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  • Técnica Histologica y Micros

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    Antony Carrero
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    Técnica Histologica y Microscopia (1)

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    ‘Técnica histoldégica y microscopla GENERALIDADES DE LAS TECNICAS UTILIZADAS EN HISTOLOGIA /1 PREPARACION DEL TEJIDO /2 Tinci6n con hematoxilina y eosina de muestras fijadas en formaiina /2 Otros fiadores /2 Oitras técnicas de tincion / 3. HISTOQUIMICA Y CITOQUIMICA/3 CComposicion quimica de as muss isolgics /3 Fundamentos quimicos de la coloracién / 5 Digestion enzimatia /7 Histoqumica enzimatica 7 Inmunoelonuimica/7 “Técricas de hibridacién /10 Radioautogratia/ 13, @ GENERALIDADES DE LAS TECNICAS UTILIZADAS EN HISTOLOGIA El objetivo de un curso de hi + conducir al estudian- te a comprender la microanatomia de las células, los tejidos, y los érganos y a correlacionar la estructura con la funcion. Ls ecnicasutlizadas porlos hiseslogos son diversas en extremo. ‘La mayor parte de los contenidos de un curso de histologl se puede formular en los téeminos de la microscopia éprica, En la actualidad, en ls trabajos pricticos de laboratorio de istologia, os escudiantes uiizan microscopios épticos 0, cada ver con mis frecuencia, se valen del microscopia virtual, que cansiste en un :mérodo para examinarespecimencs microxpicos digitalizads en tuna pantalla de onenador. Antes, la interprtacién mds detallada de a microanatoma se fndamentaba en la microscapia electré- tnica (ME), tanto con el microscopio dlectrénico de transimi- sién (MET) como con el microscopio clectrénico de barride (MEB). Hoy, el microscopio de fuerza atdmica (MEA) tam- bin puede proveer imagenes de alta resolucién comparables con las obtenidas mediante el TEM, Tanto la ME como la MFA, dado su aumento més itl y su resolucién mayos, suclen ser el dtimo, MICROSCOPIA / 14 Microscopia 6ptica /14 Examen de un preparado histol6gico con ‘microscopio Optio / 14 Otros sistemas dpticos / 15 Microscopia electronica / 18 Microscopia de fuerza atémica / 20 Recuadro 1.1 Correlacion clinica: biopsias por ‘congelacién /4 Recuadro 1.2 Consideraciones funcionales: rmictoespectrofotometria de Feulgen / 7 Recuadro 1.3 Cotrelacion clinica: anticuerpos ‘moniocionales en medicina /9 Rlecuadlr 1.4 Uso corracto del microscopio 6ptico / 11 paso en la adquiscidn de datos al que se recurre entre las muchas técnicas auxiliaves de a biologia celular y molecular, ‘Eves técnicis auriliaresineluyens ‘© histoquimica e histoquimica, ‘© inmunocivoquimica y éencas de hibrdacion, ‘© ndioautografia, © cultivo de tejidosy drganos, ‘© separaciin de cals y orginulos por centifugacidn diferencial x ‘© Imicroscopiosy ténicas microsoipica especial, Es posible que lox estudiantes se sientan distantes de estas técni- ‘easy procedimientos experimental porque no suck estar contcm- plada una experiencia directa con cllos en los programas actuaes de {a asignatura. Sin embargo, es importante saber algo acerca de Jos procedimicntos especializados y de los datos que proporcionan, Ei ‘te capiule se prenca un panorama gener de eta tcnicasy une cexpliacin de cm ls datoraportades por ells pueden ayudar al cctudlante a eamprender mejor be xructure yl fui dels els, de los eis y de ly organs Uno de los problemas que enffentan Jos estudiantes en histlo- scx comprender la indole de la imagen bidimensional de un pre- 1 parado hiswoligico o de una lectrénica y obmo ‘esa imagen se relaciona con la estructura tridimensional de a cual ‘proven. Para salvar esa brecha conceprual. primero tenemos que ‘presentar una breve descripcion de las tcnicas utilzadas para pre- pparar los cortes hicol6gicos tanto de la microscopia 6prca como de la microscopia electténica. § PREPARACION DEL TEJIDO Tincién con hematoxilina y eosina de muestras fijadas en formalina El corte de rutina tefido con hematoxilina y cosina es la ‘muestra que mis frecuentemente se estudia. La caja de preparados que se entrega a cada estudiante para que examine bajo el microscopio éptico contiene, principalmente, «specimenes fijaclos en formalina, incluidos en parafina y colorea- dos con hematosilina y cosina (H-E), Casi todas las microforogra- fiasSpticas en las secciones del atlas de exe libro son de preparados ‘de estas mismas caas. Ademas, la mayor parte de las fas utiliza para iustrartejidosy Srganos en la clases tedricas de histologia y en conferencias se obtienen de estos preparados. A. veces se usan otras ténicas para demostrar componentes espe 0s ce las clas y los tejidos; varias de estas técicas se describen ‘mis adelante. primer paso en la preparacién de una muestra de tejido u rgano es la fijacién para conservar la estructura, La fijacién, en general obtenida mediante el empleo de sustan- cas quimicas individuals 0 meaclas de exas sustancias, conserva la csructura del tejdo de forma permanence para permitr el tata- ‘miento ulterior. Las muestra tienen que sumergise en fijador inmediaramente después de extracse del organismo. ‘La fjacién se sili para: ‘© sbolir cl merabolismo cela (© impedir la degradacin enzimtica de las e@ulasy de los tejidos por autbliss autodigestién), ‘© dstruir los microorganismos patdgenos, como las bacteras, kos hhongos oko virus y ‘© endurecer el tejido como consecuencia dela formacién de enl- cxscruzados o dela desnaturalzacién de las moléculasprotecas. El fijador de uso mis comin es la formalina: una solucién acuosi de formaldchido al 379%, en diluciones variadas y en ‘combinacién con otras sustancias quimicas y amortiguadores (buffers). El formaldehido preserva la estructura general de la ‘Alla y de los componentes extracelulares al reaccionar con los ‘grupos amino de las proceinas (con mucha frecuencia forma enlaces cruzados entre residios de lisina). Dado que el formal- Achido no alerasignificativamente su estructura tridimensional. las proteinas mantienen su capacidad de reaccionar can. anti- cuerpos especifcos. Esta propiedad es importante en los méto- dos de tincién inemunoeitoquimica (véase bp. 7). La solucién comercial estindar de formaldehido amortiguado con fosfatos (pH 7) acuis con bastante lentitud, pero penetra bien en el ej- do, Sin embargo, el formaldehido no reacciona con ls lipidos y, por consiguiente, es un mal fijador de las membranas. En el segundo paso, la muestra se dispone para su inclusi6n en parafina con el fin de permitir su corte. 1 picémetro (pm) = __0,01 angstroms (A) "angetrom = 0.1 nanémetre (om) 10 angstioms = 10 nanémetro + nanémeto = 1,000 pieémettos F000 nanémetros = ——*1,0 micrémetro um) ‘| 1.000 micrometros: = 1,0 milimetro (mm) Para poder examinar la muestra hay que infiltrarla con un medio de inclusiém que permica realizar cortes muy delgados, de 54.15 jim (1 miczémecro [jim] equivale a una milésima parte de un milimetro; éase el Cuadro 1.1). Luego de la fija- cin, la muestra se lava y se deshidrata en una serie de solucio- nes acohdlicas de concentracincreciente hasta aeanzar alcohol al 100%. En el paso siguiente el aclarado, se utilizan solventes ‘orginicos como xileno 0 tolueno, que son miscibles tanto en alcohol como en parafina, para extraer el alcohol al 100% antes de la infleracin de la muestra con parafina fundida, ‘Cuando la parafina fundida se ha enfriado y endurecido, xe ‘empareja para formar un bloque de tamatio adecuado. Este blo- ‘que, llamado “taco”, se coloct entonces en una miquina corta- dora especial, el micrétomo, que lo cortaen rebanadas finas con ta cuchilla de acero. Luego, fos cartes obtenidos se montan sobre portaobjetos de vidrio alos que antes se esha afiadido una pequefa cantidad de medio de montaje (albimina, pineno o resinasactlcas) para que sirva de adhesivo, En el tercer paso, la muestra se tfie para permitir su examen. Dado que los cortes en parafina son incoloros, la muestra odavia no est lista para su examen bajo el micrascopio éptico. Para colotear 0 tir los cortes histolégicos, la parafina debe dlisolversey extraense, de nuevo con xileno o toluene, y los tele dos deben rehdratarse mediante el wo de una serie de alcoholes de concentraciia decreciente. Luego, el tejido sobre los portaob- jetos se tile con hematonilina en agua. Como el colorante de contrast, I eosina, es mis soluble en alcohol que en agua, se vuelve a deshidratar la mucstra en soluciones aleohdlicas de con- centracién creciente y después se tie con cosina en alcohol Los resultados de la incién eon hemateailina sola, con eosina sola y con ambos colorantes se muestran en la Figura 1 dela coloracibn, la muestra se hace pasar por allen o tolueno y se le coloca un medio de montaje no aeuoso antes de cubritla con un cubreobjetos para lograr un preparado permanente, Otros fijadores La formalina no preserva todos los componentes de las célu- las y los tejidos. ‘Aunque los corte reidos con HE de muestrasfijadas en For- malina son convenientes porque dejan ver bien lascaracreristicas cetructurales generales, no son especifios para diucidar la compo- sicién quimica de los elementos constcucivos celulares, Ademés, ‘muchos componentes se pierden durante la preparacién de la ‘muestra Para retener estos companentesy estructura hay que uti liar otros mérodos de fijaci6n. Estos metodos se fundamentan en ‘un conocimient sélido dela quimica. Por ejemplo, los alcoholes FIGURA 1.1 * Coloracién con hematoxlina y eosina (}-E). Las tres imagenes que se presentan aqui corresponden a cortes de pan- creas seriados (contiguos) para demostrar el efecto dala harataxlina y de la eosina utlizadas solas o combinadas. e. En esta microlo- tograia so ve una eoloracién con hematoxiina sola. Si bien hay una tincién general de la muestra, aquellos componentes y aquelas stTucturas con gran afiidad por el colorante se tien con una intensidad mucho mayor. por ejemplo, el DNA nuclear y el AINA citoplas- ‘matico. b. De manera sinilar, la eosina (colorante de contraste), al usarse sola, consigue una tincién genaral de los tjdos, como puede verse en esta microfotograia. Obsérvese, sin embargo, que los nicleos son menos conspicuos que en la muestra tefida solo con hema toxling. Después de que la muestra so colorea con hematoxina, y luego de que se la prepara para su tinclén con eosina en solucion alcohélic, la hematoxiina que no estaba unida con firmoza se lava, y entonces la eosina tie aquellos componentes para los que tiene ‘gran afinidad.c, En esta micrototogratia pueden verse los efectos tntaiales combinados de ambos colorantas (H-E). 480 x. Y los solventes orginicos que se usan en las preparaciones de ruti- a diluyen los lipidos neutros, ara conservar los lipids neutros, como los dela elas adi- pposas, deben urlizarse cortes por congelacién de tejido Bijado en formalina y colorantes que se dsuelvan en las grass: para con- servar estructuras de la membrana hay que usar fijadoresespe- ciales con metales pesados, como permanganato y osmio, que se tunan a los fosfolipidos (Recuadro 1.1), El empleo de rutina de tetréxido de osmio como fijador en la microscopia clectrbnica «sla razin principal del excelente estado de conservacién de las ‘membranas en las microfotografias elecrdnicas. Otras técnicas de tincién ‘La hematonilina y la cosina se utilizan en histologia principal- ‘mente para poner en evidencia las caratersticas A pesar de los mésios de la tinciGn con HLE, este procedimien- to no permite ver adecuadamenteciertos componentesestructra- les de los corte hisroligicos, a saber, elatina, fbrasrevculares, ‘membranas basales y lipidos. Cuando se desea exudliar estos com- ponentes pueden ulilzase otros métodos de tincién, en su mayo- fa selectivos, que ineluyen la coloracién con orceina y ficsina- resorcina para el maceralelistico y la impregnacién argéntica para las fbrasretcularesy las membranas basales. Pese a que el funda- ‘mento quimico de muchos no siempre se comprende, estos proce- dimientos sirven. En cualquier eas0, ¢s més importante sabcr lo que dl método permite observa que conocer su mecanismo intimo de actin, @ HISTOQUIMICA Y CIToquimicA Los procedimientos quimicos es pucden prover {nformacién detallada acerca de la funcién de las cdlulas y de os componentes extracelulares de los tejidos. Los mécodos histoquiimicos y citoquimicos pueden tener sit fandamento en |a unién especifiea de un colorante, en el uso de anticuerp. se diri- sgidos contra un componente celular en particular o en la activi dad enzimética inheremte de un elemento constitutivo de las cdlulas. Ademis, muchas macromoléculas presences en las eflu- las pueden detectarse por medio de la radioautografia, en la ‘cual precursores moleculares marcados radiactivamente se incor- poran en las células y en los tejdos antes de la fjacidn, Muchos de estos procedimicntos pueden usarse en preparados tanto para a microscopia éptica como para la microscopia electrdnica, ‘Antes de comentar ln quitmica de las tinciones de rutina y de las técnicas histoquimicas y citoquimicas, convendri describiz breve- ‘mente la indole de un corte histol6gico comin, narcados con un colorante fluor Composicién quimica de las muestras histolégicas 1a composicién quimica de wn tejdo listo para una colora- cién de rutina es muy diferente de la del tjido vivo. Los componentes que perduran luego de ba Bjacién son princi palmente molécubs grandes que no se disuelven con fcldad, en ‘special después de aplicar el jador. Estas moléculas grandes, en particular las que reaccionan con otras moléculs semejantes para formar complejos macromolecular, son las que suelen conservat- se en un corte histlégico. Los siguientes son ejemplos de estos complejos macromolecula- res grandes: «nucleoprotein, formas po dcidos nuccios unidos a pro- i oesqueleto, en complejo con otras proteinas; xtracelulares en grandes aglomeraciones insolu- bles, en las cuales moléculas vecinas semejantes se nen a través 3a 1 onyjdeo VOININOOLIO A VOININDOISIH @ vidoosoiow A eortgiaisy eajuOg), ‘A veo0s ol patélogo necesita evaluar de inmedato et do | cei aan co urge: en eapotl cuando ot _ diagnéstico patoldgico instanténeo puede determinar el paso siguiente en la crugia. Hay varias incieaciones para realizar ‘este tipo de evaluacién, que se conoce como blopsia por -congelacién. Con mucha frecuencia, un cirujano en el quird- ‘allazaos intraoperatorios inesperados. Ademas, ‘puede querer saber si se ha extitpado toda la masa patolégh ‘ca dentro del limite del tejido sano y si el borde de la resec- ‘ion quiringica esta libre de tej ‘Las biopsias por ‘congelacion también se realizan en combinacién con otros ‘procedimientos, como la endoscopia 0 la biopsia con aguja fina, para confirmar si el material bidpsico obtenigo sera ti ‘en estutios patologicos adcionales, _ Para realizar una biopsia por congelacion se siguen tres pasos principales: ‘© Congelacion de la muestra de teido. Se congelan muestras de teido de tamaio pequatio mediante el uso de anhidrido _carbéico comprimido.0 mediante fa inmersion en un liquido {ro (sopentano) a una temperatura de 50 °C, Elentiamien- Sees ee eee cielo le Saptacry prvtas Mee bem? ‘bono) ea las membranas, En si mayor pare, estas moléculas constiuyen la estructura de las eu y de los teidos, dado que son loselementos morfSgcnos histicos. Son la base de la organizacién de ls ejidos visible eon el microscopio. En muchos casos, un elemento estructural es al mismo tiempo una tinidad funcional Por ejemplo, n el caso de las proseinas que forman los filamentos contrictiles de las células musculaes, ellos 10 puede lograrse en una cémara refigeradore muy efcien- 1@. La congelacién endurece el te permite et corte con ‘un micrétomo, ‘© Corte del edo congelada corte suele realizarse dentro do ‘un eriéstato (una eémara refigarada que conione un micrlo- ‘mo). Dado que et tad esta congelado y duro, puede cortar: ‘seen rebenadas muy fnas (5 @ 10 mm), Luego os cores se ‘montan sobre portzabetos de vicra. | «© Tincion de los cores. La tincion se relia para dlerencar {os niicleos celulares del resto de las estructuras del tj- do. Las tinciones de uso més frecuente para las biopsias ‘por congelacion son HE, azul de metileno (Fig. F111) y PAS. ‘Todo el proceso de preparacisn y evaluacion de las biopsias. 'por congelacién puede tardar en compietarse en un minimo, {de 10 minutos. i tiempo total que transcurre hasta obtener fa tebido con HE. 180 x. (Gontileza deh ‘doctor Daniel W. Visscher) | son los componentesestructualesvisibles y adems participan en

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