo y propsito especfico del estudio.
II. OBJETIVOS
Aplicar la tcnica adecuada para preparar el rea de trabajo y evitar contaminaciones.
Organizar el material para su fcil manejo e identificacin.
Manipular adecuadamente los cultivos puros.
Seleccionar y aplicar las tcnicas de siembra adecuadas para alcanzar propsitos
especficos.
Identificar y describir correctamente las caractersticas culturales y microscpicas de
algunas bacterias.
Organizar e interpretar los resultados del estudio macroscpico y microscpico de
bacterias.
III. MARCO TEORICO

Cultivar un microorganismo significa promover intencionalmente el desarrollo de ste en
medios de cultivo y condiciones de laboratorio controladas. La poblacin de microorganismos
desarrollada en un medio se denomina cultivo. Cuando ste contiene una sola especie de
microorganismo, se denomina cultivo puro o axnico, cuando contiene ms de una especie de
microorganismos se denomina cultivo mixto. Un cultivo tipo contiene una especie conocida de
microorganismos y es conservada en el laboratorio para realizar diversos ensayos y estudios.
33 | P g i n a
Un cultivo axnico consiste en una sola especie microbiana, proveniente de una sola clula. Los
cultivos axnicos son muy raros en la naturaleza. En los medios naturales -por ejemplo, en el
suelo, agua, o en el cuerpo humano- existen cultivos mixtos. En un cultivo mixto, viven muchas y
diferentes especies de forma conjunta. Un cultivo axnico se obtiene artificialmente en el
laboratorio. A la hora de obtener un cultivo axnico se han de tomar precauciones especiales, ya
que los microorganismos estn por todas partes, en la naturaleza, en el laboratorio y en los
instrumentos y recipientes usados en los experimentos. Estos microorganismos no deseados o
contaminantes deben ser eliminados de un cultivo para que ste pueda ser axnico. El segundo
paso para obtener un cultivo axnico es inocular o introducir, una sola clula de un
microorganismo en un medio slido o liquido, esterilizado previamente. De esta manera, aislamos
un solo microorganismo del resto y se podr multiplicar en condiciones favorables. Un clon est
constituido por una poblacin de clulas descendientes de un solo microorganismo. Una colonia
es un clon lo suficientemente grande como para ser visible sobre la superficie de un medio slido.
Un cultivo microbiano que ha estado creciendo por cierto tiempo en el mismo tubo o
matraz, debe ser transferido a un medio de cultivo nuevo, de otra manera el crecimiento y
sobrevivencia no pueden continuar. En esta transferencia se deben considerar dos aspectos
bsicos referentes a: no introducir microorganismos indeseables (contaminantes) y concentracin
o carga microbiana de la muestra (inculo) a sembrar.
Para impedir la contaminacin de los cultivos, es necesario tener plena conciencia de la
ubicuidad de los microorganismos, lo que determina que el are y todas las superficies estn
densamente pobladas por microorganismos, de este modo en la transferencia de una muestra
microbiolgica a otro recipiente, se deben tener una serie de cuidados que eliminen los riesgos de
contaminacin. Estos incluyen el rea de trabajo, el lavado de las manos, la esterilizacin de todos
los utensilios y medios de cultivo a emplear y realizar la transferencia del microorganismo en una
zona estril, la que se obtiene trabajando cerca de la flama del mechero. Al conjunto de
procedimientos realizados para prevenir o evitar la contaminacin se le llama tcnica asptica; el
seguimiento cuidadoso y detallado de la misma evita accidentes tales como:
o La contaminacin y prdida del cultivo en estudio
o La salida y dispersin de microorganismos del cultivo, lo que ocasionara la contaminacin
de utensilios, productos y del personal. Este ltimo aspecto es particularmente importante
cuando se trabaja con cultivos de microorganismos patgenos.
Con relacin a la concentracin del inculo, un error frecuente del principiante consiste en
tomar muestras grandes, lo que es innecesario. Una colonia de bacterias del tamao de la cabeza
de un alfiler contiene varios millones de microorganismos, es obvio que con una cantidad
pequesima (casi invisible) que se adhiera al asa, ser ms que suficiente para efectuar una
transferencia exitosa.
Dispositivos empleados en la transferencia de muestras microbianas: hisopo, pipeta (para
uso microbiolgico son terminales y la parte superior o boquilla debe estar protegida con filtro de
algodn), pipeta pasteur, cable de Kolle o portasa con alambre de platino dispuesto en forma de:
aguja, asa, esptula y/o gancho.
34 | P g i n a
En la transferencia de microorganismos se emplean agujas, asas de inoculacin, hisopos,

pipetas o pipetas pasteur que debern esterilizarse previamente. La utilizacin de estos
dispositivos, as como de los diferentes medios de cultivo tienen aplicaciones especficas. Por
ejemplo: los medios lquidos se preparan en tubos o matraces que se cubren con tapones de
algodn o tapones especiales. Un cultivo lquido puede ser transferido mediante un asa
microbiolgica, un hisopo, pipeta o pipeta pasteur; el inculo se deposita dentro del caldo o medio
lquido. En este tipo de cultivos los microorganismos presentan un desarrollo particular que se
manifiesta en la superficie o a travs de todo el lquido. Una de las ventajas que presenta este tipo
de cultivo se refiere a la posibilidad de agitarlos acelerando la velocidad de microorganismos
anaerobios, por otra parte, en este tipo de cultivos, las poblaciones se encuentran suspendidas y
es fcil homogeneizarlas, lo que permite estandarizar la concentracin del inculo. La desventaja
que presentan, e que en ellos e difcil detectar contaminacin a simple vista.
Los medios semislidos e preparan en tubos, se inoculan con aguja de siembra (asa recta) o
pipeta pasteur; en este ltimo caso es necesario calentar el medio y cuando se encuentra en
estado lquido y a una temperatura de aproximadamente 42C se agrega el inculo, se
homogeniza y se deja solidificar. Estos medios se emplean para estudiar la movilidad de los
microorganismos y para favorecer la separacin de microorganismos con diferentes
requerimientos de oxgeno.
Los medios slidos e preparan en tubos o matraces dependiendo de la cantidad o de las
necesidades, despus de esterilizarlos, estos se inclinan o vierten en cajas de petri. La siembra se
realiza con el asa, inoculando la superficie del agar con mucha suavidad; en estos medios, los
microorganismos al multiplicarse forman agregados que se hacen visibles a simple vista; a estos
agregados se les denominan colonias, las que presentan caractersticas que varan con el tipo de
microorganismo cultivado y el medio de cultivo empleado.
En cualquier medio de cultivo es de primordial importancia ajustar el pH, ya que an
cuando la mayora de los microorganismos crecen mejor en pH neutro, algunos requieren de pH
alcalino o cido, por lo que al proporcionar un pH adecuado se favorecer el crecimiento del
microorganismo de inters y la obtencin del cultivo. Con este mismo propsito durante la
incubacin se deben proporcionar las condiciones adecuadas para el microorganismo en estudio.
El crecimiento ptimo de los microorganismos se presenta a temperaturas que la mayora de las
veces estn relacionadas con la de su hbitat natural.
Algunos microorganismos crecen por debajo de 15C, otros requieren temperaturas ms
elevadas (30 a 45C) y algunos hasta 80C. Para alcanzar y mantener estas temperaturas se puede
usar una incubadora microbiolgica o un bao de agua a temperatura constante, en tanto que
para los microorganismos que presentan su crecimiento ptimo a temperaturas entre 20 y 25C
se pueden incubar en la gaveta o cajn del laboratorio, a temperatura ambiente.
En general las incubadoras microbiolgicas satisfacen las necesidades en cuanto a los
rangos de temperatura requeridas por los microorganismos. La desventaja que tienen es que estos
aparatos funcionan con are seco, lo que determina la deshidratacin de los medios de cultivo. Por
lo tanto, el crecimiento de cualquier cultivo experimental que se realice en incubadora no debe
prolongare por ms de nueve das. Con relacin a las necesidades gaseosas, no todos los
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microorganismo crecen en presencia de oxgeno atmosfrico; los que slo crecen en presencia de
are se llaman aerobios obligados; los que slo crecen en ausencia de oxgeno se denominan
anaerobios obligados o estrictos, un tercer grupo se adapta a las dos condiciones y se le conoce
como facultativos. Existe una cuarta categora que comprende bacterias que requieren oxgeno,
pero slo lo utilizan cuando ste existe en concentraciones reducidas; a estos se les llama
microaeroflicos. El desarrollo de estos diferentes grupos e favorece mediante la agitacin de los
cultivos o mediante la exclusin de oxgeno para lo que se emplean sustancias reductoras o
equipos especiales.
Las bacterias son organismos procariticos, se encuentran ampliamente distribuidas en la
naturaleza, habitan en el agua, el suelo, en la superficie o en el interior de plantas y animales
incluyendo al hombre. Pueden vivir en forma libre o en simbiosis con otros organismos, ya sea
como parsitos, comensales o mutualistas. Fisiolgicamente este grupo presenta caractersticas
muy variables, hay bacterias mviles e inmviles fotosintticas y quimiotrficas, auttrofas y
hetertrofas; se desarrollan en un rango muy amplio de temperatura, pH y condiciones gaseosas.
En el estudio de cultivos bacterianos algunos de los criterios que se emplean para
caracterizarlas incluyen: tamao, morfologa celular, forma de agrupacin, reaccin a la tincin de
Gram, formacin de esporas, movilidad, presencia de inclusiones de reserva y caractersticas
culturales en medios lquidos y slidos en los que presentan patrones de desarrollo en cuanto a la
forma, tamao, elevacin y color de las colonias.
IV. MATERIALES
Frasco con Agar Nutritivo

Frasco con Agar EMB
Frasco con Agar Mac Conkey
Frasco con Agar SS (salmonella shiguella)
Luna de Reloj, probeta 200 ml, vaso precipitado
Botella estril con tapa (wallon)
Franela, pabilo, papel aluminio, bolsa, jara elctrica
V. PROCEDIMIENTO
1. Calibrar la balanza analtica y tarar a cero
2. Pesar la cantidad necesaria del agar seleccionado en una luna reloj, para preparar 100 ml
de agar. Siga la formulacin del fabricante dado en el frasco.
3. Colocar el agar deshidratado en un vaso precipitado limpio y seco, aadir el agua necesaria
medida en probeta y completar hasta 100 ml.
4. Mezclar circularmente.
5. Transferir el agar a una botella estril y cerrarla. Sujetar la botella con pabilo.
6. Introducir la botella en vapor de agua (jarra) y cada 5 min. Retire la botella con una franela,
mover de forma circular y fuerte por 1 min. Luego introducir la botella al agua hirviente
nuevamente otros 5 min. Y hacer esta operacin 6 veces hasta que el agar se vea
transparente (lustroso)
7. Enfriar, rotular, cubrir con papel aluminio y bolsa
8. Refrigerar a 4o C por 7 das
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VI. CUESTIONARIO
1. Describa la composicin qumica y forma de preparacin del agar segn el fabricante de

agar:
Agar Mac conkey

Este medio se utiliza para el aislamiento de bacilos Gram negativos de fcil desarrollo,
aerobios y anaerobios facultativos. Permite diferenciar bacterias que utilizan o no, lactosa
en muestras clnicas, de agua y alimentos. Todas las especies de la familia
Enterobacteriaceae desarrollan en el mismo.
Fundamento
En el medio de cultivo, las peptonas, aportan los nutrientes necesarios para el desarrollo
bacteriano, la lactosa es el hidrato de carbono fermentable, y la mezcla de sales biliares y
el cristal violeta son los agentes selectivos que inhiben el desarrollo de gran parte de la
flora Gram positiva. Por fermentacin de la lactosa, disminuye el pH alrededor de la
colonia. Esto produce un viraje del color del indicador de pH (rojo neutro), la absorcin en
las colonias, y la precipitacin de las sales biliares. Los microorganismos no fermentadores
de lactosa producen colonias incoloras.
Frmula (en gramos por litro)
Instrucciones
Peptona
17.0
Pluripeptona
3.0
Lactosa
10.0
Mezcla de sales biliares
1.5
Cloruro de sodio
5.0
Agar
13.5
Rojo neutro
0.03
Cristal violeta
0.001
Suspender 50 g del polvo por litro

de agua destilada. Reposar 5
minutos y mezclar hasta uniformar.
Calentar suavemente y hervir 1 a 2
minutos hasta disolver. Esterilizar en
autoclave a 121C durante 15
minutos.
pH final: 7.1 0.2

Siembra
-
Sembrar en superficie.
Utilizando la tcnica de Pour Plate: sembrar 1 ml de muestra y agregar aproximadamente

15 ml de medio de cultivo fundido y enfriado a 45-50 C.
Incubacin
Durante 18-48 horas, a 35-37 C, en atmsfera aerbica
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Resultados
Microorganismos
Colonias
Escherichia coli ATCC 25922
Rojas con halo turbio
Klebsiella pneumoniae ATCC 700603
Rosadas mucosas
Salmonella
14028
typhimurium
ATCC Incoloras, transparentes
Shigella flexneri ATCC 12022
Incoloras, transparentes
Proteus mirabilis ATCC 43071
Incoloras, transparentes
Enterococcus faecalis ATCC 29212
Diminutas,
opacas
incoloras,
Caractersticas del medio

Medio preparado: rojo prpura
Almacenamiento:
Medio deshidratado: a 10-35 C. Medio preparado: a 2-8 C.
Agar Salmonella shiguella (SS)

Medio de cultivo utilizado para el aislamiento de Salmonella spp. y de algunas especies de
Shigella spp. a partir de heces, alimentos y otros materiales en los cuales se sospeche su
presencia.
Fundamento
Es un medio de cultivo selectivo y diferencial. La selectividad, est dada por la sales biliares
y el verde brillante, que inhiben el desarrollo de bacterias Gram positivas, de la mayora de
los coliformes y el desarrollo invasor del Proteus spp. Es diferencial debido a la
fermentacin de la lactosa, y a la formacin de cido sulfhdrico a partir del tiosulfato de
sodio. Los pocos microorganismos fermentadores de lactosa capaces de desarrollar,
acidifican el medio haciendo virar al rojo el indicador de pH, obtenindose colonias rosadas
o rojas sobre un fondo rojizo.
Instrucciones
Pluripeptona
5.0
Extracto de carne
5.0
Lactosa
10.0
Mezcla de sales biliares
8.5
Citrato de sodio
8.5
Tiosulfato de sodio
8.5
Citrato frrico
1.0
Agar
13.5
Verde brillante
0.00033
Rojo neutro
0.025
Suspender 60 g del polvo por litro

de agua destilada. Reposar 5
minutos
y
mezclar
hasta
homogeneizar. Calentar a ebullicin
durante 2 o 3 minutos. NO
ESTERILIZAR EN AUTOCLAVE. Enfriar
a 45-50C y distribuir unos 20 ml por
placa. Secar la superficie del medio
unos minutos en la estufa.
pH final: 7.0 0.2

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Siembra
Sembrar por estriado la superficie del medio de cultivo. Recomendaciones, se aconseja
sembrar en forma conjunta una placa de agar E.M.B. (B02-101-05) o de agar Mac Conkey
(B02-114-05).
Incubacin
Durante24-48 horas a 35-37 C, en aerobiosis.
Resultados
Microorganismos
Colonias
Salmonella typhimurium ATCC 14028
Transparentes, centro negro
Shigella flexneri
Incoloras
Shigella sonnei
Incoloras
Transparentes, centro negro
Rosadas a rojas
Rosadas cremosas y mucosas
Incoloras,
de
crecimiento
muy
escaso

Medio preparado: rojo naranja.
Almacenamiento:
Medio deshidratado: a 10-35 C.
Agar Nutritivo
Medio de cultivo utilizado para propsitos generales, para el aislamiento de
microorganismos poco exigentes en lo que se refiere a requerimientos nutritivos.
Su uso est descripto en muchos procedimientos para el anlisis de alimentos, aguas y
otros materiales de importancia sanitaria.
Fundamento
Por las caractersticas de sus componentes es un medio usado para el cultivo de
microorganismos poco exigentes en sus requerimientos nutricionales. No contiene
inhibidores del desarrollo bacteriano. La Pluripeptona es la fuente de carbono y nitrgeno
para el desarrollo bacteriano. El agregado de cloruro de sodio permite el enriquecimiento
con sangre de carnero u otras sustancias para facilitar el cultivo de microorganismos
exigentes.
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Instrucciones
Pluripeptona
5.0
Extracto de carne
3.0
Cloruro de sodio
8.0
Agar
15.0
Suspender 31 g de polvo por litro de

agua destilada. Mezclar y dejar
reposar 5 minutos. Calentar
suavemente agitando y hervir 1 o 2
minutos hasta su disolucin.
Distribuir y esterilizar a 121C
durante 15 minutos.
pH final: 7.3 0.2

Siembra
En superficie o por la tcnica de pour plate, segn el uso a que se destine.
Incubacin
En aerobiosis, a 35-37 C durante 24 horas.
Resultados
Microorganismos
Crecimiento
P. mirabilis ATCC 43071
Bueno-excelente
E. coli ATCC 25922
Bueno-excelente
S. aureus ATCC 25923
Bueno-excelente
B. cereus ATCC 10876
Bueno-excelente
E. faecalis ATCC 29212
Bueno-excelente
P. aeruginosa ATCC 27853
Bueno-excelente

Medio preparado: mbar claro a medio ligeramente opalescente.
Almacenamiento
Agar EMB
Este medio (tambin denominado E.A.M.) es utilizado para el aislamiento selectivo de
bacilos Gram negativos de rpido desarrollo y escasas exigencias nutricionales. Permite el
desarrollo de todas las especies de la familia Enterobacteriaceae.
Fundamento
Este medio combina las frmulas de Holt-Harris y Teague con la de Levine, para obtener un
mejor rendimiento en el aislamiento selectivo de enterobacterias y otras especies de
bacilos Gram negativos. La diferenciacin entre organismos capaces de utilizar la lactosa
y/o sacarosa, y aquellos que son incapaces de hacerlo, est dada por los indicadores eosina
y azul de metileno; stos ejercen un efecto inhibitorio sobre muchas bacterias Gram
positivas. Muchas cepas de Escherichia coli y Citrobacter spp. Presentan un caracterstico
40 | P g i n a
brillo metlico. Las cepas que utilizan la lactosa poseen centro oscuro con periferia azulada
o rosada, mientras que las que no lo hacen son incoloras. Este medio permite el
crecimiento de Cndida spp. como colonias rosadas y puntiformes; la siembra en
profundidad permite el desarrollo de clamidosporas en C. albicans. Enterococcus spp. crece
en este medio como colonias puntiformes y transparentes, mientras que Acinetobacter
spp. y otras bacterias oxidativas pueden dar colonias de color azul lavanda; esto puede
ocurrir aunque las cepas no sean capaces de acidificar a partir de lactosa al 0.5% y ello se
debe a la incorporacin de azul de metileno a sus membranas. En este medio se obtiene
adems, un buen desarrollo de especies de Salmonella y Shigella.
Peptona
10.0
Lactosa
5.0
Sacarosa
5.0
Fosfato dipotsico
2.0
Agar
13.5
Eosina
0.4
Azul de metileno
0.065
Instrucciones
Suspender 36 g del polvo en un
litro de agua destilada. Reposar 5
minutos; mezclar, calentando a
ebullicin durante 1 o 2 minutos
hasta su disolucin. Esterilizar en
autoclave a no ms de 121C
durante 15 minutos. Enfriar a
45C y distribuir agitando
suavemente.
pH final: 7.2 0.2

Siembra
En superficie, por estriado a partir de un inculo poco denso, para obtener colonias
aisladas. En profundidad, para favorecer el desarrollo de clamidosporas.
Incubacin
De 24 a 48 horas a 35-37 C, en aerobiosis.
Resultados
Microorganismos
Tipo de Colonia
Verdosas con brillo metlico y centro

negro azulado
Mucosas, rosa prpura, confluentes
Incoloras
Incoloras, pequeas, puntiformes
Shigella flexneri ATCC 12022
Incoloras
Salmonella typhimurium ATCC 14028
Incoloras
Caractersticas del medio:

Placas preparadas: color prpura.
La esterilizacin del medio de cultivo reduce el azul de metileno al color naranja. El color
prpura se restaura por agitacin. La presencia de un precipitado en el medio esterilizado
es normal y no debe ser removido, ya que es parte esencial del mismo.
41 | P g i n a
Almacenamiento:
2. Qu son las peptonas, extracto de levadura, extracto de carne y agar? Por qu se

utilizan los medios?
PEPTONAS
Las peptonas son derivados de la leche animal o carne digeridos por la digestin
proteolitica. Adems de contener pequeos pptidos. Tambin contienen grasas, metales,
sales, vitaminas y muchos otros compuestos biolgicos. La peptona se usa en Bacteriologa,
como medio de cultivo para el desarrollo de bacterias y hongos.
La aplicacin principal de las peptonas, extractos y otras materias primas es la produccin
de medios de cultivo ya sean deshidratados, lquidos o medios slidos. Estos productos
tambin se emplean en la produccin de medios para la fermentacin de tejidos vegetales
y como estabilizadores de vacunas. Se utiliza tambin en otras aplicaciones como
cosmtica, electroplantingas y productos dietticos.
Estos productos derivan de protenas vegetales y animales. Hispanagar ofrece productos
animales incluyendo toda la documentacin de su trazabilidad.
-
Peptonas de origen vegetal / otras peptonas: Peptona de Soya, Peptona de Soya (no
modificada genticamente), Peptona de Soya (no modificada genticamente y libre de
derivados animales), Extracto de Levadura.
Peptonas de origen animal: Peptona Bacteriolgica, Extracto de Carne en polvo, Peptona

Biotriptasa, Infusin Cerebro Corazn (bovino), Infusin Cerebro Corazn (porcino),
Peptona de Casena tipo I (triptona), Peptona de Casena tipo II, Peptona de Casena AS
(Alta solubilidad), Peptona de Gelatina, Infusin de corazn (bovino), Infusin de corazn
(porcino), Hidrolizado de Lactoalbmina, Peptona Marina, Extracto de Carne (porcina),
Peptona de carne (bovina), Peptona de carne (porcina), Digerido de Corazn de cerdo (PD
polvo), Bilis de Buey Bacteriolgica, Leche peptonizada, Polipeptona, Peptona Proteosa,
Peptona Proteosa n3, Infusin de Ternera, Peptona de Casena Tipo III, Peptona de
Casena TT, Peptona de Casena y Carne, Extracto de Carne (porcina).
EXTRACTO DE LEVADURA
Es un producto residual de la elaboracin de la cerveza que contiene altas concentraciones
de levadura y que se emplea en la industria de la alimentacin frecuentemente como aditivo.
EXTRACTO DE AGAR
Es un alga roja y gelatinosa, muy flexible y resistente a pesar de sus intrincadas
ramificaciones. Tambin es conocida por los nombres siguientes: gelosa, gelosia, gelatina
vegetal, gelatina china, gelatina japonesa, cola de pescado japonesa... etc.
Botanicamente pertenece a la familia Gelidaceae, su nombre cientfico es Gelidium
cantilagineum (L.) Gaillon Gelidium capense (5. G. Gmelin) P. C. Silva. En espaol se
conoce como gelosa, gelosina, gelatina vegetal, gelatina china, gelatina japonesa, cola de
pescado japons o gelatina de kosher.
42 | P g i n a
Es originaria de los mares del sur de frica. Su extracto denominado tambin agar-agar es
incoloro, inspido y absorbe agua en una cantidad que vara entre 200 y 300 veces su
peso, formando una gelatina. Existe tambin un producto comercial denominado agaragar, el alga es la materia prima del mejor agar-agar conocido. Se utiliza entre otras cosas
como estabilizador de algunos alimentos y comestibles y para la realizacin de diversas y
suculentas gelatinas
3. Qu son los cultivos puros y porque son importantes?
Un mtodo fundamental para estudiar las bacterias es cultivarlas en un medio lquido o en
la superficie de un medio slido de agar. Los medios de cultivo contienen distintos
nutrientes que van, desde azcares simples hasta sustancias complejas como la sangre o el
extracto de caldo de carne. Para aislar o purificar una especie bacteriana a partir de una
muestra formada por muchos tipos de bacterias, se siembra en un medio de cultivo slido
donde las clulas que se multiplican no cambian de localizacin; tras muchos ciclos
reproductivos, cada bacteria individual genera por escisin binaria una colonia
macroscpica compuesta por decenas de millones de clulas similares a la original. Si esta
colonia individual se siembra a su vez en un nuevo medio crecer como cultivo puro de un
solo tipo de bacteria.
CARACTERIZACIN DE CULTIVOS PUROS

Las colonias deben ser iguales en forma, tamao y color.
Que no existan formas inhibidas.
Al microscopio deben tener un aspecto comn.
Tiene que tener iguales propiedades tintoriales.
Deben ser bioqumicamente y fisiolgicamente iguales.
Una regla importante es no coger nunca de la primera colonia.
MANTENIMIENTO
1. Debemos transferir peridicamente, ya que los tubos de agar se secan, se evapora
el agua.
2. Se debe cubrir con parafina, con lo cual la transferencia se puede hacer ms tarde,
disminuye el metabolismo y tardan en envejecer.
3. Se disminuye la temperatura, congelamos las clulas. Para proteger las clulas y
que no se formen cristales que las daen se usa el glicerol
4. La liofilizacin es la sublimacin a alto vaco de las muestras congeladas con rapidez
4. En qu consiste la tcnica de siembra en placa por extensin y en estras y en qu consiste

la tcnica de siembra en profundidad?
El mtodo de siembra por estra en placa
Es el mtodo ms fcil y el ms usado para obtener cultivos axnicos. Para ello, con un asa
de siembra se toma una muestra de la poblacin mixta y a continuacin se hacen estras
sobre la superficie de un medio slido preparado en una placa Petri (a las placas Petri
tambin se les denomina simplemente placas). Conforme se van haciendo estras en zigzag
con el asa, cada vez se van depositando en la superficie del medio menos
microorganismos. A continuacin, se flamea el asa, se toca en la regin donde se han
realizado las ltimas estras y se contina la siembra con la misma tcnica, en la superficie
43 | P g i n a
de medio sin sembrar an. Repitiendo este proceso varias veces se logra separar clulas
individuales. A continuacin, las placas se incuban en un lugar adecuado, permitiendo que
las clulas aisladas experimenten un nmero suficiente de divisiones para formar colonias
visibles. Aunque cada colonia posiblemente representa un clon derivado de una sola clula,
no podemos asegurarlo. Quizs, dos clulas quedaron depositadas tan juntas que han
originado una nica colonia mixta. Por tanto, para asegurarnos de que hemos obtenido un
cultivo axnico, conviene repetir el procedimiento a partir de una colonia bien aislada en la
primera placa. Las colonias que se desarrollen la segunda vez, sern, casi con toda
seguridad, cultivos axnicos.
Los mtodos de vertido en placa y extensin en placa
En estos mtodos, las suspensiones de clulas microbianas se diluyen antes de su siembra
en placa. Se siguen estas tcnicas cuando la muestra contiene tantos microorganismos,
que la dilucin no se puede realizar en una sola etapa. Por ejemplo, una suspensin con mil
millones de clulas por mililitro debe ser diluida 107 veces para obtener una suspensin
con un centenar de clulas por mililitro, Por tanto, se realizan diluciones seriadas (en varias
etapas), normalmente de diez en diez, pero a veces de cien en cien. Para realizar diluciones
de diez en diez, se aade 1 ml de la suspensin bacteriana a 9 ml (le medio estril o
solucin salina, igualmente estril. Se agita vigorosamente para diluir las clulas y el
proceso se repite cuantas veces sea necesario. A continuacin, se puede proceder de dos
maneras diferentes.
En el mtodo de vertido en placa, las muestras diluidas se mezclan con agar fundido y se
vierten en placa. Algunas colonias quedarn embebidas en el agar y otras crecern en la
superficie. Las colonias superficiales se extendern y sern ms grandes. En el segundo
mtodo (extensin en placa), las muestras diluidas se siembran directamente en la
superficie de la placa de agar, extendindolas con ayuda de un asa de Diralsky de cristal
estril. La suspensin se absorbe en el agar, dejando las clulas microbianas sobre la
superficie. En ambas tcnicas las placas se incuban hasta la aparicin de las colonias. Como
en el mtodo de siembra por estra, no existe la seguridad de que las colonias que
aparecen en las placas sembradas por extensin o en el agar solidificado sembrado por el
mtodo del vertido en placas sean cultivos axnicos hasta que se repita el proceso.
5. De que forma el crecimiento microbiano vara dentro de una colonia. Qu factores
pueden causar estas variaciones en el crecimiento?
Los requisitos para el crecimiento microbiano incluyen factores fsicos y qumicos. Entre los
factores fsicos tenemos la temperatura, el pH y la presin osmtica. Los factores qumicos
necesarios para el crecimiento bacterial son diversos elementos constitutivos de las
clulas.
Requisitos Fsicos
Temperatura
El patrn de crecimiento bacterial se ve profundamente influenciado por la temperatura.
La temperatura a crecimiento ptimo permite el crecimiento ms rpido de las bacterias
durante un perodo de tiempo, usualmente entre 12 y 14 horas. La temperatura mnima
de crecimiento es aquella temperatura menor a la cual la especie puede crecer. La
Temperatura de crecimiento mximo es la temperatura mayor en la cual el crecimiento es
44 | P g i n a
posible. Los microorganismos se dividen en 3 grandes grupos en base a su preferencia de

rango de temperatura.
Sicrfilos son capaces de crecer a 0C menos, pero crecen mejor a una temperatura
mayor. Estas bacterias son capaces de crecer a 0C, pero tienen una temperatura ptima
de 15C menos y una mxima de aproximadamente 20C. Los sicrfilos estrictos mueren
si se exponen a la temperatura de saln. Un ejemplo de sicrfilos estrictos son las
bacterias que crecen en la Antrtica. An a una temperatura ptima estas bacterias se
tardan en crecer de 2 a 3 semanas. Los sicrfilos facultativos o sicrotrofos son aquellos
organismos que pueden crecer a 0C, pero crecen mejor a una temperatura de entre 20 a
30C. Los mesfilos crecen mejor a temperaturas que fluctan de entre 25C a 40C. Aqu
encontramos los patgenos de humanos y animales de sangre caliente, stos crecen mejor
a 37C. Los termfilos son bacterias que crecen a una temperatura ptima sobre los 45C.
La regin de crecimiento de muchos termfilos se extiende a la regin de los mesfilos.
Estas se conocen como termfilos facultativos. La temperatura ptima de crecimiento
para estos ltimos microorganismos es entre 50 a 60C. Los termfilos extremos crecen a
una temperatura mayor de 90C. Es muy importante sealar que una bacteria no
manifiesta las mismas caractersticas de cultivo cuando se crece a diferentes temperaturas,
un ejemplo lo observamos en Serratia marcescens, esta bacteria produce un pigmento rojo
solamente a cierta temperatura de cultivo.
pH
En la mayora de las bacterias el crecimiento ptimo es entre 6.5 y 7.5. Muy pocas
bacterias crecen a un pH menor de 4.0. Sin embargo, las bacterias clasificadas como
acidfilos son tolerantes a la acidez, un ejemplo es Thiobacillus thiodans que crece a un pH
ptimo de entre 2.0 a 3.5.
Presin osmtica
Los microorganismos requieren agua para su crecimiento, adems para obtener nutrientes
de sta. Una presin osmtica alta causa prdida de agua y plasmlisis de la clula, por lo
que se utiliza este fenmeno para conservar los alimentos ya sea aadiendo sal o azcar, lo
que previene el crecimiento bacterial. Sin embargo algunas bacterias se han adaptado a
altas concentraciones de sal, a stas se les conoce como halfilos extremos. Por otro lado,
los halfilos facultativos no requieren una alta concentracin de sal, pero pueden crecer
hasta una concentracin de 2%. Otras bacterias pueden tolerar hasta un 15% de sal.
Requisitos Qumicos
Carbono (C)
Todos los organismos requieren C para sintetizar los componentes celulares.
Nitrgeno, azufre. y fsforo.
Estos elementos se requieren para la sntesis de DNA, RNA, protenas y ATP. Las bacterias
pueden obtener nitrgeno (N) ya sea fijndolo directamente de la atmsfera, como por
ejemplo el gnero bacteriano Rhizobium. Tambin pueden obtener este elemento de
45 | P g i n a
compuestos inorgnicos que contengan N como nitritos, nitratos, sales de amonia o amino
cidos. Las bacterias pueden obtener azufre de iones de sulfato, sulfito de hidrgeno y
amino cidos con azufre. El fsforo es esencial para la sntesis de cidos nucleicos y
membranas celulares. Una fuente para obtener fsforo son los iones de fosfato y el ATP.
Elementos trazas.
Otros elementos como hierro, cobre, molibdeno y zinc son requeridos por los
microorganismos en pequeas cantidades. Usualmente tienen funcin de cofactores.
Oxgeno
No todos los microorganismos necesitan 02, sin embargo, muchas formas de vida requieren
oxgeno para llevar a cabo respiracin aerbica. Los microorganismos que utilizan oxgeno
molecular son llamados aerbicos. Estos se clasifican en aerbicos obligados que son los
que requieren oxgenos molecular para vivir, y los aerbicos facultativos los cuales utilizan
el oxgeno molecular cuando est presente, pero en su ausencia continan su crecimiento
por la va de fermentacin o respiracin anaerbica, un ejemplo es Escherichia coli. Por
otro lado tenemos los anaerbico obligados que necesitan ausencia de oxgeno molecular
para crecer y donde este generalmente es txico, un ejemplo es el gnero Clostridium.
Estos microorganismos obtienen el tomo de oxgeno molecular del agua. Tambin se
observan microorganismos anaerbicos aerotolerantes los cuales no utilizan el oxgenos
molecular para su crecimiento, pero pueden tolerarlo. Los microaeroflicos slo pueden
crecer en concentraciones de oxgeno molecular menor a las encontradas en el aire.
Factores orgnicos de crecimiento Estos son compuestos orgnicos esenciales que el
organismo no puede sintetizar, aqu se incluyen las vitaminas, los amino cidos, las purinas
y las pirimidinas.
Medios de cultivo
Es un material nutriente preparado para el crecimiento de microorganismos en el
laboratorio. Un medio qumicamente definido es aquel donde su composicin qumica
exacta es conocida. Un medio complejo es aquel donde su composicin exacta vara de un
lote a otro, ya que este medio esta hecho de nutrientes como extractos de levaduras,
carne, partes de plantas o protenas digeridas. Hay medios especficos para crecer
anaerbicos, es estos se utiliza un ingrediente reductor como tioglicolato de sodio, que se
combina con el oxgeno molecular disuelto para eliminarlo del medio. Tambin hay medios
selectivos, stos medios en particular proveen nutrientes que ayudan al crecimiento y
predominancia de un tipo particular de bacterias, y a su vez inhibe que otros tipos de
microorganismos estn presentes, un ejemplo de estos es el medio para crecer la bacteria
Neisseria gonorrhoeae. El Medio diferencial nos permite diferenciar entre varios tipos de
bacterias al incorporar a ste ciertas substancias como sangre, sal, tintes y otros. Si
inoculamos el medio con bacterias que destruyen las clulas rojas mientras que otras
bacterias no destruyen este tipo de clulas, podemos diferenciar unas de otras en el mismo
medio.
46 | P g i n a
6. Explicar:
Coliformes:
La denominacin genrica coliformes designa a un grupo de especies bacterianas que
tienen ciertas caractersticas bioqumicas en comn e importancia relevante como
indicadores de contaminacin del agua y los alimentos.
Coliforme significa con forma de coli, refirindose a la bacteria principal del grupo, la
Escherichia coli, descubierta por el bacterilogo alemn Theodor von Escherich en 1860.
Von Escherich la bautiz como bacterium coli ("bacteria del intestino", del griego ,
kolon, "intestino"). Con posterioridad, la microbiologa sistemtica nombrara el gnero
Escherichia en honor a su descubridor.
Salmonella:
Salmonella es un gnero de bacteria que pertenece a la familia Enterobacteriaceae,
formado por bacilos gramnegativos, anaerobios facultativos, con flagelos pertricos y que
no desarrollan cpsula ni esporas. Son bacterias mviles que producen sulfuro de
hidrgeno (H2S). Fermentan glucosa por poseer una enzima especializada, pero no lactosa,
y no producen ureasa.
Es un agente productor de zoonosis de distribucin universal. Se transmite por contacto
directo o contaminacin cruzada durante la manipulacin, en el procesador de alimentos o
en el hogar, tambin por va sexual. Algunas salmonellas son comunes en la piel de
tortugas y de muchos reptiles, lo cual puede ser importante cuando se manipulan a la vez
este tipo de mascotas y alimentos.
Shiguella:
Shigella es un gnero de bacterias con forma de bacilo Gram negativas, no mviles, no
formadoras de esporas e incapaces de fermentar la lactosa, que puede ocasionar diarrea
en los seres humanos. Fueron descubiertas hace 100 aos por el cientfico japons Kiyoshi
Shiga, de quien tom su nombre
Hay varias especies diferentes de bacterias Shigella, clasificados en cuatro subgrupos:
-
Serogrupo A: S. dysenteriae (12 serotipos), es un tipo que se encuentra en los pases del
mundo en desarrollo donde ocasiona epidemias mortferas.
Serogrupo B: S. flexneri (6 serotipos), causante de cerca de una tercera parte de los casos
de shigelosis en los Estados Unidos.
Serogrupo C: S. boydii (23 serotipos).
Serogrupo D: S. sonnei (1 serotipo), conocida tambin como Shigella del grupo D, que
ocasiona ms de dos terceras partes de todos los casos de shigelosis en los Estados Unidos.
Los grupos AC son fisiolgicamente similares, S. sonnei (grupo D) puede ser distinguida del resto
en base de pruebas de metabolismo bioqumico.1
47 | P g i n a
Enterobacterias:
Enterobacteriaceae es una familia de bacterias Gram negativas que contiene ms de 30

gneros y ms de 100 especies que pueden tener morfologa de bacilos o cocos. Los
miembros de esta familia forman parte de la microbiota del intestino (llamados coliformes)
y de otros rganos del ser humano y de otras especies animales. Algunas especies pueden
vivir en tierra, en plantas o en animales acuticos. Sucumben con relativa facilidad a
desinfectantes comunes, incluido el cloro. Con frecuencia se encuentran especies de
Enterobacteriaceae en la bio-industria: para la fermentacin de quesos y productos
lcteos, alcoholes, tratamientos mdicos, produccin de toxinas en el uso de cosmticos,
fabricacin de agentes antivirales de la industria farmacutica, etc.
Estaphylococus
El gnero Staphylococcus comprende microorganismos que estn presentes en la mucosa y
en la piel de los humanos y de otros mamferos y aves, incluyendo a 35 especies y 17
subespecies, muchas de las cuales se encuentran en los humanos. Las especies que se
asocian con ms frecuencia a las enfermedades en humanos son Staphylococcus aureus (el
miembro ms virulento y conocido del gnero), Staphylococcus epidermidis,
Staphylococcus saprophticus, Staphylococcus capitis, "Staphylococcus afarensis" y
Staphylococcus haemolyticus.
Morfologicamente los staphylococcus son cocos grampositivos. Los estafilococos crecen
fcilmente sobre casi todos los medios bacteriolgicos, en cultivos su crecimiento es mejor
en el medio sal manitol y agar sangre, es un coco anaerobio facultativo, esto significa que
puede crecer tanto en condiciones con aire como carente de este. Su mayor velocidad de
crecimiento es a 5 - 25 C; pero tambin se puede ver en activa fisin binaria entre 30 y
27 C. Adems, producen catalasa, lo que los diferencia de los estreptococos. Tiene
importancia mdica principalmente el S. aureus, y en humanos adems de ste, el S.
saprophiticus y el S. epidermidis.
48 | P g i n a
Laboratorio 08
SIEMBRA DE
MICROORGANISMOS
EN AGAR
UNFV
FIIS
Ing. AGROINDUSTRIAL
MICROBIOLOGIA I
49 | P g i n a
SIEMBRA DE MICROORGANISMO
EN AGAR
I.
OBJETIVOS
-
II.
Familiarizarse con el manejo de microorganismos y con las tcnicas de aislamiento.

Obtener colonias separadas, utilizando uno o ms mtodos.
Estudiar la morfologa de cada colonia.
GENERALIDADES
TECNICAS GENERALES DE AISLAMIENTO Y CULTIVO DE MICROORGANISMOS

En microbiologa, todas las manipulaciones deben ser llevadas a cabo de modo que se
impida cualquier tipo de contaminacin en el rea de trabajo. Se aconseja que la siembra de todas
las muestras a los medios de cultivos se realice bajo una cabina de flujo de aire laminar o en un
gabinete de seguridad biolgica, con los protectores de plstico o vidrio para el cuello y la cara, las
muestras procesadas se las debe considerar como potencialmente infecciosas y manipularlos
adecuadamente.
Tambin se deben de utilizar guantes de goma o ltex biolgicos. La mesa de trabajo debe
de estar equipada con todos los materiales necesarios para efectuar siembras, tambin se debe de
contar con todos los medios de cultivos necesarios para realizar siembras. A continuacin algunos
alcances necesarios para el cultivo de microorganismos:
-
Las asas deben esterilizarse antes de utilizarlas y enfriarse sobre el agar o el material de
vidrio (en zonas estriles) antes de tomar la muestra de microorganismos, con objeto de
no destruirlo por calor.
Despus de utilizarlas, las asas se vuelven a esterilizar en todo su permetro.
Las bocas de los tubos y matraces de vidrio se flamean ligeramente una vez destapadas,
antes y despus de la inoculacin.
Durante la inoculacin, los tapones se mantienen en la mano sujetndolos por la parte
que no entra en contacto con tubos y matraces.
Los tubos abiertos deben mantenerse en posicin inclinada hacia el frente para que el
riesgo de contaminacin sea mnimo.
Las tapas de las placas Petri no deben colocarse nunca sobre la mesa de trabajo boca
arriba trabajando con bacterias.
TECNICAS DE SIEMBRA.
1. Tcnica de siembra por aislamiento
1.1 Estra Mltiple.
Con un asa de siembra, previamente esterilizada, se toma una muestra de cultivo
de microorganismo y se extiende sobre un rea pequea de la superficie de la placa
con agar nutritivo, en forma de estras muy juntas, pero sin hacer presin para no
daar el agar.
50 | P g i n a
Mediante esta tcnica se obtiene colonias aisladas de una muestra que contenga un
elevado nmero de grmenes.
1.2 Tcnica de los cuatro cuadrantes.

- Se divide la placa en cuatro cuadrantes.
- Se toma el inoculo y se siembra consecutivamente en 1-2-3-4. Incubar.
- En el cuarto cuadrante, al menos, obtendramos colonias aisladas.
Mediante esta grfica se observa cmo se toma una muestra y se siembra en placas:
51 | P g i n a
1.3 Siembra por Agotamiento (o en superficie)

Se realiza una descarga y se realiza estra por
toda la placa.
2. Siembra para recuento.

2.1 Tcnica de Barry
- En una placa Petri vaca se
deposita un pequeo volumen
conocido de muestra y a
continuacin se aade el medio
de cultivo (agar nutritivo)
fundido
y
atemperado
aproximadamente a 45o C.
- Se mezclan ambos por rotacin
suave de la placa. De esta forma
los
microorganismos
se
distribuirn
de
forma
homognea en el medio cultivo,
permitiendo el desarrollo de
colonias separadas por todo el
agar.
2.2 Tcnica de inoculo a dilucin conocida y con asa de Dygraski (Barry modificada)
- Depositar sobre la superficie de una placa con agar nutritivo una gota 0.1 ml de
una determinada dilucin del cultivo de microorganismos problema y extenderlo
con ayuda del cayado, previamente esterilizado, todas las direcciones hasta que
est completamente seco.
- Incubar la placa, en posicin invertida, a la temperatura deseada (durante 24, 48
72 horas) segn el tipo de microorganismo.
- La posicin invertida evitar que el agua de condensacin se deposite sobre la
superficie del medio, dificultando la obtencin de colonias aisladas.
- Es una tcnica usada para el
aislamiento de colonias, que
permite igualmente el recuento de
bacterias viables en la muestra, si
conocemos
exactamente
la
dilucin. Mediante esta tcnica se
obtiene colonias asiladas a partir
de una muestra que contenga un
elevado nmero de grmenes.
52 | P g i n a

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INGENIERIA INDUSTRIAL Y DE SISTEMAS

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INFORMES DEL LABORATORIO DE MICROBIOLOGIA 2009

GRUPO I: agentes con bajo riesgo para el individuo y la comunidad

NORMAS GENERALES DE BIOSEGURIDAD

Asegurarse de no presentar cortes, raspones u otras lastimaduras en la piel y en caso de

No tocar los ojos, nariz o piel con las manos enguantadas.

No detener manualmente la centrifuga, no destaparla antes de que cese de girar.

No permitir la entrada de personas ajenas al laboratorio y/o que no tengan sus

Emplear en todo momento las medidas de bioseguridad aqu expuestas

Cuando se produzca derrame de material infectado o potencialmente infectado, el

Usando papel absorbente seco y limpio levantar el material y arrojarlo al recipiente de

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No se recomienda el uso de alcohol ya que evapora rpidamente y coagula los residuos

Durante todo el procedimiento de desinfeccin deber usarse guantes y evitar el contacto

Los pinchazos, heridas punzantes, lastimaduras y piel contaminada por salpicadura de

Si un trabajador sufre exposicin parenteral o de las membranas mucosa a sangre o fluidos

ELEMENTOS PROTECTORES Y SU USO ADECUADO

Se usaran guantes de ltex en todo procedimiento que implique el manejo de material

No tocar los ojos, nariz o piel con las manos enguantadas.

MANIPULACION Y EVACUACION DE DESECHOS CONTAMINADOS

Despus es preciso desinfectar el material con sustancias qumicas antes de limpiarlo e

INFORMES DEL LABORATORIO DE MICROBIOLOGIA 2009

Para la eliminacin de todo material contaminado, el mtodo de eleccin es la incineracin

Para la descontaminacin del material descartable (agujas, jeringas, etc.) se utilizara

Descartar la solucin de hipoclorito por el desage.

Para la descontaminacin del material reusable se utilizara Glutaraldehido al 2% por ser

Despus de este tratamiento se retirara el material para lavarlo y esterilizarlo.

La solucin de glutaraldehido tiene una duracin promedio de 28 das, pero se debe

Redactar protocolos de bioseguridad en cada rea y velar por su debido cumplimiento.

Implantar procedimientos de emergencia, particulares y generales, para casos de

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Garantizar el entrenamiento adecuado del personal que trabaja en el laboratorio.

Temperaturas extremas: afectan de forma hormonal y/o humoral al trabajador.

No ionizantes (UV, IR, RV, microondas)

Ionizantes (Rayos X, neutrones)

Las radiaciones estn determinadas por dos fuentes:

Emisores deliberados: TV, estaciones radiales, etc.

Emisores accidentales: equipos elctricos, etc.

Natural: sol, luna.

Artificial: lmparas de gas, incandescentes, etc.

INFORMES DEL LABORATORIO DE MICROBIOLOGIA 2009

Estos agentes qumicos pueden penetrar al organismo por diferentes mecanismos de

El diseo deficiente del sitio de trabajo y sus mobiliarias.

El trabajo repetitivo causa desinters y desmotivacin por el mismo, lo cual con un

Comportamiento: aislamiento de la familia.

Trastornos psiquitricos, clnicos

Trastornos adoptivos, afectivos.

INFORMES DEL LABORATORIO DE MICROBIOLOGIA 2009

Accidentes de trabajo al manipular las muestras

Negligencia e inobservancia de reglamentos al manipular agentes infecciosos

No disponer de medios adecuados de proteccin

Personal inadecuadamente entrenado

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MATERIALES Y EQUIPOS DEL

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En un laboratorio de qumica se utiliza una amplia variedad de instrumentos utilizados por

Identificar, discriminar y describir los materiales de laboratorio.