Estacin de Viticultura e

Enoloxa de Galicia
Microorganismos en la industria enolgica
y su relacin con la calidad del vino

Pilar Blanco Camba

Las levaduras y el vino

CARACTERSTICAS GENERALES
Hongos microscpicos unicelulares
Clulas eucariotas
Morfologa variada: esfricas, elpticas , ovaladas, alargadas,
apiculadas
Reproduccin vegetativa o asexual por gemacin (algunas por
biparticin)
Reproduccin sexual. Formacin de esporas
Responsables de la fermentacin alcohlica (transformacin de
azcar en alcohol +CO2)
Alteraciones (flor, refermentaciones)

Organizacin de una clula procariota (A) y eucariota (B)

Principales levaduras vnicas

Nombre: Saccharomyces cerevisiae
Caractersticas:
Morfologa elpticas u ovoides
Alta capacidad fermentativa
Formadora de esporas (ascosporas con 4 esporas)
No asimila nitratos ni escinde arbutina
Crecimiento en presencia de etanol
Fermenta y asimila glucosa, galactosa, maltosa,
sacarosa y rafinosa.
No fermenta ni asimila lactosa

Principales levaduras vnicas

Nombre:

Kloeckera apiculata
Hanseniaspora guillermondii

Morfologa: apiculadas (forma de limn)

Aparece al inicio de la fermentacin
Fermenta la glucosa
Bajo poder fermentativo (4%)
Fuerte produccin de cidos voltiles
No esporula (Hanseniaspora si esporula)
No asimila nitratos
No escinde la arbutina

Principales levaduras vnicas

Nombre: Metschnikowia pulcherrima
Morfologa: clulas ovoides aisladas o en parejas. A
veces clulas grandes con un grueso grnulo central de
grasa.
Fermenta la glucosa
Bajo poder fermentativo (1%)
No asimila nitratos
Escinde la arbutina
Crece bien en presencia de alcohol
No esporula
En placa colonias blancas, brillantes con ligera
coloracin rojiza

Principales levaduras vnicas

Nombre: Schizosaccharomyces pombe
Morfologa : Clulas alargada o cilndricas
aisladas o en parejas (3-5 X 6-16) m
Divisin por fisin
Esporulada
No asimila nitratos ni escinde la arbutina
Buena capacidad fermentativa
Capacidad para degradar cido mlico a
etanol y CO2 (fermentacin maloalcohlica)

Otras levaduras vnicas

Brettanomyces
Torulaspora
Cryptococcus
Debaryomyces hansenii
Rhodotorula
Levaduras formadoras de velo
Saccharomyces (flor)
Candida
Pichia
Hansnula
Zygosaccharomyces

Debaryomyces hansenii

Requerimientos nutricionales de las levaduras

Fuente de carbono: azcares
Fuente de nitrgeno
Sustancias minerales
Factores de crecimiento (vitaminas)

El mosto rene los requisitos adecuados para el desarrollo de las

levaduras (Excepciones: maduracin inadecuada, el ataque por botritisfalta de nitrgeno, etc). pH cido-impide el desarrollo de muchas
bacterias

Origen de las levaduras de vinificacin

Uva (flora epiftica)

Material de bodega

Inculo (LSA)

Sucesin de la poblacin de levaduras a lo largo de la

fermentacin
Fase inicial

Fase tumultuosa
Saccharomyces invade el medio, acaba
dominando la fermentacin y desaparecen
las levaduras de la fase inicial
Fase final
Predominio de especies del gnero
Saccharomyces. Produce ms alcohol y
menos productos secundarios

Albario
1150
1100

Densidad

Predominio de levaduras apiculadas y de

otras morfologas con baja produccin de
alcohol y elevada produccin de cidos
voltiles (actico) Ex: Kloeckera apiculata,
Metschnikowia pulcherrima, Candida
sp,etc.

1050
1000
950
900
1 3 5 7 9 11 13 15

Tiempo (das)

Evolucin de la poblacin de levaduras viables durante

la fermentacin

10,00
9,00

Fase tumultuosa: 107-108

Fase final: 105

8,00
Log NLV

Fase inicial : 104-105

7,00
6,00
5,00
4,00
0

10

Tiempo (das)

15

La fermentacin alcohlica

Glucosa

Glucolisis

Acido pirvico

Piruvato descarboxilasa
CO2
Acetaldehido
NADH2

Alcohol deshidrogenasa

NAD+

Etanol

Fermentacin alcohlica: Influencia del

temperatura y O2
Rango de Temperatura para fermentacin en blancos: 14-20C
Rango para fermentacin en tintos: 25-30C
Temperatura crtica >35C
TREIXADURA

Densidad

1120
1100
1080

nTT16

1060

nTT22

nTT19

1040
1020
1000
980
0

10

20

Tiempo (Das)

O2: Las levaduras requieren O2 para su multiplicacin ya que interviene en

la sntesis de AG y esteroles, constituyentes de la membrana celular y
responsables de su permeabilidad (prctica de remontado)

Productos secundarios originados durante

la fermentacin alcohlica
Glicerina suavidad y aterciopelado
Fermentacin gliceropirvica
glucosa

Glicerina + pirvico

Succnico- es el cido que ms impresiona el gusto (sabor a bebida

fermentada, entre salado y amargo)
cidos orgnicos (mlico, ctrico, lctico, cidos voltiles
Actico y su ster, acetato de etilo- producido por las levaduras de la 1
fase y levaduras oxidativas. Efecto negativo sobre el vino
Metabolitos del ciclo diacetilo-acetonico (a concentraciones elevadas son
negativos)

BACTERIAS LCTICAS
Gram +, catalasa -, no esporuladas, no mviles
Divisin por biparticin
Microaerfilas o anaerobias facultativas y fermentadoras
de azcares
Morfologa: cocos y bacilos
Segn el metabolismo de la glucosa pueden ser:
-Homofermentativas- c. lctico
-Heterofermentativas-c. lctico, actico,
CO2 ,
etanol, acetaldehido, acetona, diacetilo,etc
Responsables de la fermentacin malolctica
Bajo ciertas condiciones pueden causar alteraciones
Metabolismo de aminoacidos-origina sustancias peligrosas
para la salud

Oenococcus oeni

BACTERIAS LCTICAS

aldolasa

Metabolismo homofermentativo de la glucosa (va

glucoltica de Embden-Meyerhof)

BACTERIAS LCTICAS

Metabolismo heterofermentativo de la glucosa

(ruta de Warburg-Dickens)

Clasificacin de las bacterias lcticas

Forma

Gnero

Metabolismo de la glucosa

Especies

Cocos

Pediococcus

Homofermentativos

P. damnosus
P. pentosaceous

Leuconostoc

Heterofermentativos

L. oeni (O.oeni)
L. mesenteroides
(ssp. mesenteroides)

Bacilos

Lactobacillus I. Homofermentativos estrictos

No descritas en vino

(No fermentan pentosas

Glucosa- 2 c. Lctico)

II. Heterofermentativ. facultativos

(Fermenta las pentosas y la glucosa)

L. casei
L. plantarum

II. Heterofermentativ. obligatorios

(No poseen el enzima aldolasa,
fermentan la glucosa mediante la va
de las pentosa fosfato)

L. brevis
L. hilgardii

Caractersticas de los principales gneros de bacterias lcticas

Caracterstica

Leuconostoc

Pediococcus

Lactobacillus

Morfologa de
las clulas

Esfricas o un
poco alargadas
En pares o en
cadenas

Esfricas
Divisin en dos
planos-ttradas

Alargadas en
pares e en
cadenas

Tamao

0,5-0,7 m

1-2 m

0,5-1,2 X 1,0-10
m

Metabolismo de CO2, lctico,

la glucosa
etanol

DL L lctico
No carbnico

lctico, etanol,
actico, CO2

Hidrlisis de la
arginina

Algunas cepas

No

No

(G+C)%

38-44%

34-42%

36-47%

Pared celular

Sin cido
teicoico

Sin cido
teicoico

Algunas sp
contienen cidos
teicoicos

BACTERIAS LCTICAS: ecologa

Origen
Uva
Material de bodega
Inculo (Cultivos iniciadores de Oenococcus oeni. Se trata de cultivos
puros o mezclas de 2-3 cepas)
Evolucin durante la fermentacin
En uva- poblacin muy baja
Mosto- 102-104 UCF/ml. Disminuyen por proliferacin de las levaduras
durante la fermentacin alcohlica
Fase final Empieza a aumentar la poblacin de bacterias lcticas (lisis
de las levaduras), desaparecen los bacilos homofermentativos, luego los
heterofermentativos y acaba predominando O. oeni, mejor adaptado a las
condiciones de bajo pH y elevada concentracin de etanol
La fermentacin malolctica se inicia cuando las UFC/ml= 106

FERMENTACIN MALOLCTICA
Mlico

Lctico + CO2
Enzima malolctica
(Bacterias lcticas)

Repercusiones en el vino
Desadificacin biolgica del vino
Disminuye la acidez total y el mlico (sabor astringente)
Aumenta el cido lctico (suavidad)
Protege al vino de las enfermedades por bacterias lcticas
Otras: Produccin de diacetilo (aroma a mantequilla)
A bajas concentraciones bouquet
A elevadas concentraciones - rancio

Posibles rutas del cido mlico

BACTERIAS LCTICAS: fermentacin malolctica

Factores que influyen en la fermentacin malolctica
Caractersticas de la variedad (relacin tartrico/mlico), residuos
fitosanitarios
pH del medio (Actan mejor a pH> 3.5; T ptima 4.2-4.5). El pH
condiciona el crecimiento bacteriano y los sustratos que van a metabolizar
(*enfermedades del vino). A mayor pH mayor facilidad para que se
desarrolle la FML pero tambin mayor peligro de que aparezcan
enfermedades.
temperatura (19-25)
Aireacin (la presencia de una pequea proporcin de O2 es favorable)
Etanol (< 13%)
SO2 (no superior a 50 mg/L)
Prcticas de vinificacin (El tiempo de contacto del vino con los hollejos,
contacto con las las, trasiegos, etc. determinan la poblacin de bacterias
lcticas al final de la fermentacin alcohlica)
Interaccin de las bacterias con otros microorganismos

BACTERIAS LCTICAS: fermentacin malolctica

Aplicacin de la fermentacin malolctica
En tintos

Mejora gustativa
Color menos rojo vivo
Aroma evolucionado (menos a uva y ms a
vinosidad)

En blancos

Puede ser deseable:

Repercute en el equilibrio grado/acidez
Disminuye la sensacin de dureza y verdor
Peligroso en vino dulce

BACTERIAS LCTICAS: fermentacin malolctica

Ventajas e inconvenientes de la fermentacin malolctica

Ventajas

Inconvenientes

Reduccin de la acidez y suavizacin

organolptica

Reduccin del color

Garanta de estabilidad

Reduccin de aromas varietales

Incremento aromtico

Incremento de acidez voltil

Reduccin de amargor y astringencia

Aparicin de olores y sabores

anmalos

Mayor complejidad y atributos de

envejecimiento

Formacin de aminas bigenas y

carbamato de etilo

Metabolismo del ctrico

Bacterias acticas
Gram negativas, Catalasa positivas, no esporuladas

Morfologa variable (clulas elpticas o con forma de bastn corto

agrupadas en pares o en cadenas)
Tamao: 0.6-0.8 x 1-4 m
Inmviles o mviles por flagelos:
polares (G. Gluconobacter)
peritricos (G. Acetobacter)
Aerobias estrictas*(sobrevive en barrica)
Oxidan el alcohol a cido actico e incluso a CO2 y H2O
Produccin de polisacridos extracelulares
filtrabilidad del vino) y pigmentos

(celulosa-afecta

la

Tolerancia a la acidez, al etanol y moderada al SO2

Formacin de velo
En el vino pueden dar lugar al picado actico y su desarrollo es
indeseable en todas las etapas de vinificacin

Bacterias acticas
ECOLOGA DE LAS BACTERIAS ACTICAS
Muy extendidas en la naturaleza, especialmente en bebidas fermentadas
alcohlicas como el vino, la cerveza o la sidra
En uva la poblacin de bacterias acticas depende del estado sanitario de la
vendimia.
En uva sana: 102-103 UFC/mL (G. oxydans)
En uva atacada por Botrytis: 105-106 (mezcla de Guconobacter y
Acetobacter)
Durante la fermentacin alcohlica la adicin de sulfuroso y el desarrollo de las
levaduras no afecta la poblacin de bacterias acticas. Existe una sucesin de
bacterias acticas: G. oxydans predomina al inicio y va siendo reemplazado por
A. pasteurianus y A. aceti.
Durante la fermentacin malolctica se mantiene la poblacin
Durante la conservacin la poblacin de bacterias acticas puede aumentar y
causar enfermedades.

Clasificacin de las bacterias acticas

Caracterstica

Gluconobacter

Acetobacter

polar

peritrica

Crecimiento a pH 4.5

Oxidacin de etanol a actico

Oxidacin de actico hasta CO2

(G+C)%

56-64

53-65

Especies

G. oxydans

A. aceti
A. pasteurianus
A. liquefaciens
A. hansenii

Flagelacin

Metabolismo de las bacterias acticas

Oxidacin del etanol a cido actico (Gluconobacter y Acetobacter)
etanol

acetaldehido

cido actico
Aldehido
deshidrogenasa

Alcohol
deshidrogenasa

Oxidacin del cido actico a CO2 (Acetobacter)

cido actico

CO2+H2O
TCA

*Gluconobacter carece de algunos enzimas del TCA, la -cetoglutarato

deshidrogenasa y la succinato deshidrogenasa

Metabolismo de las bacterias acticas

Metabolismo de los azcares
Oxidacin de los azcares va
hexosas monofosfato
Oxidacin de azcares a cetonas
Glucosa cido 2-5
dicetoglucnico
Fructosa-cetofructosa
Xylosa-cetoxylosa
Metabolismo del cido lctico
Oxidacin a pirvico,
acetaldehido y actico
Metabolismo del glicerol
Oxidacin a dihidroxiacetona

ALTERACIONES DEL VINO DE ORIGEN MICROBIANO

Introduccin
Alteraciones microbianas
Bacterias lcticas
Picado lctico
Amargor
Vuelta
Grasa o ahilado
Bacterias del cido actico: Picado actico
Levaduras
Flor
Refermentaciones
Brettanomyces
Sustancias txicas de origen microbiano

INTRODUCCIN
Las alteraciones microbianas del vino pueden aparecer durante la
elaboracin y/o durante la conservacin del vino
Se producen por el ataque de componentes del vino y/o formacin
de sustancias indeseables
Evidencias: Turbidez, Gas, Transformacin del color
Factores a favor:
Composicin del vino (cidos orgnicos, azcares, factores
de crecimiento y sales minerales)
Factores en contra:
Grado alcohlico elevado
pH bajo
Baja temperatura

Las bacterias lcticas

Producen alteraciones graves porque atacan la totalidad de la masa del
vino aunque haya sido bien elaborado
Microaerfilos o anaerobios facultativos
Importancia de la higiene en la bodega
Alteraciones producidas
Picado lctico- fermentacin de azcares residuales
Amargor- fermentacin del glicerol
Vuelta fermentacin del tartrico
Grasa o ahilado formacin de polisacridos en el vino

Bacterias lcticas: PICADO LCTICO

PICADO LCTICO
Fermentacin de azcares residuales con formacin de actico y
lctico
Puede aparecer en vinos con azcares residuales por cese de la
fermentacin alcohlica (Ex. Por altas temperaturas)
Efecto en el vino: sabor agridulce (por el actico y el azcar) y
aumento de la acidez voltil
Tambin tiene lugar la fermentacin mantica formacin de
manitol a partir de fructosa (Vuelta mantica)
Prevenir las paradas fermentativas y envasado apropiado, sulfitado
racional control de la temperatura

Bacterias lcticas: AMARGOR

AMARGOR
Fermentacin del glicerol formando lactico, actico, cidos grasos
y acrolena (reacciona con compuestos fenlicos como los taninos
dando sabores amargos)
Efecto en el vino: sabor amargo
Muy rara, aparece e casos de mala cosecha
Afecta a vinos con poco grado y pH bajo (3.2-3.3); La fermentacin
de tartrico (vuelta) afecta a vinos de pH alto (3.5-3.3)

Bacterias lcticas: VUELTA

VUELTA
Origen: Fermentacin del cido tartrico para dar lctico, actico
y CO2
Efecto en el vino:
No apto para el consumo
Disminuye la acidez fija y aumenta la acidez voltil y el pH
Pierde sabor (inspido, flojo)
Color apagado
Turbidez
Formacin de gas, vino con aguja
olor a ratn (vuelta + otras causas-formacin de 2acetiltetrahidroxipridina )
Ataca a vinos poco cidos, los mejores vinos son los ms propensos
No suele darse.

Bacterias lcticas: GRASA

GRASA O AHILADO
Causa: formacin de polisacridos en el vino que le dan aspecto
oleoso.
Efectos en el vino: aspecto de aceite, vino pesado que se desliza sin
ruido. La acidez voltil no siempre es elevada.
Peligro: puede ir seguido de otras alteraciones
Prevencin: empleo racional de sulfuroso que no impida la
Fermentacin Malolctica pero s la formacin de grasa
Correccin: con sulfuroso y agitado

Bacterias lcticas: Otras alteraciones

Alteracin

Causa

Olor a mantequilla

Produccin de diacetilo a partir del ctrico o

del piruvato

Olor a ratn

Formacin de 2-acetil-tetrahidropiridina

Olor a geranio

Formacin de 2-etoxi-3,5-hexadieno a partir

del cido srbico

Formacin de aminas
bigenas

Metabolismo de los aminocidos del mosto

Formacin de
carbamato de etilo

Metabolismo de la arginina

Bacterias acticas: PICADO ACTICO

PICADO ACTICO O AVINAGRAMIENTO
Oxidacin del alcohol a cido actico- Necesitan O2
Causado por las bacterias acticas o del vinagre que constituyen parte de la
microflora de la uva y pernanecen durante todo el procesado. Desaparecen
tras el embotellado por las condiciones de anaerobiosis
Picado- inicio del proceso , solo afecta a las capas superficiales
Avinagramiento- afecta a ms volumen
Efecto en el vino:
En cata- olor a acetaldehido
Enturbiamento y formacin de velo
Aumento de la acidez voltil (Mxima permitida 0,65 g/L)
Producen actico (retrogusto, final de boca spero y agrio) y acetato
de etilo (indicativo de mala calidad)

Bacterias acticas: PICADO ACTICO

Enfermedad muy corriente, perjudicial y difcil de corregir

Prevencin:

Relleno de los depsitos y cierre hermtico

Evitar trasiegos en perodos clidos (la elevada
temperatura aumenta la probabilidad de picado
actico)
Sulfitado a dosis adecuadas (25-30 mg/l)
Higiene de la bodega y los depsitos

Aparece con mayor frecuencia en uvas atacadas con Botritis

LEVADURAS: Flor
FLOR
Enmohecimiento de la superficie del vino, velo
Causado por levaduras que requieren O2
Candida mycoderma
Pichia membranifaciens
Hansenula anmala
Zygosaccharomyces
Crecen en vino con alcohol < 13 y no tienen capacidad fermentativa
Saccharomyces-flor til para crianza biolgica de los vinos
Diferenciacin: morfologa al microscopio, aspecto del velo, capacidad
fermentativa

LEVADURAS: Flor

Caracterstica

Levaduras de velo

Saccharomyces Flor

Observacin a
microscopio (forma y
agrupacin)

Clulas cilndricas,
alargadas. A veces forman
cadenas ramificadas

Clulas elpticas-ovoides
En parejas o flculos

Aspecto del velo

Velo delgado, blanco o

grisaceo, liso o poco
plegado

Velo grueso, color crema y

rugoso

Capacidad fermentativa

Nula o muy baja. En mosto Buena. En mosto dan

forman velo
turbidez y carbnico

LEVADURAS: Flor
Efectos en el vino:
9 Disminuye la acidez fija y voltil
9 Disminuye el alcohol
9en caso exagerado da lugar a un sabor soso u acuoso del
vino y origina turbidez
La aparicin de flor no es grave
Recomendaciones para su prevencin:
Filtracin amicrbica
Cerrar bien los depsitos
Sulfitado adecuado

LEVADURAS: Refermentaciones
Refermentaciones
Provocan enturbiamiento y formacin de gas
No se forma velo
Causadas por Saccharomyces, va anaerobia
Ocurren cuando hay azcares residuales (<2 g/L)
Control microbiolgico: observacin directa a microscopio
En vinos con pocos azcares residuales puede aparecer sedimentos
en el fondo de la botella. Metabolismo de otros componentes del
vino.

LEVADURAS: Brettanomyces
Brettanomyces (forma asexual)/Dekkera (esporgena)
Frecuente en barrica y vinos de crianza (rara en uva y fermentacin)
Se desarrolla en vinos de elevado grado alcohlico con o sin azcares
Especie ms frecuente: Brettanomyces bruxellensis
Origina fenoles voltiles
p-cumrico

4-vinil-fenol
descarboxilasa

p-ferlico
*VRP-vinil fenol reductasa

4-etil-fenol

VPR
4-vinil-guayacol

4-etil-guayacol

LEVADURAS: Brettanomyces
Afecta las caractersticas organolptica del vino
Defectos causados por Brettanomyces:
Olores fenlicos (cuero, sudor de caballo) *Debido al
metabolismo de bacterias y levaduras
4-etil-fenol:

bajo contenido- complejidad

Alto contenido-defecto

Gusto a ratn (ms raro)- derivados de la tetrahidropirina.

*Tambin originados por bacterias lcticas Lactobacillus y
Pediococcus
Produccin de aminas bigenas
Puede causar acidez voltil elevada
Prevencin: limpieza y desinfeccin de las barricas

Sustancias txicas de origen microbiano

Origen de sustancias txicas en el vino
Contaminantes (fungicidas, pesticidas, etc)
Aditivos (SO2)
Metabolismo microbiano
Etanol
Metanol
Aminas bigenas (descarboxilacin de aminocidos)
Carbamato de etilo (Metabolismo de la arginina)
Ocratoxina A
Peligrosas para la salud humana

Aminas bigenas
Se originan por descarboxilacin de los aminocidos
Principales aminas bigenas en el vino:
Histidina-Histamina
Ornitina-Putrescina (diaminobutano)
Tirosina-Tiramina
Etilamina
Feniletilamina
Cadaverina
Origen de las aminas bigenas:
9Bacterias lcticas
9Levaduras

Aminas bigenas
Efectos sobre la salud:
Dolor de cabeza
Problemas respiratorios
Problemas de corazn (Palpitaciones)
Hipertensin, hipotensin
Cuadros de alergia
La sensibilidad a estos compuestos depende de cada
individuo y puede alterarse con el consumo de alcohol
y/o drogas.
La histamina es la ms txica.

Aminas bigenas: papel de las bacterias lcticas

Histamina, tiramina y putrescina son las principales aminas
bigenas presentes en el vino.
Baja concentracin despus de la F. Alcohlica
El contenido aumenta durante la FML
El contenido de aminas en vino vara de unas zonas a otras
Depende de la microflora (vara con la cepa bacteriana) y de la
presencia de aminocidos en el vino (composicin del mosto,
metabolismo levaduras, prcticas enolgicas-contacto con las las)
La microflora es ms compleja cuanto ms alto es el pH
Pedioccocus, Oenoccocus, Lactobacillus ,
La descarboxilacin de aminocidos tiene lugar en condiciones de
estrs, como va alternativa para obtencin de energa

Carbamato de etilo

Se forma en el vino por reaccin entre:

Etanol+compuesto carbamlico
El precursor en el vino es la urea que procede del metabolismo de la
arginina, relacionado con la actividad arginasa de las cepas de levaduras
que conducen la fermentacin. Las bacterias lcticas tambin degradan la
arginina
Tambin se forma urea a partir de la degradacin de cidos nucleicos o de
componentes de la uva
Prevencin
Limitar el contenido de nitrgeno en los mostos (evitar abonos
nitrogenados y terrenos muy frtiles)
Limitar activadores de fermentacin y controlar las levaduras utilizadas
Control de la temperatura durante las fermentaciones
Eliminacin de la urea con ureasa cida
Baja acidez y alta temperatura inducen aumento de carbamato de etilo

Alteraciones causadas por mohos

Los mohos atacan el grano de uva, especialmente durante la maduracin
Botrytis cinerea, Penicillium, Aspergillus, Mucor, Cladosporium, otros
Efectos causados en el mosto y/o vino:
9Reduccin de la cosecha
9Afecta el contenido de nitrgeno

Aspergillus niger

9Presencia de enzimas como la lacasa (oxidasas)-quiebra

oxidsica
9Alteraciones organolpticas
9Afecta la estabilidad fisico-qumica del vino
9Olor y sabor a moho

Penicillium citroviride

Ocratoxina A
Micotoxina producida por sp de Aspergillus y Penicillium (A. ochraceous,
P. verrucosum, A. carbonarum)
Efectos sobre la salud: Persistencia en sangre- 35 das
9Nefrotxico
9Cancergeno (Grupo 2B-IARC International Agency for
Research on Cancer
Nivel tolerado establecido OMS: 100 ng/Kg peso y semana (1995); 5
ng/Kg dia (1998).
Contenido mximo en vinos para el 2005 (2g/L). (Propuesto en la 82
asamblea de la OIV)
Deteccin : ELISA HPLC
Incidencia:
Mayor en los pases calidos, mediterrneos que en zonas fras
Mayor en vinos tintos que blancos

Ocratoxina A
Presencia de Ocratoxina A en mostos y vino

AISLAMIENTO E IDENTIFICACIN DE
MICROORGANISMOS EN ENOLOGA
Toma de muestras
Tratamiento de las muestras
Siembra en medios de cultivo adecuados
Recuento de clulas viables
Aislamiento de microorganismos en cultivo puro
Identificacin de los microorganismos aislados

Controles microbiolgicos: Toma de muestras

Via (de uva, suelo, madera...)
Bodega (suelo, paredes, material de bodega, agua...)
Mosto (antes y despus de sulfitar)
Fermentacin (diariamente o en las distintas fases)
Vino (despus de la estabilizacin, clarificacin, filtrado,
embotellado...)
NOTA: Utilizar un recipiente estril y manipular todo lo ms
aspticamente posible

Tratamiento de las muestras

Uva-Incubacin en medio lquido apropiado durante 1h
y siembra en placa para el recuento de clulas
Mosto- Recuento al microscopio y clculo de la
dilucin adecuada para siembra en placa y recuento de
clulas
Muestras de fermentacin-Recuento, dilucin apropiada
y siembra
Vino-filtracin

Recuento del n de clulas viables por mL

Medios de cultivo
Generales (YEPD, Agar mosto, WL)
Selectivos- suplementados con compuestos que inhiben el
crecimiento de los distintos grupos microbiano
Bacterias-antibiticos como el cloranfenicol
Bacterias lcticas- estreptomicina, penicilina, nisina
Levaduras-cicloheximida, pimaricina
Hongos- propionato sdico
Microorganismos viables, no cultivables (Seguimiento mediante
microscopa con epifluorescencia)
Conservacin de las cepas (a -80C)
Bacterias: (medio de cultivo+ 40% glicerol)
Levaduras: YEPD+15% glicerol

Aislamiento de levaduras
Toma de muestras
Uva
Mosto (sulfitado y sin sulfitar)
Fermentacin
Fase inicial
Fase tumultuosa
Fase lenta o final

Recuento y dilucin adecuada de la muestra

Siembra en un medio de cultivo (suplementado con un inhibidor de
crecimiento bacteriano y de hongos)

YEPD
Agar malta
Agar Mosto
WL nutrient agar

Aislamiento en cultivo puro y conservacin

Aislamiento: YEPD // Conservacin: YEPD+15% glicerol

Identificacin de levaduras
Pruebas de identificacin:
Morfolgicas (en placa, medio lquido y al microscopio)
Esporulacin
Fisiolgicas y Bioqumicas (dependen del estado fisiolgico
y del medio de cultivo)
9Asimilacin y fermentacin de azcares
9Asimilacin de compuestos nitrogenados
9Produccin de enzimas
9Requerimiento de factores de crecimiento
9Resistencia a cicloheximida,etc

Identificacin de levaduras
Pruebas de biologa molecular:
Anlisis del cariotipo
Anlisis de DNA mitocondrial
Secuenciacin y anlisis de restriccin del rDNA
PCR
Mtodos rpidos de deteccin y cuantificacin:
(Especialmente tiles para microorganismos de crecimiento
lento o para clulas viables pero no cultivables)
Bioluminiscencia: (actividad metablica; Ex. luciferasa)
Epifluorescencia: (tincin con un colorante fluorescente,
Ex. Naranja de acridina)
PCR a tiempo real: seguimiento de mRNA mediante RTPCR
Hibridacin in situ con sondas especficas marcadas con
un fluorocromo

Anlisis del cariotipo

Mediante electroforesis de campo pulsante

Detecta polimorfismo del DNA genmico
Diferenciacin entre especies y cepas, mediante
diferencias de nmero y tamao de los
cromosomas (S. cerevisiae- 16 cromosomas de
tamao entre 250 y 2500 Kpb)
Equipamiento especfico, costoso y largo
Requiere personal especializado y cepas
aisladas
Ms discriminante que la tcnica de PCR y
DNA mitocondrial

Schuller et al. 2003

Anlisis del DNA mitocondrial

Anlisis del polimorfismo del DNA
mitocondrial (muy polimorfo y estable)
Requiere poca infraestructura de
laboratorio
Relativamente rpida y econmica
Diferenciacin entre especies
Diferenciacin entre cepas de S.
cerevisiae
Requiere cepas aisladas y personal
especializado
EVEGA 2004

Anlisis de restriccin del rDNA

Implica la comparacin de secuencias de genes que

codifican el rRNA y de los espaciadores entre ellos
(ITS
Comparacin de secuencias
Comparacin de fragmentos de restriccin
(PCR-RFLP)
Requiere previa amplificacin mediante PCR

PCR
Amplificacin de secuencias especficas utilizando un
termociclador
Equipamiento costoso, personal especializado
Tcnica rpida que permite actuar en caso de necesidad
Seguimiento de implantacin de levaduras inoculadas
en fermentacin (Permite diferenciar LSA)
Schuller etal. 2003

RAPDs- amplificacin de regiones genomicas al azar utilizando primers

cortos e inespecficos (poco reproducible)
ITS
Amplificacin de secuencias delta- flanquean el retrotransposn Ty

Aislamiento e identificacin de Brettanomyces

Filtracin de la muestra
Siembra en un medio especfico (crecimiento lento, en medios
convencionales las otras levaduras crecen ms rpido)
Medio DBDM
Crecimiento 25 C, 2 semanas
Identificacin : mtodos convencionales
Mtodos moleculares: PCR, hibridacin in situ con fluorescencia,
PCR a tiempo real

Aislamiento e identificacin de bacterias acticas

Medios de cultivo
Suplementados con inhibidor del crecimiento de
levaduras y de bacterias lcticas
WL+ 2% etanol ( 10% de vino estril). Colonias color
verde
GYC (Glucosa 5%, extracto de levadura 1%, , CaCO3
3%, agar %)
Mannitol medium (manitol 2,5%, extracto de levadura
1%, agar 1,5%)
MRS + 2% etanol
Temperatura de incubacin: 25-28 C (5-7 das)
Condiciones aerbicas

Aislamiento e identificacin de bacterias acticas

Pruebas de identificacin
Gram +, Catalasa
Oxidacin del etanol, glicerol y lactato
Formacin de compuestos cetnicos
Crecimiento en acetato sdico o etanol como nica
fuente de carbono
Crecimiento en dulcitol
Produccin de pigmentos marrones en GYC
Produccin de celulosa (filtrabilidad del vino)
Mtodos moleculares (PCR y secuenciacin de rRNA 16S)

Aislamiento e identificacin de bacterias lcticas

AISLAMIENTO
Medios de Cultivo
9 AGB (acidic grape broth, pH4,8) (O. oeni)
9 MRS

Incubacin en estufa de anerobiosis

Temperatura y tiempo de incubacin. 30 durante 48 h
Pruebas de Identificacin
Gram +
Morfologa (coco o bacilo)
Homofermentativa o heterofermentativa
Fermentacin de azcares
Crecimiento en determinadas condiciones de pH, T
Tcnicas moleculares
PCR especfica (primers del gen-enzima malolctica) (O. oeni)

Aislamiento e identificacin de bacterias lcticas

Caractersticas identificativas de Oenoccocus oeni

Control microbiolgico de vinos embotellados

Filtracin de una cantidad de vino conocida

utilizando un sistema adecuado
Colocacin de la membrana en un medio de cultivo
adecuado
Crecimiento a temperatura adecuada
Recuento de microorganismos viables presentes en la
muestras
Identificacin de los microorganismos encontrados
Evaluacin del riesgo

Como prevenir las enfermedades microbianas de los vinos

Mantener unas condiciones higinicas adecuadas en la
bodega
Procurar que la uva entre en buenas condiciones
Evitar paradas fermentativas procurando obtener vinos con
una concentracin de azcar < 2g/l
Sulfitado adecuado (25-30 mg/L)
Conservacin adecuada: Mantener los depsitos llenos y
cerrados y a baja temperatura
Filtracin amicrbica de los vinos antes del embotellado

Seleccin de levaduras y bacterias en

enologa

Papel en la calidad del vino

Bacterias
Criterios de seleccin
Uso de bacterias seleccionadas

Levaduras
Criterios de seleccin
Levaduras seleccionadas
Levaduras autctonas: ventajas e inconvenientes

Seleccin de bacterias
Caractersticas deseables para cultivos iniciadores de bacterias lcticas
Elevada degradacin de cido L-mlico
Resistencia a grado alcohlico elevado (en torno al 15%)
Resistencia a SO2 (a concentracin 50 mg/L)
Capacidad de crecimiento a bajo pH (Resistencia a la acidez)
Capacidad de crecimiento a bajas temperaturas
Baja produccin de acidez voltil
Buenas propiedades organolpticas (ausencia de caracteres sensoriales -)
Metabolismo limitado de azcares
Resistencia al ataque de bacteriofagos
No produccin de polisacridos extracelulares
No produccin de compuestos txicos (Ej: aminas bigenas)
Fcil obtencin de biomasa y resistencia a los procesos de congelacin y
liofilizacin

Seleccin de bacterias
Obtencin de cultivos iniciadores de bacterias
Obtencin de biomasa, centrifugado y liofilizacin
Utilizacin de bacterias comerciales
Siembra directa o con rehidratacin y/o reactivacin

previa

Control de calidad de las cepas comerciales

Caracterizacin de la especie
Viabilidad (UFC/g)
Determinacin de la actividad malolctica
Verificacin de la ausencia de contaminantes (coliformes,
estreptococos, sulfitoreductores, leavduras y mohos)
Verificacin de caracteres fisiolgicos sobre medios sintticos
y vinos
Verificacin de la ausencia de fagos

Seleccin de levaduras autctonas

Criterios generales:
Ser autctona
Buena capacidad fermentativa (rpido arranque y acabado)
Alta produccin de etanol y regularidad fermentativa
Alta tolerancia al etanol
Produccin baja de acidez voltil
No formacin de espuma
Resistencia a sulfuroso
Baja produccin de sulfhdrico
Otras: fenotipo killer

Seleccin de levaduras autctonas

Levaduras seleccionadas para elaboracin de blancos
Tolerancia a bajas temperaturas
Potenciacin de aromas varietales y expresin de aromas
secundarios
Capacidad de acidificacin y desacidificacin biolgica
Crecimiento disperso en medio lquido
Levaduras seleccionadas para tintos
Alta produccin de acetaldehido y pirvico-estabilizacin del
color
Baja capacidad de adsorcin de antocianos a la PC
Produccin de glicerol- suavidad
Degradacin del cido mlico

Seleccin de levaduras autctonas

Uso de levaduras comerciales (LSA)
Ventajas
Calidad ms uniforme, garantiza repetitividad
Ayuda a resolver problemas de posible arranque, ralentizacin o
paradas de fermentacin
Homogeneidad en los vinos
Inconvenientes
Prdida de complejidad en el vino final
No son propias de la regin
Pueden no implantarse por competencia entre las levaduras
presentes en el mosto

Seleccin de levaduras autctonas

Ventajas de las levaduras autctonas
Especficas del rea
Totalmente adaptadas a las condiciones climticas de la zona
Totalmente adaptada al tipo de mosto
Responsables de caractersticas nicas de los vinos (tipicidad)

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