TECNOLOGIA DEL DNA

RECOMBINANTE

Tecnologa del DNA recombinante

Conjunto de tcnicas que permiten el
aislamiento de genes, su purificacin,
modificacin y expresin en organismos
diferentes de aquel de origen.

Herramientas: Nucleasas
DNA o RNA ss o ds
Endonucleasas: no requiere extremos.
Exonucleasas: substratos con extremos

Endonucleasas. S1 nucleasa

Exonucleasas cadena nica

Exonucleasa cadena doble

RNasa H
Degrada RNA de un hbrido RNA - DNA

Endonucleasas de restriccin
Evolucin dot a las diferentes especies
bacterianas con endonucleasas
especficas para distinguir su propio DNA
del DNA extrao.
Marcada especificidad para reconocer
cortas secuencias de nts.
Existencia de muchas E.R. c/u
reconociendo una secuencia especfica.

Tipos de E.R.
Tipo I: reconoce y corta a distancias variables
del sitio de reconocimiento. Mnimo 400 pb y
mximo 7 Kb. Corta DNA doble cadena.
Tipo III: cortan DNA doble cadena aprox. 25 pb
de su sitio de reconocimiento.
Tipo II: cortan DNA en el sitio de
reconocimiento. Generan fragmentos
reproducibles.
Tipos I y III: no producen fragmentos
reproducibles de DNA.

Secuencias palindrmicas
Palabra o frase que se lee igual de
izquierda a derecha, que de derecha a
izuierda.
Radar
Anilina
Dbale arroz a la zorra el abad.
TTAGCACGTGCTAA
AATCGTGCACGATT

Enzimas de restriccin
Por ejemplo:
EcoRI
Escherichia
(gnero)

coli
(especie)

Primera enzima aislada

de ese organismo.
cepa R

Otros ejemplos:
BamHI la primera que se aisl de la cepa H de
Bacillus amyloliquefaciens
SmaI la primera que se aisl de Serratia
marcesens
HindIII la tercera que se aisl de la cepa d de
Haemophilus influenzae

Tipos de corte
Sticky o pegajosos
es ms fcil para
volver a ligarse los
extremos.
Ejms.
EcoRI
Bam HI
HindIII

Blunt o abruptos
Ejm.
SmaI

E.R: extremos cohesivos

E.R: extremos cohesivos

Mapas de restriccin
Analizando los fragmentos producidos por
varias E.R en particular y en combinacin
se consigue deducir el orden de los
segmentos dentro de la molcula original.
Digerir con E.R en forma individual y
simultanea, correr en gel y determinar su
tamao.

Mapas restriccin

Ejemplos de mapas de restriccin

DNA circular digerido con:
DNA lineal digerido con:

Hacer mapa de restriccin

DNA no digerido
Hind III
Sma I
Hind III + Sma I

7 Kb.
6.2 0.8 Kb.
5.8 1.2 kb.
5.8 0.8 0.4 Kb

Mapa Restriccin