UNIVERSIDAD CENTRAL DEL ECUADOR

FACULTAD DE CIENCIAS QUÍMICAS

ESCUELA DE BIOQUIMICA Y FARMACIA
CARRERA DE QUIMICA DE ALIMENTOS

INFORME DE MICROBIOLOGIA INDUSTRIAL

AISLAMIENTO, SELECCIÓN Y PRESERVACION DE MICROORGANISMOS

CELULOLITICOS A PARTIR DE RESIDUOS VEGETALES EN COMPOST
GENERADOS EN UN CULTIVO DE CRISANTEMO

CRISTINA BARRERA
PAMELA CARLOSAMA
PAOLA FLORES

NOVENO SEMESTRE

2009 – 2010
 INDICE

1. INTRODUCCION .................................................................................................. 3
2. OBJETIVO GENERAL .......................................................................................... 3
3. OBJETIVOS ESPECIFICOS ................................................................................. 3
4. MARCO TEÓRICO ............................................................................................... 4
4.1. CULTIVO DE CRISANTEMO ........................................................................ 4
4.2 CELULOSA ......................................................................................................... 4
4.3 DESECHOS ORGÁNICOS ................................................................................. 5
4.4 COMPOST .......................................................................................................... 5
4.5 Microorganismos celulolíticos ............................................................................. 5
4.6 METABOLISMO DE LA CELULOSA ................................................................... 6
4.7 GRUPO TRÓFICO DE MICROORGANISMOS CELULOLITICOS ...................... 6
4.8 PARES ELECTRONICOS....................................................................................... 6
4.9 FACTOR LIMITANTE ............................................................................................. 6
5. MARCO METODOLOGICO .................................................................................. 7
MUESTREO ............................................................................................................. 7
FUNDAMENTO DEL METODO UTILIZADO ............................................................. 7
AISLAMIENTO E IDENTIFICACION DE MICROORGANISMOS CELULOLITICOS . 7
MEDIO DE CULTIVO ............................................................................................ 7
PREENRIQUECIMIENTO ..................................................................................... 8
AISLAMIENTO PRIMARIO ................................................................................... 8
AISLAMIENTO SECUNDARIO ............................................................................. 8
CONSERVACION DE CEPAS .................................................................................. 8
6. BIBLIOGRAFIA ..................................................................................................... 9
1. INTRODUCCION

En la actualidad existen aproximadamente 2.749 hectáreas dedicadas al cultivo de

flores. 1 Entre las flores mas sembradas se encuentran: las rosas con el 63.50 %; las
gipsophilas con el 12.72 %; las flores de verano con el 10.35 %; el clavel y mini clavel
con el 5.4 %; las flores tropicales con el 5.2 %; el crisantemo-pompom 0.64 y el 2.19 %
distribuidas entre otras clases. 2
En las instalaciones florícolas se libera cerca de 1 553 100 Kg anuales de desechos
orgánicos, provenientes del área de cultivo: cortes de tallos, separación de hojas,
flores de desecho, eliminación de plantas; desechos orgánicos de las cocinas y áreas
verdes. En algunas fincas, estos desechos son recolectados y trasladados a pilas de
compostaje donde son triturados y procesados para la elaboración de abono orgánico,
cuyo uso no esta siendo optimizado.3

El compostaje se lleva a cabo a campo abierto, requiere armar pilas de material

vegetal de altura adecuada (2,5 m. de ancho por 1,4 de alto). Según los tipos de
plantas procesadas y la temperatura del ambiente (sierra o costa), el compostaje toma
entre 4 y 5 meses, se necesita de una mezcla mecánica ($150), estática ($180) y una
agitación mecánica ($220) por metro cúbico, sus limitaciones son que se requieren
grandes espacios para su aplicación y la excavación del suelo puede liberar VOCs
(compuestos orgánicos volátiles). 4

La utilización de microorganismos con actividad celulolitica representa una de las

opciones con mayor viabilidad en la solución de esta problemática ya que, se ahorra
espacio y el costo de la producción de un saco de 35 kilogramos (Kg) de compost es
de $1,16. 5
Al aislar microorganismos celuloliticos la degradación de los residuos vegetales, o su
transformación, será más eficaz, logrando preparar un compost con las características
que requiere el suelo: nitrógeno y potasio.

2. OBJETIVO GENERAL

Aislar, seleccionar y preservar microorganismos degradadores de celulosa a

partir de residuos vegetales en compost generados en un cultivo de
crisantemo.

3. OBJETIVOS ESPECIFICOS

Obtener muestras de compostaje de crisantemo de mínimo 4 semanas de

descomposición.
Formular un medio de preenriquecimiento con CMC para el aislamiento de
microorganismos celuloliticos

1
http://www.sica.gov.ec/agronegocios/Biblioteca/Ing%20Rizzo/nuevos%20exportables/flores/flores_ecuad
or.htm
2
http://www.sica.gov.ec/censo/contenido/analisis_flores.pdf
3
ESTUDIO DE IMPACTO AMBIENTAL EXPOST, FINCA FLORÍCOLA MARÍA BONITA
4 DESCONTAMINACIÓN DE SUELOS: TÉCNICAS BIOLÓGICAS, Francisco Martín Peinado,

Departamento de Edafología y Química AgrícolaFacultad de Ciencias. Universidad de Granada

5 Bioabonos garantizan mayor producción, Publicado el 23/Septiembre/2009 | 00:12, Diario HOY.

 Seleccionar los microorganismos que presentan mayor actividad celulolítica
mediante condiciones ecológicas adecuadas.
Preservar las cepas puras obtenidas al final del bioproceso mediante la técnica
de crioconservación.

4. MARCO TEÓRICO

4.1. CULTIVO DE CRISANTEMO

El crisantemo es un cultivo que tiene muchas enfermedades por lo que su cuidado

implica aplicación de fertilizantes, plaguicidas, etc. Una forma de contrarrestar esto es
utilizando compostaje de residuos vegetales de aquellas flores que no se van a
comercializar o de las que han florecido antes de su cosecha.

Los residuos son picados, depositados en una fosa, añadidos tierra, agua en
diferentes capas. El proceso de compostaje dura alrededor de 8 meses.

Preparación del suelo

Es importante controlar periódicamente los valores de pH y CE del suelo. El pH deberá
situarse entre 5,5 y 6,5 y la CE (conductividad eléctrica de un extracto de pasta
saturado); no deberá exceder los 2,5 mmhos.cm-1.

Fertilizantes
Los crisantemos son muy exigentes en nutrientes, y especialmente, en nitrógeno y
potasio. La dosis de fertilización que se recomienda para el cultivo de crisantemo es la
100-120-120 de N-P-K, respectivamente.6

Necesidades Nutrimentales del cultivo

Las necesidades de elementos, para un óptimo crecimiento y desarrollo de la planta,
son:

Nitrógeno Magnesio Boro

Fósforo Azufre Molibdeno
Potasio Fierro Zinc
Calcio Cobre Manganeso

4.2 CELULOSA

Principal constituyente carbonado de las plantas (C6H10O5). Constituida por

moléculas de D-glucosa unidas por enlaces  (1-4) glucosídicos. Estas cadenas
lineales interaccionan entre sí por medio de enlaces de puentes de hidrógeno
formando microfibrillas con regiones altamente ordenadas que le dan características
de insolubilidad, rigidez y resistencia al ataque enzimático, conocidas como regiones
cristalinas. Cuando a lo largo del haz de cadenas se rompen los puentes de hidrógeno
se forman regiones amorfas, que permiten su hidratación y ataque enzimático por
microorganismos celulolíticos que poseen enzimas específicas encargadas de su
degradación.

6
EL CULTIVO DEL CRISANTEMO Elaborado por M.C. HELADIO LINARES ONTIVEROS Tipo de curso
TEÓRICO-PRÁCTICO Fecha de elaboración Enero 2005
 4.3 DESECHOS ORGÁNICOS

Se consideran desechos orgánicos vegetales de producción agrícola los residuos de

cosecha formados por los órganos aéreos y subterráneos de las plantas, mientras que
rastrojos son los residuos de la parte aérea que permanecen en la superficie del suelo
después de la cosecha.
La adición de residuos vegetales influye positivamente en la cantidad y actividad de la
biomasa microbiana; la mantención de una población microbiana estable y diversa
promueve la estabilidad de los agregados del suelo a través de productos de síntesis
que unen partículas, influyendo en las propiedades físicas primarias del suelo.

4.4 COMPOST

El compostaje se puede definir como la transformación y estabilización biológica de la

materia orgánica debido a microorganismos en condiciones aeróbicas, termófilas y
controladas. El compostaje es la técnica por la cual la materia orgánica es
descompuesta de forma controlada, imitando los procesos naturales de fermentación
para producir biomasa y humus, un producto válido para abonar suelos y plantas, que
actualmente tiene mucha difusión, ya que convierte desperdicios orgánicos en un
sustrato nutritivo.

4.5 MICROORGANISMOS CELULOLÍTICOS

GRUPO ORDEN GÉNERO ECOLOGÍA

Vibrio Aerobios, mesófilos, termófilos,
Pseudomonadales
Cellvibrio con pigmentos, aerobios, Gram -,
Cellulomonas bacilos pigmentaos aerobios, a
Eubacteriales Bacillus veces pleomórficos anaerobios,
Clostridium suelos inundados, turbas bacilos
Bacterias
Cytophaga aerobios, en suelos con pajas o
Mixobacteriales
Esporocytophaga abonos orgánicos.
Streptomyces Crecen en agar mineral con
Actinomycetales Micromonospora celulosa, halo de hidrólisis,
Nocardia pigmentos
Descomponen celulosa en cultivo
Protozoos Hertmella puro, importantes en el rumen,
menos en el suelo
Rhizoctonia Activos degradadores de la
Humicola celulosa, dominan en ambientes
Hongos Ascomycetes Botrytichum ácidos, en mantillos de bosques.
Alternaria También se encuentran en el
Rhyzopus rumen

Estos microorganismos secretan un sistema complejo de enzimas extracelulares,

celulasas y xilanasas, que sinergísticamente degradan celulosa y hemicelulosa. Las
fibras de celulosa son degradadas por dos tipos de sistemas enzimáticos:

1. Sistemas agregativos. En bacterias anaerobias, las enzimas que participan en la

degradación de celulosa y hemicelulosa.
 2. Sistemas no agregativos.- Compuestos por tres tipos de enzimas:
-1,4-endoglucanasa
celobiohidrolasas ( -1,4-glucan celobiohidrolasas)
-glucosidasas

Estos tres tipos de enzimas actúan en forma cooperativa en la degradación de las

celulosas.

4.6 METABOLISMO DE LA CELULOSA

La actividad enzimática es el factor más importante en la degradación de la celulosa.

La célula microbiana de los microorganismos sintetizan exoenzimas que actúan sobre
la celulosa y la descomponen en productos que puedan ser utilizados como fuente de
carbono. Estas exoenzimas son:
Celulasa que transforma la celulosa a celobiosa
Celobiasa que transforma celobiosa en glucosa

4.7 GRUPO TRÓFICO DE MICROORGANISMOS CELULOLITICOS

CARACTERÍSTICAS
Nivel trófico de Organismos heterótrofos (algunas bacterias
Descomponedores
ecosistema y hongos), que se alimentan de restos
Por la fuente de orgánicos. En este proceso alimenticio
Heterótrofo
carbono descomponen la materia orgánica y la
Por la naturaleza trasforman en inorgánica.
de donadores de Organotrofo Los compuestos orgánicos son utilizados
electrones como fuente de energía y de carbono.
Obtienen energía por oxidación enzimática
Heterotrofia de sustancias orgánicas con
Tipo nutricional
quimioorganotrófica
desprendimiento de CO2 (respiración).

4.8 PARES ELECTRONICOS

Degradación aerobia

celulasa
(C 6 H10 O 5 ) n C 6 H12 O 6

C 6 H12 O 6 O2 CO 2 H 2O Energia Biomasa

100% 60% 40%

Par donador de e- : CO2/Glucosa → Par reducido

Par aceptor de e- : ½ O2/H2O → Par oxidado

4.9 FACTOR LIMITANTE

La aplicación de nitrógeno inorgánico aumenta la descomposición de la celulosa en el

suelo y tanto las sales de amonio con las de nitrato son fuentes de este elemento, por
tanto el nivel de nitrógeno en el suelo es un factor limitante.
5. MARCO METODOLOGICO

MUESTREO

TIPO DE No DE
MUESTRA CANTIDAD OBSERVACIONES
MUESTREO MUESTRAS
Residuos de
degradación de pila
Registrar la
de compostaje de 4 Aleatorio 11 100g
temperatura y pH.
semanas de
degradación

Los residuos vegetales se recolectaran manualmente y se depositaron en frascos

estériles, llevar al laboratorio y mantenerlas a 4º C.

FUNDAMENTO DEL METODO UTILIZADO

BIOESTIMULACION

Consiste en optimizar las condiciones ambientales que componen el entorno de las

bacterias. Modificando los factores ambientales (temperatura, concentración de
oxígeno, nutrientes etc.) del entorno natural a tratar, se consigue que la velocidad de
crecimiento de los microorganismos aumente, al aislar microorganismos celuloliticos la
degradación de los residuos vegetales, o su transformación, será más eficaz, logrando
preparar un compost con las características que requiere el suelo: nitrógeno y potasio.

La principal ventaja en que es una técnica in situ, y relativamente fácil y barata de

aplicar. La desventaja es que es un proceso lento, que requiere de un control técnico
exhaustivo.

AISLAMIENTO E IDENTIFICACION DE MICROORGANISMOS CELULOLITICOS

MEDIO DE CULTIVO

Elemento Fuente Cantidad

Carbono CMC 10g /L
Nitrógeno Peptona 2,5 g /L
Extracto de levadura 2,5 g /L
Oxigeno Agua, mat. celular 1L
Hidrogeno Agua, comp. org.
Azufre (NH4)2SO4 0,5 g /L
Fósforo KH2PO4 0,1 g /L
K2HPO4 0,1 g /L
Potasio KH2PO4
K2HPO4
Cloro CaCl2 0,5 g /L
Calcio CaCl2
 PREENRIQUECIMIENTO

10g de M de Llevar a la incubadora

o
residuos vegetales en por 48 h a 35 C.
compostaje + 90ml de
Caldo CMC

AISLAMIENTO PRIMARIO

10g de M de residuos vegetales en

compostaje + 90ml de Caldo CMC

10-1
1ml

1ml

10-3
1ml 1ml

Sembrar en superficie en agar CMC (Carboximetil celulosa al 1 %)

Incubación a 35º C por 48 horas.
Después de la incubación adicionar rojo congo al 1%, luego de 15 min. Retirar
el exceso, añadir NaCl 0,1M, dejar reposar 15 min. y contar las colonias que
presentan halos de hidrólisis.

AISLAMIENTO SECUNDARIO

A partir de los microorganismos obtenidos en el aislamiento primario, realizar repiques

en agar CMC al 1% de las colonias que presentaron actividad celulolitica, colonias que
presenten halos de hidrólisis, llevar a incubación y revelado bajo las mismas
condiciones del aislamiento primario.

CONSERVACION DE CEPAS

Las cepas seleccionadas someter a tinción Gram y una vez definidas sus
características microscópicas, obtener cultivos axénicos en agar CMC. Preparar
suspensiones en caldo CMC y mezclar con glicerol al 25%, colocar en crioviales y
almacenarlos a -20º C.
6. BIBLIOGRAFIA

1. http://www.sica.gov.ec/agronegocios/Biblioteca/Ing%20Rizzo/nuevos%20export
ables/flores/flores_ecuador.htm
2. http://www.sica.gov.ec/censo/contenido/analisis_flores.pdf
3. ESTUDIO DE IMPACTO AMBIENTAL EXPOST, FINCA FLORÍCOLA MARÍA
BONITA
4. DESCONTAMINACIÓN DE SUELOS: TÉCNICAS BIOLÓGICAS, Francisco
Martín Peinado, Departamento de Edafología y Química AgrícolaFacultad de
Ciencias. Universidad de Granada
5. Bioabonos garantizan mayor producción, Publicado el 23/Septiembre/2009 |
00:12, Diario HOY.
6. EL CULTIVO DEL CRISANTEMO Elaborado por M.C. HELADIO LINARES
ONTIVEROS Tipo de curso TEÓRICO-PRÁCTICO Fecha de elaboración
Enero 2005