RESUMEN

El diagnstico de muchas enfermedades hereditarias

necesita una confirmacin a nivel molecular del defecto
gentico que presenta el paciente. Una vez detectada la muta-
cin y confirmado el diagnstico clnico, podemos deter-
minar cul es el efecto de dicha mutacin en la protena codi-
ficada (cambio de conformacin, alteracin o prdida de
funcin, localizacin errnea, disminucin en su expresin,
etc.), y as poder abrir puertas a nuevas terapias dirigidas
al defecto especfico. En esta revisin, primero considera-
remos algunos conceptos bsicos de gentica molecular,
incluyendo estructura y expresin del gen, intrones y exo-
nes, cdigos genticos, transcripcin, traduccin, procesa-
miento del RNAy mutaciones y sus tipos. Tambin expli-
caremos algunos mtodos para extraer DNAy RNAde san-
gre u otros tejidos del paciente. Acontinuacin discutire-
mos los mtodos que se emplean para detectar mutacio-
nes en genes asociados a enfermedades hereditarias. El prin-
cipio en el que se basa un ensayo de deteccin de mutacio-
nes es que la secuencia de nucletidos del gen de un indi-
viduo afecto ser distinta de la secuencia de un individuo
con fenotipo normal. Adems, describiremos dos mtodos
para analizar el efecto de algunas mutaciones en la madu-
racin del pre-mRNA(RT-PCR a partir de RNAde sangre
y anlisis de minigenes). Por ltimo, mencionaremos algu-
nos mtodos informticos que sirven para determinar si las
mutaciones detectadas son patolgicas o no, y para prede-
cir el efecto de mutaciones en la maduracin del pre-mRNA.
Palabras clave: Enfermedades hereditarias; mutacin;
diagnstico molecular; genes; mRNA; amplificacin por
PCR; transcripcin inversa; minigenes.
ABSTRACT
The diagnoses of many hereditary diseases must be con-
firmed on a molecular level of a genetic defect that the
patient has. Once the mutation is detected and the clinical
diagnoses confirmed, we can determine which is the effect
of said mutation in the coded protein (changing shape, alter-
ation or loss of function, erroneous location, decrease of
its expression, etc.) and just be able to open the doors to new
therapies aimed at the specific defect. In this article, we first
consider some basic concepts of molecular genetics, includ-
ing the gene structure and expression, introns and exons,
genetic codes, transcription, translation, RNAprocessing,
and mutations and its types. We will also give some expla-
nations of methods to extract DNAand RNAfrom the blood
and other tissues of the patient. After that, we will discuss
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BOL PEDIATR 2008; 48: 235-241
Revisin
Tcnicas para el diagnstico molecular de enfermedades
hereditarias
F. CLAVERIE MARTN, E. RAMOS TRUJILLO, F.J. GONZLEZ PAREDES
Unidad de Investigacin. Hospital Universitario Nuestra Seora de Candelaria. Santa Cruz de Tenerife.
Correspondencia: Flix Claverie Martn. Unidad de Investigacin. Hospital Universitario Nuestra Seora de Candelaria.
Carretera del Rosario, 145. 38010 Santa Cruz de Tenerife
Correo electrnico: fclamar@gobiernodecanarias.org
2008 Sociedad de Pediatra de Asturias, Cantabria, Castilla y Len
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siempre que se cite el trabajo original.
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the methods used to detect mutations in genes associated
to hereditary diseases. The principal on which a mutation
detection trial is based is that this sequence of gene
nucleotides of an individual affected will be different from
the sequence of an individual with normal phenotype. In
addition, we will describe two methods to analyze the effect
of some mutations in the maturation of pre-mRNA(RT-PCR
from RNAof the blood and analysis of minigenes). Final-
ly, we will mention some computer methods that serve to
determine if the mutations detected are pathological or not
and to predict the effect of the mutations in the matura-
tion of the pre-mRNA.
Key words: Hereditary diseases; mutation; molecular
diagnosis; genes; mRNA; PCR amplification; inverse tran-
scription; minigenes.
Palabras clave: Enfermedades hereditarias; mutacin;
diagnstico molecular; genes; mRNA; amplificacin por
PCR; transcripcin inversa; minigenes.
CONCEPTOS BSICOS
Los genes eucariotas estn formados por regiones codi-
ficantes o exones que son ledas por la maquinaria celu-
lar para la sntesis proteica y regiones no codificantes o intro-
nes. Durante la expresin gnica, lo primero que ocurre en
el ncleo celular es el proceso de transcripcin, por el cual
se realiza una copia de RNAdel gen de inters de forma
ntegra. Esta copia, que incluye los exones e intrones del gen,
se conoce como RNA inmaduro o pre-RNA mensajero.
Seguidamente, el RNAinmaduro sufre un procesamiento
especfico, llevado a cabo por un complejo enzimtico lla-
mado espliceosoma, que consiste en una serie de reacciones
de corte y empalme (splicing o maduracin del pre-mRNA)
por medio de las cuales los intrones son eliminados, gene-
rando una molcula madura que incluye nicamente los
exones (RNAmensajero maduro, mRNA). Este mRNAcon-
tiene la informacin que codifica a la protena.
Las uniones entre exones e intrones estn definidas por
secuencias conservadas denominadas sitios de splicing, (sitio
aceptor o 5, donador o 3, tracto de pirimidinas y branch
site). Sin embargo, estos sitios por s solos no son suficien-
te para definir correctamente la secuencia exnica, por lo
que dentro de los exones e intrones existen secuencias menos
conservadas que son reconocidas por protenas regulado-
ras del splicing. Estas protenas reguladoras pueden poten-
ciar o inhibir el reconocimiento de un exn y su incorpo-
racin en el mRNAmaduro. Por tanto, el mRNAcontiene
un segundo cdigo gentico que especifica cmo se proce-
san los mensajes.
Tras el proceso de maduracin, el mRNAsale por los
poros nucleares al citoplasma donde es utilizado por los ribo-
somas como molde para su traduccin en protena. El cdi-
go gentico en el mRNAse lee en grupos de tres nucletidos
o tripletes, y cada grupo representa un aminocido. Cada
secuencia de tres nucletidos se denomina codn. La lectu-
ra comienza en un codn de inicio (AUG), el cual marca la
pauta de lectura, contina con los siguientes trinucletidos
y termina en un codn de parada (UGA, UAAo UAG).
La correcta expresin de un gen puede verse afectada por
modificaciones locales (mutaciones o polimorfismos) en la
secuencia de DNAdel mismo. Podemos diferenciar distintos
tipos de mutaciones, segn sus efectos sobre los diferentes
pasos que conforman la expresin gnica. Cuando el cambio
ocurre en la regin codificante del gen, podemos hablar, de
forma general, de tres tipos de mutaciones: silentes, de cam-
bio de sentido y sin sentido. Se denominan mutaciones silen-
tes a aquellas donde, a pesar de que ocurra un cambio de un
nucletido por otro, el cambio no supone una alteracin en
el mensaje codificado por el RNAmensajero, de forma que
la secuencia final de la protena no se ve alterada. Por otro
lado, cuando ese cambio nucleotdico s afecta al mensaje
codificado por la molcula de RNAhaciendo que se susti-
tuya un aminocido por otro en la cadena polipeptdica, esta-
mos ante una mutacin de cambio de sentido. Este tipo de
mutaciones puede afectar gravemente a la conformacin de
la protena resultante y, por consiguiente, a su actividad o
funcin. Las mutaciones sin sentido son aquellas en las que
el cambio introducido hace que en el mRNAaparezca una
seal de parada prematura de la sntesis proteica, generan-
do de este modo una protena truncada, ms corta que la nor-
mal y carente de regiones que pudiesen ser importantes para
su funcin o localizacin. Por otra parte, existe un mecanis-
mo celular por el cual los mRNAque contienen un codn de
parada prematuro son degradados rpidamente y, por tanto,
no son utilizados para la sntesis de protena.
Existen otro tipo de mutaciones que pueden afectar de
forma ms severa a un gen, y en las que el cambio no es pun-
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tual sino que implica a regiones mayores del mismo. Es el
caso de las deleciones (donde una regin del gen se elimi-
na completamente), inserciones (donde ocurre la incorpo-
racin de fragmentos de DNA dentro del mismo gen) y
duplicaciones (cuando una regin del gen se incluye varias
veces seguidas en la regin del mismo, afectando a su estruc-
tura normal).
Finalmente, hay otro tipo de mutaciones cuyo efecto se
traduce en un incorrecto procesamiento del RNAmensaje-
ro, de forma que la reaccin de splicing no sucede tal cual
debera, pudiendo tener efectos drsticos en la protena resul-
tante. Estas mutaciones pueden conllevar la prdida com-
pleta de secuencias exnicas en el RNA mensajero o, de
forma ms drstica, pueden eliminar indirectamente uno o
ms exones de la molcula resultante. Asimismo, existen
mutaciones de splicing que generan la inclusin de regiones
intrnicas (no codificantes) en la molcula de RNAmen-
sajero. Este tipo de mutaciones suelen traducirse en una pr-
dida de la pauta de lectura en el RNAmensajero y a la apa-
ricin y deteccin, por parte de los ribosomas, de secuen-
cias de parada de la sntesis proteica prematuras. Normal-
mente, estas mutaciones se localizan en los nucletidos de
unin de intrones y exones en el DNA, o bien en regiones
importantes para el reconocimiento de los intrones y exo-
nes, en lugares de unin de las protenas encargadas del pro-
cesamiento de RNAinmaduro (amplificadores o inhibido-
res del splicing).
Generalmente se asume que las mutaciones puntuales
causantes de enfermedad dan lugar al cambio de un ami-
nocido por otro en la protena codificada por el gen, o a un
codn de parada prematuro. Sin embargo, debemos tener
en cuenta que algunas mutaciones puntuales tienen su efec-
to en el paso anterior alterando el splicing del pre-mRNA,
bien sea inactivando o creando un sitio de splicing, activan-
do un sitio de splicing crptico o alterando un elemento regu-
lador de splicing (un amplificador o un inhibidor). En este
caso, el efecto de la mutacin podra ser la prdida completa
de un exn, producindose un cambio mucho ms drstico
en la estructura de la protena que el que cabra esperar como
resultado del cambio de un aminocido por otro.
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F. CLAVERIE MARTN Y COLS.
TABLA I. EJEMPLOS DE ALGUNAS ENFERMEDADES CAUSADAS POR DEFECTOS GENTICOS QUE SE IDENTIFICAN MEDIANTE ANLISIS MOLECULAR
Enfermedad Gen o genes Cromosoma Herencia OMIM*
Sndrome de Marfan FBN1 15q21.1 Autosmica dominante 154700
Neurofibromatosis tipo 1 NF1 17q11.2 Autosmica dominante 162200
Sndrome de X frgil FMR1 Xq27.3 Ligada al X 300624
Fibrosis qustica CFTR 7q31.2 Autosmica recesiva 219700
Distrofia muscular de Duchenne DMD Xp21.2 Ligada al X 310200
Cistinosis CTNS 17p13 Autosmica recesiva 219900
Enfermedad de Fabry GLA Xq22 Ligada al X 301500
Poliquistosis renal autosmica dominante PKD1 16p13.3-p13.12 Autosmica dominante 173900
PKD2 4q21-q23
Enfermedad de Dent CLCN5 Xp11.22 Ligada al X 300009
OCRL1 Xq26.1 300555
Sndrome de Bartter tipo I, II, IV SLC12A1 15q15-q21.1 Autosmica recesiva 601678
KCNJ1 11q24 241200
BSND 1p31 602522
Hipomagnesemia familiar con CLDN16 3q27 Autosmica recesiva 248250
hipercalciuria y nefrocalcinosis CLDN19 1p34.2 248190
Nefronoptisis NPHP1 2q13 Autosmica recesiva 256100
NPH2 9q31 602088
*Ver base de datos OMIM (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/sites/entrez?db=omim)
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MTODOS DE EXTRACCIN Y PURIFICACIN DEL
DNAY RNA
Mediante distintas tcnicas podemos purificar, con rela-
tiva facilidad, el DNAo RNAde diversas muestras biol-
gicas, entre ellas la sangre de nuestros pacientes. De entre
los distintos mtodos a utilizar, el ms sencillo, rpido y lim-
pio es el uso de columnas que capturan de forma especfi-
ca el cido nucleico de inters para nuestro estudio. Para ello
se procede a la lisis controlada de las clulas sanguneas
nucleadas (linfocitos) con el fin de liberar el contenido celu-
lar al medio. Seguidamente, los extractos celulares se hacen
pasar, mediante centrifugacin, por las columnas especfi-
cas que capturan el DNAo RNA. Una vez adheridos a la
superficie de estas columnas, se llevan a cabo diversos pasos
de lavado para eliminar el resto de sustancias no deseadas.
Finalmente, se lleva a cabo la elucin de la columna del DNA
o RNAy su recogida para posteriores procesos analticos.
MTODOS PARADETECTAR MUTACIONES EN DNA
En todos ellos el DNAque se va a analizar es primero
amplificado mediante la reaccin en cadena de la DNA poli-
merasa (PCR), que a su vez ya es un mtodo de deteccin
si la mutacin afecta al tamao del fragmento (insercin o
delecin).
Reaccin en cadena de la polimerasa
Utilizando la reaccin en cadena de la DNApolimerasa
podemos obtener cantidades adecuadas de un fragmento de
DNApara poder analizarlo. Este procedimiento ha revolu-
cionado el diagnstico molecular ya que, partiendo de una
cantidad pequea de DNAgenmico del paciente, podemos
amplificar distintas partes de genes en un par de horas. Pri-
mero tenemos que sintetizar un par de cebadores (oligonu-
cletidos de 15-25 nucletidos) que reconocen los extremos
del fragmento que queremos amplificar. Luego tenemos que
favorecer que ocurra la sntesis de DNA. Para ello, lo pri-
mero que debemos hacer es facilitar la separacin de las cade-
nas (desnaturalizacin) del DNAmolde. Acontinuacin, per-
mitir el apareamiento de los cebadores a su regin comple-
mentaria en el DNAmolde y, por ltimo, facilitar que una
DNApolimerasa resistente a altas temperaturas (como la
DNApolimerasa Taq) lleve a cabo la sntesis (extensin) de
DNAa partir de los cuatro desoxirribonucletidos trifosfa-
tos (dATP, dGTP, dTTP y dCTP). Estos tres pasos constitu-
yen un ciclo. La repeticin de este ciclo unas 40 veces per-
mite obtener, como resultado de un experimento de ampli-
ficacin, millones de copias del fragmento de inters. Todo
esto se realiza de forma automatizada. Para ello, los tubos
de reaccin se introducen en un termociclador que de forma
automtica realiza los 40 ciclos de amplificacin.
Secuenciacin del DNA
La secuenciacin del DNA consiste en determinar el
orden exacto de los nucletidos (bases, G, A, T y C) a lo largo
de un segmento de DNA. De esta secuencia se deduce la
secuencia de aminocidos de la protena codificada. El mto-
do que ms se utiliza es el de Sanger de sntesis de DNA.
El DNAque se va a secuenciar se desnaturaliza y se mez-
cla con un cebador (complementario a un sitio en una de las
hebras), polimerasa de DNA y los cuatro nucletidos
(dNTPs). Tambin se aaden pequeas cantidades de los
cuatro terminadores de la sntesis (ddNTPs) marcados cada
uno con un fluorforo distinto. Cada vez que uno de ellos se
incorpora previene la incorporacin de otros nucletidos a
la cadena. De esa manera se genera un conjunto de frag-
mentos de DNAmarcados con fluorescencia que difieren en
tamao solo en un nucletido. Los fragmentos se separan
mediante electroforesis en un capilar de un analizador auto-
mtico. Cuando los fragmentos van migrando por el capilar
pasan por un rayo lser que los hace fluorescer. Un detector
de fluorescencia graba el orden del color de las bandas que
luego se traduce en la secuencia. Finalmente, la secuencia de
los fragmentos del gen de pacientes se compara con la secuen-
cia normal para determinar la presencia de mutaciones.
Anlisis de conformacin de cadenas sencillas de DNA(SSCP)
Es uno de los procedimientos que ms se ha utilizado
para detectar mutaciones. Los exones y parte de los intrones
flanqueantes del gen se amplifican por PCR a partir de DNA
de pacientes e individuos sanos. Para obtener resultados pti-
mos, los fragmentos amplificados deben ser de unos 200
pares de bases. Despus de la amplificacin los fragmentos
se desnaturalizan, se enfran y se someten a electroforesis.
Cada molcula de DNAde cadena sencilla asume una con-
formacin tridimensional que depende de su secuencia de
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nucletidos. Las diferentes conformaciones migran con velo-
cidades distintas durante la electroforesis en gel. Por lo tanto,
por cada fragmento amplificado se visualizarn dos bandas
despus de teir el gel. Un cambio de un solo nucletido har
que los fragmentos adquieran una conformacin distinta y
por tanto una movilidad diferente en el gel.
Electroforesis en gel de gradiente desnaturalizante (DGGE)
Los productos intactos de la PCR de exones u otras regio-
nes del gen de individuos afectos y sanos se someten a elec-
troforesis en un gel que contiene un gradiente ascendente
de un agente desnaturalizante del DNA(urea o formami-
da). Auna concentracin determinada del agente desnatu-
ralizante a lo largo del gradiente la molcula de DNAempe-
zar a desnaturalizarse. Al separarse las hebras del DNAla
migracin por el gel se retarda. Un cambio de un solo nucle-
tido en la molcula de DNApuede cambiar el punto en
el gradiente en el que sta se empieza a desnaturalizar.
Anlisis de heterodplex
Un heterodplex es una molcula de DNAde doble cade-
na con uno o ms pares de nucletidos desapareados. Una
molcula de DNAsin bases desapareadas es un homod-
plex. El desapareamiento de un solo par de bases cambia la
conformacin de la molcula y retarda su movilidad elec-
trofortica. En este anlisis, las muestras de DNAdel pacien-
te y del control sano se combinan y se amplifican por PCR.
Si hay alguna diferencia en la secuencia de nucletidos, se
formar un heterodplex. Las muestras de DNAse separan
por electroforesis en un gel especial que aumenta la dife-
rencia en movilidad entre el homodplex y el heterodplex.
Anlisis por rotura qumica de bases desapareadas.
Esta prueba es una variante de la anterior. Las mues-
tras de DNAde pacientes y controles se amplifican por PCR.
Una de las muestras se marca con fluorescencia o radioac-
tividad durante la amplificacin. Acontinuacin los pro-
ductos de la reaccin se mezclan, se desnaturalizan y se dejan
enfriar. Si hay diferencias en las secuencias se formar un
heterodplex. Las muestras luego se dividen en dos alcuo-
tas. Una se trata con hidroxilamina, que modifica las citosi-
nas no apareadas. La otra se trata con tetraxido de osmio,
que modifica las timinas no apareadas. Seguidamente ambas
se tratan con piperidina, que rompe los residuos modifica-
dos. El DNAse separa por electroforesis en gel desnatura-
lizante. Si se produjo una rotura en la hebra del DNAapa-
recern dos fragmentos. Por tanto, la rotura de productos
indica la presencia de bases desapareadas, es decir, dife-
rencia de un nucletido entre las muestras de DNA.
Micromatrices de oligonucletidos
Las micromatrices (microarrays) permiten el anlisis
en paralelo de ms de cien mil biomolculas en volme-
nes de reaccin muy pequeos. Una de sus aplicaciones es
la deteccin de mutaciones causantes de enfermedad o muta-
ciones que predisponen a enfermedad para diagnstico.
Sobre la superficie de una placa de cristal se sintetizan en
un orden determinado miles de oligonucletidos (frag-
mentos cortos de DNA, 20-50 nucletidos) que contienen
todas las mutaciones conocidas de un gen o todas las varia-
ciones posibles en la regin codificante del gen. El DNA
de los pacientes y controles sanos se amplifica y se marca
con fluorescencia utilizando PCR, y luego se aade a la
micromatriz. La fluorescencia en una posicin determina-
da indica que el DNAse ha unido al oligonucletido.
Cromatografa lquida desnaturalizante de alto
rendimiento (DHPLC)
El anlisis de fragmentos de DNAmediante DHPLC
es un mtodo eficiente de deteccin de mutaciones de un
solo o pocos nucletidos, y se ha utilizado con xito en la
deteccin de mutaciones en genes asociados con enferme-
dades. Los fragmentos de DNAse separan segn su tama-
o o segn la presencia de heterodplex durante su trn-
sito por un gradiente en una columna. En el DNAamplifi-
cado de cadena doble, los nucletidos que se asocian err-
neamente a causa de mutaciones se hacen evidentes des-
pus de la formacin de heterodplex. La presencia de estas
mutaciones crea una mezcla de heterodplex y homod-
plex durante la reasociacin del DNAnormal y del mutan-
te. Si esta mezcla de fragmentos se hace migrar, mediante
HPLC en condiciones parcialmente desnaturalizantes, los
heterodplex fluyen de la columna antes que los homod-
plex debido a su temperatura de fusin ms baja.
Anlisis mediante RFLP
Una vez identificada una mutacin especfica, sta puede
detectarse en otras muestras de DNAmediante una tcnica
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F. CLAVERIE MARTN Y COLS.
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sencilla conocida como RFLP (del ingls Restriction Fragment
length Polymorphism). Para poder llevar a cabo esta tcnica,
el cambio puntual generado por la mutacin a estudio debe
generar o destruir una diana de reconocimiento de una enzi-
ma de restriccin especfica. En el caso en que la mutacin
genere un sitio de restriccin, el enzima producir un corte
en las molculas de DNAque contengan dicha mutacin,
dejando intactas aquellas donde no est presente la muta-
cin y, por consiguiente, presenten el alelo normal (no muta-
do). Mientras que si la mutacin destruye un sitio de res-
triccin, ocurrir lo opuesto, es decir, el corte se producir
en las molculas que presentan la secuencia normal y no en
las que tienen la mutacin. De esta forma, tras una amplifi-
cacin por PCR de la regin de inters del gen que sabemos
que contiene dicha mutacin, someteremos al producto a la
digestin con una enzima de corte especfico. Seguidamen-
te, haciendo uso de geles de agarosa o acrilamida, se lleva-
r a cabo una separacin de los distintos fragmentos de corte
(fragmentos de restriccin) que variarn segn el genoti-
po de cada paciente. Siguiendo esta metodologa, podemos
analizar una cantidad importante de pacientes para una o
varias mutaciones de una forma sencilla, rpida y fiable, sin
necesidad de secuenciar el DNA.
DETECCIN YANLISIS DE MUTACIONES EN RNA
Transcripcin inversa seguida de amplificacin por PCR
(RT-PCR)
La presencia de mutaciones puede tambin detectarse en
el RNAde los pacientes. Una vez aislado este RNAde san-
gre u otros tejidos, se emplea la tcnica de transcripcin inver-
sa seguida de amplificacin mediante PCR. Posteriormente,
los productos de la reaccin son analizados mediante secuen-
ciacin de DNApara determinar si existen mutaciones en la
regin codificante del gen. La transcripcin inversa utiliza
el mRNAcomo molde para sintetizar una hebra de DNA
complementaria (denominada cDNA). Dicha molcula es
idntica a la hebra de DNAdel correspondiente gen pero
carente de los intrones presentes en el DNAgenmico. Segui-
damente, se usa el cDNAcomo molde para una PCR con-
vencional. Mediante esta tcnica, se pueden distinguir alte-
raciones en el procesamiento de RNAdurante su madura-
cin, presencia de trnscritos alternativos del gen, etc.
Sistemas de minigenes
La manera idnea de determinar el verdadero efecto de
una mutacin causante de enfermedad sobre el procesamiento
del pre-RNAmensajero es el anlisis directo del RNAproce-
dente de tejido del individuo afectado mediante RT-PCR. Sin
embargo, no siempre es posible obtener la muestra de teji-
do y su RNAcorrespondiente. La solucin en estos casos es
construir en un vector plasmdico parte de un gen con algu-
nos de sus exones e intrones (sistemas de minigenes). Estos
minigenes se introducen en lneas celulares, donde se expre-
sarn de manera transitoria. El RNAprocedente de cultivos
celulares es extrado y analizado mediante RT-PCR.
La comparacin de los patrones de splicing resultantes
de un minign con la secuencia normal del exn de inters
con el de un minign portador de la secuencia exnica muta-
da permitir detectar el efecto de esta mutacin a nivel del
procesamiento del pre-RNAmensajero.
HERRAMIENTAS INFORMTICAS PARAANALIZAR
EL EFECTO DE LAS MUTACIONES
Anlisis informtico de mutaciones con cambio de
sentido
Existen diversos programas informticos, disponibles de
forma gratuita en la red que, mediante estudios comparati-
vos de las secuencias, permiten predecir si un cambio de ami-
nocido por otro afecta a la funcin de la protena y, por tanto,
si es potencialmente patognico. Estas herramientas son fci-
les de utilizar y solo requieren el introducir la secuencia nor-
mal de la protena y el cambio de aminocido que predice
la mutacin. Ejemplos de este tipo de herramientas son
PMUT (http://mmb2.pcb.ub.es:8080/PMut/), PolyPhen
(http://coot.embl.de/PolyPhen/), SIFT (http://blocks.fhcrc.
org/sift/SIFT.html) y SNPs3D (http://www.snps3d.org/).
Anlisis informtico de mutaciones que afectan al splicing
Como discutimos anteriormente, los minigenes son herra-
mientas muy tiles para el estudio de mutaciones que afec-
tan al correcto procesamiento del RNAmensajero. Sin embar-
go, realizar el anlisis rutinario in vivo de un elevado nme-
ro de variantes genmicas susceptibles de afectar al proceso
de splicing no resulta viable. En los ltimos aos se han desa-
rrollado diversos algoritmos que permiten realizar predic-
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Tcnicas para el diagnstico molecular de enfermedades hereditarias
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ciones fiables del efecto de mutaciones en el splicing. La mayo-
ra de los mismos analizan mutaciones que afectan a los sitios
aceptor, donador y branch site, y tambin aquellas que pue-
dan afectar a aquellos sitios que permiten a la clula distin-
guir entre exones verdaderos y pseudoexones. Estos elementos
se dividen en cuatro categoras simplemente en base a su loca-
lizacin y su efecto: sitios exnicos que incrementan la selec-
cin de un exn (Exonic Splicing Enhancers, ESEs) o lo silen-
cian (Exonic Splicing Silencers, ESSs), y sitios anlogos intr-
nicos (Intronic Splicing Enhancers, ISEs, e Intronic Splicing Silen-
cers, ISSs). De todos ellos los ms estudiados y conocidos son
los ESEs, por lo que la mayora de las herramientas dispo-
nibles en la actualidad han sido diseadas para su estudio.
El anlisis informtico permite realizar un estudio pre-
liminar de las mutaciones o variantes de inters. Entre ellos,
cabe destacar ESE Finder y RESCUE-ESE. Ambas herra-
mientas permiten identificar sitios ESEs. ESE Finder
(http://rulai.cshl.edu/cgi-bin/tools/ESE3/esefinder.cgi?pro-
cess=home) otorga un valor a posibles ESEs segn su pro-
babilidad de ser sitios de unin a un subgrupo de protenas
conocidas como protenas SR, caracterizadas por un domi-
nio de unin al RNArico en serinas y argininas. RESCUE-
ESE (http://genes.mit.edu/burgelab/rescue-ese/) asigna
como posibles ESEs hexanucletidos significativamente
abundantes en exones humanos y/o localizados con fre-
cuencia significativa cercanos a sitios 5 o 3 dbiles.
Otras herramientas son de gran utilidad para identificar
sitios aceptores, donadores y branch site dentro de un segmento
genmico. Es el caso de Splice-Site Prediction by Neural Net-
work (NNSplice), (http://www.fruitfly.org/seq_tools/
splice.html) y el Splice-Site Finder (SSF) (http://violin.genet.
sickkids.on.ca/~ali/splicesitefinder.html). Ambos algoritmos
asignan un valor a cada sitio identificado en funcin de su
fuerza. Adems existen pginas que anan algunas de estas
herramientas, lo que permite realizar diferentes tipos de an-
lisis de forma simultnea, como Human Splicing Finder Ver-
sion 2.3 (http://www.umd.be/HSF/).
BASES DE DATOS DE MUTACIONES HUMANAS
En los ltimos aos, el conocimiento de la secuencia com-
pleta del genoma humano ha permitido desarrollar nuevos
mtodos para la bsqueda y deteccin de mutaciones pun-
tuales, lo que nos ha llevado a un enorme incremento en el
conocimiento de genes implicados en diferentes enfermeda-
des y sus mutaciones asociadas. La correcta recopilacin y
clasificacin de todas estas mutaciones es vital, y es suma-
mente importante la creacin de bases de datos dinmicas
que permitan la consulta y el uso de los datos por parte de
investigadores y clnicos de todo el mundo, y que adems
estn asequibles en la red para poder fcilmente realizar dife-
rentes tipos de anlisis mediante herramientas informticas
de distinta naturaleza. Dentro de estas bases de datos
cabe destacar la Human Gene Mutation Database
(http://www.hgmd.cf.ac.uk/ac/index.php), que recopila las
diferentes mutaciones caracterizadas para cada gen, y MutDB
(http://www.mutdb.org/), una base de datos de mutacio-
nes que incluye informacin estructural y funcional, tambin
en funcin de cada gen. Por otra parte, existen otras bases de
mutaciones especficas de cada enfermedad como, por ejem-
plo, la ADPKD Mutation Database (http://pkdb.mayo.edu)
y la ARPKD Mutation Database (http://www.humgen.rwth-
aachen.de), que recopilan todas las mutaciones asociadas con
la enfermedad poliqustica renal.
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