CUANTIFICACIN DE SAPONINAS EN AJO GENETICAMENTE

SELECCIONADO
L. Daz-Jimnez*a, E. Ibarra-Arellanob, K. Jimnez-Lpezb
a

Tecnologa Qumca, CINVESTAV-Saltillo, km. 13.5 carretera Saltillo-Monterrey, Ramos

Arizpe, 25900, Coah., Mxico lourdes.diaz@cinvestav.edu.mx
b
Departamento de Qumica, CUCEI-Universidad de Guadalajara, Marcelino Barragn,
Guadalajara,
44420,
Jal.,
Mxico
eduardoibarraarellano@yahoo.com.mx,
tristania999@hotmail.com
RESUMEN:
El trabajo consisti en la determinacin cuantitativa de saponinas en una muestra de ajo genticamente
seleccionado a fin de verificar que la seleccin aument la produccin de saponinas en el vegetal. La
cuantificacin se realiz usando dos mtodos: el primero indirecto, a partir de la determinacin de los
azcares ligados a la aglicona en las saponinas; y el segundo directo empleando la tcnica de cromatografa de
lquidos de alta resolucin. Para el mtodo directo fue necesaria la purificacin previa de las saponinas
presentes en los extractos de ajo y la validacin del mtodo de cuantificacin. La purificacin se realiz por
cromatografa de lquidos de alta resolucin (CLAR) semipreparativo.

1. INTRODUCCIN:
Las saponinas son derivados terpnicos y esteroidales de origen natural que estn presentes en los tubrculos
de varias especies de Dioscrea. Las saponinas esteriodales son ampliamente usadas en la sntesis de
hormonas (progesterona y cortisona) y otros productos esteroidales [1,2]. La estructura de las saponinas est
constituida por una aglicona y una o varias cadenas de azcares.
La cuantificacin de saponinas se ha determinado mediante mtodos indirectos tales como la prueba de la
espuma [3], su capacidad hemoltica [4] o la tcnica conocida como ndice de pescado [2], sin embargo estos
mtodos no son muy confiables puesto que pueden dar un falso positivo [5, 6]. El mtodo directo de
cuantificacin se puede realizar por CLAR o por espectrometra, sin embargo, se tiene el problema de no
contar siempre con el estndar requerido para su cuantificacin, de manera que se debe proceder a la laboriosa
actividad de su purificacin.
El ajo es una planta de amplio cultivo en el mundo que entre sus componentes contiene saponinas. Si bien las
saponinas no son el principal constituyente de los ajos, por seleccin genrica se puede conseguir un aumento
en su biosntesis [7].
La mejora vegetal por la seleccin natural es un proceso gentico que la naturaleza realiza a lo largo de
numerosas generaciones, en la que los seres vivos luchan por su propia existencia lo que da lugar a la
supervivencia de los ms aptos, estas caractersticas son transmitidas a los descendientes, que obtienen
mejores cualidades genticas para enfrentarse a la vida en condiciones mas favorables [7]. El hombre ha
conseguido acelerar el proceso de mejora y seleccin natural mediante seleccin artificial en esta se eligen
aquellos individuos progenitores cuyo fenotipo es ms favorable.
En el presente trabajo se determin la influencia de la seleccin gentica en la biosntesis de saponinas en
muestras de ajo.

2. METODOLOGA:
Las muestras fueron proporcionadas por la empresa Nutrilite S. de R.L. de C.V. (Jalisco, Mxico). Estas se
conservaron en ultracongelacin a 80 C. Con fines comparativos, una porcin de la muestra se sec a 55 C
y otra se liofiliz hasta sequedad.
EXTRACCIN: Se sigui una serie de diseos experimentales multifactoriales usando mezclas de
Agua/Etanol y Agua/Metanol en seis proporciones (100/0, 95/5, 75/25, 50/50, 35/65, 25/75). Para la
extraccin una cantidad determinada de muestra se coloc en un matraz Erlenmeyer, adicionando el solvente
o mezcla de solventes. La mezcla se homogeneiz durante 40 seg. Posteriormente se dej en reposo a
temperatura ambiente.

ENSAYO DE LA ESPUMA: Se tom una alcuota de cada extracto y se coloc en un tubo de ensayo
graduado. El tubo se agit vigorosamente y se dej en reposo durante 1 hr. Posteriormente se midi el nivel de
la espuma formada.
PRUEBA DE HEMLISIS: De cada extracto se inocul una alcuota en caja petri con agar-sangre como
medio de cultivo. La caja inoculada se dej en incubacin a 37 C por 24 horas. La prueba da como resultado
un halo de hemlisis en el medio.
METODO INDIRECTO: El mtodo consiste hidrolizar la saponina para separa las molculas de azcar de la
sapogenina, cuantificando posteriormente los carbohidratos presentes en el extracto por espectrofotometra.
PURIFICACIN: Se realiz una purificacin previa del extracto mediante cromatografa en columna abierta
usando Sephadex LH-20, la fraccin as pre-purificada, se pas por CLAR semipreparativo para su
purificacin final. La purificacin se realiz en un equipo Agilent Technologies 1100 semipreparativo,
Columna semipreparativa CROM C18 (25040 mm, 12 m), Flujo 8 mL/min, Fase mvil cido fosfrico
0.0025N/Acetronitrilo (80/20 v/v).
CUANTIFICACIN: Una vez purificada la saponina mayoritaria de extracto, se usa sta como patrn para
realizar la cuantificacin por CLAR. Condiciones: Fase mvil cido fosfrico 0.0025N/Acetronitrilo (80/20
v/v), Columna BDS Hypersil C8 (2504.6 mm, 5 m), Flujo 0.2 mL/min.

3. RESULTADOS:
PRUEBAS PRELIMINARES: La primera parte de la experimentacin fue de gran importancia puesto que
ayud a determinar el solvente ms adecuado para la extraccin de saponinas a partir de ajo. De igual manera,
permiti determinar la influencia del tiempo de extraccin y del estado de la muestra en la extraccin de
saponinas.
En esta primera parte se siguieron dos diseos experimentales multifactoriales donde la variable de respuesta
fue la concentracin de saponinas medida en base a la espuma formada por los extractos.
Como se puede observar en la Figura 1, cuando se us una mezcla Agua/Metanol en la proporcin 95/5, la
espuma que se form inmediatamente despus de la agitacin alcanz una altura de 6 mm al tiempo cero,
mantenindose constante hasta despus de una hora. Conforme aumenta la concentracin de metanol en la
composicin de la mezcla de solventes, la extraccin de saponinas se hace menos eficiente.
10
8

Altura
(mm)

25/75
35/65
50/50
75/25
95/5
100/0

6
4
2
0
0
15
Tiempo (min)

30

45

60

Figura 1.- Influencia de la relacin Agua/Metanol en la extraccin de saponinas en ajo fresco.

De los datos obtenidos de esta primera prueba se puede apreciar que la formacin de espuma es mayor cuando
la proporcin de la mezcla contiene mas agua que solvente orgnico. Esto est en concordancia con Gafner
[8] el cul hizo un estudio de evaluacin de tres solventes de extraccin de saponinas en races de Panax
quinquefolius, donde se encontr que la mayor cantidad de saponinas extradas se obtuvo con el solvente ms
polar.
A fin de determinar si el rendimiento de saponinas extradas se ve influenciado por el estado de la materia
prima, se realizaron ensayos en los que previamente a la extraccin, se someti a la muestra a deshidratacin
por calor y por liofilizacin. Los resultados mostraron, que de alguna manera, el proceso de liofilizacin
afecta en cierta medida la extraccin de saponinas, puesto que los extractos no presentaron formacin de
espuma. En el caso de los extractos realizados con ajo deshidratado, s se pudo observar formacin de espuma
durante la extraccin, sin embargo esta espuma fue de consistencia muy frgil que desapareci rpidamente.
Los resultados fueron sometidos a anlisis de varianza, observndose que estadsticamente, el factor Tiempo
de reposo, es no-significativo en la cantidad de saponinas extradas, mientas que el Estado de Ajo y la
composicin del solvente de extraccin es significativo.

Se realizaron ensayos similares usando una mezcla Agua/Etanol en las mismas proporciones. Los resultados
fueron similares.
Sin embargo, el ensayo de la espuma, es una prueba presuntiva y no definitiva de la presencia de saponinas en
un extracto vegetal. De manera que los resultados hasta presentados no deben tomarse como concluyentes.
Por tanto se consider necesario realizar a la par otra prueba para confirmar los datos obtenidos hasta este
punto.
ENSAYO DE LA HEMLISIS: El ensayo se desarroll aplicando tambin un diseo multifactorial donde la
variable de respuesta fue el tamao de halo de hemlisis provocado por cada extracto. La prueba se realiz
por quintuplicado y paralelamente a cada ensayo de la espuma obteniendo los siguientes resultados.
Cuando el tiempo de extraccin fue de 5 minutos, usando agua (100 por ciento) como solvente, se observ la
formacin un halo de hemlisis de 1.6 cm, en promedio, de dimetro y al utilizar la mezcla de Agua/Etanol
(50/50) se obtuvo un halo de 1.3 cm.
Cuando el tiempo de extraccin fue de 60 minutos, al usar Agua como solvente, el tamao promedio del halo
de hemlisis alcanz 1.6 cm, mientras que al usar la mezcla Agua/Etanol (50/50) el tamao del halo fue de 1.8
cm.
Estos resultados, confirmaron, por un lado, que el tiempo de extraccin no influye en la cantidad de saponinas
extradas, y adems, que no hay diferencias importantes al usar Agua o la mezcla Agua/Etanol como solvente,
a pesar de que el ensayo de la espuma no haba podido dar evidencia de la presencia de saponinas debido a la
inestabilidad de la espuma formada en el extracto cuando se us la mezcla etanlica.
CUANTIFICACIN INDIRECTA DE SAPONINAS: Una vez confirmada la presencia de saponinas en los
extractos acuoso y etanlico, se plante la cuantificacin de tales compuestos a fin de determinar si la
seleccin gentica influy en la concentracin de tales metabolitos en la planta. Adems de determinar la
eficiencia de extraccin entre el Agua como solvente y la mezcla etanlica.
La cuantificacin se llev a cabo mediante dos mtodos. Primero se emple un mtodo indirecto el cual
consiste en hacer una hidrlisis cida de la muestra, liberando los azcares de la molcula de la saponina y
cuantificando stos por el mtodo de Miller [9].
Para realizar la cuantificacin por el mtodo indirecto, como primer paso, fue necesario preparar una serie de
soluciones de concentracin conocida de glucosa, a estas soluciones se les dio el tratamiento del mtodo de
Miller y finalmente se les midi la absorbancia a una longitud de onda de 550 nm. Con los valores de
absorbancia obtenidos y las concentraciones conocidas se construy una curva de calibracin con un
coeficiente de correlacin lineal de 0.99. Por otra parte, se prepar una curva de calibracin de los azcares
liberados de quillaja a partir de la hidrlisis cida.
Con las dos curvas anteriores se construy un nuevo conjunto de datos, que relaciona la concentracin de
saponinas en una muestra de quillaja con la concentracin de glucosa. Para la obtencin de esta relacin se
usaron los siguientes datos de la curva de calibracin de glucosa [10].
Por tanto, a partir de los datos de la curva anterior, se calcul la concentracin de saponinas totales en los
extractos acuoso y etanlico de ajo fresco y deshidratado.
De esa manera, fue posible calcular la concentracin de saponinas totales (en base a la saponina triterpenoide
quillaja) en la serie de extractos ensayados previamente por la prueba de hemlisis (Tabla 1).

Tabla 1. Concentracin obtenida de saponinas a partir del mtodo indirecto.

Muestra
Extracto
Conc. total saponinas
base quillaja (%)
Agua 5 min
0.3
Ajo fresco
Agua 60 min
0.3
Agua/Etanol 5 min
0.4
Agua/Etanol 60 min
0.5
Agua 5 min
1.5
Ajo
Agua 60 min
1.6
deshidratado Agua/Etanol 5 min
1.2
Agua/Etanol 60 min
1.2

Como puede observarse en los datos de la Tabla 1, la concentracin de saponinas totales en ajo fresco tanto en
los extractos con Agua como con los extractos obtenidos con la mezcla Agua/Etanol oscila entre 0.3 y 0.5 %,
mientras que para ajo deshidratado, la concentracin total de saponinas fue tres veces mayor, lo cual era de
esperar ya que en el ajo fresco existe un alto porcentaje de agua.
PURIFICACIN DE SAPONINAS: Una vez determinada la concentracin de saponinas por el mtodo
indirecto, se plante su cuantificacin por un mtodo directo para lo cual fue necesario purificar la saponina
mayoritaria para usarla como patrn. La Figura 2, representa el cromatograma obtenido para la saponina
purificada. Como puede verse, la purificacin se llev a cabo con puesto que slo se observ una seal
correspondiente a la fraccin pura a diferencia del cromatograma que se observ para el extracto bruto.

Figura 2. Cromatograma de la fraccin purificada del extracto de ajo.

CUANTIFICACIN DE SAPONINAS POR CLAR: Con la saponina purificada se prepar una curva de
calibracin para la cuantificacin de saponinas en los extractos obtenidos a partir de ajo fresco con agua y la
mezcla Agua/Etanol (50/50). La comparacin entre la concentracin de saponinas encontrada por el mtodo
directo y la obtenida por el mtodo indirecto presenta una ligera divergencia (Tabla 2), obtenindose una
mayor concentracin de saponinas con el mtodo directo que con el mtodo indirecto. Este efecto puede
explicarse en base a que en la cuantificacin por el mtodo indirecto se utiliz como referencia una saponina
de diferente naturaleza (triterpenoide), mientras que en la cuantificacin directa, la saponina de referencia fue
purificada a partir del extracto. En este sentido, tambin hay evidencias de que el proceso de hidrlisis para la
liberacin de las molculas de azcar a partir de la saponina no se lleva a cabo de manera completa [11], lo
que se traduce en una menor concentracin de azcares y por ende en una menor concentracin de saponinas.
Tabla 2. Comparacin de la concentracin de saponinas totales por los mtodos directo e indirecto.
Extracto
Mtodo
Desviacin
estndar
Directo
Indirecto
Acuoso de ajo fresco
(Agua 100%)
0.52 %
0.3 %
0.15%
Etanlico de ajo fresco (Agua/Etanol, 50/50)
0.69 %
0.4 %
0.20%
Por otra parte, se ha encontrado reportado en bibliografa que la concentracin total de saponinas en ajo
varan del 0.04 al 0.11 % [12]. Como se puede observar en la Tabla 2, los datos obtenidos en la cuantificacin
de saponinas en la muestra de ajo, objeto de estudio de este trabajo de tesis, la concentracin de saponinas
vara del 0.5 al 0.7%. Este resultado conduce a la conclusin de que en este caso, el proceso de seleccin
gentica a que fue sometido el ajo analizado, result en un aumento de la cantidad de saponinas presentes en
la planta.

4. CONCLUSIONES:

El solvente es un factor determinante en la extraccin de saponinas, siendo para el caso de ajo, el

mejor solvente el agua.
Es indiferente trabajar con ajo fresco o deshidratado ya que la diferencia de la concentracin de
saponinas en los extractos obtenidos no es estadsticamente significativa.
Tomando como base los datos reportados en bibliografa, donde se han encontrado concentraciones
saponinas en ajo entre 0.04 y 0.11 %, se concluye que la seleccin gentica de las muestras usadas en

el presente trabajo, influy positivamente en la biosntesis de estos metabolitos, ya que se

encontraron concentraciones que van del 0.50 al 0.70 %.

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