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Brucelosis Bovina
Brucelosis Bovina
BRUCELOSIS BOVINA
RESUMEN
La brucelosis bovina suele estar causada por Brucella abortus, menos frecuentemente por
B. melitensis y por B. suis. La infeccin est muy extendida por el mundo. Algunos pases del norte
y del centro de Europa, Canad, Japn, Australia y Nueva Zelanda se consideran libres de su
agente etiolgico.
La enfermedad se caracteriza clnicamente por uno o ms de los sntomas siguientes: aborto,
retencin de placenta, orquitis, epididimitis y, raramente artritis, con excrecin de los
microorganismos en los exudados uterinos y en la leche. El diagnstico depende del aislamiento
de Brucella a partir de los abortos, de las secreciones de la ubre y de los tejidos analizados
postmortem. Se puede realizar un diagnstico preliminar determinando la respuesta especfica
mediada por las clulas o la serolgica frente a los antgenos de Brucella.
Brucella abortus, B. melitensis y B. suis son muy patgenos para el hombre y por los tanto, todos
los tejidos infectados como los cultivos y el material potencialmente contaminado deben manejarse
bajo condiciones apropiadas de contencin.
Identificacin del agente: La evidencia preliminar de Brucella la suministra la observacin de su
morfologa, mediante la tincin modificada de los cido-alcohol resistentes, en los productos del
aborto o los exudados vaginales, especialmente si est respaldada por pruebas serolgicas. La
reaccin en cadena de la polimerasa recientemente desarrollada, proporciona medios adicionales
de deteccin. Cuando sea posible, se debe aislar Brucella en medios normales o selectivos
cultivando los exudados uterinos, los fetos abortados, las secreciones de las ubres o los tejidos
seleccionados, como los ganglios linfticos y los rganos reproductores masculino y femenino. Las
especies y biovariedades deberan identificarse mediante fagolisis y segn criterios de cultivo,
bioqumicos y serolgicos. La reaccin en cadena de la polimerasa (PCR) puede proporcionar un
mtodo complementario para la biotipificacin basado en secuencias genmicas especficas.
Pruebas serolgicas y alrgicas cutneas: Las pruebas con el antgeno tamponado de Brucella,
es decir la prueba con rosa de bengala y la prueba de aglutinacin tamponada en placa, as como
la fijacin del complemento, el enzimoinmunoensayo (ELISA) o el ensayo de polarizacin de la
fluorescencia, son pruebas adecuadas para analizar los rebaos y los animales individuales. Sin
embargo, ninguna prueba serolgica aislada es adecuada para todas y cada una de las
situaciones epidemiolgicas. Por tanto, la reactividad de las muestras que son positivas en las
pruebas de anlisis deben confirmarse utilizando una estrategia confirmativa establecida. La
prueba de ELISA indirecto o la del anillo de leche, realizadas con muestras de leche completa, son
eficaces para analizar y controlar la brucelosis en las vacas lecheras, pero la prueba del anillo de
leche es menos fiable en los grandes rebaos. Otra prueba inmunolgica es la prueba cutnea de
la brucelina, que puede utilizarse en los anlisis o como una prueba confirmativa en los rebaos
cuando existe una reaccin serolgica positiva en ausencia de factores de riesgo obvios en los
rebaos no vacunados. Se ha demostrado que la prueba interfern gamma, la prueba de
precipitacin que utiliza como antgeno el hapteno nativo y el ELISA indirecto en el que se utiliza
como antgeno el lipopolisacrido rugoso han resultado prometedores para diferenciar entre la
brucelosis y la exposicin a los microorganismos con reaccin cruzada.
Se ha demostrado que las pruebas con interfern gamma, las pruebas con precipitina en las que
se utiliza antgeno y hapteno nativo y el ELISA indirecto en el que se utiliza un antgeno
lipopolisacrido rugoso son prometedores de cara a diferenciar entre la brucelosis y la exposicin a
los microorganismos con reaccin cruzada.
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A. INTRODUCCIN
En el ganado vacuno la brucelosis suele estar causada por biovariedades de Brucella abortus. En algunos
pases, particularmente en el sur de Europa y en el oeste de Asia, donde el ganado se cra junto a ovejas o
cabras, la infeccin tambin puede ser debida a B. melitensis (41). En ocasiones, B. suis puede causar una
infeccin crnica de las mamas en el ganado vacuno, pero no se ha descrito que origine abortos o se extienda a
otros animales (29). Normalmente la enfermedad es asintomtica en las hembras no gestantes. Despus de la
infeccin por B. abortus o por B. melitensis, las hembras adultas en gestacin desarrollan una placentitis que, por
lo general, provoca el aborto entre el quinto y el noveno mes de gestacin. Incluso en ausencia de aborto se
produce una gran excrecin de microorganismos a travs de la placenta, los lquidos fetales y los exudados
vaginales. Las mamas y los ganglios linfticos regionales tambin pueden infectarse y los microorganismos
pueden aparecer en la leche. Las gestaciones posteriores llegan, por lo general, a trmino, pero la infeccin
uterina y la mamaria se repiten, con un nmero reducido de microorganismos en los productos del parto y en la
leche. En las infecciones agudas, el microorganismo est presente en la mayora de los ganglios linfticos. Los
machos adultos pueden desarrollar orquitis, y la brucelosis puede causar la esterilidad en ambos sexos. Una
manifestacin corriente de la brucelosis en algunos pases tropicales son los higromas, por lo general en las
articulaciones de las patas, que pueden representar el nico indicador de la infeccin; con frecuencia, el lquido
de los higromas est infectado por Brucella.
La brucelosis se ha descrito tambin en el camello de una joroba (Camelus dromedarius) y en el de dos jorobas
(C. bactrianus), as como en los siguientes camlidos de Sudamrica: la llama (Lama glama), la alpaca (Lama
pacos), el guanaco (Lama guinicoe), y la vicua (Vicugne vicugne) como consecuencia de contactos con
rumiantes infectados con B. abortus o B. melitensis. Adems, se ha observado en el bfalo domstico (Bubalus
bubalus), el bisonte americano y europeo (Bison bison, Bison bonasus), el yak (Bos grunniens), el alce o wapiti
(Cervus elaphus), as como en el bfalo africano (Syncerus caffer) y en varias especies de antlopes africanos.
Las manifestaciones de la brucelosis en estos animales son similares a las del ganado vacuno.
En el manual de bioseguridad para los laboratorios elaborado por la Organizacin Mundial de la Salud (OMS)
clasifica a los microorganismos del gnero Brucella en el Grupo de Riesgo III. La brucelosis se transmite
fcilmente al hombre y causa una enfermedad febril aguda la fiebre ondulante que puede convertirse en
crnica y producir complicaciones graves que afectan a los msculos esquelticos, al sistema cardiovascular y al
sistema nervioso central. En las zonas en las que la enfermedad es endmica deben tomarse medidas para
evitar la infeccin del hombre. A menudo la infeccin se debe a una exposicin profesional y se adquiere por va
oral, respiratoria o conjuntival, pero el riesgo mayor para la poblacin general es la ingestin de productos
lcteos contaminados en las zonas en las que la enfermedad es endmica. Los veterinarios y los granjeros que
manejan animales infectados, fetos abortados o placentas, estn expuestos a ese riesgo laboral. La brucelosis
es una de las enfermedades de ms fcil adquisicin en el laboratorio, y se deben observar precauciones de
seguridad muy estrictas cuando se manejen cultivos y muestras infectadas, como lo son los productos del aborto.
Existen recomendaciones especficas que han de seguirse con el material infectado por Brucella (para ms
detalles vanse las referencias 2, 42, 95 y el captulo 1.1.2. Bioproteccin y seguridad humana en los
laboratorios veterinarios de microbiologa y en las instalaciones de los animales). La manipulacin de los cultivos
vivos o del material animal contaminado en el laboratorio es peligrosa y debe realizarse en un nivel de
contencin 3 o superior, como se indica en el captulo 1.1.2, para reducir la exposicin ocupacional. Es esencial
que se utilice un nivel de contencin 3 en los lugares en los que se realicen cultivos de Brucella a gran escala
(p.ej. para la produccin de antgeno o de vacunas).
La evidencia gentica e inmunolgica indica que todos los miembros del gnero Brucella estn estrechamente
relacionados. Sin embargo, teniendo en cuenta que existen diferencias relevantes entre las principales variantes
683
B. abortus
+e
Actividad
ureasa
Oxidasa
RTD
R/C
Iz1
RTD
RTD
Wb
104RTD
RTDc
Requiere
suero
Especies
Morfologa
colonialb
Tb
+f
Hospedador preferido
B. suis
+g
+g
+h
Biovariedad 3: cerdo
Biovariedad 4: reno
Biovariedad 5: roedores salvajes
B. melitensis
+j
Ovejas y cabras
B. neotomae
+h
B. ovis
Carneros
B. canis
+h
Perros
684
Biotipo
Requiere CO2
Produccin de H2S
Tionina
Fucsina
bsica
+b
+b
+b
+b
+c
+o
B. neotomae
B. ovis
B. canis
Especies
B. melitensis
B. abortus
B. suis
Aglutinacin con
sueros monospecficos
B. TCNICAS DE DIAGNSTICO
Todos los abortos del ganado vacuno deben considerarse como casos sospechosos de brucelosis y deberan
investigarse. El cuadro clnico no es patognomnico, aunque el historial del rebao puede servir de ayuda. El
diagnstico inequvoco de las infecciones por Brucella solo puede hacerse mediante el aislamiento y la
identificacin de Brucella, pero en situaciones en las que no es posible el anlisis bacteriolgico, el diagnstico
685
1.
a)
Mtodos de tincin
El gnero Brucella est formado por cocobacilos o bacilos cortos que miden 0,61,5 m de largo por 0,5
0,7 m de ancho. Normalmente aparecen aislados, y con menos frecuencia en pares o en grupos
pequeos. La morfologa de los microorganismos del gnero Brucella es bastante constante aunque en
cultivos viejos se observan formas pleomrficas. No es una bacteria mvil. No forma esporas ni flagelos, ni
fimbrias o cpsulas verdaderas. Los microorganismos del gnero Brucella son Gram negativos y no suelen
mostrar tincin bipolar. No son verdaderamente bacterias cido-alcohol resistentes, pero resisten a la
decoloracin por cidos dbiles y se tien de rojo por la modificacin de Stamp del mtodo de Ziehl
Neelsen. Este mtodo constituye el procedimiento normal para el examen de frotis de rganos o de lquidos
biolgicos, que se fijan previamente con calor o con etanol, y por este mtodo los microorganismos se tien
de rojo frente a un fondo azul. Tambin puede utilizarse una tcnica basada en anticuerpos conjugados a
un fluorocromo o marcados con peroxidasa (77). La presencia de microoorganismos intracelulares con
morfologa de Brucella, dbilmente resistentes a cidos, o inmunoespecficamente teidos, es una
evidencia preliminar de la brucelosis. Sin embargo, estos mtodos presentan una baja sensibilidad en la
leche y en productos lcteos donde los microorganismos del gnero Brucella se presentan a menudo en
escaso nmero, y donde la presencia de glbulos de grasa impide frecuentemente una interpretacin
correcta. En la interpretacin de los resultados positivos por el mtodo de Stamp tambin debe tenerse en
cuenta que otros microorganismos que causan aborto son difciles de diferenciar de Brucella, como
Chlamydophila abortus (antes Chlamydia psittaci) o Coxiella burnetii. Los resultados, tanto positivos como
negativos, deben confirmarse por cultivo.
Para demostrar el agente en diversas muestras biolgicas, se pueden utilizar mtodos basados en sondas
de ADN o en la reaccin en cadena de la polimerasa (PCR) (11).
b)
Cultivo
i)
Medio basal
El aislamiento y cultivo directo de Brucella se realiza normalmente en un medio slido. En general,
este representa el mtodo ms satisfactorio porque permite el desarrollo de colonias aisladas
fcilmente reconocibles. Los medios slidos tambin limitan el establecimiento de los mutantes no
lisos y el desarrollo excesivo de contaminantes. Sin embargo, el empleo de los medios lquidos puede
recomendarse para muestras voluminosas o con fines de enriquecimiento. Se dispone de un amplio
rango de medios basales comercializados en forma deshidratada, por ejemplo el medio base para
Brucella, agar triptosa o (tripticasa)-soja (TSA). Es necesario aadir 25% de suero bovino o equino
para el crecimiento de algunas cepas como la biovariedad 2 de B. abortus, y muchos laboratorios lo
aaden sistemticamente al medio basal con resultados excelentes, como en el caso del agar sangre
(Oxoid) o agar Columbia (BioMrieux). Se pueden utilizar otros medios satisfactorios como el agar
suero-dextrosa (SDA) o el agar glicerol-dextrosa (2). El medio SDA es normalmente el de eleccin
para la observacin de la morfologa colonial. Para el aislamiento de Brucella de la sangre o de la
leche, y de otros lquidos del cuerpo, donde se aconseja un cultivo de enriquecimiento, se recomienda
un medio bifsico no selectivo conocido como medio de Castaeda. Este medio se emplea porque las
brucelas tienden a disociarse en medio lquido y esto interfiere con la tipificacin llevada a cabo
mediante las tcnicas bacteriolgicas convencionales.
ii)
Medios selectivos
Todos los medios base indicados anteriormente se pueden utilizar para la preparacin de medios
selectivos. Se aaden los antibiticos apropiados para evitar el crecimiento de organismos distintos a
Brucella. El medio selectivo ms difundido es el de Farrell (30), que se prepara aadiendo seis
antibiticos a un medio base. Se aaden las siguientes cantidades por 1 litro de medio: sulfato de
polimixina B (5.000 unidades = 5 mg); bacitracina (25.000 unidades = 25 mg); natamicina (50 mg);
cido nalidxico (5 mg); nistatina (100.000 unidades); vancomicina (20 mg).
Se ha comercializado un suplemento de antibiticos liofilizado (Oxoid). Sin embargo, a las
concentraciones utilizadas en el medio de Farrell, el cido nalidxico y la bacitracina pueden tener
efectos inhibidores sobre algunas cepas de B. abortus y B. melitensis (50). Por ello, la sensibilidad del
aislamiento de B. melitensis aumenta cuando se utilizan tanto el medio de Farrell como el medio de
ThayerMartin. En esencia, el medio modificado de ThayerMartin se puede preparar con medio base
GC (38 g/litro; Biolife Laboratories, Miln, Italia) suplementado con hemoglobina (10 g/litro; Difco) y
metanosulfonato de colistina (7,5 mg/litro), vancomicina (3 mg/litro), nitrofurantona (10 mg/litro),
nistatina (100.000 Unidades Internacionales [UI]/litro = 17,7 mg) y anfotericina B (2,5 mg/litro) (todos
686
687
c)
Identificacin y tipificacin
Cualquier colonia con una morfologa similar a la de Brucella debe analizarse por la tincin de Gram (o por
la coloracin de Stamp). Como en las fases no lisas se alteran las propiedades serolgicas, tintoriales y de
sensibilidad a los fagos, la morfologa colonial resulta esencial para las pruebas de tipificacin que se
describen ms abajo. Los mtodos recomendados para observar la morfologa de las colonias son el
mtodo de Henry mediante luz reflejada oblicua, la prueba de la acriflavina descrita por Braun & Bonestell, o
el mtodo de White & Wilson de tincin de colonias con cristal violeta (2).
La identificacin de los microorganismos se puede realizar mediante una combinacin de las siguientes
pruebas: morfologa celular y tincin de Gram o de Stamp, propiedades de crecimiento, pruebas de ureasa,
oxidasa y catalasa, y la prueba de la aglutinacin en porta con un suero policlonal anti-Brucella. La
identificacin de especies y de biovariedades requiere pruebas ms elaboradas (como la lisis por fagos y la
aglutinacin con sueros monoespecficos anti-A, anti-M anti-R), cuya realizacin se lleva a cabo en
laboratorios de referencia con experiencia en estos mtodos. La utilizacin simultnea de varios fagos, es
decir, el Tbilissi (Tb), Weybridge (Wb), Izatnagar (Iz) y RC, representa un sistema de tipificacin fgica que,
con suficiente experiencia, permite identificar las especies lisas y las rugosas de Brucella. No obstante,
algunas propiedades, como el requerimiento de CO2 para crecer, la produccin de H2S (detectada
mediante papeles con acetato de plomo) y el crecimiento en presencia de fucsina bsica y tionina a
concentraciones finales de 20 g/ml, se detectan mediante pruebas rutinarias que pueden realizarse en
laboratorios no especializados moderadamente equipados (vanse los cuadros 1 y 2).
Cuando se envan cepas de Brucella a un laboratorio de referencia para su tipificacin, es esencial
seleccionar las cepas lisas. Los cultivos se liofilizan y se cierran en ampollas dentro de tubos con tampn de
rosca o se subcultivan en agar inclinado contenido en tubos con tapn de rosca. Tambin deben enviarse
cepas suspendidas en medio lquido (por ejemplo, en el medio de transporte de Ames) pero esto puede dar
lugar a la aparicin de mutantes rugosas.
688
i)
Brucella est considerada entre las bacterias ms peligrosas con las que se trabaja, por el riesgo a las
infecciones adquiridas en el laboratorio. Para transportar cultivos de Brucella, las tapas de los
recipientes deben estar bien cerradas y selladas con tapones de PVC. Deben envolverse con papel
adsorbente o con algodn, sellarse en bolsas de polietileno y empaquetarse en un contenedor rgido
de acuerdo con las exigencias de la Asociacin para el Transporte Areo (IATA) para el envo de
muestras peligrosas (39). Estas regulaciones se resumen en el captulo 1.1.1. Recogida y envo de
muestras de diagnstico. Como los cultivos de Brucella son infecciosos, se designan UN2814 y se
debe realizar una Declaracin de Muestras Peligrosas. Tambin existen restricciones para enviar
muestras sospechosas de brucelosis y se deben tener en cuenta las regulaciones de la IATA antes de
su envo (39). Tambin deben seguirse otras directrices nacionales e internacionales (96).
ii)
Antes de enviar cultivos o muestras de diagnstico para cultivo, se debe de contactar con el
laboratorio receptor para determinar si se necesita algn permiso especial y si el laboratorio tiene la
capacidad de realizar las pruebas solicitadas. Si las muestras traspasan fronteras nacionales,
probablemente se necesitar un permiso de importacin que debe obtenerse antes de despachar la
d)
Se ofrece el ejemplo de la PCR BaSS como muestra de un procedimiento molecular (vanse las
instrucciones detalladas en las referencias 16 y 27).
Preparacin bacteriana
i)
Cualquier mtodo aceptado de purificacin de ADN sera adecuado. Un mtodo simple y eficaz
consiste en seleccionar una sola colonia y, utilizando un asa de siembra estril, transferir las bacterias
a 100 l de agua grado-PCR. Se debe hervir la suspensin bacteriana durante un mnimo de
5 minutos para matar las bacterias y facilitar la lisis de la mayor parte de las mismas como molde para
la reaccin. Se ajusta la concentracin bacteriana a una densidad de entre 1,5 y 2 unidades de
absorbancia a 600 nm con solucin salina. Inmediatamente antes de su utilizacin, se vuelve a
mezclar la suspensin de cultivo y se diluye en alcuota de 1/10 en agua grado-PCR (p.ej. 5 l de
suspensin en 45 l de agua). Se mezcla con suavidad pero a fondo. Una vez utilizado, el material
diluido debe descartarse de forma adecuada.
Secuencia de nucletidos 5 a 3
Concentracin
de 100 stock
TGC-CGA-TCA-CTT-AAG-GGC-CTT-CAT-TGC-CAG
1,90 g/l
GAC-GAA-CGG-AAT-TTT-TCC-AAT-CCC
1,55 g/l
GTG-CCA-GCA-GCC-GCC-GTA-ATA-C
1,40 g/l
TGG-TGT-GAC-GGG-CGG-TGT-GTA-CAA-G
1,60 g/l
Directo eri
GCG-CCG-CGA-AGA-ACT-TAT-CAA
1,35 g/l
Inverso eri
CGC-CAT-GTT-AGC-GGC-GGT-GA
1,30 g/l
RB51-3
GCC-AAC-CAA-CCC-AAA-TGC-TCA-CAA
1,55 g/l
689
i)
Deben disolverse los oligonucletidos sintticos en tampn TE a una concentracin de 100 (vase el
cuadro anterior). El 100 stock permanece estable a 4C durante al menos dos aos siempre que se
tome la precaucin de no contaminar la solucin.
ii)
Se prepara el primer cctel colocando los siguiente concentrados 100 en un tubo de microcentrfuga
de 1,5 ml:
233 l
2,5 l
2,5 l
2,5 l
2,5 l
2,5 l
2,5 l
2,5 l
iii)
agua grado-PCR
cebador especfico para IS711
cebador especfico para B. abortus
cebador directo universal para 16S (control opcional para los inhibidores)
cebador inverso universal para 16SR (control opcional para los inhibidores)
cebador directo para eri
cebador inverso para eri
cebador para RB51
agua grado-PCR
10 tampn de reaccin sin MgCl2 (vase la Nota 6)
25 mM MgCl2
10 mM mezcla dNTP
cctel de cebadores del paso 2
GC potenciador. Si no se usa un potenciador, debe sustituirse por 500 l de agua gradoPCR.
TAQ ADN polimerasa FastStart
iv)
v)
Se hacen alcuotas de la mezcla base de 25 l en tubos PCR con una pared de 0,2 l (o
alternativamente una placa de 96 pocillos certificada para PCR). Se guardan los tubos de ensayo a
20C 2C.
vi)
Antes de su utilizacin, se descongela una cantidad suficiente de tubos con la mezcla base para los
desconocidos y los controles, y se mezcla a fondo pero con suavidad golpeando ligeramente con el
dedo.
i)
Se aade entre 1,0 y 2,5 l de la muestra desconocida o del control a cada tubo de ensayo. Debe
rmezclarse por completo cada muestra inmediatamente antes de retirar la alcuota, puesto que
Brucella tiende a depositarse rpidamente.
iii)
5,0 minutos
1 ciclo
95C 15 segundos
52C 30 segundos
40 ciclos
72C 90 segundos
4C
indefinidamente
690
iii)
Despus de la amplificacin, pueden guardarse indefinidamente las muestras sin abrir a 4C hasta el
momento de la deteccin.
i)
Se prepara un gel de agarosa al 2%, de 5 mm de espesor (en 0,5 TBE) con un nmero adecuado de
pocillos.
ii)
iv)
Se tie el gel
g durante 45
5 minutos en solucin de bromuro de etidio
e
(250 gg/500 ml de 0,5
0
TBE).
Como altern
nativa, puede teirse el ge
el antes de la
a electrofores
sis o durante la misma mediante la
adicin de bromuro
b
de etiidio al tampn
n que se est corriendo. PR
RECAUCIN: el bromuro de
e etidio es
mutagnico y un carcing
geno potenciall.
Interpretaci
n de los datos
dentificacin se
s basa en el nmero y los tamaos de los
l productos amplificados por la PCR (v
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epto los contro
oles negativos, deberan aamplificar al menos
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un
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ducto, la secu
uencia del 16
6S de 800 pb
b. Si esta ban
nda no est presente,
p
es pposible que la
a muestra
conttenga inhibido
ores de la PC
CR, el ADN no
o se degrad, o no se disp
pens la muesstra en la mez
zcla base.
Pue
ede ser necesa
ario diluir la muestra
m
origina
al para disminu
uir los niveles de inhibidorees en la reaccin, repetir
la prrueba con una
a nueva mues
stra o simplem
mente repetir la
a prueba con la muestra origginal.
Todos los aislam
mientos de B. abortus (biovvariedades 1, 2, y 4), inclluidas las ceppas vacunales tambin
plificarn un producto de 50
00 pb a partir del locus alkB
B del IS711. Ni
N otras especcies de Brucellla ni otras
amp
bactterias amplificcarn este pro
oducto. Solo la
a cepa vacunal RB51 de B.
B abortus ampplificar un prroducto de
300 pb a partir de
el locus wboA del IS711. To
odas las espe
ecies y cepas de Brucella, eexcepto la cep
pa vacunal
S19
9 de B. abortuss, amplificar el producto de
e 180 pb a pa
artir del gen ervA, pero no ass otras bacte
erias. En la
secccin B de la fig
gura siguiente
e se muestran algunos resultados.
Leyeendas de la Figgura
Figu
ura A. loci (filaas) amplificado
os predichos p
para varias cate
egoras de desconocidos (coolumnas). A: Se
e muestran
los ccuatro loci para cada catego
ora con sus ccebadores hibrridantes; B: loss productos prredichos deriv
vados de la
amp
plificacin eficcaz (fs se refierre a la cepa na tural de B. abo
ortus).
Figu
ura B. Patronees tpicos amplificados a pa rtir de aislamiientos bacteria
anos en bovinnos detectadoss mediante
elecctroforesis en gel
g de agarosa.. Carril 1: cepaa natural de B. abortus; Carrril 2: s19 de B . abortus; Carrril 3: RB51
691
de B. abortus; Carril 4: Brucella spp. (no B. abortus); Carril 5: bacterias distintas de Brucella. Se carg un gel de
agarosa al 2% con 8 l de producto amplificado y 1 l de tinte de carga por cada pocillo, se someti a
electroforesis durante 2,5 horas a 70 V, se ti con bromuro de etidio, y se visualiz con luz UV.
Otra nueva prueba es HOOF-Prints. Esta prueba de identificacin se ha elaborado recientemente y se ha
comprobado que tiene un gran potencial como herramienta epidemiolgica (12, 13). Conocida tambin
como anlisis de repeticiones en tndem de un nmero variable de locus mltiples (MLVA), esta prueba
puede ser un complemento de los mtodos clsicos de biotipificacin de acuerdo con la taxonoma
establecida (45).
Se ha incrementado la utilizacin de procedimientos moleculares para la identificacin de las especies de
Brucella y los procedimientos de la prueba han mejorado desde los aos noventa. Actualmente se dispone
de otras pruebas, tales como omp 25, 2a y 2b PCR/RFLP para B. abortus, que pueden utilizarse para la
identificacin de las especies de Brucella (17, 18).
e)
2.
Pruebas serolgicas
Ninguna prueba serolgica aislada es adecuada en cualquiera de las situaciones epidemiolgicas, presentando
limitaciones en el diagnstico de animales individuales (36, 68). Se deben considerar todos los factores que
influyen en la relevancia del mtodo de prueba y de sus resultados para una aplicacin o interpretacin
diagnstica especfica. Los mtodos serolgicos que se describen en este captulo son mtodos estandarizados
y validados, con caractersticas de realizacin adecuadas para ser consideradas pruebas obligadas o alternativas
en el comercio internacional. Esto no impide el uso de pruebas modificadas o similares o la utilizacin de
reactivos diferentes. Sin embargo, los mtodos y reactivos descritos en este captulo suponen un estndar de
comparacin respecto a la realizacin esperada del diagnstico.
Debe resaltarse que la prueba de la seroaglutinacin lenta en tubo (SAT) se considera inadecuada a efectos del
comercio internacional. La prueba de la fijacin del complemento (FC) es ms especfica que la SAT para el
diagnstico y adems posee un sistema estandarizado de unidades. Las caractersticas diagnsticas de algunos
enzimoinmunoensayos (ELISA) y la prueba de la polarizacin de fluorescencia (FPA) son similares o superiores
a la FC y, como son ms fciles de realizar tcnicamente y ms consistentes, es preferible su utilizacin (64, 98).
Se ha comparado el rendimiento de algunas de estas pruebas.
Para el control de la brucelosis en un pas o regin, son adecuadas para el anlisis las pruebas con antgeno
tamponado de Brucella, es decir, la prueba con rosa de bengala (RBT) y la prueba de aglutinacin tamponada en
placa (BPAT), as como ELISA y FPA. Las reacciones positivas deben volverse a comprobar utilizando una
estrategia confirmativa adecuada.
692
Sueros de Referencia
Los estndares primarios de referencia bovina son aquellos frente a los que se comparan y calibran todos
los dems estndares. Estos estndares de referencia estn a disposicin de los laboratorios nacionales de
referencia y deben utilizarse para establecer estndares secundarios o nacionales frente a los que pueden
prepararse otros de trabajo para utilizacin en el diagnstico diario rutinario de laboratorio.
Estos sueros se han desarrollado y designado por la OIE como Sueros Internacionales Estndar1. Su
empleo favorece la armonizacin internacional de las pruebas de diagnstico y la estandarizacin de
antgenos (98):
Para la RBT y la FC se emplea el suero estndar internacional de la OIE (OIEISS, antes designado
Segundo suero anti-B. abortus de la OMS) que contiene 1000 UI y UIFC (unidades internacionales
para la prueba de fijacin del complemento).
Adems, se dispone de tres sueros estndar de la OIE para ELISA. Son tambin de origen bovino y
comprenden un estndar fuertemente positivo (OIEELISASPSS), otro dbilmente positivo
(OIEELISAWPSS) y otro negativo (OIEELISANSS).
Produccin de clulas
En la produccin de antgenos para diagnstico debe utilizarse siempre la cepa 99 de B. abortus
(Weybridge) (S99) (ver direccin en la nota 1 a pie de pgina) o la cepa 1119-3 (USDA) (S-1119-3)2. Debe
destacarse que el antgeno preparado de una de estas cepas tambin se utiliza en las pruebas para
infeccin por B. melitensis o B. suis. Las cepas deben ser lisas y no autoaglutinables en solucin salina con
0,1% (p/v) de acriflavina. Tienen que ser cultivos puros y cumplir las propiedades de las cepas de
B. abortus biovariedad 1 que son independientes de CO2. Los cultivos originales de siembra se cultivan
para producir un lote de inculo que debe tener las propiedades de estas cepas, y se conservan por
liofilizacin o por congelacin en nitrgeno lquido.
Para la produccin de antgeno, el inculo de siembra se utiliza para sembrar varios tubos de agar inclinado
con medio de infusin de patata que se incuban a 37C durante 48 horas. Los medios slidos SDA y TSA,
con adicin de un 5% de suero equino o suero de ternero neonato y un 0,1% de extracto de levadura, son
satisfactorios con tal de que se utilice un inculo adecuado como se recomienda arriba. La pureza del
crecimiento se comprueba suspendiendo a la cepa en PBS estril, pH 6,4, y se utiliza para sembrar frascos
Roux con medio slido de infusin de patata o con glicerol-dextrosa. Estos se incuban luego a 37C durante
72 horas con la superficie inoculada hacia abajo. La pureza del crecimiento se comprueba en cada frasco
mediante la tincin de Gram, y los microorganismos se recogen aadiendo a cada frasco 5060 ml de
solucin salina con fenol (con un 0,5% de fenol en una solucin de cloruro sdico al 0,85%). Los frascos se
agitan, se decanta la suspensin, y los microorganismos se inactivan por calentamiento a 80C durante
90 minutos. Despus de una prueba de viabilidad, el antgeno se conserva a 4C.
Alternativamente, las clulas se pueden producir en medio lquido o por cultivo continuo en un fermentador
(38), en un medio que contenga (por litro de agua destilada) D-glucosa (30 g), peptona de grado elevado
(30 g), extracto de levadura (Difco) (10 g), fosfato sdico (9 g) y fosfato bisdico (3,3 g). El pH inicial es
6,6 pero tiende a subir a 7,27,4 durante el crecimiento. Debe comprobarse la capacidad de los lotes de
peptona y de extracto de levadura para producir un buen crecimiento sin formacin de clulas anormales o
disociadas. Durante el crecimiento se puede necesitar una aireacin y agitacin vigorosas y el ajuste del pH
a 7,27,4 por adicin de HCl 0,1 M. El inculo de siembra se prepara como se describi anteriormente. El
cultivo se incuba a 37C durante 48 horas. El cultivo continuo puede mantenerse ms tiempo, pero se
necesita ms experiencia. Para confirmar su pureza deben realizarse controles del proceso del crecimiento
tanto en medio slido como lquido, del nivel de microorganismos viables para que sea el adecuado y la
ausencia de formas rugosas disociadas. En la fase de recogida las clulas para utilizacin como antgeno
deben comprobarse de nuevo su pureza y ausencia de disociacin.
1
2
Disponibles en el Laboratorio de Referencia de la OIE para la Brucelosis en la Veterinary Laboratories Agency (VLA)
Weybridge, New Haw, Addlestone, Surrey KT15 3NB, Inglaterra.
Disponible en el Departamento de Agricultura de los EE.UU. (USDA), National Veterinary Services Laboratories (NVSL),
1800 Dayton Road, Ames, Iowa 50010, EE. UU.
693
a)
Produccin de antgeno
El antgeno para la RBT se prepara depositando clulas muertas de las cepas de B. abortus S99 o S11193, recogidas por centrifugacin a 23.000 g durante 10 minutos a 4C, y resuspendindolas uniformemente
en una solucin salina fenicada estril (0,5%) a razn de 1 g por cada 22,5 ml.(Nota: si se utiliza
carboximetil celulosa sdica como agente sedimentador durante la preparacin del concentrado celular, los
residuos insolubles deben eliminarse antes de la tincin filtrando la suspensin por un prefiltro AMF-CUNO
Zeta-plus [Tipo CPR 01A]). A cada 35 ml de esta suspensin se aade 1 ml de rosa de bengala (CI No.
45440) al 1% (p/v) en agua destilada estril, y la mezcla se agita durante 2 horas a temperatura ambiente.
La mezcla se filtra a travs de una gasa estril y se centrifuga a 10.000 g para depositar las clulas teidas,
que a continuacin se resuspenden uniformemente a razn de 1 g de clulas por 7 ml de diluyente (21,1 g
de hidrxido sdico disueltos en 353 ml de solucin salina estril con fenol ms 95 ml de cido lctico, que
se ajusta a 1.056 ml con solucin salina fenicada estril). El color de esta suspensin debe ser rojo intenso
y el sobrenadante de una muestra centrifugada debe carecer de colorante; el pH debe ser 3,65 + 0,05.
Despus de la filtracin a travs de una gasa, la suspensin se filtra dos veces a travs de un prefiltro de
fibra de vidrio Sartorius No. 13430, se ajusta a un PCV de aproximadamente 8%, dependiendo de la
estandarizacin final frente a un suero calibrado contra el OIEISS, y se guarda a 4C en la oscuridad. El
antgeno debe almacenarse siguiendo las recomendaciones de los fabricantes, pero normalmente no debe
congelarse.
Cuando se utiliza en la prueba estndar, el antgeno RBT debe dar una reaccin positiva clara con dilucin
1/45 del OIEISS diluido en 0,5% de solucin salina con fenol, pero no a una dilucin de 1/55. Tambin es
conveniente comparar la reaccin de antgeno nuevo y de lotes previamente estandarizados utilizando un
conjunto de sueros definidos.
Procedimiento de la pruebas
i)
Poner las muestras de suero y de antgeno a temperatura ambiente (22 4C); solo debe sacarse del
refrigerador el antgeno suficiente para las pruebas del da.
ii)
Colocar 2530 l de cada muestra de suero en una baldosa blanca, placa esmaltada o de plstico, o
en una placa para hemaglutinacin de la OMS.
iii)
Agitar bien el frasco de antgeno, pero suavemente, y colocar el mismo volumen de antgeno prximo
a la gota de suero.
iv)
v)
vi)
Comprobar la aglutinacin, justo a los 4 minutos. Cualquier reaccin visible se considera positiva.
Antes de las pruebas de cada da se debe comprobar que un suero control origine una reaccin
positiva mnima para verificar la sensibilidad de las condiciones de la prueba.
La RBT es muy sensible. Sin embargo, como toda prueba serolgica, a veces origina una reaccin positiva
debido a vacunacin con S19 o a reacciones serolgicas positivas falsas (FPSR). Por tanto, las reacciones
positivas deben confirmarse con estrategias confirmativas (que incluyan tanto la realizacin de otras
pruebas como la investigacin epidemiolgica). Las reacciones negativas falsas se producen muy
raramente, sobre todo debido a los fenmenos de prozona y en ocasiones se pueden detectar diluyendo la
muestra de suero o volviendo a probarla despus de 46 semanas. Sin embargo, la RBT parece adecuada
como una prueba para detectar rebaos infectados o para garantizar la ausencia de infeccin en rebaos
libres de brucelosis.
694
Produccin de antgeno
El antgeno para la BPAT se prepara a partir de la cepa S1119-3 de B. abortus siguiendo el procedimiento
descrito por Angus & Barton (3).
Se requieren dos soluciones de colorante: verde brillante (2 g/100 ml) y cristal violeta (1 g/100 ml) de
calidad garantizada disueltos en agua destilada. Una vez preparadas, las dos soluciones se almacenan por
separado durante 24 horas, y luego se mezclan en volmenes iguales en una botella opaca y se guardan
en un refrigerador durante ms de 6 meses antes de uso. La mezcla de colorantes solo puede utilizarse
entre 6 y 12 meses despus de su preparacin inicial.
El diluyente tamponado se prepara disolviendo lentamente hidrxido sdico (150 g) en 34 litros de solucin
salina estril con fenol. A esta solucin se aade cido lctico (675 ml) y el volumen final se ajusta a 6 litros
aadiendo solucin salina estril con fenol. El pH de la solucin debe estar comprendido entre 3,63 y 3,67.
Las clulas empaquetadas de B. abortus S1119-3 se diluyen a una concentracin de 250 g/litro en solucin
salina fenolada; se aaden 6 ml de colorante por litro de suspensin celular, y la mezcla se agita antes de
filtrar por algodn absorbente estril. Las clulas se centrifugan a 10.000 g a 4C y las clulas precipitadas
se resuspenden a continuacin a una concentracin de 50 g/100 ml en diluyente tamponado (como se
describi anteriormente). La mezcla se agita vigorosamente durante 2 horas y despus se diluye aadiendo
300 ml de diluyente tamponado por cada 100 ml de clulas resuspendidas (es decir, a una concentracin
final de 50 g de clulas empaquetadas/400 ml de diluyente tamponado). La mezcla se agita a temperatura
ambiente durante 2024 horas antes de que la concentracin celular se ajuste al 11% (p/v) con diluyente
tamponado. Esta suspensin se agita durante toda la noche antes de uso. Pendientes de pruebas de
control final de calidad, el antgeno se guarda a 4C hasta su utilizacin. El antgeno tiene una caducidad de
1 ao y no se debe congelar.
El pH del antgeno tamponado en placa debe ser de 3,70 0,03 y el pH de una mezcla suero-antgeno a
una proporcin 8:3 debe ser de 4,02 0,04. La suspensin al 11% de clulas teidas debe ser azulverdosa. Cada lote de antgeno tamponado en placa debe comprobarse con al menos 10 sueros de
reactividad dbil y comparar los resultados con uno o ms lotes previos de antgeno. Si es posible, los lotes
de antgeno deben compararse con el antgeno estndar preparado por el NVSL, USDA (ver nota 2 a pie de
pgina para direccin). No hay sin embargo establecido un procedimiento de estandarizacin internacional
para uso con el OIEISS.
Procedimiento de la prueba
i)
Se colocan las muestras de suero y el antgeno a temperatura ambiente (22 4C). Se sacar de la
nevera solo el antgeno necesario para las pruebas del da.
ii)
Se agita bien la muestra. Se colocan 80 l de cada muestra de suero en una placa de vidrio marcada
con cuadros de 4 4 cm.
iii)
Se agita bien la botella de antgeno, pero con suavidad, y se colocan 30 l de antgeno cerca de cada
gota de suero.
iv)
v)
Despus de la mezcla inicial, la placa se mueve tres veces para asegurar la dispersin homognea de
los reactivos y se incuba 4 minutos a temperatura ambiente en una cmara hmeda.
vi)
vii)
Lase de inmediato la aglutinacin una vez transcurridos 8 minutos. Cualquier reaccin visible se
considera positiva. Debe probarse un suero control que d una reaccin positiva mnima antes de
comenzar las pruebas de cada da para comprobar la sensibilidad de las condiciones de la prueba.
Como la RBT, esta prueba es muy sensible, especialmente para la deteccin de anticuerpos inducidos por
la vacuna, y las muestras positivas deben volverse a verificar con pruebas confirmativas. Pueden producirse
reacciones negativas falsas, debidas por lo general a fenmenos de prozona, la cual puede eliminarse
diluyendo el suero o volviendo a probar despus de cierto tiempo.
b)
695
Produccin de antgeno
Existen numerosas variaciones de la prueba pero, cualquiera que sea el procedimiento, debe emplearse un
antgeno preparado de una cepa lisa aprobada de B. abortus, como la S99 o la S1119-3, y que est
estandarizado frente al OIEISS. El antgeno para la FC puede preparase por mtodos especiales (2, 38) o
utilizar clulas enteras diluyendo la suspensin stock de modo que la PCV de la suspensin de antgeno
concentrado para la FC sea aproximadamente del 2% antes de la estandarizacin frente al OIEISS. El
antgeno debe estandarizarse para dar una fijacin del 50% a una dilucin 1/200 del OIEISS y debe mostrar
tambin una fijacin completa a diluciones ms bajas de suero, porque una concentracin demasiado baja
(o demasiado alta) de antgeno puede no producir un 100% de fijacin a diluciones ms bajas de suero.
Cuando son adecuadas dos diluciones de antgeno, debe escogerse la suspensin de antgeno ms
concentrada para evitar el fenmeno de prozona.
La apariencia del antgeno a una dilucin 1/100 debe ser la de una suspensin blanca, uniforme y densa,
sin agregacin visible ni formacin de depsito despus de incubar a 37C durante 18 horas. No debe
producir efectos anticomplementarios en las condiciones de la prueba. El antgeno se guarda a 4C y no
debe congelarse.
Los sueros problema sin diluir y los estndar de trabajo adecuados se inactivan durante 30 minutos en una
bao de agua a 60C 2C. Si previamente se han diluido a la mitad con una solucin salina tamponada
con veronal, se pueden inactivar a 58C 2C durante 50 minutos. En general solo se prueba
rutinariamente una dilucin del suero (1/4 o 1/5, dependiendo del procedimiento escogido de la FC), pero se
recomiendan diluciones seriadas a efectos de detectar la existencia de prozona.
Con el empleo de placas de microtitulacin estndar de 96 pocillos de fondo redondeado (en U), la tcnica
se realiza normalmente del modo siguiente:
696
i)
ii)
iii)
v)
Las placas se incuban a 37C durante 30 minutos o durante toda la noche a 4C y se aade a cada
pocillo un volumen de SRBC sensibilizados (25 o 50 l dependiendo de la tcnica). Las placas se
reincuban a 37C durante 30 minutos.
vi)
Los resultados se leen despus de centrifugar las placas a 1.000 g durante 10 minutos a 4C y
despus dejarlas en reposo a 4C durante 23 horas para permitir que sedimenten las clulas no
lisadas. El grado de hemolisis se compara con los estndares que correspondan a una lisis del 0, 25,
50, 75 y 100% de lisis. La ausencia de actividad anticomplementaria se comprueba en la primera fila
para cada suero.
vii)
viii) Interpretacin de los resultados: Los sueros con un ttulo equivalente a 20 UIFC/ml o ms, se
consideran positivos.
Este procedimiento es un ejemplo y se pueden escoger otros volmenes y cantidades de reactivos con tal
de que la prueba se calibre frente al OIEISS como se describe antes y que los resultados se expresen en
UIFC/ml.
La prueba la FC es muy especfica. Sin embargo, como todas las pruebas serolgicas, a veces da
resultados positivos debido a vacunacin con S19 o a consecuencia de la FPSR. En consecuencia, las
reacciones positivas deben investigarse mediante estrategias confirmativas. Las hembras que se han
vacunado con B. abortus S19 entre los 3 y 6 meses se consideran generalmente positivas si los sueros dan
una fijacin positiva con un ttulo de 30 o ms UIFC/ml cuando los animales se diagnostican con una edad
de 18 meses o superior.
c)
ELISA indirecto
Se han descrito muchas variaciones de ELISA indirecto (I-ELISA) utilizando diferentes preparaciones
antignicas, diversos conjugados de antiglobulinas con enzimas, y varios substratos/cromgenos. Algunos
I-ELISA validados en ensayos amplios de campo se han comercializado y son muy utilizados. Para una
homologacin internacional se deben usar los tres Sueros Estndar para ELISA de la OIE en los
laboratorios nacionales de referencia para comprobar o calibrar el mtodo de la prueba en particular.
La prueba debe calibrarse de modo que la densidad ptica (OD) del Suero Estndar de la OIE fuertemente
positivo represente un punto de la porcin lineal de una curva tpica de dosis-respuesta, justo por debajo de
la meseta. El Suero Estndar dbilmente positivo de la OIE para ELISA debe dar siempre una reaccin
positiva que est situado en la porcin lineal de la misma curva dosis-respuesta, justo por encima del
umbral positivo/negativo. El suero negativo y el control de tampn deben originar reacciones que estn por
debajo del umbral positivo/negativo (97). El umbral debe establecerse en la prueba con tcnicas adecuadas
de validacin (ver Captulo 1.1.4. Principios de validacin para las pruebas de diagnstico de enfermedades
infecciosas).
La prueba I-ELISA es muy sensible, pero a veces no es capaz de distinguir entre los anticuerpos debidos a
vacunacin por S19 u otros problemas de FPSR y los inducidos por las cepas patgenas de Brucella (60).
Por consiguiente, la prueba I-ELISA debe considerarse como una prueba de diagnstico ms que como una
prueba confirmativa con ganado vacunado o en rebaos afectados con problemas de FPSR.
697
El sLPS de B. abortus S1119-3 S99 se prepara calentando 5 g de peso seco (o 50 g de peso hmedo) de
clulas suspendidas a 66C en 170 ml de agua destilada y aadiendo 190 ml de fenol al 90% (v/v) a 66C.
La mezcla se agita continuamente a 66C durante 15 minutos, se enfra y se centrifuga a 10.000 g durante
15 minutos a 4C. El fenol parduzco de la capa inferior se extrae con una cnula larga y si es necesario los
restos celulares se eliminan por filtracin (utilizando un filtro de papel Whatman No.1).
El sLPS se precipita aadiendo 500 ml de metanol fro que contenga 5 ml de metanol saturado con acetato
sdico. Despus de 2 horas de incubacin a 4C, el precipitado se recoge por centrifugacin a 10.000 g
durante 10 minutos. El precipitado se agita con 80 ml de agua destilada durante 18 horas y se centrifuga a
10.000 g durante 10 minutos. El sobrenadante se mantiene a 4C. El precipitado se resuspende en 80 ml
de agua destilada y se agita otras 2 horas a 4C. El sobrenadante se recoge mediante centrifugacin como
antes y se mezcla con el sobrenadante recogido previamente.
A continuacin, se aaden 8 g de cido tricloroactico a los 160 ml del LPS crudo. Despus de agitar
durante 10 minutos, el precipitado se elimina por centrifugacin y la solucin traslcida que constituye el
sobrenadante se dializa frente a agua destilada (como mnimo, dos cambios de 400 ml cada uno) y luego se
liofiliza.
El LPS liofilizado se pesa, se reconstituye a una concentracin de 1 mg/ml en tampn carbonato 0,05 M, pH
9,6, y se sonica en un bao de hielo utilizando tres sonicaciones de 6 vatios durante 1 minuto cada vez. A
continuacin, el LPS se liofiliza en fracciones de 1 ml y se guarda a temperatura ambiente.
698
i)
El sLPS liofilizado se reconstituye con 1 ml de agua destilada y se diluye a 1/1000 con tampn
carbonato 0,05 M, pH 9,6 (o a una dilucin predeterminada por titulacin frente al suero estndar de la
OIE para ELISA). Para antigenizar las microplacas, se aade a todos los pocillos 100 l de la solucin
de sLPS, se cubren las placas y se incuba durante 18 horas a 4C. Despus de la incubacin, las
placas se pueden usar o se mantienen selladas y congeladas a 20C hasta un ao. Las placas
congeladas se descongelan antes de uso durante 3045 minutos a 37C.
ii)
El antgeno no unido se elimina lavando todos los pocillos cuatro veces con PBST. A los pocillos
especificados se aaden 100 l de suero diluido de 1/50 a 1/200 con PBST, pH 6,3, que contiene
Se aaden a las placas los sueros problema y se ensayan por separado o en duplicado. Los controles,
calibrados con Sueros Estndar de la OIE para ELISA, se disponen en pocillos duplicados e incluyen
un suero control fuertemente positivo, otro dbilmente positivo, un suero control negativo y un control
del tampn.
iv)
El suero no unido se elimina lavando cuatro veces con PBST (no debe usarse PBS que contenga
EDTA/EGTA con HRPO ya que inactiva el enzima). A cada pocillo se aade 100 l de conjugado
(MAb M23) especfico para un eptopo de la cadena pesada de la IgG1 bovina unido a HRPO y diluido
en PBST (predeterminado por titulacin) y las placas se incuban a temperatura ambiente durante
30 minutos.
v)
El exceso de conjugado se elimina con cuatro lavados. A cada pocillo se aade 100 l de
sustrato/cromgeno (1,0 mM de H2O2 [100 l/20 ml de tampn citrato] y 4,0 mM de ABTS [500 l/
20 ml de tampn citrato]), las placas se agitan durante 10 minutos y el color desarrollado se determina
en un espectrofotmetro a 414 o 405 nm. Si se desea, se puede aadir directamente a todos los
pocillos 100 l de SDS al 4% como agente de parada de la reaccin.
vi)
Los pocillos control que contienen el suero fuertemente positivo se consideran como un 100% de
positividad y todos los datos se calculan de estas lecturas de absorbancia (entre 1,000 y 1,800)
empleando la ecuacin:
Porcentaje de positividad (%P) = absorbancia (muestra problema)/absorbancia (control fuertemente
positivo) 100.
ELISA competitivo
El ELISA competitivo (C-ELISA) que emplea un MAb especfico para uno de los eptopos de la Brucella
OPS parece tener mayor especificidad que el I-ELISA (49, 64, 83, 92). Se realiza seleccionando un MAb
con mayor afinidad que los anticuerpos con reaccin cruzada. No obstante, se ha comprobado que el CELISA elimina algunas, pero no todas, las reacciones (FPSR) debidas a bacterias con reaccin cruzada
(61). El C-ELISA es tambin capaz de eliminar la mayora de las reacciones debidas a los anticuerpos
residuales que se producen en respuesta a la vacunacin con S19. La eleccin del MAb y su singular
especificidad y afinidad influencian las propiedades diagnsticas de la prueba. Como en cualquier prueba
basada en el MAb, se debe considerar la disponibilidad general del MAb o del hibridoma para su aceptacin
internacional y su utilizacin generalizada.
Se han descrito algunas variaciones de C-ELISA. El C-ELISA tambin est disponible comercialmente. Para
una homogenizacin internacional, los laboratorios nacionales de referencia deben utilizar los tres Sueros
Estndar de la OIE para el ELISA a fin de comprobar o calibrar el mtodo concreto.
La prueba debe calibrarse de tal modo que la densidad ptica del Suero Estndar de la OIE fuertemente
positivo represente un punto en la zona lineal de una curva tpica de dosis-respuesta justo por encima de la
meseta (es decir, prximo a la mxima inhibicin). El Suero Estndar de la OIE dbilmente positivo debe
dar una reaccin que caiga en la porcin lineal de la misma curva de dosis-respuesta justo por encima del
umbral positivo/negativo (es decir, inhibicin moderada). El suero negativo y el control de tampn/MAb
deben dar reacciones siempre menores que el umbral positivo/negativo (es decir, inhibicin mnima).
El mtodo que se describe a continuacin es un ejemplo de prueba que se ha validado internacionalmente y
utilizado con una difusin mundial a travs de proyectos de cooperacin tcnica y colaboracin cientfica
con financiacin internacional.
Los sistemas de tampn son los mismos que los descritos para la prueba I-ELISA.
Laboratorio de Referencia de la OIE para la Brucelosis, Animal Diseases Research Institute, 3851 Fallowfield Road,
Nepean, Ontario K2H 8P9, Canada.
699
Procedimiento de la prueba
i)
El sLPS liofilizado se reconstituye con 1 ml de agua destilada y se diluye a 1/1000 con tampn
carbonato 0,05 M y pH 9,6. Para antigenizar las microplacas, se aade a todos los pocillos 100 l de la
solucin de LPS, se cubren las placas y se incuban durante 18 horas a 4C. Despus de la
incubacin, las placas se pueden usar o mantenerlas selladas y congeladas a 20C hasta un ao.
Las placas congeladas se descongelan antes de uso durante 3045 minutos a 37C.
ii)
El antgeno no unido se elimina lavando todos los pocillos cuatro veces con PBST. A cada pocillo se
aaden 50 l de MAb (M84 en este caso) convenientemente diluido en PBST/EDTA e inmediatamente
otros 50 l de suero diluido 1/10 en PBST/EDTA. Las placas se incuban a temperatura ambiente
durante 30 minutos con agitacin, por lo menos durante los 3 minutos iniciales.
iii)
Se aaden a las placas los sueros problema y se ensayan por separado o en duplicado. Los controles,
calibrados con Sueros Estndar de la OIE para ELISA, se disponen en pocillos duplicados e incluyen
un suero control fuertemente positivo, otro dbilmente positivo, un suero control negativo y un control
del tampn.
iv)
El suero no unido se elimina lavando cuatro veces con PBST. A cada pocillo se aade 100 l de
conjugado comercial de IgG anti-ratn de cabra (cadena H y L) unida a HRPO y diluida en PBST
(predeterminado por titulacin) y las placas se incuban a temperatura ambiente durante 30 minutos.
v)
El exceso de conjugado se elimina con cuatro lavados. A cada pocillo se aade 100 l de
substrato/cromgeno (1,0 mM de H2O2 y 4,0 mM de ABTS), se agitan las placas durante 10 minutos y
el color desarrollado se determina con un espectrofotmetro a 414 o 405 nm. Si se desea, se puede
aadir directamente a todos los pocillos 100 l de SDS al 4% como agente de parada de la reaccin.
vi)
Los pocillos control que contienen el suero fuertemente positivo se consideran como una inhibicin del
0% y todos los datos se calculan de estas lecturas de absorbancia (entre 1.000 y 1.800) empleando la
ecuacin:
Porcentaje de inhibicin (%I) = 100 (absorbancia [muestra problema]/absorbancia [control de
tampn] 100).
d)
700
El OPS se prepara a partir de 5 g de peso seco (o 50 g de peso hmedo) de B. abortus S1119-3 aadiendo
400 ml de cido actico al 2% (v/v), autoclavando la suspensin durante 15 minutos a 121C y eliminando
los restos celulares mediante centrifugacin a 10.000 g durante 10 minutos a 4C. A continuacin, el
sobrenadante se trata con 20 g de cido tricloroactico para precipitar las protenas y los cidos nucleicos.
El precipitado se elimina de nuevo mediante centrifugacin a 10.000 g durante 10 minutos a 4C. El
sobrenadante se dializa frente, al menos, 100 volmenes de agua destilada y se liofiliza.
Se disuelven 3 mg de OPS en 0,6 ml de hidrxido sdico 0,1 M (4 g NaOH/litro) y se incuba a 37C durante
1 hora. Despus se aade 0,3 ml de ismero 1 de FICT a una concentracin de 100 mg/ml en dimetil
sulfxido y se incuba otra vez durante 1 hora a 37C. El OPS conjugado se aplica a una columna de 1
10 cm de DEAE (dietilaminoetil) Sephadex A 25 equilibrada con tampn fosfato 0,01 M, pH 7,4. La primera
fraccin (despus de 1015 ml de elucin con tampn) es verde fuerte, y despus se cambia el tampn a
fosfato 0,1 M, pH 7,4. Se eluyen 1015 ml de tampn seguidos luego de 2040 ml donde se obtiene el
material verde fluorescente. Este ltimo material es el antgeno utilizado en FPA. La preparacin de
antgeno se puede aumentar proporcionalmente.
La cantidad de antgeno utilizada por prueba se determina diluyendo el material antes obtenido hasta lograr
una intensidad de fluorescencia de 250.000300.000 en el FPM.
El antgeno se guarda como un lquido durante varios aos a 4C en un frasco opaco o se puede liofilizar en
frascos opacos.
Se puede disponer de pequeas cantidades de antgeno marcado para la investigacin y estandarizacin
de procedimientos operativos relacionados con la obtencin de antgeno y la realizacin de FPA (para
direccin, ver nota 3 a pie de pgina).
Procedimiento de la pruebas
i)
ii)
Se aade al tubo un volumen de antgeno que corresponda a una intensidad total de fluorescencia de
250300 103 y se mezcla bien. Este volumen puede variar de un lote a otro, pero en general es de
unos 10 l. Se obtiene una segunda lectura en el FPM despus de una incubacin a temperatura
ambiente de 2 minutos para suero y de 15 segundos para sangre tratada con EDTA.
iii)
iv)
En cada serie de pruebas se incluye un suero estndar de trabajo fuertemente positivo, otro
dbilmente positivo y un suero negativo (calibrados frente a los Sueros Estndar de la OIE).
La sensibilidad y la especificidad diagnstica de la FPA en la brucelosis bovina son casi idnticas a las de
C-ELISA. La especificidad diagnstica en ganado recientemente vacunado con la cepa S19 supera el 99%
(62). Sin embargo se desconoce en la actualidad la especificidad de la FPA en condiciones de FPSR. La
FPA debe estandarizarse de modo que los sueros positivos fuertes y dbiles de la OIE suministren
resultados positivos repetitivos.
701
3.
Otras pruebas
a)
Procedimiento de la prueba
i)
Se inyecta intradrmicamente 0,1 ml de brucelina en el repliegue caudal, en la piel del costado lateral,
o de un lado del cuello.
ii)
iii)
El grosor de la piel en el sitio de la inyeccin se mide con un calibrador Vernier antes y despus de la
inyeccin.
iv)
Una reaccin positiva fuerte se reconoce fcilmente como una inflamacin local e induracin. No
obstante, las reacciones dudosas requieren una interpretacin cuidadosa. Un engrosamiento de la piel
de 1,52 mm debe considerarse como una reaccin positiva.
Aunque la prueba intradrmica de la brucelina es una de las ms especficas de la brucelosis (en animales
no vacunados) el diagnstico no puede hacerse basndose solamente en reacciones intradrmicas
positivas en unos cuantos animales del rebao, y debe apoyarse en una prueba serolgica fiable. La
inoculacin intradrmica de la brucelina puede originar una anergia temporal de la respuesta inmune
celular. Por tanto, en general se recomienda un intervalo de 6 semanas entre dos pruebas realizadas sobre
el mismo animal.
La prueba cutnea, realizada con brucelina de la RB51 homloga tras la vacunacin de los terneros con
RB51, produce una respuesta humoral anamnsica. De esta forma, la asociacin de la prueba cutnea y la
prueba de FC con RB51 puede aportar un sistema de diagnstico para identificar los animales individuales
vacunados con RB51 (23).
b)
702
Brucellergne OCB, Synbiotics Europe, 2 rue Alexander Fleming, 69007 Lyon, Francia.
c)
d)
Pruebas en la leche
Un medio eficaz de examinar a las vacas lecheras es recurrir a la leche de los tanques de recogida. De
estos tanques se puede obtener leche de forma ms barata y frecuente que las muestras de sangre, y
habitualmente estn disponibles en las centrales lecheras. Cuando se obtiene un resultado positivo, todas
las vacas que aportan leche deben comprobarse individualmente analizando sus muestras de sangre. La
prueba I-ELISA en leche es sensible y especfica, y resulta particularmente til para llevarla a cabo en
grandes poblaciones de animales. La prueba del anillo de leche (MRT) es una alternativa adecuada cuando
no se dispone de ELISA.
I-ELISA en leche
Como con el I-ELISA para suero, se utilizan numerosas variaciones del I-ELISA para leche. Se han
comercializado varios I-ELISA que se han validado en ensayos de campo y son de uso amplio. A efectos de
una armonizacin internacional, los laboratorios nacionales de referencia deben utilizar los tres Sueros
Estndar de la OIE para ELISA con el fin de comprobar o calibrar el mtodo particular de la prueba en
cuestin. El I-ELISA debe estandarizarse de modo que el estndar positivo fuerte positivo de la OIE para
ELISA diluido a 1/125 en suero negativo y diluido despus a 1/10 en leche negativa se comporte
repetidamente como positivo. Las muestras de leche completa se comprueban generalmente con diluciones
mucho ms bajas que el suero, es decir, de 1/2 a 1/10 en tampn de dilucin, y el resto de la prueba es
similar a lo descrito para suero. La prueba C-ELISA no debe utilizarse con leche completa pero puede
usarse con muestras de suero.
En los animales lactantes, la prueba del anillo de leche o MRT (sigla inglesa para milk ring test) puede
utilizarse para el diagnstico de la brucelosis en rebaos. En poblaciones grandes (>100 terneros lactantes)
la sensibilidad de la prueba tiene menos fiabilidad. La MRT puede ajustarse para compensar el factor de
dilucin de las muestras de leche entera procedente de rebaos grandes. Las muestras se ajustan de
acuerdo con la siguiente frmula: tamao del rebao <150 animales usan 1 ml de leche. 150450 usan una
muestra de leche entera de 2 ml. 451700 usan una muestra de leche de 3 ml.
Pueden presentarse reacciones positivas falsas en animales vacunados 4 meses antes de la prueba, en
muestras de leche anormal (como el calostro) o en casos de mamitis. Por tanto, no se recomienda la
utilizacin de esta prueba en granjas muy pequeas, donde estos problemas presentan un mayor impacto
en los resultados de la prueba.
El procedimiento detallado puede obtenerse del Departamento de Sanidad Animal, Servicio de Investigacin
Agraria/DGA, Apartado 727, 50080 Zaragoza, Espaa.
703
Produccin de antgeno
Procedimiento de la prueba
La prueba se lleva a cabo sobre las muestras del tanque de leche entera. Si es necesario, las muestras se
pueden pretratar con un conservante (formalina al 0,1% o bronopol al 0,02%) durante 23 das a 4C antes
de su utilizacin.
i)
Se debe procurar que las muestras de leche y el antgeno se mantengan a temperatura ambiente
(20 3C). Debe retirarse de la nevera solo el antgeno necesario para las pruebas del da.
ii)
iii)
La prueba se lleva a cabo aadiendo 3050 l de antgeno a 12 ml de leche completa (el volumen de
leche puede aumentarse para muestras de poblaciones grandes. Vase ms arriba la prueba del anillo
de leche).
iv)
La altura de la columna de leche en el tubo debe ser como mnimo de 25 mm. Las muestras de leche
no deben haber sido congeladas, calentadas, sometidas a agitacin violenta o guardadas durante ms
de 72 horas.
v)
Normalmente, las mezclas de leche y antgeno se incuban a 37C durante 1 hora junto con los
estndares de trabajo positivos y negativos. Sin embargo, la incubacin durante la noche a 4C
aumenta la sensibilidad de la prueba y permite una interpretacin ms fcil.
vi)
Una reaccin fuertemente positiva se indica por la formacin de un anillo azul oscuro por encima de la
columna blanca de leche. Cualquier anillo azul en la interfase de leche y de crema debe considerarse
como positivo y podra ser significativo, especialmente en el caso de grandes poblaciones.
vii)
viii) Cuando se ajusta la MRT para aplicarla en rebaos de gran tamao (utilizndose 2 o 3 ml de leche),
se aade 0,1 ml de una mezcla de nata negativa al tubo de ensayo y a continuacin 3050 l del
antgeno de la prueba del anillo. Despus de mezclar, se incuba y se lee de la misma forma que para
la MRT no ajustada. La mezcla de nata negativa se recoge mediante la separacin de la leche entera
y sin pasteurizar procedente de un rebao de 25 o ms vacas que sean negativas a la brucelosis.
704
e)
f)
C1. Brucelina
La brucelina INRA es un extracto libre de LPS de la cepa B115 de B. melitensis en fase rugosa. Esta preparacin
no provoca la formacin de anticuerpos reactivos en la BBAT, la FC o el ELISA.
1.
Control de inculos
a)
b)
c)
Se puede obtener del Institut National de la Recherche Agronomique (INRA), Laboratoire de Pathologie Infectieuse et
Immunologie, 37380 Nouzilly, Francia.
705
2.
Las clulas de la cepa B115 de Brucella melitensis se inactivan despus del cultivo elevando la temperatura a
70C durante 90 minutos, se enfran a 4C, y se recogen por centrifugacin a 9.000 g durante 15 minutos a 4C.
Las clulas se lavan con agua destilada estril y fra y se deshidratan precipitndolas con tres volmenes de
acetona a 20C, y luego se deja reposar a 20C durante 2448 horas. Despus de lavados repetidos con
acetona fra y de un lavado final con dietil ter, las clulas se secan sobre cloruro clcico y se mantienen a 4C.
Las clulas secas se someten a una prueba de viabilidad. Se resuspenden en cloruro sdico estril al 2,5% hasta
una concentracin final del 5% (p/v) y se agitan durante 3 das a 4C. Las clulas bacterianas se eliminan
mediante centrifugacin como se ha descrito con anterioridad y el sobrenadante se concentra a un cuarto de su
volumen mediante ultrafiltracin con una membrana Diaflo PM10 (Amicon) y se precipita aadiendo tres
volmenes de etanol fro. La mezcla se mantiene a 4C durante 24 horas y el precipitado se centrifuga y el
concentrado se redisuelve en agua destilada y se dializa para eliminar el etanol. Despus de centrifugar a
105.000 g durante 6 horas a 4C, el sobrenadante, que es la brucelina sin estandarizar, se determinan mediante
anlisis sus protenas y carbohidratos. Puede liofilizarse en su totalidad o despus de distribuirla en sus envases.
3.
Debe comprobarse la esterilidad del extracto crudo de brucelina despus de su extraccin con acetona para
comprobar la inactivacin de las clulas de Brucella, y una vez ms al final del proceso, a fin de comprobar una
posible contaminacin. Deben determinarse el pH y la concentracin de protena y realizarse pruebas de
identidad en la totalidad del material obtenido antes de proceder al llenado de los envases.
4.
Control de lotes
a)
Esterilidad
La esterilidad de las preparaciones de alrgenos debe comprobarse como se describe en el captulo 1.1.9.
b)
Inocuidad
Las muestras de brucelina en sus recipientes finales deben someterse a la prueba estndar de esterilidad y
tambin deben comprobarse la toxicidad anormal de las preparaciones. Se inyectan intraperitonealmente
dosis equivalentes a 20 dosis de ganado (2 ml) en un par de cobayas normales que no se hayan expuesto
con anterioridad a Brucella o a sus antgenos. Tambin se inyectan subcutneamente cinco ratones
normales con 0, 5 ml de brucelina examinada. Los animales se observan durante 7 das y no debe haber
reaccin local o generalizada a la inyeccin.
La capacidad dermonecrtica se examina mediante la inoculacin intradrmica de 0,1 ml del producto
examinado en el costado previamente afeitado y desinfectado de tres cobayas albinos normales que no se
hayan expuesto con anterioridad a Brucella o a sus antgenos. No debe observarse reaccin cutnea
alguna. La ausencia de sensibilizacin alrgica o serolgica se comprueba mediante la inoculacin
intradrmica de tres cobayas albinos normales, tres veces cada 5 das, con 0,1 ml de una dilucin al 1/10
de la preparacin examinada. Se suministra una inyeccin similar 15 das despus a los mismos tres
animales y a un lote control de tres cobayas del mismo peso que no se hayan inyectado previamente. Los
animales no deben convertirse en seropositivos cuando se examinan 24 horas despus de la ltima
inoculacin por las pruebas estndar de brucelosis (RBT, FC) ni deben desarrollar respuestas de
hipersensibilidad retardada.
c)
Potencia
La potencia de las preparaciones de brucelina se determina mediante la inyeccin intradrmica de dosis
graduales de brucelina en cobayas que se han sensibilizado con inoculacin subcutnea con 0,5 ml de
brucelina de referencia7 con adyuvante completo de Freund de 1 a 6 meses antes. Se determina y mide la
reaccin eritematosa a las 24 horas y se calcula el ttulo por comparacin con una brucelina de referencia8.
Este mtodo solo es vlido para comparar preparaciones de brucelina obtenidas por el mismo protocolo que
7
8
706
Se ha producido por el INRA-PII (F-37380 Nouzilly, Francia) una brucelina de referencia nacional que puede obtenerse
del Laboratorio de Referencia de la OIE para la Brucelosis, AFSSA, 23 avenue du Gnral-de-Gaulle, 94706 MaisonsAlfort Cedex, France.
El procedimiento estadstico puede obtenerse del Laboratorio de Referencia de la OIE para Brucelosis, AFSSA, BP67,
94706 Maisons-Alfort Cedex, France.
d)
Duracin de la sensibilidad
La duracin de la sensibilidad es dudosa. El grado de hipesensibilidad a la brucelina de los animales vara
individualmente de forma considerable. Los animales en la fase inicial de la infeccin, o con infecciones
crnicas, pueden no manifestar hipersensibilidad a la inyeccin intradrmica.
e)
Estabilidad
La preparacin liofilizada mantiene ntegramente su actividad durante varios aos. La preparacin comercial
lquida debe mantener su potencia hasta la caducidad recomendada.
f)
Conservantes
No se recomienda el uso de conservantes en las preparaciones liofilizadas. En la forma lquida, se puede
utilizar mertiolato sdico como conservante (mximo 0,1 mg/ml). Si la preparacin est liofilizada no debe
reconstituirse hasta inmediatamente antes de su uso.
g)
Precauciones (riesgos)
La brucelina no es txica. Sin embargo, puede provocar reacciones graves de hipersensibilidad en
individuos sensibilizados que se exponen accidentalmente a ella. Debe tenerse cuidado en evitar la
inyeccin accidental o la contaminacin de las mucosas. El equipo de inyeccin utilizado y los recipientes
deben descontaminarse cuidadosamente o eliminarse por incineracin en contenedores adecuados de
desecho.
5.
a)
Inocuidad
La prueba de la esterilidad se debe llevar a cabo por el mtodo recomendado. Las pruebas de seguridad in
vivo son las descritas para el control de los lotes (vase la seccin C1.4.b.). Estas pruebas pueden omitirse
en el lote si se realiza la prueba completa en los lotes finales de llenado.
b)
Potencia
Se realiza por inyeccin de una nica dosis en cobayas segn el procedimiento descrito en la seccin
C1.4.c.
C2. Vacunas
Vacuna con la cepa 19 de Brucella abortus
La vacuna ms ampliamente utilizada para prevenir la brucelosis en el ganado vacuno es la vacuna con la cepa
S19 de B. abortus, que contina siendo la vacuna de referencia con la que se compara el resto de las vacunas.
Se utiliza como una vacuna viva que por lo general se suministra a terneras entre 3 y 6 meses como una dosis
nica subcutnea de 58 1010 microorganismos viables. Se puede administrar al ganado adulto una dosis
reducida de 3 108 a 3 109 microorganismos, pero algunos animales desarrollan ttulos duraderos de
anticuerpos y pueden abortar y excretar la cepa vacunal por la leche (84). Alternativamente, se puede administrar
a ganado de cualquier edad en dos dosis de 510 109 microorganismos viables por va conjuntival; esto
produce proteccin sin una respuesta duradera de anticuerpos y reduce los riesgos de aborto y de la excrecin
en la leche.
La vacuna con B. abortus S19 induce una buena inmunidad frente a desafos moderados por microorganismos
virulentos. La vacuna debe prepararse a partir de inculos derivados del USDA (para direccin, ver nota 2 a pie
de pgina) y cada lote ha de probarse para pureza (ausencia de microorganismos extraos), viabilidad (bacterias
vivas por dosis) y homogeneidad (determinacin de la fase de disociacin). La virulencia residual y la
inmunogenicidad de los lotes de inculo para la produccin de vacuna S19 deben comprobarse regularmente en
ratones.
Los procedimientos de control para esta vacuna se indican ms adelante.
707
1.
Control de inculos
a)
708
b)
Mtodo de cultivo
Para producir la vacuna de cepa S19 de B. abortus se cultiva en un medio libre de suero o de otros
productos animales, bajo condiciones similares a las descritas antes para las cepas S99 S1119-3 de
B. abortus (2).
La cepa RB51 de B. abortus sigue mtodos similares de cultivo.
c)
2.
Mtodo de produccin
Para la produccin de la vacuna S19 se pueden utilizar los procedimientos descritos anteriormente, excepto que
las clulas se recogen en PBS, pH 6,3, y se depositan por centrifugacin o aadiendo carboximetil celulosa
sdica a una concentracin final de 1,5 g/litro. El producto obtenido de un fermentador o las clulas agrupadas
de un lote de cultivos en frascos de Roux que se hayan inoculado al mismo tiempo y con el mismo lote de inculo
constituye una cosecha individual. Se puede juntar ms de un lote para formar la masa final que se utiliza para
llenar los recipientes terminales de un lote de vacuna. Antes de mezclarlas, en cada lote individual se ha de
comprueba la pureza, concentracin celular, disociacin e identidad. Deben hacerse las mismas pruebas en el
producto final, que debe tener un nmero de microorganismos viables comprendido entre 8 y 24 109 UFC/ml.
Los ajustes de concentracin se hacen aadiendo PBS a la vacuna presentada en forma lquida o un
estabilizador a la forma liofilizada. Si se emplea un estabilizador debe tenerse en cuenta la prdida de viabilidad
en la liofilizacin, y no debe superar el 50%. El producto final desecado no debe someterse a temperaturas
superiores a 35C durante el secado y el contenido en humedad residual debe ser el 12%. Los envases deben
cerrarse al vaco o en nitrgeno seco inmediatamente despus del secado, y han de mantenerse a 4C.
El proceso de produccin para la cepa BR51 de B. abortus es muy similar al utilizado para la S19.
9
Colorado Serum Company, 4950 York Street, P.O. Box 16428, Denver, Colorado 80216-0428, EE.UU.; o Veterinary
Technologies Corporation, 1872 Pratt Drive, Suite 1100B, Blacksburg, Virginia 24060, EE.UU.
709
3.
La pureza y la fase lisa de la vacuna con B. abortus S19 debe comprobarse durante la preparacin de cada
cosecha individual. Tambin debe comprobarse la concentracin celular, que puede realizarse mediante medidas
de opacidad, pero en los lotes finales de llenado debe realizarse una determinacin de microorganismos viables.
Tambin debe comprobarse su identidad mediante pruebas de aglutinacin con antisuero contra el antgeno A de
Brucella. La concentracin de microorganismos viables en los recipientes finales no debe ser inferior a 50 109
por cada dosis estndar despus de la liofilizacin y al menos el 95% de las clulas deben estar en la fase lisa.
La pureza y le fase rugosa de la vacuna con cepa RB51 de B. abortus debe probarse durante la preparacin de
cada cosecha individual. Tambin debe comprobarse la concentracin celular. En los lotes finales de llenado
debe realizarse una determinacin de microorganismos viables. Su concentracin en los recipientes finales debe
ser de 13,4 1010 UFC por dosis (dosis de 2 ml aplicadas subcutneamente) y el 100% de las clulas deben
estar en fase rugosa. Todas las colonias deben ser negativas en pruebas puntuales con MAb especficos para el
antgeno OPS.
4.
Control de lotes
a)
Esterilidad
Las pruebas para esterilidad y ausencia de contaminacin en los materiales biolgicos se encuentran en el
captulo 1.1.5.
b)
Inocuidad
La vacuna S19 es per se un producto virulento y debe mantenerse con mnima virulencia para que sea
eficaz (vase la seccin C2.4.c.). Sin embargo, no se realiza rutinariamente una prueba de inocuidad. Si se
desea, puede realizarse en ganado cuando se inicia un nuevo proceso de fabricacin o cuando se espera
alguna modificacin de la seguridad de la vacuna. Este control debe realizarse como sigue: la prueba utiliza
12 terneras de 46 meses. Seis de las hembras se inyectan con una o con tres dosis recomendadas. Cada
lote de seis terneras se mantiene por separado y se observan durante 21 das. No deben producirse
lesiones locales o sistmicas significativas. Si para una dosis y una va de administracin dadas la prueba
da buenos resultados para un lote representativo de vacuna, no tiene que repetirse con lotes de inculo o
de vacuna preparados con el mismo inculo original y con el mismo proceso de fabricacin. Tambin debe
realizarse una prueba de seguridad de la vacuna S19 en cobayas. A grupos de 10 animales como mnimo
se inyectan por va intramuscular dosis de vacuna diluida en PBS, pH 7,2, que contengan 5 109
microorganismos viables. Los animales no deben mostrar signos nocivos ni debe haber mortalidad.
Normalmente, no se realizan pruebas de inocuidad con la vacuna de la cepa RB51 de B. abortus. Si se
desea, se pueden inyectar intraperitonealmente ratones Balb/c hembras de 810 semanas con 1 108 UFC
y se cultivan los bazos a las 6 semanas post-inoculacin. Los bazos deben estar libres de la cepa RB51 y
los ratones no deben desarrollar anticuerpos anti-OPS.
c)
Potencia
Vacuna S19
Una vacuna S19 es eficaz si posee las caractersticas de la cepa original S19, es decir, si es satisfactoria
respecto a su identidad, fase lisa, inmunogenicidad y virulencia residual (9). En los lotes debe comprobarse
tambin el nmero de microorganismos viables.
Identidad
La vacuna de cepa S19 reconstituida no debe contener microorganismos exgenos. La B. abortus
presente en la vacuna se identifica por pruebas morfolgicas, serolgicas y bioqumicas adecuadas y
por cultivo: B. abortus S19 tiene las propiedades normales de una cepa de B. abortus biovariedad
1 pero no requiere CO2 para crecer, ni crece en presencia de bencilpenicilina (3 g/ml = 5 UI/ml), azul
de tionina (2 g/ml) o i-eritritol (1 mg/ml) (concentraciones finales).
710
Virulencia residual (tiempo de persistencia al 50% o tiempo de recuperacin al 50%) (9, 24, 37, 75)
i)
Preparar suspensiones adecuadas del lote de siembra o de vacuna de cepa S19 de B. abortus que se
vaya a probar (vacuna problema) y del cultivo original de inculo de S19 (como cepa de referencia).
Para esto, se recoge un cultivo de 2448 horas de cada cepa en solucin salina estril tamponada
(BSS: NaCl 8,5 g; KH2PO4 1,0 g; K2HPO4 2,0 g; agua destilada 1000 ml; pH 6,8) y se ajusta la
suspensin con BSS a 109 UFC/ml con un espectrofotmetro (OD = 0,170 cuando se lee a 600 nm). El
nmero exacto de UFC/ml se determina despus mediante la siembra en placa de las diluciones
decimales sobre un medio adecuado (se recomienda agar sangre o TSA).
ii)
iii)
A las 3, 6, 9 y 12 semanas, sacrificar los ratones por dislocacin cervical, en grupos de ocho elegidos
al azar.
iv)
v)
Extender en cada caso toda la suspensin completa de bazo sobre varias placas con un medio
apropiado de cultivo e incubar en condiciones estndar para Brucella durante 57 das (lmite inferior
de deteccin: 1 bacteria por bazo). Un animal se considera infectado cuando se asla al menos 1 UFC
del bazo.
vi)
Calcular el tiempo de persistencia al 50% o el tiempo de recuperacin al 50% (RT50) por el mtodo
estadstico SAS, desarrollado especficamente para calcular RT50 (para obtener el SAS especfico,
ver la direccin en la nota 5 a pie de pgina). Para esto se determina el nmero de ratones curados
(sin colonias aisladas en el bazo) a cada punto temporal de sacrificio (ocho ratones por punto) y se
calcula el porcentaje acumulado de ratones curados con el tiempo por el mtodo de Reed y Muench
(descrito en la ref. 7). La funcin de distribucin de este porcentaje describe una curva sigmoidal que
debe linearizarse para calcular los valores RT50, mediante el procedimiento computarizado PROBIT en
el sistema estadstico SAS.
vii)
Comparar estadsticamente el paralelismo (corte y pendiente) existente entre las lneas de distribucin
obtenidas para la cepa problema y para la cepa S19 de referencia, utilizando el SAS diseado para
este propsito. Se pueden comparar estadsticamente dos valores RT50 solo cuando derivan de
lneas de distribucin paralelas. Si no existe paralelismo, la virulencia residual de la cepa problema se
considera inadecuada y se rechaza.
viii) Si se confirma el paralelismo, comparar estadsticamente los valores RT50 obtenidos para la cepa
problema y de referencia utilizando el SAS diseado para este propsito. Para ser aceptable para la
produccin de vacunas, el RT50 obtenido con la cepa problema no debe diferir significativamente del
711
Esta prueba utiliza tres grupos de seis ratones CD1 hembras, de 57 semanas, que se eligen al azar.
i)
ii)
Inyectar subcutneamente una suspensin de la vacuna examinada (vacuna problema) que contenga
105 UFC (en un volumen de 0,1 ml/ratn) a cada uno de los seis ratones del primer grupo.
iii)
Inyectar subcutneamente una suspensin de la vacuna de referencia S19 que contenga 105 UFC de
bacterias vivas en cada uno de los seis ratones del segundo grupo. El tercer grupo sirve como grupo
control sin vacunar y se inocula subcutneamente con 0,1 ml de BSS.
iv)
El nmero exacto de UFC inoculado se comprueba despus por siembra en placa de diluciones
decimales sobre un medio adecuado (se recomienda agar sangre o TSA).
v)
vi)
vii)
Cada bazo se corta aspticamente, se elimina la grasa, y se pesa y homogeniza. Alternativamente, los
bazos pueden congelarse y mantenerse a 20C de 24 horas a 7 semanas.
viii) Cada bazo se homogeniza aspticamente con un desintegrador de vidrio (o con un Stomacher en
sacos estriles adecuados) en nueve veces su peso con BSS, pH 6,8, y de cada homogenizado se
hacen tres diluciones decimales seriadas (1/10, 1/100 y 1/1.000) en el mismo diluyente. Por
cuadruplicado, se extienden 0,2 ml en placas con medio slido y se incuban dos placas a 37C
durante 5 das en atmsfera con un 10% de CO2 (permite el crecimiento de la cepa vacunal y la
desafo) y otras dos placas en atmsfera normal (se inhibe el crecimiento de la cepa de desafo
B. abortus 544 que es dependiente de CO2).
ix)
Se cuentan las colonias de Brucella en las placas que contengan menos de 300 UFC. Cuando no se
cuentan colonias en la placa de la dilucin 1/10, se considera que el bazo est infectado con cinco
bacterias. Este nmero de Brucella por bazo se anota como X y se expresa como Y, despus de hacer
la siguiente transformacin: Y = log (X/log X). Se calcula la respuesta de cada grupo de seis ratones
como media y desviacin estndar.
x)
Las condiciones del experimento son adecuadas cuando: i) la respuesta de los ratones no vacunados
(media de Y) es por lo menos 4,5; ii) la respuesta de los ratones vacunados con la vacuna S19 de
referencia es menor de 2,5; y iii) la desviacin estndar calculada en cada lote de seis ratones es
inferior a 0,8.
xi)
Si esta prueba se realiza con buenos resultados en un lote representativo de vacuna problema, no tiene que
repetirse rutinariamente con otros lotes de vacuna preparados del mismo lote de inculo y utilizando el
mismo proceso de produccin.
712
Vacuna RB51
Como la dosificacin (UFC) del inculo primario se correlacion con la proteccin como parte de la
autorizacin de la RB51 para el ganado vacuno en EE.UU., las pruebas de potencia in vivo no se aplican de
forma rutinaria para las series de vacunas con RB51. En EE.UU. se han aprobado y utilizado los recuentos
de placas de microorganismos viables para medir la potencia (este enfoque es idntico al utilizado en las
pruebas de potencia para la vacuna con S19 en EE.UU).
Se ha propuesto una prueba con ratones Balb/c hembras utilizando 1 104 microorganismos de la cepa
2308 de B. abortus como cepa de desafo, pero la correlacin de la prueba con la proteccin de la vacuna
en el ganado vacuno no est completamente determinada. En EE.UU. se ha aprobado y utilizado la
determinacin en placa de microorganismos viables (85). Se ha discutido con bastante detalle sobre las
vacunas rugosas para la brucelosis (55).
d)
Duracin de la inmunidad
Se considera que la vacunacin de los terneros con una dosis completa de vacuna S19 confiere inmunidad
duradera, y no se recomiendan dosis posteriores. Sin embargo no existe evidencia probada de esto y en
reas endmicas puede ser aconsejable la revacunacin.
e)
Estabilidad
La vacuna S19 de B. abortus preparada a partir de inculos de orgenes apropiados muestra unas
caractersticas estables siempre que se cumplan los requisitos descritos anteriormente sobre el control del
proceso y de los lotes, y no tiene tendencia a revertir a la virulenta. La vacuna liofilizada muestra una
prdida gradual de microorganismos viables pero debe conservar su potencia hasta el el final del perodo
de caducidad recomendado. En funcin de este fenmeno se establece un cierto margen de seguridad, de
tal forma que el nmero de viables antes de la liofilizacin sea superior al mnimo exigido. El mantenimiento
de la cadena de fro durante la distribucin de la vacuna asegura su viabilidad.
La cepa RB51 de B. abortus no muestra tendencia a revertir a la fase lisa de Brucella virulenta despus de
muchos pases in vivo o in vitro. Esto se debe probablemente a la naturaleza y localizacin de las
mutaciones en esta cepa. La cepa RB51 de B. abortus tiene una disrupcin en el gen wboA debida a un
elemento IS711 que impide la sntesis de OPS. Datos no publicados indican que tambin contiene una
segunda mutacin que afecta al transporte de OPS a la superficie externa bacteriana o al acoplamiento de
OPS con el ncleo del LPS, o a ambos procesos.
f)
Conservantes
En las vacunas vivas S19 o con la cepa RB51 de B. abortus no deben utilizarse conservantes
antimicrobianos. Para la preparacin de la vacuna liofilizada se recomienda un estabilizador que contenga
2,5% de hidrolizado de casena, por ejemplo Triptona (Oxoid), un 5% de sacarosa y un 1% de glutamato
sdico, disuelto en agua y esterilizado por filtracin.
g)
Precauciones (riesgos)
Aunque son cepas atenuadas, B. abortus S19 y RB51 son an capaces de causar enfermedad en el
hombre. los cultivos celulares y las suspensiones deben manejarse bajo condiciones apropiadas de
contencin para bioseguridad. La reconstitucin y el posterior manejo de las vacunas deben hacerse con
cuidado para evitar una inyeccin accidental o la contaminacin de los ojos o la piel. Los residuos de
vacuna y el equipo de inoculacin deben descontaminarse con un desinfectante adecuado (de tipo fenlico,
iodforo o aldehdo) a la concentracin adecuada. En caso de exposicin accidental debe requerirse
atencin mdica. No se ha establecido adecuadamente la eficacia del tratamiento antibitico de las
infecciones causadas por las cepas S19 y RB51 en el hombre; sin embargo, el CDC suministra
recomendaciones para el tratamiento. Si se produce contaminacin por la cepa S19, se recomienda un
tratamiento combinado con doxiciclina y rifampicina. En caso de contaminacin con la RB51 (que es
resistente a rifampicina) debe evitarse el tratamiento con rifampicina y debe utilizarse un rgimen de
doxiciclina y estreptomicina o gentamicina, excepto en las mujeres embarazadas, que deben tratarse con
trimetoprim sulfametoxazol. Sin embargo, existen estudios parciales sobre el tratamiento de los humanos
expuestos a la RB51 (5) y ha habido al menos un informe de infeccin en humanos con RB-51. La cepa
RB51 es muy susceptible a la tetraciclina y el tratamiento solo con doxiciclina puede ser satisfactorio (5).
5.
a)
Inocuidad
Vase la seccin C2.4.b.
713
b)
Potencia
Para la vacuna liofilizada, la potencia debe determinarse en el producto final. El procedimiento es como el
descrito en la seccin C2.4.c.
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